JPH06206870A - 新規標識カルバマゼピン類似体 - Google Patents
新規標識カルバマゼピン類似体Info
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- JPH06206870A JPH06206870A JP5193278A JP19327893A JPH06206870A JP H06206870 A JPH06206870 A JP H06206870A JP 5193278 A JP5193278 A JP 5193278A JP 19327893 A JP19327893 A JP 19327893A JP H06206870 A JPH06206870 A JP H06206870A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
- C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
- C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D223/00—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D223/14—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D223/18—Dibenzazepines; Hydrogenated dibenzazepines
- C07D223/22—Dibenz [b, f] azepines; Hydrogenated dibenz [b, f] azepines
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
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- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 標識カルバマゼピン類似体を開示する。
【効果】 類似体は、カルバマゼピンを検出するための
イムノアッセイ乾式要素及びイムノアッセイに使用され
る。好ましくは要素が、標識カルバマゼピン類似体を含
んで成る、乾式で薄いフィルム状の分析要素である。 【構成】 アミンもしくはスルフヒドリル基を有するイ
ムノアッセイに使用される型の標識、カルバマゼピン
核、及びカルバマゼピン核のカルボキサシド基を、カル
ボニル基を介して前記の標識に連絡鎖、よりなる標識カ
ルバマゼピン類似体。
イムノアッセイ乾式要素及びイムノアッセイに使用され
る。好ましくは要素が、標識カルバマゼピン類似体を含
んで成る、乾式で薄いフィルム状の分析要素である。 【構成】 アミンもしくはスルフヒドリル基を有するイ
ムノアッセイに使用される型の標識、カルバマゼピン
核、及びカルバマゼピン核のカルボキサシド基を、カル
ボニル基を介して前記の標識に連絡鎖、よりなる標識カ
ルバマゼピン類似体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床化学、詳細には標
識カルバマゼピン類似体及びイムノアッセイにおけるそ
れらの使用に関する。
識カルバマゼピン類似体及びイムノアッセイにおけるそ
れらの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】自然の免疫学的反応を利用するイムノア
ッセイは、臨床化学において分析技術として広範に使用
されてきた。反応の特異性により、それらは、生物学的
流体中に非常に低濃度で存在する生物学的分析物を定量
する際に特に有利である。このような分析物（本明細書
ではリガンドと称される）には、例えば、抗体類、治療
薬類、麻酔薬類、酵素類、ホルモン類及びタンパク質類
などが挙げられる。
ッセイは、臨床化学において分析技術として広範に使用
されてきた。反応の特異性により、それらは、生物学的
流体中に非常に低濃度で存在する生物学的分析物を定量
する際に特に有利である。このような分析物（本明細書
ではリガンドと称される）には、例えば、抗体類、治療
薬類、麻酔薬類、酵素類、ホルモン類及びタンパク質類
などが挙げられる。
【０００３】競合バインディングイムノアッセイでは、
免疫適格性誘導体類及びリガンドの類似体類を包含する
標識リガンドが、一定量の適当なバインディング物質
（本明細書ではレセプターと称される）との反応の際に
標識されていないリガンドと競争状態におかれる。未知
濃度のリガンドが、結合又は未結合（すなわち、遊離）
標識リガンドのどちらかの信号を測定することにより検
出できる。反応は以下のように進行する。
免疫適格性誘導体類及びリガンドの類似体類を包含する
標識リガンドが、一定量の適当なバインディング物質
（本明細書ではレセプターと称される）との反応の際に
標識されていないリガンドと競争状態におかれる。未知
濃度のリガンドが、結合又は未結合（すなわち、遊離）
標識リガンドのどちらかの信号を測定することにより検
出できる。反応は以下のように進行する。
【０００４】
【化３】
【０００５】伝統的な標識には、放射性タグ類、酵素
類、発色団類、蛍光団類、安定なフリーラジカル類、酵
素コファクター類、酵素阻害剤類及びアロステリック・
エフェクター類が挙げられる。前述と矛盾することな
く、血清中のカルバマゼピンを初めとするリガンドにつ
いてのイムノアッセイは、（１）酵素標識カルバマゼピ
ン類似体と、（２）患者血清中のカルバマゼピンとの間
の、固定化された抗体バインディング部位についての競
合に基づいて実施できる。
類、発色団類、蛍光団類、安定なフリーラジカル類、酵
素コファクター類、酵素阻害剤類及びアロステリック・
エフェクター類が挙げられる。前述と矛盾することな
く、血清中のカルバマゼピンを初めとするリガンドにつ
いてのイムノアッセイは、（１）酵素標識カルバマゼピ
ン類似体と、（２）患者血清中のカルバマゼピンとの間
の、固定化された抗体バインディング部位についての競
合に基づいて実施できる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】標識カルバマゼピン類
似体についての特別な要件としては、１）少なくとも70
〜90％の類似体が過剰の固定化カルバマゼピン抗体によ
り結合せしめられること；２）固定化抗体についての類
似体の親和性が、一定量のカルバマゼピンの競合が治療
に適切な濃度範囲で生じるようなものであること；及び
３）保存条件下における類似体の酵素標識の加水分解に
対する類似体の安定性；が挙げられる。カルバマゼピン
類似体に課せられる要件としては、１）酵素標識との接
合に次ぐ、固定化抗体に対する誘導体の接近し易さ；
２）カルバマゼピンに対する抗体による誘導体の特異的
な認識；３）直接の、又は酵素活性に悪影響を及ぼさな
い条件下で酵素もしくは誘導体を活性化したの後の、誘
導体の酵素標識との十分な反応性；４）酵素由来のカル
バマゼピン類似体の加水分解に対する標識の安定性；及
び５）酵素を変性することなく、共有結合による酵素に
対するカルバマゼピンハプテンの迅速且つ完全な付着；
が挙げられる。
似体についての特別な要件としては、１）少なくとも70
〜90％の類似体が過剰の固定化カルバマゼピン抗体によ
り結合せしめられること；２）固定化抗体についての類
似体の親和性が、一定量のカルバマゼピンの競合が治療
に適切な濃度範囲で生じるようなものであること；及び
３）保存条件下における類似体の酵素標識の加水分解に
対する類似体の安定性；が挙げられる。カルバマゼピン
類似体に課せられる要件としては、１）酵素標識との接
合に次ぐ、固定化抗体に対する誘導体の接近し易さ；
２）カルバマゼピンに対する抗体による誘導体の特異的
な認識；３）直接の、又は酵素活性に悪影響を及ぼさな
い条件下で酵素もしくは誘導体を活性化したの後の、誘
導体の酵素標識との十分な反応性；４）酵素由来のカル
バマゼピン類似体の加水分解に対する標識の安定性；及
び５）酵素を変性することなく、共有結合による酵素に
対するカルバマゼピンハプテンの迅速且つ完全な付着；
が挙げられる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、新規標識カル
バマゼピン類似体、イムノアッセイ要素及びカルバマゼ
ピンについてのイムノアッセイ方法を提供する。標識カ
ルバマゼピン類似体は請求項１に記載の構造を有する。
方法は請求項２に従って遂行される。イムノアッセイ要
素は請求項３に記載のものである。
バマゼピン類似体、イムノアッセイ要素及びカルバマゼ
ピンについてのイムノアッセイ方法を提供する。標識カ
ルバマゼピン類似体は請求項１に記載の構造を有する。
方法は請求項２に従って遂行される。イムノアッセイ要
素は請求項３に記載のものである。
【０００８】
【具体的な態様】本発明者らは、本発明のイムノアッセ
イに使用される標識カルバマゼピン類似体の新規製造方
法を考案した。新規製造方法は、下記工程を含んで成
る。 １）（Ａ）アミンもしくはスルフヒドリル基を有する標
識を、過剰の （Ｂ）（i) 活性エステル基、例えば、スクシンイミド
キシカルボニル、（ii) カルバマゼピン核、及び（iii)
カルバマゼピン核のカルボキサミド基をカルボニル基を
介して活性エステル基に連結する連結鎖（連結基は、本
明細書で先に定義した連結基とは同一ではないものであ
る）、を含んで成るカルバマゼピン類似体と接触せしめ
る工程、並びに ２）未使用のカルバマゼピン類似体及び縮合副生成物
を、好ましくは透析により除去する工程。
イに使用される標識カルバマゼピン類似体の新規製造方
法を考案した。新規製造方法は、下記工程を含んで成
る。 １）（Ａ）アミンもしくはスルフヒドリル基を有する標
識を、過剰の （Ｂ）（i) 活性エステル基、例えば、スクシンイミド
キシカルボニル、（ii) カルバマゼピン核、及び（iii)
カルバマゼピン核のカルボキサミド基をカルボニル基を
介して活性エステル基に連結する連結鎖（連結基は、本
明細書で先に定義した連結基とは同一ではないものであ
る）、を含んで成るカルバマゼピン類似体と接触せしめ
る工程、並びに ２）未使用のカルバマゼピン類似体及び縮合副生成物
を、好ましくは透析により除去する工程。
【０００９】好ましくは接触せしめる工程が、類似体及
び標識の両者を、一緒に混合せしめる前に、水混和性有
機溶剤、例えば、 N,N−ジメチルホルムアミドもしくは
ジメチルスルホキシド又は溶剤及び水（緩衝化せしめ
た）の混合物に溶解せしめることにより実施される。以
下の例１〜９は、標識カルバマゼピン類似体を製造する
ためのカルバマゼピン類似体の製法を記載するものであ
る。
び標識の両者を、一緒に混合せしめる前に、水混和性有
機溶剤、例えば、 N,N−ジメチルホルムアミドもしくは
ジメチルスルホキシド又は溶剤及び水（緩衝化せしめ
た）の混合物に溶解せしめることにより実施される。以
下の例１〜９は、標識カルバマゼピン類似体を製造する
ためのカルバマゼピン類似体の製法を記載するものであ
る。
【００１０】製造例１ Ｎ−〔２−（３−スクシンイミドキシカルボニルプロピ
オニルオキシ）エチル〕カルバマゼピン
オニルオキシ）エチル〕カルバマゼピン
【００１１】
【化４】
【００１２】工程１：Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）カ
ルバマゼピンの製造 トルエン（ 250mL）中エタノールアミン（ 6.1ｇ, 0.1
モル）及び５−クロロカルボニル− 2,2′−イミノスチ
ルベン（ 6.5ｇ, 0.025モル）の混合物を４時間加熱還
流し、次いで周囲温度で16時間放置した。混合物にジク
ロロメタン（ 500mL）を添加し、そして溶液を10％塩酸
（ 100mL×２）で洗浄し、飽和重炭酸ナトリウム溶液
（ 100mL）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（ 100m
L）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し
そしてロータリー・エバポレーターで溶剤を除去した。
残渣にジクロロメタン（45mL）及び酢酸エチル（75mL）
を添加し、そして混合物をフリーザー（−16℃）に置い
た。固体を濾過した。
ルバマゼピンの製造 トルエン（ 250mL）中エタノールアミン（ 6.1ｇ, 0.1
モル）及び５−クロロカルボニル− 2,2′−イミノスチ
ルベン（ 6.5ｇ, 0.025モル）の混合物を４時間加熱還
流し、次いで周囲温度で16時間放置した。混合物にジク
ロロメタン（ 500mL）を添加し、そして溶液を10％塩酸
（ 100mL×２）で洗浄し、飽和重炭酸ナトリウム溶液
（ 100mL）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（ 100m
L）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し
そしてロータリー・エバポレーターで溶剤を除去した。
残渣にジクロロメタン（45mL）及び酢酸エチル（75mL）
を添加し、そして混合物をフリーザー（−16℃）に置い
た。固体を濾過した。
【００１３】工程２：Ｎ−〔２−（３−カルボキシプロ
ピオニルオキシ）エチル〕カルバマゼピン クロロホルム（25mL）中、Ｎ−（２−ヒドロキシエチ
ル）カルバマゼピン（ 5.6ｇ, 0.02モル）、無水琥珀酸
（ 2.2ｇ, 0.02モル）及びジメチルアミノピリジン（
2.4ｇ, 0.02モル）の混合物を周囲温度で24時間攪拌し
た。ジクロロメタン（ 400mL）を添加し、そして混合物
を10％塩酸溶液（ 100mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナト
リウム溶液（ 100mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥し、濾過しそして溶剤を除去した。残渣にエチル
エーテル（25mL）及び石油エーテル（25mL）を添加し
た。試料をメタノールから再結晶した。
ピオニルオキシ）エチル〕カルバマゼピン クロロホルム（25mL）中、Ｎ−（２−ヒドロキシエチ
ル）カルバマゼピン（ 5.6ｇ, 0.02モル）、無水琥珀酸
（ 2.2ｇ, 0.02モル）及びジメチルアミノピリジン（
2.4ｇ, 0.02モル）の混合物を周囲温度で24時間攪拌し
た。ジクロロメタン（ 400mL）を添加し、そして混合物
を10％塩酸溶液（ 100mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナト
リウム溶液（ 100mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥し、濾過しそして溶剤を除去した。残渣にエチル
エーテル（25mL）及び石油エーテル（25mL）を添加し
た。試料をメタノールから再結晶した。
【００１４】工程３：Ｎ−〔２−（３−スクシンイミド
キシカルボニルプロピオニルオキシ）エチル〕カルバマ
ゼピン クロロホルム（75mL）中、Ｎ−〔２−（３−カルボキシ
プロピオニルオキシ）エチル〕カルバマゼピン（ 3.8
ｇ, 0.01モル）、 N,N′−ジクロロヘキシルカルボジイ
ミド（ 2.1ｇ，0.01モル）及びＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（ 1.2ｇ，0.01モル）の混合物を室温で20時間攪
拌した。混合物を濾過し、そして濾液を真空中ロータリ
ー・エバポレーターで濃縮すると、白色固体が得られ
た。C25H23N3O7についての分析計算値：Ｃ,62.89；Ｈ,
4.86；Ｎ, 8.80。実験値：Ｃ,60.74；Ｈ, 5.12；Ｎ, 8.
83。
キシカルボニルプロピオニルオキシ）エチル〕カルバマ
ゼピン クロロホルム（75mL）中、Ｎ−〔２−（３−カルボキシ
プロピオニルオキシ）エチル〕カルバマゼピン（ 3.8
ｇ, 0.01モル）、 N,N′−ジクロロヘキシルカルボジイ
ミド（ 2.1ｇ，0.01モル）及びＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（ 1.2ｇ，0.01モル）の混合物を室温で20時間攪
拌した。混合物を濾過し、そして濾液を真空中ロータリ
ー・エバポレーターで濃縮すると、白色固体が得られ
た。C25H23N3O7についての分析計算値：Ｃ,62.89；Ｈ,
4.86；Ｎ, 8.80。実験値：Ｃ,60.74；Ｈ, 5.12；Ｎ, 8.
83。
【００１５】製造例２ Ｎ−〔３−（３−スクシンイミドキシカルボニルプロピ
オンアミド）プロピル〕カルバマゼピン
オンアミド）プロピル〕カルバマゼピン
【００１６】
【化５】
【００１７】工程１：Ｎ−〔３−（ベンジルオキシカル
ボニルアミノ）プロピル〕カルバマゼピン クロロホルム（75mL）中、Ｎ−ベンジルオキシカルボニ
ル− 1,3−プロパンジアミン（ 8.0ｇ, 0.04モル）及び
トリエチルアミン（ 5.0ｇ, 0.05モル）の混合物を、15
分間に亘ってクロロホルム（ 200mL）中５−クロロカル
ボニル− 2,2′−イミノスチルベン（ 7.6ｇ，0.03モ
ル）に添加した。次いで混合物を１時間加熱還流し、そ
して周囲温度で16時間放置した。ジクロロメタン（ 500
mL）を添加し、そして混合物を10％塩酸（ 100mL×２）
で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（ 100mL）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過しそして真空
中ロータリー・エバポレーターで溶剤を除去した。残渣
に酢酸エチル（50mL）を添加し、そして溶液をフリーザ
ーに２時間置き、そして濾過した。
ボニルアミノ）プロピル〕カルバマゼピン クロロホルム（75mL）中、Ｎ−ベンジルオキシカルボニ
ル− 1,3−プロパンジアミン（ 8.0ｇ, 0.04モル）及び
トリエチルアミン（ 5.0ｇ, 0.05モル）の混合物を、15
分間に亘ってクロロホルム（ 200mL）中５−クロロカル
ボニル− 2,2′−イミノスチルベン（ 7.6ｇ，0.03モ
ル）に添加した。次いで混合物を１時間加熱還流し、そ
して周囲温度で16時間放置した。ジクロロメタン（ 500
mL）を添加し、そして混合物を10％塩酸（ 100mL×２）
で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（ 100mL）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過しそして真空
中ロータリー・エバポレーターで溶剤を除去した。残渣
に酢酸エチル（50mL）を添加し、そして溶液をフリーザ
ーに２時間置き、そして濾過した。
【００１８】工程２：Ｎ−（３−アミノプロピル）カル
バマゼピン臭化水素酸塩 Ｎ−〔３−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピ
ル〕カルバマゼピン（13.2ｇ, 0.03モル）及び30〜35％
臭化水素−酢酸溶液（70mL）を室温で１時間攪拌した。
次いでこの混合物をジエチルエーテル（３Ｌ）に注ぎ入
れ、そして生成する固体を新たなエーテル（１Ｌ×３）
で磨り潰した。固体を濾過した。
バマゼピン臭化水素酸塩 Ｎ−〔３−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピ
ル〕カルバマゼピン（13.2ｇ, 0.03モル）及び30〜35％
臭化水素−酢酸溶液（70mL）を室温で１時間攪拌した。
次いでこの混合物をジエチルエーテル（３Ｌ）に注ぎ入
れ、そして生成する固体を新たなエーテル（１Ｌ×３）
で磨り潰した。固体を濾過した。
【００１９】工程３：Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロ
ピオンアミド）プロピル〕カルバマゼピン クロロホルム（ 200mL）中、Ｎ−（３−アミノプロピ
ル）カルバマゼピン臭化水素酸塩（ 7.5ｇ，0.02モ
ル）、トリエチルアミン（ 2.0ｇ，0.02モル）及び無水
琥珀酸（ 2.0ｇ，0.02モル）の混合物を30分間50〜60℃
で加熱し、そして周囲温度で20時間放置した。ジクロロ
メタン（ 500mL）を添加し、そして混合物を10％塩酸
（ 100mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（ 1
00mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
しそして真空中ロータリー・エバポレーターで溶剤を除
去した。残渣にジクロロメタン（ 100mL）及び石油エー
テル（ 100mL）を添加し、そしてそれをフリーザーに一
晩置いた。固体を濾過した。
ピオンアミド）プロピル〕カルバマゼピン クロロホルム（ 200mL）中、Ｎ−（３−アミノプロピ
ル）カルバマゼピン臭化水素酸塩（ 7.5ｇ，0.02モ
ル）、トリエチルアミン（ 2.0ｇ，0.02モル）及び無水
琥珀酸（ 2.0ｇ，0.02モル）の混合物を30分間50〜60℃
で加熱し、そして周囲温度で20時間放置した。ジクロロ
メタン（ 500mL）を添加し、そして混合物を10％塩酸
（ 100mL×２）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（ 1
00mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
しそして真空中ロータリー・エバポレーターで溶剤を除
去した。残渣にジクロロメタン（ 100mL）及び石油エー
テル（ 100mL）を添加し、そしてそれをフリーザーに一
晩置いた。固体を濾過した。
【００２０】工程４：Ｎ−〔３−（３−スクシンイミド
キシカルボニルプロピオンアミド）プロピル〕カルバマ
ゼピン クロロホルム（80mL）中、Ｎ−〔３−（３−カルボキシ
プロピオンアミド）プロピル〕カルバマゼピン（ 3.3
ｇ, 0.01モル）、 N,N′−ジクロロヘキシルカルボジイ
ミド（ 2.0ｇ，0.01モル）及びＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（ 1.0ｇ，0.01モル）の混合物を室温で20時間攪
拌した。混合物を濾過し、そして溶剤を真空中ロータリ
ー・エバポレーターで除去すると、 4.7ｇの生成物が得
られた。固体をジクロロメタン（20mL）に溶解し、濾過
し、そして溶剤を除去した。この処理を更に１回繰り返
すと、 3.0ｇ（収率64％）の生成物が得られた。C26H26
N3O6についての分析計算値：Ｃ,65.54；Ｈ, 5.50；Ｎ,
8.82。実験値：Ｃ,62.38；Ｈ, 5.47；Ｎ,11.02。
キシカルボニルプロピオンアミド）プロピル〕カルバマ
ゼピン クロロホルム（80mL）中、Ｎ−〔３−（３−カルボキシ
プロピオンアミド）プロピル〕カルバマゼピン（ 3.3
ｇ, 0.01モル）、 N,N′−ジクロロヘキシルカルボジイ
ミド（ 2.0ｇ，0.01モル）及びＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（ 1.0ｇ，0.01モル）の混合物を室温で20時間攪
拌した。混合物を濾過し、そして溶剤を真空中ロータリ
ー・エバポレーターで除去すると、 4.7ｇの生成物が得
られた。固体をジクロロメタン（20mL）に溶解し、濾過
し、そして溶剤を除去した。この処理を更に１回繰り返
すと、 3.0ｇ（収率64％）の生成物が得られた。C26H26
N3O6についての分析計算値：Ｃ,65.54；Ｈ, 5.50；Ｎ,
8.82。実験値：Ｃ,62.38；Ｈ, 5.47；Ｎ,11.02。
【００２１】製造例３ Ｎ−〔３−（４−スクシンイミドキシカルボニルブチル
アミド）プロピル〕カルバマゼピン
アミド）プロピル〕カルバマゼピン
【００２２】
【化６】
【００２３】工程１：Ｎ−〔３−（４−カルボキシブチ
ルアミド）プロピル〕カルバマゼピン Ｎ−（３−アミノプロピル）カルバマゼピン臭化水素酸
塩（ 4.8ｇ, 0.0128モル）を、製造例２の工程３に記載
の処理方法により無水グルタル酸（ 1.5ｇ, 0.0128モ
ル）、トリエチルアミン（ 1.4ｇ, 0.014モル）で処理
した。
ルアミド）プロピル〕カルバマゼピン Ｎ−（３−アミノプロピル）カルバマゼピン臭化水素酸
塩（ 4.8ｇ, 0.0128モル）を、製造例２の工程３に記載
の処理方法により無水グルタル酸（ 1.5ｇ, 0.0128モ
ル）、トリエチルアミン（ 1.4ｇ, 0.014モル）で処理
した。
【００２４】工程２：Ｎ−〔３−（４−スクシンイミド
キシカルボニルブチルアミド）プロピル〕カルバマゼピ
ン Ｎ−〔３−（４−カルボキシブチルアミド）プロピル〕
カルバマゼピンを、製造例２の工程４に記載の方法によ
りＮ−ヒドロキシスクシンイミドで処理すると生成物が
得られた。C27H28N4O6についての分析計算値：Ｃ,64.2
8；Ｈ, 5.59；Ｎ,11.10。実験値：Ｃ,63.84；Ｈ, 5.7
2；Ｎ,10.89。
キシカルボニルブチルアミド）プロピル〕カルバマゼピ
ン Ｎ−〔３−（４−カルボキシブチルアミド）プロピル〕
カルバマゼピンを、製造例２の工程４に記載の方法によ
りＮ−ヒドロキシスクシンイミドで処理すると生成物が
得られた。C27H28N4O6についての分析計算値：Ｃ,64.2
8；Ｈ, 5.59；Ｎ,11.10。実験値：Ｃ,63.84；Ｈ, 5.7
2；Ｎ,10.89。
【００２５】製造例４ Ｎ−〔６−（４−スクシンイミドキシカルボニルブチル
アミド）ヘキシル〕カルバマゼピン
アミド）ヘキシル〕カルバマゼピン
【００２６】
【化７】
【００２７】工程１：Ｎ−〔６−（ベンジルオキシカル
ボニルアミノ）ヘキシル〕カルバマゼピン Ｎ−ベンジルオキシカルボニル− 1,3−プロパンジアミ
ンの代わりにＮ−ベンジルオキシカルボニル− 1,6−ヘ
キサンジアミンを使用したことを除いて、この物質を製
造例２，工程１に概説した方法を用いて製造すると、生
成物11.0ｇ（収率94％）が得られた。酢酸エチル／ペン
タン（１：１）から結晶化することにより純物質が得ら
れた。
ボニルアミノ）ヘキシル〕カルバマゼピン Ｎ−ベンジルオキシカルボニル− 1,3−プロパンジアミ
ンの代わりにＮ−ベンジルオキシカルボニル− 1,6−ヘ
キサンジアミンを使用したことを除いて、この物質を製
造例２，工程１に概説した方法を用いて製造すると、生
成物11.0ｇ（収率94％）が得られた。酢酸エチル／ペン
タン（１：１）から結晶化することにより純物質が得ら
れた。
【００２８】工程２：Ｎ−（６−アミノヘキシル）カル
バマゼピン臭化水素酸塩 Ｎ−〔３−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−〔６−（ベンジルオ
キシカルボニルアミノ）ヘキシル〕カルバマゼピンを使
用したことを除いて、この物質を製造例２，工程２に概
説した方法を用いて製造すると、生成物 8.5ｇ（収率 1
00％）が得られた。
バマゼピン臭化水素酸塩 Ｎ−〔３−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−〔６−（ベンジルオ
キシカルボニルアミノ）ヘキシル〕カルバマゼピンを使
用したことを除いて、この物質を製造例２，工程２に概
説した方法を用いて製造すると、生成物 8.5ｇ（収率 1
00％）が得られた。
【００２９】工程３：Ｎ−〔６−（４−カルボキシブチ
ルアミド）ヘキシル〕カルバマゼピン Ｎ−（３−アミノプロピル）カルバマゼピン臭化水素酸
塩及び無水琥珀酸の代わりに、それぞれＮ−（６−アミ
ノヘキシル）カルバマゼピン臭化水素酸塩及び無水グル
タル酸を使用したことを除いて、この物質を製造例２，
工程３に概説した方法を用いて製造した。生成物をジク
ロロメタン／酢酸エチル（１：１）から結晶化した。
ルアミド）ヘキシル〕カルバマゼピン Ｎ−（３−アミノプロピル）カルバマゼピン臭化水素酸
塩及び無水琥珀酸の代わりに、それぞれＮ−（６−アミ
ノヘキシル）カルバマゼピン臭化水素酸塩及び無水グル
タル酸を使用したことを除いて、この物質を製造例２，
工程３に概説した方法を用いて製造した。生成物をジク
ロロメタン／酢酸エチル（１：１）から結晶化した。
【００３０】工程４：Ｎ−〔６−（４−スクシンイミド
キシカルボニルブチルアミド）ヘキシル〕カルバマゼピ
ン Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロピオンアミド）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−〔６−（４−カルボ
キシブチルアミド）ヘキシル〕カルバマゼピンを使用し
たことを除いて、この物質を製造例２，工程４に概説し
た方法を用いて製造した。C30H34N4O6についての分析計
算値：Ｃ,65.92；Ｈ, 6.27；Ｎ,10.25。 実験値：Ｃ,65.20；Ｈ, 6.19；Ｎ,10.02。
キシカルボニルブチルアミド）ヘキシル〕カルバマゼピ
ン Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロピオンアミド）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−〔６−（４−カルボ
キシブチルアミド）ヘキシル〕カルバマゼピンを使用し
たことを除いて、この物質を製造例２，工程４に概説し
た方法を用いて製造した。C30H34N4O6についての分析計
算値：Ｃ,65.92；Ｈ, 6.27；Ｎ,10.25。 実験値：Ｃ,65.20；Ｈ, 6.19；Ｎ,10.02。
【００３１】製造例５ ５−〔４−（４−スクシンイミドキシカルボニルブチリ
ル）ピペラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，
ｆ〕アゼピン
ル）ピペラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，
ｆ〕アゼピン
【００３２】
【化８】
【００３３】工程１：５−〔４−（ベンジルオキシカル
ボニル）ピペラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｆ〕アゼピン Ｎ−ベンジルオキシカルボニル− 1,3−プロパンジアミ
ンの代わりにベンジル １−ピペラジンカルボキシレー
トを使用したことを除いて、この物質を製造例２，工程
１に概説した方法を用いて製造した。化合物をエチルエ
ーテル（10mL）に溶解し、そして石油エーテルを曇点ま
で添加した。混合物をフリーザーに置き、次いで濾過す
ると物質 9.3ｇが得られた。
ボニル）ピペラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｆ〕アゼピン Ｎ−ベンジルオキシカルボニル− 1,3−プロパンジアミ
ンの代わりにベンジル １−ピペラジンカルボキシレー
トを使用したことを除いて、この物質を製造例２，工程
１に概説した方法を用いて製造した。化合物をエチルエ
ーテル（10mL）に溶解し、そして石油エーテルを曇点ま
で添加した。混合物をフリーザーに置き、次いで濾過す
ると物質 9.3ｇが得られた。
【００３４】工程２Ａ：５−（ピペラジノカルボニル）
−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピン臭化水素酸塩 工程２Ｂ：５−〔４−（４−カルボキシブチリル）ピペ
ラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピ
ン 工程２のＮ−〔３−（ベンジルオキシカルボニルアミ
ノ）プロピル〕カルバマゼピンの代わりに５−〔４−
（ベンジルオキシカルボニル）ピペラジノカルボニル〕
−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピンを使用して出発
し、従って工程２の生成物の代わりに５−（ピペラジノ
カルボニル）−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピン臭化
水素酸塩を生成し、そして工程３の方法では無水琥珀酸
の代わりに無水グルタル酸を使用したことを除いて、こ
れらの物質を製造例２の工程２及び３に概説した方法を
用いて製造した。残渣（２Ｂ）を酢酸エチル（10mL）及
び石油エーテル（２mL）から結晶化し、フリーザーに置
き、そして濾過するとこの酸が得られた。
−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピン臭化水素酸塩 工程２Ｂ：５−〔４−（４−カルボキシブチリル）ピペ
ラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピ
ン 工程２のＮ−〔３−（ベンジルオキシカルボニルアミ
ノ）プロピル〕カルバマゼピンの代わりに５−〔４−
（ベンジルオキシカルボニル）ピペラジノカルボニル〕
−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピンを使用して出発
し、従って工程２の生成物の代わりに５−（ピペラジノ
カルボニル）−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピン臭化
水素酸塩を生成し、そして工程３の方法では無水琥珀酸
の代わりに無水グルタル酸を使用したことを除いて、こ
れらの物質を製造例２の工程２及び３に概説した方法を
用いて製造した。残渣（２Ｂ）を酢酸エチル（10mL）及
び石油エーテル（２mL）から結晶化し、フリーザーに置
き、そして濾過するとこの酸が得られた。
【００３５】工程３：５−〔４−（３−カルボキシプロ
ピオニル）ピペラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｆ〕アゼピン 無水グルタル酸の代わりに無水琥珀酸を使用したことを
除いて、この物質を製造例４の工程２Ｂに概説した方法
を用いて製造した。試料をジクロロメタン／酢酸エチル
（１：１）から再結晶すると純物質が得られた。
ピオニル）ピペラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｆ〕アゼピン 無水グルタル酸の代わりに無水琥珀酸を使用したことを
除いて、この物質を製造例４の工程２Ｂに概説した方法
を用いて製造した。試料をジクロロメタン／酢酸エチル
（１：１）から再結晶すると純物質が得られた。
【００３６】工程４：５−〔４−（４−スクシンイミド
キシカルボニルブチリル）ピペラジノカルボニル〕−５
Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピン Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロピオンアミド）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりに５−〔４−（カルボキシ
ブチリル）ピペラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｆ〕アゼピンを使用したことを除いて、この物質
を製造例２，工程４に概説した方法を用いて製造する
と、生成物 4.6ｇ（収率 100％）が得られた。物質（
3.0ｇ）をシリカゲルを用いてクロマトグラフィーにか
けた。C28H28N4O6についての分析計算値：Ｃ,65.09；
Ｈ, 5.47；Ｎ,10.85。実験値：Ｃ,64.87；Ｈ, 5.99；
Ｎ,10.62。
キシカルボニルブチリル）ピペラジノカルボニル〕−５
Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピン Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロピオンアミド）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりに５−〔４−（カルボキシ
ブチリル）ピペラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｆ〕アゼピンを使用したことを除いて、この物質
を製造例２，工程４に概説した方法を用いて製造する
と、生成物 4.6ｇ（収率 100％）が得られた。物質（
3.0ｇ）をシリカゲルを用いてクロマトグラフィーにか
けた。C28H28N4O6についての分析計算値：Ｃ,65.09；
Ｈ, 5.47；Ｎ,10.85。実験値：Ｃ,64.87；Ｈ, 5.99；
Ｎ,10.62。
【００３７】製造例６ ５−〔４−（３−スクシンイミドキシカルボニルプロピ
オニル）ピペラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｆ〕アゼピン
オニル）ピペラジノカルボニル〕−５Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｆ〕アゼピン
【００３８】
【化９】
【００３９】Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロピオンア
ミド）プロピル〕カルバマゼピンの代わりに５−〔４−
（３−カルボキシプロピオニル）ピペラジノカルボニ
ル〕−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピンを使用したこ
とを除いて、この物質を製造例２，工程４に概説した方
法を用いて製造した。試料をジクロロメタン（35mL）及
び酢酸エチル（８mL）から再結晶すると、 135〜140 ℃
で溶解する物質が得られた。C27H26N4O6についての分析
計算値：Ｃ,64.33；Ｈ, 5.22；Ｎ,11.15。実験値：Ｃ,6
2.46；Ｈ, 5.29；Ｎ,10.82。
ミド）プロピル〕カルバマゼピンの代わりに５−〔４−
（３−カルボキシプロピオニル）ピペラジノカルボニ
ル〕−５Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｆ〕アゼピンを使用したこ
とを除いて、この物質を製造例２，工程４に概説した方
法を用いて製造した。試料をジクロロメタン（35mL）及
び酢酸エチル（８mL）から再結晶すると、 135〜140 ℃
で溶解する物質が得られた。C27H26N4O6についての分析
計算値：Ｃ,64.33；Ｈ, 5.22；Ｎ,11.15。実験値：Ｃ,6
2.46；Ｈ, 5.29；Ｎ,10.82。
【００４０】製造例７ Ｎ−（４−スクシンイミドキシカルボニルブチル）カル
バマゼピン
バマゼピン
【００４１】
【化１０】
【００４２】工程１：Ｎ−（４−メトキシカルボニルブ
チル）カルバマゼピン テトラヒドロフラン（ 400mL）中、水素化ナトリウム
（ 6.0ｇ, 0.2モル，80％）及びカルバマゼピン（40.0
ｇ, 0.17モル）の混合物に、30分間に亘ってテトラヒド
ロフラン（ 100mL）中５−ブロモ吉草酸メチル（39.0
ｇ, 0.19モル）を添加した。混合物を周囲温度で３日間
攪拌し、次いで濃塩酸（ 100mL）を含有する氷中に注ぎ
入れた。水性溶液をジクロロメタン（ 200×３）で抽出
し、そして合わせた有機溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶
液（ 200mL）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（ 200
mL）で洗浄し、次いで無水硫酸マグネシウムで乾燥し、
濾過しそして真空中ロータリー・エバポレーターで溶剤
を除去した。残渣にエチルエーテル（ 100mL）を添加し
た。混合物をフリーザー（−16℃）に置き、そして濾過
すると、白色固体が得られた。
チル）カルバマゼピン テトラヒドロフラン（ 400mL）中、水素化ナトリウム
（ 6.0ｇ, 0.2モル，80％）及びカルバマゼピン（40.0
ｇ, 0.17モル）の混合物に、30分間に亘ってテトラヒド
ロフラン（ 100mL）中５−ブロモ吉草酸メチル（39.0
ｇ, 0.19モル）を添加した。混合物を周囲温度で３日間
攪拌し、次いで濃塩酸（ 100mL）を含有する氷中に注ぎ
入れた。水性溶液をジクロロメタン（ 200×３）で抽出
し、そして合わせた有機溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶
液（ 200mL）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（ 200
mL）で洗浄し、次いで無水硫酸マグネシウムで乾燥し、
濾過しそして真空中ロータリー・エバポレーターで溶剤
を除去した。残渣にエチルエーテル（ 100mL）を添加し
た。混合物をフリーザー（−16℃）に置き、そして濾過
すると、白色固体が得られた。
【００４３】 工程２：Ｎ−（４−カルボキシブチル）カルバマゼピン Ｎ−（４−メトキシカルボニルブチル）カルバマゼピン
（ 6.3ｇ, 0.18モル）をｐ−ジオキサン（ 120mL) 、水
（25mL）及び濃塩酸（50mL）に溶解した。溶液を２時間
還流し、次いで周囲温度で攪拌した。この混合物に飽和
塩化ナトリウム溶液（ 100mL）を添加し、そして混合物
をジクロロメタン（ 300mL×３）で抽出した。合わせた
有機溶液を飽和塩化ナトリウム溶液（ 100mL）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過しそして溶剤
を除去した。残渣をジクロロメタン（ 175mL) に溶解
し、そして酢酸エチル（ 100mL）を添加した。混合物を
フリーザー（−16℃）に置き、次いで濾過した。
（ 6.3ｇ, 0.18モル）をｐ−ジオキサン（ 120mL) 、水
（25mL）及び濃塩酸（50mL）に溶解した。溶液を２時間
還流し、次いで周囲温度で攪拌した。この混合物に飽和
塩化ナトリウム溶液（ 100mL）を添加し、そして混合物
をジクロロメタン（ 300mL×３）で抽出した。合わせた
有機溶液を飽和塩化ナトリウム溶液（ 100mL）で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過しそして溶剤
を除去した。残渣をジクロロメタン（ 175mL) に溶解
し、そして酢酸エチル（ 100mL）を添加した。混合物を
フリーザー（−16℃）に置き、次いで濾過した。
【００４４】工程３：Ｎ−（４−スクシンイミドキシカ
ルボニルブチル）カルバマゼピン Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロピオンアミド）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−（４−カルボキシブ
チル）カルバマゼピンを使用したことを除いて、この物
質を製造例２，工程４に概説した方法を用いて製造し
た。C24H23N3O5についての分析計算値：Ｃ,66.50；Ｈ,
5.35；Ｎ, 9.69。実験値：Ｃ,65.82；Ｈ,5.58；Ｎ, 9.3
7。
ルボニルブチル）カルバマゼピン Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロピオンアミド）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−（４−カルボキシブ
チル）カルバマゼピンを使用したことを除いて、この物
質を製造例２，工程４に概説した方法を用いて製造し
た。C24H23N3O5についての分析計算値：Ｃ,66.50；Ｈ,
5.35；Ｎ, 9.69。実験値：Ｃ,65.82；Ｈ,5.58；Ｎ, 9.3
7。
【００４５】製造例８ Ｎ−｛４−〔４−（３−スクシンイミドキシカルボニル
プロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバ
マゼピン
プロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバ
マゼピン
【００４６】
【化１１】
【００４７】工程１：Ｎ−〔４−（４−ベンジルオキシ
カルボニルピペラジノカルボニル）ブチル｝カルバマゼ
ピン テトラヒドロフラン（ 100mL）中、Ｎ−（４−カルボキ
シブチル）カルバマゼピン（ 3.4ｇ，0.01モル）及び
1,1′−カルボニルジイミダゾール（ 2.1ｇ, 0.0125モ
ル）の混合物を周囲温度で30分間攪拌した。この混合物
に室温で30分間に亘ってテトラヒドロフラン（ 100mL）
中ベンジル １−ピペラジンカルボキシレート（2.75
ｇ, 0.0125モル）を添加した。20時間後、ジクロロメタ
ン（ 300mL）を添加し、そして有機溶液を５％塩酸溶液
（ 100mL×３）で洗浄し、飽和重炭酸ナトリウム溶液
（ 100mL）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（ 100m
L）で洗浄し、次いで無水硫酸マグネシウムで乾燥し、
濾過しそして真空中ロータリー・エバポレーターで溶剤
を除去した。この物質を次工程で直接使用した。
カルボニルピペラジノカルボニル）ブチル｝カルバマゼ
ピン テトラヒドロフラン（ 100mL）中、Ｎ−（４−カルボキ
シブチル）カルバマゼピン（ 3.4ｇ，0.01モル）及び
1,1′−カルボニルジイミダゾール（ 2.1ｇ, 0.0125モ
ル）の混合物を周囲温度で30分間攪拌した。この混合物
に室温で30分間に亘ってテトラヒドロフラン（ 100mL）
中ベンジル １−ピペラジンカルボキシレート（2.75
ｇ, 0.0125モル）を添加した。20時間後、ジクロロメタ
ン（ 300mL）を添加し、そして有機溶液を５％塩酸溶液
（ 100mL×３）で洗浄し、飽和重炭酸ナトリウム溶液
（ 100mL）で洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（ 100m
L）で洗浄し、次いで無水硫酸マグネシウムで乾燥し、
濾過しそして真空中ロータリー・エバポレーターで溶剤
を除去した。この物質を次工程で直接使用した。
【００４８】工程２Ａ：Ｎ−（４−ピペラジノカルボニ
ルブチル）カルバマゼピン臭化水素酸塩 工程２Ｂ：Ｎ−｛４−〔４−（３−カルボキシプロピオ
ニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバマゼピン 工程２ＡではＮ−〔３−（ベンジルオキシカルボニルア
ミノ）プロピル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−〔４−
（４−ベンゾイルオキシカルボニルピペラジノカルボニ
ル）ブチル〕カルバマゼピンを使用して出発して、次い
で製造例８の工程２Ｂで製造例２の工程２の生成物の代
わりに製造例８の工程２Ａ由来の生成物を使用したこと
を除いて、これらの物質を製造例２の工程２及び３に概
説した方法を用いて製造するとこの酸が得られた。
ルブチル）カルバマゼピン臭化水素酸塩 工程２Ｂ：Ｎ−｛４−〔４−（３−カルボキシプロピオ
ニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバマゼピン 工程２ＡではＮ−〔３−（ベンジルオキシカルボニルア
ミノ）プロピル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−〔４−
（４−ベンゾイルオキシカルボニルピペラジノカルボニ
ル）ブチル〕カルバマゼピンを使用して出発して、次い
で製造例８の工程２Ｂで製造例２の工程２の生成物の代
わりに製造例８の工程２Ａ由来の生成物を使用したこと
を除いて、これらの物質を製造例２の工程２及び３に概
説した方法を用いて製造するとこの酸が得られた。
【００４９】工程３：Ｎ−｛４−〔４−（３−スクシン
イミドキシカルボニルプロピオニル）ピペラジノカルボ
ニル〕ブチル｝カルバマゼピン Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロピオンアミド）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−｛４−〔４−（３−
カルボキシプロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチ
ル｝カルバマゼピンを使用したことを除いて、この物質
を製造例２，工程４に概説した方法を用いて製造した。
試料をシリカゲルを用いてクロマトグラフィーにかける
と分析的に純粋な物質が得られた。C32H35N5O7について
の分析計算値：Ｃ,63.88；Ｈ, 5.86；Ｎ,11.64。実験
値：Ｃ,63.13；Ｈ, 6.02；Ｎ,11.06。
イミドキシカルボニルプロピオニル）ピペラジノカルボ
ニル〕ブチル｝カルバマゼピン Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロピオンアミド）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−｛４−〔４−（３−
カルボキシプロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチ
ル｝カルバマゼピンを使用したことを除いて、この物質
を製造例２，工程４に概説した方法を用いて製造した。
試料をシリカゲルを用いてクロマトグラフィーにかける
と分析的に純粋な物質が得られた。C32H35N5O7について
の分析計算値：Ｃ,63.88；Ｈ, 5.86；Ｎ,11.64。実験
値：Ｃ,63.13；Ｈ, 6.02；Ｎ,11.06。
【００５０】製造例９ Ｎ−｛４−〔３−（４−スクシンイミドキシカルボニル
ブチルアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチル｝カ
ルバマゼピン 工程１：Ｎ−〔４−（３−ベンジルオキシカルボニルア
ミノプロピルアミノカルボニル）ブチル〕カルバマゼピ
ン ベンジル １−ピペラジンカルボキシレートの代わりに
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル− 1,3−プロパンジアミ
ンを使用したことを除いて、この物質を製造例８，工程
１に概説した方法を用いて製造した。残渣をエチルエー
テル（８mL）、アセトン（４mL）及び石油エーテル（３
mL）で処理し、フリーザー（−16℃）に置き、そして濾
過すると生成物が得られた。
ブチルアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチル｝カ
ルバマゼピン 工程１：Ｎ−〔４−（３−ベンジルオキシカルボニルア
ミノプロピルアミノカルボニル）ブチル〕カルバマゼピ
ン ベンジル １−ピペラジンカルボキシレートの代わりに
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル− 1,3−プロパンジアミ
ンを使用したことを除いて、この物質を製造例８，工程
１に概説した方法を用いて製造した。残渣をエチルエー
テル（８mL）、アセトン（４mL）及び石油エーテル（３
mL）で処理し、フリーザー（−16℃）に置き、そして濾
過すると生成物が得られた。
【００５１】工程２Ａ：Ｎ−〔４−（３−アミノプロピ
ルアミノカルボニル）ブチル〕カルバマゼピン臭化水素
酸塩 工程２Ｂ：Ｎ−｛４−〔３−（４−カルボキシブチルア
ミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチル｝カルバマゼ
ピン 工程２のＮ−〔３−（ベンジルオキシカルボニルアミ
ノ）プロピル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−〔４−
（３−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピルアミノ
カルボニル）ブチル〕カルバマゼピンを使用し、工程３
のＮ−（３−アミノプロピル）カルバマゼピン臭化水素
酸塩の代わりにＮ−〔４−（３−アミノプロピルアミノ
カルボニル）ブチル〕カルバマゼピン臭化水素酸塩を使
用し、そして無水琥珀酸の代わりに無水グルタル酸を使
用したことを除いて、これらの物質を製造例２の工程２
及び３に概説した方法を用いて製造すると、生成物、収
量 2.6ｇ（収率44％）が得られた。固体をメタノール
（４mL）及び酢酸エチル（15mL）から再結晶すると純物
質が得られた。
ルアミノカルボニル）ブチル〕カルバマゼピン臭化水素
酸塩 工程２Ｂ：Ｎ−｛４−〔３−（４−カルボキシブチルア
ミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチル｝カルバマゼ
ピン 工程２のＮ−〔３−（ベンジルオキシカルボニルアミ
ノ）プロピル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−〔４−
（３−ベンジルオキシカルボニルアミノプロピルアミノ
カルボニル）ブチル〕カルバマゼピンを使用し、工程３
のＮ−（３−アミノプロピル）カルバマゼピン臭化水素
酸塩の代わりにＮ−〔４−（３−アミノプロピルアミノ
カルボニル）ブチル〕カルバマゼピン臭化水素酸塩を使
用し、そして無水琥珀酸の代わりに無水グルタル酸を使
用したことを除いて、これらの物質を製造例２の工程２
及び３に概説した方法を用いて製造すると、生成物、収
量 2.6ｇ（収率44％）が得られた。固体をメタノール
（４mL）及び酢酸エチル（15mL）から再結晶すると純物
質が得られた。
【００５２】工程３：Ｎ−｛４−〔３−（４−スクシン
イミドキシカルボニルブチルアミド）プロピルアミノカ
ルボニル〕ブチル｝カルバマゼピン Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロピオンアミド）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−｛４−〔３−（４−
カルボキシブチルアミド）プロピルアミノカルボニル〕
ブチル｝カルバマゼピンを使用したことを除いて、この
物質を製造例２，工程４に概説した方法を用いて製造し
た。試料をシリカゲルでのクロマトグラフィーにかける
と白色固体が得られた。C32H37N5O7についての分析計算
値：Ｃ,63.67；Ｈ, 6.18；Ｎ,11.60。実験値：Ｃ,61.7
4；Ｈ, 6.21；Ｎ,10.77。
イミドキシカルボニルブチルアミド）プロピルアミノカ
ルボニル〕ブチル｝カルバマゼピン Ｎ−〔３−（３−カルボキシプロピオンアミド）プロピ
ル〕カルバマゼピンの代わりにＮ−｛４−〔３−（４−
カルボキシブチルアミド）プロピルアミノカルボニル〕
ブチル｝カルバマゼピンを使用したことを除いて、この
物質を製造例２，工程４に概説した方法を用いて製造し
た。試料をシリカゲルでのクロマトグラフィーにかける
と白色固体が得られた。C32H37N5O7についての分析計算
値：Ｃ,63.67；Ｈ, 6.18；Ｎ,11.60。実験値：Ｃ,61.7
4；Ｈ, 6.21；Ｎ,10.77。
【００５３】例１０ Ｎ−（４−スクシンイミドキシカルボニルブチル）カル
バマゼピン及びアミン富化ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキ
シダーゼ）接合体（標識Ａ）の接合体の調整 アミン富化ＨＲＰを以下のようにして調整した。簡単に
は、乾燥ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を 0.1
Ｍ ＭＥＳ緩衝剤，pH 5.5，に溶解して、最終濃度が緩
衝剤10mL中 2.5×10-6モル（ 100mg）となるようにした
（ＭＥＳ＝２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸）。タンパク質濃度を、換算係数A403 1mg/mL ＝2.24
を用いてA403測度により測定した。ＨＲＰ溶液を、 0.1
Ｍ ＭＥＳ緩衝剤，pH 5.5，10mLに溶解したＬ−リジン
一塩酸塩 1.5×10-3モル（ 275mg）と合わせた。新たに
調整したＭＥＳ緩衝剤中１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ，５
×10-4モル， 960mL）の溶液を添加した。容器に蓋をし
て一晩室温で混合した。反応混合物を0.02Ｍ ＭＯＰＳ
緩衝剤pH 7.3（３Ｌ，10℃）に対して透析した。透析緩
衝剤を３回変えた。ＭＯＰＳ＝３−（Ｎ−モルホリノ）
プロパンスルホン酸。
バマゼピン及びアミン富化ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキ
シダーゼ）接合体（標識Ａ）の接合体の調整 アミン富化ＨＲＰを以下のようにして調整した。簡単に
は、乾燥ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を 0.1
Ｍ ＭＥＳ緩衝剤，pH 5.5，に溶解して、最終濃度が緩
衝剤10mL中 2.5×10-6モル（ 100mg）となるようにした
（ＭＥＳ＝２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸）。タンパク質濃度を、換算係数A403 1mg/mL ＝2.24
を用いてA403測度により測定した。ＨＲＰ溶液を、 0.1
Ｍ ＭＥＳ緩衝剤，pH 5.5，10mLに溶解したＬ−リジン
一塩酸塩 1.5×10-3モル（ 275mg）と合わせた。新たに
調整したＭＥＳ緩衝剤中１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ，５
×10-4モル， 960mL）の溶液を添加した。容器に蓋をし
て一晩室温で混合した。反応混合物を0.02Ｍ ＭＯＰＳ
緩衝剤pH 7.3（３Ｌ，10℃）に対して透析した。透析緩
衝剤を３回変えた。ＭＯＰＳ＝３−（Ｎ−モルホリノ）
プロパンスルホン酸。
【００５４】反応せしめる前に、Centricell Centrifug
al Ultrafilter（30,000公称分子量限界，nominal mole
cular weight limit）を用いて、アミン富化ＨＲＰの試
料をＭＯＰＳ緩衝剤から 0.1Ｍ ＥＰＰＳ緩衝剤，pH
8.0，に交換した。次いでこの試料を 5.0mLまで希釈し
て最終濃度 10.00mg/mL （ 2.5×10-4Ｍ）の溶液を生成
した。ＥＰＰＳはＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラ
ジン−Ｎ′−３−プロパンスルホン酸である。
al Ultrafilter（30,000公称分子量限界，nominal mole
cular weight limit）を用いて、アミン富化ＨＲＰの試
料をＭＯＰＳ緩衝剤から 0.1Ｍ ＥＰＰＳ緩衝剤，pH
8.0，に交換した。次いでこの試料を 5.0mLまで希釈し
て最終濃度 10.00mg/mL （ 2.5×10-4Ｍ）の溶液を生成
した。ＥＰＰＳはＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラ
ジン−Ｎ′−３−プロパンスルホン酸である。
【００５５】アミン富化ＨＲＰ溶液１mLを小バイアルに
添加した（ 2.5×10-4Ｍ）。10 mM４′−ヒドロキシア
セトアニリドを含有するジメチルホルムアミド，Aldric
h 22,705-6, （ＤＭＦ ４′−ＨＡ）500 mLをバイアル
に添加し、ボルテックスにかけ、そして42℃の水浴に入
れた。
添加した（ 2.5×10-4Ｍ）。10 mM４′−ヒドロキシア
セトアニリドを含有するジメチルホルムアミド，Aldric
h 22,705-6, （ＤＭＦ ４′−ＨＡ）500 mLをバイアル
に添加し、ボルテックスにかけ、そして42℃の水浴に入
れた。
【００５６】同時に、必要なカルバマゼピン類似体をＤ
ＭＦ ４′−ＨＡに溶解して 21.54mg/mL の溶液（ 5.0
×10-2Ｍ）を得た。ボルテックスで混合しながらこの溶
液 500mLをＨＲＰ／ＤＭＦ ４′−ＨＡ溶液に滴下し
た。カルバマゼピン／ＨＲＰのモル比は 100/1であっ
た。予め42℃で１時間穏やかに振盪しながら水浴中でイ
ンキュベーションを行った。更に反応容器を濯ぐために
使用したＤＭＦ ４′−ＨＡ／ 0.1Ｍ ＥＰＰＳ（１：
１） 0.5mLと共に、試料をSpectrapor #2 透析管に移し
た。
ＭＦ ４′−ＨＡに溶解して 21.54mg/mL の溶液（ 5.0
×10-2Ｍ）を得た。ボルテックスで混合しながらこの溶
液 500mLをＨＲＰ／ＤＭＦ ４′−ＨＡ溶液に滴下し
た。カルバマゼピン／ＨＲＰのモル比は 100/1であっ
た。予め42℃で１時間穏やかに振盪しながら水浴中でイ
ンキュベーションを行った。更に反応容器を濯ぐために
使用したＤＭＦ ４′−ＨＡ／ 0.1Ｍ ＥＰＰＳ（１：
１） 0.5mLと共に、試料をSpectrapor #2 透析管に移し
た。
【００５７】反応混合物を以下のように透析した。 ａ）ＤＭＦ ４′−ＨＡ／ 0.1Ｍ ＥＰＰＳ，１Ｌ，pH
8.0（１：１），42℃，１時間。 ｂ）透析条件ａ）を１回繰り返した。 ｃ） 0.1％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する
0.1Ｍ ＥＰＰＳ,1.5Ｌ，pH 8.0，５℃，２時間。 ｄ） 0.1Ｍ ＥＰＰＳ,1.5Ｌ，pH 8.0，５℃，一晩。 ｅ）40mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2.0Ｌ，pH 7.5, 少
なくとも８時間。 ｆ）透析条件ｅ）を１回繰り返した。 Tris-HClはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩
酸塩である。透析に続いて、0.02％メルチオレートを防
腐剤として添加し、そして標識を冷蔵保存した。
8.0（１：１），42℃，１時間。 ｂ）透析条件ａ）を１回繰り返した。 ｃ） 0.1％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する
0.1Ｍ ＥＰＰＳ,1.5Ｌ，pH 8.0，５℃，２時間。 ｄ） 0.1Ｍ ＥＰＰＳ,1.5Ｌ，pH 8.0，５℃，一晩。 ｅ）40mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2.0Ｌ，pH 7.5, 少
なくとも８時間。 ｆ）透析条件ｅ）を１回繰り返した。 Tris-HClはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩
酸塩である。透析に続いて、0.02％メルチオレートを防
腐剤として添加し、そして標識を冷蔵保存した。
【００５８】例１１ Ｎ−〔６−（４−スクシンイミドキシカルボニルブチル
アミド）ヘキシル〕カルバマゼピン及びアミン富化ＨＲ
Ｐの接合体（標識Ｂ） 例１０に記載したようにアミン富化ＨＲＰを調整した。
反応せしめる前に、Centricell Centrifugal Ultrafilt
er（30,000公称分子量限界）を用いて、アミン富化ＨＲ
Ｐの試料をＭＯＰＳ緩衝剤から 0.1Ｍ ＥＰＰＳ緩衝
剤，pH 8.0，に交換した。次いでこの試料を 3.0mLまで
希釈して最終濃度 8.36 mg/mL （2.08×10 -4Ｍ）の溶液
を生成した。ＥＰＰＳはＮ−（２−ヒドロキシエチル）
ピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルホン酸である。
アミド）ヘキシル〕カルバマゼピン及びアミン富化ＨＲ
Ｐの接合体（標識Ｂ） 例１０に記載したようにアミン富化ＨＲＰを調整した。
反応せしめる前に、Centricell Centrifugal Ultrafilt
er（30,000公称分子量限界）を用いて、アミン富化ＨＲ
Ｐの試料をＭＯＰＳ緩衝剤から 0.1Ｍ ＥＰＰＳ緩衝
剤，pH 8.0，に交換した。次いでこの試料を 3.0mLまで
希釈して最終濃度 8.36 mg/mL （2.08×10 -4Ｍ）の溶液
を生成した。ＥＰＰＳはＮ−（２−ヒドロキシエチル）
ピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルホン酸である。
【００５９】標識Ｂを調整するために、アミン富化ＨＲ
Ｐ溶液１mLを小バイアルに添加した（1.85×10-5Ｍ）。
10 mM ４′−ヒドロキシアセトアニリドを含有するジメ
チルホルムアミド，Aldrich 22,705-6, （ＤＭＦ ４′
−ＨＡ）500 mLをバイアルに添加し、ボルテックスにか
け、そして42℃の水浴に入れた。
Ｐ溶液１mLを小バイアルに添加した（1.85×10-5Ｍ）。
10 mM ４′−ヒドロキシアセトアニリドを含有するジメ
チルホルムアミド，Aldrich 22,705-6, （ＤＭＦ ４′
−ＨＡ）500 mLをバイアルに添加し、ボルテックスにか
け、そして42℃の水浴に入れた。
【００６０】同時に、必要なカルバマゼピン薬剤類似体
をＤＭＦ ４′−ＨＡに溶解して 22.72mg/mL の溶液
（4.16×10-2Ｍ）を得た。ボルテックスで混合しながら
この溶液 500mLをＨＲＰ／ＤＭＦ ４′−ＨＡ溶液に滴
下した。カルバマゼピン／ＨＲＰのモル比は 100/1であ
った。予め42℃で１時間穏やかに振盪しながら水浴中で
インキュベーションを行った。更に反応容器を濯ぐため
に使用したＤＭＦ ４′−ＨＡ／ 0.1Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１）１mLと共に、試料をSpectrapor #2 透析管に
移した。反応混合物を透析し、そして例１０に記載した
ように保存した。
をＤＭＦ ４′−ＨＡに溶解して 22.72mg/mL の溶液
（4.16×10-2Ｍ）を得た。ボルテックスで混合しながら
この溶液 500mLをＨＲＰ／ＤＭＦ ４′−ＨＡ溶液に滴
下した。カルバマゼピン／ＨＲＰのモル比は 100/1であ
った。予め42℃で１時間穏やかに振盪しながら水浴中で
インキュベーションを行った。更に反応容器を濯ぐため
に使用したＤＭＦ ４′−ＨＡ／ 0.1Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１）１mLと共に、試料をSpectrapor #2 透析管に
移した。反応混合物を透析し、そして例１０に記載した
ように保存した。
【００６１】例１２ Ｎ−｛４−〔４−（３−スクシンイミドキシカルボニル
プロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバ
マゼピン及びアミン富化ＨＲＰの接合体（標識Ｃ）；並
びに Ｎ−｛４−〔３−（４−スクシンイミドキシカルボニル
ブチルアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチル｝カ
ルバマゼピン−アミン富化ＨＲＰの接合体（標識Ｄ） 例１０に記載したようにアミン富化ＨＲＰを調整し、そ
して Amicon StirredUltrafiltration Cells 中の Diaf
lo Ultrafilters YM30 フィルター（30,000分子量カッ
トオフ）を用いて、アミン富化ＨＲＰの試料を 0.1Ｍ
ＥＰＰＳ緩衝剤，pH 8.0，に交換した。次いでこの試料
を3.18mLまで希釈して最終濃度10.00 mg/mL （ 2.5×10
-4Ｍ）の溶液を生成した。
プロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバ
マゼピン及びアミン富化ＨＲＰの接合体（標識Ｃ）；並
びに Ｎ−｛４−〔３−（４−スクシンイミドキシカルボニル
ブチルアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチル｝カ
ルバマゼピン−アミン富化ＨＲＰの接合体（標識Ｄ） 例１０に記載したようにアミン富化ＨＲＰを調整し、そ
して Amicon StirredUltrafiltration Cells 中の Diaf
lo Ultrafilters YM30 フィルター（30,000分子量カッ
トオフ）を用いて、アミン富化ＨＲＰの試料を 0.1Ｍ
ＥＰＰＳ緩衝剤，pH 8.0，に交換した。次いでこの試料
を3.18mLまで希釈して最終濃度10.00 mg/mL （ 2.5×10
-4Ｍ）の溶液を生成した。
【００６２】アミン富化ＨＲＰ溶液１mLを２つの小バイ
アル各々に添加した。ジメチルホルムアミド，Aldrich
22,705-6, 500 mLをバイアルに添加し、ボルテックスに
かけ、そして42℃の水浴に少なくとも15分間入れた。
アル各々に添加した。ジメチルホルムアミド，Aldrich
22,705-6, 500 mLをバイアルに添加し、ボルテックスに
かけ、そして42℃の水浴に少なくとも15分間入れた。
【００６３】同時に、｛〔（スクシンイミドキシカルボ
ニルプロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カ
ルバマゼピンをＤＭＦに溶解して 30.05mg/mL の溶液
（ 2.5×10-2Ｍ）を得た。標識Ｃを調整するために、ボ
ルテックスで混合しながらこの溶液 500mLをＨＲＰ／Ｄ
ＭＦ溶液に滴下した。標識Ｄを同様の方法で調整した
が、しかしながら、薬剤類似体、Ｎ−｛４−〔３−（３
−スクシンイミドキシカルボニルブチルアミド）プロピ
ルアミノカルボニル〕ブチル｝カルバマゼピンをＤＭＦ
に溶解して 30.15mg/mL の溶液（ 2.5×10-2Ｍ）を得
た。両標識についてのカルバマゼピン／ＨＲＰのモル比
は 100/1であった。予め42℃で１時間穏やかに振盪しな
がら水浴中でインキュベーションを行った。更に反応容
器を濯ぐために使用したＤＭＦ／ 0.1Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１）１mLと共に、試料をSpectrapor #2 透析管に
移した。
ニルプロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カ
ルバマゼピンをＤＭＦに溶解して 30.05mg/mL の溶液
（ 2.5×10-2Ｍ）を得た。標識Ｃを調整するために、ボ
ルテックスで混合しながらこの溶液 500mLをＨＲＰ／Ｄ
ＭＦ溶液に滴下した。標識Ｄを同様の方法で調整した
が、しかしながら、薬剤類似体、Ｎ−｛４−〔３−（３
−スクシンイミドキシカルボニルブチルアミド）プロピ
ルアミノカルボニル〕ブチル｝カルバマゼピンをＤＭＦ
に溶解して 30.15mg/mL の溶液（ 2.5×10-2Ｍ）を得
た。両標識についてのカルバマゼピン／ＨＲＰのモル比
は 100/1であった。予め42℃で１時間穏やかに振盪しな
がら水浴中でインキュベーションを行った。更に反応容
器を濯ぐために使用したＤＭＦ／ 0.1Ｍ ＥＰＰＳ
（１：１）１mLと共に、試料をSpectrapor #2 透析管に
移した。
【００６４】各反応混合物を以下のように透析した。 ａ）ＤＭＦ／ 0.1Ｍ ＥＰＰＳ，１Ｌ，pH 8.0（１：
１），42℃，１時間。 ｂ）透析条件ａ）を１回繰り返した。 ｃ） 0.1％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する
0.1Ｍ ＥＰＰＳ,2.0Ｌ，pH 8.0，８℃，一晩。 ｄ）0.02Ｍ ＭＯＰＳ,2.0Ｌ，pH 7.0，８℃，８時間 ｅ）透析条件ｄ）を２回，一晩及び８時間，繰り返し
た。 透析に続いて、0.02％メルチオレートを防腐剤として添
加し、そして標識を冷蔵保存した。
１），42℃，１時間。 ｂ）透析条件ａ）を１回繰り返した。 ｃ） 0.1％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する
0.1Ｍ ＥＰＰＳ,2.0Ｌ，pH 8.0，８℃，一晩。 ｄ）0.02Ｍ ＭＯＰＳ,2.0Ｌ，pH 7.0，８℃，８時間 ｅ）透析条件ｄ）を２回，一晩及び８時間，繰り返し
た。 透析に続いて、0.02％メルチオレートを防腐剤として添
加し、そして標識を冷蔵保存した。
【００６５】例１３ カルバマゼピン類似体−アミン富化ＨＲＰ標識Ｅ，Ｆ及
びＧの調整 Ｎ−〔６−（４−スクシンイミドキシカルボニルブチル
アミド）ヘキシル〕カルバマゼピン及びアミン富化ＨＲ
Ｐの接合体（標識Ｅ）； Ｎ−｛４−〔４−（３−スクシンイミドキシカルボニル
プロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバ
マゼピン及びアミン富化ＨＲＰの接合体（標識Ｆ）；並
びに Ｎ−｛４−〔３−（４−スクシンイミドキシカルボニル
ブチルアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチル｝カ
ルバマゼピン及びアミン富化ＨＲＰの接合体（標識Ｇ）
びＧの調整 Ｎ−〔６−（４−スクシンイミドキシカルボニルブチル
アミド）ヘキシル〕カルバマゼピン及びアミン富化ＨＲ
Ｐの接合体（標識Ｅ）； Ｎ−｛４−〔４−（３−スクシンイミドキシカルボニル
プロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバ
マゼピン及びアミン富化ＨＲＰの接合体（標識Ｆ）；並
びに Ｎ−｛４−〔３−（４−スクシンイミドキシカルボニル
ブチルアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチル｝カ
ルバマゼピン及びアミン富化ＨＲＰの接合体（標識Ｇ）
【００６６】例１０に記載したようにアミン富化ＨＲＰ
を調整し、そして 0.1Ｍ ＥＰＰＳ緩衝剤，pH 8.0，に
交換すると、10.00 mg/mL の溶液（2.48×10-4Ｍ）が数
mL得られた。３種の標識を各々アミン富化ＨＲＰ１mLで
調整した。ＤＭＳＯ 500mLを、ボルテックスで混合しな
がら各試料に滴下した。試料を、2400rpm で振盪しなが
ら少なくとも20分間室温で予めインキュベーションし
た。
を調整し、そして 0.1Ｍ ＥＰＰＳ緩衝剤，pH 8.0，に
交換すると、10.00 mg/mL の溶液（2.48×10-4Ｍ）が数
mL得られた。３種の標識を各々アミン富化ＨＲＰ１mLで
調整した。ＤＭＳＯ 500mLを、ボルテックスで混合しな
がら各試料に滴下した。試料を、2400rpm で振盪しなが
ら少なくとも20分間室温で予めインキュベーションし
た。
【００６７】同時に、Ｎ−〔６−（４−スクシンイミド
キシカルボニルブチルアミド）ヘキシル〕カルバマゼピ
ンをＤＭＳＯに溶解して 27.08mg/mL の溶液（2.48×10
-2Ｍ）を得た。この溶液 500mLを先に調整したＨＲＰ／
ＤＭＳＯ溶液の１つに添加することにより標識Ｅを調整
した。これは、ボルテックスで混合しながら滴下した。
標識Ｆ及びＧを前記の通りに調整したが、しかし溶液は
以下のように調整した。 Ｎ−｛４−〔４−（３−スクシンイミドキシカルボニル
プロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバ
マゼピンを溶解して 29.81mg/mL （2.48×10-2Ｍ）の溶
液を調整し、そして標識Ｆを調整するために使用し、Ｎ
−｛４−〔３−（４−スクシンイミドキシカルボニルブ
チルアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチル｝カル
バマゼピンを溶解して 29.81mg/mL （2.48×10-2Ｍ）の
溶液を調整し、そして標識Ｇを調整するために使用し
た。３種の標識のモル比はすべてカルバマゼピン対ＨＲ
Ｐ 100/1であった。
キシカルボニルブチルアミド）ヘキシル〕カルバマゼピ
ンをＤＭＳＯに溶解して 27.08mg/mL の溶液（2.48×10
-2Ｍ）を得た。この溶液 500mLを先に調整したＨＲＰ／
ＤＭＳＯ溶液の１つに添加することにより標識Ｅを調整
した。これは、ボルテックスで混合しながら滴下した。
標識Ｆ及びＧを前記の通りに調整したが、しかし溶液は
以下のように調整した。 Ｎ−｛４−〔４−（３−スクシンイミドキシカルボニル
プロピオニル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバ
マゼピンを溶解して 29.81mg/mL （2.48×10-2Ｍ）の溶
液を調整し、そして標識Ｆを調整するために使用し、Ｎ
−｛４−〔３−（４−スクシンイミドキシカルボニルブ
チルアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチル｝カル
バマゼピンを溶解して 29.81mg/mL （2.48×10-2Ｍ）の
溶液を調整し、そして標識Ｇを調整するために使用し
た。３種の標識のモル比はすべてカルバマゼピン対ＨＲ
Ｐ 100/1であった。
【００６８】2400rpm で振盪しながら室温で４時間イン
キュベーションを行った。更に反応容器を濯ぐための透
析液１mLと共に、試料を各々Spectrapor #2 透析管に移
した。これらの標識を0.02Ｍ ＭＯＰＳ緩衝剤，pH 7.
0，５〜10℃で透析した。この透析条件を３回、各回２
〜３Ｌの緩衝剤を用いて繰り返した。透析に続いて、0.
02％メルチオレートを防腐剤として添加し、そして標識
を冷蔵保存した。
キュベーションを行った。更に反応容器を濯ぐための透
析液１mLと共に、試料を各々Spectrapor #2 透析管に移
した。これらの標識を0.02Ｍ ＭＯＰＳ緩衝剤，pH 7.
0，５〜10℃で透析した。この透析条件を３回、各回２
〜３Ｌの緩衝剤を用いて繰り返した。透析に続いて、0.
02％メルチオレートを防腐剤として添加し、そして標識
を冷蔵保存した。
【００６９】本発明のイムノアッセイは、溶液状態で又
は乾式分析要素を用いて実施できる。一般的には乾式分
析要素がより都合が良いと見なされる。それらは単一も
しくは多層であるか、又はそのような層の内部に複数の
区画を有する層の組み合わせであってもよい。通常、要
素は輻射線透過性支持体、１つ以上の試薬層、好ましく
は特定のカルバマゼピン分析物に対する抗体が固定され
たビーズを含んで成る粒状展開層を含んで成ることがで
きる。
は乾式分析要素を用いて実施できる。一般的には乾式分
析要素がより都合が良いと見なされる。それらは単一も
しくは多層であるか、又はそのような層の内部に複数の
区画を有する層の組み合わせであってもよい。通常、要
素は輻射線透過性支持体、１つ以上の試薬層、好ましく
は特定のカルバマゼピン分析物に対する抗体が固定され
たビーズを含んで成る粒状展開層を含んで成ることがで
きる。
【００７０】層は、当該技術分野で周知の塗布技術を使
用して塗布できる。例えば、米国特許第 2,761,417号明
細書に記載されたタイプのスライド押出ホッパーは、少
なくとも１つの層が固定化された抗体ビーズを担持する
ポリマー粒子を含んで成る、複数の層の同時塗布の際に
有利であることが多い。より詳細には、ビーズを含有す
る塗布組成物を、スライド押出ホッパーの押出スロット
を介して注ぎ入れ、同時に、所望であれば、またビーズ
を含有してもよい第２塗布組成物の層をスライド押出ホ
ッパーのスライド表面下に流すことにより、多層要素を
塗布できる。
用して塗布できる。例えば、米国特許第 2,761,417号明
細書に記載されたタイプのスライド押出ホッパーは、少
なくとも１つの層が固定化された抗体ビーズを担持する
ポリマー粒子を含んで成る、複数の層の同時塗布の際に
有利であることが多い。より詳細には、ビーズを含有す
る塗布組成物を、スライド押出ホッパーの押出スロット
を介して注ぎ入れ、同時に、所望であれば、またビーズ
を含有してもよい第２塗布組成物の層をスライド押出ホ
ッパーのスライド表面下に流すことにより、多層要素を
塗布できる。
【００７１】抗体が固定される粒状層は多孔質である。
このような層に使用するための材料は、乾式分析要素の
製造分野では周知である。好ましい粒状層はビーズ展開
層（ＢＳＬ）である。この層は、希釈した又は希釈して
いない試験試料（例えば、１〜 100mL）を収容するよう
に、本発明の要素において使用に適する多孔性を有する
ように容易に構成できる。好ましくは展開層が、多孔性
が、区画を含んで成る粒子間の相互に連結した空間によ
り創造される等方性多孔質である。等方性多孔質とは、
展開層が、塗布された流体を放射状に層を介して均一に
展開することを意味する。
このような層に使用するための材料は、乾式分析要素の
製造分野では周知である。好ましい粒状層はビーズ展開
層（ＢＳＬ）である。この層は、希釈した又は希釈して
いない試験試料（例えば、１〜 100mL）を収容するよう
に、本発明の要素において使用に適する多孔性を有する
ように容易に構成できる。好ましくは展開層が、多孔性
が、区画を含んで成る粒子間の相互に連結した空間によ
り創造される等方性多孔質である。等方性多孔質とは、
展開層が、塗布された流体を放射状に層を介して均一に
展開することを意味する。
【００７２】ビーズ展開層を包含する有用な粒状展開層
が、米国特許第 4,670,381号、同第4,258,001号及び同
第 4,430,436号明細書に開示されている。要素の粒状層
は適当な支持体上に置かれる。このような支持体は、い
ずれか適当な寸法安定性であり、そして好ましくは非孔
質且つ 200〜900 nm間の波長の電磁輻射線を透過する透
明（すなわち、輻射線透過性）な物質であることができ
る。特定の要素についての支持体の選択は、意図する検
出方式（反射、透過又は蛍光分光法）と適合性であるべ
きである。有用な支持体材料には、ポリスチレン、ポリ
エステル類〔例えば、ポリ（エチレンテレフタレー
ト）〕、ポリカーボネート類及びセルロースエステル類
（例えば、酢酸セルロース）などが挙げられる。
が、米国特許第 4,670,381号、同第4,258,001号及び同
第 4,430,436号明細書に開示されている。要素の粒状層
は適当な支持体上に置かれる。このような支持体は、い
ずれか適当な寸法安定性であり、そして好ましくは非孔
質且つ 200〜900 nm間の波長の電磁輻射線を透過する透
明（すなわち、輻射線透過性）な物質であることができ
る。特定の要素についての支持体の選択は、意図する検
出方式（反射、透過又は蛍光分光法）と適合性であるべ
きである。有用な支持体材料には、ポリスチレン、ポリ
エステル類〔例えば、ポリ（エチレンテレフタレー
ト）〕、ポリカーボネート類及びセルロースエステル類
（例えば、酢酸セルロース）などが挙げられる。
【００７３】要素は、１つ以上の更なる層、例えば、別
の必要な添加剤及びカプリング酵素などを含有する別個
の又は合わさった試薬／展開層及びゼラチン／緩衝剤層
を含んで成ることができる。要素のゼラチン／緩衝剤層
もしくは試薬層又は展開層は、１つ以上の合成又は天然
のバインダー材料、例えば、ゼラチンもしくは別の天然
産コロイド類、ホモポリマー類及びコポリマー類例え
ば、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリド
ン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ
（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリド
ン）、及び同様のコポリマー類の中に分散せしめた１つ
以上の試薬を含んで成る指示薬組成物を含有する。
の必要な添加剤及びカプリング酵素などを含有する別個
の又は合わさった試薬／展開層及びゼラチン／緩衝剤層
を含んで成ることができる。要素のゼラチン／緩衝剤層
もしくは試薬層又は展開層は、１つ以上の合成又は天然
のバインダー材料、例えば、ゼラチンもしくは別の天然
産コロイド類、ホモポリマー類及びコポリマー類例え
ば、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリド
ン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ
（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリド
ン）、及び同様のコポリマー類の中に分散せしめた１つ
以上の試薬を含んで成る指示薬組成物を含有する。
【００７４】別の任意の層、例えば、下塗り層、輻射線
遮断層などは、所望であれば含めることができる。要素
のすべての層が互いに流体接触状態でなければならず、
これは流体及び試薬類並びに流体中の未複合反応生成物
類が隣接した層の重なった領域間を通過できることを意
味する。要素の層は、界面活性剤、増粘剤、緩衝剤、硬
化剤、酸化防止剤、カプラー溶剤及び当該技術分野で既
知である別の材料を包含する、様々な別の所望のしかし
任意の成分を含有できる。またこれらの成分の量は当業
者の技術範囲内である。
遮断層などは、所望であれば含めることができる。要素
のすべての層が互いに流体接触状態でなければならず、
これは流体及び試薬類並びに流体中の未複合反応生成物
類が隣接した層の重なった領域間を通過できることを意
味する。要素の層は、界面活性剤、増粘剤、緩衝剤、硬
化剤、酸化防止剤、カプラー溶剤及び当該技術分野で既
知である別の材料を包含する、様々な別の所望のしかし
任意の成分を含有できる。またこれらの成分の量は当業
者の技術範囲内である。
【００７５】要素は、流体中、例えば、生物学的流体
（例えば、全血、血清、血漿、尿、脊髄液、ヒトもしく
は動物の組織の懸濁液、糞便、唾液及びリンパ液など）
中の低濃度のカルバマゼピンを検出するために使用でき
る。カルバマゼピンは、10-15モルの低濃度で検出で
き、そして最も一般的には約 5.0×10-6〜約10-4モルの
濃度で検出できる。
（例えば、全血、血清、血漿、尿、脊髄液、ヒトもしく
は動物の組織の懸濁液、糞便、唾液及びリンパ液など）
中の低濃度のカルバマゼピンを検出するために使用でき
る。カルバマゼピンは、10-15モルの低濃度で検出で
き、そして最も一般的には約 5.0×10-6〜約10-4モルの
濃度で検出できる。
【００７６】アッセイは規定されたカルバマゼピン類似
体に付着できるいずれかの適当な標識を使用して実施で
きる。有用な標識には、放射性タグ類、色素類、蛍光剤
類、酵素類、酵素基質類、酵素阻害剤類、アロステリッ
ク・エフェクター類、コファクター類、補酵素類及び別
の既知酵素モジュレーター類が挙げられる。酵素、例え
ば、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ類、例
えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアミン富化西洋
ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ並
びにガラクトシダーゼが好ましい標識である。
体に付着できるいずれかの適当な標識を使用して実施で
きる。有用な標識には、放射性タグ類、色素類、蛍光剤
類、酵素類、酵素基質類、酵素阻害剤類、アロステリッ
ク・エフェクター類、コファクター類、補酵素類及び別
の既知酵素モジュレーター類が挙げられる。酵素、例え
ば、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ類、例
えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアミン富化西洋
ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ並
びにガラクトシダーゼが好ましい標識である。
【００７７】酵素標識が使用される場合には、酵素につ
いての基質が要素中に存在するか又は現像液中に存在し
てそれに添加される。基質は、液体試料の前に又はそれ
と同時にあるいはバインディング反応の後に要素に添加
できる。所定の標識についての適当な基質を決定するこ
とは、臨床化学分野の通常業者の技術範囲内である。基
質は、酵素標識により直接作用を受ける物質であるか、
又は標識の酵素反応を包含する一連の反応に含まれる物
質であることができる。例えば、酵素標識がペルオキシ
ダーゼであれば、基質は過酸化水素である。具体例とし
てグルコースオキシダーゼを用いる場合には、0.01モル
／m2、そして好ましくは 0.001〜 0.1モル／m2となるよ
うに、一般的には基質グルコースを試薬層中に存在せし
めるか、又は現像液に添加する。当業者は、特定の基質
の量を、アッセイに使用される酵素標識の量についてど
のように調節すればよいのか知っている。
いての基質が要素中に存在するか又は現像液中に存在し
てそれに添加される。基質は、液体試料の前に又はそれ
と同時にあるいはバインディング反応の後に要素に添加
できる。所定の標識についての適当な基質を決定するこ
とは、臨床化学分野の通常業者の技術範囲内である。基
質は、酵素標識により直接作用を受ける物質であるか、
又は標識の酵素反応を包含する一連の反応に含まれる物
質であることができる。例えば、酵素標識がペルオキシ
ダーゼであれば、基質は過酸化水素である。具体例とし
てグルコースオキシダーゼを用いる場合には、0.01モル
／m2、そして好ましくは 0.001〜 0.1モル／m2となるよ
うに、一般的には基質グルコースを試薬層中に存在せし
めるか、又は現像液に添加する。当業者は、特定の基質
の量を、アッセイに使用される酵素標識の量についてど
のように調節すればよいのか知っている。
【００７８】ある種の標識、例えば、酵素類、コファク
ター類、酵素基質類もしくは酵素モジュレーター類を使
用する場合には、試薬層は、標識の反応の結果として検
出可能な種を提供する１つ以上の試薬を含んで成る指示
薬組成物を含有する。好ましくは指示薬組成物が、酵素
標識リガンド類似体と基質との酵素反応の結果として比
色的に検出可能な種を提供する比色指示薬組成物であ
る。
ター類、酵素基質類もしくは酵素モジュレーター類を使
用する場合には、試薬層は、標識の反応の結果として検
出可能な種を提供する１つ以上の試薬を含んで成る指示
薬組成物を含有する。好ましくは指示薬組成物が、酵素
標識リガンド類似体と基質との酵素反応の結果として比
色的に検出可能な種を提供する比色指示薬組成物であ
る。
【００７９】指示薬組成物は、酵素反応において検出可
能な色素を生成する単一化合物であるか、又は色素を生
成する試薬類の組み合わせでありうる。例えば、基質と
してグルコースが、そして酵素標識としてグルコースオ
キシダーゼが使用される場合には、比色指示薬組成物
は、反応して色素を提供する酸化可能な化合物及びカプ
ラーを含むことができる。あるいは組成物が、ロイコ色
素及びペルオキシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ
がグルコースをグルコン酸に転化するときに生成される
過酸化水素の形成の結果として検出可能な色素を生成す
る別の適当な過酸化的化合物を含有できる。有用なロイ
コ色素は当該技術分野で既知であり、それらとしては、
例えば、米国特許第 4,089,747号及び同第 4,670,385号
明細書に記載されるものが挙げられる。比色指示薬組成
物及びその様々な成分の特定の量は、当業者の技術範囲
内である。
能な色素を生成する単一化合物であるか、又は色素を生
成する試薬類の組み合わせでありうる。例えば、基質と
してグルコースが、そして酵素標識としてグルコースオ
キシダーゼが使用される場合には、比色指示薬組成物
は、反応して色素を提供する酸化可能な化合物及びカプ
ラーを含むことができる。あるいは組成物が、ロイコ色
素及びペルオキシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ
がグルコースをグルコン酸に転化するときに生成される
過酸化水素の形成の結果として検出可能な色素を生成す
る別の適当な過酸化的化合物を含有できる。有用なロイ
コ色素は当該技術分野で既知であり、それらとしては、
例えば、米国特許第 4,089,747号及び同第 4,670,385号
明細書に記載されるものが挙げられる。比色指示薬組成
物及びその様々な成分の特定の量は、当業者の技術範囲
内である。
【００８０】イムノアッセイは手動又は自動で実施でき
る。一般的には、液体中のリガンドの量は、供給ロー
ル、チップパケットもしくは別の供給源から要素を取り
出し、そして展開層の限定領域を液体の試料、例えば、
１〜 100mLと物理的に接触せしめることにより検出され
る。接触せしめられる限定領域は、一般的にはわずか 1
00mm2 である。
る。一般的には、液体中のリガンドの量は、供給ロー
ル、チップパケットもしくは別の供給源から要素を取り
出し、そして展開層の限定領域を液体の試料、例えば、
１〜 100mLと物理的に接触せしめることにより検出され
る。接触せしめられる限定領域は、一般的にはわずか 1
00mm2 である。
【００８１】リガンドの量は、直接的に複合リガンド類
似体を検出するための、又は酵素標識及び基質の酵素反
応の結果として形成される検出可能な種を検出するため
の適当な装置を介して要素を通過せしめることにより検
出される。例えば、これらの種は、一般的に知られてい
る方法を用いて適当な放射測定、蛍光測定又は分光測定
装置で検出できる。酵素反応では、例えば、試験試料と
接触せしめた限定領域の中心における反射もしくは透過
濃度又は蛍光を測定することにより、得られた生成物が
検出される。一般的には、競合アッセイについては、測
定される領域は直径３〜５mmである。液体試料中のリガ
ンドの量は、限定領域の中心で測定される標識の量に対
して反比例である。好ましい態様では、複合していない
リガンドから複合したリガンドを最大限分離するため
に、別個の現像工程が必要とされる。一般的には、標識
の測定は、試料接触及び展開又は現像液の適用後５〜 1
80秒後に実施される。
似体を検出するための、又は酵素標識及び基質の酵素反
応の結果として形成される検出可能な種を検出するため
の適当な装置を介して要素を通過せしめることにより検
出される。例えば、これらの種は、一般的に知られてい
る方法を用いて適当な放射測定、蛍光測定又は分光測定
装置で検出できる。酵素反応では、例えば、試験試料と
接触せしめた限定領域の中心における反射もしくは透過
濃度又は蛍光を測定することにより、得られた生成物が
検出される。一般的には、競合アッセイについては、測
定される領域は直径３〜５mmである。液体試料中のリガ
ンドの量は、限定領域の中心で測定される標識の量に対
して反比例である。好ましい態様では、複合していない
リガンドから複合したリガンドを最大限分離するため
に、別個の現像工程が必要とされる。一般的には、標識
の測定は、試料接触及び展開又は現像液の適用後５〜 1
80秒後に実施される。
【００８２】
【実施例】以下の例は、イムノアッセイ及び乾式イムノ
アッセイ要素における新規標識カルバマゼピン類似体の
利用を具体的に説明するものである。例１４ 調整例１０〜１３，標識Ａ〜Ｇ由来のカルバマゼピン−
アミン富化ＨＲＰ接合体の挙動。カルバマゼピンモノク
ローナル抗体（Kallestad prod. no. 330509）を平均直
径0.47mmのポリ〔スチレン−コ−４−（２−クロロエチ
ルスルホニルメチル）スチレン〕（重量比 90/10）ポリ
マービーズに共有結合せしめることにより、固定化抗体
ビーズを製造した。
アッセイ要素における新規標識カルバマゼピン類似体の
利用を具体的に説明するものである。例１４ 調整例１０〜１３，標識Ａ〜Ｇ由来のカルバマゼピン−
アミン富化ＨＲＰ接合体の挙動。カルバマゼピンモノク
ローナル抗体（Kallestad prod. no. 330509）を平均直
径0.47mmのポリ〔スチレン−コ−４−（２−クロロエチ
ルスルホニルメチル）スチレン〕（重量比 90/10）ポリ
マービーズに共有結合せしめることにより、固定化抗体
ビーズを製造した。
【００８３】カルバマゼピンＨＲＰ標識を結合せしめる
ための固定化カルバマゼピン抗体の能力を、下記のよう
に測定した。抗体バインディング部位 242〜0.242 nM間
の抗体濃度となるように、 0.1％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで抗体ビーズを連続的に希
釈した。ビーズ希釈液を等容量の接合体、カルバマゼピ
ン−ＨＲＰ標識10×10-11 Ｍと混合した。１時間インキ
ュベーションした後、遠心分離してビーズをペレット状
にした。懸濁液の試料（ 100mL）を基質（ｏ−フェニレ
ンジアミン／H2O2） 100mLと混合した。 450nmでの発色
速度を標準のものと比較して、溶液中に残留するカルバ
マゼピン−ＨＲＰ標識の量を計算した。バインディング
部位 121nMの最高抗体濃度で固定化抗体に結合した標識
の量を報告する。また、標識の50％が結合する抗体バイ
ンディング部位の濃度を報告する。
ための固定化カルバマゼピン抗体の能力を、下記のよう
に測定した。抗体バインディング部位 242〜0.242 nM間
の抗体濃度となるように、 0.1％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで抗体ビーズを連続的に希
釈した。ビーズ希釈液を等容量の接合体、カルバマゼピ
ン−ＨＲＰ標識10×10-11 Ｍと混合した。１時間インキ
ュベーションした後、遠心分離してビーズをペレット状
にした。懸濁液の試料（ 100mL）を基質（ｏ−フェニレ
ンジアミン／H2O2） 100mLと混合した。 450nmでの発色
速度を標準のものと比較して、溶液中に残留するカルバ
マゼピン−ＨＲＰ標識の量を計算した。バインディング
部位 121nMの最高抗体濃度で固定化抗体に結合した標識
の量を報告する。また、標識の50％が結合する抗体バイ
ンディング部位の濃度を報告する。
【００８４】
【表１】
【００８５】長い連結鎖を有し且つピペラジンを含有す
る標識は、抗体により良好に認識される。連結鎖の長さ
が増大すると標識結合パーセントが増大した。ＤＭＳＯ
を用いて製造した標識Ｅは、標識Ｂよりも良好な挙動を
示した。ＤＭＳＯを用いた製品は、ＤＭＦで製造したも
のよりも良好な挙動を示した。ＤＭＳＯは、より簡単な
透析精製を許容し、そして改良された又は同じような挙
動を示すものを与える。
る標識は、抗体により良好に認識される。連結鎖の長さ
が増大すると標識結合パーセントが増大した。ＤＭＳＯ
を用いて製造した標識Ｅは、標識Ｂよりも良好な挙動を
示した。ＤＭＳＯを用いた製品は、ＤＭＦで製造したも
のよりも良好な挙動を示した。ＤＭＳＯは、より簡単な
透析精製を許容し、そして改良された又は同じような挙
動を示すものを与える。
【００８６】例１５ カルバマゼピン（ＣＢＺ）につてのエンザイム・イムノ
アッセイにおける伸長連結鎖を用いて製造した接合体カ
ルバマゼピン−ＨＲＰ標識の使用。本例は、本発明の分
析要素の製造方法及び薬剤、カルバマゼピンを検出する
ための競合バインディングアッセイにおけるその使用を
具体的に説明するものである。米国特許出願第 4,670,3
81号、同第 4,258,001号及び同第 4,430,436号明細書に
記載される既知技術を用いて以下の構造を有するよう
に、イムノアッセイ要素を製造した。
アッセイにおける伸長連結鎖を用いて製造した接合体カ
ルバマゼピン−ＨＲＰ標識の使用。本例は、本発明の分
析要素の製造方法及び薬剤、カルバマゼピンを検出する
ための競合バインディングアッセイにおけるその使用を
具体的に説明するものである。米国特許出願第 4,670,3
81号、同第 4,258,001号及び同第 4,430,436号明細書に
記載される既知技術を用いて以下の構造を有するよう
に、イムノアッセイ要素を製造した。
【００８７】
【表２】
【００８８】＊1987年８月３日に出願した米国特許出願
第 081,206号明細書に記載された方法により、抗体を平
均直径約0.47mmのポリ〔スチレン−コ−４−（２−クロ
ロエチルスルホニルメチル）スチレン〕（重量比 90/1
0）ポリマービーズ上に固定した。ＣＢＺ及びＣＢＺ−
ＨＲＰ標識（調整例１２由来の標識Ｃ）を含有する一連
のヒト血清ベースキャリブレーターを調整した。ＣＢＺ
の濃度を 0.0〜18.7mg/mLに変化させた。接合体ＣＢＺ
−ＨＲＰ標識を添加して最終濃度２nMとした。
第 081,206号明細書に記載された方法により、抗体を平
均直径約0.47mmのポリ〔スチレン−コ−４−（２−クロ
ロエチルスルホニルメチル）スチレン〕（重量比 90/1
0）ポリマービーズ上に固定した。ＣＢＺ及びＣＢＺ−
ＨＲＰ標識（調整例１２由来の標識Ｃ）を含有する一連
のヒト血清ベースキャリブレーターを調整した。ＣＢＺ
の濃度を 0.0〜18.7mg/mLに変化させた。接合体ＣＢＺ
−ＨＲＰ標識を添加して最終濃度２nMとした。
【００８９】一連のＣＢＺ標準（アリコート10mL）を、
一連の分析要素の展開層上にスポットした。37℃で５分
間インキュベーションした後、過酸化水素（0.03％）、
リン酸ナトリウム緩衝剤（0.01Ｍ，pH 6.8）、４′−ヒ
ドロキシアセトアニリド（５mM) 、ジエチレントリアミ
ン五酢酸（10mM) 及び 0.1％ １−ヘキサデシルピリジ
ニウムクロリドを含んで成る洗浄溶液（10mL）を添加し
て、色素生成を開始させた。約１分後、反射率濃度（Ｄ
r ）を37℃， 680nmで領域の中心で測定した。Ｄr 値を
Clapper-Williams 変換によりＤt に変換した。60秒間
に亘るＤt における変化を計算した。結果を以下に示
す。
一連の分析要素の展開層上にスポットした。37℃で５分
間インキュベーションした後、過酸化水素（0.03％）、
リン酸ナトリウム緩衝剤（0.01Ｍ，pH 6.8）、４′−ヒ
ドロキシアセトアニリド（５mM) 、ジエチレントリアミ
ン五酢酸（10mM) 及び 0.1％ １−ヘキサデシルピリジ
ニウムクロリドを含んで成る洗浄溶液（10mL）を添加し
て、色素生成を開始させた。約１分後、反射率濃度（Ｄ
r ）を37℃， 680nmで領域の中心で測定した。Ｄr 値を
Clapper-Williams 変換によりＤt に変換した。60秒間
に亘るＤt における変化を計算した。結果を以下に示
す。
【００９０】
【表３】 結果は、望ましい動的範囲（dynamic range)を越える十
分な速度変化が存在することを示す。治療範囲は８〜12
mg/mL である。
分な速度変化が存在することを示す。治療範囲は８〜12
mg/mL である。
【００９１】例１６ カルバマゼピン（ＣＢＺ）につてのエンザイム・イムノ
アッセイにおける伸長連結鎖を用いて製造した接合体カ
ルバマゼピン−ＨＲＰ標識の使用。本例は、本発明の分
析要素の製造方法及び薬剤、カルバマゼピンを検出する
ための競合バインディングアッセイにおけるその使用を
具体的に説明するものである。既知技術を用いて以下の
構造を有するように要素を製造した。
アッセイにおける伸長連結鎖を用いて製造した接合体カ
ルバマゼピン−ＨＲＰ標識の使用。本例は、本発明の分
析要素の製造方法及び薬剤、カルバマゼピンを検出する
ための競合バインディングアッセイにおけるその使用を
具体的に説明するものである。既知技術を用いて以下の
構造を有するように要素を製造した。
【００９２】
【表４】
【００９３】＊米国特許出願第 539,774号及び同第 65
4,112号明細書に記載された方法により、抗体16.7.1を
ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）
プロピオン酸〕（モル比 97.6/2.4 ；重量比 95/5 ）ビ
ーズ上に固定した。ＣＢＺ及びＣＢＺ−ＨＲＰ標識（調
整例１２由来の標識Ｄ）を含有する一連のヒト血清ベー
スキャリブレーターを調整した。ＣＢＺの濃度を 0.0〜
18.7mg/mLに変化させた。ＣＢＺ−ＨＲＰ標識を添加し
て最終濃度２nMとした。
4,112号明細書に記載された方法により、抗体16.7.1を
ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）
プロピオン酸〕（モル比 97.6/2.4 ；重量比 95/5 ）ビ
ーズ上に固定した。ＣＢＺ及びＣＢＺ−ＨＲＰ標識（調
整例１２由来の標識Ｄ）を含有する一連のヒト血清ベー
スキャリブレーターを調整した。ＣＢＺの濃度を 0.0〜
18.7mg/mLに変化させた。ＣＢＺ−ＨＲＰ標識を添加し
て最終濃度２nMとした。
【００９４】一連のＣＢＺ標準（アリコート10mL）を、
一連の分析要素の展開層上にスポットした。37℃で５分
間インキュベーションした後、過酸化水素（0.03％）、
リン酸ナトリウム緩衝剤（0.01Ｍ，pH 6.8）、４′−ヒ
ドロキシアセトアニリド（５mM) 、ジエチレントリアミ
ン五酢酸（10mM) 及び 0.1％ １−ヘキサデシルピリジ
ニウムクロリドを含んで成る洗浄溶液（10mL）を添加し
て、色素生成を開始させた。約１分後、反射率濃度（Ｄ
r ）を37℃， 680nmで領域の中心で測定した。Ｄr 値を
Clapper-Williams 変換によりＤt に変換した。60秒間
に亘るＤt における変化を計算した。結果を以下に示
す。
一連の分析要素の展開層上にスポットした。37℃で５分
間インキュベーションした後、過酸化水素（0.03％）、
リン酸ナトリウム緩衝剤（0.01Ｍ，pH 6.8）、４′−ヒ
ドロキシアセトアニリド（５mM) 、ジエチレントリアミ
ン五酢酸（10mM) 及び 0.1％ １−ヘキサデシルピリジ
ニウムクロリドを含んで成る洗浄溶液（10mL）を添加し
て、色素生成を開始させた。約１分後、反射率濃度（Ｄ
r ）を37℃， 680nmで領域の中心で測定した。Ｄr 値を
Clapper-Williams 変換によりＤt に変換した。60秒間
に亘るＤt における変化を計算した。結果を以下に示
す。
【００９５】
【表５】 結果は、望ましい動的範囲を越える十分な速度変化が存
在することを示す。治療範囲は８〜12mg/mL である。
在することを示す。治療範囲は８〜12mg/mL である。
【００９６】発明の更なる具体的な態様 本発明の具体的な態様を特許請求の範囲に関連して更に
具体的に説明する。類似体が、構造（Ｉ）
具体的に説明する。類似体が、構造（Ｉ）
【００９７】
【化１２】
【００９８】（上式中、Ｒは、水素又は炭素原子数１〜
６の低級アルキルを表し、Ｒ1 は、Ｒ7 と共に 1,4−ピ
ペラジニレン、 2,5−ジメチル− 1,4−ピペラジニレ
ン、 1,3−イミダゾリジニレン及び 1,4−ヘキサヒドロ
ジアゼピニレンから成る群より選ばれる複素環を形成す
るのに十分な炭素原子数１〜３のアルキレンであり、Ｒ
2 、Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 は、各々独立して炭素原子数２
〜10のアルキレン基又はフェニレンを表し、Ｒ7 は、水
素又はメチルであり、各々Ｚは、独立して−Ｏ−、−Ｓ
−又は−ＮＲ−（ここで、Ｒは、水素もしくは炭素原子
数１〜６のアルキルを表す）を表し、LABEL は、酵素で
あり、ｌは、０、１又は２であり、ｍは、１又は２であ
り、ｎは、０、１又は２であり、そして（i) Ｒ2 、Ｒ
3 、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ7 及びＺに含まれる原子を含んで成
る、連結鎖中の炭素原子及びヘテロ原子の和が５〜40で
あり、（ii) 構造Ｉの括弧で括った成分、ｌ、ｍ及びｎ
がいずれかの順序でそこに出現することを条件とし、そ
して（iii)Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 もしくはＲ5 基の１つのみ
がフェニレンでありうる）で示される請求項１の標識カ
ルバマゼピン類似体。
６の低級アルキルを表し、Ｒ1 は、Ｒ7 と共に 1,4−ピ
ペラジニレン、 2,5−ジメチル− 1,4−ピペラジニレ
ン、 1,3−イミダゾリジニレン及び 1,4−ヘキサヒドロ
ジアゼピニレンから成る群より選ばれる複素環を形成す
るのに十分な炭素原子数１〜３のアルキレンであり、Ｒ
2 、Ｒ3 、Ｒ4 及びＲ5 は、各々独立して炭素原子数２
〜10のアルキレン基又はフェニレンを表し、Ｒ7 は、水
素又はメチルであり、各々Ｚは、独立して−Ｏ−、−Ｓ
−又は−ＮＲ−（ここで、Ｒは、水素もしくは炭素原子
数１〜６のアルキルを表す）を表し、LABEL は、酵素で
あり、ｌは、０、１又は２であり、ｍは、１又は２であ
り、ｎは、０、１又は２であり、そして（i) Ｒ2 、Ｒ
3 、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ7 及びＺに含まれる原子を含んで成
る、連結鎖中の炭素原子及びヘテロ原子の和が５〜40で
あり、（ii) 構造Ｉの括弧で括った成分、ｌ、ｍ及びｎ
がいずれかの順序でそこに出現することを条件とし、そ
して（iii)Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 もしくはＲ5 基の１つのみ
がフェニレンでありうる）で示される請求項１の標識カ
ルバマゼピン類似体。
【００９９】構造Ｉが、以下の定義：Ｒ1 がエチレンを
表し、それによって、それが結合される原子と共に 1,4
−ピペラジニレン環基を形成し、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 及び
Ｒ5 が、各々独立してメチレン、エチレン、トリメチレ
ン、テトラメチレン、ペンチレンもしくはヘキシレンを
表し、そして各々Ｚが、独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、
表し、それによって、それが結合される原子と共に 1,4
−ピペラジニレン環基を形成し、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 及び
Ｒ5 が、各々独立してメチレン、エチレン、トリメチレ
ン、テトラメチレン、ペンチレンもしくはヘキシレンを
表し、そして各々Ｚが、独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、
【０１００】
【化１３】 （ここで、Ｚは０又はアミドである）、
【０１０１】
【化１４】 を表す、を包含する前記具体的な態様の標識カルバマゼ
ピン類似体。
ピン類似体。
【０１０２】構造Ｉが、以下の定義：Ｒ1 がエチレンで
あり、Ｒ2 がテトラメチレンであり、Ｒ3 がエチレン、
トリメチレンもしくはヘキシレンであり、Ｒ4 及びＲ5
が、独立してエチレン、プロピレンもしくはヘキシレン
であり、Ｒ7 が水素でありそしてＺが−Ｏ−もしくは−
ＮＨ−である、を包含する標識カルバマゼピン類似体。
標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）もしく
はアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＨＲＰ）
より選ばれる標識カルバマゼピン類似体。
あり、Ｒ2 がテトラメチレンであり、Ｒ3 がエチレン、
トリメチレンもしくはヘキシレンであり、Ｒ4 及びＲ5
が、独立してエチレン、プロピレンもしくはヘキシレン
であり、Ｒ7 が水素でありそしてＺが−Ｏ−もしくは−
ＮＨ−である、を包含する標識カルバマゼピン類似体。
標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）もしく
はアミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＨＲＰ）
より選ばれる標識カルバマゼピン類似体。
【０１０３】アミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ並
びにＮ−〔６−（４−スクシンイミドキシカルボニルブ
チルアミド）ヘキシル〕カルバマゼピン、Ｎ−｛４−
〔４−（３−スクシンイミドキシカルボニルプロピオニ
ル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバマゼピン、
及びＮ−｛４−〔３−（４−スクシンイミドキシカルボ
ニルブチルアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝カルバマゼピン、から成る群より選ばれるカルバマ
ゼピン類似体の接合体である標識カルバマゼピン類似
体。
びにＮ−〔６−（４−スクシンイミドキシカルボニルブ
チルアミド）ヘキシル〕カルバマゼピン、Ｎ−｛４−
〔４−（３−スクシンイミドキシカルボニルプロピオニ
ル）ピペラジノカルボニル〕ブチル｝カルバマゼピン、
及びＮ−｛４−〔３−（４−スクシンイミドキシカルボ
ニルブチルアミド）プロピルアミノカルボニル〕ブチ
ル｝カルバマゼピン、から成る群より選ばれるカルバマ
ゼピン類似体の接合体である標識カルバマゼピン類似
体。
【０１０４】イムノアッセイ要素で実施されるアッセイ
方法。或る層もしくは区画に抗体を含有し、且つ標識カ
ルバマゼピン類似体を含有する別の層もしくは区画を含
有するイムノアッセイ要素で実施されるアッセイ方法。
抗体が粒状層中のビーズ上に固定され、そして標識類似
体が抗体を含有する層の上に直接塗布されているイムノ
アッセイ要素で実施されるアッセイ方法。
方法。或る層もしくは区画に抗体を含有し、且つ標識カ
ルバマゼピン類似体を含有する別の層もしくは区画を含
有するイムノアッセイ要素で実施されるアッセイ方法。
抗体が粒状層中のビーズ上に固定され、そして標識類似
体が抗体を含有する層の上に直接塗布されているイムノ
アッセイ要素で実施されるアッセイ方法。
【０１０５】
【発明の効果】カルバマゼピン核と標識、例えば、西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の間に短い連結鎖を
有する標識カルバマゼピン類似体は、幾つかの固定化抗
体とは有用である。標識とカルバマゼピン核の間に長い
連結鎖を有する類似体は、試験される固定化抗体により
強く結合した。エステル結合の代わりにアミド結合を有
する連結基は加水分解に対して耐性であり、それによっ
て標識からのカルバマゼピン核の分離についてのいかな
る問題も回避される。伸長した連結鎖を有する本発明の
カルバマゼピン−ＨＲＰ標識は、本発明者らが製造した
すべての固定化抗体の型によって完全に（＞90％）結合
される能力を有する。これは、カルバマゼピン酵素イム
ノアッセイを発展せしめるために、種々抗体を追求する
ことを許容する。
ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の間に短い連結鎖を
有する標識カルバマゼピン類似体は、幾つかの固定化抗
体とは有用である。標識とカルバマゼピン核の間に長い
連結鎖を有する類似体は、試験される固定化抗体により
強く結合した。エステル結合の代わりにアミド結合を有
する連結基は加水分解に対して耐性であり、それによっ
て標識からのカルバマゼピン核の分離についてのいかな
る問題も回避される。伸長した連結鎖を有する本発明の
カルバマゼピン−ＨＲＰ標識は、本発明者らが製造した
すべての固定化抗体の型によって完全に（＞90％）結合
される能力を有する。これは、カルバマゼピン酵素イム
ノアッセイを発展せしめるために、種々抗体を追求する
ことを許容する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イグナツィオ サルバトーレ ポンティセ ロ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14534, ピッツフォード，コッパー ウッズ 21
Claims (3)
- 【請求項１】 （１）アミンもしくはスルフヒドリル基
を有するイムノアッセイに使用される型の標識、 （２）カルバマゼピン核、及び （３）カルバマゼピン核のカルボキサミド基をカルボニ
ル基を介して標識に連結する連結鎖、を含んで成る標識
カルバマゼピン類似体であって、前記連結鎖が、 （Ａ）Ｃ2 〜Ｃ6 アルキレン基、並びに（Ｂ） 1,4−ピ
ペラジニレン、 2,5−ジメチル− 1,4−ピペラジニレ
ン、 1,3−イミダゾリジニレン及び 1,3−ヘキサヒドロ
ジアゼピニレンより選ばれる５〜７員複素環、から成る
群より選ばれる４〜40個の原子を有し、各々（Ａ）及び
（Ｂ）基が （ａ）チオエステル類を包含するエステル類 【化１】 （上式中、Ｚは、Ｏ又はＳである）、 （ｂ）アミド類、 【化２】 （上式中、Ｒは、水素又はＣ1 〜Ｃ6 アルキルを表
す）、 （ｃ）−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＲ−（ここで、各々Ｒ
は、独立して水素又はＣ 1 〜Ｃ6 アルキルを表す）より
選ばれるヘテロ原子、並びに （ｄ）カルボニル、から成る群より選ばれる化学基を介
して連結鎖に結合してる標識カルバマゼピン類似体。 - 【請求項２】 Ａ．カルバマゼピンを含有する液体試料
を、標識カルバマゼピン類似体と、カルバマゼピンにつ
いての抗体の存在下、カルバマゼピン／抗体免疫複合体
の生成を促進する条件下で接触せしめる段階、並びに Ｂ．結合もしくは未結合標識薬剤類似体を測定すること
により液体中の薬剤の量を検出する段階、を含んで成る
カルバマゼピンについてのイムノアッセイ方法であっ
て、標識カルバマゼピン類似体が請求項１に記載の構造
を有することを特徴とするカルバマゼピンについてのイ
ムノアッセイ方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載の標識カルバマゼピンの
層、区画もしくは塗膜を担持するイムノアッセイ要素。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US926202 | 1992-08-07 | ||
| US07/926,203 US5543311A (en) | 1992-08-07 | 1992-08-07 | Labeled carbamazepine hapten analogues for competitive enzyme immunoassays |
| US926203 | 1992-08-07 | ||
| US07/926,202 US5578457A (en) | 1992-08-07 | 1992-08-07 | Immunoassays with novel labeled carbamazepine hapten analogues |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06206870A true JPH06206870A (ja) | 1994-07-26 |
| JP3022942B2 JP3022942B2 (ja) | 2000-03-21 |
Family
ID=27129920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5193278A Expired - Lifetime JP3022942B2 (ja) | 1992-08-07 | 1993-08-04 | 新規標識カルバマゼピン類似体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0584854B1 (ja) |
| JP (1) | JP3022942B2 (ja) |
| AT (1) | ATE161962T1 (ja) |
| DE (1) | DE69316112T2 (ja) |
| HK (1) | HK1011082A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5688944A (en) * | 1995-06-07 | 1997-11-18 | Dade International Inc. | Carbamazepine derivatives |
| US6368814B1 (en) * | 2000-12-22 | 2002-04-09 | Roche Diagnostics Corporation | Tricyclic antidepressant derivatives and immunoassay |
| GB201110164D0 (en) | 2011-06-16 | 2011-07-27 | Randox Lab Ltd | Sensitive and generic antibodies with multiple applications |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4058511A (en) * | 1976-01-12 | 1977-11-15 | Syva Company | Tegretol antigens and antibodies |
| JPS54119026A (en) * | 1978-03-06 | 1979-09-14 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | Simultaneous enzyme immunoassay and kit for practicing the same |
| JPS57109724A (en) * | 1980-12-26 | 1982-07-08 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Novel hapten antigen and its preparation |
| US4874692A (en) * | 1987-07-20 | 1989-10-17 | Eastman Kodak Company | Binder composition and analytical element having stabilized peroxidase in layer containing the composition |
| CA2013014A1 (en) * | 1989-11-30 | 1991-05-31 | Linda A. Mauck | Dry immunoassay analytical element comprising monodispersed beads |
| US5200315A (en) * | 1990-07-25 | 1993-04-06 | Eastman Kodak Company | Particulate biologically active reagent containing polyoxyalkylene side chains, analytical element and methods for use of the reagent |
| CA2062176A1 (en) * | 1991-06-07 | 1992-12-08 | Glen M. Dappen | Use of the gravure process for coating thin film layers |
| DE69232002T2 (de) * | 1991-06-07 | 2002-06-06 | Johnson & Johnson Clin Diag | Immunoassays unter Verwendung von markierten Hapten-Analogen |
-
1993
- 1993-08-04 EP EP93202292A patent/EP0584854B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-04 JP JP5193278A patent/JP3022942B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-04 AT AT93202292T patent/ATE161962T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-08-04 DE DE69316112T patent/DE69316112T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-11-18 HK HK98112113A patent/HK1011082A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE161962T1 (de) | 1998-01-15 |
| HK1011082A1 (en) | 1999-07-02 |
| EP0584854A1 (en) | 1994-03-02 |
| DE69316112D1 (de) | 1998-02-12 |
| DE69316112T2 (de) | 1998-06-10 |
| JP3022942B2 (ja) | 2000-03-21 |
| EP0584854B1 (en) | 1998-01-07 |
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