DE69007473T2

DE69007473T2 - Katalysierte ablagerung von markierungsmittel.

Info

Publication number: DE69007473T2
Application number: DE69007473T
Authority: DE
Inventors: Mark Bobrow; Richard Ebersole; Gerald Litt; John Moran
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Revvity Health Sciences Inc
Priority date: 1989-03-29
Filing date: 1990-03-28
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2010-03-29
Also published as: ES2063347T3; WO1990011523A3; EP0465577B1; AU645491B2; DE69007473D1; JPH04504206A; AU5410190A; RU2102759C1; WO1990011523A2; JP2948904B2; EP0465577A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf Tests und genauer auf das Katalysieren der Beladung mit einem Reporter über ein aktiviertes Konjugat unter Verstärken des Detektorsignals, wodurch der Nachweis und/oder die quantitative Bestilnmung eines Analyten in einer Probe verbessert wird.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Einführung iinmundiagnostischer Tests in den 60er und 70er Jahren hat die Zahl der Analyten, die einer genauen und sorgfältigen Analyse zugänglich sind, stark erhöht. Radioimmunassays (RIA) und immunradiometrische Assays (IRMA) verwenden zum Messen eines Analyten die Radioisotopenmarkierung entweder eines Antikörpers oder eines konkurrierenden Antigens. Auf Enzymen oder Fluoreszenzmarkierungen beruhende Nachweissysteme wurden als Alternative zu Isotopennachweissystemen entwickelt. Tests auf Enzymgrundlage erwiesen sich als empfindlicher, schneller, weniger von teurer, hochentwickelter Ausrüstung abhängend.
Das Bedürfnis nach diagnostischen Tests mit einfacherem Format, erhöhter Empfindlichkeit mit weniger Abhängigkeit von teurer, hochentwickelter Ausrüstung veranlaßte Forscher zu versuchen, zum Entwickeln dieser neueren Tests die katalytische Wirksamkeit von Enzymen nutzbar zu machen.
D. L. Bates, Trends in Biotechnology, Seite 204-209, Bd. 5, Nr. 7 (1987), beschreibt zum Entwickeln empfindlicherer und einfacherer Immuntests Diagnostika, die ein Verfahren der Enzymverstärkung verwenden. Bei diesem Verfahren wird ein zweites Enzym-System mit der primären Enzymmarkierung gekuppelt, z.B. kann das primäre Enzym katalytisch mit einem weiteren System, wie etwa ein Substratzyklus oder eine Enzymkaskade, verknüpft werden. Somit ist gemäß Bates das Wesentliche der Enzymverstärkung das Kuppeln katalytischer Vorgänge, bei welchen ein Enzym durch die Wirkung eines zweiten Enzyms entweder durch direkte Anderung oder durch Wechselwirkung mit dem Produkt des kontrollierenden Systems moduliert wird.
Das an Doellgast am 26. Mai 1987 erteilte US-Patent 4 668 621 beschreibt die Anwendung eines enzymverbundenen Koagulationsassays (ELCA) zum Entwickeln eines verstärkten Immuntests unter Verwenden der Gerinnungskaskade, um die Nachweisempfindlichkeit von Immunkomplexen zu verstärken. Das Verfahren umfaßt die Gerinnungsbildung aufgrund einer Thrombin-aktivierten Fibrinbildung aus unlöslich gemachtem Fibrinogen und markiertem, löslich gemachtem Fibrinogen. Die Verstärkung der Menge an anzeigbarem Ligand, der an die feste Phase gebunden ist, wird nur durch Kombinieren der Verwendung von Gerinnungsfaktor-Konjugaten mit darauffolgenden Gerinnungskaskade-Reaktionen erhalten. Einer der Nachteile dieses Systems ist, daß es nur zum Messen der Anwesenheit von Materialien verwendet werden kann, welche die Aktivität eines oder mehrerer Blutgerinnungsfaktoren modulieren. Ein weiterer Nachteil ist, daß das primäre Enzym, Thrombin, nicht an einen Reporter oder ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars immobilisiert oder gekuppelt werden kann.
Das an Harris am 31. Juli 1984 erteilte US-Patent 4 463 090 beschreibt einen Kaskadenverstärkungs-Immuntest, der eine Kombination wenigstens zweier aufeinanderfolgender Katalysen erfordert, wobei ein erstes Enzym ein zweites Enzym aktiviert, das wiederum auf das Substrat einwirkt.
Ein weiteres Verstärkungssystem wird in dem am 1. Juli 1986 an Self erteilten US-Patent 4 598 042 und der UK-Patentanmeldung 2 059 421, die am 23. April 1981 veröffentlicht wurde, beschrieben, welche einen Immuntest beschreiben, der eine Enzymmarkierung zum direkten oder indirekten Erzeugen einer Substanz verwendet, welche befähigt ist, ein katalytisches Ereignis zu beeinflussen, ohne während des kata1ytischen Ereignisses selbst verbraucht zu werden. Genauer erzeugt oder entfernt ein primäres Enzymsystem eine Substanz, die zum Modulieren eines sekundären Enzymsystems befähigt ist, was zur Verstärkung führt. Die Enzymsysteme verwenden unkonjugierte Enzyme, um die Neigung zum Inaktivieren gewisser Enzyme bei der Konjugation zu vermeiden.
Die Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung Nr. 123 265, die am 31. Oktober 1984 veröffentlicht wurde, beschreibt einen weiteren Kaskadenverstärkung-Immuntest, bei welchem ein von Zymogen abgeleitetes Enzym an eine Zymogen-zu-Enzym-Kaskadenreaktionsfolge gekuppelt wird, um beim Herstellen nachweisbaren Markermaterials, das zum mengenmäßigen Bestiinmen einer Analytmenge verwendet wird, mehrfache Verstärkungsstufen zu erhalten.
Die Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung Nr. 144 744, die am 19. Juni 1985 veröffentlicht wurde, beschreibt einen spezifischen Bindungstest, der auf einer Enzymkaskadenverstärkung beruht, wobei der im Nachweisreagenz eingesetzte Markierungsbestandteil ein Teilnehmer bei oder ein Modulator einer Enzymkaskadenreaktion ist, bei welcher ein erstes Enzym auf ein erstes Substrat unter Erzeugen eines zweiten Enzyms wirkt. Der Erzeugung des zweiten Enzyms kann gefolgt werden oder das zweite Enzym kann auf ein zweites Substrat unter Erzeugen eines dritten Enzyms wirken.
In ähnlicher Weise beschreibt das am 9. März 1982 an Boguslaski et al. erteilte US-Patent 4 318 980 einen heterogenen, spezifischen Bindungstest mittels eines Konjugats, das aus einer spezifischen Bindungssubstanz gebildet ist, die an den Reaktanten, d.h. einen enzymatischen Reaktanten, gekuppelt ist. Die Fähigkeit des Reaktanten, an der Überwachungsreaktion zum Nachweisen der Anwesenheit eines Analyten teilzunehmen, wird durch die Anwesenheit des Liganden in dem Medium verändert. So ist das Konjugat in seinem freien Zustand bei der Überwachungsreaktion aktiver als in seinem gebundenen Zustand.
Ein heterogener spezifischer Bindungstest mittels Enzymverstärkung wird in der britischen Patentanme1dung Nr. 1 401 297, die am 30. Juli 1975 veröffentlicht wurde, und dem am 15. März 1983 an Rubenstein et al. erteilten US-Patent 4 376 825 beschrieben. Die Verstärkung wird durch Binden der zu bestimmenden Verbindung oder einer Kopie von ihr an ein Enzym erreicht. Der daraus folgende enzymgebundene Ligand konkurriert mit dem freien Liganden um spezifische Rezeptorstellen. Wenn der enzymgebundene Ligand durch den freien Liganden ersetzt wird, ist das Enzym anschließend frei, um mit einer großen Zahl Substratmoleküle zu reagieren und die Konzentration des restlichen Substrats oder des Produkts kann gemessen werden. Die internationale PTC-Veröffentlichung Nr. WO81/00725, die am 19. März 1981 veröffentlicht wurde, beschreibt ein Verfahren zum Bestimmen eines Substrats in einer Probe, welches das Überführen des Substrats in ein Produkt in einer ersten Stufe einer zyklischen Reaktionsfolge und Rücküberführen des Produkts zum Substrat in einer zweiten Reaktionsstufe der zyklischen Reaktionsfolge umfaßt. Wenigstens eine der ersten und zweiten Reaktionsstufen ist enzymkatalysiert.
Die PCT-Anmeldung mit der internationalen Veröffentlichungsnummer W084/02193, die am 7. Juni 1984 veröffentlicht wurde, beschreibt einen Immuntest mit einem chromogenen Träger, bei welchem der Analyt mit einem enzymmarkierten Antikörper in Berührung gebracht wird und bei welchem das durch die Reaktion des Enzyms mit seinem Substrat erzeugte Signal an einem aktiven Träger konzentriert wird.
Die am 21. Mai 1986 veröffentlichte europäischen Patentanmeldung Nr. 181 762 beschreibt ein Verfahren zum Bestimmen der enzymatischen Aktivität in einer flüssigen Probe durch Teilchenagglutination oder Hemmung der Teilchenagglutination.
Substrat/Cofaktor-Kreisführung ist ein weiteres Beispiel für Verstärkung, was auf der Kreisführung eines Cofaktors oder Substrats beruht, die durch die primäre Enzymmarkierung erzeugt wird. Das primäre Enzym überführt das primäre Substrat in eine aktive Form, welche durch zwei Enzyme des Verstärkungskreislaufs im Kreis geführt werden kann. Diese beiden Enzyme werden in hoher Konzentration bereitgestellt und werden im Gleichgewicht gehalten, um hohe Substratkonzentration umzusetzen, werden aber daran gehindert, bis das im Kreis geführte Substrat gebildet ist. Das Produkt des primären Enzyms ist ein katalytischer Aktivator des Verstärkungszyklus, welcher im Verhältnis zur Substratkonzentration und damit auf die Konzentration der Enzymmarkierung anspricht.
In den frühen Sechzigern beschrieben Lowry et al., Journal of Biological Chemistry, Seiten 2746-2755, Bd. 236, Nr. 10 (Oktober 1961) die Messung von Pyridinnukleotiden durch enzymatische Kreisführung, bei welcher das zu bestimmende Coenzym zum Verstärken einer enzymatischen Dismutation zwischen zwei Substraten veranlaßt wurde.
Ein komplexeres Substratkreislaufsystem wird in dem am 17. Mai 1988 an Rabin et al. erteilten US-Patent 4 745 054 beschrieben. Das Rabin-System umfaßt das Verwenden eines kleinen, enzymatisch inaktiven Peptidfragments eines Enzyms als Markierung, das mit dem komplementären Fragment konjugiert ist, um ein Enzym zu bilden, welches eine primäre Reaktion katalysiert, deren Produkt ein wesentliches Coenzym oder eine prosthetische Gruppe für ein zweites Enzym ist oder dazu führt, welches eine Sekundärreaktion katalysiert, die zu einem nachweisbaren Ergebnis führt, das die Anwesenheit eines Analyten anzeigt.
Vary et al., Clinical Chemistry, Seiten 1696-1701, Bd. 32 (1986), beschreiben ein an Nukleinsäuren angepaßtes Verstärkungsverfahren. Dieses ist der Strangersatztest, welcher die einzigartige Fähigkeit eines polynukleotids nutzt, als Substratmarkierung zu wirken, die durch eine Phosphorylase freigesetzt werden kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Katalysieren der Beladung mit einem Reporter, um den Nachweis oder die mengenmäßige Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch Verstärken des Detektorsignals zu verbessern, welches das Immobilisieren eines analytabhängigen Enzymaktivierungssystems, das die Beladung mit einem Reporter durch Aktivieren eines Konjugats umfaßt, das aus einem nachweisbar markierten, auf das Enzymsystem spezifischen Substrats besteht, wobei das Konjugat mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem unter Erzeugen eines aktivierten Konjugats reagiert, welches im wesentlichen überall dort beladen wird, wo der Rezeptor für das aktivierte Konjugat immobilisiert ist, wobei der Rezeptor mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem nicht reaktionsfähig ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Test zum Nachweisen oder mengenmäßigen Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Analyten in einer Probe durch Verwenden der katalysierten Beladung mit einem Reporter zum Verstärken des Reportersignals.
Diese Erfindung betrifft ferner 6-(Phenoxy-(4'-azo-2"-carboxy- ethylphenyl))-hexanoyl-alkalische Phosphatase.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 ist eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse eines HSV-Antigentest vergleicht, der mit und ohne katalysierte Beladung mit einem Reporter durchgeführt wurde.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse eines HIV p24-Kernantigentests unter Verwenden von Konjugat-Konzentrationen von 0,2, 0,4 und 0,8 µl/ml (Amp 1, 2 beziehungsweise 3) vergleicht. "HRP" bedeutet einen nicht-verstärkten Test, bei welchem der Detektorantikörper direkt mit HRP markiert wurde. "Biotin" zeigt einen weiteren, nicht-verstärkten Test an, bei welchem der Detektorantikörper mit Biotin konjugiert war und mit HRP-markiertem Streptavidin nachgewiesen wurde.
Figur 3 ist eine graphische Darstellung eines Maus-IgG-Tests, der unter Verwenden eines HRP-ADEAS zum Katalysieren der Beladung mit Biotin-Tyramin durchgeführt wurde, welches mit Streptavidin-HRP (HRP-Amp HRP) oder mit Streptavidin-AP (HRP-Amp AP) nachgewiesen wurde. Der Test wurde auch durchgeführt, indem nur ein HRP-markierter Detektor-Antikörper oder AP-markierter Detektor-Antikörper verwendet wurde.
Figur 4 stellt zwei graphische Darstellungen vor, welche die Ergebnisse vergleichen, die aus einer Ausführung eines Du Pont HIV-p24-Antigen-ELISA mit und ohne Verwenden einer katalysierten Beladung mit einem Reporter zum Verstärken des Reportersignals erhalten wurden.
Figur 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse eines Maus-IgG-Tests ohne katalysierte Beladung mit einem Reporter (HRP) und mit katalysierter Beladung mit einem Reporter (HRP-ß-Gal) vergleicht.
Figur 6 stellt eine Zubereitung von 6-(Phenoxy-(4'-azo-2"-carboxyethylphenyl))-hexanoyl-alkalischer Phosphatase (HEE-6-AP) dar, deren Synthese in Beispiel 10 beschrieben ist.
Figur 7 veranschaulicht die esterasekatalysierte Überführung von HEE in den 2-(4'-Hydroxyphenylazo)benzoesäure (HABA)/Streptavidin-Komplex.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der Ausdruck analytabhängiges Enzymaktivierungssystem (ADEAS) bezieht sich auf ein Enzymsystem, in welchem (i) wenigstens ein Enzym in irgendeiner dem Fachmann bekannten Weise an ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars gekuppelt ist, oder (ii) das Enzym nicht an ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares gekuppelt zu sein braucht, wenn es der Analyt ist. Das Enzym katalysiert entweder durch sich selbst oder in Verbindung mit einem zweiten Enzym die Bildung eines aktivierten Konjugats, welches sich anschließend überall dort beladen wird, wo ein Rezeptor für das aktivierte Konjugat immobilisiert ist.
Der hier verwendete Ausdruck Verstärkung bedeutet die Verstärkung eines Reportersignals aufgrund der Beladung eines durch ein ADEAS aktivierten Konjugats.
Der Ausdruck Konjugat bedeutet ein nachweisbar markiertes Substrat, das für das ADEAS spezifisch ist, sei es ein Ein-Enzym-ADEAS oder ein Multi-Enzym-ADEAS. Das Substrat muß mindestens einen Bestandteil besitzen, ist aber nicht darauf beschränkt. Das Substrat kann zum Beispiel aus zwei Bestandteilen bestehen. Ein Bestandteil enthält die Bindungsstelle für den Rezeptor und ist nachweisbar markiert. Der andere Bestandteil ist ein Bestandteil, welcher das Binden an den Rezeptor bis zu dem Zeitpunkt verhindert oder stört, an dem das ADEAS das Konjugat wie nachstehend erörtert initiiert. Ein weiteres Beispiel eines Konjugats ist Biotin-Tyramin, worin Tyramin der Substratteil ist und Biotin die nachstehend beschriebene, nachweisbare Markierung darstellt. Konjugate werden ebenfalls nachstehend in größerer Einzelheit erläutert.
Der Ausdruck nachweisbar markiert bedeutet, daß das Substrat entweder an einen Reporter oder an ein unmarkiertes erstes Mitglied eines spezifischen Bindungspaares gekuppelt sein kann, vorausgesetzt, daß der Reporter eine unterschiedliche Struktureinheit wie nachstehend erörtert in das Substrat einführt. Wenn das Substrat an ein unmarkiertes Mitglied eines spezifischen Bindungspaares gekuppelt ist, wird der substratspezifische Bindungspartnerkomplex auf die Festsetzung folgend mit dem zweiten Mitglied des Bindungspaares zur Reaktion gebracht, welches an einen Reporter gekuppelt ist. Wahlweise kann der substratspezifische Bindungspartnerkomplex mit dem anderen, nachweisbar markierten Mitglied des spezifischen Bindungspaares vor der Beladung vorumgesetzt werden.
Der Ausdruck Beladung bedeutet gerichtetes Binden eines aktivierten Konjugats an den Rezeptor, was entweder aus der Bildung einer kovalenten Bindung oder der nachstehend beschriebenen, spezifischen Wechselwirkung eines Bindungspaares folgt.
Der Ausdruck Rezeptor bedeutet eine Stelle, die entweder über die Bildung einer kovalenten Bindung oder der nachstehend beschriebenen, spezifischen Wechselwirkung eines Bindungspaars an das aktivierte Konjugat bindet.
Der Ausdruck aktiviertes Konjugat bedeutet, daß das Konjugat durch das ADEAS initiiert worden ist, um mit dem Rezeptor zu binden.
Eines der einzigartigen Merkmale dieser Erfindung ist das analytabhängige Enzymaktivierungssystem, welches die Beladung durch das Konjugat durch Überführen des Substratteils des Konjugats in eine aktivierte Form katalysiert, die überall dort beladen wird, wo ein spezifischer Rezeptor für das aktivierte Konjugat immobilisiert ist. Das ADEAS verwendet zum Bewirken der Verstärkung keine Enzymkaskadenreaktionen oder Enzymkreisläufe. Es verwendet vielmehr entweder ein einzelnes Enzym oder eine Kombination von Enzymen zum Aktivieren des Konjugats. Das Beladen mit dem Konjugat tritt nur auf, wenn der Analyt und das analytabhängige Enzymaktivierungssystem, welche dieselben sein können, wenn der Analyt ein Enzym ist, zum Beispiel beim Nachweis eines Enzyms wie etwa alkalischer Phosphatase, oder verschieden sein können, immobilisiert worden sind und ein Rezeptor wie nachstehend beschrieben unter Binden des aktivierten Konjugats immobilisiert ist. So werden das ADEAS, das Konjugat und der Rezeptor ausgewählt, um ein Einsatztrio zu bilden.
Das Folgende ist eine Ausführungsform eines Ein-Enzym-ADEAS- Systems, das auf ein Vorwärts-Sandwich-Immuntestformat angewandt wurde: die den Analyten enthaltende Testprobe wird mit einem immobilisierten Fängerreagenz wie etwa einem Antikörper umgesetzt, überschüssige Reagenzien werden abgewaschen, der immobilisierte Fängerantikörper-Analyt-Komplex wird mit einem ADEAS, wie etwa einem zweiten, auf den Analyten spezifischen Antikörper, der an ein Enzym gekuppelt worden ist, z.B. Meerrettichperoxidase (HRP), alkalische Phosphatase (AP) usw., umgesetzt. Das ADEAS bindet nur, wenn der Analyt durch das Fängerreagenz gebunden worden ist, andernfalls werden die Reagenzien abgewaschen. Die Kupplung des Enzyms an einen spezifischen Bindungspartner beeinflußt die Fähigkeit des Enzyms, mit dem Substratteil des Konjugats zu reagieren, nicht. Wenn ein Konjugat, wie etwa Biotin-Tyramin oder ein HABA-Tyramin-Analogon (z.B. N- (4'"-Hydroxyphenethyl)-6-(phenoxy-(4'-azo-2"-benzoesäure))hexamid), dem Komplex aus immobilisiertem Fänger-Antikörper, Analyt, zweitem Antikörper und Enzym zugesetzt wird, reagiert das Enzym mit dem Substratteil des Konjugats, z.B. mit dem Tyraminteil des Konjugats und überführt es in eine aktive Form, welche an einen immobilisierten Rezeptor bindet, der gegenüber dem Testsystem entweder endogen oder exogen ist. Die Menge beladenes Konjugat ist eine Funktion des immobilisierten ADEAS. Beladenes Konjugat, wie etwa Biotin-Tyramin oder ein HABA-Tyramin-Analogon, kann anschließend durch Umsetzen mit Streptavidin-HRP und ortho-Phenylendiamin nachgewiesen werden. Der Ausdruck HABATyramin-Analogon bedeutet im allgemeinen unsubstituiertes oder substituiertes HABA, das mit oder ohne einen Spacer an eine hydroxyphenylhaltige Verbindung wie etwa Tyramin gekuppelt ist. Falls das Konjugat Fluoreszein-Tyramin ist, dann kann das beladene Konjugat direkt oder auf die Reaktion mit einem markierten Anti-Fluoreszein-Antikörper folgend nachgewiesen werden.
So wird das ADEAS zum Katalysieren der Beladung mit einem nachweisbar markierten Substrat (dem Konjugat) unter Erzeugen eines zusätzlichen Signals verwendet. Das ADEAS wird direkt als Teil des Gesamtsignals nachgewiesen, wenn der Enzymbestandteil des ADEAS derselbe ist, wie das als Reporter verwendete Enzym. Figur 3 veranschaulicht sowohl diesen Zustand als auch den Zustand, wo ein ADEAS-Enzymbestandteil und das Reporterenzym verschieden sind und auf diese Weise wird der ADEAS-Enzymbestandteil nicht direkt als Teil des Gesamtsignals nachgewiesen.
Ein Multienzym-ADEAS-Immuntestformat umfaßt einen ähnlichen Weg. In dem vorstehenden Beispiel kann das ADEAS ein an ein Enzym wie etwa AP gekuppelter Antikörper sein. Außer dem Komplex aus immobilisiertem Fänger-Antikörper, Analyt, zweitem Antikörper und AP kann ein zweites Enzym wie etwa HRP auf dem Träger immobilisiert werden. Das Konjugat kann ein nachweisbar markiertes Phenylphosphat sein, das nicht mit HRP reagieren kann, bis es entphosphoryliert ist. AP entphosphoryliert das Phenol, welches anschließend bereit ist, mit der immobilisierten HRP unter Bilden eines aktivierten phenolischen Konjugats zu reagieren, das überall dort beladen wird, wo Rezeptoren immobilisiert sind. Nach dem Entfernen von überschüssigem Reagenz wird der beladene Reporter nachgewiesen und mengenmäßig bestimmt. Wahlweise kann HRP an den zweiten Antikörper gekuppelt werden und AP kann auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert werden.
Diese Erfindung ist überraschend und unerwartet, weil die Verstärkung des Reportersignals über ein beladenes, aktiviertes Konjugat ohne das Verwenden von Kaskadenmechanismen oder eines Enzymkreislaufs erhalten wird. Das ADEAS reagiert mit dem Konjugat unter Bilden eines aktivierten Konjugats, das mit dem für das aktivierte Konjugat spezifischen, immobilisierten Rezeptor bindet. Die Mengen Rezeptor und aktiviertes Konjugat sind zur Menge des immobilisierten ADEAS im Überschuß.
Die Wahl eines ADEAS wird von der Fähigkeit des Enzyms oder der Enzyme, ein Konjugat in eine aktivierte Form zu überführen, die an einen immobilisierten, endogenen oder exogenen Rezeptor bindet, bestimmt. Demgemäß wird eine genaue Kenntnis der katalytischen Eigenschaften jedes spezifischen Enzyms benötigt, um das Substrat und den Rezeptor richtig zu planen. Andere wichtige Faktoren schließen sowohl die Verfügbarkeit des Enzyms oder der Enzyme, die relative Leichtigkeit oder Schwierigkeit, es an das Mitglied eines spezifischen Bindungspaars zu kuppeln, die Stabilität des Enzyms oder der Enzyme als auch die Stabilität des Konjugats und des Rezeptors ein. In einigen Fällen kann ein ADEAS in Abhängigkeit von dem Testformat käuflich erworben werden.
Zur Verwendung in einem ADEAS geeignete Enzyme schließen Hydrolasen, Lyasen, Oxidoreduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen ein. Es können Peroxidase, Glucoseoxidase, Phosphatase, Esterase und Glycosidase angeführt werden. Spezifische Beispiele schließen alkalische Phosphatase, Lipasen, Beta-Galaktosidase und Meerrettichperoxidase ein.
Mitglieder spezifischer Bindungspaare, die zur Verwendung beim Ausüben der Erfindung geeignet sind, können vom Immun- oder Nicht-Immuntyp sein. Immunspezifische Bindungspaare werden durch Antigen/Antikörpersysteme oder Hapten/Antihaptensysteme veranschaulicht. Das Antikörpermitglied des Bindungspaars, sei es polyklonal, monoklonal oder ein immunreaktionsfähiges Fragment desselben, kann durch gebräuchliche Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, hergestellt werden. Die Ausdrücke immunreaktionsfähiges Antikörperfragment oder immunreaktionsfähiges Fragment bedeuten Fragmente, die den Bindungsbereich des Antikörpers enthalten. Derartige Fragmente können Fragmente vom Fab-Typ sein, welche als Fragmente ohne den Fc-Teil definiert sind, z.B. Fab, Fab' und F(ab')&sub2;-Fragmente, oder können sogenannte "Halbmolekül"-Fragmente sein, die durch reduktive Spaltung der Disulf idbindungen erhalten wurden, welche die Bestandteile der schweren Kette des unversehrten Antikörpers verbinden. Wenn das Antigenmitglied des spezifischen Bindungspaars nicht immunogen ist, z.B. ein Hapten, kann es kovalent an ein Trägerprotein gekuppelt werden, um es immunogen zu machen.
Nicht-Immun-Bindungspaare schließen Systeme ein, in welchen die beiden Bestandteile eine natürliche Affinität für einander teilen, aber keine Antikörper sind. Beispielhafte Nicht-Immun-Bindungspaare sind Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin, Folsäure-Folat-Bindungsprotein, Komplementärsonden-Nukleinsäuren usw. Ebenfalls eingeschlossen sind Nicht-Immun-Bindungspaare, die miteinander eine kovalente Bindung bilden, aber keine Antikörper bilden. Beispielhafte kovalente Bindungspaare schließen gegenüber Sulfhydryl reaktionsfähige Gruppen, wie etwa Maleimide und Halogenacetylderivate und gegenüber einem Amin reaktionsfähige Gruppen, wie etwa Isothiocyanate, Succinimidylester und Sulfonylhalogenide usw., ein.
Bei den Tests verwendete, geeignete Träger schließen synthetische Polymerträger, wie etwa Polystyrol, Polypropylen, substituiertes Polystyrol, z.B. aminiertes oder carboxyliertes Polystyrol, Polyacrylamide, Polyamide, Polyvinylchlorid usw., Glasperlen, Agarose, Nitrocellulose usw., ein.
Ein weiterer wichtiger Bestandteil der Erfindung ist das Konjugat, d.h. ein nachweisbar markiertes Substrat, das auf den ADEAS spezifisch sein muß. Wenn das Konjugat wie vorstehend angeführt mit dem ADEAS reagiert, katalysieren das Enzym oder die Enzyme die Bildung eines aktivierten Konjugats, das immer dort bindet, wo ein exogener oder endogener Rezeptor immobilisiert ist. Ein immobilisierter, exogener Rezeptor bedeutet ein Rezeptor, der nicht innerhalb des Tests entsteht. Er muß auf der Oberfläche des Trägers vor dem Zuf ügen des Konjugats zum Reaktionsgemisch immobilisiert werden. Ein endogener Rezeptor bedeutet ein Rezeptor, der innerhalb des Tests entsteht und keine Immobilisierung vor dem Zusetzen des Konjugats erfordert, da der Rezeptor innerhalb des Testsystems immobilisiert wird.
Wenn zum Beispiel ein HRP-ADEAS (an ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares gebundene HRP) mit einem ein phenolisches Substrat enthaltenden Konjugat umgesetzt wird, wird ein aktiviertes phenolisches Substrat erzeugt. Es wird angenommen, daß das aktivierte phenolische Substrat an elektronenreiche Struktureinheiten wie etwa Tyrosin und Tryptophan bindet, die in den Proteinen auf dem festen Träger vorhanden sind. Falls jedoch ein unterschiedliches Konjugat verwendet wird, wie etwa markiertes 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazin (MBTH), das nachstehend erörtert wird, muß ein Rezeptor wie etwa 3-(Dimethylamino)benzoesäure (DMAB) vor der Zugabe des Konjugats immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform umf aßt das Umsetzen eines Konjugats, das durch ein ADEAS phosphoryliert wird. Das aktivierte (phosphorylierte) Konjugat kann anschließend mit einem für das aktivierte Konjugat spezifischen Antikörper reagieren.
In noch einer weiteren Abwandlung kann ein ADEAS mit einem Konjugat umgesetzt werden, das aus einem Bestandteil besteht, der, wenn er aktiviert wird, an einen Rezeptor bindet und der an einen Bestandteil mit einer gegenüber Thiol reaktionsfähigen Gruppe wie etwa einem Maleimid gekuppelt ist. Die beladene Maleimid-Struktureinheit kann anschließend durch Umsetzen mit einem sulfhydrylhaltigen Reporter, der gegenüber dem Reporter endogen sein kann, z.B. beta-Galactosidase, nachgewiesen werden oder die Sulfhydrylgruppen können an Reporter wie etwa HRP oder AP mittels Thiolisierungsreagenzien, wie etwa N-Succinimidyl-S- acetylthioacetat (SATA), S-Acetylmercaptosuccinanhydrid (SAMSA) oder Succinimidyl-3-(acetylthio)-propionat (SATP) addiert werden.
Wahlweise kann das Substrat an eine geschützte, sulfhydrylhaltige Gruppe gekuppelt werden und diese kann als Konjugat verwendet werden. Nach dem Binden an den Rezeptor kann dieser mittels herkömmlicher, dem Fachmann bekannter Techniken entschützt werden. Der Nachweis kann durch Verwenden eines Reporters mit einer gegenüber Thiol reaktionsfähigen Gruppe wie etwa Maleimid-HRP oder Iodacetyl-HRP ausgeführt werden.
Eine weitere Alternative ist, ein Konjugat zu verwenden, in welchem das Substrat zwei vorstehend beschriebene Bestandteile besitzt, ein nachweisbar markierter erster Bestandteil, der an den Rezeptor bindet, nachdem der zweite Bestandteil durch das ADEAS aktiviert oder entfernt worden ist. Ein Beispiel davon ist ein kleines organisches Molekül wie etwa 2-(4'-Hydroxyphenylazo)benzoesäure (HABA), die spezifisch an Avidin und Streptavidin bindet. Die Ausdrücke Avidin und Streptavidin werden hier als gegenseitig austauschbar verwendet. HABA kann mittels irgendeinem der nachstehend beschriebenen Reporter, wie etwa Radioisotope, Enzyme usw., nachweisbar markiert werden. Zum Beispiel kann alkalische Phosphatase (AP) mit HABA unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken mit oder ohne einen Spacer an eine funktionelle Gruppe an HABA konjugiert werden. Ein Beispiel einer derartigen funktionellen Gruppe ist die 4'-Hydroxylstruktureinheit. Weiter kann HABA modifiziert werden, um einen zweiten Bestandteils aufzuweisen, der das Binden verhindert, bis er durch den ADEAS entfernt worden ist. Zum Beispiel liefert die Veresterung von HABA mit Ethanol einen HABA-Ethylester, der nicht an Streptavidin bindet. Nachweisbar markierte HABA-Ethylester binden nicht an Streptavidin, bis die Estergruppe zur entsprechenden Carbonsäure hydrolysiert worden ist. Die Hydrolyse kann durch Verwenden eines solchen Enzyms wie etwa einer Esterase, z.B. Schweineleberesterase, bewirkt werden. Auf diese Weise können nachweisbar markierte HABA-Ester, wie etwa 6-(Phenoxy-(4'-azo-2"-carboxyethylphenyl))-hexanoyl-alkalische Phosphatase mittels eines ADEAS mit einer geeigneten Esterase beladen werden, die den Ester hydrolysiert, um das Binden der nachweisbar markierten HABA mit Streptavidin (d.h. exogener Rezeptor), das auf der Oberfläche eines Trägers immobilisiert worden ist, zu gestatten.
Verbindungen der Formel
worin
R¹ bis R&sup8; gleich oder verschieden sind und aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen, F, Cl, Br oder I besteht,
Z Phenyl oder Naphthyl ist,
n 1-19 ist,
X N, O, S ist und
R&sup9; H oder geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen sein kann,
können wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben zum Synthetisieren von Konjugaten vom HABA-Typ verwendet werden. Der Ausdruck HABA-Konjugat bedeutet HABA-Derivate: (i) die substituiert oder unsubstituiert sein können und mit einem Spacer an einen Reporter gebunden sind und (ii) die eine durch ADEAS aktivierbare Struktureinheit enthalten, die das Konjugat am Binden an Streptavidin hindert, bis es durch das ADEAS aktiviert oder entfernt worden ist. Die Synthese einer derartigen Verbindung wird sowohl in Figur 6 als auch nachstehend in Beispiel 10 veranschaulicht. Der nachstehend beschriebene Weg kann zum Synthetisieren aller dieser Verbindungen durch Fachleute in allgemeiner Weise abgeändert werden, indem dem Fachmann wohl bekannte Verfahren verwendet werden.
Andere Kombinationen eines kleinen organischen Moleküls und eines Rezeptors, die zum Ausüben der Erfindung geeignet sind, schließen Haptene/Antikörper, Zucker und Oligosaccharide/Lectine, Biotin und Farbstoffe/Avidin und/oder Streptavidin ein.
Wie in Tabelle 1 dargestellt wird, ist eine Anzahl Rezeptoren verfügbar. Die Wahl eines Rezeptors hängt von dem ausgewählten Konjugat ab.
Die optimale Konjugatkonzentration wird gemäß dem in Beispiel 1 erklärten Verfahren bestimmt. Die optimalen Konzentrationen schwanken in Abhängigkeit von dem in dem ADEAS verwendeten Enzym und dem zum Herstellen des Konjugats ausgewählten Substrat.
Das Konjugat kann mittels herkömmlicher Kupplungs- und Markierungstechniken synthetisiert werden. Die Substratwahl hängt von dem ausgewählten ADEAS ab. Um es zu wiederholen, zum richtigen Planen eines brauchbaren synthetischen Substrats und nötigenfalls eines Rezeptors ist eine genaue Kenntnis der katalytischen Eigenschaften jedes spezifischen Enzyms erforderlich.
Eine breite Vielfalt Reporter ist zur Kupplung an das Substrat unter Herstellen des Konjugat oder zum Kuppeln an ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars verfügbar. Wie vorstehend erörtert wurde, sollte der Reporter eine unterschiedliche Struktureinheit in das Substrat einführen. Reporter können ein radioaktives Isotop, wie etwa ¹²&sup5;I, Enzyme, fluorogene, chemiluminiszierende, elektrochemische oder magnetische Materialien sein. Intern markierte Reporter (z.B. Tritium oder andere derartige Radionukleotide), die keine unterschiedliche Struktureinheit in das Substrat einführen, werden nicht zur Ausübung der Erfindung in Betracht gezogen.
Beispiele von Reporterenzymen, die zum Ausüben der Erfindung verwendet werden können, schließen Hydrolasen, Lyasen, Oxidoreduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen ein. Einige bevorzugte Beispiele sind Phosphatasen, Esterasen, Glykosidasen und Peroxidasen. Es können Peroxidase, Glucoseoxidase, Phosphatase, Esterase und Glycosidase angeführt werden. spezifische Beispiele schließen alkalische Phosphatase, Lipasen, beta-Galaktosidase und Meerettichperoxidase ein. Wie vorstehend angeführt wurde, kann, falls ein Enzym als Reporter verwendet wird, es das gleiche wie das im ADEAS verwendete Enzym oder Enzyme oder davon verschieden sein. Diese Erfindung kann zum katalysieren der Beladung eines mit Radioisotopen markierten Konjugats oder eines enzymmarkierten Konjugats usw. verwendet werden.
Eine weitere Ausführung des vorstehend beschriebenen Vorwärts-Sandwich-Immuntests umfaßt das Umsetzen eines Komplexes aus Fänger-Antikörper, Analyt und zweitem Antikörper mit einem ADEAS, das aus einem an ein Enzym, wie etwa HRP oder AP, gekuppelten Anti-Antikörper besteht. Der Anti-Antikörper bindet an ein Epitop auf dem zweiten Antikörper.
Diese Erfindung ist nicht auf Sandwich-Immuntests beschränkt. Sie ist auf eine breite Vielfalt von Testformaten, zum Beispiel ukleinsäure-Hybridisierungstests sowohl für RNA als auch DNA anwendbar.
Um die Erfindung weiter zu veranschaulichen, werden Beispiele von Ein- und Mehrfach-Enzym-ADEAS, Konjugaten, Rezeptoren und Rezeptortypen nachstehend in Tabelle 1 vorgestellt. TABELLE 1 ADEAS KONJUGAT³ REZEPTOR Klasseas Enzyme Substrat Klass Typ Ein-Enzym Multi-Enzym ß-Galaktosidase substituierte Phenole, z. B. Tyramin ß-Galaktropyranosylglykosid, z.B. von Fluoreszein substituierte Phosphate, z.B. Nitrophenylphosphat phosphoryliertes Biotin Phosphorylierte, subsubstituierte Phenole z. B. Tyrosinphosphat ß-Galaktopyranosylglykosid eine phenolischen Vebindung, a.B. Nitrophnylgalaktosid endogen exogen Phenole, elektronenreiche Struktureinheiten Antikörper auf die entglykosylierte Struktureinheit, z.B. Anti-Fluoreszein NAD-Bindungsproteine Antikörper auf entphosphoryliertes Produkt, z.B. Anti-Nitrophenol Avidin, Streptavidin ¹ HRP erforder die Anwesenheit von H&sub2;O&sub2;. ² Es spielt keine Rolle, welches Enzym an ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars gekuppelt wird. ³ Markierung kann ein Reporter oder ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares sein.
In dem vorstehend beschriebenen A/HRP-Multi-Enzym-ADEAS, muß das Konjugat entphosphoryliert werden, bevor es mit HRP reagiert und in dem ß-gal/HRP-Multi-Enzym-ADEAS muß das Konjugat entglykosyliert werden, bevor es mit HRP reagiert.
Es sollte für den Fachmann offensichtlich sein, daß eine große Zahl Abänderungen möglich sind und alle diese Abänderungen unter den Umfang der Erfindung fallen.
Die folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, die Erfindung zu veranschaulichen. Solange nicht anders angegeben, wurden von allen Reagenzien 100µl verwendet. Die eine Ausnahme war, daß 200 µl Blockierungspuffer verwendet wurden.

BEISPIEL 1

Herstellung von Konjugaten und Optimierung der Konjugatkonzentration

para-Hydroxyphenylpropionylbiocytin (HPPB) wurde durch Mischen einer Lösung von p-Hydroxyphenylpropionsäure-N-hydroxysuccinimidester (50 mg [0,2 mMol]/2 ml Dimethylsulfoxid) mit Biocytin (70,75 mg [0,2 mMol]/2 ml 0,1 M NaHCO&sub3;) über Nacht bei Raumtemperatur (RT) hergestellt. Biotin-Tyramin (BT) wurde durch Mischen einer Tyraminlösung (40 mg [0,3 mMol]/1 ml Dimethylsulfoxid) mit Biotin-N-hydroxysuccinimidester (100 mg [0,3 mMol]/1 ml Dimethylsulfoxid) über Nacht bei Raumtemperatur hergestellt. Die Lösungen von HPPB und BT wurden so wie sie sind verwendet. Die berechneten Konzentrationen betrugen 26 mg/ml für HPPB und 55 mg/ml für BT.
Polystyrol-EIA-Streifen (NUNC) wurden mit polyklonalem anti-Herpes simplex-Virus- (HSV) Antikörper (Dako, Carpenteria, CA) in 0,1M Carbonatpuffer pH 9,6 über Nacht bei 4ºC überzogen und anschließend mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) in Carbonatpuffer blockiert und dann mit 10 mM phosphatgepuf ferter Kochsalzlösung, 0,05% Tween 20, pH 7,4 (PBST) gewaschen. Eine Verdünnung des HSV-Antigens in 1% BSA, 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 0,05% Tween 20, pH 7,4 (BSA-PBST) oder Puffer ohne Antigen wurde 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Verdünnung war zum Erhalten der optischen Dichten in dem in Tabelle 1 mitgeteilten Bereich ausreichend. Es wurde mit PBST gewaschen. Das analytabhängige Enzymaktivierungssystem bestand aus an anti-HSV gekuppelter HRP (HRP ADEAS), welche von Dako erworben wurde. Das HRP ADEAS wurde zugesetzt und 30 min bei RT inkubiert und mit PBST gewaschen. Verschiedene, nachstehend in Tabelle 2 angegebene Konzentrationen von HPPB oder BT wurden während 15 min bei RT in 50 mM Tris-HCl, 0,01% H&sub2;O&sub2;, pH 8,0, zugesetzt. Nach Waschen mit PBST wurde Streptavidin-HRP zugesetzt und 15 min bei RT unter Reagieren mit beladenem Biotin inkubiert. Die Platte wurde anschließend mit PBST gewaschen. Ein HRP-Substrat, o-Phenylendiamin (OPD), wurde zugesetzt, 30 min bei RT inkubiert und mit 4N H&sub2;SO&sub4; abgebrochen. Optische Dichten bei 490 nm wurden mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät aufgezeichnet.

Ergebnisse

Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 vorgestellt. Spalte 1 zeigt die verschiedenen Konzentrationen in µl/ml HPPB oder BT. Spalten 2 und 3 zeigt die optischen Dichten, die als Funktion der HPPB- Konzentration aufgezeichnet wurden. Spalten 4 und 5 zeigen die mittels BT erhaltenen Ergebnisse.
HPPB und BT wurden durch HRP ADEAS in aktivierte Formen überführt. Die katalysierte Beladung mit einem Reporter wurde ohne Immobilisieren eines Rezeptors erreicht.
Beim Auswählen der optimalen Konzentration muß sowohl auf die Größenordnung der Signalverstärkung als auch den Rauschabstand geachtet werden. Unter Beachtung dessen betrug die optimale HPPB-Konzentration 20 µl/ml (ungefähr 0,5 mg/ml) und die diejenige von BT betrug etwa 0,3 µl/ml (ungefähr 16 µg/ml). TABELLE 2 490 nm-AbsorptionKonz. HPPB oder BT HPPB-KONJUGAT BT-KONJUGAT HSV Puffe * w/o Ag = ohne Antigen

BEISPIEL 2

Verstärkung des Detektorsignals beim HSV-Test mittels katalysierter Reporterbelegung

Mit anti-HSV überzogene EIA-Streifen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Eine 1:100-Verdünnung des HSV-Antigens wurde hergestellt und vierfach seriell verdünnt. Diese HSV-Verdünnungen wurden 2 Stunden bei 37ºC mit den mit anti-HSV überzogenen EIA-Streifen inkubiert. Überschüssiges Reagenz wurde mit PBST abgewaschen. Das ADEAS war dasselbe wie das vorstehend in Beispiel 1 beschriebene. Es wurde den mit anti-HSV überzogenen EIA-Streifen, die den anti-HSV-HSV-Komplex enthielten, zugesetzt und 30 min bei RT inkubiert und dann mit PBST gewaschen. 20 µl/ml wie in Beispiel 1 bestimmtes HPPB-Konjugat wurden in 50 mM Tris-HCl, 0,01% H&sub2;O&sub2;, pH 8,0, zugesetzt und 15 min bei RT inkubiert und anschließend mit PBST gewaschen. Belegtes Biotin wurde mit Streptavidin-HRP (SA-HRP) 15 min bei RT umgesetzt. Es wurde mit PBST gewaschen. Das Substrat, OPD, wurde zugesetzt und 30 min bei RT inkubiert, mit 4N H&sub2;SO&sub4; abgebrochen, und die Absorption bei 490 nm wurde mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät aufgezeichnet.
Nicht-verstärkte Tests wurden durchgeführt, bei welchen (a) kein HPPB und kein SA-HRP verwendet wurden, (b) HPPB ohne SA-HRP verwendet wurde, (c) SA-HRP ohne HPPB verwendet wurde.

Ergebnisse

Die in Figur 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß (a) eine katalysierte Belegung des Reporters erhalten wurde und (b) sowohl das Konjugat als auch SA-HRP zum Nachweis benötigt wurden, weil das Konjugat ein unmarkiertes Mitglied eines spezifischen Bindungspaars enthielt.
Ergebnisse für den nicht-verstärkten Test (kein HPPB, kein SA- HRP) wurden ausgedruckt. Die Ergebnisse für die anderen Tests wurden nicht ausgedruckt, weil sich die zusätzlichen Ausdrucke mit den bereits ausgedruckten, nicht-verstärkten Ergebnissen überschneiden würden.

BEISPIEL 3

Verstärkung des Detektorsignals im HIV p24-Test mittels katalysierter Reporterbelegung: Auswirkung der Konkugatkonzentration

Polystyrol-EIA-Streifen (NUNC) wurden mit Kaninchen-anti-HIV p24-Antikörpern in 0,1M Carbonatpuf fer, pH 9,6, über Nacht bei 4ºC überzogen und anschließend mit 2% BSA in Carbonatpuffer blockiert, gefolgt vom Waschen mit PBST. Das HIV-Antigen wurde 2 Stunden bei 37 ºC inkubiert (die Konzentrationen werden in Figur 2 angezeigt). Die Platte wurde anschließend mit PBST gewaschen. Ein analytabhängiges Kaninchen-anti-HIV p24-HRP- Enzymaktivierungssystem wurde anschließend 2 Stunden bei 37ºC inkubiert und mit PBST gewaschen. Verschiedene Konzentrationen BT-Konjugat (0,2, 0,4 und 0,8 µl/ml) in 0,1M Boratpuffer, 0,01% H2O2, pH 8,5, wurden 15 min bei RT inkubiert, gefolgt vom Waschen mit PBST. Anschließend wurde Streptavidin-HRP 15 min bei RT inkubiert.
Als Vergleich wurde ein biotinylierter anti-HIV p24-Antikörper verwendet und mit Streptavidin-HRP nachgewiesen. OPD wurde zugesetzt und es wurde 30 Minuten inkubiert, mit 4N H2SO4 abgebrochen und die optischen Dichten bei 490 nm wurden auf einem Mikrotiterplatten-Lesegerät aufgezeichnet.

Ergebnisse

Die Ergebnisse werden in Figur 2 dargestellt, wo sich Amp 1, Amp 2 und Amp 3 auf BT in Konzentrationen von 0,2, 0,4 beziehungsweise 0,8 µl/ml beziehen. Verschiedene Verstärkungswerte wurden mittels der katalysierten Reporterbelegung in Abhängigkeit von der Konjugatkonzentration erreicht.
Figur 2 zeigt auch die Ergebnisse für einen nicht-verstärkten Test mittels eines Nachweissystems (Biotin) biotinylierter Antikörper/SA-HRP und einen nicht-verstärkten Test, bei welchem ein anti-HIV p24-Detektor direkt mit HRP markiert war. Die mittels des anti-HIV p24-HRP-Detektors erhaltenen Ergebnisse waren schlechter verglichen mit der bedeutenden Zunahme des mittels der katalysierten Reporterbelegung erhaltenen Detektorsignals.
In Abhängigkeit von der Konjugatkonzentration wurden mittels des Verfahrens der katalysierten Reporterbelegung dieser Erfindung so gute und bessere Signale erhalten als diejenigen, welche mit dem biotinylierten Antikörper erhalten wurden. Die besten Ergebnisse wurden mittels einer Konjugatkonzentration in der Nähe der in Beispiel 1 bestimmten optimalen Menge erhalten.

BEISPIEL 4

Herstellung und Charakterisierung von Biotin-Tyramin

Herstellung von Biotin-Tyramin: eine Lösung von Biotin-N-hydroxysuccinimid, 170 mg (0,5 mMol), und Tyramin (aus Wasser umkristallisiert), 68,5 mg (0,5 mMol), in 25 ml Dimethylformamid wurde mit 10 ml 1M Triethylammoniumbicarbonat, pH 7,5, behandelt und anschließend 3 Stunden auf 50ºC erhitzt.
Isolierung: die Lösung wurde an einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt und der Rückstand wurde mit einer Ausbeute von 72% aus Wasser umkristallisiert.
Charakterisierung: der Schmelzpunkt wurde zu 192-193ºC bestimmt.

BEISPIEL 5

Verstärkung des Detektorsignals bei einem Maus IgG-Test mittels der katalysierten Reporterbelegung

Polystyrol-EIA-Streifen (NUNC) wurden mit Ziege-anti-Maus-IgG- Antikörper (ICN) (Fc-Fragment-spezifisch) in 0,1M Carbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei RT überzogen. Sie wurden anschließend mit 2% BSA in Carbonatpuf fer blockiert und mit PBST gewaschen. Verdünnungen von Maus-IgG in BSA-PBST wurden in den Näpfchen 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, gefolgt vom Waschen mit PBST. Die Konzentrationen werden in Figur 3 angegeben. Ziegeanti-Maus-IgG-HRP (HRP ADEAS) und Ziege-anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase (AP ADEAS) (Boehringer Mannheim) wurden wie vom Hersteller empfohlen verdünnt und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Tests wurden mit und ohne katalysierte Reporterbelegung ausgeführt. Das AP ADEAS wurde in diesem Versuch nicht zum Katalysieren der Reporterbelegung verwendet.
Zur katalysierten Reporterbelegung mittels des HRP ADEAS wurde eine Vorratslösung von Biotin-Tyramin (wie in Beispiel 4 beschrieben) von 1 mg/ml in Dimethylsulfoxid hergestellt und anschließend 0,1M Boratpuffer, pH 8,5, 0,01% H&sub2;O&sub2;, zu 10 µl/ml (10 µg/ml Biotin-Tyramin) zugesetzt und 15 min bei RT inkubiert. Die Platte wurde anschließend mit PBST gewaschen. Streptavidin-HRP (für HRP-Amp HRP) oder Streptavidin-alkalische Phosphatase (für HRP-Amp Alk Phos) wurden 15 min bei RT inkubiert und die Platte wurde mit PBST gewaschen. Der spektrophotometrische Nachweis wurde nach der Zugabe von OPD (für HRP) oder p-Nitrophenylphosphat (für AP) während 15 min bei RT erreicht. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 4N H2SO4 (HRP/OPD) oder IN NaOH (Alk Phos/pNPP) abgebrochen. Die optischen Dichten wurden bei 490 nm für HRP/OPD und 405 nm für Alk Phos/pNPP mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät aufgezeichnet.

Ergebnisse

Die Ergebnisse werden in Figur 3 gezeigt. Wie ersichtlich ist, kann man eine Signalverstärkung bei gleichzeitig niedrigerer Nachweisgrenze erreichen, indem man das HRP ADEAS die Belegung eines aktivierten BT-Konjugats katalysieren läßt, gefolgt vom Nachweis mit an HRP oder AP gekuppeltem Streptavidin. Dieses Beispiel zeigt, daß falls der Reporter ein Enzym ist, er dasselbe Enzym wie das im ADEAS verwendete oder davon verschieden sein kann.

BEISPIEL 6

Verstärkung des Detektorsignals in einem Test auf HIV p24- der ein Nachweissystem aus einem biotinylierten Detektorantikörper/Streptavidin-HRP verwendet

Der Du Pont HIV p24-Antigen-ELISA (Katalognummer NEK 060) wurde für die katalysierte Reporterbelegung wie folgt abgeändert: SAHRP wurde in einem 1/4 der in der Anleitung angegebenen Konzentration verwendet. Dies wurde von 15 min Inkubation mit Biotin-Tyramin, 10 µg/ml, in 0,1M Borat, 0,01% H2O2, pH 8,5 Puffer (wie in Beispiel 5) bei RT gefolgt. Auf das Waschen mit PBST folgend wurde SA-HRP in 1/16 der Konzentration 15 min bei RT inkubiert. Schließlich wurde OPD nach den Kitanweisungen zugesetzt. Außer dem Ausdehnen der Standardkonzentrationen bis hinunter zu 0,39 µg/ml wurden keine anderen Änderungen ausgeführt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse werden in Figur 4 gezeigt. Dieses Experiment zeigte, daß man das durch ein System aus biotinyliertem Antikörper/SA-HRP erzeugte Signal mittels katalysierter Reporterbelegung verstärken kann. Weil die Konzentration von SA-HRP bei beiden Inkubationen viel geringer war, als diejenige bei dem nicht-verstärkten Test, war es offensichtlich, daß das erhöhte Signal der Reporterbelegung und nicht einer doppelten SA-HRPInkubation zuzuschreiben war.

BEISPIEL 7

Reporterbelegung auf Membranen

Nitrocellulose (schleicher & Schüll, BA 85) wurden mit HSV- Antigen getüpfelt und anschließend mit 1% BSA, 1% Trockenmilch ohne Fett in PBS-Puf =fer über Nacht blockiert. Die Membranen wurden 1 Stunde bei RT mit dem vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen analytabhängigen Enzymaktivierungssystem inkubiert. Die Membranen wurden anschließend mit Biotin-Tyramin (aus Beispiel 1) bei 2 µl/10 ml 50 mM Tris-HCl, 0,01% H&sub2;O&sub2;, pH 8,0 Puffer 15 min bei RT inkubiert, was von 15 min Inkubation bei RT mit Streptavidin-alkalischer Phosphatase gefolgt wurde. Kontrollen wurden durchgeführt, wo Biotin-Tyramin ohne Streptavidin-alka lische Phosphatase inkubiert wurde und Streptavidin-alkalische Phosphatase ohne Biotin-Tyramin inkubiert wurde. Die Sichtbarmachung der belegten alkalischen Phosphatase wurde durch den Zusatz von BCIP/NBT (Kirkegaard & Perry) erleichtert. BCIP ist 5-Brom-4-chlorindoxylphosphat und NBT ist 2,2'-Di-(p-nitrophenyl)-5,5'diphenyl-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-diphenylen)-ditetrazoliumchlorid. Die Sichtbarmachung des gebundenen anti-HSV- HRP-Konjugats wurde durch den Zusatz von Diaminobenzidin (DAB) erleichtert.

Ergebnisse

Der Zusatz von DAB erzeugte beobachtbare, braune Flecken, wo HSV-Antigen auf die Nitrocellulosemembran getüpfelt war. Der Zusatz von BCIP/NBT erzeugte beobachtbare, blaue Flecken, wo HSV-Antigen getüpfelt war, wenn Biotin-Tyramin und streptavidinalkalische Phosphatase mit der Membran inkubiert wurden. Dies zeigte, daß aufgrund der HRP-Aktivierung des Biotin-Tyramin-Konjugats alkalische Phosphatase belegt wurde, gefolgt vom Nachweis durch streptavidin-alkalische Phosphatase.

BEISPIEL 8

Belegung von beta-Galaktosidase durch Meerrettich-Peroxidase und Nachweis durch Fluoreszenz

Polystyrol-EIA-Streifen (NUNC) wurden mit Ziege-anti-Maus-IgG- Antikörper (ICN) (Fc-Fragment-spezifisch) in 0,1M Carbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei RT überzogen. Sie wurden darauf mit 2% BSA in Carbonatpuffer blockiert und mit PBST gewaschen. Wie in Figur 5 angegebene Maus-IgG-Konzentrationen in BSA-PBST wurden 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, gefolgt vom Waschen mit PBST. Von Boehringer Mannheim erworbene Ziege-anti-Maus-IgG-HRP (ADEAS) wurde wie vom Hersteller empfohlen verdünnt und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Platte wurde anschließend mit PBST gewaschen. Eine 1 mg/ml Vorratslösung von BT-Konjugat (wie in beispiel 4 beschrieben) in Dimethylsulfoxid wurde hergestellt und anschließend 0,1M Borat, 0,01% H&sub2;O&sub2;, pH 8,5 Puffer zu 10 µl/ml zugesetzt (10 µg/ml Biotin-Tyramin). Das Gemisch wurde der Platte zugesetzt und 15 min bei RT inkubiert und anschließend mit PBST gewaschen. streptavidin-beta-Galaktosidase (Bethesda Research Labs) wurde zugesetzt und 15 min bei RT inkubiert. Der Test wurde ferner ohne katalysierte Reporterbelegung, d.h. ohne Zusetzen von BT, ausgeführt. Der kolorimetrische Nachweis des nicht-verstärkten Tests wurde nach 15 min Inkubation mit OPD (für HRP) bei RT erreicht. Der Fluoreszenznachweis des verstärkten Tests wurde nach dem Zusatz von 4-Methylumbelliferyl-beta-D- galaktosid (MUG) (für HRP-beta Gal) erreicht. Die optischen Dichten wurden bei 490 nm für HRP/OPD auf einem Mikrotiterplatten-Lesegerät aufgezeichnet. Die Fluoreszenz für HRP-beta Gal/- MUG wurde auf einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät (Dynatech Laboratories) aufgezeichnet.

Ergebnisse

Die Ergebnisse werden in Figur 5 dargestellt. Das Fluoreszenzsignal war auf die quantitative Belegung von Biotin-Tyramin durch das HRP ADEAS, gefolgt von der Inkubation mit Streptavidin-beta-Galaktosidase zurückzuführen.

BEISPIEL 9

Verstärkung eines Membrantests

Fluoreszein-Tyramin (FT) wurde wie folgt hergestellt: Lösungen von 46,6 mg 5- (und 6) -Carboxyfluoreszeinsuccinimidylester in 0,3 ml Dimethylsulfoxid und 14,6 mg Tyramin in 0,3 ml Dimethylsulfoxid wurden hergestellt. Die Konjugation wurde durch Mischen von jeweils 0,25 ml Lösung über Nacht bei RT erreicht. Die Lösung wurde so wie sie war verwendet.
Drei Nitrocellulosestreifen (Schleicher & Schüll, BA 83) wurden mit 1 µl Mouse-IgG zu 10 µg/ml und seriellen, zweifachen Verdünnungen in PBS getüpfelt. Die Membranen wurden mit 5% fettfreier Trockenmilch in PBST während 30 min blockiert und anschließend dreimal in PBST gewaschen. Ein 1/2000 in 1% BSA-PBST verdünntes Ziege-anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat (Boehringer Mannheim) wurde 30 min bei RT inkubiert und die Membrane wurde dreimal mit PBST gewaschen. Die dritte Membrane wurde mit FT zu 20 µg/ml in 0.1M Borat, 0,01% H&sub2;O&sub2;, pH 8,5 Puffer 15 min bei RT inkubiert und dreimal in PBST gewaschen. Anschließend wurde die zweite und dritte Membrane mit einem in 1% BSA-PBST verdünnten anti-Fluoreszein-Antikörper (Chemicon), welcher auf HRP konjugiert war (durch das SMCC-Verfahren von Ishikawa, E. et al., J. Immunoassay, 4, 209-327, 1983), 15 min bei RT inkubiert und dreimal in PBST gewaschen. Die Sichtbarmachung aller drei Streifen wurde durch den Zusatz von Diaminobenzidin während 5 min erleichtert.

Ergebnisse

Drei Flecke konnten auf den ersten zwei Streifen erkannt werden, was eine Nachweisgrenze von 2,5 µg/ml anzeigte und daß das anti-Fluoreszein-HRP-Konjugat nicht zum zusätzlichen Signal beitrug.
Sechs Flecke konnten auf dem dritten Streifen erkannt werden, was eine Nachweisgrenze von 313 ng/ml anzeigte. Die Verwendung des Verstärkungsverfahrens der katalysierten Reporterbelegung der Erfindung verbesserte die Nachweisgrenze des Tests um das achtfache gegenüber derjenigen des nicht-verstärkten Tests.

BEISPIEL 10

Synthese des Konjugats, HEE-6-AP, aus 6-(phenoxy-(4'-azo-2"- carboxvethylphenyl))hexansäure-(N-succinimidylester), HEE-6-NHS, und alkalischer Phosphatase (AP)

Das folgende Reaktionsschema wird in Figur 6 veranschaulicht: 2- (4'-Hydroxyphenylazo)benzoesäureethylester (HEE) wird aus 2-(4'- Hydroxyphenylazo)benzoesäure (HABA), (1)), wasserfreiem Ethanol und einer katalytischen Menge Acetylchlorid hergestellt. Der Ethylester (HEE) wird mit 6-Iodhexansäure-t-butylester und Natriumhydrid unter Anwenden des allgemeinen, von Castellanos et al., Tetrahedron, Seiten 1691-1696, Bd. 37 (1981), mitgeteilten Verfahrens unter Herstellen von 6-(Phenoxy-(4'-azo-2"-carboxyethylphenyl))hexansäure-t-butylester (HEE-6-t-Bu, (3)) umgesetzt. Der tert-Butylester wird durch Behandlung mit Trifluoressigsäure unter Anwenden des allgemeinen, von Bryan et al., Journal of the American Chemical Society, Seiten 2353-2355, Bd. 99 (1977), mitgeteilten Verfahrens unter Herstellen von 6-(Phenoxy-(4'-azo-2"-1-carboxyethylphenyl))hexansäure (HEE-6-H) umgesetzt. 6-(Phenoxy-(4'-azo-2"-carboxyethylphenyl))hexansäure-(N- succinimidylester) (HEE-6-NHS, (5)) wird aus HEE-6-H, N-Hydroxysuccinimid und Dicyclohexylcarbodiimid in THF unter Anwenden des allgemeinen, von Bryan et al., Makromolekulare Chemie, Seiten 2375-2382, Bd. 186 (1985), mitgeteilten Verfahrens hergestellt. Der NHS-Ester (5) wird im Mindestvolumen DMSO gelöst und einer gepufferten, wäßrigen Lösung von alkalischer Phosphatase (z.B. Kalbsdarm) unter Anwenden des allgemeinen, von O'Sullivan et al., Methods in Enzymology, Seiten 147-166, Bd. 73 (1981), mitgeteilten Verfahrens zugesetzt, um das Konjugat (HEE-6-AP, zu ergeben.

BEISPIEL 11

Synthese des HABA-Tvramin-Konjugats (H-T) aus 6-(Phenoxy-(4'-azo-2-carboxyethylphenyl hexansäure-(N-succinimidylester) (HEE-6-NHS, (5)) und Tyramin

Der vorstehend in Beispiel 10 beschriebene NHS-Ester (5) (1 mMol) und Tyramin (1 mMol) werden in DMF (5 ml) gelöst und 48 h bei RT gerührt. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in H2O (pH 8,0, 50 ml) suspendiert und Schweineleberesterase (100 mg) wird zugesetzt. Der pH der Lösung wurde durch Zusetzen von 0,1 N NaOH nach Bedarf aufrechterhalten. Die Lösung wird nach 24 Stunden zur Trockene eingeengt. Das sich daraus ergebende H-T-Konjugat wird durch Chromatographie (Kieselgel, Chloroform/Methanol) isoliert.

BEISPIEL 12

Verstärkung des Detektorsignals in einem Maus-IgG-Test mittels durch Schweineleberesterase (PLE) katalysierter Reporterenzymbelegung

Mikrotiterplattenstreifen (Nunc) werden mit einem Gemisch von Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (ICN) (Fc-Fragment-spezifisch) und Streptavidin (Scripps Laboratories) in 0,1M Carbonatpuffer pH 9,6 über Nacht bei RT überzogen. Sie werden darauf mit 2% BSA in PBS blockiert und mit PBST gewaschen. Verdünnungen von Maus-IgG (0-100 ng/ml in BSA-PBST werden in den Näpfchen 1 h bei 37ºC inkubiert, gefolgt vom Waschen mit PBST. Eine Zubereitung von Ziege-anti-Maus-IgG-PLE (PLE ADEAS) (0,75 mg/ml) wird durch das allgemeine, von Hashida et al., Journal of Applied Biochemistry, Bd. 6, Seiten 56-63, 1984, mitgeteilte Verfahren hergestellt und 1:100 - 1:2000 mit Phosphatpuffer (0,1 M, pH 8,0, 0,2% BSA) verdünnt und wird 1 h bei 37ºC inkubiert und mit PBST gewaschen. HEE-6-AP (1 mg/ml) (wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt) wird den Mikrotiterplattennäpf chen zugesetzt und wenigstens 15 min bei 37ºC inkubiert. Die Platte wird anschließend mit PBST gewaschen. Der spektrophotometrische Nachweis wird nach der Zugabe von p-Nitrophenylphosphat erreicht. Die Reaktionen werden durch den Zusatz von 1N NaOH abgebrochen. Die optischen Dichten bei 405 nm werden auf dem Mikrotiterplatten-Lesegerät auf gezeichnet. Die Verstärkung des Detektorsignals in diesem Beispiel ergibt sich aus der katalysierten Reporterenzymbelegung, d.h. PLE katalysiert die Belegung von HEE-6-AP, wo der Rezeptor, Streptavidin, auf der Mikrotiterplattenoberfläche immobilisiert worden ist.

BEISPIEL 13

Demonstration des enzymmodulierten Bindens eines blockierten Bindemittels

Eine Suspension von Schweineleberesterase (10 µl, 2860 E/ml, Kat. Nr. E3128, Sigma Chemical, St. Louis, MO) wurde einer Lösung von 2-(4'-Hydroxyphenylazo )benzoesäureethylester (HEE) (0,25 mM) und Streptavidin (0,2 mg/ml) in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 8,0, 2 ml) zugesetzt. Eine zweite, zur ersten identische Lösung, die kein Streptavidin enthielt, wurde hergestellt. Die Absorption der beiden Lösungen wurde bei 500 nm als Funktion der Zeit gemessen. Figur 7 zeigt, daß die Absorption der Lösung, welche kein Streptavidin enthielt, mit der Zeit abnahm, was die Hydrolyse von HEE zu 2-(4'-Hydroxyphenylazo)benzoesäure (HABA) anzeigt. Die Absorption der Lösung, welche Streptavidin enthielt, erhöhte sich im Lauf der Zeit, was die Bildung des HABA:Streptavidin-Komplexes anzeigt, von welchem bekannt ist, daß er bei 500 nm eine starke Absorption besitzt.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis oder der mengenmäßigen Bestimmung eines Analyten in einem Test, welches das Verwenden eines analytabhängigen Enzymaktivierungssystems umfaßt, das wenigstens ein Enzym zum Umsetzen mit einem Konjugat umfaßt, welches aus einem nachweisbar markierten Substrat besteht, das auf das Enzymsystem spezifisch ist, unter Bilden eines aktivierten Konjugats, das sich im wesentlichen überall dort festsetzt, wo wenigstens ein Rezeptor für das aktivierte Konjugat immobilisiert ist, wobei der Rezeptor mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem, in welchem die abgeschiedenen Markierungen entweder direkt oder indirekt ein Signal erzeugen, das nachgewiesen oder mengenmäßig bestimmt werden kann, nicht reaktionsfähig ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem wenigstens ein Enzym des analytabhängigen Enzymaktivierungssystems aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Oxidoreduktasen, Hydrolasen, Lyasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen besteht.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei welchem das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Peroxidasen, Oxidasen, Phosphatasen, Esterasen und Glykosidasen besteht.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei welchem das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Meerrettichperoxidase, Glukoseoxidase, alkalischer Phosphatase und beta-Galaktosidase besteht, und vorzugsweise Meerrettichperoxidase ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, bei welchem das Konjugat aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Biotin-Tyrainin, p-Hydroxyphenylpropionylbiocytin oder Fluorescein-Tyramin besteht.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Konjugat mit nachweisbar markiertem Antikörper umgesetzt wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Konjugat mit einem nachweisbar markierten Mitglied eines spezifischen Bindungspaares umgesetzt wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Konjugat mit nachweisbar markiertem Streptavidin umgesetzt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die nachweisbare Markierung aus der Gruppe, die aus Enzymen, radioaktiven Isotopen, fluorogenen, chemilumineszierenden oder elektrochemischen Materialien besteht, oder einem Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ausgewählt ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das Konjugat 6- (Phenoxy-(4'-azo-2"-carboxyethylphenyl))-hexanoyl-alkalische Phosphatase ist.

11. Test zum Nachweisen oder mengenmäßigen Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Analyten in einer Probe, der

a) das Immobilisieren des Analyten;

b) das Umsetzen des Produkts aus Schritt (a) mit einem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem;

c) das Umsetzen des Produkts aus Schritt (b) mit einem aus einem nachweisbar markierten Substrat bestehenden Konjugat unter Bilden eines aktivierten Konjugats, das sich im wesentlichen überall dort festsetzt, wo ein Rezeptor für das aktivierte Konjugat immobilisiert ist, wobei der Rezeptor mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem nicht reaktionsfähig ist und

d) das Nachweisen oder mengenmäßige Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Analyten in der Probe umfaßt.

12. Test gemäß Anspruch 11, bei welchem das analytabhängige Enzymaktivierungssystem wenigstens ein Enzym besitzt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Oxidoreduktasen, Hydrolasen, Lyasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen besteht.

13. Test gemäß Anspruch 12, bei welchem das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Peroxidasen, Oxidasen, Phosphatasen, Esterasen und Glykosidasen besteht.

14. Test gemäß Anspruch 13, bei welchem das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Meerrettichperoxidase, Glukoseoxidase, alkalischer Phosphatase und beta-Galaktosidase besteht.

15. Test gemäß Anspruch 11, bei welchem die nachweisbare Markierung aus der Gruppe, die aus Enzymen, radioaktiven Isotopen, fluorogenen, chemilumineszierenden oder elektrochemischen Materialien besteht, oder einem Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ausgewählt ist.

16. Test gemäß Anspruch 14, bei welchem das Enzym Meerrettichperoxidase ist und das Konjugat aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Biotin-Tyramin, p-Hydroxyphenylpropionylbiocytin oder Fluorescein-Tyramln besteht.

17. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei welchem das Konjugat 6- (Phenoxy-(4'-azo-2"-carboxyethylphenyl))-hexanoyl-alkalische Phosphatase ist.

18. Test gemäß Anspruch 11, bei welchem das Konjugat mit einem nachweisbar markierten Mitglied eines spezifischen Bindungspaars umgesetzt wird.

19. Test gemäß Anspruch 11, bei welchem das Konjugat mit einem nachweisbar markierten Antikörper umgesetzt wird.

20. Test gemäß Anspruch 11, bei welchem das Konjugat mit nachweisbar markiertem Streptavidin umgesetzt wird.

21. Test gemäß Anspruch 11, bei welchem der Test ein Imrnunassay ist.

22. Test zum Nachweisen oder mengenmäßigen Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Analyten in einer Probe, welcher

a) das Umsetzen eines analytabhängigen Enzymaktivierungssystems mit einem aus einem nachweisbar markierten Substrat bestehenden Konjugat unter Bilden eines aktivierten Konjugats, welches sich im wesentlichen überall dort festsetzt, wo ein Rezeptor für das aktivierte Konjugat immobilisiert ist, wobei der Rezeptor mit dem analytabhängigen Enzymaktivierungssystem nicht reaktionsfähig ist, und

b) das Nachweisen oder mengenmäßige Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Analyten in der Probe umfaßt.

23. Test gemäß Anspruch 22, bei welchem das analytabhängige Enzymaktivierungssystem wenigstens ein Enzym besitzt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Oxidoreduktasen, Hydrolasen, Lyasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen besteht.

24. Test gemäß Anspruch 23, bei welchem das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Peroxidasen, Oxidasen, Phosphatasen, Esterasen und Glykosidasen besteht.

25. Test gemäß Anspruch 24, bei welchem das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Meerrettichperoxidase, Glukoseoxidase, alkalischer Phosphatase und beta-Galaktosidase besteht.

26. Test gemäß Anspruch 22, bei welchem die nachweisbare Markierung aus der Gruppe, die aus Enzymen, radioaktiven Isotopen, fluorogenen, chemilumineszierenden oder elektrochemischen Materialien besteht, oder einem Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ausgewählt ist.

27. Test gemäß Anspruch 22, bei welchem das Konjugat mit einem nachweisbar markierten Mitglied eines spezifischen Bindungspaars umgesetzt wird.

28. Test gemäß Anspruch 22, bei welchem das Konjugat mit nachweisbar markiertem Streptavidin umgesetzt wird.

29. Test gemäß Anspruch 22, bei welchem das Konjugat mit einem nachweisbar markierten Antikörper umgesetzt wird.

30. Test gemäß Anspruch 22, bei welchem der Test ein Immunassay ist.

31. Verbindung, welche 6-(Phenoxy-(4'-azo-2"-carboxyethylphenyl))-hexanoyl-alkalische Phosphatase ist.