CN113135948B - 一种用于检测ClO-/ONOO-的比率荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于检测ClO-/ONOO-的比率荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测ClO‑/ONOO‑的比率荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针可以单独检测ClO‑或ONOO‑；当ClO‑和ONOO‑同时存在时，该荧光探针能够通过荧光比率变化识别ClO‑和/或ONOO‑，荧光信号间隔较大，不会出现荧光信号相互干扰情况，对ClO‑和ONOO‑都具有高灵敏度，低检测限(对ClO‑为21nM，ONOO‑为19nM)，良好的选择性，且探针生物相容性好的优点，可以多通道识别RAW 264.7细胞内的ClO‑和/或ONOO‑。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针检测领域，具体涉及一种用于检测ClO-/ONOO-的比率荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
研究表明炎症与多种疾病存在密切关系，例如，癌症，阿尔兹海默症，动脉粥样硬化，肝和肺纤维化等。在炎症过程中，主要由吞噬细胞例如中性粒细胞，和巨噬细胞将大量的活性氧与活性氮释放到吞噬细胞膜形成的吞噬小体中，而高活性的活性氧与活性氮可以介导各种生物分子的化学修饰，例如蛋白质，脂质，DNA和RNA，从而破坏入侵的病毒与细菌等的，达到免疫防御功能。然而，在炎症过程中，活性氧与活性氮过量产生，释放到吞噬细胞外部，从而攻击正常组织与细胞，导致一系列疾病，如神经炎症导致大脑中淀粉样蛋白团块的聚集，从而导致阿尔兹海默症的发展与恶化。
吞噬细胞主要通过两个途径免疫防御功能，分别是NADPH氧化酶(Phox)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)途径。吞噬细胞通过NADPH氧化酶作用下，与细胞膜外两个氧分子产生超氧阴离子，产生的超氧阴离子通过超氧化物歧化酶(SOD)作用，进一步转化为过氧化氢。吞噬细胞通过诱导型一氧化氮合酶作用产生一氧化氮。实际上，超氧阴离子，过氧化氢和一氧化氮都不是强氧化剂，在体内也不具有强力杀菌作用。但是，过氧化氢可以通过髓过氧化物酶(MPO)的作用与氯离子生成次氯酸，一氧化氮可以与超氧阴离子通过自由基偶联产生过氧亚硝酸根(ONOO-)。次氯酸与过氧亚硝酸根都是具有强氧化性的物质，它们可以通过氧化、硝化、卤化和脱氨作用直接修饰几乎所有类型生物分子，从而发挥免疫防御作用，同时与炎症的相关疾病密切相关。因此，同时对吞噬细胞中产生的ClO-/ONOO-进行实时监测对于评估炎症相关疾病的发生和进展以及开发新的治疗方法具有重要意义。目前，已报道的能够做到同时检测细胞内的次氯酸根与过氧亚硝酸根的荧光探针并不多，例如，文献(TingGuo,Lei Cui.A dual-emission and large Stokes shift fluorescence probe forreal-time discrimination of ROS/RNS and imaging in live cells.Chem. Commun.,2013,49,1862-1864)报道一种荧光探针，但是其对过氧亚硝酸盐的灵敏度较差，没有过氧亚硝酸根的单独识别基团，出现荧光检测信号相互干扰的情况。
文献(Linfang Wang,Jing Liu,Fluorescence Imaging of Hypochlorous Acidand Peroxynitrite in Vitro and in Vivo with Emission Wavelength Beyond750nm.Chem.Commun.,2020,56,7718-7721) 也报道一种荧光探针，虽然荧光信号可达到近红外，但同样只有一个荧光报道基团和靶向基团，选择性较差，成像荧光信号完全重合，无法区分次氯酸根与过氧亚硝酸根。
荧光探针由于其灵敏度高，无创性和实时检测特性，在探测由过量ClO-/ONOO-引起的细胞氧化应激方面显示出巨大的潜力。双分子荧光探针主要挑战包括：(1)探针应在单个分子中整合多识别结构域，荧光报告分子和靶向基团；(2)响应不同分析物而产生的荧光信号应具有足够的信号间隔，以防止成像通道之间的干扰；(3)两个反应位点应具有良好的选择性，且不能互相作用；(4)探头应能够分别或连续响应两种分析物，并对不同的分析物具有合理的信号响应。
因此，探索一种可以用于同时检测ClO-和ONOO-且在检测的过程中并不产生相互干扰，选择性和灵敏度高的荧光探针迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种检测ClO-/ONOO-的比率荧光探针(PTZ-ONOO)，该探针能够荧光比率变化定量的单独或同时检测ClO-和ONOO-，具有检测限低，灵敏度高和选择性高的优点。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的制备方法。
本发明的又一发明目的是提供上述荧光探针在ClO-和/或ONOO-检测中的应用，该荧光探针可以单独检测ClO-或ONOO-；当ClO-和ONOO-同时存在时，该荧光探针可以同时检测ClO-或ONOO-，在检测的过程中并不产生相互干扰，具有较高的检测灵敏度和选择性。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测ClO-/ONOO-的比率荧光探针，其探针的结构式如下所示：
比率荧光探针可以通过使用两个荧光信号进行自校准来减少荧光探针浓度，仪器因子和环境的干扰的优点。本发明设计的比率荧光探针(PTZ-ONOO)，利用吩噻嗪中硫原子易被次氯酸根氧化成亚砜结构，改变其推拉电子能力，从而实现特异性识别次氯酸根并产生不同的光信号，并将其与香豆素结构结合，使荧光波长红移；芳基硼酸酯基团能与过氧亚硝酸根反应，通过ESIPT原理使得探针PTZ-ONOO能与过氧亚硝酸根响应产生荧光信号。因此，本发明设计出同时具有吩噻嗪并香豆素与芳基硼酸酯结构的探针PTZ-ONOO，探针本身具有640nm的红色波长发射，当探针PTZ-ONOO遇到ONOO-时，苯硼酸酯频哪醇结构被ONOO-破坏，氮原子上暴露出一个氢，通过ESIPT原理，产生460nm的蓝色荧光发射，此时可检测到红色与蓝色荧光信号；当探针PTZ-ONOO遇到ClO-时，吩噻嗪中硫原子被氧化成亚砜结构，吩噻嗪整体给电子能力减弱，发射波长蓝移，探针 PTZ-ONOO本身的红色荧光变为520nm的绿色荧光发射，此时可检测到绿色荧光信号；当同时遇到ClO-和ONOO-时，上述两个响应机理同时发生，并不产生相互干扰，此时可检测到绿色与蓝色荧光信号。
借助共聚焦显微镜，该探针能够对RAW 264.7的炎症模型中的次氯酸根和过氧亚硝酸根进行成像，尤其是通过比率荧光变化观察到内源性次氯酸根与过氧亚硝酸根的生成。探针PTZ-ONOO与ClO-和ONOO-反应原理如下所示：探针PTZ-ONOO与ClO-和/或 ONOO-反应机理，PTZ-ONOO本身发出红色荧光，当单独与ClO-响应后，吩噻嗪中硫原子被氧化成亚砜结构，红色荧光消失，产生绿色荧光；当单独与ONOO-响应后，芳基硼酸酯基团分解掉，通过ESIPT效应，产生红色荧光；当同时与ClO-和ONOO-响应后，两种反应同时发生，红色荧光消失，绿色与蓝色荧光出现。
识别ClO-和/或ONOO-的比率荧光探针(PTZ-ONOO)的制备方法，它包括以下步骤：
进一步地，识别ClO-和/或ONOO-的比率荧光探针(PTZ-ONOO)的制备方法，它包括以下步骤：
第一步：在乙酸钠和乙酸存在的条件下，2-氨基苯硫醇和靛红酸酐进行化学反应制备中间体ONOO-N；
第二步：在硼氢化钠和乙酸存在的条件下，中间体ONOO-N和5-羟基戊醛进行化学反应制备中间体ONOO-OH；
第三步：在碳酸钾存在的条件下，中间体ONOO-OH与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯进行化学反应制备中间体ONOO-B；
第四步：在EDCI和DMAP存在的条件下，中间体ONOO-B和化合物S5进行化学反应制备荧光探针PTZ-ONOO。
在一种更优选方案中，在第一步中，2-氨基苯硫醇和靛红酸酐的摩尔比为1:0.5～0.9，可以但不仅限于1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.75、1:0.8或1:0.9，为了获得更好的效果，2-氨基苯硫醇和靛红酸酐的摩尔比为1:0.75。
进一步地，2-氨基苯硫醇和乙酸钠的摩尔比为1:0.4～0.8，可以但不仅限于1:0.4、1:0.5、 1:0.55、1:0.6、1:0.65、1:0.7或1:0.8，为了获得更好的效果，2-氨基苯硫醇和乙酸钠的摩尔比1:0.6。
在一种更优选方案中，在第二步中，中间体ONOO-N和5-羟基戊醛的摩尔比为 1:0.8～1.5，可以但不仅限于1:0.8、1:0.85、1:0.9、1:0.95、1:1、1:1.15、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，为了获得更好的效果，中间体ONOO-N和5-羟基戊醛的摩尔比为1:1。
进一步地，中间体ONOO-N和硼氢化钠的摩尔比为1:1.3～2.0，可以但不仅限于1:1.3、 1:1.4、1:1.5、1:1.55、1:1.6、1:65、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2.0，为了获得更好的效果，中间体ONOO-N和硼氢化钠的摩尔比为1:1.6。
在一种更优选方案中，在第三步中，中间体ONOO-OH与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不仅限于1:0.8、1:0.85、1:0.9、1:0.95、1:1、1:1.15、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，为了获得更好的效果，中间体ONOO-OH与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:1。
进一步地，中间体ONOO-OH与碳酸钾的摩尔比为1:2.0～4.0，可以但不局限于1:2.0、 1:2.2、1:2.4、1:2.6、1:2.8、1:3.0、1:3.2、1:3.4、1:3.6、1:3.8或1:4.0，为了获得更好的效果，中间体ONOO-OH与碳酸钾的摩尔比为1:3.0。
更进一步地，在第三步中，反应温度50～80℃，可以但不局限于50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃；反应时间为8～16h，可以但不局限于8h、10h、12h、14h或 16h。
在一种更优选方案中，在第四步中，中间体ONOO-B和化合物S5的摩尔比为 1:1.5～2.5，可以但不仅限于1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2.0、1:2.2或1:2.5，为了获得更好的效果，中间体ONOO-B和化合物S5的摩尔比为1:2.0。
进一步地，在第四步中，中间体ONOO-B和EDCI的摩尔比为1:1.5～2.5，可以但不仅限于1:1.5、1:1.55、1:1.6、1:65、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2.0、1:2.2、1:2.4或1:2.5，为了获得更好的效果，中间体ONOO-B和EDCI的摩尔比为1:2.0。
更进一步地，中间体ONOO-B和DMAP的摩尔比为1:1.1～1.5，可以但不仅限于1:1、1:1.15、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，为了获得更好的效果，中间体ONOO-B和DMAP 的摩尔比为1:1.3。
识别ClO-和/或ONOO-的比率荧光探针(PTZ-ONOO)，还包括以下更详细的合成路线：
本发明提供的识别ClO-和/或ONOO-的比率荧光探针(PTZ-ONOO)，可以单独检测ClO-或ONOO-；当ClO-和ONOO-同时存在时，该荧光探针可以同时检测ClO-或ONOO-，在检测的过程中并不产生相互干扰，具有较高的检测灵敏度和选择性。
采用本发明的技术方案，优势如下：
本发明提供一种识别ClO-和/或ONOO-的新型比率荧光探针(PTZ-ONOO)，能够通过荧光比率变化识别ClO-和/或ONOO-，荧光信号间隔较大，不会出现荧光信号相互干扰情况，对ClO-和ONOO-都具有高灵敏度，低检测限(对ClO-为21nM，ONOO-为19nM)，良好的选择性，且探针生物相容性好的优点，可以多通道识别RAW 264.7细胞内的ClO-和/或ONOO-。
附图说明
图1是化合物ONOO-OH的13C NMR；
图2是化合物ONOO-OH的HRMS，m/z calcd for C18H20N2OS[M+Na]+335.1189, found335.1185；
图3是化合物ONOO-B的13C NMR；
图4是化合物ONOO-B的HRMS，m/z calcd for C31H37BN2O3S[M+Mg]+551.2499,found 551.2493；
图5是探针PTZ-ONOO的13C NMR；
图6是探针PTZ-ONOO的HRMS，m/z calcd for C51H52BN3O6S2[M+Mg]+,900.3272,found 900.3277；
图7是探针PTZ-ONOO与次氯酸根反应后生成物的HRMS，m/z calcd forC51H52BN3O7S2[M+Mg]+,916.3221,found 916.3211；
图8是探针PTZ-ONOO与过氧亚硝酸根反应后生成物的HRMS，m/z calcd forC38H35N3O4S2[M+Na]+,684.1961,found 684.1953；
图9是探针PTZ-ONOO与次氯酸根和过氧亚硝酸根反应后生成物的HRMS，m/z calcdfor C38H35N3O5S2[M+Na]+,700.1910,found 700.1891；
图10是探针PTZ-ONOO与分别与次氯酸根和/或过氧亚硝酸根响应的紫外吸收光谱；
图11是探针PTZ-ONOO分别与次氯酸根和/或过氧亚硝酸根孵育30min的荧光光谱荧光光谱，其中，A)探针PTZ-ONOO(10μM)分别与次氯酸根(10μM)、次氯酸根(10μM) 和过氧亚硝酸根(10μM)孵育30min的荧光光谱；B)探针PTZ-ONOO(10μM)分别与过氧亚硝酸根(10μM)、过氧亚硝酸根(10μM)和次氯酸根(10μM)孵育30min的荧光光谱；
图12是探针PTZ-ONOO分别与ClO-和ONOO-孵育不同时间的荧光光谱，其中，A) 探针PTZ-ONOO(10μM)与ClO-(10μM)在37℃孵育0s、5s、10s、15s、20s、25s、 30s、40s、50s、60s、80s的荧光光谱；B)探针PTZ-ONOO(10μM)与ONOO-(10μM) 在37℃孵育0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min的荧光光谱；
图13是探针PTZ-ONOO与ClO-孵育1min与I520nm/I640nm的线性关系，其中，A)探针PTZ-ONOO(10μM)与ClO-(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、 20、25、30、35、40μM)在37℃孵育1min的荧光光谱，其中ClO-的浓度在0-10μM呈良好的线性关系；B)探针PTZ-ONOO(10μM)与ClO-(0、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40μM)在37℃孵育1min，440nm激发光激发下，520nm荧光强度与640nm的荧光强度比值；C)探针TZ-ONOO(10μM)与ClO- (0-10uM)在37℃孵育1min，440nm激发光激发下，520nm荧光强度与640nm的荧光强度比值的线性方程；
图14是探针PTZ-ONOO与ONOO-孵育30min与I460nm/I640nm的线性关系，其中，A) 探针PTZ-ONOO(10μM)与ONOO-(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、 16、18、20、25、30、35、40μM)在37℃孵育30min的荧光光谱，其中ONOO-的浓度在0-10μM呈良好的线性关系；B)探针PTZ-ONOO(10μM)与ONOO-(0、1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40μM)在37℃孵育30min，400nm 激发光激发下，460nm荧光强度与640nm的荧光强度比值；C)探针PTZ-ONOO(10μM) 与ONOO-(0-10μM)在37℃孵育30min，400nm激发光激发下，460nm荧光强度与640nm 的荧光强度比值的线性方程；
图15是探针PTZ-ONOO与ONOO-(40μM)孵育30min后，再与ClO-孵育1min的荧光光谱与I520nm/I460nm的线性关系，其中，A)探针PTZ-ONOO(10μM)与ONOO-(40μM) 孵育30min后，再与ClO-(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、 25、30、35、40μM)在37℃孵育1min的荧光光谱，其中ClO-的浓度0-10μM呈良好的线性关系；B)探针PTZ-ONOO(10μM)与ONOO-(40μM)孵育30min后，再与ClO- (0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40μM)在37℃孵育1min，400nm激发光激发下，520nm荧光强度与460nm的荧光强度比值；C) 探针PTZ-ONOO(10μM)与ONOO-(40μM)孵育30min后，再与ClO-(0-10μM)在 37℃孵育1min，400nm激发光激发下，520nm荧光强度与460nm的荧光强度比值的线性方程；
图16是探针PTZ-ONOO与ClO-(40μM)孵育1min后，再与ONOO-孵育30min的荧光光谱与I460nm/I520nm的线性关系，其中，A)探针PTZ-ONOO(10μM)与ClO-(40μM) 孵育1min后，再与ONOO-(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、 25、30、35、40μM)在37℃孵育30min的荧光光谱，其中ONOO-的浓度0-10μM呈良好的线性关系；B)探针PTZ-ONOO(10μM)与ClO-(40μM)孵育1min后，再与ONOO- (0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40μM)在 37℃孵育30min，400nm激发光激发下，460nm荧光强度与520nm的荧光强度比值；C) 探针PTZ-ONOO(10μM)与ClO-(40μM)孵育1min后，再与ONOO-(0-10μM)在37℃孵育30min，400nm激发光激发下，460nm荧光强度与520nm的荧光强度比值的线性方程；
图17是在存在其他干扰物质的情况下，探针PTZ-ONOO(10μM)在460nm，520nm 和640nm的荧光发射强度，干扰物质其他活性氧活性氮，金属离子，氨基酸(50.0当量，孵育120分钟)；
图18是不同浓度探针PTZ-ONOO与RAW 264.7细胞孵育24小时的细胞存活率；
图19是探针PTZ-ONOO(5μM)在RAW 264.7细胞成像图，其中，a-d)探针 PTZ-ONOO(5μM)与RAW 264.7细胞孵育20min的成像图；e-h)探针PTZ-ONOO(5μM) 与RAW 264.7细胞孵育20min后，加入次氯酸溶液(终浓度500μM)至培养液中继续培养30min的细胞成像图；i-l)探针PTZ-ONOO(5μM)与RAW 264.7细胞孵育20min 后，加入过氧亚硝酸根溶液(终浓度500μM)至培养液中继续培养30min的细胞成像图； m-p)探针PTZ-ONOO(5μM)与RAW 264.7细胞孵育20min后，加入次氯酸溶液(终浓度500μM)至培养液中继续培养30min后，在加入过氧亚硝酸根溶液(终浓度500μM) 至培养液中继续培养30min的细胞成像图；q-t)探针PTZ-ONOO(5μM)与RAW 264.7 细胞孵育20min后，加入过氧亚硝酸根溶液(终浓度500μM)至培养液中继续培养30min 后，在加入次氯酸溶液(终浓度500μM)至培养液中继续培养30min的细胞成像图；
图20是探针PTZ-ONOO(5μM)在RAW 264.7细胞成像图，其中，a-d)将脂多糖 (LPS)和PMA加入至培养液中，使其终浓度都为2μg/ml，与RAW 264.7细胞共同培养 12h后，加入探针PTZ-ONOO(5μM)与RAW 264.7细胞孵育30min的成像图；e-h) 将脂多糖(LPS)和PMA加入至培养液中，使其终浓度都为2μg/ml，与RAW 264.7细胞共同培养12h后，加入5-乙酰半胱氨酸(2mol/L)继续孵育2h，再加入探针PTZ-ONOO (5μM)与RAW 264.7细胞孵育30min后的细胞成像图。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的识别ClO-和/或ONOO-的比率荧光探针PTZ-ONOO，作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
一、实施方法
1、材料与仪器
MTT细胞增殖/毒性检测试剂盒(Biosharp公司)；Gibco DMEM高糖培养基(美国Life Technologies公司)；Gibco胎牛血清(美国Life Technologies公司)；薄层色谱使用GF254硅胶板(250μm)，柱层析使用300-400目的硅胶(青岛海洋化工)；其余试剂都是国产分析纯。
细胞：
RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞。
仪器：
ECZ-400S核磁共振仪(日本JEOL公司)；YRT-3型熔点测定仪(天津市天大天发科技有限公司)；质谱仪(maXisTM 4G UHR-TOF德国Bruker公司)；细胞培养箱(美国ThermoFisher Scientific公司)；酶标仪(Clinibio公司Thermo Fisher Scientific,Finland)；超净工作台 (苏州净化设备有限公司)；PB-21型pH计(德国Sartorius公司)；PharmaSpecUV-2401PC紫外分光光度计(日本Shimadzu公司)；SHB-IIIS循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；RTC basic磁力搅拌器(德国IKA公司)；F-4600荧光分光光度计(日本日立高新技术公司)；RE-2000B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
2、溶液的配制
(1)ONOO-溶液配制
①取0.6mg NaOH加入至25ml离心管中，加入10ml去离子水；
②取0.207g NaNO2加入至25ml离心管中，加入5ml去离子水中；
③取0.35ml H2O2(30％,0.7M)加入至25ml离心管中，再加入4.4ml去离子水，0.25ml浓盐酸(35％)；
④将步骤②与步骤③中离心管中溶液共同匀速倒入烧杯中，会有气泡产生，并带有刺激性气味；
⑤将烧杯中的混合溶液快速倒入步骤①的离心管中，混匀几分钟后，加入0.08gMnO2，通过硅藻土过滤，滤液为过氧亚硝酸盐母液；
⑥用紫外吸光光度计测定所配置的过氧亚硝酸盐母液在302nm吸光度，用0.1M的NaOH作为空白对照，计算过氧亚硝酸盐母液浓度，-20℃保存。(过氧亚硝酸盐ε302nm＝1670M-1CM-1)
(2)1×PBS溶液：取PBS粉包一袋，溶于1.8L的超纯水中，用1mol/L的盐酸溶液调pH至7.00-7.20，定容至2L，在超净台中用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后4℃存储备用。
(3)MTT溶液：避光取250mg MTT加入到50ml 1×PBS中，室温涡旋5分钟充分溶解，配成5mg/ml的溶液，在超净台中用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，避光分装，-20℃长期保存。
(4)PTZ-ONOO储存液配置：使用万分之一天平称取荧光探针8.77mg，将其倒入10ml容量瓶中，使用DMSO定容，得到1mM荧光探针储存液，并将其放于冰箱中低温避光保存。
(5)次氯酸根溶液配制：称取10％次氯酸钠溶液7.44mg，将其倒入10ml容量瓶中，使用双纯水定容，得到1000μM的次氯酸根溶液。
(6)其它干扰性生物学物质储存液的配制：将L-半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、高半胱氨酸(Hcy)、SO3 2-，S2O3 2-，SO4 2-，Na2S4，HSO3-，Ser，Pro，Val，Arg，Leu， Gly，Tyr，pHe，Met，His，Trp，Thr，Ala，Glu，Gln，Thr，Na+，Mg2+，Ca2+，K+，Al3+，Fe3+，F-，Cl-，I-，ClO-，SCN-，NO3 -，CO3 2-，HCO3-，H2PO4-，NO2 -等按照类似的方法配制，但溶剂使用双蒸水。配制成1.0mmol的储存液，放置在冰箱中低温避光保存。
3、荧光分析
(1)荧光光谱的测定
荧光光谱分析法：使用日立F4600荧光分光光度计进行本论文的整个光谱分析过程。首先，确定探针PTZ-ONOO分别于次氯酸、过氧亚硝酸盐反应之后的最佳激发波长，通过仪器的正扫与反扫得到，与次氯酸反应后的最佳激发波长是440nm，与过氧亚硝酸盐的最佳激发波长是400nm，同时与两种反应的最佳激发波长是400nm。然后确定合适的响应体系，通过对1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％的乙腈与PBS 体系的实验效果对比，得到最佳的响应体系为50％。最后对测量仪器的各个参数进行了筛选，得到激发与发射狭缝宽度为10nm，电压为600V，扫描速度为1200nm/min，扫描范围为400-800nm。探针与次氯酸、过氧亚硝酸盐的响应都在37℃恒温水浴锅中进行。
(2)检测限的测量
最低检测限按文献报道方法进行。首先是空白样品(即未加入次氯酸与过氧亚硝酸盐的探针PTZ-ONOO溶液)的荧光光谱测定，连续检测其10次荧光光谱，并计算其10次荧光强度熟知的标准偏差(σ)。后将探针PTZ-ONOO分别与某个浓度范围内的次氯酸、过氧亚硝酸盐、次氯酸和过氧亚硝酸盐进行响应，其在这一范围内具有较好的荧光强度- 浓度的线性关系，并且计算出其线性回归方程。根据检测限计算公式：检测限＝3σ/k。k 为此线性回归方程的斜率，整个测定过程探针浓度为10μM，某个浓度范围是根据实验结果所确定。
(3)紫外分析方法
在室温下，利用双光束紫外分光光度计对不同浓度的荧光母核、探针以及探针加不同底物的溶液进行波长全扫描，记录波长扫描结果。其最大吸收波长即可作为粗略的荧光激发波长，但具体的激发波长需通过荧光分光光度计来确定，扫描过程所使用的都是四面透明的石英比色皿。
4.RAW 264.7细胞的培养
(1)RAW 264.7细胞的培养
RAW 264.7细胞为贴壁生长细胞，正常形态为圆形，当细胞培养时间过长或受到外部因素刺激，细胞容易分化，变为多边形，分化后细胞无法变回原形态，分化的细胞少于10％，细胞可正常使用。RAW 264.7细胞常规培养于含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素的DMEM高糖完全培养基中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，2天传代一次，操作均在超净台与生物安全柜中完成，培养时避免细胞过度分化。
(2)RAW 264.7细胞的传代
倒置显微镜下观察细胞形态，分化量少于10％，确定细胞无细菌、真菌污染，生长状态良好且达到80％左右融合时(处于对数生长期)可进行细胞传代。在超净台中，倒出培养瓶中的培养基，加入2ml生理盐水清洗细胞表面，除去细胞瓶内残留的培养基。加入6ml生理盐水，用巴氏吸管反复吹打细胞表面，倒置显微镜下观察，细胞均匀分散在生理盐水中，将细胞悬液转移到15ml离心管中，800rpm离心3min，弃去上清，用2ml DMEM完全培养基重悬细胞，分别吸取1ml细胞悬液接种于新的培养瓶中，置于37℃， 5％CO2培养箱中培养，每隔1-2天全量换液一次，待细胞长至80％左右时可再次传代。
5.实验方法
(1)MTT实验
取对数生长期的细胞以3-5×104cells/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL细胞悬液，在37℃，5％CO2条件的恒温培养箱孵育24h。吸弃培养基，将化合物配制成7个浓度梯度(1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM)，每孔加入100μL化合物溶液，孵育24h。孵育结束后，用1mL注射器吸取96孔板内的培养基，各孔避光加入100μL含MTT的基础培养基(MTT终浓度为0.5mg/ml)，培养箱避光孵育4h，孵育结束后，用1mL注射器吸取培养基，每孔加100μLDMSO溶液，置摇床上低速震摇10min 使甲瓒充分溶解。酶标仪测定550nm波长处的吸光度(OD)值，用空白孔(培养基+MTT) 校准吸光度值，按以下公式计算各组细胞存活率：细胞相对存活率(％)＝(实验组OD 值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。实验重复3次以上，数据表示为mean±SD。
(2)造细胞炎症模型
小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7为贴壁生长细胞，常规培养于含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高糖完全培养基中，置于37℃，5％CO2 培养箱中培养。当细胞处于对数生长期时，将脂多糖(LPS)和PMA加入至培养液中，使其终浓度都为2μg/ml，共同培养12h。当细胞成为多角形态以及伪足数量增加，即造模成功。
(3)探针PTZ-ONOO在RAW264.7细胞中与外源性ClO-与ONOO-成像
为检测探针PTZ-ONOO能否在细胞内与ClO-、ONOO-响应，并进行RAW 264.7细胞的激光共聚焦成像。倒置显微镜下观察细胞，生长状态良好且达到60％-80％融合时(处于对数生长期)，以1*105cells/ml的密度接种于共聚焦培养皿中，共培养五组细胞，待细胞长至60％-80％密度且状态良好时，将探针PTZ-ONOO溶液(终浓度5μM)加入到细胞培养液中继续培养20min。第一组细胞为空白对照，不加入其它外源物质；第二组细胞与探针PTZ-ONOO孵育20min后，加入次氯酸钠溶液(终浓度500μM)至培养液中继续培养30min；第三组细胞与探针PTZ-ONOO孵育20min后，加入过氧亚硝酸根溶液 (终浓度500μM)至培养液中继续培养30min；第四组细胞与探针PTZ-ONOO孵育20min 后，先加入次氯酸钠溶液(终浓度500μM)至培养液中继续培养30min，再加入过氧亚硝酸根溶液(终浓度500μM)至培养液中继续培养30min；第五组细胞与探针PTZ-ONOO 孵育20min后，加入过氧亚硝酸根溶液(终浓度500μM)至培养液中继续培养30min，再加入次氯酸钠溶液(终浓度500μM)至培养液中继续培养30min；所有细胞组孵育完成后去除上清，用1ml生理盐水洗涤三次后，加入0.5ml生理盐水，使用Olympus FV1000 激光共聚焦显微镜进行荧光成像拍照(10*和60*油镜)。采用Olympus软件进行细胞图像和数据的分析。
(4)探针PTZ-ONOO在炎症模型RAW 264.7细胞中与内源性ClO-与ONOO-成像
为检测探针PTZ-ONOO能否与细胞内源性的ClO-、ONOO-响应，并进行炎症模型 RAW264.7细胞的激光共聚焦成像。倒置显微镜下观察细胞，生长状态良好且达到 60％-80％融合时(处于对数生长期)，以1*105cells/ml的密度接种于共聚焦培养皿中，共培养三组细胞，待细胞长至60％-80％密度且状态良好时，第一组细胞为空白对照；第二组与第三组细胞与LPS和PMA溶液(终浓度为2μg/ml)孵育12h，使细胞成为多角形态以及伪足数量增加，造细胞炎症模型后，第三组细胞加入氧化清除剂；三组细胞与探针 PTZ-ONOO(终浓度为5μM)孵育20min，去除上清，用1ml生理盐水洗涤三次后，加入0.5ml生理盐水，使用OlympusFV1000激光共聚焦显微镜进行荧光成像拍照(10*和 60*油镜)。采用Olympus软件进行细胞图像和数据的分析。
(5)Olympus FV1000激光共聚焦显微镜实验
将显微镜激发波长调制405nm，开启三个荧光发射检测通道，分别为蓝光检测通道420-470nm，绿光检测通道480-540nm，红光检测通道580-640nm。
6.探针识别ONOO-，ClO-原理
将PTZ-ONOO(8.77mg,0.01mmol)溶于DMSO(1mL)中，加入至10ml PBS缓冲液(pH＝7.4)，在37℃下反应1h。乙酸乙酯(3×10mL)萃取，浓缩，通过HRMS确认反应产物，从而确认探针和ONOO-，ClO-反应机理与预测一致。
二、实施例
1.1中间体S1的合成
在0℃的条件下，将2-甲氧基吩噻嗪(1.15g，0.5mmol)搅拌溶于10ml DMF中，再将氢化钠(0.36g，15mmol)缓慢加入其中，在冰浴的条件下搅拌三十分钟，然后将得到的混合溶液在25℃条件下继续搅拌1h。将溴代正丁烷(0.61g，6mmol)逐滴加入上述混合溶液中，25℃搅拌1小时后，升温至70℃继续搅拌3h，TLC检测(石油醚:二氯甲烷＝2:1)。
后处理：将得到的反应液冷却至25℃后，缓慢倒入100ml冷水中，用200ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，有机相用100ml冷水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析分离(石油醚:二氯甲烷＝10:1)，得到无色油状物，即中间体S1，其收率约为75％。
1.2中间体S2的合成
制备V-H试剂：在冰浴的条件下，将8ml DMF与13ml POCl3加入250ml茄形瓶中，搅拌30min，溶液变为粉红色，V-H制备完成。
将中间体S1(4g，14mmol)溶于15ml 1,2-二氯乙烷中，将其缓慢滴加至上述制备完成的V-H试剂中，加热至60℃，过夜反应，TLC检测(检测时吸取100μl反应液，加入0.5ml冷水，0.5ml乙酸乙酯，摇晃后使其自然分层，点有机相，石油醚:二氯甲烷＝5:1)。
后处理：将得到的反应液降至25℃，缓慢倒入300ml冷水中，使用1.5L乙酸乙酯多次萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，有机相采用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析纯化(石油醚:二氯甲烷＝20:1)得到黄色固体，即中间体S2，产率80％。
1.3中间体S3的合成
将中间体S2(313mg，1mmol)用于15ml无水二氯甲烷中，在冰浴的条件下搅拌5 min后，向其中加入无水氯化铝(798mg，6mmol)，在氮气保护下，25℃反应12h，TLC 检测(取10μl反应液，加入20μl 3N HCl，0.5ml水，摇晃3min后，加入1ml乙酸乙酯，摇晃后使其自然分层，点有机相，石油醚:二氯甲烷＝1:2)。
后处理：将得到的反应液中加入2ml 3N HCl，10ml水继续搅拌30min，溶液呈酸性后加入50ml乙酸乙酯，30ml水进行多次萃取，合并有机相，用无水硫酸钠进行干燥，减压浓缩，柱层析分离(石油醚:二氯甲烷＝5:1)得到红色固体，即中间体S3，其收率为 89％。
1.4中间体S4的合成
将化合物S3(155mg，0.5mmol)溶于15ml乙醇中，加入丙二酸二乙酯(112mg，0.7mmol)，再滴加哌啶五滴，25℃反应12h，TLC检测(石油醚:二氯甲烷＝1:1)。
后处理：将得到的反应液倒入50ml水中，有红色固体析出，抽滤，用乙醇多次洗涤，得产物，即中间体S4，其收率为90％。
1.5中间体S5的合成
将中间体S4(790mg，2mmol)溶于20ml甲醇中，加入1ml氢氧化钠(240mg，72.6mmol)水溶液，加热至回流温度，回流反应30min。待反应完成后，减压除去溶剂，将得到的残余物溶于50ml二氯甲烷中，用10％HCl溶液调节其pH至3-4，将溶液用盐水洗涤一次，有机相采用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得到红色固体S5，产率99％。 1.6中间体ONOO-N的合成
将2-氨基苯硫醇(2.55ml，20.37mmol)、靛红酸酐(2.93g，15.27mmol)、乙酸钠(1.2g，12.43mmol)溶于120ml乙酸中，在氩气保护下，将得到的混合溶液加热至回流温度，回流反应1.5h。待反应结束后，将得到的反应液降至25℃，加入100ml乙酸乙酯，同时加入固体碳酸氢钠猝灭反应。有机相采用盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗品，柱层析分离(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)得到暗绿色固体，即中间体ONOO-N，产率85％。
1.7中间体ONOO--OH的合成
将中间体ONOO-N(1.18g，5.08mmol)溶于10ml 1，2-二氯乙烷中，再加入5- 羟基戊醛(510mg，5mmol)、1.11ml乙酸，将得到的混合溶液在25℃搅拌1h，然后加入硼氢化钠(8mmol)，继续反应24h，TLC检测(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)。反应完成后，加入固体碳酸氢钠猝灭反应，用30ml乙酸乙酯、50ml水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得粗品，柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)得到黄色油状物，即中间体 ONOO-OH，产率约为70％，1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.98(s,1H),7.93(d,J＝8Hz, 1H),7.85(d,J＝8Hz,1H),7.72(dd,J＝8,1.2Hz,1H),7.43(q,J＝14.8Hz,1H),7.35-7.29 (m,2H),6.77(d,J＝8Hz,1H),6.67(t,J＝14.8Hz,1H),3.70(t,J＝12.8Hz,2H),3.33(t,J＝ 14Hz,2H),1.85-1.69(m,2H),1.67-1.61(m,4H),1.35(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ 169.6,153.6,147.6,133.2,132.2,130.8,126.1,124.9,122.3,121.2,115.1,114.7,111.5,63.0, 43.0,32.6,29.0,23.6.HRMS m/z calcd for C18H20N2OS[M+Na]+335.1194,found 335.1185。相关的谱图见图1-2。
1.8中间体ONOO-B的合成
将中间体ONOO-OH(100mg，0.33mmol)、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(100mg，0.34mmol)溶于10ml无水乙腈中，加入碳酸钾(138mg，1mmol)，加热至60℃反应12h， TLC检测(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)。待反应完全后，将得到的反应液冷却至25℃，倒入 50ml冷水中，用30ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析分离(石油醚:乙酸乙酯＝20:3)得到黄色固体，即中间体ONOO-B，产率约为70％， m.p.87.5-90℃。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.33(dd,J＝8,1.2Hz,1H),8.06(d,J＝8 Hz,1H),7.91(d,J＝8Hz,1H),7.69(d,J＝7.6Hz,2H),7.49-7.45(m,1H),7.37(q,J＝15.2 Hz,1H),7.33-7.19(m,1H),7.20(t,J＝14.8Hz,1H),7.15(d,J＝7.6Hz,2H),6.97(d,J＝8 Hz,1H),4.16(s,2H),3.53(t,J＝12.8Hz,2H),2.94(q,J＝14.8Hz,2H),1.60-1.50(m,2H), 1.48-1.41(m.2H),1.32(s,12H),1.28-1.25(m,2H),1.22(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3): δ165.3,152.1,149.3,139.5,136.6,134.6,130.5,129.3,125.9,125.0,124.3,124.0,123.0, 121.5,83.9,62.8,59.6,52.8,34.8,32.5,26.0,25.4,25.0,23.6.HRMS m/z calcd for C31H37BN2O3S[M+Na]+551.2516,found 551.2493。相关的谱图见图3-4。
1.9PTZ-ONOO的合成
在50ml茄形瓶中，将中间体ONOO-B(40mg，0.075mmol)溶于10ml 1，2-二氯乙烷中，加入中间体S5(37mg，0.15mmol)搅拌溶解。然后，加入EDCI(30mg，0.15 mmol)、DMAP(12mg，0.1mmol)，25℃反应4h，TLC检测(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)。
后处理：待反应完全后，将得到的反应液倒入100ml烧杯中，加入20ml冷水，用60ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析分离(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，得到红色固体，即产物PTZ-ONOO，产率约为80％，m.p.99-100℃1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.34(d,J＝7.6Hz,1H),8.23(s,1H),8.00(d,J＝8.4Hz,1H), 7.67(d,J＝7.6Hz,2H),7.42(t,J＝14.8Hz,1H),7.36-7.27(m,2H),7.23-7.14(m,2H), 7.13-7.08(m,4H),6.98(t,J＝14.8Hz,2H),6.90(d,J＝7.6Hz,1H),6.63(s,1H),4.23(t,J＝ 12.8Hz,2H),4.16(s,2H),3.85(t,J＝15.2Hz,2H),2.99(s,2H),1.83-1.76(m,2H),1.72-1.56 (m,4H),1.49-1.37(m,2H),1.31(s,12H),1.28-1.23(m,2H),0.96(t,J＝6.4Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ165.1,163.4,157.2,156.6,152.0,151.0,147.8,142.4,134.5,130.6,129.3,127.9,127.6,126.2,125.9,125.0,124.0,122.9,121.4,121.1,116.2,113.3,112.8,102.1, 83.9,65.6,52.6,48.4,28.5,27.0,26.1,25.0,22.7,20.1,13.8。相关的谱图见图5-6。
三、效果验证
1、探针PTZ-ONOO的光学性能检测
1.1探针PTZ-ONOO分别与ONOO-，ClO-，ONOO-和ClO-反应之后的荧光光谱变化
利用荧光分光光度计法检测PTZ-ONOO分别与ONOO-，ClO-，ONOO-和ClO-反应之后的荧光光谱。其中，PTZ-ONOO分别与ONOO-，ClO-，ONOO-和ClO-反应后生成物的 HRMS图，具体见图7-9。
如图11所示，探针PTZ-ONOO(10μM)溶液本身具有640nm红色荧光，与ONOO- (10μM)反应之后，探针PTZ-ONOO本身红色不改变，在460nm处荧光具有明显的蓝色荧光增强现象；与ClO-(10μM)反应之后，探针PTZ-ONOO本身红色荧光消失，在 520nm处出现绿色荧光；当与ClO-(10μM)反应之后，再加入ONOO-(10μM)，探针 PTZ-ONOO本身在520nm处的绿色荧光出现蓝移，检测到460nm蓝色与520nm绿色的混合荧光信号；当与ONOO-(10μM)反应之后，再加入ClO-(10μM)，在460nm处的蓝色荧光出现红移，也检测到460nm蓝色与520nm绿色的混合荧光信号；证明探针能分别或同时与ClO-和ONOO-响应产生不同的荧光信号，且ClO-与ONOO-的加样顺序对荧光信号并不产生影响。
1.2探针PTZ-ONOO对与ONOO-和ClO-的响应时间
为确定探针PTZ-ONOO与ONOO-和ClO-的最佳响应时间，将探针PTZ-ONOO (10μM)与ONOO-和ClO-在37℃恒温水浴锅中进行孵育，测量不同时间下的荧光强度变化，以确定最佳响应时间。如图12所示，ClO-与ONOO-都能在较短时间与探针 PTZ-ONOO响应，荧光信号迅速增强，在40s时ClO-与探针PTZ-ONOO反应完全，在 30min时，ONOO-与探针PTZ-ONOO反应完全。此外，随着孵育时间的延长，探针 PTZ-ONOO与单一ONOO-和ClO-反应时，荧光强度基本不发生变化，从另一方面说明探针PTZ-ONOO比较稳定。探针PTZ-ONOO能够快速与ClO-响应，35s内即可完成检测。 1.3探针PTZ-ONOO对与ONOO-和ClO-响应的浓度线性关系及检测限的测定
为了研究探针PTZ-ONOO是否能用于ClO-与ONOO-的定量检测，测定了探针 PTZ-ONOO(10μM)与不同浓度的ClO-(0-40μM)和ONOO-(0-40μM)在37℃恒温水浴锅中孵育5min之后的荧光光谱变化，以此探讨荧光强度与ClO-与ONOO-浓度之间的关系。如图13-16所示，随之ClO-与ONOO-浓度的增加，探针PTZ-ONOO的荧光强度比率不断增大，探针荧光比率与底物0-40uM具有较好的线性关系，可以做到定量检测ClO-与ONOO-。
1.4探针PTZ-ONOO的抗干扰能力
在复杂的生物背景下，衡量探针PTZ-ONOO能否成功的最重要的指标是探针对ClO-与ONOO-的特异性识别能力。为了验证探针PTZ-ONOO在复杂的生物背景干扰下，是否对ClO-与ONOO-具有高选择性，通过检测探针与其他活性氧、活性氮、氨基酸、金属离子等干扰物质存在下的荧光光谱情况。如图17所示，探针PTZ-ONOO在多种干扰物质存在下，只对ClO-与ONOO-进行响应，而与其他物质不响应，且在高浓度干扰物质存在下，探针PTZ-ONOO与ClO-与ONOO-响应之后而荧光强度基本没有改变，说明探针具有较好的选择性，不受其它物质干扰，能够特异性识别ClO-与ONOO-。
1.5探针对ClO-与ONOO-响应之后紫外吸收改变
如图9所示，探针PTZ-ONOO本身在500nm处具有一个较强的吸收，在340nm左右也具有一个较强的吸收，当与ClO-响应后，探针PTZ-ONOO在500nm处的吸光度降低，其他位置吸光度基本不改变；当与ONOO-响应之后，探针PTZ-ONOO在340nm处的吸光度降低，其他位置吸光度基本不改变；当探针PTZ-ONOO同时与ClO-和ONOO-响应之后，探针PTZ-ONOO在340nm与500nm处的吸光度同时降低，说明探针单独识别ClO-与ONOO-，与同时识别ClO-与ONOO-响应机理一致。
2、细胞荧光实验
2.1细胞毒性实验
在探针PTZ-ONOO检测细胞内ClO-与ONOO-的荧光成像实验之前，必须先对其进行细胞毒性试验，确定对细胞无损伤的合适探针浓度，以应用于活细胞成像试验。如图18 所示，在不同浓度(1，2，5，10μM)探针PTZ-ONOO孵育24h后，小鼠单核巨噬细胞 (RAW 264.7)的存活率与对照组相比并没有明显变化，即使PTZ-ONOO浓度在100μM，细胞存活率在80％左右。说明探针PTZ-ONOO在0-100μM范围内对RAW 264.7细胞基本没有毒性，生物兼容性较好。结合相关实验，确定探针PTZ-ONOO的使用浓度为5μM。 2.1外源性ONOO-与ClO-细胞实验
如图19中，如a-d所示，探针PTZ-ONOO(5μM)预处理细胞20min后，激光共聚焦成像结果显示，细胞在蓝色与绿色通道基本无荧光，红色通道有明显荧光出现，此为探针PTZ-ONOO本身荧光；如e-h所示，探针PTZ-ONOO(5μM)预处理细胞20min后，加入ClO-(500μM)继续孵育20min，激光共聚焦成像结果显示，细胞在蓝色与红色通道基本无荧光，绿色通道有明显荧光出现；如i-l所示，探针PTZ-ONOO(5μM)预处理细胞20min后，加入ONOO-(500μM)继续孵育20min，激光共聚焦成像结果显示，细胞在绿色通道基本无荧光，蓝色与红色通道有明显荧光出现；如m-p所示，探针PTZ-ONOO (5μM)预处理细胞20min后，加入ClO-(500μM)继续孵育20min后，再加入ONOO- (500μM)继续孵育20min，激光共聚焦成像结果显示，细胞在红色通道基本无荧光，蓝色与绿色通道有明显荧光出现；如q-t所示，探针PTZ-ONOO(5μM)预处理细胞20min 后，加入ONOO-(500μM)继续孵育20min后，再加入ClO-(500μM)继续孵育20min，激活共聚焦成像结果显示，细胞在红色通道基本无荧光，蓝色与绿色通道有明显荧光出现。说明探针可以特异性识别RAW 264.7细胞中外源性的ClO-与ONOO-，并在对应通道产生荧光。
2.2内源性ONOO-与ClO-细胞实验
如图20中，如a-d所示，细胞与LPS和PMA溶液(终浓度为2μg/ml)孵育12h，使细胞成为多角形态以及伪足数量增加，造细胞炎症模型后，细胞与探针PTZ-ONOO(终浓度为5μM)孵育20min，细胞在红色通道基本无荧光，蓝色与绿色通道有明显荧光出现；如e-h所示，细胞与LPS和PMA溶液(终浓度为2μg/ml)孵育12h，加入5-乙酰半胱氨酸(2mol/L)继续孵育2h，再加入探针PTZ-ONOO(5μM)与RAW 264.7细胞孵育30min，细胞在蓝色与绿色通道基本无荧光，红色通道有明显荧光出现，说明探针可以特异性识别炎症模型RAW 264.7细胞中内源性的ClO-与ONOO-，并在对应通道产生荧光。
Claims (16)
1.一种用于检测ClO-/ONOO-的比率荧光探针，其探针的结构式如下所示：
2.一种权利要求1所述的用于检测ClO-/ONOO-的比率荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
第一步：在乙酸钠和乙酸存在的条件下，2-氨基苯硫醇和靛红酸酐进行化学反应制备中间体ONOO-N；
第二步：在硼氢化钠和乙酸存在的条件下，中间体ONOO-N和5-羟基戊醛进行化学反应制备中间体ONOO-OH；
第三步：在碳酸钾存在的条件下，中间体ONOO-OH与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯进行化学反应制备中间体ONOO-B；
第四步：在EDCI和DMAP存在的条件下，中间体ONOO- B和化合物S5进行化学反应制备荧光探针PTZ-ONOO。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在第一步中，2-氨基苯硫醇和靛红酸酐的摩尔比为1:0.5~0.9；2-氨基苯硫醇和乙酸钠的摩尔比为1:0.4~0.8。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在第一步中，2-氨基苯硫醇和靛红酸酐的摩尔比为1:0.75；2-氨基苯硫醇和乙酸钠的摩尔比为1:0.6。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在第二步中，中间体ONOO-N和5-羟基戊醛的摩尔比为1:0.8~1.5；中间体ONOO-N和硼氢化钠的摩尔比为1:1.3~2.0。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在第二步中，中间体ONOO-N和5-羟基戊醛的摩尔比为1:1；中间体ONOO-N和硼氢化钠的摩尔比为1:1.6。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在第三步中，中间体ONOO-OH与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:0.8~1.5；中间体ONOO-OH与碳酸钾的摩尔比为1:2.0~4.0。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在第三步中，中间体ONOO-OH与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:1；中间体ONOO-OH与碳酸钾的摩尔比为1:3.0。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在第三步中，反应温度为50~80℃；反应时间为8~16h。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在第三步中，反应温度为60℃；反应时间为12 h。
12.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在第四步中，中间体ONOO- B和化合物S5的摩尔比为1:1.5~2.5。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，在第四步中，中间体ONOO- B和化合物S5的摩尔比为1:2.0。
14.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在第四步中，中间体ONOO- B和EDCI的摩尔比为1:1.5~2.5；中间体ONOO- B和DMAP的摩尔比为1:1.1~1.5。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，在第四步中，中间体ONOO- B和EDCI的摩尔比为1:2.0；中间体ONOO- B和DMAP的摩尔比为1:1.3。
16.权利要求1所述的用于检测ClO-/ONOO-的比率荧光探针作为非疾病的诊断或治疗的检测ClO-和/或ONOO-的应用。
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