DE69232002T2

DE69232002T2 - Immunoassays unter Verwendung von markierten Hapten-Analogen

Info

Publication number: DE69232002T2
Application number: DE69232002T
Authority: DE
Inventors: Barbara A. Brummond; Susan Jean Danielson; David Alan Hilborn; Marsha D. Oenick; Ignazio Salvatore Ponticello
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1991-06-07
Filing date: 1992-06-02
Publication date: 2002-06-06
Anticipated expiration: 2012-06-03
Also published as: EP0517327A3; JPH0627108A; EP0517327A2; EP0517327B1; JP3190730B2; ATE204385T1; US5601994A; DE69232002D1

Description

Diese Erfindung betrifft die klinische Chemie, insbesondere Immuntests.
Immuntests, welche sich natürliche immunologische Reaktionen zunutze machen, haben als Analysetechnik weit verbreitete Anwendung in der klinischen Chemie gefunden. Aufgrund der Spezifität der Reaktionen sind sie besonders vorteilhaft zum Quantifizieren biologischer Analyte, die in sehr niedrieger Konzentration in biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind. Derartige Analyte schließen beispielsweise Antikörper, therapeutische Wirkstoffe, Narkotika, Enzyme, Hormone, Proteine usw. ein.
Bei kompetitiven Immunbindungstests wird ein markierter Ligand, einschließlich immunkompetenter Derivate und Analoga des Liganden, in Kompetition mit einem unmarkierten Liganden bei der Reaktion mit einer festgesetzten Menge des entsprechenden bindenden Materials (hier als Rezeptor bezeichnet) gebracht. Unbekannte Konzentrationen des Liganden können von dem gemessenem Signal entweder des gebundenen oder nicht-gebundenen (d. h. freien) markierten Liganden abgeleitet werden. Die Reaktion verläuft wie folgt:
Ligand + markierter Ligand + Rezeptor → Ligand-Rezeptor + markierter Ligand-Rezeptor.
Herkömmliche Markierungen schließen radioaktive Anhänge, Enzyme, Chromophore, Fluorophore, stabile freie Radikale und Enzym-Cofaktoren, Inhibitoren und allosterische Effektoren ein.
In Übereinstimmung mit dem vorangehend Dargestellten kann ein Immuntest auf Arzneistoffe, wie etwa Phenobarbital und Phenytoin, im Serum auf einer Kompetition eines Enzymmarkierten Analogons eines solchen Arzneistoff-Haptens mit dem Arzneistoff in dem Patientenserum um Bindungsstellen eines immobilisierten Antikörpers beruhen.
Spezielle Anforderungen an das markierte Arzneistoff-Hapten-Analogon (nachstehend manchmal LDH, labeled drug hapten analog) beinhalten: 1) Mindestens 65% des LDH können durch einen Überschuß an immobilisiertem Antikörper gebunden werden; 2) die Affinität LDH zu einem immobilisierten Antikörper ist derart, daß eine Kompetition einer festgelegten Menge an LDH mit dem Arzneistoff in einem therapeutisch relevanten Bereich der Arzneistoffkonzentration auftritt; und 3) die Stabilität des LDH gegenüber einer Hydrolyse seiner Enzymmarkierung unter Lagerungsbedingungen.
Anforderungen, die an das Arzneistoff-Hapten-Analogon gestellt werden, beinhalten: 1) Zugänglichkeit des Analogons zu dem immobilisierten Antikörper nach Konjugation mit der Enzymmarkierung; 2) spezifische Erkennung des LDH-Analogons durch den Antikörper zu dem Arzneistoff; und 3) ausreichende Reaktivität des Analogons mit der Enzymmarkierung, entweder direkt oder nach Aktivierung des Enzyms oder des Analogons unter Bedingungen, welche sich nicht nachteilig auf die Enzymaktivität auswirken.
Enzymmarkierungen, bei denen Glukoseoxidase (GOD) und alkalische Phosphatase (ALP) an Phenobarbital- und Phenytoin-Hapten-Analoga gekoppelt sind, offengelegt im US-Patent 4,752,568, ergeben adäquate Enzym-markierte Analoga zum Durchführen effektiver kompetetiver Immuntests in dem gewünschten Format.
Das Problem besteht darin, daß die in dem oben zitierten Patent offengelegten markierten Phenobarbital- und Phenytoin-Analoga zum Durchführen kompetitiver Immuntests unzureichend sind, wenn das Enzym Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidcrse, HRP) als Markierung verwendet wurde. Die Kupplungsreaktionen zwischen solchen Analoga und HRP waren sowohl langsam als auch unvollständig. Darüberhinaus wurden Phenobarbital- und Phenytoin-HRP-Markierungen sehr schwach gebunden, so daß sehr viel höhere Konzentrationen an Markierung oder Antikörperbindungsstellen erforderlich wären, um ein lesbares Signal zu ergeben.
Das US-Patent 4,244,939 legt Verbindungen offen, die nützlich sind als Tracer in Radioimmuntests auf Barbiturate, bei denen eine Radiojod-markierte Gruppe mit einem Pyrimidinring-Stickstoffatom des Barbiturats verbunden ist.
Die Beschreibung des Patents EP 0 233 690 beschreibt ein markiertes Hydantoin-Konjugat und dessen Verwendung in analytischen Elementen und Immuntests. Die Markierung ist an die 3-Stickstoff-Position des Hydantoinrings mit einer Verbindung, die sich von einer aliphatischen Monocarbonsäure mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen ableitet, gebunden.
Die Beschreibung des Patents DE 32 05 506 beschreibt eine Fluoreszenzmarkierung, die kovalent an Haptene gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung macht ein Verfahren für einen Immuntest auf einen Arzneistoff verfügbar, das folgende Schritte umfaßt:
A. In-Kontakt-Bringen einer flüssigen Probe, die den Arzneistoff oder ein Derivat davon enthält, mit einem markierten Analogon des Arzneistoffs oder Arzneistoff-Derivats in Gegenwart von Antikörpern gegen den Arzneistoff unter Bedingungen, welche die Bildung von Antikörper-Immunkomplexen fördert; und
B. Bestimmender Quantität des Arzneistoffs in der Flüssigkeit durch Messen von gebundenem oder nicht-gebundenem Arzneistoff-Analogon; dadurch gekennzeichnet, daß das markierte Arzneistoff-Analogon umfaßt:
(i) eine Enzymmarkierung,
(ii) einen Arzneistoff-Kern, ausgewählt aus einem Hydantoin-Kern oder einem Barbiturat-Kern, und
(iii) eine verbindende Kette, welche die 3-Position des Barbiturat- oder Hydantoin-Kerns mit der Markierung über eine Carbonylgruppe verbindet; wobei die verbindende Kette, ausgenommen die Carbonylgruppe, 12 bis 40 Atome auf weist, bestehend aus:
(I) zwei oder mehr C&sub1;- bis C&sub1;&sub0;-Alkylengruppen, wahlweise in Verbindung mit einer oder mehr Phenylen-Gruppen und/oder einem oder mehr 5- bis 7-gliedrigen heterozyklischen Ringen, welche in die verbindende Gruppe über Ring-Stickstoffatome eingebunden sind, oder
(II) eine C&sub1;- bis C&sub1;&sub0;-Alkylengruppe in Verbindung mit einer oder mehr Phenylengruppen und einer oder mehr 5- bis 7-gliedrigen heterozyklischen Ringen, welche in die verbindende Gruppe über Ring-Stickstoffatome eingebunden sind;
wobei die Gruppen und Ringe über chemische Gruppen aneinander gebunden sind, die ausgewählt sind aus.
(a) Estern, einschließlich Thioestern, (-COZ-), wobei Z O oder S ist;
(b) Amiden, (-CONH);
(c) Heteroatomen, ausgewählt aus -O-, -S- und -NR-; wobei R C&sub1;- bis C&sub6;-Alkyl repräsentiert; und
(d) Carbonyl.
Die markierten Arzneistoff-Analoga, die für das oben beschriebene Verfahren nützlich sind, schließen solche ein, die der folgenden Struktur entsprechen:
(I)
wobei
A einen Hydantoinkern der Struktur
oder einen Phenobarbital-Barbiturat-Kern der Struktur
repräsentiert.
R¹ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, nichtsubstituiertes oder substituiertes Phenyl repräsentiert;
R², R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; jeweils, unabhängig C&sub1;- bis C&sub1;&sub0;-Alkylen repräsentieren oder solche Alkylengruppen, die mit mindestens einer oder mehr Estergruppen, Amidgruppen, -O-, -S- und - NR- unterbrochen sind;
R³ C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylen repräsentiert;
Z -O-, -S- und -NR- repräsentiert, wobei R Wasserstoff oder C&sub1;- bis C&sub6;-Alkyl, z. B. Methyl, Propyl und Hexyl, repräsentiert;
m ist 0, 1 oder 2;
n ist 0, 1 oder 2;
m + n > 0; und
die Gesamtzahl der Atome, die von m, n und R² umfaßt sind, 12 bis 40 beträgt;
die Markierung LABEL ein Enzym ist;
und weiter vorausgesetzt, daß (i) mindestens eine der R¹-Gruppen substituiertes oder nichtsubstituiertes Phenyl ist;
(ii) einer von R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; Phenylen sein kann; und
(iii) die in Klammern gesetzten Bestandteile von Struktur I in jeder Reihenfolge auftreten können.
Mindestens 65% des markierten Arzneistoff-Hapten-Analogons können durch einen Überschuß an immobilisierten Antikörpern gegen die Arzneistoffe gebunden werden. Die markierten Analoga mit erweiterten Linkern, insbesondere solchen mit Amidbindungen in der verbindenden Kette, werden durch alle Typen von immobilisiertem Antikörper, die verwendet wurden, lull diese Erfindung zur praktischen Ausführung zu bringen, ähnlich gebunden. Auch sind die Derivate mit dem Amid in dem erweiterten Linker gegenüber Hydrolyse sehr stabil.
Die Arzneistoff-Hapten-Analoga, die für die Immuntests, welche durch die vorliegende Erfindung verfügbar gemacht werden, zweckmäßig sind, sind solche, die folgendes umfassen:
(a) eine aktive Estergruppe, wie etwa ein Succinimidoxycarbonyl;
(b) einen Kern, ausgewählt aus Hydantoin- oder Barbiturat-Derivaten; und
(c) eine verbindende Kette, welche die aktive Estergruppe mit dem Hydantoin- oder Barbiturat-Kern verbindet;
wobei die verbindende Kette der vorherigen Definition entspricht.
Genauer sind die bevorzugten neuen Arzneistoff-Hapten-Analoga, die bei dieser Erfindung zweckmäßig sind, solche, welche der folgenden Struktur entsprechen:
wobei
A einen Hydantoin-Kern der Struktur.
oder einen Barbituratkern der Struktur
repräsentiert;
R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, Z, m und n und die Bedingungen, die daran geknüpft sind, der vorherigen Definition entsprechen, und
R&sup7; eine Ethylen- oder o-Phenylen-Gruppe ist.
Diese neuen Arzneistoff-Hapten-Analoga reagieren mit HRP und arideren Enzymen, wie etwa GOD und ALP, schneller und vollständiger als Analoga nach dem Stand der Technik, (b) bilden mit solchen Enzymen kovalente Bindungen ohne nachteiligen Effekt auf die Enzymaktivität, und (c) die resultierenden LDH-Analoga werden durch Antikörper gegen solche Arzneistoffe leichter erkannt und fest gebunden.

Hydantoin-Arzneistoff-Hapten-Analoga

Neue Hydantoin-Arzneistoff-Hapten-Analoga werden zur Herstellung der markierten Analoga verwendet, die in den Immuntests dieser Erfindung verwendet werden. Die aktiven Ester dieser Hydantoin-Derivate mit kurzen verbindenden Ketten zwischen dem Hydantoin-Kern und der aktiven Estergruppe waren gegenüber HRP ausreichend reaktiv, um eine annehmbare Enzym-Markierung zur Verwendung mit einigen immobilisierten Antikörpern herzustellen. Derivate mit längeren Linkergruppen (R² plus die in Klammern gesetzten Gruppen) von 8 bis 20 Atomen zwischen der aktiven Estergruppe und dem Hydantoin-Kern ergeben Markierungen, die von allen getesteten immobilisierten Antikörpern gebunden werden können. Verbindende Ketten, in denen jedes Z -NR- ist, das mit dem angrenzenden Carbonyl eine Amidgruppe bildet, sind besonders zweckmäßig insofern, als Hydantoin-Derivate, die derartige Ketten enthalten, gegenüber Hydrolyse resistenter sind als Ketten, bei denen Z -O-oder -S- ist, so daß mit dem angrenzenden Carbonyl eine Estergruppe gebildet wird.

Vorbereitende Beispiele - Hydantoin-Analoga

Die Hydantoin-Analoga können gemäß den folgenden Präparationen, bei denen Phenytoin- Analoga, eine Unterklasse von Hydantoin-Verbindungen, hergestellt werden, präpariert werden.
1. Präparation von HD 1, 5,5-Diphenyl-3-{4-[2-(3-Succinimidoxycarbonylpropionyloxy)ethylaminocarbonyl]butyl}hydantoin.
Schritt 1: Präparation von 5,5-Diphenyl-3-[4-(2- Hydroxyethylaminocarbonyl)butyl]hydantoin.
Teil A: Zunächst wird das Säurechlorid hergestellt.
Eine Mischung aus 3-(4-Carboxybutyl)-5,5-diphenyl-2,4-imidazolidindion (3,52 g, 0,01 Mol), Thionylchlorid (20 ml), N,N-Dimethylformamid (2 Tropfen) und Chloroform (50 ml) wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt, und dieses Produkt wurde direkt im nächsten Teil B eingesetzt.
Teil B: Das Säurechlorid wird mit Ethanolamin zur Reaktion gebracht.
Das Säurechlorid in Chloroform (50 ml) wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 15 Minuten zu einer Mischung aus Ethanolamin (1,2 g, 0,02 Mol) und Triethylamin (2,4 g, 0,024 Mol) in Chloroform (100 ml) gegeben. Die Mischung wurde dann 2 Stunden auf 60ºC erhitzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde dann mit 5% Salzsäure (2 · 100 ml) gewaschen, mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationseväporator entfernt. Das Filtrat wurde dann unter Verwendung einer Aluminiumoxid- Säule chromatographiert, um Material (3,0 g) zu ergeben, das nach TLC einen Fleck zeigte. Dieses Material wurde direkt in der nächsten Präparation eingesetzt.
Schritt 2: Präparation von 3-{4-[2-(3-Carboxypropionyloxy)ethylaminocarbonyl]butyl}-5,5- diphenylhydantoin.
Die Hydroxyverbindung aus Schritt 1 (3,0 g, 0,0075 Mol), Bernsteinsäureanhydrid (1,0 g, 0,01 Mol) und Diementhylaminopyridin (0,9 g, 0,0075 Mol) in Chloroform (100 ml) wurden 4 Stunden bei 50-60ºC erhitzt und über das Wochenende auf Raumtemperatur abkühlengelassen.
Dichlormethan (300 ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde mit 5% Salzsäure-Lösung (3 · 100 ml) gewaschen, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel entfernt, uni ein Material zu ergeben, das nach TLC einen Fleck lieferte.
Sehritt 3: Präparation von HD 1 : 5,5-Diphenyl-3-{4-[2-(3- succinimidoxycarbonylpropionyloxy)ethylaminocarbonyl]butyl}hydantoin.
Eine Mischung aus der Säure aus Schritt 2 (3,0 g, 0,006 Mol), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (1,5 g, 0,007 Mol) und N-Hydroxysuccinimid (0,7 g, 0,006 Mol) in Chloroform (80 ml) wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde filtriert, und das Filtrat wurde in einem Rotationsevaporator unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde dann unter Verwendung von Silika chromatographiert, um 1,3 g (40% Ausbeute) zu ergeben. Anal. Kalk. für C&sub3;&sub0;H&sub3;&sub2;N&sub4;O&sub9;: C, 60,8; H, 5,44; N, 9,45. Gefunden: C, 59,6; H, 5,51; N, 8,91.
2. Präparation von HD 2: 5,5-Diphenyl-3-{4-[4-(3-succinimidoxycarbonylpropionyl)-1- piperazinylcarbonyl]butyl}-2,4-imidazolidindion.
Schritt 1: Präparation von 5,5-Diphenyl-3-(1-piperazinylcarbonylbutyl)hydantion.
Teil A: Zunächst wurde 3-[4-(4-Benzyloxycarbonylpiperazinylcarbonyl)butyl]-5,5- diphenyl-2,4-imidazolidindion hergestellt.
Das Säurechlorid (0,01 Mol), hergestellt wie für die Präparation von HD 1, Teil A, oben beschrieben, wurde über einen Zeitraum von 15 Minuten tropfenweise zu einer Mischung aus Benzyl-1-piperazincarboxylat (2,4 g, 0,011 Mol) und Triethylamin (2,0 g, 0,02 Mol) in Chloroform (50 ml) gegeben. Diese Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und Dichlormethan (300 ml) wurde zugegeben. Die Mischung wurde mit 5% Salzsäure (2 · 100 ml) gewaschen, mit verdünnter Natriumcarbonatlösung (100 ml) gewaschen, mit gesättigter Natriumchloridlösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat [Lösung] getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt. Das Filtrat wurde dann chromatographiert, um ein Öl, 4,3 g (78% Ausbeute) zu ergeben, das direkt im nächsten Schritt eingesetzt wurde.
Teil B: Das geschützte Amin aus Teil A (4,8 g, 0,008 Mol) und 30-35% Bromwasserstoff-Essigsäure-Lösung (25 ml) wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur rührengelassen. Diese Mischung wurde dann in Diethylether (1 l) gegossen, und das Öl, das sich abtrennte, wurde mit frischen Portionen von Ether (3 · 1 l) trituriert. Das Öl wurde in 10% wässriger Natriumhydroxid-Lösung (pH = 14) gelöst und die wässrige Lösung mit Dichlormethan (4 · 100 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Lösung wurde mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (150 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum entfernt. Das Filtrat verfestigte sich, um einen weißen Feststoff (2,6 g, 77% Ausbeute) zu ergeben. Dieses Material wurde direkt im nächsten Schritt eingesetzt.
Schritt 2: Präparation von 3-{4-[4-(3-Carboxypropionyl)-1-piperazinylcarbonyl]butyl}- 5,5-diphenyl-2,4-imidazolidindion.
Eine Mischung des Amins aus dem oben genannten Schritt 1 (2,1 g, 0,005 Mol) und Bernsteinsäureanhydrid (0,54 g, 0,0054 Mol) in Chloroform (15 ml) wurde 30 Minuten bei 50- 60ºC erhitzt und 20 Stunden bei Umgebungstemperatur stehengelassen. Dichlormethan (150 ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde mit 5% Salzsäure (2 · 100 ml), gesättigter Natriumchloridlösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt, um einen weißen Feststoff, 2,5 g (95%) zu ergeben, der direkt im nächsten Schritt eingesetzt wurde.
Schritt 3: Präparation von HD 2, 5,5-Diphenyl-3-{4-[4-(3- succinimidoxycarbonylpropionyl)-1-piperazinylcarbonyl]butyl}-2,4- imidazolidindion.
Eine Mischung aus der Säure aus Schritt 2 (1,56 g, 0,003 Mol), N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid (0,64 g, 0,003 Mol) und N-Hydroxysuccinimid (0,36 g, 0,003 Mol) in Chloroform (40 ml) wurde über das Wochenende bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator unter Vakuum aus dem Filtrat entfernt, um 1,9 g (100% Ausbeute) zu ergeben. Der Feststoff wurde chromatographiert, und die Produktfraktion wurde in Dichlormethan (200 ml) gelöst, mit verdünnter Natriumcarbonatlösung (2 · 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator entfernt, um einen weißen Feststoff zu ergeben, der nach TLC einen Fleck ergab.
3. Präparation von HD 3, 5,5-Diphenyl-3-{4-[6-(3- succinimidoxycarbonylpropionamido)hexylaminocarbonyl]butyl}-2,4- imidazolidindion.
Schritt 1: Präparation von 3-[4-(6-Aminohexylaminocarbonyl)butyl]-5,5-diphenyl-2,4- imidazolidindion.
Teil A: Präparation von 3-[4-(6-Benzyloxycarbonylaminohexylaminocarbonyl)butyl]- 5,5-diphenyl-2,4-imidazolidindion.
Das Säurechlorid, hergestellt als ein Zwischenprodukt bei der Präparation von HD 1, wurde mit N-Benzyloxycarbonyl-1,6-hexandiamin durch die in Schritt 1 für die Präparation von HD 2 beschriebenen Verfahren behandelt, um 7,5 g, 85% Ausbeute, des geschützten Amins zu ergeben.
Teil B: Das geschützte Amin aus Teil A wurde mit Bromwasserstoffsäure-Essigsäure durch die bei der Präparation von HD 2 verwendeten Verfahren, Schritt 1, Teil B, behandelt, um das freie Amin zu liefern, das ohne Reinigung in Schritt 3 verwendet wurde.
Schritt 3: Präparation von 3-{4-[6-(3-Carboxypropionamido)hexylaminocarbonyl]butyl)- 5,5-diphenyl-2,4-imidazolidindion.
Diese Verbindung wurde unter Verwendung derselben Verfahren wie in Schritt 2 bei der Präparation von HD 2 präpariert.
Schritt 4: Präparation von HD 3, 5,5-Diphenyl-3-{4-[6-(3- succinimidoxycarbonylpropionamido)hexylaminocarbonyl]butyl}-2,4- imidazolidindion.
Dieses Material wurde unter Verwendung der Verfähren von Schritt 3 bei der Präparation von HD 2 präparariert, um 2,6 g (80% Ausbeute), Schmelzpunkt 133-134ºC zu ergeben. Anal. Kalk. für C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub1;N&sub5;O&sub8;: C, 63,05; 11,6,38; N, 10,81. Gefunden: C, 62,91; H, 6,41; N, 10,69.

Barbiturat-Arzneistoff-Analoga

Die folgenden vorbereiteten Beispiele 4 bis 8 veranschaulichen die Präparation von neuen Barbiturat-Arzneistoff-Hapten-Analoga anhand von Phenobarbital. Die Analoga werden allgemein hergestellt durch (1) Kondensieren eines Barbiturat-Derivats, wie etwas Phenobarbital, mit einem omega-Haloalkancarbonsäureester, (2) Verseifen des Esters zu der korrespondierenden Säure, (3) Umsatz der Säure zu dem korrespondierenden Säurechlorid und (4) Kondensation des Säurechlorids mit N-Hydroxysuccinimid oder, um die verbindende Kette weiter zu verlängern, mit einem Diamin, Diol oder Aminoalkohol, bei denen eine der Amino- oder Hydroxygruppen blockiert ist, (5) Entfernen der blockierenden Gruppen, Kondensation mit einer Dicarbonsäure, wie etwa Bernsteinsäure, und dann Kondensation mit dem N- Hydroxysuccinimid, um das Analogon zu produzieren.
Falls gewünscht, kann die Kondensation mit einem zur Hälfte blockierten Diamin, Diol oder Aminoalkohol und dann einer weiteren zweiwertigen Säure einmal oder zweimal mehr wiederholt werden, um die verbindende Kette weiter zu verlängern. Dasselbe kann jedoch mit weniger Schritten erreicht werden, indem längerkettige zweiwertige Säuren, Diole, Diamine, Aminoalkohole oder Haloalkancarbonsäureester verwendet werden.
4. Präparation von PB 1,5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[4-(3-succinimidoxycarbonylpropionyl)- 1-piperazinylcarbonyl]butyl}-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion.
Schritt 1: Präparation von 5-Ethyl-6-hydroxy-3-(4-methoxycarbonylbutyl)-5-phenyl-2,4 (3H,5H)-pyrimidindion.
Eine Mischung aus Phenobarbital (46,5 g, 0,2 Mol) und Tetrabutylammoniumhydroxid (500 ml, 0,2 Mol von 0,4 M in Wasser) in Dichlormethan (500 ml) wurde hergestellt und dazu wurde Methyl-5-Bromvalerat (39,0 g, 0,2 Mol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht (20 Stunden) kräftig gerührt. Dieser Mischung wurde gesättigte Natriumchlorid- Lösung (100 ml) zugesetzt, die organische Schicht wurde abgetrennt, und die wässrige Lösung Wurde mit Dichlormethan (2 · 100 ml) gewaschen. Die vereinigte organische Lösung wurde mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel entfernt.
Schritt 2: Präparation von 3-(4-Carboxybutyl)-5-ethyl-6-hydroxy-5-phenyl-2,4(3H,5H)- pyrimidindion.
Der 5 -Ethyl-6-hydroxy-3-(4-methoxycarbonylbutyl)-5-phenyl-2,4(3H,5H)- pyrimidindionester (54,0 g, 0,156 Mol) aus Schritt 1 in Dioxan (500 ml), konzentrierte Salzsäure (55 ml) und Wasser (55 ml) wurden unter Rückflußbedingungen 4 Stunden und bei Raumtemperatur über Nacht erhitzt. Das Dioxan wurde unter reduziertem Druck entfernt, und gesättigte Natriumchloridlösung (250 ml) und Dichlormethan (400 ml) wurden zu dem Rückstand gegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, und die wäßrige Lösung würde mit Dichlormethan (3 · 150 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Lösungen wurden mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (200 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel entfernt. Zu dem Rückstand wurde Diethylether gegeben, und die Mischung wurde in einen Gefrierschrank bei -16ºC über das Wochenende getan und dann filtriert.
Schritt 3: Präparation von 1-(4-Chlorcarbonylbutyl)-5-ethyl-5-phenyl-2,4,6(1H,3H, 5H)-pyrimidintrion.
Eine Mischung aus der Säure (6,6 g, 0,2 Mol) aus Präparation 2, Thionylchlorid (50 ml), N,N'-Dimethylformamid (2 Tropfen) und Chloroform (80 ml) wurden 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt, und dieses Produkt wurde direkt im nächsten Schritt 4 eingesetzt.
Schritt 4: Präparation von 1-[4-(4-Benzyloxycarbonyl-1-piperazinylcarbonyl)butyl]-5- ethyl-5-phenyl-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion.
Das Säurechlorid aus Schritt 3 (0,2 Mol) in Chloroform (75 ml) wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 15 Minuten zu einer Mischung aus Benzyl-1-piperazincarboxylat (6,0 g, 0,030 Mol) und Triethylamin (4,0 g, 0,04 Mol) in Chloroform (100 ml) gegeben. Diese Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und Dichlormethan (300 ml) wurde dann zugesetzt. Die Mischung wurde mit 10%iger Salzsäure-Lösung (3 · 100 ml) gewaschen, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wurde dann an SiO&sub2; chromatographiert, um einen Feststoff zu ergeben.
Schritt 5: Präparation von 5-Ethyl-5-phenyl-1-[4-(1-piperazinylcarbonyl)butyl]-2,4,6- (1H,3H,5H)-pyrimidintrion-Hydrobromid.
Das geschützte Amin aus Präparation 4 (6,5 g, 0,012 Mol) und 30-35% Bromwasserstoff- Essigsäure-Lösung (30 ml) wurden 1,5 Stunden bei Raumtemperatur rührengelassen. Die Mischung wurde dann in Ethylacetat (2 l) gegossen, 1 Stunde gerührt, filtriert und der Feststoff mit 500 ml Ethylacetat gewaschen.
Schritt 6: Präparation von 1-{4-[4-(3-Carboxypropionyl)-1-piperazinylcarbonyl]butyl}- 5-ethyl-5-phenyl-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion
Das Amin aus Schritt. 5 (4,8 g, 0,01 Mol), Bernsteinsäureanhydrid (1,2 g, 0,012 Möl) und Triethylamin (2,2 g, 0,02 Mol) in Chloroform (150 ml) wurden 30 Minuten bei 50-60ºC (Heißwasser) erhitzt und 16 Stunden bei Umgebungstemperatur rührengelassen. Dichlormethan (200 ml) wurde zugesetzt, die Mischung wurde mit 10%iger Salzsäure-Lösung (3 · 100 ml), gesättigter Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt, um einen weißen Feststoff, 3,3 g (66%) zu ergeben. Dieses Material wurde unter Verwendung einer Siliziumdioxid-Säule chromatographiert, um einen weißen Feststoff zu liefern.
Schritt 7: Präparation von 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[4-(3-succinimidoxycarbonylpropionyl)-1- piperazinylcarbonyl]butyl}-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion
Eine Mischung der Säure aus Schritt 6 (3,4 g, 0,007 Mol), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (1,6 g, 0,008 Mol) und N-Hydroxysuccinimid (1,0 g, 0,008 Mol) in Chloroform (75 ml) wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde filtriert, und Ethylacetat (100 ml) wurde zugesetzt. Die organische Lösung wurde mit Wasser (2 · 100 ml), gesättigter Natriumchlorid-Lösung (50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaportor unter Vakuum entfernt. Eine Portion des Feststoffs wurde chromatogaphiert, um einen weißen Feststoff zu liefern.
5. Präparation von PB 3, 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[2-(3-succinimidoxycarbonylpropionyloxy)ethylaminocarbonyl]butyl}-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion
Schritt 1: Präparation von 5-Ethyl-1-[4-(2-hydroxyethylaminocarbonyl)butyl]-5-phenyl- 2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion.
Dieses Material wurde hergestellt wie in Schritt 4 des vorbereitenden Beispiels 4 ausgeführt, abgesehen davon, daß 2-Hydroxyethylamin anstelle des Benzyhl-1-piperazincarboxylats verwendet wurde.
Schritt 2: Präparation von 1-{4-[2-(3-Carboxypropionyloxy)ethylaminocarbonyl] butyl}-5-ethyl-5-phenyl-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintriontrion
Eine Mischung aus dem Produkt aus Schritt 1 (2,9 g, 0,007 Mol), Bernsteinsäureanhydrid (0,7 g, 0,007 Mol) und Dimethylaminopyridin (0,9 g, 0,007 Mol) in Chloroform (100 ml) wurde in heißem Wasser (50-60ºC) 30 Minuten erhitzt und dann 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dichlormethan (300 ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde mit 10%iger Salzsäure-Lösung (2 · 100 ml) gewaschen, mit gesättigter Natriumchorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel enfernt, um ein Öl zu liefern, das direkt im nächsten Schritt eingesetzt wurde.
Schritt 3: Präparation von PB 3, 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[2-(3-succinimidoxycarbonylpropionyloxy)ethylaminocarbonyl]butyl)-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion
Diese Material wurde hergestellt unter Verwendung des Verfahrens, das in Schritt 7 des vorbereitenden Beispiels 4 dargestellt wurde, wobei von der Säure aus Schritt 2 dieses Beispiels ausgegangen wurde.
6. Präparation von PB 4, 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[3-(succinimidoxycarbonylpropionamido) propylaminocarbonyl]butyl-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion
Schritt 1: Präparation von 1-[4-(3-Benzyloxycarbonylaminopropylaminocarbonyl) butyl]-5-ethyl-5-phenyl-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion
Dieses Material wurde unter Verwendung des Verfahrens, das in Schritt 4, vorbereitendes Beispiel 4, dargestellt wurde, hergestellt, abgesehen davon, daß N-Benzyloxycarbonyl-1,3- propandiamin gegen das Benzyl-1-piperazincarboxylat ersetzt wurde, und das rohe Material wurde im nächsten Schritt eingesetzt.
Schritt 2: Präparation von 1-[4-(3-Aminopropylaminocarbonyl)butyl]-5-ethyl-5-phenyl- 2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion-Hydrobromid
Dieses Material wurde wie in Schritt 5, vorbereitendes Beispiel 4, hergestellt, abgesehen davon, daß von dem Amid aus Schritt 1 dieses Beispiels ausgegangen wurde, um beim Gießen in Ethylether ein Öl zu erhalten.
Schritt 3: Präparation von 1-{4-[3-(3-Carboxypropionamido)propylaminocarbonyl]butyl)- 5-ethyl-5-phenyl-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion
Dieses Material wurde durch das Verfahren von Schritt 6, vorbereitendes Beispiel 4, hergestellt, außer daß von dem Amin aus Schritt 2 dieses Beispiels ausgegangen wurde, um die Säure zu liefern. Schritt 4: Präparation von PB 4, 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[3-(3-succinimidoxycarbonylpropioriamido)propylaminocarbonyl]butyl}-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion
Dieses Material wurde hergestellt unter Verwendung des Verfahrens aus Schritt 7, vorbereitendes Beispiel 4, außer daß von der Säure aus Schritt 3 dieses Beispiels ausgegangen wurde. 7. Präparation von PB 5, 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[6-(3-succinimidoxycarbonylpropionamido)hexylaminocarbonyl]butyl}-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion
Diese Verbindung wurde durch die Abfolge der Reaktionen des vorbereitenden Beispiels 6 hergestellt, außer daß N-Benzyloxycarbonyl-1,6-hexandiamin gegen das Benzyloxycarbonyl- 1,3-propandiamin in Schritt 1 ausgetauscht wurde und die entsprechenden Reaktionsprodukte danach in den Schritten 2, 3 und 4 des vorbereitenden Beispiels 6.

Markierten Arzneistoff-Hapten-Analoga

Wir haben neue markierte Arzneistoff-Hapten-Analoga der wie oben beschrieben hergestellten Barbiturat- und Hydantoin-Analoga hergestellt, die bei kompetitiven Immuntests auf Barbiturate und Hydantoin-Arzneistoffe, insbesondere Phenobarbital und Phenytoin, nützlich sind. Die Markierungen sind solche, die allgemein bei Immuntests eingesetzt werden, die eine Amino- oder Sulfhydryl-Gruppe haben, allgemein mit Analyten oder Analyt-Analoga bei kompetitiven Immuntests verwendet werden, wie etwa Enzyme, sichtbaren Farbstoffe, Leuko- Farbstoffe, Fluoreszenz-Farbstoffe, radioaktive Materialien, usw.
Zweckmäßige Markierungen sind Enzyme, wie etwa alkalische Phosphatase (ALP), Glucoseoxidase (GOD) und Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP).
Die markierten Arzneistoff-Hapten-Analoga werden mit einem neuen Verfahren hergestellt, das die folgenden Schritte umfaßt:
1. In-Kontakt-Bringen einer Markierung mit einer nukleophilen Gruppe darin, wie etwa eine Amino- oder Sulfhydrylgruppe, mit einem Überschuß an einem Barbiturat- oder Hydantoin-Arzneistoff-Hapten-Analogon, wie oben beschrieben. Bevorzugterweise werden die Analoga und die Markierung in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, wie etwa N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid (DMSO) oder einer Mischung aus Lösungsmittel und Wasser (gepuffert) gelöst, bevor sie miteinander gemischt weiden; und
2. Entfernen des unverbrauchten aktiven Esters und der Kondensationsnebenprodukte, bevorzugt durch Dialyse.
Die nachfolgend dargestellten Beispiele veranschaulichen die Präparation der neuen markierten Analoga dieser Erfindung. Die markierten Analoga wurden unter Verwendung von Phenytoin- und Phenobarbital-Arzneistoff-Hapten-Analoga hergestellt.

Markierte Hydantoin-Analoga

1. Präparation eines, mit Amin-angereicherter HRP markierten Hydantoin HD 1 (enthaltend einen erweiterten Linker, Markierung AHRP-HD 1, Markierung A).
HD 1 wurde in 1,452 ml trockenem DMF, das 10 mM 4'-Hydroxyacetanilide enthielt (DMF/4'-HA), gelöst.
Amin angereicherte HRP wurde hergestellt wie in EP-A-0 462 669 beschrieben. Kurz, trockene HRP wurde in 0,1 M MES-Puffer, pH 5,5, gelöst, um eine Endkonzentration von 2,5 · 10&supmin;&sup6; Mol (100 mg) in 10 ml Puffer (MES = 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) zu erhalten. Die Proteinkonzentration würde durch A&sub4;&sub0;&sub3;-Messung bestimmt, wobei der Umrechnurigsfaktor A&sub4;&sub0;&sub3; 1 mg/ml = 2,24 verwendet wurde. Die HRP-Lösung wurde mit, 1,5 · 10&supmin;³ Mol (275 mg) L-Lysin-Monohydrochlorid, gelöst in 10 ml 0,1 M MES-Puffer bei pH 5,5, zusammengebracht. Eine Lösung von frisch hergestelltem 1-Ethyl-3-(3- Dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDC, 5 · 10&supmin;&sup4; Mol, 960 ml) in MES- Puffer wurde zugegeben. De Behälter wurde mit einem Deckel verschlossen und [der Inhalt] über Nacht bei Raumtemperatur gemischt. Das Reaktion[sgemisch] wurde gegen 0,02 M MOPS = Puffer bei pH 7,0 (3 l bei 10ºC) dialysiert. Der Dialysepuffer wurde dreimal gewechselt. MOPS = 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure.
Vor der Reaktion wurde mit einer Probe der Amin-angereicherten HRP ein Pufferwechsel von MOPS-Puffer zu 0,1 M EPPS-Puffer, pH 8,0, durchgeführt, wobei "Centricells"- Zentrifugalultrafilter mit 30.000 NMWL (nominal molecular weight limit cutoff, Ausschlußgrenze für nominelles Molekulargewicht) verwendet wurden. Diese Probe wurde dann verdünnt, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von 10 mg/ml zu erhalten.
Die Amin angereicherte HRP (AHRP) (1 ml) wurde mit 500 ul einer 10 mM Lösung von 4'-Hydroxyacetanilid in Dimethylformamid (DMF/4'-HA) unter Vortex-Mischen zusammengebracht und wurde dann in einer Wasserbad mit 42ºC getan. Eine HD 1-Lösung, hergestellt durch Lösen von 21 mg HD 1 in 1,452 ml trockenes DMF/4'-HA-Lösung (500 ul) wurde tropfenweise zu der AHRP unter Vortex-Mischen gegeben, so daß das molare Verhältnis von Phenytoin/HRP 50/1 betrug. Die Reaktion[smischung] wurde eine Stunde in einem Wasserbad bei 42ºC unter sanftem Schütteln inkubiert.
Die Reaktion[smischung] wurde in einen "Spektrapor Nr. 2"-Dialyseschlauch getan, gemeinsam mit zusätzlich 0,5 ml DMF-4'-HA/0,1 M EPPS (1 : 1), was verwendet wurde, um den Reaktionsbehälter zu spülen.
Die Reaktionsmischung wurde wie folgt dialysiert:
a) 1 l DMF/4'-HA/0,1M EPPS, pH 8,0, (1 : 1) eine Stunde bei 42ºC;
b) die Dialysebedingung a) wurde einmal wiederholt;
c) 2 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, enthaltend 0,1% BSA, 15 Stunden bei 8ºC;
d) 2 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, 3 Stunden bei 8ºC
e) 3 l 0,04 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid (Tris-HCl)/0,15 M NaCl, pH 7,5, 3 Stunden bei 8ºC; und
f) die Dialysebedingung e) wurde einmal für 3 Stünden wiederholt;
Nach der Dialyse wurde Merthiolat in einer Konzentration von 0,02% als ein Konservierungsstoff zugesetzt, und das AHRP-HD 1 wurde gekühlt aufbewahrt.
2. Präparation eines mit Amin-angereicherter HRP markierten HD 2 (enthaltend einen erweiterten Linker mit einer Amidbindung, Markierung AHRP-HD 2, Markierung B).
HD 2 (15.5 mg) wurde in 1,031 ml trockenem DMF, das 10 mM 4'-Hydroxyacetanilid (DMF/4'-HA) enthielt, gelöst.
Eine Lösung von AHRP (10 mg/ml, 1 ml in 0,1 M EPPS, pH 8,0), hergestellt wie in dem Markierung-vorbereitenden Beispiel 1, wurde mit 500 ul DMF/4'-HA unter Vortex- Mischen zusammengebracht und wurde dann in ein Wasserbad mit 42ºC getan. Die oben beschriebene HD 2-Lösung (500 ul) wurde tropfenweise zu der AHRP unter Vortex- Mischen gegeben, so daß das molare Verlhältnis 50/l betrug. Die Reaktion[smischung] wurde eine Stunde in einem Wasserbad bei 42ºC unter sanftem Schütteln inkubiert.
Das Reaktionsprodukt wurde in einen "Spektrapor Nr. 2"-Dialyseschlauch getan und wie folgt dialysiert:
a) 1 l DMF/4'-HA/0,1 M EPPS, pH 8,0 (1 : 1), eine Stunde bei 42ºC;
b) die Dialysebedingung a) wurde einmal wiederholt;
c) 1,5 l 0,1 M EPPS, ph. 8,0, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA), 1,5 Stunden bei 8ºC;
d) 1,5 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, 18 Stunden bei 8ºC;
e) 1,5 l 0,04 M Tris HCL/0,15 M NaCl, pH 7,5, 2 Stunden bei 8ºC; und
f) die Dialysebedingung e) wurde einmal für 4 Stunden wiederholt.
Nach der Dialyse wurden 0,02% Merthiolat als ein Konservierungsstoff zugesetzt. Das markierte Hydantoin-Derivat wurde in einem Kühlschrank gelagert.
3. Präparation von AHRP-HD3 (enthaltend einen erweiterterten Linker mit einer Amidbinding, Markierung AHRP-HD 3, Markierung C).
HD 3 (9,2 mg) wurde in 1 ml trockenem DMF, das 10 mM 4'-Hydroxyacetanilid enthielt (DMF/4'-HA), gelöst.
Eine Lösung von AHRP, hergestellt wie in dem Markierung-vorbereitenden Beispiel 1 beschrieben, wurde in 0,1 M EPPS-Puffer, pH 8,0, umdialysien. Die Endkonzentration wurde mit 5,71 mg/ml bestimmt.
Die AHRP (1 ml) wurde mit 500 ul DMF/4'-HA unter Vortex-Mischen zusammengebracht und wurde dann in ein Wasserbad bei 42ºC getan. Die oben beschriebene HD 3- Lösung (500 ul) wurde tropfenweise zu der AHRP unter Vortex-Mischen gegeben, so daß das molare Verhältnis von HD 3/AHRP 50/1 betrug. Die Reaktion[smischung] wurde 1 Stunde in einem Wasserbad bei 42ºC unter sanftem Schütteln inkubiert. Die Reaktion[smischung] wurde in einen "Spectrapor Nr. 2"-Dialyseschlauch gegeben, gemeinsam mit zusätzlich 0,5 ml DMF/4'-HA/0,1 M EPPS (1 : 1), was verwendet wurde, um den Reaktionsbehälter zu spülen.
Die Reaktion[smischung] wurde wie folgt dialysiert:
a) 1 l DMF/4'-HA/0,1 M EPPS, pH 8,0, (1 : 1), 1 Stunde bei 42ºC;
b) die Dialysebedingung a) wurde einmal wiederholt;
c) 1,5 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, enthaltend 0,1% BSA, 15 Stunden bei 5ºC;
d) 1,5 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, für 8 Stunden;
e) 2 l 0,02 M 3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS), pH 7,0, 13 Stunden bei 5ºC; und
f) die Dialysebedingung e) wurde zweimal wiederholt.
Nach der Dialyse wurde Merthiolat in einer Konzentration von 0,02% als ein Konservierungsstoff zugesetzt, und die Markierung wurde gekühlt aufbewahrt.

Markierte Barbiturat-Arzneistoff-Hapten-Analoga

Die folgenden. Beispiele demonstrieren die Herstellung von markierten Barbiturat- Arzneistoff-Hapten-Analoga.
4. Präparation von, mit Amin-angereicherter HRP markiertem PB 2 (Markierung AHRP-PB 2, Markierung D).
PB 2 wurde in DMSO gelöst, um eine Lösung mit 10,7 mg/ml (1,25 · 10&supmin;² M) zu ergeben. Dann wurden 500 ul dieser Lösung tropfenweise zu einer Lösung aus Amin- angereicherter HRP/DMSO (ähnlich hergestellt wie AHRP/DMF) unter Vortex-Mischen gegeben. Das molare Verhältnis von Phenobarbital/HRP betrug 50/1.
Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden unter Schütteln mit 2400 Upm durchgeführt. Die Probe wurde in einen "Spectrapor Nr. 2"-Dialyseschlauch überführt, gemeinsam mit zusätzlich 1 ml Dialysat, das verwendet wurde, um den Reaktionsbehälter zu spülen. Die Markierung wurde in 0,02 M MOPS-Puffer, pH 7,0, bei 5-10ºC umdialysiert. Diese Dialysebedingung wurde dreimal mit jeweils 2-3 l Puffer wiederholt. Nach der Dialyse wurden 0,02% Merthiolat als ein Konservierungsstoff zugesetzt, und die Markierung wurde gekühlt gelagert.
5. Präparation von Amin angereicherte HRP-PB 3 (AHRP-PB 3, Markierung E, enthaltend einen erweiterten Linker).
Amin-angereichterte HRP wurde einem Pufferwechsel von MOPS-Puffer zu 0,1 M EPPS- Puffer, pH 8,0, unterzogen, wobei ein "Centricell"-Zentrifugalultrafilter (30.000, Ausschlußgrenze für nominelles Molekulargewicht) verwendert wurde. Diese Probe wurde dann auf 4,6 ml, 0,743 mg/ml verdünnt.
Ein ml der HRP (1,85 · 10&supmin;&sup5; M) wurde in eine kleine Phiole gegeben. 500 ul Dimethylformamid, Aldrich 22, 705-6, das 10 mM 4'-Hydroxyacetanilid enthielt (DMF/4'-HA), wurde in die Phiole gegeben, [es] wurde gevortext, und [die Phiole wurde] in ein Wasserbad bei 42ºC gestellt.
Zwischenzeitlich wurde PB-3 in DMF/4'-HA gelöst, um eine Lösung mit 2,12 mg/ml (3,70 · 10&supmin;³ M) zu ergeben. 500 ul dieser Lösung wurde tropfenweise zu der HRP/DMF/4'-HA-Lösung gegeben, während durch Vortexen gemischt wurde. Das molare Verhältnis von Phenobarbital/HRP betrug 100/l.
Die Inkubation wurde 1 Stunde bei 42ºC unter sanftem Schütteln in einem Wasserbad durchgeführt. Die Probe wurde in einen "Spectrapor Nr. 3"-Dialyseschlauch überführt, gemeinsam mit zusätzlich 1 ml DMF/4'-HA/0,1 M EPPS (1 : 1), was verwendet wurde, um den Reaktionsbehälter zu spülen.
Die Reaktion[smischung] wurde wie folgt dialysiert:
a) 1 l DMF/4' = HA/0,1 M EPPS, pH 8,0 (1 : 1), 1 Stunde bei 42ºC;
b) die Dialysebedingung a) wurde einmal wiederholt;
c) 1,5 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA), über Nacht bei 5ºC;
d) 1,5 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, 8 Stunden bei 5ºC;
e) 2,0 l 0,02 M MOPS, pH 7,0, mindestens 8 Stunden bei 5ºC; und
f) die Dialysebedingung e) wurde zweimal wiederholt. Nach der Dialyse wurden 0,02% Merthiolat als ein Konservierungsstoff zugesetzt, und die Markierung wurde gekühlt gelagert.
6. Präparation eines Amin angereicherte HRP-PB 1 (Markierung AHRP-PB 1, Markierung F, ein aktiver Ester eines Phenobarbital-Hapten-Analogons, enthaltend einen erweiterten Linker mit einer Amidbindung).
Amin angereicherte HRP wurde hergestellt und [der Puffer] gegen 0,1 M EPPS-Puffer, pH 8,0, ausgetauscht, um eine Lösung von 10 mg/ml (2,5 · 10&supmin;&sup4; M) zu ergeben. Die Markierung F wurde hergestellt, indem 5 ml (50 mg) Amin-angereicherte HRP verwendet wurde. 2,5 ml DMSO wurden langsam zugesetzt, während auf einer magnetischen Rührplatte gerührt wurde. Die Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Zwischenzeitlich wurde PB 1 in DMSO gelöst, um eine Lösung von 14,9 mg/ml zu ergeben. 2,5 ml dieser Lösung wurden langsam unter Rühren zu der HRP/DMSO-Lösung gegeben. Das molare Verhältnis von Phenobarbital/HRP betrug 50/1.
Die Inkubation würde bei Raumtemperatur 5 Stunden unter Schütteln mit 2400 Upm durchgeführt. Die Probe wurde in einen "Spectropor Nr. 2"-Dialyseschlauch überführt, gemeinsam mit zusätzlichem Dialysat, [das verwendet wurde,] um den Reaktionsbehälter zu spülen. Die Markierung wurde in 0,02 M MOPS-Puffer, pH 7,0, bei 5-10ºC umdialysiert. Diese Dialysebedingung wurde dreimal mit jeweils 3 l Puffer wiederholt. Nach der Dialyse wurden 0,02% Merthiolat als ein Konservierungsstoff zugesetzt, und die Markierungen wurden gekühlt gelagert.

Immunkompetenz

Die folgenden Tests demonstrieren die Immunkompetenz der oben aufgeführten Markierungen 1 bis 6.
1. Immunkompetenz der Markierung AHRP-HD 1 (Markierung A).
In diesem Beispiel wird die Fähigkeit mehrerer immobilisierter Antikörper (DilAs&sub8;, DilAs&sub9;, DilAs&sub1;&sub4;, DilAs&sub1;&sub6; und DilAs&sub2;&sub1;), AHRP-HD 1 (Markierung A aus dem Markierung- vorbereitenden Beispiel 1) zu binden, untersucht.
(a) Proben von Polymer-Beads, wobei jede Probe einen der oben identifizierten Typen von Antikörpern kovalent daran gebunden hatte, wurden unter Verwendung der in EP- A-323 692 beschriebenen Methoden und Materialien hergestellt.
(b) Die Fähigkeit der immoilisierten Antikörper, AHRP-HD 1 (Markierung A) zu binden, wurde wie folgt bestimmt:
Jede [Probe] der unterschiedlichen Antikörper-Beads wurde seriell mit PBS, das 1% BSA enthielt, verdünnt, um Konzentrationen an Antikörperbindungsstellen zwischen 500 und 0,50 nM zu ergeben. Die Beads-Verdünnungen wurden mit gleichen Volumina der Markierung bei 10 · 10&supmin;¹¹ M gemischt. Nach einer einstündigen Inkubation wurden die Beads durch Zentrifugation pelletiert. Eine. Probe (100 ul) des Überstands wurde mit 100 ul Substrat (o-Phenylendiamin/H&sub2;O&sub2;) gemischt. Die Raten der Farbentwicklung bei 450 nm wurden mit denen von Standards verglichen, um die Menge an Phenytoin-HRP-Markierung, die in der Lösung verblieben war, zu berechnen. Die Menge der Markierung, die bei der höchsten, getesteten Antikörperkonzentration (250 nM Bindungsstellen) an den immobilisierten Antikörper gebunden wurde, wird angegeben.

% Markierung, gebunden bei 250 nM Antikörperbindungsstellen

Markierung A (erweiterter Linker)

DilAs&sub8; 93
DilAs&sub9; 94
DilAs&sub1;&sub4; 90
DilAs&sub1;&sub6; 96
DilAs&sub2;&sub1; 97
Diese Ergebnisse zeigen, daß diese Antikörper AHRP-HD 1-Markierungen (Markierung A) sehr gut erkennen.
2. Hydrolytische Stabilität von AHRP-HD 2 (Markierung B).
Dieses Beispiel veranschaulicht die hydrolytische Stabilität eines markierten Phenytoin- Derivats der Erfindung, AHRP-HD 2 (Markierung B), das eine Amidbindung in der verbindenden Kette zwischen der Markierung und dem Phenytoin-Kern hat.
Beads mit immobilisierten Kallestad-Antikörpern wurden wie in EP-A-0 323 692 beschrieben hergestellt.
AHRP-HD 2 (Markierung B) wurde in PBS, enthaltend 1% BSA, eingestellt auf pH 7,3 oder 8,5, auf 1 · 10&supmin;¹&sup0; M verdünnt. Die Markierung wurde 6 Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Die Markierung wurde nach 2 Tagen und 6 Tagen auf eine Bindung durch immobilisierten Antikörper wie folgt getestet:
Kallestad 52-2-Antikörper-Beads wurden seriell mit PBS, das 1% BSA enthielt, verdünnt, um Konzentrationen an Antikörperbindungsstellen zwischen 500 und 0,50 nM zu erhalten. Die Beads-Verdünnungen wurden mit gleichen Volumina an Markierungen bei 10 · 10&supmin;¹¹ M gemischt. Nach einer einstündigen Inkubation wurden die Beads durch Zentrifugation pelletiert. Eine Probe (100 ul) des Überstands wurde mit 100 ul Substrat (o- Phenylendiamin/H&sub2;O&sub2;) gemischt. Die Raten wurden mit solchen von Standards verglichen, um die Menge an Markierung, die in der Lösung zurückblieb, zu berechnen. Die Menge an Markierung, die bei der höchsten getesteten Antikörperkonzentration (250 nM Bindungsstellen) an den immobilisierten Antikörper gebunden wurde, wird angegeben. Prozent Markierung, gebunden bei 250 nM Antikörperbindungsstellen
Die Ergebnisse zeigen, daß eine Bindung von AHRP-HD 2 (Markierung B), das die Amidbindung in der verbindenden Kette enthielt, während dieser Zeitdauer keine Degradation zeigte. Das zeigt, daß die Markierung B einer Degradation aufgrund von. Hydrolyse gegenüber resistent sein wird. Eine derartige Hydrolyse kann mit der Zeit eine Verschiebung der Testantwort verursachen.
3. Vergleich der Phenobarbital-HRP-Markierungen, die mit Valerat und erweiterten Linkern hergestellt wurden.
In diesem Beispiel wird die Fähigkeit von mehreren immobilisierten Antikörpern (Kall 1571 und PbAs9); eine Markierung mit dem Valerat-Linker (Markierung D, AHRP-PB 2) zu binden, mit der Fähigkeit, an eine Markierung mit einem erweiterten Linker (Markierung F, AHRP-PB 1) zu binden, verglichen.
Proben mit immobilisierten Antikörper-Beads wurden wie folgt präpariert:
Polymer-Beads (30 mg) [Poly(styrol-co-p-vinylbenzyl-2-chlorethylsulfon) (95 : 5, molares Verhältnis)] wurden in 1 ml Puffer (0,1 M EPPS, pH 8,5) dispergiert, und 0,3 mg Antikörper (Kall 1571 oder PbAs9) wurden zugesetzt. Das Gesamtvolumen betrüg 1,5 ml. Die Mischung wurde Kopf-Über-Kopf 4 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Dann wurden 0,3 ml einer Lösung mit 10% BSA zugesetzt, und die Überstände wurden entfernt und auf nicht-gebundenen Antikörper unter Verwendung eines Anti-Maus-IgG untersucht. Die Menge an Antikörper, der an die Oberfläche gebunden war, wurde unter Verwendung eines ELISA berechnet. Die Sedimente wurden dreimal mit PBS, pH 7,2, durch Resuspendieren in dem Puffer und Zentrifugieren gewaschen. Das letztmalige Wiederaufnehmen durch Dispersion erfolgte in 1,8 ml PBS; Merthiolat wurde in einer Konzentration von 0,02% zugegeben, und die Präparationen wurden bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert.
Die Fähigkeit der immobilisierien Antikörper, die Markierung zu binden, wurde wie folgt bestimmt:
Jede [Probe] der unterschiedlichen Antikörper-Beads wurde seriell mit PBS, das 1% BSA enthielt, verdünnt, tim Konzentrationen an Antikörper-Bindungsstellen zwischen 200 und 0,50 nM zu ergeben. Die Bead-Verdünnungen wurden mit gleichen Volumina an Phenobarbital-HRP-Markierungen bei 10 · 10&supmin;¹¹ M gemischt. Nach einer einstündigen Inkubation wurden die Beads durch Zentrifugation pelletiert. Eine Probe (100 ul) des Überstands wurde mit 100 ul Substrat (o-Phenylendiamin/H&sub2;O&sub2;) gemischt. Die Raten der Farbentwicklung bei 450 nm wurden mit denen von Standards verglichen, um die Menge an Phenobarbital-HRP- Markierung, die in Lösung geblieben war, zu berechnen. Die Menge der Markierung, die bei der höchsten getesteten Antikörper-Konzentration (100 nM Bindungsstellen) an den immobilisierten Antikörper gebunden wurde, wird angegeben. % Markierung, gebunden bei 100 nM Antikörperbindungsstellen
Diese Ergebnisse zeigen, daß diese Antikörper eine verbesserte Erkennung von Markierungen, die mit Haptenen hergestellt wurden, welche die erweiterte verbindende Gruppe, die bei den markierten Arzneistoff-Hapten-Analoga, die durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt werden, verwendet wurden, aufweisen. Dies stellt einen erheblichen Vorteil dar, da das Hapten mit dem erweiterten Linker ermöglicht, diese Antikörper bei der Entwicklung eines Immuntests auf Phenobarbital zu berücksichtigen.
Der Immuntest kann ausgeführt werden, indem jede geeignete Markierung, welche an die definierten Hydantoin- und Barbiturat-Derivate angehängt werden kann, verwendet wird. Zusätzlich zu der Meerrettich-Peroxidase, die zum. Herstellen der vorangehend genannten markierten Arzneistoff-Hapten-Analoga verwendet wurden, schließen geeignete Markierungen radioaktive Anhänge, Farbstoffe, fluoreszierende Agenzien, andere Enzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, allosterische Effektoren, Co-Faktoren und andere bekannte Enzym- Modulatoren ein. Enzyme, wie etwa Glucoseoxidase, Peroxidasen, wie etwa Meerrettich- Peroxidase und Amin angereicherte Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und Galaktosidase sind bevorzugte Markierungen.
Wenn eine Enzym-Markierung verwendet wird, ist das Substrat des Enzyms in dem Element vorhanden oder wird diesem in der Entwicklerflüssigkeit zugesetzt. Das Substrat kann dem Element vor oder gleichzeitig mit der flüssigen Probe zugesetzt werden, oder nachdem die Bindungsreaktion abgeschlossen ist. Es entspricht der Fähigkeit eines durchschnittlichen Mitarbeiters im Bereich der klinischen Chemie, ein geeignetes Substrat für eine vorgegebene Markierung zu bestimmen. Bei dem Substrat kann es sich um ein Material handeln, auf welches die Enzym-Markierung direkt wirkt, oder um ein Material, das an einer Reihe von Reaktionen, in welche die enzymatische Reaktion der Markierung eingebunden ist, beteiligt ist. Wenn beispielsweise die Enzym-Markierung eine Peroxidase ist, ist, das Substrat Waserstoffperoxid. Benutzt man Glucoseoxidase als ein Beispiel, ist das Substrat Glucose im allgemeinen in der Reagenzschicht vorhanden oder wird mit der Entwicklerflüssigkeit zugegeben, um 0,01 Mol/m² und bevorzugterweise 0,001 bis 0,1 Mol/m² zu ergeben. Ein Mitarbeiter, der sich im Stand der Technik auskennt, würde wissen, wie die Menge eines bestimmten Substrats für die Menge der in dem Test eingesetzten Markierung einzustellen ist.
Wenn bestimmte Markierungen verwendet werden, beispielsweise Enzyme, Co-Faktoren, Enzym-Substrate oder Enzym-Modulatoren, enthält die Reagenzschicht eine Indikator-Zusammensetzung, die ein oder mehr Reagenzien umfaßt, welche als ein Ergebnis der Reaktion der Markierung eine meßbare Spezies verfügbar machen. Bevorzugterweise ist die Indikator- Zusammensetzung eine colorimetrische Indikator-Zusammensetzung, die eine colorimetrisch nachweisbare Spezies als ein Ergebnis einer enzymatischen Reaktion eines Enzym-markierten Ligand-Analogons mit dem Substrat verfügbar macht.
Die Indikator-Zusammensetzung kann eine einzelne Verbindung sein, die auf eine enzymatische Reaktion hin einen meßbaren Farbstoff produziert, oder eine Kombination von Reagenzien, die den Farbstoff produziert. Wenn beispielsweise Glucose als das Substrat und Glucoseoxidase als die Enzym-Markierung verwendet werden, kann die colorimetrische Indikator- Zusammensetzung eine Kuppler- und oxidierbare Verbindung beinhalten, welche unter Bereitstellung eines. Farbstoffs reagiert. Alternativ kann die Zusammensetzung einen Leukofarbstoff und Peroxidase oder eine andere geeignete peroxidative Verbindung beinhalten, die einen nachweisbaren Farbstoff als ein Resultat der Bildung von Wasserstoffperoxid herstellt, wenn Glucoseoxidase Glucose zu Gluconsäure umsetzt. Zweckmäßige Leukofarbstoffe sind nach dem Stand der Technik bekannt und schließen solche ein, die z. B. im US-Patent 4,089,747 und in EP-A-162 685 beschrieben wurden. Die jeweiligen Mengen der colorimetrischen Indikator-Zusammensetzung und ihre verschiedenen Bestandteile entsprechen den Fähigkeiten eines Mitarbeiters, der mit dem Stand der Technik vertraut ist.
Die Immuntests können manuell [durchführbar] oder automatisiert sein. Im allgemeinen wird die Menge eines Liganden in einer Flüssigkeit bestimmt, indem das Element einer Spenderrolle, einer Chip-Schachtel oder einer anderen Quelle entnommen wird und ein begrenzter Bereich der Verteilungsschicht physisch mit einer Probe der Flüssigkeit, z. B. 1 bis 100 ul, in Kontakt gebracht wird. Der begrenzte Bereich, der in Kontakt gebracht wird, beträgt im allgemeinen nicht mehr als 100 mm².
Die Menge an Ligand wird bestimmt, indem man das Element ein geeignetes Gerät zum direkten Messen des komplexierten Ligand-Analogons oder der nachweisbaren Spezies, die als ein Ergebnis einer enzymatischen Reaktion einer Enzym-Markierung und eines Substrats gebildet wird, passieren läßt. Die Spezies können beispielsweise durch geeignete radiometrische, fluorometrische oder spektrophotometrische Geräte unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren nachgewiesen werden. Bei einer enzymatischen Reaktion wird das resultierende Produkt durch Messen, beispielsweise der Reflexions- oder Transmissionsdichte oder der Fluoreszenz im Zentrum des begrenzten Bereichs, der mit der Testprobe in Kontakt gebracht wurde, bestimmt. Der Bereich, der gemessen wird, hat im allgemeinen einen Durchmesser von 3 bis 5 mm bei kompetitierenden Tests. Die Menge an Ligand in der flüssigen Probe ist umgekehrt proportional zu der Menge an Markierung, die im Zentrum des begrenzten Bereichs gemessen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein separater Entwicklungsschritt erforderlich, um die Trennung von komplexiertem Ligand und nicht-komplexiertem Ligand zu maximieren. Im allgemeinen wird eine Messung der Markierung 5 bis 180 Sekunden nach Probenkontakt und Verteilen oder Applikation der Entwicklerflüssigkeit durchgeführt.
Die nachfolgenden Beispiele demonstrieren die Immuntests vorteilhafterweise auf Immuntest- Trockenelementen, wobei die oben beschriebenen markierten Arzneistoff-Hapten-Analoga verwendet wurden. Die Beispiele demonstrieren die Erfindung anhand eines Durchführens von Tests auf Phenytoin und Phenobarbital. Es wird allerdings klar sein, daß die Erfindung auf andere Barbiturate und mit Hydantoin-Arzneistoff-Derivaten anwendbar ist.
In diesen Beispielen werden die. Testverfahren schrittweise nach dem folgenden Protokoll durchgeführt. Zehn ul einer Probe wurden auf den oberen Teil der Oberfläche eines Immuntest-Trockenelements der Erfindung getropft. Das Element mit der jetzt aufgetropften Probe wurde dann 5 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach dieser Inkubationsdauer wurde das Element aus dem Inkubator genommen und mit 10 ul Enzym-Substrat-Lösung entwickelt. Bei den in den Beispielen verwendeten Tests ist die Markierung Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase, HRP), und das in der Entwicklerlösung verwendete Substrat ist ungefähr 0,3 Gew.-% H&sub2;O&sub2;. Die Entwicklerlösung enthält ebenfalls Natriumphosphat-Puffer (pH 6,8), 0,01 M, 4'-Hydroxyacetanilid (Elektronen-übertragendes Agens), 0,005 M, Diethylentriaminpentaessigsäure, 10 uM, und ein oberflächenaktives Agens (Detergenz). Die Entwicklerlösung löst eine Entwicklung der nachweisbaren Spezies aus. Der gebundene HRP-markierte Ligand katalysiert die Oxidation eines farblosen Leukofarbstoffs zu seiner gefärbten Form. Derartige Farbstoffe sind bei analytischen Trockenelementen nach dem Stand der Technik bestens bekannt und sollen hier nicht genau beschrieben werden. In den hier dargestellten Beispielen ist der Leukofarbstoff ein Triarylimidazol. Die Rate der katalysierten Reaktion wird über die Änderung der Reflexionsdichte über die Zeit bei 37ºC gemessen.
Material und Methoden zum Messen der Reflexionsdichte sind im Bereich der Analyse bestens bekannter Stand der Technik
Beispiel 1: Verwendung eines markierten Phenytoin-Analogons (AHRP-HD 1, Markierung A) in einem Immuntest auf Phenytoin.
Das Element wurde unter Anwendung bekannter Technologie hergestellt, um die folgende Struktur aufzuweisen:
Eine Reihe von Kalibratoren, die auf menschlichem Serum beruhten [und] Phenytoin und ein AHRP-HD 1 (Markierung A) enthielten, wurde hergestellt. Lyophilisierte Kalibratoren (Bio- Rad), basierend auf Serum, wurden mit 3 ml entionisiertem Wasser rehydratisiert. Die Konzentration von Phenytoin variierte von 0,5 bis 128 ug/ml. Markierung A wurde zugesetzt, wodurch eine Endkonzentration von 1 nM erhalten wurde.
Die Reihe von Phenytoin-Standards (10 ul-Aliquots) wurde auf die Verteilungsschichten einer Reihe von identischen analytischen Elementen, welche die oben angegebene Konfiguration hatten, getropft. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37ºC wurde eine Entwicklerlösung (10 ul), die Wasserstoffperoxid (0,03%), Natriumphosphat-Puffer (0,01 M, pH 6,8), 4'- Hydroxyacetanilid (5 mM) und Diethylentriaminpentaessigsäure (10 uM) umfaßte, zugegeben, um die Farbstoffentwicklung auszulösen. Nach ungefähr einer Minute wurde die Reflexionsdichte (Dr) im Zentrum des Bereichs bei 680 nm bei 37ºC gemessen. Die Dr-Werte wurden durch die Clapper-Williams-Transformation in Dt-Werte umgewandelt. Die Änderung in Dt über 30 Sekunden wurde berechnet. Die Ergebnisse werden unten dargestellt:

Phenytoin, ul/ml Rate (Dt/min)

0,5 0,0954
1,0 0,0950
2,0 0,0869
4 0 0,0788
8,0 0,0661
16,0 0,0522
32,0 0,0364
64,0 0,0237
128,0 0,0157
Die Ergebnisse zeigen, daß es eine signifikante Änderung der Raten über den gewünschten dynamischen Bereich gibt. Der therapeutischen Bereich beträgt 10-20 ug/ml. Dieses Beispiel zeigt ein analytisches Element, das bei dem Immuntest-Verfahren, das durch die Erfindung verfügbar gemacht wird, nützlich ist, und seine Verwendung in einem kompetitiven Bindungstest zum Nachweis des Arzneistoffs Phenytoin.

Beispiel 2:

Verwendung von AHRP-HD 2 (Markierung B) mit dem erweiterten Linker und einer Amidbindung in einem Immuntest auf Phenytoin.
Dieses Beispiel demonstriert ein weiteres analytisches Element, das durch diese Erfindung verfügbar gemacht wird, und seine Verwendung als ein markiertes Hydantoin-Derivat der Erfindung in einem kompetitiven Bindundungstest zum Nachweis des Arzneistoffs Phenytoin.
Das Element wurde unter Verwendung bekannter Technologie hergestellt und weist die folgende Struktur auf:
Eine Reihe von Kalibratoren, die auf menschlichem Serum beruhten [und] Phenytoin und die Markierung B (AHRP-HD 2) enthielten, wurde hergestellt. Gefrorene, auf Serum basierende Kalibratoren enthielten Phenytoin in Konzentrationen von 0 bis 70 ug/ml. Die Markierung B wurde zugesetzt, so daß sich eine Endkonzentration von 1 nM ergab.
Eine Reihe von Phenytoin-Standards (10 ul-Aliquots) wurde auf die Verteilungsschichten einer Reihe von identischen analytischen Elementen gemäß der oben aufgeführten Konfiguration aufgetropft. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37ºC wurde eine Entwicklerlösung (10ul), die Wasserstoffperoxid (0,03%) Natriumphosphat-Puffer (0,01 M, pH 6,8), 4'- Hydroxyacetanilid (5 mM) und Diethylentriaminpentaessigsäure (10 uM) enthielt, zugesetzt, um die Farbstoffentwicklung auszulösen. Nach ungefähr 1 Minute wurde die Reflexionsdichte (Dr) im Zentrum der Fläche bei 680 nm bei 37ºC gemessen. Die Dr-Werte wurden durch die Clapper-Williams-Transformation in Dt-Werte umgewandelt. Die Änderung in Dt über 30 Sekunden wurde berechnet. Die Ergebnisse werden unten gezeigt:

Phenytoin, ug/ml Rate (Dt/min)

0 0,0759
10 0,0338
20 0,0293
40 0,0206
70 0,0159
Die Ergebnisse zeigen, daß es über den gewünschten dynamischen Bereich eine signifikante Änderung der Raten gibt. Der therapeutische Bereich ist 10-20 ug/ml.

Beispiel 3:

Verwendung von markiertem Phenytoin-Derivat, AHRP-HD 3 (Markierung C), das einen erweiterten Linker, hergestellt aus Hexandiamin mit Amidbindungen, aufweist, in einem Immuntest auf Phenytoin.
Dieses Beispiel demonstriert die Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen analytischen Elements mit einem anderen markierten Hydantoin-Derivat der Erfindung in einem kompetitiven Bindungstest zum Nachweisen des Arzneistoffs Phenytoin.
Eine Reihe von, auf menschlichem Serum beruhenden Kalibratoren, die Phenytoin und die Markierung C aus dem Markierung-vorbereitendem Beispiel 3 enthielten, wurde hergestellt. Gefrorene, auf Serum beruhende Kalibratoren enthielten Phenytoin in Konzentrationen von 0 bis 70 ug/ml. Die Markierung C wurde zugesetzt, so daß eine Endkonzentration von 1 nM erhalten wurde.
Eine Reihe von Phenytoin-Standards (10 ul-Aliquots) wurde auf die Verteilungsschichten einer Reihe von analytischen Elementen, die mit den in Beispiel 10 beschriebenen identisch waren, abgesehen davon, daß sie die Markierung C anstelle der Markierung B enthielten, getropft. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37ºC wurde eine Entwicklerlösung (10 ul), die Wasserstoffperoxid (0,03%), Natriumphosphat-Puffer (0,01 M, pH 6,8), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mM) und Diethylentriaminpentaessigsäure (19 uM) enthielt, zugesetzt, um die Farbstoffentwicklung auszulösen. Nach ungefähr 1 Minute wurde die Reflexionsdichte (Dr) im Zentrum der Fläche bei 680 nm bei 37ºC gemessen. Die Dr-Werte wurden durch die Clapper-Williams- Transformation in Dt-Werte umgewandelt. Die Änderung in Dt über 30 Sekunden wurde berechnet. Die Ergebnisse werden unten gezeigt.
0 0,0872
10 0,0439
20 0,0340
40 0,0255
70 0,0202
Die Ergebnisse zeigen, daß es über den gewünschten dynamischen Bereich eine signifikante Änderung der Raten gibt.

Beispiel 4:

Verwendung einer Phenobarbital-HRP-Markierung, präpariert mit einem erweiterten Linker, in einem Enzymimmuntest auf Phenobarbital.
Dieses Beispiel demonstriert die Herstellung eines analytischen Elements dieser Erfindung und seine Verwendung in einem kompetitiven Bindungstest zum Nachweisen des Arzneistoffs Phenobarbital.
Das Element wurde mit der folgenden Struktur hergestellt:
Eine Reihe von, auf menschlichem Serum beruhenden Kalibratoren, die Phenobarbital oder eine Phenobarbital-HRP-Markierung (Markierung AHRP-PB 3 oder Markierung E des PB-3 aus dem Markierung-vorbereitenden Beispiels 6) enthielten, wurde hergestellt. Die Konzentration von Phenobarbital variierte von 0 bis 80 ug/ml. Die Phenobarbital-HRP-Markierung wurde zugesetzt, so daß sich eine Endkonzentration von 6 nM ergab.
Die Reihe von Phenoborbital-Standards (10 ul-Aliquots) wurde auf die Verteilungsschichten einer Reihe von analytischen Elementen getropft. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37ºC wurde ein Waschlösung (10 ul), die Wasserstoffperoxid (0,03%), Natriumphosphat-Puffer (0,01 M, pH 6,8), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mM) und Diethylentriaminpentaessigsäure (10 uM) umfaßte, zugesetzt, um nicht-gebundenen Komplex vom Zentrum der Fläche, auf welche die Phenobarbital-Standards aufgegeben worden waren, wegzuwaschen, und um die Farbstoffentwicklung auszulösen. Nach ungefähr 1 Minute wurde die Reflexionsdichte (Dr) im Zentrum der Fläche bei 680 nm bei 37ºC gemessen. Die Dr-Werte wurden durch die Clapper- Williams-Transformation in Dt-Werte umgewandelt. Die Änderung in Dt über 30 Sekunden wurde berechnet. Die Ergebnisse werden unten dargestellt:

Phenobarbital, ug/ml Rate (Dt/min)

0 0,095
7 0,073
20 0,053
40 0,038
80 0,026
Die Ergebnisse zeigen, daß es über den gewünschten dynamischen Bereich eine signifikante Änderung der Raten gibt. Der therapeutische Bereich ist 20-40 ug/ml.

Beispiel 5:

Verwendung einer Phenobarbital-HRP-Markierung, hergestellt mit einem erweiterten Linker mit einer Amidbindung, in einem Enzym-Immuntest auf Phenobarbital.
Dieses Beispiel demonstriert die Präparation eines analytischen Elements dieser Erfindung und seine Anwendung bei einem kompetitiven Bindungstest zum Nachweisen des Arzneistoffs Phenobarbital.
Das Element wurde mit der folgenden Struktur hergestellt:
Eine Reihe von, auf menschlichem Serum beruhenden Kalibratoren, die Phenobarbital und eine Phenobarbital-HRP-Markierung (AHRP-PB-1, Markierung F aus dem Markierung-vorbereitenden Beispiel 6) enthielten, wurde hergestellt. Gefrorene, auf Serum beruhende Kalibratoren enthielten Phenobarbital in Konzentrationen von 0 bis 80 ug/ml. Die Phenobarbital-HRP-Markierung wurde zugesetzt, so daß sich eine Endkonzentration von 8 nM ergab.
Eine Reihe von Phenobarbital-Standards (10 ul-Aliquots) wurde auf die Verteilungsschichten einer Reihe von analytischen Elementen getropft. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37ºC wurde eine Waschlösung (10 ul), die Wasserstoffperoxid (0,03%), Natriumphosphatpuffer (0,01 M, pH 6,8), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mM) und Diethylentriaminpentaessigsäure (10 uM) enthielt, zugesetzt, um nicht-gebundenen Komplex vom Zentrum der Fläche, auf welche die Phenobarbital-Standards aufgetragen worden waren, wegzuwaschen und um die Farbstoffentwicklung auszulösen. Nach ungefähr 1 Minute wurde die Reflexionsdichte (Dr) im Zentrum der Fläche bei 680 nm bei 37ºC gemessen. Die Dr-Werte wurden durch die Clapper- Williams-Transformation in Dt-Werte umgewandelt. Die Änderung in Dt über 30 Sekunden wurde berechnet. Die Ergebnisse werden unten dargestellt:

Phenobarbital, ug/ml Rate (Dt/min)

0 0,116
7 0,083
20 0,043
40 0,026
80 0,017
Diese Ergebnisse zeigen, daß es über den gewünschten dynamischen Bereich eine signifikante Änderung der Raten gibt. Der therapeutische Bereich ist 20-40 ug/ml.
Bei den Elementen der Beispiele der Erfindung wird das markierte Arzneistoff-Hapten- Derivat mit der Probe auf das Element getropft. Alternativ kann das markierte Arzneistoff- Hapten-Analogon durch Gravur über die Verteilungsschicht des Elements geschichtet werden.

Claims

1. Immunotest-Verfahren auf einen Wirkstoff, umfassend:

A. In Kontakt bringen einer flüssigen Probe, die den Wirkstoff oder ein Derivat davon enthält, mit einem markierten Analogon des Wirkstoffs oder Wirkstoff- Derivats in Gegenwart von Antikörpern gegen den Wirkstoff unter Bedingungen, die die Bildung von Antikörper-Wirkstoff-Immunkomplexen fördern; und

B. Bestimmen der Menge des Wirkstoffs in der Flüssigkeit durch Messen von gebundenem oder nicht-gebundenem markierten Wirkstoff-Analogon; dadurch charakterisiert, daß das markierte Wirkstoff-Analogon umfaßt:

(i) eine Enzym-Markierung;

(ii) einen Wirkstoffkern, ausgewählt aus einem Hydantoin- oder einem Barbiturat- Kern, und

(iii) eine verbindende Kette, die die 3-Position des Hydantoin- oder Barbituratkerns mit der Markierung über eine Carbonylbrücke verbindet; wobei die verbindende Keife, ausgenommen die Carbonylbrücke, 12 bis 40 Atome aufweist, bestehend aus:

(I) zwei oder mehr C&sub1;- bis C&sub1;&sub0;-Alkylengruppen, gegebenenfalls in Kombination mit einer oder mehreren Phenylengruppen, und/oder einem oder mehreren 5- bis 7-gliedrigen heterozyklischen Ringen, die in die verbindende Gruppe über Ring-Stickstoff-Atome eingebunden sind;

oder

(II) eine C&sub1;- bis C&sub1;&sub0;-Alkylengruppe in Kombination mit einer oder mehreren Phenylengruppen und einem oder mehreren 5- bis 7-gliedrigen heterozyklischen Ringen, die in die verbindende Gruppe über Ring- Stickstoff-Atome eingebunden sind;

wobei die Gruppen und Ringe miteinander über chemischen Gruppen verbunden sind, die ausgewählt sind aus

(a) Estern, (-COZ-), worin Z O oder S ist;

(b) Amiden, (-CONH-);

(c) Heteroatomen, ausgewählt aus -O-, -S-, und NR-; worin R C&sub1;- bis C&sub1;&sub0;- Alkyl repräsentiert; und

(d) Carbonyl.

2. Immunotest-Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verbindende Kette eine heterozyklische Gruppe beinhaltet, die aus 1,4-Piperazinylen, 2,5-Dimethyl-1,4-piperazinylen, 1,3-Imidazolidinylen und 1,3-Hexahydrodiazepinylen ausgewählt ist.

3. Immunotest-Verfahren nach Anspruch 1, wobei das markierte Wirkstoff-Analogon der Struktur:

(I)

entspricht, worin

A einen Hydantoin-Kern der Struktur

oder einen Phenobarbital-Kern der Struktur

repräsentiert;

worin R¹ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl aus 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, nichtsubstuiertes oder substituiertes Phenyl repräsentiert;

R², R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander C&sub1;- bis C&sub1;&sub0;-Alkylen repräsentieren oder solche Alkylengruppen, die mit einer oder mehreren Estergruppen, Amidgruppen, -O-, -S- und -NR-, unterbrochen sind;

R³ C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylen repräsentiert;

Z -O-, -S-, und -NR- repräsentiert, worin R Wasserstoff oder C&sub1;- bis C&sub6;-Alkyl repräsentiert;

m ist 0, 1 oder 2;

n ist 0, 1 oder 2;

m + n ist > 0, und

die Gesamtzahl der Atome, die von m, n und R² umfaßt sind, 12 bis 40 beträgt;

LABEL ist ein Enzym;

und weiter vorausgesetzt, daß (i) mindestens eine der R¹-Gruppen substituiertes oder nichtsubstituiertes Phenyl ist;

(ii) einer von R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; Phenylen sein kann; und

(iii) die eingeklammerten Komponenten von Struktur I in jeder Reihenfolge auftreten können.

4. Immunotest-Verfahren nach Anspruch 3, wobei:

R¹ unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Propyl, Hexyl, Dezyl, nichtsubstituiertes Phenyl oder mit Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiertes Phenyl, Nitro, Halogen, Cyano und Alkoxy von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen repräsentiert;

R², R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander Alkylen repräsentiert, ausgewählt aus Ethylen, Butylen, Pentylen, Octylen oder einem solchen Alkylen, das mit mindestens einer oder mehr Estergruppen, Amidgruppen, -O-, -S- oder -NR-, unterbrochen ist;

R³ Methylen, Ethylen oder Trimethylen repräsentiert; und

Z -NR- repräsentiert, worin R Wasserstoff, Methyl, Propyl oder Hexyl repräsentiert; und

LABEL ein Enzym repräsentiert.

5. Immunotest-Verfahren nach Anspruch 4, wobei R¹ unabhängig voneinander Phenyl oder Ethyl repräsentiert; R² Tetramethylen ist, R³ Ethylen ist, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander Ethylen oder Hexylen repräsentieren; Z -O- oder NH- ist, und LABEL ein Enzym ist.

6. Immunotest nach Anspruch 5, wobei die Markierung Meerrettichperoxidase (HRP) oder Amin angereicherte Meerrettichperoxidase (AHRP) ist, das markierte Wirkstoff- Analogon ein markiertes Phenytoin- oder Phenobarbital-Analogon ist und die verbindende Gruppe, die das Wirkstoff-Analogon mit der Meerrettichperoxidase verbindet, ausgewählt ist aus:

Tetramethylencarbonyliminohexamethyleniminocarbonylethylencarbonyl, Tetramethylencarbonyl-1,4-Piperazinylencarbonylethylencarbonyl, und Tetramethylencarbonyliminoethylenoxycarbonylethylencarbonyl.

7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, ausgeführt auf einem Immunotest-Element.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei das Verfahren auf einem Immunotest-Element ausgeführt wird, das das markierte Wirkstoff-Analogon enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, ausgeführt auf einem Immunotest-Element, das die Antikörper in einer Schicht oder Zone enthält, und eine separate Schicht oder Zone, die die markierten Hydantoin-Derivate enthält.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei das Verfahren auf einem Immunotest-Element ausgeführt wird, in dem die Antikörper an beads in einer partikulären Schicht immobilisiert sind und sich das markierte Wirkstoff-Analogon in einem Überzug direkt über der Schicht befindet, die die Antikörper enthält.

11. Immunotest-Element mit einer Schicht, Zone oder einem Überzug aus dem Markierten, ausgewählt aus einem Phenytoin- oder Phenobarbital-Analogon nach einem der Ansprüche 1-6.

12. Immunotest-Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei der Test auf einen Wirkstoff durchgeführt wird, der Phenytoin oder Phenobarbital ist.