CN106749404B - 一种与碱性磷酸酶反应产生化学发光的化合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种与碱性磷酸酶反应产生化学发光的化合物制备方法，包括以下步骤，按顺序依次进行合成：（1）合成吖啶‑9‑酰氯；（2）合成9,10‑二氢化吖啶‑9‑酰氯；（3）合成10‑甲基‑9,10‑二氢化吖啶‑9‑酰氯；（4）合成10‑甲基‑9,10‑二氢化吖啶‑9‑硫代羧酸‑3’‑乙氧苯酯；（5）合成9‑（3’‑乙氧苯基硫代磷酸氧亚甲基）‑10‑甲基‑9,10‑二氢化吖啶二（氰乙基）酯。本发明的制备方法工艺简单，稳定性好，价格便宜。
Description
技术领域
本发明涉及一种与碱性磷酸酶反应产生化学发光的化合物的制备工艺，属于化学发光免疫分析的技术领域。
技术背景
化学发光酶疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入酶的发光底物，化学发光物质经酶催化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。
碱性磷酸酶在化学发光酶疫分析应用比较广泛，目前使用最多的发光底物是1，2－二氧环己烷，主要是AMPPD及其衍生物。此类物质大多为国外专利产品，价格昂贵、不易购买。
碱性磷酸酶能催化二氢吖啶磷酸酯类化合物反应并产生化学发光，此种反应速度快，发光到达平台期时间短，已经用于碱性磷酸酶的活性检测和碱性磷酸酶酶联免疫反应检测。
中国专利CN104761584A、CN104418887A和CN1312252A公开了几种二氢吖啶磷酸酯类化合物的合成方法。但是合成工艺较为复杂，合成物质稳定性较差。
本发明提供了一种的新化合物的制备方法，该化合物制备工艺较简单，稳定性好，价格便宜。
发明内容
本发明公开了一种与碱性磷酸酶反应产生化学发光的化合物的制备方法。其中，该化合物结构式如下：
，该化合物的NMR图如图2所示。
该化合物的制备方法包括以下步骤（如图1所示）：
（1）合成吖啶-9-酰氯：将吖啶-9-羧酸溶于三氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶，缓慢滴加亚硫酰氯，并回流该反应混合物，减压除去溶剂得到黄色固体。
（2）合成9,10-二氢化吖啶-9-酰氯：将吖啶-9-酰氯悬浮于甲醇中，分别先后加入氯化铵和锌到该溶液中，回流反应该反应混合物，过滤该溶液并用甲醇洗涤该沉淀，蒸发干燥得到产物9,10-二氢化吖啶-9-酰氯。
（3）合成10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-酰氯：将9,10-二氢化吖啶-9-酰氯溶于甲苯溶液中，冰浴控温，加入碳酸二甲酯和碳酸铯，搅拌反应，升温至室温，搅拌反应，蒸发干燥除去溶剂，加入乙酸乙酯做萃取剂，减压除去萃取剂得到产物10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-酰氯。
（4）合成10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸-3’-乙氧苯酯：将制备好的10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-酰氯溶于三氯甲烷中，分别加入3-乙氧基苯硫酚和4-二甲氨基吡啶，冰浴控温0～10℃，搅拌反应，然后撤去冰浴，室温再反应，干燥蒸发得到产10-甲 基-9,10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸-3’-乙氧苯酯。
（5）合成9-（3’-乙氧苯基硫代磷酸氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶二（氰乙基）酯：将10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸-3’-乙氧苯酯溶于四氢呋喃溶液中干冰浴维持-80℃条件下，滴加入2mol/L 溶于四氢呋喃的LDA，搅拌反应后，加入三氯氧磷和 4-二甲氨基吡啶，连续搅拌，撤去干冰浴自然升温并再继续搅拌，再用冰浴冷却该溶液并缓慢滴加3-羟基丙腈，加完后撤去冰浴室温搅拌，滤去沉淀并减压除去反应试剂，将残留物溶于乙酸乙酯，用氮气作为保护剂，滴加入2MOL/L氢氧化钾溶液，搅拌反应，抽滤所形成的沉 淀并空气干燥，得到一定量的微黄色固态产物9-（3’-乙氧苯基硫代磷酸氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶二钾盐。
优选的，步骤（1）中吖啶-9-羧酸用量为1g～5g， 4-二甲氨基吡啶用量为0.2g～5g，亚硫酰氯用量为2～5mL，反应时间为6～12小时。
优选的，步骤（2）中吖啶-9-酰氯用量为0.5～2.0g，氯化铵用量为5～10g，锌用量为5～10g，回流反应时间为1～2小时。
优选的，步骤（3）中9,10-二氢化吖啶-9-酰氯用量为1g～5g，冰浴控温0～10℃，碳酸二甲酯用量为0.5～1g，碳酸铯用量为0.1～0.5g，搅拌反应时间为30～60分钟，升温至室温后，搅拌反应时间为1～2小时。
优选的，步骤（4）中10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-酰氯的用量为0.5～5g， 3-乙氧基苯硫酚的用量为1g～5g，4-二甲氨基吡啶的用量为0.5g～2g，冰浴控温0～10℃，搅拌反应30～60分钟，然后撤去冰浴，室温再反应1～2小时。
优选的，步骤（5）中的10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸-3’-乙氧苯酯的用量为0.5～2.0g，搅拌反应时间为1～2小时，三氯氧磷的用量为0.1～1.0g， 4-二甲氨基吡啶的用量为1～2g，连续搅拌时间为1～2小时小时，撤去干冰浴自然升温并再继续搅拌时间为1～2小时， 3-羟基丙腈的用量为1～2mL，加完后撤去冰浴室温搅拌时间为6～12小时，2mol/L氢氧化钾溶液用量为0.5～1.0mL。
本发明提供了一种新的与碱性磷酸酶反应产生化学发光的化合物的制备方法，该化合物制备工艺较简单，稳定性好，价格便宜。
附图说明
图1为本发明化合物的制备过程图。
图2为本发明化合物的NMR图。
具体实施方式
下面结合实例进一步说明本发明，本发明的优点和特点将被描述的更清楚。但是，应该可以理解，本实例仅仅是本发明的一种范例，并不会对本发明的范围做任何限制。
（1）准备主要实验材料:
a.吖啶-9-羧酸（≥97%，Sigma）
b. 4-二甲氨基吡啶（≥99%，Sigma）
c.亚硫酰氯（AR，国药集团）
d.碳酸二甲酯（≥99%，Sigma）
e.碳酸铯（AR，国药集团）
f.3-乙氧基苯硫酚（≥97%，Sigma）
g.3-羟基丙腈（≥99%，Sigma）
（2）合成吖啶-9-酰氯：在150mL三口反应瓶中将吖啶-9-羧酸2.53g溶于10mL三氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶1.25g，缓慢滴加亚硫酰氯5mL并回流该反应混合物6小时，减压除去溶剂得到黄色固体。
（3）9,10-二氢化吖啶-9-酰氯：在250mL三口反应瓶中将吖啶-9-酰氯1.05g悬浮于甲醇（100mL）中，分别先后加入氯化铵6.56g和锌5.33g到该溶液中，回流反应2小时。过滤该溶液并用甲醇洗涤该沉淀，蒸发干燥得到产物9,10-二氢化吖啶-9-酰氯。
（4）合成10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-酰氯：在250mL三口反应瓶中将9,10-二氢化吖啶-9-酰氯2.08g溶于200mL甲苯溶液中，冰浴控温0～10℃，加入碳酸二甲酯0.63g 和碳酸铯0.24g，搅拌反应30分钟。升温至室温，搅拌反应2小时，，蒸发干燥除去溶剂，加入20mL乙酸乙酯做萃取剂，减压除去萃取剂得到产物10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-酰氯。
（5）合成10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸-3’-乙氧苯酯：在150mL三口反应瓶中将制备好的10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-酰氯2.32g溶于三氯甲烷中（20mL），分别加入3-乙氧基苯硫酚2.57g和4-二甲氨基吡啶1.08g，冰浴控温0～10℃，搅拌反应30分钟。 然后撤去冰浴，室温再反应2小时，干燥蒸发得到产物10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸-3’-乙氧苯酯。
（6）合成9-（3’-乙氧苯基硫代磷酸氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶二（氰乙基）酯：在150mL三口反应瓶中将10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸-3’-乙氧苯酯0.95g溶于10mL四氢呋喃溶液中干冰浴维持-80℃条件下，滴加入2mol/L 溶于四氢呋喃的LDA，搅拌反应1小时后，加入三氯氧磷0.53g和4-二甲氨基吡啶1.25g，连续搅拌1小时，撤去干冰浴自然升温并再继续搅拌1小时，再用冰浴冷却该溶液并缓慢滴加3-羟基丙腈2mL，加完后撤去冰浴室温搅拌12小时，滤去沉淀并减压除去反应试剂，将残留物溶于乙酸乙酯，用氮气作为保护剂，滴加入浓度为2mol/L的氢氧化钾溶液1.0mL，搅拌过夜，抽滤所形成的沉淀并空气干燥，得到一定量的微黄色固态产物9-（3’-乙氧苯基硫代磷酸氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶二钾盐。
二氢吖啶磷酸酯类化合物不稳定，水溶液中容易发生水解，从而产生微弱的发光信号。将上述合成的化合物与厂家A生产的二氢吖啶磷酸酯类化合物进行稳定性验证比较。
分别取上述合成的化合物与厂家A生产的化合物，配制100mg/L的甲醇溶液。于4℃放置7天、15天、30天后， 进行空白发光强度的测试。分别取200微升的两种甲醇溶液，加入检测样本管底部，在发光检测仪上检测空白发光强度。重复测定10次，记录测试结果，见表1、表2、表3、表4、表5。
表1 0天空白发光强度(RLU)测试结果
表2 7天空白发光强度测试结果
表3 15天空白发光强度测试结果
表4 30天空白发光强度测试结果
表5 对照表
按照本发明制备的一种新的碱性磷酸酶的发光底物稳定性好，工艺简单，价格便宜。
Claims (6)
1.一种与碱性磷酸酶反应产生化学发光的化合物的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
（1）合成吖啶-9-酰氯：将吖啶-9-羧酸溶于三氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶，缓慢滴加亚硫酰氯，并回流该反应混合物，减压除去溶剂得到黄色固体；
（2）合成9,10-二氢化吖啶-9-酰氯：将吖啶-9-酰氯悬浮于甲醇中，分别先后加入氯化铵和锌到该溶液中，回流反应该反应混合物，过滤该溶液并用甲醇洗涤该沉淀，蒸发干燥得到产物9,10-二氢化吖啶-9-酰氯；
（3）合成10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-酰氯：将9,10-二氢化吖啶-9-酰氯溶于甲苯溶液中，冰浴控温，加入碳酸二甲酯和碳酸铯，搅拌反应，升温至室温，搅拌反应，蒸发干燥除去溶剂，加入乙酸乙酯做萃取剂，减压除去萃取剂得到产物10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-酰氯；
（4）合成10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸-3’-乙氧苯酯：将制备好的10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-酰氯溶于三氯甲烷中，分别加入3-乙氧基苯硫酚和4-二甲氨基吡啶，冰浴控温0～10℃，搅拌反应，然后撤去冰浴，室温再反应，干燥蒸发得到产物10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸-3’-乙氧苯酯；
（5）合成9-（3’-乙氧苯基硫代磷酸氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢化吖啶二（氰乙基）酯：将10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸-3’-乙氧苯酯溶于四氢呋喃溶液中干冰浴维持-80℃条件下，滴加入2mol/L 溶于四氢呋喃的LDA，搅拌反应后，加入三氯氧磷和4-二甲氨基吡啶，连续搅拌，撤去干冰浴自然升温并再继续搅拌，再用冰浴冷却该溶液并缓慢滴加3-羟基丙腈，加完后撤去冰浴室温搅拌，滤去沉淀并减压除去反应试剂，将残留物溶于乙酸乙酯，用氮气作为保护剂，滴加入2MOL/L氢氧化钾溶液，搅拌反应，抽滤所形成的沉淀并 空气干燥，得到微黄色固态产物9-（3’-乙氧苯基硫代磷酸氧亚甲基）-10-甲基-9,10-二氢 化吖啶二钾盐。
2.根据权利要求1所述的一种与碱性磷酸酶反应产生化学发光的化合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中吖啶-9-羧酸用量为1g～5g， 4-二甲氨基吡啶用量为0.2g～5g，亚硫酰氯用量为2～5mL，反应时间为6～12小时。
3.根据权利要求1所述的一种与碱性磷酸酶反应产生化学发光的化合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中吖啶-9-酰氯用量为0.5～2.0g，氯化铵用量为5～10g，锌用量为5～10g，回流反应时间为1～2小时。
4.根据权利要求1所述的一种与碱性磷酸酶反应产生化学发光的化合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中9,10-二氢化吖啶-9-酰氯用量为1g～5g，冰浴控温0～10℃，碳酸二甲酯用量为0.5～1g，碳酸铯用量为0.1～0.5g，搅拌反应时间为30～60分钟，升温至室温后，搅拌反应时间为1～2小时。
5.根据权利要求1所述的一种与碱性磷酸酶反应产生化学发光的化合物的制备方法，其特征在于，步骤（4）中10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-酰氯的用量为0.5～5g， 3-乙氧基苯硫酚的用量为1g～5g，4-二甲氨基吡啶的用量为0.5g～2g，冰浴控温0～10℃，搅拌反应30～60分钟，然后撤去冰浴，室温再反应1～2小时。
6.根据权利要求1所述的一种与碱性磷酸酶反应产生化学发光的化合物的制备方法，其特征在于，步骤（5）中的10-甲基-9,10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸-3’-乙氧苯酯的用量为0.5～2.0g，搅拌反应时间为1～2小时，三氯氧磷的用量为0.1～1.0g， 4-二甲氨基吡啶的用量为1～2g，连续搅拌时间为1～2小时小时，撤去干冰浴自然升温并再继续搅拌时间为1～2小时，3-羟基丙腈的用量为1～2mL，加完后撤去冰浴室温搅拌时间为6～12小时，2mol/L氢氧化钾溶液用量为0.5～1.0mL。
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