DE69935408T2

DE69935408T2 - Chemilumineszente markierungsverbindungen

Info

Publication number: DE69935408T2
Application number: DE69935408T
Authority: DE
Inventors: Hashem Howell TAFTI-AKHAVAN
Original assignee: Lumigen Inc
Current assignee: Lumigen Inc
Priority date: 1998-06-17
Filing date: 1999-05-03
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2019-05-04
Also published as: EP1029016A1; ES2283111T3; AU3740999A; ATE356179T1; CA2301120A1; US6126870A; WO1999066005A1; JP2002518410A; AU760023C; EP1029016B1; AU760023B2; EP1029016A4; DE69935408D1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Methode, durch ein einfaches chemisches Verfahren unter Verwendung von kostengünstigen und einfach zugänglichen Reagenzien rasch Chemilumineszenz von elektronenreichen Alkenen zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus chemilumineszente Markierungsverbindungen, ihre Verwendung zur Herstellung von chemilumineszent markierten Verbindungen und die Verwendung der markierten Verbindungen in Assay-Methoden. Die Erfindung betrifft darüber hinaus Assay-Methoden zur Detektion eines Analyten und zur Detektion chemilumineszent markierter Analyte, insbesondere in einem Elektrophorese-Gel. Die Verfahren sind beispielsweise für Immunoassays und Nukleinsäure-Assays nützlich.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Detektion eines Analyten durch Chemilumineszenz hat in einer Reihe von Gebieten zunehmende Bedeutung erlangt, unter anderem für biomedizinische Analysen, Lebensmittel-Kontrollen, Identifizierung von Krankheitserregern, forensische Untersuchungen und Screening auf Umwelt-Schadstoffe. Die Vorgehensweise, einen chemilumineszenten Endpunkt in einen Test oder in ein Assay einzuführen, kann verschiedene Formen annehmen, beispielsweise durch ein chemilumineszentes Substrat für einen Enzym-Marker, eine chemilumineszente Verbindung, die innerhalb einer Struktur, wie einer Mizelle, einem Liposom oder einem Latex-Partikel, abgeschirmt ist, oder durch die Verwendung einer chemilumineszenten Verbindung als Marker. Zahlreiche Verbindungen wurden zu diesem Zweck entworfen (R. Handley, H. Akhavan-Tafti, A. P. Schaap, J. Clin. Ligand Assay, 20(4) 302-312 (1997)). Die Verwendung von chemilumineszenten Verbindungen zur Markierung von Spezies, die mit kleinen Molekülen detektiert werden sollen, hat aufgrund der Möglichkeit, mehrere Marker anzubringen und rasch Chemilumineszenz zu generieren, Interesse geweckt. Dennoch hat sich keine einzelne Methode zum Labeln und Detektieren in allen Anwendungen durchgesetzt.
Chemilumineszente Marker. Luminol, Isoluminol und verwandte zyklische Diacyl-Hydrazide waren die ersten chemilumineszenten Verbindungen, die als direkte Marker angepasst wurden, indem ihre Struktur so modifiziert wurde, dass ein verknüpfender Substituent darin enthalten war. Ihre Verwendung ist für viele Anwendungen aufgrund ungenügender, die Nachweisempfindlichkeit begrenzender, Generierung von Licht nicht zufrieden stellend. Die geringe Quanteneffektivität der Chemilumineszenz, 0.1–1%, und Zeiten von bis zu mehreren Minuten, um alle der Photonen zu emittieren, verringern unverzüglich die Lichtintensität.
Acridinium-Ester und Acridinium-Sulfonamide sind häufig für chemilumineszente Immunoassays verwendet worden. (siehe beispielsweise U.S. 5,656,500, U.S. 5,521,103 mit weiteren Nachweisen). Die prinzipiellen Vorteile dieser Marker sind die hohe Ausbeute an Chemilumineszenz (etwa 10%) in Verbindung mit der kurzen Emissionszeit, typischerweise 1–2 Sekunden. Wird die Lichtenergie in einem derartigen kurzen Blitz freigesetzt, entstehen hohe Lichtintensitäten. Die Verwendung dieser Marker leidet jedoch unter einigen erheblichen Nachteilen. Acridinium-Ester, und in geringerer Weise auch die Sulfonamide, neigen zur Hydrolyse zu nicht-lumineszenter Carbonsäure, wobei die Hydrolyse bei basischen pH-Werten beschleunigt abläuft. Dieses bekannte Problem der Bildung einer Pseudo-Base bei Angriff von Wasser an der 9-Position des Rings erfordert einen separaten Reaktionsschritt, um den Acridinium-Ring neu zu bilden.
Ruthenium- oder Osmium-enthaltende Komplexe produzieren Chemilumineszenz, wenn sie in Anwesenheit eines Opferamins als Elektronendonor elektrochemisch oxidiert werden. Diese Reaktion erfordert eine teurere und aufwendigere Ausrüstung, um die elektrochemischen und die lichtdetektierenden Schritte gleichzeitig durchführen zu können.
Obwohl viele große Moleküle als Marker genutzt werden, einschließlich Enzyme und das Photoprotein Aequorin, leidet ihre Verwendung unter dem Nachteil, dass nur eine begrenzte Anzahl von Markern mit der Zielverbindung verknüpft werden kann, und dass die Tendenz zur unspezifischen Ablagerung an Trägermaterialien und Oberflächen besteht.
Es bleibt ein Ziel auf dem Gebiet der Assays, chemilumineszente Markierungsverbindungen zu entwickeln, die kleine, wasserlösliche Moleküle sind, hohe Chemilumineszenz-Effizienzen aufweisen, das Licht bei Reaktion mit einfachen chemischen Aktivierungsreagenzien rasch emittieren, bei langer Lagerung stabil sind und keine Nebenreaktionen eingehen. Die vorliegende Erfindung stellt derartige Verbindungen bereit.
Markierungsverfahren. Eine große Auswahl an Verfahren zum chemischen Binden von Markern an organische und biologische Moleküle ist in der Literatur beschrieben (siehe beispielsweise: L. J. Kricka, Ligand-Binder Assays, Marcel Dekker, Inc., New York, 1985, Seite 15–51 und M. Z. Atassi, „Chemical Modification and Cleavage of Proteins", Kapitel 1 in Immunochemistry of Proteins, Vol. 1, Plenum Press, New York, 1977, Seite 1–161, mit weiteren Nachweisen).
Antikörper und Proteine werden zweckmäßig durch Reaktion bestimmter nukleophiler Gruppen, die in den Proteinen vorhanden sind (-SH, -OH, -NH₂, -COOH), mit chemisch reaktiven Gruppen markiert. Geeignet funktionalisierte Nukleinsäuren und DNA-Proben können durch Reaktion mit der entsprechenden reaktiven Gruppe eines Markers markiert werden. Viele andere Arten von Molekülen, die markiert werden können, beinhalten Antikörper, Enzyme, Protein- Antigene, Peptide, Haptene, Steroide, Kohlenhydrate, Fettsäuren, Hormone, Nukleoside und Nukleotide.
Chemilumineszenz-Detektion in Gelen. Ein Verfahren zur Detektion des Enzyms Alkalische Phosphatase in einem Gel unter Verwendung eines chemilumineszenten Substrats ist beschreiben worden (N. Theodosiou, C. Chalot, C. Ziomek, BioTechniques, 13(6), 898–901 (1992)). Der Anmelder kennt keine Veröffentlichung betreffend der elektrophoretischen Trennung und Chemilumineszenz-Detektion einer chemilumineszent markierten Verbindung in einem Gel.
Die am Prioritätstag unveröffentlichte WO-A-9914358 beschreibt heterozyklische Verbindungen, unter anderem Acridan-Verbindungen, zur Verwendung in chemilumineszenten Reaktionen. Die Verbindungen werden in Gegenwart von Peroxid und Peroxidase oxidiert. Das Acridan kann die generelle Formel wie unten unter I aufweisen. Eine Offenbarung betreffend eines Substituenten -L-RG, wie er in Anspruch 1 definiert ist, existiert nicht.
Die am Prioritätstag unveröffentlichte WO-A-9940161 offenbart chemilumineszente Acridane. Keine der beispielhaften Verbindungen, die eine mit den hiesigen Verbindungen der Formel I verwandte Struktur haben, besitzt einen Substituenten -L-RG, wie er in Anspruch 1 definiert ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verfahren bereitzustellen, mit denen Chemilumineszenz durch ein einfaches chemisches Verfahren mit kostengünstigen, einfach zugänglichen Reagenzien von einer chemilumineszenten Verbindung generiert werden kann.
Es ist auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Assay-Methoden unter Verwendung einer einfachen chemilumineszenten Reaktion bereitzustellen.
Darüber hinaus ist es Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Markierungsverbindungen zur Herstellung von chemilumineszent markierten Verbindungen bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, chemilumineszent markierte Verbindungen bereitzustellen.
Weiterhin ist es Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Markierungsverbindungen der Formel I bereitzustellen, wobei Z1 und Z2 unabhängig voneinander aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel gewählt werden.
Es ist darüber hinaus Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Generierung von Chemilumineszenz aus dem chemilumineszenten Marker selbst oder aus der chemilumineszent markierten Verbindung bereitzustellen.
Darüber hinaus ist es ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Detektion eines Analyten in einem Gel bereitzustellen, indem eine chemilumineszent markierte Verbindung für die Detektion bereitgestellt wird, diese einer elektrophoretischen Trennung in einem Gel unterworfen wird, und durch eine chemilumineszente Reaktion direkt in dem Gel detektiert wird.
Es ist noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, chemilumineszente Verfahren bereitzustellen, mit denen ein Assay unter Verwendung von chemilumineszent markierten Verbindungen durchgeführt werden kann. Repräsentative Assays beinhalten Immunoassays, Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays, andere Ligand-Bindungs-Assays, Detektion eines Analyten in Lebensmittel-, Umwelt- und Industrie-Proben.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG
Moderne biomedizinische Analysen erfordern die Möglichkeit, sehr geringe Mengen von Verbindungen detektieren zu können, was entweder auf einen geringen Überschuss des Analysten in der Probe zurückzuführen ist, oder auf eine begrenzte Menge der Probe. Darüber hinaus muss es möglich sein, die Menge der Verbindung über einen sehr großen Konzentrationsbereich hinweg genau zu bestimmen. Hier werden chemilumineszente Markierungsverbindungen und Verfahren offenbart, die für diese Art der Analyse geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Generierung von Chemilumineszenz und Verbindungen, die in diesen Verfahren verwendet werden können. Die Verfahren verwenden Acridan-Verbindungen und einfache, kostengünstige und einfach zugängliche Reagenzien, um von diesen Chemilumineszenz zu generieren. Die lichtproduzierende Reaktion kann für eine Vielzahl von Anwendungen, die in Fachkreisen bekannt sind, verwendet werden, darunter analytische Assay-Methoden, Signalgebung, Notfallbeleuchtung und für neue Gegenstände.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch chemilumineszente Markierungsverbindungen, die über chemische Bindungen oder durch physikalische Wechselwirkungen zum Zwecke der Durchführung eines Assays an organische oder biologische Moleküle gebunden werden können. Die Reaktion der chemilumineszenten Verbindungen der vorliegenden Erfindung entsprechend der vorliegend beschriebenen Verfahren erzeugt Chemilumineszenz als sichtbares Licht. Die Intensität der resultierenden Chemilumineszenz stellt eine direkte Messmethode für die Quantität des chemilumineszenten Markers und damit auch für die markierte Verbindung dar.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet darüber hinaus ein Verfahren zur Detektion einer chemilumineszent markierten Verbindung in einem Elektrophorese-Gel des Typs, wie es zur Trennung von biologischen Molekülen verwendet wird. Chemilumineszent markierte Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in ein Gel appliziert werden, durch Elektrophorese getrennt und anschließend in dem Gel detektiert werden, ohne auf eine Membran geblottet werden zu müssen.
Die chemilumineszenten Acridan-Verbindungen nach der Erfindung haben die Formel I
wobei
Z¹ und Z² unabhängig voneinander aus O, S und NR¹² gewählt werden, R¹² aus Alkyl-, Aryl-, Alkylsulfonyl- und Arylsulfonyl-Gruppen gewählt wird;
R¹ eine Gruppe ist, die 1 bis ungefähre 50 Nicht-Wasserstoff-Atome gewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogen-Atomen enthält, und die mit einer Säure abspaltbar ist, und die gewählt wird aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, substituierten oder unsubstituierten Alkyl- oder Aryl-Carbonyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, tri-(C₁-C₈-Alkyl)-Silyl-Gruppen, einer SO₃-Gruppe, Glykosyl-Gruppen und Phosphoryl-Gruppen der Formel PO(OR')(OR''), wobei R' und R'' unabhängig voneinander gewählt werden aus Wasserstoff, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, Trialkylsilyl-Gruppen, Alkalimetall-Kationen, Erdalkalimetall-Kationen, Ammonium- und Phosphonium-Kationen;
R² und R³ organische Gruppen sind, die 1 bis 50 Nicht-Wasserstoff-Atome gewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogen-Atomen enthalten, wobei R² gewählt wird aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, substituierten oder unsubstituierten Alkyl- oder Aryl-Carbonyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, tri-(C₁-C₈-Alkyl)-Silyl-Gruppen, einer SO₃-Gruppe, Glykosyl-Gruppen und Phosphoryl-Gruppen der Formel PO(OR')(OR''), wobei R' und R'' unabhängig voneinander gewählt werden aus Wasserstoff, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, Trialkylsilyl-Gruppen, Alkalimetall-Kationen, Erdalkalimetall-Kationen, Ammonium- und Phosphonium-Kationen, und R³ gewählt wird aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen, Aryl-Gruppen, substituierten Aryl-Gruppen, Aralkyl-Gruppen, Alkoxyalkyl-Gruppen, Carboxyalkyl-Gruppen und Alkyl-Sulfonsäure-Gruppen; und
R⁴–R¹¹ unabhängig voneinander gewählt werden aus Wasserstoff und Substituenten, die nicht die Generierung von Chemilumineszenz stören und 1–50 Atome gewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogen-Atomen enthalten, und die aus Substituenten-Gruppen bestehen, die gewählt werden aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen, Aryl-Gruppen, substituierten Aryl-Gruppen, Aralkyl-Gruppen, Alkenyl-Gruppen, Alkinyl-Gruppen, Alkoxy-Gruppen, Aryloxy-Gruppen, Halogenen, Amino-Gruppen, substituierten Amino-Gruppen, Carboxyl-Gruppen, Carboalkoxy-Gruppen, Carbamid-Gruppen, Cyano-Gruppen und Sulfonat-Gruppen;
wobei einer der R¹ bis R¹¹ substituiert ist mit dem markierenden Substituenten der Formel -L-RG, in dem L eine verknüpfende Gruppe ist, die gewählt wird aus einer Bindung, einem Atom oder einer unverzweigten oder verzweigten Kette von Atomen, von denen einige Bestandteil eines Ringsystems sein können, in dem die Atome der Kette gewählt werden aus C-, O-, N-, S-, P-, Si-, B- und Se-Atomen, und funktionellen Gruppen, die den verknüpfenden Substituenten enthalten und Alkylen-Gruppen, Arylen-Gruppen, Alkenylen-Gruppen, Ether-Gruppen, Peroxid-Gruppen, Carbonyl-Gruppen wie Ketone, Ester, Carbonat-Ester, Thioester oder Amide, Amin-Gruppen, Amidin-Gruppen, Carbamat-Gruppen, Harnstoff-Gruppen, Imin-Gruppen, Imid-Gruppen, Imidat-Gruppen, Carbodiimid-Gruppen, Hydrazin-Gruppen, Diazo-Gruppen, Phosphordiester-Gruppen, Phosphortriester-Gruppen, Phosphonat-Ester-Gruppen, Thioether-Gruppen, Disulfid-Gruppen, Sulfoxid-Gruppen, Sulfon-Gruppen, Sulfonatester-Gruppen, Sulfatester-Gruppen und Thioharnstoff-Gruppen beinhalten, und RG eine reaktive Gruppe ist, die gewählt wird aus

a) Amin-reaktiven Gruppen:
b) Thiol-reaktiven Gruppen:
c) Carbonsäure-reaktiven Gruppen: -NH₂ -OH -NHNH₂ und
d) Hydroxyl-reaktiven Gruppen:

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHUNGEN
1 zeigt eine Graphik, die das Zeitprofil der Chemilumineszenz zeigt, die aus der Reaktion des Acridan-Phosphats 5 resultiert. Die Lichtproduktion folgt auf das Mischen und erreicht die maximale Intensität nach weniger als 1 s.
2 zeigt eine Graphik, die die Menge der Verbindung mit der maximalen Chemilumineszenz-Intensität, die von dem bei Raumtemperatur angeregten Acridan-Phosphat 5 emittiert wird, in Verbindung setzt. Die Emission der Chemilumineszenz wurde durch Zugabe von 100 μL einer 0.25 M NaOH-Lösung ausgelöst.
3 zeigt ein Bild eines Röntgen-Films von der Detektion eines chemilumineszent markierten Proteins in einem Polyacrylamid-Gel für die Elektrophorese; sobald die chemilumineszente Reaktion begann, wurde das Gel 20 min einem Röntgen-Film ausgesetzt. 3A zeigt die Detektion von BSA-APN_a2; 3B zeigt die Detektion von BSA-APCN₂.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen:
Säure – eine Verbindung die, bei Zugabe zu Wasser, eine Absenkung des pH-Wertes der resultierenden Lösung verursacht. Der Begriff der Säure, wie er hier verwendet wird, beinhaltet Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure und Perchlorsäure, organische Säuren, einschließlich Carbonsäuren wie Oxalsäure, Essigsäure und Propionsäure, sowie andere Arten von organischen Verbindungen wie Pikrinsäure und Lewis-Säuren wie Aluminiumchlorid und Eisenchlorid.
Alkyl – eine verzweigte oder unverzweigte Kette oder eine Gruppe zyklischer Kohlenwasserstoffe, die 1–20 Kohlenstoffe enthält. Niedriges Alkyl, wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf diejenigen Alkyl-Gruppen, die bis zu 8 Kohlenstoffe enthalten.
Alkenyl – eine verzweigte oder unverzweigte Kette oder eine Gruppe zyklischer Kohlenwasserstoffe, die mindestens eine C-C-Doppelbindung enthält und die 2–20 Kohlenstoffe enthält. Niedriges Alkenyl, wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf diejenigen Alkenyl-Gruppen, die bis zu 8 Kohlenstoffe enthalten.
Alkinyl – eine verzweigte oder unverzweigte Kette von Kohlenwasserstoffen, die mindestens eine C-C-Dreifachbindung enthält und die 2–20 Kohlenstoffe enthält. Niedriges Alkinyl, wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf diejenigen Alkinyl-Gruppen, die bis zu 8 Kohlenstoffe enthalten.
Analyt – eine Substanz, deren Anwesenheit oder Menge in einer Probe durch ein Assay gemessen werden soll. Analyten beinhalten organische oder biologische Moleküle, für die ein spezifischer Bindungspartner mit spezifischer Bindungsaffinität existiert. Beispielhafte Analyten beinhalten – ohne Einschränkungen – Einzelstrang- oder Doppelstrang-DNA, RNA, DNA-RNA-Komplexe, Oligonukleotide, Antiköper, Antikörper-Fragmente, Antikörper-DNA-Chimären, Antigene, Haptene, Proteine, Lektine, Avidin, Streptavidin und Biotin. Andere beispielhafte Analyten beinhalten auch Pharmakons, Hormone und Pestizide.
Aryl – eine Aromaten-enthaltende Gruppe, die 1 bis 5 aromatische zyklische Kohlenstoff-Ringe enthält, die mit 1 oder mehr Substituenten außer H substituiert sein können.
Biomedizinische Analyse – eine Analyse von Proben biologischen Ursprungs auf interessierende Analyten. Die Analysen können in Immunoassays, Western Blots, Northern Blots, Southern Blots, DNA-Hybridisierungs-Assays, DNA-Sequenzanalysen, Kolonie-Hybridisierungen, Gen-Expressions-Analyse, Pharmakon-Screenings mit hohem Durchsatz, und zur Detektion von infektiösen Wirkstoffen oder von Pathogenen Verwendung finden.
Glykosyl – Rückstände von Kohlenwasserstoff-Gruppen, einschließlich Hexosen und Pentosen und mit einer oder mehreren Zucker-Einheiten. Beispiele beinhalten Fruktose, Galaktose, Glukose, Glukuronate, Mannose, Ribose und N-Acetylglukosamin.
Halogen – Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iod-Atome.
Heteroaryl – eine Aromaten-enthaltende Gruppe, die 1 bis 5 aromatische zyklische Kohlenstoff-Ringe enthält, in denen mindestens eines der Kohlenstoff-Atome im Ring durch ein Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefel-Atom ersetzt ist und die mit 1 oder mehr Substituenten außer H substituiert sein kann.
Lumineszent – fähig, bei Anregung in einen elektronisch angeregten Zustand Licht zu emittieren. Das Licht: kann sowohl als Fluoreszenz emittiert werden, wenn der Zerfall von einem angeregten Singlett-Zustand ausgeht, als auch als Phosphoreszenz, wenn der Zerfall von einem angeregten Triplett-Zustand ausgeht.
Peroxid – eine Verbindung, die eine O-O-Doppelbindung besitzt, vorzugsweise Wasserstoffperoxid oder ein Komplex von Wasserstoffperoxid wie Harnstoff-Peroxid, Perborat oder Peroxocarbonat.
Probe – eine Flüssigkeit, die einen oder mehrere zu prüfende Analyte enthält oder enthalten könnte. Typische Proben, die durch Verfahren mit Chemilumineszenz-Reaktionen untersucht werden, sind biologische Proben, einschließlich Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Samenflüssigkeit, Speichel, Zell-Lysat und Gewebeextrakte. Andere Arten von Proben beinhalten Lebensmittelproben und Umweltproben wie Erde oder Wasser.
Spezifisches Bindungspaar – zwei Substanzen, die eine gegenseitige Bindungsaffinität aufweisen. Beispiele beinhalten Antigen-Antikörper-, Hapten-Antikörper- oder Antikörper-Antikörper-Paare, komplementäre Oligonukleotide oder Polynukleotide, Avidin-Biotin, Streptavidin-Biotin, Hormon-Rezeptor, Lektin-Kohlenhydrat, IgG-Protein A, Nukleinsäure-nukleinsäure-bindendes Protein und Nukleinsäure-anti-Nukleinsäure-Antikörper.
Substituiert – bezieht sich auf den Ersatz von zumindest einem Wasserstoff-Atom einer Gruppe gegen ein anderes Atom oder gegen eine Gruppe, bestehend aus 1 bis 50 Atomen, gewählt aus C, O, N, S, P, Si, B, Se, F, Cl, Br und I. Es sei angemerkt, dass in Bezug auf substituierte Gruppen beabsichtigt ist, dass mehrere Substitutions-Punkte vorhanden sein können, solange es nicht anders erwähnt ist.
Es ist in überraschender Weise entdeckt worden, dass chemilumineszente Verbindungen der unten genannten Formel I mit bestimmten Reagenzien eine Reaktion eingehen, wobei Chemilumineszenz als ein kurzer, intensiver Lichtblitz freigesetzt wird. Die Verwendung der vorliegenden Verbindungen für die Detektion, beispielsweise als Marker, in Chemilumineszenz-Assays führt zu einer hochempfindlichen Detektion von Analyten. Bei den chemilumineszenten Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann zumindest eine der Gruppen R¹–R¹¹ mit einem markierenden Substituenten substituiert werden. Ist ein markierender Substituent vorhanden, ist dieser vorzugsweise mit R¹ oder R² verknüpft.
VERFAHREN ZUR GENERIERUNG VON CHEMILUMINESZENZ
Bei den heutigen Verfahren zur Generierung von Chemilumineszenz geht eine Verbindung der Formel I eine Reaktion ein, die folgende Schritte umfasst:

a) Versetzen der Verbindung der Formel I mit einer Säure, um ein erstes Reaktionsprodukt zu bilden; und
b) Versetzen des ersten Reaktionsproduktes mit einer ausreichenden Menge einer Base, um eine basische Umgebung zu schaffen, wobei zumindest einer der Reaktionsschritte die Bereitstellung eines Oxidationsmittels zur Reaktion beinhaltet, wobei ein zweites Reaktionsprodukt gebildet wird und das Licht in der basischen Umgebung produziert wird. Wenn die Reaktion bei alkalischen pH-Werten durchgeführt wird, erreicht die Lichtintensität bei Raumtemperatur rasch ein maximales Niveau, oftmals innerhalb einer Sekunde oder weniger.

Die im ersten Reaktioneschritt verwendete Säure muss in der Lage sein, eine Umgebung mit einem niedrigen pH-Wert zu schaffen, zumindest geringer als pH 3, und vorzugsweise nicht größer als pH 1. Aufgrund ihrer geringen Kosten und ihrer hohen Säurestärke werden Mineralsäuren bevorzugt. Bei einigen Ausführungsbeispielen können oxidierende Mineralsäuren, beispielsweise Salpetersäure, bevorzugt werden. Typischerweise werden die Säuren in einem Konzentrationsbereich von 0.001 M bis 1 M verwendet.
Als Oxidationsmittel können ein Peroxid oder ein Alkyl-Hydroperoxid verwendet werden. Bevorzugte Peroxide beinhalten Wasserstoffperoxid, Harnstoff-Peroxid, Peroxodisulfat und Perborat-Salze. Das Oxidationsmittel kann auch ein Metalloxid, wie CrOa, MnO₂ oder ein anionischer Komplex, wie Periodat IO₄- oder Permanganat MnO₄-; oder ein :Metall-Peroxid, wie Na₂O₂, sein. Weitere Oxidationsmittel beinhalten Häm oder Hämoglobin. Die Säure kann zum Teil ebenfalls als Oxidationsmittel wirken, wie beispielsweise in dem Fall, dass es sich bei der Säure um Salpetersäure handelt. Die Wahl, ob es bevorzugt ist, das Oxidationsmittel mit der Säure im ersten Schritt zu kombinieren, oder mit der Base im zweiten Schritt, wird von der Wahl der Säure und der Stabilität und Reaktivität des Oxidationsmittels in der Base beeinflusst. Im Allgemeinen kann es von Vorteil sein, das Oxidationsmittel mit der Base zu kombinieren, wenn die Säure eine oxidierende Säure ist. In anderen Fällen kann es von Vorteil sein, das Oxidationsmittel mit der Säure zu kombinieren.
Basische Verbindungen, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung zweckmäßig sind, umfassen Verbindungen, die bei Zugabe zu Wasser einen Anstieg des pH-Wertes der resultierenden Lösung verursachen. Dies beinhaltet Hydroxid-Salze, wie Natrium-, Kalium- oder Lithiumhydroxid, Ammoniumhydroxid und Tetraalkylammoniumhydroxid, Karbonate und basische Metalloxide. Die Verwendung organischer Basen ist ebenfalls in Erwägung zu ziehen. Bevorzugte Basen sind die Alkalimetall-Hydroxide.
Die Reaktion wird typischerweise bei einer Temperatur zwischen 5°C und 50°C durchgeführt, vorzugsweise zwischen 20°C und 40°C, und üblicherweise bei Umgebungstemperatur. Die Reaktion der vorliegenden Erfindung wird in wässriger Lösung durchgeführt, die in Kontakt zur Oberfläche eines Feststoffkatalysators stehen kann, wie beispielsweise einem „bead", eines Reaktionsgefäß, einer Membran, oder eines Mikrowell-Platte, die jeweils mit Peroxidase beschichtet sind. Für manche Assay-Methoden kann es wünschenswert sein, einige Schritte des Assays, die Bindungsreaktionen beinhalten, in Puffer-Lösungen durchzuführen. Die Säure muss in einer gewissen Menge und in ausreichender Konzentration zur Überschreitung der Puffer-Kapazität und zum Absenken des pH-Wertes auf weniger als pH 3, vorzugsweise etwa pH 1 oder weniger, verwendet werden.
CHEMILUMINESZENTE ASSAY-VERFAHREN
Die chemilumineszenten Reaktionen können für ein Verfahren zur Detektion eines Analyten verwendet werden, wobei das Licht durch die chemilumineszente Reaktion generiert wird, der Lichtproduzenten detektiert wird und, wenn eine Quantifizierung erwünscht ist, die Menge an produziertem Licht mit der Menge des Analyten in Zusammenhang gebracht wird. Die Beziehung zwischen der Lichtintensität und der Menge des Analyten kann leicht durch das Anfertigen einer Eichkurve mit bekannten Mengen der chemilumineszenten Verbindung erkannt werden. Die Gesamtreaktion der chemilumineszenten Reaktion kann durch unten stehende Gleichung verdeutlicht werden.
Die Verbindung der Formel I trägt einen markierenden Substituenten, beispielsweise um die Verknüpfung mit einem Analyten oder einem spezifischen Bindungspaar-Mitglied zu ermöglichen.
Bei anderen bevorzugten Assay-Methoden wird die Verbindung der Formel I als eine chemilumineszente Markierungsverbindung verwendet, um einen chemilumineszenten Marker für eine zu detektierende Verbindung bereitzustellen. Bei diesen Assays umfasst die Verbindung der Formel I einen markierenden Substituenten der Formel -L-RG, wobei L eine verknüpfende Gruppe ist, die optional ist, und bei ihrer Anwesenheit zur Verbindung des chemilumineszenten Teils mit einer reaktiven Gruppe RG dient.
CHEMILUMINESZENTE VERBINDUNGEN
In den Verbindungen der Formel I ist die Gruppe R¹ eine Gruppe, die, bei Anlagerung an eine Z¹-substituierte Doppelbindung, mit einer Säure abgespalten werden kann, und die jede Gruppe sein kann, die 1 bis ungefähre 50 Nicht- Wasserstoff-Atome gewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogen-Atomen enthält. Die Gruppen werden gewählt aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, substituierten oder unsubstituierten Alkyl- oder Aryl-Carbonyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, tri-(C₁-C₈-Alkyl)-Silyl-Gruppen, einer SO₃-Gruppe, Glykosyl-Gruppen und Phosphoryl-Gruppen der Formel PO(OR')(OR''), wobei R' und R'' unabhängig voneinander gewählt werden aus Wasserstoff, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, Trialkylsilyl-Gruppen, Alkalimetall-Kationen, Erdalkalimetall-Kationen, Ammonium- und Phosphonium-Kationen. Eine bevorzugte R¹-Gruppe ist eine Phosphatsalz-Gruppe PO₃M₂ mit einem Alkalimetallion als M.
Die Gruppe R² kann jede Gruppe sein, die 1 bis etwa 50 Nicht-Wasserstoff-Atome gewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogen-Atomen enthält, die eine Lichtproduktion ermöglicht. Mit letzterem ist gemeint, dass, wenn eine Verbindung der Formel I eine Reaktion nach der vorliegenden Erfindung eingeht, Licht produziert wird, und dies die Bildung einer oder mehrerer chemilumineszenter Zwischenstufen umfassen kann. R² wird gewählt aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, substituierten oder unsubstituierten Alkyl- oder Aryl-Carbonyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, tri-(C₁-C₈-Alkyl)-Silyl-Gruppen, einer SO₃-Gruppe, Glykosyl-Gruppen und Phosphoryl-Gruppen der Formel PO(OR')(OR''), wobei R' und R'' unabhängig voneinander gewählt werden aus Wasserstoff, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, Trialkylsilyl-Gruppen, Alkalimetall-Kationen, Erdalkalimetall-Kationen, Ammonium- und Phosphonium-Kationen. Beispielhafte substituierte Alkyl-Gruppen beinhalten eine Cyanoethyl-Gruppe oder eine Trimethylsilyl-Ethyl-Gruppe. In einer bevorzugten Ausführungsform ist R² eine Aryl-Gruppe, vorzugsweise Phenyl, substituiert mit dem markierenden Substituenten der Formel -L-RG.
Die Gruppe R³ ist eine organische Gruppe, die 1 bis 50 Nicht-Wasserstoff-Atome gewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogen-Atomen enthält, zusätzlich zu der notwendigen Anzahl an H-Atomen, die benötigt wird, um die Valenzen der Atome dieser Gruppe zu besetzen. In bevorzugter Weise enthält R³ 1 bis 20 Nicht-Wasserstoff-Atome. Die organische Gruppe wird gewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen, Aryl-Gruppen, substituierten Aryl- und Aralkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten C₁-C₄-Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Benzyl-Gruppen, Alkoxyalkyl-Gruppen, Carboxyalkyl-Gruppen und Alkyl-Sulfonsäure-Gruppen. Die Gruppe R³ kann an entweder R⁷ oder R⁸ geknüpft sein, um einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring zu vervollständigen.
In Verbindungen der Formel I sind die Gruppen R⁴–R¹¹ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Substituenten-Gruppe, die die Produktion von Licht erlaubt, und die allgemein 1 bis 50 Atome gewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogen-Atomen enthält. Beispielhafte Substituenten-Gruppen, die anwesend sein können, beinhalten – ohne Einschränkung – Alkyl-Gruppen, substituierte Alkyl-Gruppen, Aryl-Gruppen, substituierte Aryl-Gruppen, Aralkyl-Gruppen, Alkenyl-Gruppen, Alkinyl-Gruppen, Alkoxy-Gruppen, Aryloxy-Gruppen, Halogene, Amino-Gruppen, substituierte Amino-Gruppen, Carboxyl-Gruppen, Carboalkoxy-Gruppen, Carbamid-Gruppen, Cyano-Gruppen und Sulfonat-Gruppen. Paare benachbarter Gruppen, beispielsweise R⁴–R⁵ oder R⁵–R⁶ können miteinander verbunden sein, um ein carbozyklisches oder heterozyklisches Ringsystem zu bilden, das zumindest einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring enthält, der an den Ring kondensiert ist, mit dem die beiden Gruppen verknüpft sind. Solche kondensierten heterozyklischen Ringe können N-, O- oder S-Atome enthalten und können Ring-Substituenten außer H enthalten, wie solche, die oben genannt wurden. Eine oder mehrere der Gruppen R⁴–R¹¹ können mit einem markierenden Substituenten der Formel -L-RG substituiert sein. In bevorzugter Weise werden R⁴–R¹¹ gewählt aus Wasserstoff, Halogen-Gruppen und Alkoxy-Gruppen, wie Methoxy, Ethoxy, t-Butoxy und ähnlichen. Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen besitzt als eine von R⁵, R⁶, R⁹ oder R¹⁰ ein Halogen und die restlichen R⁴–R¹¹ sind Wasserstoff-Atome.
Die Substituenten-Gruppen können in verschiedener Anzahl und an ausgewählten Ring- oder Kettenpositionen in dem Acridan-Ring eingebaut sein, um die Eigenschaften der Verbindung zu modifizieren oder um Vorteilen bei der Synthese gerecht zu werden. Solche Eigenschaften beinhalten beispielsweise die Quantenausbeute der Chemilumineszenz, die Reaktionsgeschwindigkeit mit dem Enzym, die maximale Lichtintensität, die Dauer der Lichtemission, die Wellenlänge der Lichtemission und die Löslichkeit im Reaktionsmedium. Spezifische Substituenten und ihre Effekte sind in den spezifischen Beispielen unten beschrieben, sollen jedoch nicht in irgendeiner Weise als Einschränkung in Hinblick auf den Umfang der Erfindung angesehen werden.
Verknüpfende Gruppe (L). Die verknüpfende Gruppe kann eine Bindung sein, ein Atom oder eine unverzweigte oder verzweigte Kette von Atomen, von denen einige Bestandteil eines Ringsystems sein können. Der Substituent enthält 1 bis etwa 50 Nicht-Wasserstoff-Atome, bevorzugt 1 bis etwa 30 Nicht-Wasserstoff-Atome. Die Atome der Kette werden gewählt aus C-, O-, N-, S-, P-, Si-, B- und Se-Atomen, vorzugsweise aus C-, O-, N-, P- und S-Atomen. Halogen-Atome können als Substituenten an der Kette oder am Ring vorhanden sein. Typische funktionelle Gruppen, die den verknüpfenden Substituenten enthalten, beinhalten Alkylen-Gruppen, Arylen-Gruppen, Alkenylen-Gruppen, Ether-Gruppen, Peroxid-Gruppen, Carbonyl-Gruppen wie Ketone, Ester, Carbonat-Ester, Thioester oder Amide, Amin-Gruppen, Amidin-Gruppen, Carbamat-Gruppen, Harnstoff-Gruppen, Imin-Gruppen, Imid-Gruppen, Imidat-Gruppen, Carbodiimid-Gruppen, Hydrazin-Gruppen, Diazo-Gruppen, Phosphordiester-Gruppen, Phosphortriester-Gruppen, Phosphonat- Ester-Gruppen, Thioether-Gruppen, Disulfid-Gruppen, Sulfoxid-Gruppen, Sulfon-Gruppen, Sulfonatester-Gruppen, Sulfatester-Gruppen und Thioharnstoff-Gruppen.
Reaktive Gruppe. Die reaktive Gruppe RG ist ein Atom oder eine Gruppe, deren Anwesenheit die Bindung zu einem weiteren Molekül über kovalente Bindungen oder physikalische Kräfte ermöglicht. In einigen Ausführungsformen führt die Bindung einer chemilumineszenten Markierungsverbindung der vorliegenden Erfindung zu einer anderen Verbindung zum Verlust eines oder mehrerer Atome der reaktiven Gruppe, beispielsweise, wenn die reaktive Gruppe eine Abgangsgruppe wie ein Halogen-Atom oder eine Tosylat-Gruppe ist, und die chemilumineszente Markierungsverbindung kovalent durch eine nukleophile Substitutionsreaktion an eine andere Verbindung gebunden wird. Bei anderen Ausführungsformen führt die Bindung einer chemilumineszenten Markierungsverbindung über eine kovalente Bindung zu einer weiteren Verbindung zu einer Umlagerung von Bindungen innerhalb der reaktiven Gruppen, wie es bei einer Additionsreaktion wie der Michael-Addition auftritt, oder wenn die reaktive Gruppe eine Isocyanat- oder eine Isothiocyanat-Gruppe ist. In noch einer weiteren Ausführungsform beinhaltet die Bindung keine Ausbildung einer kovalenten Bindung, sondern physikalische Kräfte; in diesen Fällen bleibt die reaktive Gruppe unverändert bestehen. Mit physikalischen Kräften sind Anziehungskräfte gemeint, wie Wasserstoff-Brückenbindungen, elektrostatische oder ionische Anziehungskräfte, hydrophobe Anziehungskräfte wie Basenstapelung, und spezifische Affinitäts-Wechselwirkungen wie Biotin-Streptavidin-, Antigen-Antikörper- und Nukleotid-Nucleotid-Wechselwirkungen.
Tabelle 1. Reaktive Gruppen für die chemische Bindung von Markern an organische und biologische Moleküle

a) Amin-reaktive Gruppen:
b) Thiol-reaktive Gruppen:
c) Carbonsäure-reaktive Gruppen: -NH₂ -OH -NHNH₂
d) Hydroxyl-reaktive Gruppen:

Bevorzugte reaktive Gruppen beinhalten OH, NH₂, COOH, SO₂CH₂CF₃, N-Hydroxysuccinimid-Ester- und Maleimid-Gruppen.
Auch bifunktionelle Kupplungsreagentien können zur Kupplung von Markern an organische und biologische Moleküle mit einigermaßen reaktiven Gruppen genutzt werden (siehe L. J. Kricka, Ligand-Binder Assays, Marcel Dekker, Inc., New York, 1985, Seite 18–20, Tabelle 2.2 und T. H Ji, „Bifunctional Reagents", Methods in Enzymology, 91, 580-609 (1983)). Es gibt zwei Arten von bifunktionellen Reagenzien, diejenigen, die in die Endstruktur eingebaut werden, und diejenigen, die nicht eingebaut werden und lediglich zur Kupplung der beiden Reaktanden dienen.
Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen hat die Formel II, wobei R⁴ bis R¹¹ jeweils Wasserstoffe sind. Die Gruppen Z¹, Z², R¹, R² und R³ entsprechen den oben definierten.
Eine weitere bevorzugte Klasse von Verbindungen hat die untere Formel III, wobei Z¹ gemeinsam mit R¹ eine Phosphat-Gruppe ist, Z² gewählt wird aus O, S und NR¹², R², R³ und R⁴–R¹¹ wie oben definiert sind, und R' und R" unabhängig voneinander gewählt werden aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen und Alkalimetallionen.
Bevorzugte Verbindungen der Formel III besitzen für R⁴–R¹¹ jeweils Wasserstoff-Atome und R³ ist eine Alkyl-Gruppe, vorzugsweise eine niedrige Alkyl-Gruppe. Besonders bevorzugt ist eine Verbindung der Formel IV.
Bevorzugte Markierungsverbindungen haben die Formeln V–X,
wobei R'' und R' gewählt werden aus Wasserstoff, Alkyl, Cyanoethyl und Alkalimetallionen, bevorzugte reaktive Gruppen RG Hydroxy-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Amino-Gruppen (NH₂), Maleimid-Gruppen, NHS-Ester und Trifluorethansulfonat-Gruppen (CF₃CH₂SO₃) beinhalten und wobei AcO eine Acetoxy-Gruppe darstellt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung chemilumineszent markierte Verbindungen. Damit sind Konjugate einer zu detektierenden Verbindung mit einer chemilumineszenten Markierungsverbindung der Formel I, die einen markierenden Substitutenten trägt, gemeint. Bei der Darstellung eines Konjugats unter Verwendung einer Markierungsverbindung der Formel V:
erfolgt die Bindung der mit dem chemilumineszenten Marker zu markierenden Verbindung über die reaktive Gruppe RG von V. Diese Bindung kann zur Substitution eines Teils der reaktiven Gruppe RG führen. Wenn RG beispielsweise ein N-Hydroxysuccinimid-Ester ist, geht der N-Hydroxysuccinimid-Teil bei der Bildung der Bindung verloren. In anderen Fällen bleibt RG intakt, beispielsweise bei der Reaktion einer Maleimid-Gruppe mit einer -SH-Gruppe einer zu markierenden Verbindung oder bei der Reaktion eines Isocyanats mit einem Amin oder einer -OH-Gruppe. In wieder anderen Fällen geht die gesamte RG bei der Bindungsbildung verloren; beispielsweise, wenn es sich bei RG um eine Abgangsgruppe wie ein Halogenid, ein Azid, N₃ oder p-Toluolsulfonat handelt.
Bei der Herstellung der chemilumineszent markierten Verbindung wird üblicherweise ein molarer Überschuss der chemilumineszenten Markierungsverbindung verwendet, auch wenn dies nicht notwendig ist. Die chemilumineszente Markierungsverbindung wird bevorzugt in einem mindestens fünffachen molaren Überschuss bezogen auf die zu markierende Verbindung verwendet und üblicherweise in zumindest äquimolarem Verhältnis. Die chemilumineszent markierte Verbindung kann mit einer Markierungsgruppe oder mit einer Vielzahl dieser Gruppen markiert sein. Üblicherweise ist es erwünscht, eine Vielzahl von Markern einzubauen, um die Menge des Signals, die generiert werden kann, zu erhöhen.
Synthetische Methoden. Verbindungen der Formel I können mit verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Bei einem bevorzugten Verfahren – wenn die Z¹-Gruppe O ist und die Z²-Gruppe O, S oder NR¹² ist – kann die Verbindung I durch Reaktion des Enolats eines Esters, Thioesters oder Amids mit einem Reagenz der Formel Z¹-LG hergestellt werden, wobei LG eine Abgangsgruppe darstellt, wie es durch die unten angegebene Reaktionsgleichung verdeutlicht wird.
Typische Abgangsgruppen beinhalten Halogene, wie Chlorid, Bromid und Iodid, Sulfonate, wie Methansulfonat, p-Toluolsulfonat und Trifluormethansulfonat, Carboxylate, wie Acetat und Benzoat, insbesondere, wenn Z¹ eine Acyl-Gruppe ist; in diesem Fall wäre Z¹-LG ein Säureanhydrid, ein Sulfat, wie Methosulfat, oder eine andere Gruppe, wie Imidazol, Triazol und Tetrazol, Maleimid, oder eine Succinimidoxy-Gruppe.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, in denen beide Z-Gruppen S-Atome sind, beinhalten eine nukleophile Addition einer Lithiumsilan-Verbindung oder eines Phosphor-Ylids an eine passende Carbonyl-Verbindung gemäß den unteren beiden Reaktionsgleichungen (F. A Carey, A. S. Court, J. Org. Chem., 37 1926-29, (1972)).
Bei einem anderen Verfahren wird ein Ester durch Reaktion mit einem Bis(Dialkylaluminium)dithiol-Reagenz in ein Keten-Dithioacetal überführt, wie es in E. J. Corey und A. P. Kozikowski, Tetrahedron Lett., 925-8 (1975) offenbart und unten gezeigt ist.
In noch einem weiteren Verfahren wird ein Anion einer aktiven Methylen-Gruppe mit CS₂ zur Reaktion gebracht, und das Dithiocarboxylat wird mit einem Reagenz R₁-LG, das die R₁-Gruppe zur Bildung eines Dithioesters enthält, zur Reaktion gebracht. Ein Beispiel für letztere Methodik ist in I. Shahak und Y. Sasson, Tetrahedron Lett., 4207-10 (1973) offenbart. Der Dithioester wird zum Enolat umgesetzt und mit einem Reagenz der Formel X-LG zur Reaktion gebracht.
Verfahren zur Herstellung chemilumineszenter Markierungsverbindungen beinhalten üblicherweise, dass eine Precursor-Verbindung der Formel I hergestellt wird, und diese einer oder mehrerer zusätzlichen Reaktionen, die dem Fachmann üblicherweise geläufig sind, unterworfen wird, um einen markierenden Substituenten, der an einer der Gruppen R¹ bis R¹¹, vorzugsweise an R¹ oder R², hängt, zu erhalten. Eine Vielzahl von Beispielen ist unten angegeben, um das allgemeine Prinzip zu verdeutlichen.
Analyte. Substanzen, auf die durch Anwendung der vorliegenden chemilumineszenten Verfahren mittels einer Assay-Methode getestet werden kann, beinhalten verschiedene Klassen organischer und biologischer Moleküle. Solche Assays beinhalten üblicherweise die Verwendung einer spezifischen Bindungsreaktion zwischen zumindest einem Paar spezifischer Bindungspartner. Zumindest einer der spezifischen Bindungspartner ist mit einer Verbindung der Formel I in der oben beschriebenen Weise assoziiert. Beispielhafte Analyten beinhalten Pharmakons, Hormone, Pestizide, Metabolite von Pestiziden, DNA, RNA, Oligonukleotide, Antikörper, Antikörper-Fragmente, Antikörper-DNA-Chimären, Antigene, Haptene, Proteine, Kohlenhydrate, Lektine, Rezeptoren, Avidin, Streptavidin und Biotin. Beispielhafte Bindungspartner beinhalten Antigen-Antikörper-, Hapten-Antikörper- oder Antikörper-Antikörper-Paare, komplementäre Oligonukleotide oder Polynukleotide, Avidin-Biotin, Streptavidin-Biotin, Hormon-Rezeptor, Lektin-Kohlenhydrat, IgG-Protein A, Nukleinsäure-nukleinsäure-bindendes Protein und Nukleinsäure-anti-Nukleinsäure-Antikörper.
Die chemilumineszenten Reaktionen, die die Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwenden, können auch für Verfahren zur Detektion von Wasserstoffperoxid verwendet werden, da Peroxid als das Oxidationsmittel wirken kann. Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass die vorliegenden Verfahren darüber hinaus auch zur Detektion von Oxidase-Enzymen und Dehydrogenase-Enzymen, die H₂O₂ durch Reduktion von Sauerstoff und Oxidation ihrer ursprünglichen Substrate generieren, verwendet werden können. Darüber hinaus kann das Oxidase- oder Dehydrogenase-Enzym als Konjugat zu einem biologischen Molekül oder einem spezifischen Bindungspaar-Mitglied in einem Assay für einen Analyten anwesend sein.
Assays. Bei den Assays, die nach Verfahren unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, wird eine chemilumineszente Verbindung mit dem Analyt oder einem Mitglied eines spezifischen Bindungspaares assoziiert. Diese Assoziation kann in Form einer kovalenten Bindung vor liegen, wenn die Verbindung einen markierenden Substituenten besitzt. Ein Beispiel ist ein chemilumineszentes Immunoassay. Derartige Assays werden üblicherweise bei „manual Format"-Assays oder bei automatisierten Multi-Test-Immunoassay-Systemen verwendet. Die Geschwindigkeit der Generierung der Chemilumineszenz, die durch Reaktionen der vorliegenden Erfindung erreicht wird, ist insbesondere vorteilhaft bei der Adaption dieser zur Anwendung mit hochvolumiger Schnelltest-Instrumentarik.
Bei einem typischen Immunoassay wird durch Detektion der Anwesenheit oder der Menge eines chemilumineszent markierten spezifischen Bindungspartners eines Analyts oder eines markierten Analogons des Analyts auf den Analyt Hapten, ein Antigen oder einen Antikörper geprüft. Verschiedene Assay-Methoden und Vorschriften zur Durchführung der immunochemischen Schritte sind im Fachgebiet bekannt. Diese Assays fallen grob in zwei Kategorien. Bei Kompetetiven Assays kommt es zu einer immunologischen Bindung eines spezifischen Antikörpers mit dem Analyt und einem Analogon des Analyts, beispielsweise einem detektierbar markierten Analyt-Molekül. Sandwich-Assays resultieren aus der sequenziellen oder simultanen Bindung zweier Antikörper, von denen einer detektierbar markiert ist, mit dem Analyten. Auf die so gebildeten detektierbar markierten Bindungspaare kann mit den Verbindungen und Methoden der vorliegenden Erfindung geprüft werden. Die Messung kann mit markierten Verbindungen durchgeführt werden, die an eine feste Oberfläche oder an einen Träger, einschließlich „beads", Reaktionsgefäße, Mikrowell-Platten, magnetische Partikel, Latex-Partikel, Silica-Partikel, Teststreifen, Membrane und Filter, wie sie in der Fachwelt üblicherweise eingesetzt werden, gebunden sind.
Das durch das vorliegende Verfahren emittierte Licht kann durch jede geeignete Methode, einschließlich mittels Luminometer, Röntgenfilme, Hochgeschwindigkeitsfotografie-Filme, einer CCD-Kamera oder visuell, detektiert werden. Die Wahl der Detektionsmethode wird durch die Anwendung und durch Überlegungen betreffend Kosten, Zweckmäßigkeit, spektrale Empfindlichkeit und der Erfordernis nach einer permanenten Aufzeichnung beeinflusst.
Eine besonders praktische Anwendung der vorliegenden Detektionsverfahren ist die Detektion von Nukleinsäuren unter Verwendung von markierten Nukleinsäure-Proben. Verfahren zur Analyse und chemilumineszenten Detektion von Nukleinsäuren unter Verwendung von markierten Proben, beispielsweise „Solution-Hybridization-Assays", DNA-Detektion durch Southern Blots, RNA-Detektion durch Northern Blots, DNA-Sequenzierung, DNA-Fingerabdrücke, Kolonie-Hybridisierung und Plaque-Lifts, sind alles etablierte Verfahren. Der Marker kann als direktes Konjugat mit einer Oligonukleotidsonde oder mit einem Capture-Oligonukleotid anwesend sein, oder er kann durch indirekte Methoden der Verknüpfung durch in der Fachwelt übliche Verfahren eingeführt werden. Beispiele für indirekte Methoden der Verknüpfung beinhalten die Verwendung von Hapten-markierten Oligonukloetiden und anti-Hapten-HRP-Konjugaten oder von Biotin-markierten Oligonukleotiden und Avidin-HRP-Konjugaten. Derartige Nukleinsäure-Assays können auf einer Blotting-Membran oder in Lösung unter Verwendung von Oligonukleotiden, die an festen Oberflächen, einschließlich „beads", Reaktionsgefäßen, Mikrowell-Platten, magnetische Partikel oder Teststreifen, wie sie in der Fachwelt bekannt sind, haften, durchgeführt werden.
Die Verwendung der vorliegenden chemilumineszenten Reaktionen zur Detektion von markierten Analyten, wie Nukleinsäuren, Proteinen oder Antikörpern, stellt einen unerwarteten Vorteil gegenüber anderen chemilumineszenten Markierungsverfahren dar. In unerwarteter Weise hat sich herausgestellt, dass der chemilumineszent markierte Analyt einer Elektrophorese unterworfen werden kann und direkt in Gelen wie Acrylamid und Agarose detektiert werden kann. Überraschenderweise wird der markierte Analyt bei dem elektrischen Potential und den Strömungen, die während des Verfahrens auftreten, nicht zerstört oder angeregt, wie es vom Stand der Technik her zu erwarten gewesen wäre. Die chemilumineszente Detektion von markierten, durch Elektrophorese getrennten Analyten in einem Gel wurde nach bestem Wissen des Anmelders bisher nicht erfolgreich durchgeführt; die Detektion der getrennten Analyten durch Chemilumineszenz erforderte den Transfer des unmarkierten Analyten auf Blotting-Membran und die Detektion mit indirekten Methoden auf der Membran. Die vorliegenden chemilumineszenten Detektionsverfahren stellen beim Anregen in dem Gel eine ausreichende Intensität bereit und befreien daher von der Notwendigkeit eines Blotting-Schrittes und von Bindungsreaktionen. Diese neue Technik, die dadurch, dass ein Membran-Transfer-Schritt überflüssig wird, einen signifikanten Vorteil bei der Detektions-Methodik darstellt, sollte besonders gut für die Detektion von DNA-Sequenzleitern geeignet sein.
Eine weitere beispielhafte Verwendung ist die immunologische Detektion von Proteinen in Gelen oder durch die Technik des Western Blots. Eine Probe, die ein interessierendes Protein als Analyt enthält, wird einer Trennung durch Elektrophorese unterworfen. Die getrennten Proteine werden entweder direkt in dem Gel detektiert, oder werden durch Kapillar-Kräfte oder mit Hilfe eines elektrischen Feldes auf eine Blotting-Membran, wie ein Cellulosenitrat oder eine PVDF-Membran transferiert. Das transferierte Protein wird mit einem spezifischen primären Antikörper und einem markierten Sekundär-Antikörper, der den primären Antikörper erkennt und an ihn bindet, detektiert. Die quantitative Bestimmung des Markers gibt die Anwesenheit des Protein-Analyten wieder. Um die Verfahren der vorliegenden Erfindung auch an Western Blots anzupassen, ist der Sekundär-Antikörper mit einer chemilumineszenten Markierungsverbindung der vorliegenden Erfindung markiert. Variationen dieser Technik, wie die Verwendung von Biotin-markierten Antikörpern und chemilumineszent markiertem Avidin werden als innerhalb dieser Erfindung liegend angesehen.
Multi-Analyten-Assays können unter gleichzeitiger Verwendung von zwei oder mehreren unterscheidbaren chemilumineszenten Markern zur Markierung verschiedener Analyte durchgeführt werden. Geeignet gewählte chemilumineszente Marker können auf der Basis unterschiedlicher Emissions-Wellenlängen unabhängig voneinander detektiert werden. Alternativ dazu können zwei oder mehr verschie dene Marker durch die Zeit, die bis zur Emission von Licht vergeht, unterscheidbar sein. Verfahren für chemilumineszente Multi-Analyten-Assays werden in U.S. 5,656,207 offenbart. Multi-Analyten-Assays können auch die Detektion verschiedener Regionen desselben Analyts beinhalten, wie zwei verschiedene Regionen einer Nukleinsäure oder zwei Epitope eines Antigens. Diese Art von Assay ist beispielsweise zur Detektion von Juxtapositionen von Genen oder zur Bereitstellung verbesserter Detektions-Spezifizität sinnvoll.
Die Verwendung von grenzflächen-aktiven Stoffen als Additive bei den vorliegenden chemilumineszenten Reaktionen ist von Vorteil und kann zu einer Verbesserung der analytischen Empfindlichkeit führen. Nichtionische grenzflächenaktive Stoffe, die bei dem Einsatz der vorliegenden Erfindung sinnvoll sind, beinhalten in beispielhafter Weise polyoxyethylenierte Alkylphenole, polyoxyethylenierte Alkohole, polyoxyethylenierte Ether und polyoxyethylenierte Sorbitol-Ester. Kationische grenzflächen-aktive Stoffe, einschließlich quartären Ammoniumsalz-Verbindungen wie CTAB, sind für die Verwendung zum Erhöhen des Levels der emittierten Chemilumineszenz von Vorteil.
In einer weiteren Ausführungsform können Fluoreszenzenergie-Akzeptoren eingesetzt werden, um das Emissionsmaximum zu längeren Wellenlängen (Rotverschiebung) zu verschieben und/oder die Quantität der emittierten Lumineszenz zu erhöhen. Fluoreszierende Stoffe können kovalent an eine Verbindung der Formel I gebunden sein oder, alternativ dazu, zu der Reaktionslösung als separate Spezies zugegeben werden, oder mit einen Polymer verknüpft sein oder elektrostatisch an eine Mizelle oder ein Polymer gebunden sein.
BEISPIELE
Die Beispiele 1–9, 21–25 und 26 (zum Teil) dienen lediglich Referenz-Zwecken, da sie Verbindungen betreffen (benannt 1–21), die außerhalb des Umfangs der Ansprüche der vorliegenden Erfindung liegen. Der Inhalt dieser Beispiele ist dazu ge dacht, Hintergrund-Informationen zum Verständnis der Synthese-Verfahren der beanspruchten Verbindungen zu liefern.
Die Beispiele 10–20 beschreiben die Synthese der Verbindungen 22–32 die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen. In ähnlicher Weise machen die Beispiele 27–30 von den Verbindungen 25 und 26 Gebrauch, die von den Ansprüchen umfasst werden.
1. Synthese von Acridan-Phosphat-Verbindungen.
Die Herstellung der unten angegebenen Verbindungen 1-13 (Y = Na) und 1a-13a (Y = CH₂CH₂CN) wurde in der PCT-Anmeldung WO 97/26245 des Anmelders beschrieben.

R⁴–R¹¹ sind H, wenn keine andere Angabe vorhanden ist.
2. Synthese des Acridan-Derivats 14.
Eine Lösung von Phenyl-10-Methylacridan-9-carboxylat (250 mg, 0.79 mmol) in THF wurde mit LDA bei –78°C deprotoniert. (EtO)₂POCl (205 mg, 1.2 mmol) und Pyridin (94 mg, 1.2 mmol) wurden gleichzeitig über Spritzen zugegeben und weitere 15 min gerührt. Das Trockeneisbad wurde entfernt und weitere 2 h gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden entfernt und das Produkt in zwei Schritten chromatographisch aus dem Rückstand isoliert. Eine Reinigung durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 30% Ethylacetat/Hexan erlaubte die Abtrennung des Produktes, das eine fluoreszierende Verunreinigung enthielt. Endgültige Reinigung gelang durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von 10% Ethylacetat/CH₂Cl₂;¹H-NMR (Aceton-d₆) δ = 1.08 (t, 6H), 3.46 (s, 3H), 3.76–3.97 (m, 4H), 6.79–7.91 (m, 13H).
3. Synthese des Acridan-Derivats 15.
Eine Lösung von Phenyl-10-Methylacridan-9-thiocarboxylat (1.0 g, 3 mmol) in THF wurde mit LDA bei –78°C deprotoniert. (EtO)₂POCl (958 mg, 5 mmol) und Pyridin (2.5 mL, 3 mmol) wurden gleichzeitig über Spritzen zugegeben und weitere 15 min gerührt. Das Trockeneisbad wurde entfernt und weitere 2 h gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden entfernt und das Produkt in zwei Schritten chromatographisch aus dem Rückstand isoliert. Eine Reinigung durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 30-100% Ethylacetat/Hexan erlaubte die Abtrennung des Produktes, das blau und grün fluoreszierende Verunreinigungen enthielt. Endgültige Reinigung gelang durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von 12% Ethylacetat/CH₂Cl₂; ¹H-NMR (Aceton-d₆) δ = 1.01 (t, 6H), 3.49 (s, 3H), 3.74–3.96 (m, 4H), 6.91–7.45 (m, 11H), 7.78 (d, 1H), 7.99 (d, 1H).
4. Synthese des Acridan-Derivats 16.
Eine Lösung von Phenyl-10-Methylacridan-9-carboxylat (311 mg, 1 mmol) in THF wurde bei –78°C zu einer Lösung von LDA getropft. Nach 30 min bei –78°C wurde Acetanhydrid (161.3 mg, 1.6 mmol) über eine Spritze zugegeben und das Trockeneisbad wurde entfernt. Nach 1 h wurden die flüchtigen Bestandteile entfernt und das Produkt chromatographisch aus dem Rückstand isoliert. Eine Reinigung durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 5% Ethylacetat/Hexan ergab 90 mg einer sauberen Fraktion als weißer Feststoff und eine zweite Fraktion (250 mg), die etwas Ausgangsmaterial enthielt; ¹H-NMR (CDCl₃) δ = 2.04 (s, 3H), 3.44 (s, 3H), 6.82–7.65 (m, 13H).
5. Synthese des Acridan-Derivats 17.
Eine Lösung von Phenyl-10-Methylacridan-9-thiocarboxylat (1.05 g) in THF wurde mit LDA bei –78°C deprotoniert. Acetanhydrid (0.45 mL) in 10 ml THF wurden zugetropft, das Trockeneisbad wurde entfernt und über Nacht gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden entfernt und das Produkt aus dem Rückstand chromatographisch isoliert. Eine Reinigung durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 5-20% Ethylacetat/Hexan ergab 1.15 g der Verbindung 40 als einen fast farblosen Feststoff; ¹H-NMR (CDCl₃) δ = 1.89 (s, 3H), 3.48 (s, 3H), 6.95–7.06 (m, 4H), 7.20–7.34 (m, 5H), 7.40–7.44 (m, 2H), 7.62 (d, 1H), 7.79 (d, 1H).
6. Synthese des Acridan-Derivats 18.
Eine Lösung von Phenyl-10-Methylacridan-9-carboxylat (333.4 g, 1.06 mmol) in THF wurde bei –78°C innerhalb von 30 min mit LDA deprotoniert. Die tief orange Lösung wurde mit t-Butyldimethylsilylchlorid (253.4 mg, 1.68 mmol) in 10 mL trockenem THF versetzt. Das Trockeneisbad wurde entfernt und weitere 2 h gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden entfernt und das Produkt als Öl (212 mg) unter Verwendung von 5% Ethylacetat/Hexan chromatographisch aus dem Rückstand isoliert; ¹H-NMR (CDCl₃) δ = –0.12 (s, 6H), 0.77 (s, 9H), 3.37 (s, 3H), 6.75–7.38 (m, 12H), 7.79 (dd, 1H).
7. Synthese des Acridan-Derivats 19.
Eine Lösung von Phenyl-10-Methylacridan-9-thiocarboxylat (322.3 mg, 0.97 mmol) in THF wurde bei –78°C mit LDA deprotoniert. t-Butyldimethylsilylchlorid (270 mg, 1.8 mmol) in 5 mL trockenem THF wurde rasch zugegeben, das Trockeneisbad wurde entfernt und weitere 90 min gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden entfernt und 330 mg des Produktes wurden als Öl, welches beim Stehenlassen fest wurde, unter Verwendung von 5% Ethylacetat/Hexan chromatographisch aus dem Rückstand isoliert; ¹H-NMR (CDCl₃) δ = –0.09 (s, 6H), 0.73 (s, 9H), 3.43 (s, 3H), 6.84–7.01 (m, 4H), 7.16–7.47 (m, 7H), 7.73–7.76 (m, 1H), 7.90–7.93 (m, 1H).
8. Synthese des Acridan-Derivats 20.
Phenyl-10-Methylacridan-9-thiocarboxylat (1.0 g) in 60 mL trockenem THF wurde bei –70°C mit LDA in das Enolat überführt. Nachdem die Temperatur 1 h bei –70°C gehalten wurde, wurden 0.76 g Methyltriflat zugegeben und das Reaktionsgemisch durfte sich auf Raumtemperatur erwärmen. Das Gemisch wurde 4 Tage stehengelassen. CH₂Cl₂ (150 mL) wurde zugegeben, die Lösung wurde mit Wasser extrahiert und über Na₂SO₄ getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie mit 70/30 Hexan/CH₂Cl₂ als Eluens gereinigt; ¹H-NMR (CDCl₃) δ = 3.53 (s, 3H), 3.56 (s, 3H), 6.93–7.45 (m, 11H), 7.71 (d, 1H), 7.93 (d, 1H).
9. Synthese des Acridan-Derivats 21.
10-Methyl-N-(Phenyl)-N-(p-Toluolsulfonamid)-Acridan-9-carboxamid wurde wie in U.S. 5,491,072 beschrieben dargestellt. Das Sulfonamid wird mit LDA in trockenem THF in das Enolat überführt und unter Verwendung von Methyltriflat methyliert, um Verbindung 21 zu erhalten.
10. Synthese des Acridan-Derivats 22.

a) Acridin-9-carbonsäurechlorid (4.0 g) wurde in einer Lösung von Pyridin (2.94 mL) und CH₂Cl₂ (25 mL) über Nacht bei Raumtemperatur mit 4-Hydroxythiophenol (2.8 g) verestert. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde mit dem Niederschlag aus der Reaktion vereinigt und mit Wasser und CH₂Cl₂ gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen; man erhielt 3.8 g (70%) des Thioesters.
b) Der Thioester (2.0 g) wurde mit Zink (3.9 g) und Essigsäure in CH₂Cl₂ innerhalb von 3 h bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre reduziert. Das unlösliche Produkt wurde abfiltriert, mit CH₂Cl₂ gewaschen, in Aceton aufgenommen, um von den anorganischen Bestandteilen zu trennen, und eingeengt; man erhielt 1.7 g (85%) des Acridan-Thioesters.
c) Der Acridan-Thioester wurde am Stickstoff-Atom über Nacht bei Raumtemperatur mit Methyltriflat (3.3 g) in CH₂Cl₂ methyliert. Einengen bis zur Trockene, Verteilung zwischen CH₂Cl₂ und Wasser, und Trocknen ergab ein Rohprodukt, das durch Säulenchromatographie mit 30% Ethylacetat/Hexan gereinigt wurde; man erhielt 1.55 g (88%) des N-methylierten Thioesters.
d) Die Phenol-Gruppe wurde als TMS-Ether geschützt, indem 2 g des Thioesters mit 1.25 g Trimethylsilylchlorid in 20 mL THF, das 0.91 g Pyridin enthielt, über Nacht bei Raumtemperatur umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat bis zur Trockene eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie mit 25% Ethylacetat/Hexan gereinigt.
e) Der Thioester wurde in das Enol-bis-(Cyanoethyl)-Phosphat überführt, dabei wurde gleichzeitig die Silylschutzgruppe entfernt. Das Thioester-Enolat, das durch Reaktion von 2 g des Thioester bei –78°C in THF mit LDA generiert wurde, wurde anschließend mit POCl₃ (0.87 g) und Pyridin (0.45 g) in THF zur Reaktion gebracht. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde 3-Hydroxypropionitril (1.56 g) als Lösung in Pyridin zugegeben und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, eingeengt und zur Reinigung einer Säule mit Ethylacetat unterworfen; man erhielt ein leicht verunreinigtes Produkt. Das Produkt wurde anschließend mit Wasser gewaschen, um überschüssiges 3-Hydroxypropionitril zu entfernen, getrocknet und eingeengt; man erhielt 0.92 g Produkt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ = 2.55 (m, 4H), 3.50 (s, 3H), 3.94 (m, 2H), 4.06 (m, 2H), 5.94 (s, 1H), 6.85 (d, 2H), 7.06 (m, 4H), 7.33 (m, 4H), 7.87 (dd, 2H).

11. Synthese des Acridan-Derivats 23.

a) 6-Aminohexanol (0.5 g) wurde mit 0.556 g Trimethylsilylchlorid und 0.72 mL Triethylamin in 20 mL THF über Nacht silyliert. Das Gemisch wurde filtriert und der Rückstand bis zur Trockene eingeengt. Der Silylether wurde durch Reaktion mit Phenyl-Chlorformiat (0.735 g) und 1 mL Pyridin in CH₂Cl₂ in das Phenyl-Carbamat überführt. Die Lösung wurde durch Zugabe zu CH₂Cl₂ verdünnt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Silylether-Gruppe wurde mit verdünnter HCl in THF abgespalten. Das Produkt A wurde durch Säulenchromatographie isoliert.
b) Verbindung 22 wurde mit POCl₃ und Pyridin umgesetzt, um das Phenol zu phosphorylieren. Die Reaktion mit Verbindung A (unten) über 3.5 h bei Raumtemperatur in CH₂Cl₂, das Verteilen des Reaktionsgemisches zwischen CH₂Cl₂ und Wasser, das Trocknen und die Chromatographie mit 20–50% Methanol/CH₂Cl₂ ergab Verbindung 23. ¹H-NMR (CDCl₃) δ = 1.17–1.48 (m, 8H), 2.40–2.44 (m, 4H), 3.01–3.04 (m, 2H), 3.45 (s, 3H), 3.82–3.96 (m, 6H), 5.60 (bt, 1H), 6.89–7.29 (m, 15H), 7.76–7.84 (m, 2H).

12. Synthese des Acridan-Derivats 24

a) Verbindung 23 (90 mg) wurde in wässriger NaOH/Aceton durch eintägiges Rühren der Lösung bei Raumtemperatur hydrolysiert, um die Carbamat- und Cyanoethyl-Gruppen zu entfernen. Die Lösung wurde eingeengt und der gummiartige Feststoff wurde mit Methanol verrieben, um das Produkt zu kristallisieren; man erhielt 64 mg. ¹H-NMR (D₂O) δ = 1.01–1.46 (m, 8H), 2.46–2.90 (2t, 2H), 3.33 (s, 3H), 3.77–3.83 (m, 2H), 6.89–7.3 (m, 10H), 7.80–7.83 (d, 1H), 8.14–8.17 (d, 1H).

13. Synthese des Acridan-Derivats 25.

a) Verbindung 24 (15 mg) wurde in 800 μL D₂O gelöst und in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu einer Lösung von 6-Maleimidohexansäure-NHS-Ester (8.4 mg) in 75 μL p-Dioxan-d₈ gegeben. Das Röhrchen wurde zum Mischen kurz gevortext. Die Lösung wurde mit Methanol verdünnt und bis zur Trockene eingeengt. Der orange Feststoff wurde aus Methanol/Aceton kristallisiert, mit Aceton gewaschen und getrocknet; man erhielt 17 mg eines schwach orange-farbenen Feststoffs. ¹H-NMR (CD₃OD) δ = 1.25–1.58 (m, 14H), 2.11 (t, 2H), 3.09 (t, 2H), 3.33 (s, 3H), 3.45 (t, 2H), 3.83–3.85 (m, 2H), 6.76–7.16 (m, 12H), 7.87–7.89 (d, 1H), 8.44–8.46 (d, 1H).

14. Synthese des Acridan-Derivats 26.

a) Eine Lösung von 6-Maleimidohexansäure-NHS-Ester (22.7 mg) in THF wurde mit 6-Aminohexanol zur Reaktion gebracht. Nach 30 min wurde die Lösung zentrifugiert und die Flüssigkeit abdekantiert. Der Feststoff wurde mit THF gewaschen, die überstehenden Flüssigkeiten wurden vereinigt. Das THF wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand zwischen CH₂Cl₂ und Wasser verteilt. Nach Trocknung und Einengen der organischen Phase erhielt man Verbindung B.
b) Verbindung 22 (57 mg) wurde in einer Lösung aus POCl₃ (18 mg), Pyridin (168 mg) und 1.5 mL CH₂Cl₂ bei 0°C phosphoryliert. Nach etwa 90 min wurde eine Lösung von B (40 mg) in 2.5 mL CH₂Cl₂ bei 0°C zugegeben und das Gemisch wurde 4.5 h gerührt. Das Gemisch wurde mit CH₂Cl₂ verdünnt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und konzentriert. Verbindung 26 wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie aus dem Rohprodukt isoliert. ¹H-NMR (CDCl₃) δ = 1.18–1.53 (m, 14H), 2.03 (t, 2H), 2.28 (bs, 1H), 2.51 (m, 4H), 3.04–3.05 (m, 2H), 3.42 (t, 2H), 3.48 (s, 3H), 3.89–3.97 (m, 6H), 6.28 (bs, 1H), 6.62 (s, 2H), 6.89–7.34 (m, 10H), 7.75–7.78 (d, 1H), 7.81–7.84 (d, 1H).

15. Synthese des Acridan-Derivats 27.

a) Verbindung 22 (0.2 g) wurde unter einer Argon-Atmosphäre mit 93 mg AgO und 0.2 g NHS-Iodacetat in Acetonitril 1 h bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Das Gemisch wurde filtriert, der Feststoff wurde mit Aceton gewaschen und die vereinigten organischen Lösungen eingeengt. Das gekoppelte Produkt wurde durch Chromatographie unter Verwendung von 50–75% Ethylacetat/Hexan aus dem Rohprodukt gereinigt; man erhielt 64 mg der Verbindung 27. ¹H-NMR (CDCl₃) δ = 2.48–2.55 (m, 4H), 2.77 (s, 4H), 3.53 (s, 3H), 3.88–4.00 (m, 4H), 4.97 (s, 2H), 6.99–7.94 (m, 12H).

16. Synthese des Acridan-Derivats 28.

a) Eine Lösung von 3-Mercaptopropionsäure (118 mg), N-Hydroxysuccinimid (192 mg) und DCC (252 mg) in DMF wurde unter Argon gerührt. Nach 45 min wurde der ausgefallene Niederschlag abfiltriert und mit THF gewaschen. Der Feststoff wurde in Aceton suspendiert und die Aceton-Lösung zur chromatographischen Reinigung unter Verwendung von 40% Etylacetat/Hexan auf eine präparative Dünnschichtchromatographie-Platte aufgetragen. Das gekoppelte Produkt C wurde als Öl (90 mg) isoliert.
b) Verbindung 25 (2.5 mg) wurde in 1 mL eines 1:1 Gemisches Methanol/Phosphatpuffer (pH 6) gelöst und bis zur Trockene eingeengt, um die Di-natriumphosphat-Gruppe in die Form der einbasischen Säure zu überführen. Diese Verbindung und Verbindung C wurden gemeinsam in DMF-d₆ gelöst und 10 min stehengelassen. Das DMF wurde im Vakuum entfernt.

17. Synthese des Acridan-Derivats 29.

a) Die silyl-geschützte Thioester-Zwischenstufe (unten) des Beispiels 13 (dargestellt aus 5 g der nicht-silylierten Vorstufe) wurde im wesentlichen unter der Verwendung der oben beschriebenen Verfahren mit LDA deprotoniert und mit POCl₃ phosphoryliert. Ethanol (4.75 mL) wurde zu der Dichlorphosphat-Zwischenstufe gegeben und es wurde über Nacht gerührt. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Filtrat bis zur Trockene eingeengt, wobei ein Öl zurückblieb. Das Öl wurde einer Chromatographie unter Verwendung von 30–50% Ethylacetat/Hexan unterworfen; man erhielt 2.37 g der Enol-Diethylphosphat-Zwischenstufe als leicht gelben Feststoff.
b) Die Enol-Diethylphosphat-Zwischenstufe (288 mg) wurde an der Phenolgruppe mit POCl₃/Pyridin in CH₂Cl₂ durch etwa dreistündiges Rühren phosphoryliert. Verbindung A (141 mg) in CH₂Cl₂ wurde zugegeben und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie getrennt; man erhielt die Carbamat-geschützte Zwischenstufe (82 mg).
c) Die Carbamat-geschützte Zwischenstufe (82 mg) wurde in wässriger NaOH/Aceton durch sechsstündiges Rühren einer Lösung bei Raumtemperatur unter Argon hydrolysiert, um die Carbamat-Gruppe zu entfernen. Die Lösung wurde durch Zugabe zu Methanol/Aceton verdünnt, um das Produkt zu kristallisieren; man erhielt eine erste Fraktion von 21 mg des Produkts 23. Das Filtrat wurde eingeengt und der Rückstand chromatographiert (25–50% Methanol/CH₂Cl₂), um weitere 40 mg Produkt zu erhalten. ¹H-NMR (CDCl₃) δ = 1.12 (s, 6H), 1.34–1.72 (m, 8H), 2.82 (bt, 2H), 3.46 (s, 3H), 3.74–3.97 (m, 6H), 6.89–7.34 (m, 10H), 7.76–7.78 (d, 2H), 8.25 (5s, 1H).

18. Synthese des Acridan-Derivats 30.

a) Phenyl-10-Methylacridan-9-thiocarboxylat (0.5 g) wurde bei –78°C mit LDA in THF deprotoniert und mit POCl₃/Pyridin bei –78°C bis Raumtemperatur zur Reaktion gebracht, um das Enol-Dichlorphosphat zu bilden. Eine Lösung von A in THF wurde zugegeben und über Nacht gerührt. Die Lösung wurde eingeengt und der Rückstand zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt. Trocknung und Entfernen des Ethylacetats unter Vakuum ergab einen orange-farbenen Feststoff, der mit Hexan gewaschen wurde, um überschüssiges Pyridin zu entfernen. Der Feststoff wurde gelöst und unter Verwendung von 5–50% Methanol/CH₂Cl₂ einer Säulenchromatographie unterworfen; mehrere Fraktionen, die das gewünschte Produkt mit Verun reinigungen enthielten, wurden vereinigt und eingeengt. Dieses Material wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie mit 15% Methanol/CH₂Cl₂ weiter gereinigt, um das Carbamat-geschützte reine Produkt zu erhalten.
c) Das Carbamat-geschützte Produkt (17 mg) wurde in wässriger NaOH/Aceton durch Rühren einer Lösung über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon hydrolysiert, um die Carbamat-Gruppe zu entfernen. Die Lösung wurde eingeengt und der Rückstand chromatographiert (25–50% Methanol/CH₂Cl₂); man erhielt 8 mg der Verbindung 30. ¹H-NMR (CDCl₃) δ = 1.07–1.33 (m, 8H), 2.39 (t, 2H), 3.34 (s, 3H), 3.40–3.42 (m, 2H), 6.85–7.37 (m, 11H), 7.68–7.70 (d, 1H), 8.12–8.14 (d, 1H).

19. Synthese des Acridan-Derivats 31.

a) p-Hydroxyphenyl-10-Methylacridan-9-carboxylat (Darstellung beschrieben in U.S. 5,491,072) (1.1 g) wurde mit 0.46 mL Chlortrimethylsilan und 1.02 mL Triethylamin in THF durch Rühren über Nacht silyliert. Das Gemisch wurde filtriert und die Lösung bis zur Trockene eingeengt.
b) Die Silylether-Verbindung aus Schritt a) wurde in THF bei –78°C mit LDA in das Enolat überführt. Nach 30 min wurde eine Lösung von Acetanhydrid (0.5 mL) in THF zugetropft. Die Reaktion wurde 30 min bei –78°C gehalten und auf Raumtemperatur erwärmt. Die flüchtigen Bestandteile wurden entfernt und der Rückstand unter Verwendung von 5–10% Ethylacetat/Hexan chromatographiert. Man erhielt eine Fraktion, die das gewünschte Enol-Acetat sowie den ursprünglichen p-Hydroxyphenyl-Ester enthielt.
c) Das Produktgemisch aus Schritt b) (100 mg) wurde mit Trifluorethansulfonylchlorid (72 mg) und Pyridin (62 mg) in CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur 1 h zur Reaktion gebracht. Das Gemisch wurde bis zur Trockene eingeengt und unter Verwendung von 10–50% CH₂Cl₂/Hexan chromatographiert. Verbindung 31 (70 mg) wurde isoliert. ¹H-NMR (CDCl₃) δ = 2.09 (s, 3H), 3.45 (s, 3H), 3.95–4.03 (q, 2H), 6.85–7.58 (m, 12H).

20. Synthese des Acridan-Derivats 32.

a) 3-(p-Hydroxyphenyl)propionsäure wurde unter Verwendung der Methode von Tagawa (H. Tagawa, K. Ueno, Chem. Pharm. Bull., 26 (5) 1384-93, (1978)) zu 3-(p-Mercaptophenyl)propionsäure umgesetzt. Kurz gesagt wurde die Ausgangs-Säure mit Ethanol verestert, die Phenol-Gruppe in das Diethylxanthat überführt, zu dem isomeren Xanthat umgelagert und verseift, um die Mercahtosubstituierte Säure zu erhalten.
b) Der Methylester dieser Säure wurde mittels seiner -SH-Gruppe mit Acridin-9-Carbonsäurechlorid kondensiert. Der Acridin-Ring wurde mit Zink/CH₃COOH zu der entsprechenden Acridan-Verbindung reduziert, die am Stickstoff-Atom mit Methyltriflat methyliert wurde.
c) Der Thioester wurde in das Enol-bis-(Cyanoethyl)-Phosphat überführt. Das Thioester-Enolat, hergestellt durch Reaktion von 1 g des Thioesters mit LDA bei –78°C in THF, wurde anschließend mit POCl₃ (0.64 g) und Pyridin (1.9 g) in THF zur Reaktion gebracht. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde 3-Hydroxypropionitril (1.14 mL) in 1 mL Pyridin zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, eingeengt und zur Reinigung mit Ethylacetat auf eine Säule aufgetragen; man erhielt das Bis-(Cyanoethyl)-Phosphat.
d) Verseifung des Phosphats und Carboxyl-Esters erfolgte durch Reaktion in Aceton/wässriger NaOH bei Raumtemperatur; man erhielt Verbindung 32 (100 mg). ¹H-NMR (D₂O) δ = 2.33 (t, 2H), 2.70 (t, 2H), 3.34 (s, 3H), 6.89–7.34 (m, 10H), 7.70–7.80 (d, 1H), 8.18–8.19 (d, 1H).

Zahlreiche weitere Acridanphosphat-Markierungsverbindungen können ausgehend von denen, die in der PCT-Anmeldung WO 97/26245 und der US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/928,793 des Anmelders beschrieben werden, hergestellt werden, indem ein markierender Substituent zur Verfügung gestellt wird.
21. Kinetisches Profil der Chemilumineszenz-Intensität des Acridan-Phosphats 5.
Ein Reagenz, das 3.3 × 10^–4 M Acridan-Phosphat 5 in 0.1 M Tris-Puffer bei pH 8.8 (10 μL) enthielt, wurde mit 50 μL 3.6% Harnstoffperoxid in 0.4 M HNO₃ gemischt und 2 min inkubiert. Die Chemilumineszenz wurde durch Injektion von 100 μL einer 0.25 M NaOH-Lösung ausgelöst. Die Lichtproduktion erfolgte unmittelbar anschließend an das Mischen und wurde über 5 Sekunden integriert. Der Zeitverlauf der Emission der Chemilumineszenz ist in 1 dargestellt.
22. Verwendung verschiedener Säuren.
Die Möglichkeit, verschiedene saure Verbindungen bei dem Verfahren zur Generierung von Chemilumineszenz aus Acridanen einzusetzen, ist in den Tabellen 1 und 2 illustriert. Das Acridan-Phosphat 5 (8 nM oder 2 μM) in 0.1 M Tris-Puffer bei pH 8.8 (10 μL) wurde mit 50 μL 3.6% Harnstoffperoxid in 0.4 M Lösungen verschiedener Säuren gemischt und 2 min inkubiert. Die Chemilumineszenz wurde durch Injektion von 10 μL einer 0.25 M NaOH-Lösung ausgelöst. Wie unten zusammengefasst, war jede Säure bei dem vorliegenden Verfahren geeignet, rasch Licht zu generieren. Die Lichtintensitäts-Werte sind in willkürlichen Einheiten angegeben. Die Gesamtintensität wurde über einen Zeitraum von 10 s gemessen.
Tabelle 1. Anregung einer 8 nM Lösung des Acridan-Phosphats 5
Tabelle 2. Anregung einer 2 μM Lösung des Acridan-Phosphats 5
23. Anregung durch Peroxid/Basen-Lösung.
Chemilumineszenz wurde auch von einer Verbindung der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer anregenden Reaktion generiert, wobei das Peroxid in der Basen-Lösung vorliegt. Eine 2 μM Lösung des Acridan-Phosphats 5 in 0.1 M Tris-Puffer bei pH 8.8 (10 μL) wurde mit 50 μL einer 0.4 M Säure gemischt und 2 min inkubiert. Die Chemilumineszenz wurde durch Zugabe von 100 μL 3.6% Harnstoffperoxid in 0.25 M NaOH-Lösung ausgelöst. Wie unten zusammengefasst, war jede Säure bei dem vorliegenden Verfahren geeignet. Die Gesamtintensität wurde über 10 s gemessen. Tabelle 3.
24. Einfluss der Inkubationszeit der Säure.
Lösungen des Acridan-Phosphats 5 (1 μM in 0.4 M HCl) wurden wie in Beispiel 22 beschrieben behandelt, wobei die Dauer des Inkubationsschrittes der Säure/des Peroxids variiert wurde.
Tabelle 4.
25. Detektions-Empfindlichkeit auf das Acridan-Derivat 5.
Lösungen des Acridan-Phosphats 5 (10 μL), die zwischen 10–11 und 10–1^–17 Mol enthielten, wurden jeweils zu 50 μL 3.6% Harnstoffperoxid in 0.4 M HCl gegeben und 2 min bei 25°C inkubiert. Die Chemilumineszenz wurde durch Zugabe von 100 μL einer 0.25 M NaOH-Lösung zu jeder dieser Lösungen ausgelöst. Peakintensität und Gesamt-Lichtintensität wurden durch einzelne Bestimmungen gemessen. Die Hintergrund-Lichtlevels waren unter diesen Bedingungen 0.038 (Peakintensität) und 0.019 (Gesamtintensität). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und 2 dargestellt.
Tabelle 5.
26. Detektion verschiedener beispielhafter Verbindungen.
Von jeder der Verbindungen in Tabelle 6 wurde eine 0.5 μM Stammlösung hergestellt. Zehn μL-Aliquote wurden einzeln zu 50 μL 3.6% Harnstoffperoxid in 0.4 M HCl gegeben und 2 min bei 25°C inkubiert. Die Chemilumineszenz wurde durch Zugabe von 100 μL einer 0.25 M NaOH-Lösung ausgelöst. Die Chemilumineszenz wurde über 10 s gemessen. Signifikante Mengen wurden mit jeder der Verbindungen produziert. Verbindungen 2–4, 6–13, 18–19 und 21–32 produzierten ebenfalls Chemilumineszenz, wenn sie unter den Bedingungen dieses Beispiels sowie der Beispiele 22 und 23 angeregt wurden.
Tabelle 6.
27. Konjugation der Markierungsverbindung zu einem Protein.
Bovin-Serum-Albumin (BSA) (Fluka) wurde unter Verwendung des Reduce-Imm^TM-Kits (Pierce, Rockford, IL) reduziert, um freie Thiol-Gruppen entsprechend den Anweisungen des Herstellers freizusetzen.
Eine Fraktion, die 270 μg BSA in 200 μL Gleichgewichtspuffer #2 des Reduce-Imm-Kits enthielt, wurde mit 50 mL einer Lösung der Verbindung 25 in Methanol über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde über eine Sephadex G-25 Säule mit 0.01 M Phosphat bei pH 7.5 gegeben. Die Fraktionen wurden spektral-photometrisch bei 280 nm und mittels eines Chemilumineszenz-Assays unter Verwendung von Harnstoffperoxid und HNO₃ gefolgt von NaOH wie oben beschrieben untersucht. Die Fraktionen, die sowohl den Marker als auch das Protein enthielten, wurden vereinigt. Das Produkt wird als BSA-APN_a2 bezeichnet.
28. Konjugation von BSA zum Acridan-Derivat 26.
Die Markierung von reduziertem BSA mit Verbindung 26 wurde durch das Verfahren des vorstehenden Beispiels unter Verwendung von DMF anstelle des Methanols durchgeführt. BSA wurde hierdurch mit einer Bis(Cyanoethyl)-Phosphat-Acridan-Verbindung markiert. Das Produkt wird als BSA-APCN₂ bezeichnet.
29. Detektion von chemilumineszent markiertem BSA.
Proben von BSA-APN_a2 und BSA-APCN₂ wurden entsprechend des in (Warburg und Christian, B.Z., 310, 384 (1941)) beschriebenen Verfahrens auf den Gehalt an Protein getestet. Stammlösungen wurden in Laemmli-Puffer (U. K. Laemmli, Nature (London), 227, 680 (1970)) verdünnt und auf 7% Acrylamid-Bisacrylamid-Gele aufgetragen. Die Proteine liefen bei Raumtemperatur für 1–1.5 h bei 120–130 V auf einem SDS-PAGE. Die Gele wurden entfernt und in einen Plastikrahmen, der aus den Seitenkanten einer Petrischale und einer transparenten Overhead-Folie gebaut war, gelegt.
Die markierten Proteine in dem Gel wurden durch ein einfaches Chemilumineszenz-Assay detektiert. Der Gel-Halter wurde unter Dunkelkammer-Licht auf eine Platte eines Röntgenfilms platziert. Eine Lösung von Harnstoffperoxid (3.6%) in 0.4 M HNO₃ wurde über das Gel in den Halter gegossen und 20 min stehen gelassen. Die Lösung wurde aus dem Halter abgesaugt und 15 mL einer 0.25 M NaOH wurden zugegeben, um die Lichtemission auszulösen. Das Gel wurde 15 min dem Röntgenfilm ausgesetzt. Die 3A und 3B verdeutlichen die Detektion der markierten Proteine BSA-APN_a2 beziehungsweise BSA-APCN₂ direkt in dem Gel. Die Lichtemission wuchs über einen Zeitraum von einigen Sekunden an, ereichte ein Maximum und sank über einige Sekunden ab.
30. Detektions-Empfindlichkeit auf die markierten Proteine.
Lösungen der markierten Proteine BSA-APN_a2 und BSA-APCN₂ in 0.1 M Tris-Puffer bei pH 8.8, die zwischen 10^–11 und 10^–17 Mol des markierten Proteins enthielten, wurden vorbereitet. Zehn μL-Aliquote wurden jeweils zu 50 μL 3.6% Harnstoffperoxid in 0.4 M HCl gegeben und 2 min bei 25°C inkubiert. Die Chemilumineszenz wurde durch Zugabe von 100 μL einer 0.25 M NaOH-Lösung zu jeder dieser Lösungen ausgelöst. Die Gesamt-Lichtintensitäts-Werte wurden durch einzelne Bestimmungen gemessen. Die Hintergrund-Lichtlevels waren unter diesen Bedingungen 0.017 sowohl für BSA-APCN₂ als auch für BSA-APN_a2.
Tabelle 7.
Die vorstehende Beschreibung und die Beispiele sind lediglich zur Anschauung und nicht einschränkend anzusehen. Der Umfang der Erfindung wird lediglich durch die anhängenden Ansprüche beschränkt.

Claims

Eine chemilumineszente Verbindung der Formel I:
wobei Z¹ und Z² unabhängig voneinander aus O, S und NR¹² gewählt werden, R¹² aus Alkyl-, Aryl-, Alkylsulfonyl- und Arylsulfonyl-Gruppen gewählt wird; R¹ eine Gruppe ist, die 1 bis ungefähre 50 Nicht-Wasserstoff-Atome gewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogen-Atomen enthält, und die mit einer Säure abspaltbar ist, und die gewählt wird aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, substituierten oder unsubstituierten Alkyl- oder Aryl-Carbonyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, tri-(C₁-C₈-Alkyl)-Silyl-Gruppen, einer SO₃-Gruppe, Glykosyl-Gruppen und Phosphoryl-Gruppen der Formel PO(OR')(OR''), wobei R' und R'' unabhängig voneinander gewählt werden aus Wasserstoff, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, Trialkylsilyl- Gruppen, Alkalimetall-Kationen, Erdalkalimetall-Kationen, Ammonium- und Phosphonium-Kationen; R² und R³ organische Gruppen sind, die 1 bis 50 Nicht-Wasserstoff-Atome gewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogen-Atomen enthalten, wobei R² gewählt wird aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, substituierten oder unsubstituierten Alkyl- oder Aryl-Carbonyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, tri-(C₁-C₈-Alkyl)-Silyl-Gruppen, einer SO₃-Gruppe, Glykosyl-Gruppen und Phosphoryl-Gruppen der Formel PO(OR')(OR''), wobei R' und R'' unabhängig voneinander gewählt werden aus Wasserstoff, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aryl-Gruppen, substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen aus 1–20 Kohlenstoff-Atomen, Trialkylsilyl-Gruppen, Alkalimetall-Kationen, Erdalkalimetall-Kationen, Ammonium- und Phosphonium-Kationen, und R³ gewählt wird aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen, Aryl-Gruppen, substituierten Aryl-Gruppen, Aralkyl-Gruppen, Alkoxyalkyl-Gruppen, Carboxyalkyl-Gruppen und Alkyl-Sulfonsäure-Gruppen; und R⁴–R¹¹ unabhängig voneinander gewählt werden aus Wasserstoff und Substituenten, die nicht die Generierung von Chemilumineszenz stören und 1–50 Atome gewählt aus C-, N-, O-, S-, P-, Si- und Halogen-Atomen enthalten, und die aus Substituenten-Gruppen bestehen, die gewählt werden aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen, Aryl-Gruppen, substituierten Aryl-Gruppen, Aralkyl-Gruppen, Alkenyl-Gruppen, Alkinyl-Gruppen, Alkoxy-Gruppen, Aryloxy-Gruppen, Halogenen, Amino-Gruppen, substituierten Amino-Gruppen, Carboxyl-Gruppen, Carboalkoxy-Gruppen, Carbamid-Gruppen, Cyano-Gruppen und Sulfonat-Gruppen; wobei einer der R¹ bis R¹¹ substituiert ist mit dem markierenden Substituenten der Formel -L-RG, in dem L eine verknüpfende Gruppe ist, die gewählt wird aus einer Bindung, einem Atom oder einer unverzweigten oder verzweigten Kette von Atomen, von denen einige Bestandteil eines Ringsystems sein können, in dem die Atome der Kette gewählt werden aus C-, O-, N-, S-, P-, Si-, B- und Se-Atomen, und funktionelle Gruppen, die den verknüpfenden Substituenten enthalten und Alkylen-Gruppen, Arylen-Gruppen, Alkenylen-Gruppen, Ether-Gruppen, Peroxid-Gruppen, Carbonyl-Gruppen wie Ketone, Ester, Carbonat-Ester, Thioester oder Amide, Amin-Gruppen, Amidin-Gruppen, Carbamat-Gruppen, Harnstoff-Gruppen, Imin-Gruppen, Imid-Gruppen, Imidat-Gruppen, Carbodiimid-Gruppen, Hydrazin-Gruppen, Diazo-Gruppen, Phosphordiester-Gruppen, Phosphortriester-Gruppen, Phosphonat-Ester-Gruppen, Thioether-Gruppen, Disulfid-Gruppen, Sulfoxid-Gruppen, Sulfon-Gruppen, Sulfonatester-Gruppen, Sulfatester-Gruppen und Thioharnstoff-Gruppen beinhalten, und RG eine reaktive Gruppe ist, die gewählt wird aus a) Amin-reaktiven Gruppen:
b) Thiol-reaktiven Gruppen:
c) Carbonsäure-reaktiven Gruppen: -NH₂ -OH -NHNH₂ und d) Hydroxyl-reaktiven Gruppen:
Verbindung nach Anspruch 1, in der die Verbindung die Formel V hat:
in der R² eine organische Gruppe ist, die 1 bis 50 Nicht-Wasserstoff-Atomen enthält.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Gruppen Z¹ und R¹ verbunden sind, um eine Phosphat-Gruppe OPO(OR')(OR'') zu bilden, R' und R'' unabhängig voneinander gewählt werden aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen und Alkalimetall-Ionen, und die Verbindung die Formel III hat:
Verbindung nach Anspruch 3, wobei R' und R'' beide jeweils eine 2-Cyanoethyl-Gruppe sind.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei R' und R'' beide jeweils Alkalimetall-Ionen sind.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei Z² O oder S ist, und R² gewählt wird aus Phenyl oder substituierten Phenyl-Gruppen.
Verbindung nach Anspruch 6, wobei jede der Gruppen R⁴–R¹¹ Wasserstoff ist, R³ Methyl ist, Z¹ und R¹ verbunden sind, um eine Phosphat-Gruppe -OPO₃M₂ zu bilden und jedes M ein Alkalimetall-Ion ist, und die Verbindung die Formel hat:
Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Gruppen Z² und R²-L-RG verbunden sind, um eine Phosphat-Gruppe OPO(OR')(O-L-RG) zu bilden, R' unabhängig gewählt wird aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen, Wasserstoff und Alkalimetall-Ionen, und die Verbindung die Formel X hat:
Verbindung nach Anspruch 8, wobei Z¹S ist und R¹ Phenyl ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei die reaktive Gruppe RG gewählt wird aus OH, NH₂, COOH, SO₂CH₂CF₃, N-Hydroxy-Succinimid-Ester und Maleinimid-Gruppen.
Eine chemilumineszent markierte Verbindung bestehend aus einem Konjugat aus einer zu detektierenden Verbindung und einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in der die detektierte Verbindung ein Analyt oder ein spezifisches Bindungspaar-Mitglied ist, wobei der Analyt oder das Bindungspaar-Mitglied durch die Gruppe RG der chemilumineszenten Verbindung konjugiert wird.
Chemilumineszent markierte Verbindung nach Anspruch 11, wobei die zu detektierende Verbindung ein Analyt ist und gewählt wird aus Pharmakons, Hormonen, Pestiziden, Metaboliten von Pestiziden, DNA, RNA, Oligonukleotiden, Antikörpern und Antigenen.
Chemilumineszent markierte Verbindung nach Anspruch 11, wobei die zu detektierende Verbindung ein spezifischer Bindungspartner ist und gewählt wird aus Antigenen, Antikörpern, Haptenen, Oligonukleotiden, Polynukleotiden, Avidin, Streptavidin, Hormonen, Rezeptoren, Lektinen, Kohlenhydraten, IgG, Protein A und nukleinsäure-bindenden Proteinen.