DE69629333T2

DE69629333T2 - Adduktabschirmungstest

Info

Publication number: DE69629333T2
Application number: DE69629333T
Authority: DE
Inventors: Michael San Diego Becker; Norman C. San Diego Nelson
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: US5731148A; CA2222556A1; WO1996041197A1; AU6024496A; DK0747706T3; ATE246807T1; AU703605B2; EP0747706B1; JP2002515118A; EP0747706A1; DE69629333D1; ES2203656T3; KR19990022460A; CA2222556C; JP3577085B2

Description

Gegenstand der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren zur Untersuchung der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Probe.
Hintergrund der Erfindung
Eine Untersuchung auf die Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Probe kann wertvolle Informationen, wie z. B. ob ein bestimmter Organismus, Gen oder Protein in der Probe vorhanden ist, zur Verfügung stellen. Eine Untersuchung auf einen Analyten kann mittels eines Bindungspartners durchgeführt werden, der in der Lage ist einen charakteristischen Teil eines Analyten zu erkennen und zu binden. Zum Beispiel können markierte Antikörper oder Oligonukleotidsonden in diagnostischen Assays verwendet werden, um die Anwesenheit eines Organismus, Gens oder Proteins in einer Probe nachzuweisen.
Eine Oligonukleotidsonde kann mit einer komplementären Target-Nukleinsäuresequenz hybridisieren, um den Nachweis der Target-Nukleinsäuresequenz zu ermöglichen. Ein Nachweis der Anwesenheit oder Menge einer Target-Nukleinsäuresequenz kann bei verschiedenen Arten von Assays verwendet werden, welche die folgenden einschließen: Nachweis der Anwesenheit eines Mikroorganismus oder einer Gruppe von Mikroorganismen in einer Probe durch Sondieren nach einer für den Mikroorganismus oder die Gruppe von Mikroorganismen charakteristischen Nukleinsäuresequenz (z. B. Hogan et al., mit dem Titel „Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organisms", internationale Veröffentlichung Nr. WO 88/03957); Nachweis der Anwesenheit eines Virus durch Sondieren nach einer für das Virus charakteristischen Sequenz (z. B. McDonough et al., mit dem Titel „Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1", internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/23069, und McDonough et al., mit dem Titel „Nucleic Acid Amplification Oligonucleotides and Probes to Human Hepatitis B Virus", internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/22469; und ein Nachweis, ob eine bestimmte Nukleinsäuresequenz der Hybridisierung mit einem komplementären Oligonukleotid zugänglich ist (z. B. Nelson et al., mit dem Titel „Oligonucleotide Screening Assay", internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/03427).
Verschiedene Macker und Assay-Formate können verwendet werden, um die Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Probe nachzuweisen. Beispiele für nachweisbare Macker schließen Radioisotope, fluoreszierende Reste, chemilumineszierende Reste, Enzyme, Enzymsubstrate und Liganden ein.
Assay-Formate können unabhängig davon, ob der an den Analyten gebundene Bindungspartner vom nicht an den Analyten gebundenen Bindungspartner physikalisch getrennt ist, als „heterogen" oder „homogen" charakterisiert werden. Heterogene Assays schließen eine physikalische Trennung des an einen Analyten gebundenen Bindungspartners von einem nicht an einen Analyten gebundenen Bindungspartner mit ein und können zum Beispiel unter Verwendung von Trägern zum Binden entweder des an den Analyten gebundenen Bindungspartners oder des nicht an den Analyten gebundenen Bindungspartners durchgeführt werden. Arnold et al., internationale Veröffentlichung Nr.
WO 88/06633 erläutert zum Beispiel die Verwendung von polykationischen Trägern, die in einem physikalischen Trennungsschritt, der Polynukleotide mit einschließt, verwendet werden können und erwähnt andere Träger, die für eine physikalische Trennung von Polynukleotiden verwendet werden können; und Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1988, beschreibt ein Sandwich-Assay, in dem ein an einen Träger gebundener Antikörper den Analyten bindet und der Analyt dann mittels eines anderen Antikörpers nachgewiesen wird, wobei ungebundene Kontaminanten vom festen Träger abgewaschen werden.
Beispiele für Assays, die auf homogene Art und Weise ausgeführt werden können, beinhalten Immunoassays, die im U.S. Patent Nr. 3,654,090, 3,817,837 und 4,190,496 beschrieben werden; Assays, die Chromophore mit Fluoreszenz/Quencher-Paaren verwenden, die in U.S. Patent Nr. 4,199,559, 4,174,384 und 4,318,707 beschrieben werden; Assays, die ein Konjugat verwenden, das von einer spezifischen Bindungspartnersubstanz gebildet wird, die an einen chemilumineszierenden Reaktanden gebunden ist, wobei die Aktivität des chemilumineszierenden Reaktanden durch eine Reaktion zwischen der spezifischen Bindungssubstanz im Konjugat und einem spezifischen Bindungsgegenstück, wie es von Boguslaski et al. U.S. Patent Nr. 4,383,031 beschrieben wird, beeinflusst wird; Assays, die eine Polarisationsfluoreszenz, wie in U.S. Patent Nr. 4,668,640 beschrieben wird, mit einschließen; Assays, die eine Doppelsonde verwenden, schließen eine mit einem Katalysator markierte erste Sonde und eine zweite Sonde, die einen Apolumineszer enthält, wie im U.S. Patent Nr. 4,670,379 beschrieben, mit ein; Assays, die ein Energieübertragungssystem, wie es in Elazar et al., Europäische Veröffentlichung Nr. 0 159 719 beschrieben wird, verwenden; Assays, die einen chemilumineszierenden Rest und einen Absorber/Emitterrest, wie er von Heller et al., Europäische Veröffentlichung Nr. 0 070 685 und Morrison et al., europäische Veröffentlichung Nr. 0 070 686 beschrieben wird, verwendet; und Assays, die einen Marker, wie er von Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,283,174, Nelson et al., „Detection of Acridiniumesters By Chemiluminescence" in: Nonisotopic DNA Probe Techniques, (Kricka ed., Academic Press, 1992) S. 275–311, Nelson et al., Clin. Chem. Acta 194: 73–90, 1990, und Arnold et al., Clin. Chem. 35: 1588– 1594, 1989, beschrieben wird, verwenden. EP-A-0 709 466 und 0 639 648 beschreiben signalverändernde Liganden, die eine Hydrolyse von nicht gebundenen signalverändernden Liganden zur Folge haben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Addukt-Schutz-Assay, das die Verwendung eines markierten Bindungspartners und eines signalverändernden Liganden mit einschließt. Der signalverändernde Ligand kann, verglichen mit seiner Fähigkeit das von einem Marker, der Teil eines Bindungspartner : Analytkomplexes ist, erzeugte Signal zu verändern, vorzugsweise die Fähigkeit des Markers, der nicht Teil eines Bindungspartner : Analyt-Komplexes ist, verändern, ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Die Anwesenheit oder Menge des Analyten kann durch Nachweisen des Signals, das von unveränderten Markern erzeugt wird, bestimmt werden. Der Addukt-Schutz-Assay ist sehr vielseitig. Zum Beispiel kann die Veränderung eines Signals bei eine große Auswahl von Bedingungen durchgeführt werden (z. B. pH, Temperatur und Ionenstärke) und sowohl die Veränderung des Markers als auch das Triggern des Signals können bei im Wesentlichen konstanten Temperaturen durchgeführt werden, um einen hohen Empfindlichkeitsgrad zu erzielen.
Der Addukt-Schutz-Assay wird mittels eines Bindungspartners mit einem Marker, der vorzugsweise getriggert werden kann, um eine nachweisbares Signal zu erzeugen, durchgeführt werden. Ein „nachweisbares Signal" bezieht sich auf eine durch den Marker verursachte Veränderung in der Umgebung, die gemessen werden kann. Beispiele für nachweisbare Signale beinhalten die Emission von Licht und Veränderungen in der Extinktion.
Mit „Triggern" ist gemeint, einen Marker dazu zu bringen, ein nachweisbares Signal zu erzeugen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Signalbildung durch einen Trigger-Wirkstoff verursacht. Verschiedene Arten von Trigger-Wirkstoffen können verwendet werden, um ein nachweisbares Signal von einem Marker zu erzeugen. Beispiele für Trigger-Wirkstoff/Marker-Paare beinhalten die folgenden: Substrat/Enzym oder Enzym/Substrat, die eine Veränderung der Extinktion verursachen; Wasserstoffperoxid/ chemilumineszierender Marker, der eine Lichtemission verursacht; und Licht/fluoreszierender Marker, der eine Lichtemission verursacht.
Bevorzugte Marker sind jene, die getriggert werden können, um Licht zu emittieren. Das Triggern einer lichtemittierenden Substanz verursacht die Bildung eines angeregten Molekülzustandes, der Licht emittiert.
Adduktbildung durch einen signalverändernden Liganden verändert und verhindert vorzugsweise eine Signalbildung durch den Marker. Ein „signalverändernder Ligand" bezieht sich auf eine Verbindung, die sich mit einem Marker verbinden kann, um ein Addukt zu bilden, dass die Signalbildung des Markers verändert. Vorzugsweise ist die Adduktbildung reversibel.
Eine „Veränderung der Signalbildung" bezieht sich auf eine Veränderung in der Art, Menge oder Kinetik eines von einem Marker erzeugten Signals. Das erzeugte Signal ist vorzugsweise eine Lichtemission und eine Veränderung der Lichtemission wird dadurch erzielt, dass man ein oder mehrere der folgenden bewirkt: (1) Lichtemission bei einer anderen Wellenlänge; (2) eine Verringerung in der Lichtemission; und (3) eine Veränderung der Kinetik der Lichtemission. Vorzugsweise verhindert eine Adduktbildung die Lichtemission.
Die Begriffe „bevorzugte Veränderung der Signalbildung" und „Unterscheidung" beziehen sich auf eine Veränderung der Signalbildung eines Markers, der auf einem nicht an einen Analyten gebundenen (ungebundener Marker) Bindungspartner vorhanden ist, die in einem größeren Umfang stattfindet, als die Veränderung der Signalbildung eines Markers, der auf einem an einen Analyten gebundenen (gebundener Marker) Bindungspartner vorhanden ist. Der Unterschied in der Signalbildung durch Marker, die auf gebundenen oder ungebundenen Bindungspartnern vorhanden sind, ist wesentlich, um einen Durchschnittsfachmann in die Lage zu versetzen, die Anwesenheit und/oder Menge eines Analyten nachzuweisen. Eine bevorzugte Veränderung der Signalbildung kann in Form einer differentiellen Veränderung des Verhältnisses, das als die Zeit ausgedrückt wird, in der die Hälfte des Signales, das von einem Marker, der auf einem an einen Analyten gebundenen Bindungspartner vorhanden ist, erzeugt wird, verändert wird (t_1/2 gebundener Marker), geteilt durch die Zeit, in der die Hälfte des Markers, der auf einem Bindungspartner, der nicht durch einen Analyten gebunden ist, vorhanden ist, verändert wird (t_1/2 ungebundener Marker).
Daher beschreibt ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Probe. Das Verfahren schließt die folgenden Schritte ein:

a) Aussetzen der Probe gegenüber einem markierten Bindungspartner;
b) Behandeln der Probe mit einem signalverändernden Liganden, der in der Lage ist vorzugsweise einen Marker, der auf einen Bindungspartner vorhanden ist, der nicht Teil eines markierten Bindungspartner : Analytkomplexes ist, zu verändern und;
c) Nachweisen des vom Marker erzeugten Signals, das nicht verändert worden ist.

Der Nachweis eines Signals, dass von einem nicht veränderten Marker erzeugt worden ist, kann durch Triggern des Markers zum Erzeugen eines Signals und Messen der Signalbildung, die nicht verändert worden ist, erzielt werden. Zum Beispiel kann die Anwesenheit eines lichtemittierenden Markers, der nicht durch einen Liganden verändert worden ist, durch Triggern des Markers mit Standardtechniken, um Licht zu emittieren und Messen der Kinetiken, Menge oder Wellenlänge der Lichtemission erzielt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Marker lichtemittierende Marker, wie z. B. fluoreszierende, chemilumineszierende und biolumineszierende Marker. Die Lichtemission kann unter Verwendung von Standardausrüstung, wie z. B. einem Luminometer oder Fluorometer, gemessen werden. Vorzugsweise wird eine bevorzugte Veränderung der Signalbildung und Lichtemission bei im Wesentlichen konstanter Temperatur durchgeführt. Eine im Wesentlichen „konstante Temperatur" beschreibt die Beibehaltung der Temperatur innerhalb eines Bereiches von nicht mehr als 250%, bevorzugter nicht mehr als 100, bevorzugter 25%, bevorzugter 10% und am meisten bevorzugt 5%. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform wird eine bevorzugte Markerveränderung und Triggern zur Lichtemission bei Raumtemperatur (etwa 20–25°C) bei im Wesentlichen konstanter Temperatur durchgeführt.
Der Addukt-Schutz-Assay kann unter Verwendung verschiedener Formate ausgeführt werden. Zum Beispiel kann der Assay mit oder ohne einen Trennungsschritt durchgeführt werden. Das Umgehen eines Trennungsschrittes vereinfacht das Assay, und daraus ergeben sich Vorteile, wie z. B. eine Einsparung an Zeit, Reagenzien und einer vereinfachten Automation.
Ein Trennungsschritt zum Entfernen eines nicht an einen Analyten oder Kontaminanten gebundenen markierten Bindungspartners, kann vor dem Triggern der Lichtemission durchgeführt werden. Ein Trennungsschritt wird bevorzugt, wenn der Assay an klinischen Proben, die nicht gereinigt worden sind, angewendet wird.
Folglich ermöglicht der beschriebene Assay, die Anwesenheit oder Menge eines Analyten, der bevorzugt eine Veränderung des Signals, das durch einen auf einem Bindungspartner vorhandenen Marker, der nicht an den Analyten gebunden ist, erzeugt wird, nachzuweisen, wobei sich das Signal, das durch einen Macker erzeugt wird, der auf einem an einen Analyten gebundenen Bindungspartner vorhanden ist, eindeutig nachweisen läßt. Die Vielseitigkeit des Assays hat zahlreiche nützliche Aspekte, welche die Fähigkeit Markerveränderungen innerhalb eines großen Bereiches von Pufferbedingungen durchzuführen, um eine hohe Empfindlichkeit zu erzielen, die Fähigkeit den Assay unter Verwendung von im Wesentlichen konstanter Temperatur durchzuführen, um schnell einen hohen Empfindlichkeitsgrad zu erzielen und die Fähigkeit, den Assay bei Raumtemperatur durchzuführen, um einen hohen Empfindlichkeitsgrad zu erzielen, mit einschließt. Die Vorteile eines solchen Assays beinhalten eine einfache Handhabung infolge von weniger Arbeitsschritten, einer Zeitersparnis und gegenüber einer Automation anpassungsfähiger zu sein.
Verschiedene Beispiele von unterschiedlichen Aspekten und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie z. B. unterschiedliche Markerstrukturen und signalverändernder Liganden werden hier beschrieben. Falls in den Ansprüchen nicht anders ausgeführt, sind diese hier dargestellten Beispiele und anderen Beispiele nicht dazu gedacht, die Erfindung zu begrenzen.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden durch die folgenden Abbildungen, einer detaillierten Beschreibung der Erfindung, und den Ansprüchen deutlich.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 stellt eine bevorzugte Veränderung der Signalbildung mittels Natriumsulfit und einer Acridiniumester-markierten Sonde graphisch dar.
2 stellt das Triggern der Lichtemission eines chemilumineszierenden Moleküls mittels Wasserstoffperoxid dar.
3 stellt der Addukt-Schutz-Assay unter Verwendung von zunehmenden Mengen des Targets dar.
4 und 5 stellen Beispiele für Bindungspartner, die einen mit einer Binderegion verbundenen Acridiniumester-Marker enthalten, dar. Die Bindungsregion wird in den Abbildungen durch „Sonde" gekennzeichnet.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Addukt-Schutz-Assay erleichtert den Nachweis eines Analyten dadurch, dass man die Adduktbildung ausnutzt, um die Signalbildung vorzugsweise von einem auf einem Bindungspartner vorhandenen Marker, der nicht an einen Analyten gebunden ist, zu verändern. Der Assay beinhaltet die Bildung einer geschützten Mikroumgebung, wenn der markierte Bindungspartner einen Komplex mit einem Analyten bildet. Der auf einem markierten Bindungspartner vorhandene Marker, der mit einem Analyten verbunden ist, wird vorzugsweise vor der Bildung eines Addukts mit einem signalveränderndem Liganden geschützt. Der Addukt-Schutz-Assay kann verwendet werden, um die Anwesenheit und/oder Menge eines Analyten bei einem hohen Empfindlichkeitsgrad schnell nachzuweisen.
Die Signalbildung als ein Hinweis auf die Anwesenheit und/oder Menge eines Analyten kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen werden, nachdem ein bevorzugter signalverändernder Schritt gestartet worden ist. In einer Ausführungsform wird die Signalbildung nach einer Zeit gemessen, die eine stabile Adduktbildung, z. B. im Gleichgewicht, erlaubt. Das Messen der Signalbildung, bei der eine Adduktbildung mit einem Marker, der auf gebundenen oder ungebundenen Bindungspartnern vorhanden ist, über eine gewisse Zeit relativ konstant ist, kann es erleichtern, reproduzierbare Ergebnisse über einen großen Zeitraum zu erhalten, und erlauben, zahlreiche Experimente gleichzeitig durchzuführen und die Ergebnisse zu einem späteren Zeitpunkt auszulesen.
In einer anderen Ausführungsform wird das Signal zu einem Zeitpunkt nach dem Triggern gemessen, wenn das Verhältnis des Signals, das durch einen Marker, der auf einem gebundenen Bindungspartner vorhanden ist, erzeugt wird, zum Signal, das durch einen Marker, der auf einem ungebundenen Partner vorhanden ist, erzeugt wird, maximiert wird. In dieser Hinsicht kann der Addukt-Schutz-Assay schneller ablaufen als hydrolytische Assays, bei denen Marker, die auf ungebundenen Bindungspartnern vorhanden sind, bevorzugt durch Abspalten der Abgangsgruppe verändert werden (siehe Beispiele 4 und 5 weiter unten). Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,284,174, Nelson et al., „Detection of Acridiniumesters By Chemiluminescence" in: Nonisotopic DNA Probe Techniques, (Kricka ed., Academic Press, 1992) S. 275–311, Nelson et al., Clin. Chem. Acta 194: 73–90, 1990 und Arnold et al., Clin. Chem. 35: 1588: 1594, 1989, beschreibt Assays, die bevorzugt bei einer bevorzugten hydrolytischen Spaltung eines Markers, der auf einem ungebundenen Bindungspartner vorhanden ist, durchgeführt werden.
Eine Adduktbildung, die mit einem auf gebundenen oder ungebundenen Bindungspartnern vorhandenen Marker stattfindet, wird in Gleichung 1 und 2 dargestellt, wobei „ungebundener Marker" sich auf einen Marker bezieht, der auf einem Bindungspartner vorhanden ist, der nicht mit einem Analyten komplexiert ist, „gebundener Marker" bezieht sich auf einen Marker, der auf einem Bindungspartner vorhanden ist, der mit einem Analyten komplexiert ist, „Ligand" bezieht sich auf einen signalverändernden Liganden, „Marker*" weist auf einen Marker hin, der getriggert werden kann, um ein Signal zu erzeugen und „Marker-Ligand" weist auf die Bildung eines signalverändernden Adduktes hin.
Formel 1
Ungebundener Marker* + Ligand = ungebundener Marker-Ligand
Formel 2
Gebundener Marker* + Ligand = gebundener Marker-Ligand
Eine bevorzugte Veränderung der Signalbildung wird durch die Unterschiede in K₁ und K₂ und der Rate, mit der die beiden Reaktionen das Gleichgewicht erreichen, beeinflusst. Eine höhere Gleichgewichtskonstante in der Formel 1 führt zu mehr auf ungebundenen Bindungspartner vorhandenen Marker, der im Gleichgewicht verändert wird. Eine niedrigere Gleichgewichtskonstante in der Formel 2 führt zu weniger auf gebundenem Bindungspartner vorhandenem Marker, der im Gleichgewicht verändert wird. Da die durch Formel 1 dargestellte Reaktion mit einer höheren Rate voranschreitet als die in Formel 2, wird vorzugsweise mehr auf ungebundenem Bindungspartner vorhandener Marker während der Anfangsreaktionen mit signalverändernden Liganden verändert.
Faktoren, welche vorzugsweise die Veränderung der Signalbildung beeinflussen, beinhalten die Menge und Art des Analyten, die Menge und Art des markierten Bindungspartners, die Menge und Art des Liganden und mögliche Wechselwirkungen mit anderen Komponenten, die während des Assays vorhanden sind. Daher sollten das Design und die Komponenten eines bestimmten Assays die Natur und Herkunft des Analyten, die Art des verwendeten signalverändernden Liganden, die Natur des markierten Bindungspartners, die Fähigkeit des Bindungspartners, mit dem Analyten zu komplexieren, um eine geschützte Mikroumgebung für den Marker zu bilden und die Umgebung, in der der Assay durchgeführt wird, berücksichtigt werden.
I. Empfindlichkeit
Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, die Anwesenheit eines Analyten mit einem hohen Empfindlichkeitsgrad nachzuweisen. Die Empfindlichkeit spiegelt die Fähigkeit eines Assays wieder, die Anwesenheit eines Analyten exakt nachzuweisen. Die Empfindlichkeit berücksichtigt den Hintergrund, der sich sowohl aus der Signalbildung eines an einen ungebundenen Bindungspartner vorhandenen Markers, der nicht verändert worden ist, als auch der Fähigkeit des signalverändernden Liganden zwischen einem Marker, der auf gebundenen und ungebundenen Bindungspartnern vorhanden ist, zu unterscheiden.
1 stellt die Beziehung zwischen bevorzugter Veränderung der Signalbildung und Hintergrund dar. Jede Kurve stellt das Triggern der Lichtemission in Anwesenheit eines signalverändernden Liganden dar. Die hybride Kurve bezieht sich auf gegen Signalveränderung geschützte gebundene Marker, während die Sonden-Kurve sich auf einen Marker bezieht, der auf einem ungebundenen Bindungspartner vorhanden ist. Die t_1/2-Werte zur Berechnung des differentiellen Verhältnisses der Veränderungen können aus der Steigung der zwei Kurven erhalten werden. Die Punkte, in denen die beiden Kurven abflachen, weisen darauf hin, dass das Gleichgewicht erreicht worden ist. Der Punkt, an dem die Sonden-Kurve abflacht, weist auch auf ein Hintergrundrauschen hin.
Für Oligonukleotidsonden, die dazu verwendet werden, Nukleinsäureanalyten nachzuweisen, wird das differentielle Verhältnis der Veränderungen durch Messen des t_1/2 des Hybrids geteilt durch den t_1/2 der markierten Sonde bestimmt. Vorzugsweise ist das differentielle Verhältnis der Veränderungen mindestens das 2-fache, bevorzugter mindestens das 15-fache, noch mehr bevorzugt mindestens das 75-fache und am meisten bevorzugt mindestens das 100-fache.
Der Assay wird vorzugsweise unter Bedingungen hoher Empfindlichkeit durchgeführt, in denen das erzeugte Signal gleich oder größer als der Mittelwert des Hintergrundes zuzüglich zweimal der Standardabweichung ist. Die Standardabweichung kann mittels Standardtechniken und Formeln wie folgt berechnet werden: Formel 3
wobei x der Probenmittelwert ist, x ein bestimmter Wert ist und n die Gesamtzahl der Messungen ist.
Der Assay wird vorzugsweise unter Bedingungen durchgeführt, bei denen das erzeugte Signal gleich oder größer ist als der Mittelwert des Hintergrundes zuzüglich dreimal der Standardabweichung, bevorzugter mindestens viermal die Standardabweichung und am meisten bevorzugt mindestens fünfmal die Standardabweichung.
II. Analyt
Der Addukt-Schutz-Assay kann verwendet werden, um die Anwesenheit und/oder Menge verschiedener Arten von Analyten, die Nukleinsäuresequenzen und antigenische Epitope beinhalten, nachzuweisen. Die Menge des in der Probe vorhandenen Analyten hängt von der zu untersuchenden Probe ab und davon, ob irgendeine Technik angewendet worden ist, um die Menge des Analyten vor dem Nachweis zu steigern. Zum Beispiel kann die Anzahl von Nukleinsäureanalyten mittels Techniken wie z. B. PCR (z. B. wie von Mullis et al., U.S. Patent Nr. 4,683,202 beschrieben) und auf Transkription basierender Amplifikation (z. B. wie durch Kacian et al., in U.S. Patent Nr. 5,399,491 beschrieben) gesteigert werden.
A. Nachweis von Targetnukleinsäuren
Der Nachweis einer Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Nukleinsäuresequenz, deren Nachweis oder Messung angestrebt wird) kann mittels einer Nukleinsäuresonde, die zur Target- Nukleinsäuresequenz hinreichend komplementär ist, durchgeführt werden, um die Sequenz von anderen Nukleinsäuresequenzen, die in der Probe vorhanden sein können, zu unterscheiden. Die Sondenspezifität wird durch zahlreiche im Stand der Technik bekannte Faktoren wie z. B. den Grad der Komplementarität zwischen der Sonde und den Target-Nukleinsäuresequenzen und den Hybridisierungsbedingungen beeinflusst. (z. B. siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und Hogan et al., internationale Veröffentlichung Nr. WO 88/03957, siehe oben).
B. Antigennachweis
Antikörper können dazu verwendet werden, um die Anwesenheit eines bestimmten, auf einem Antigen vorhandenen Epitops nachzuweisen. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, beschreibt die Herstellung und Verwendung von Antikörpern.
III. Markierter Bindungspartner
Markierte Bindungspartner umfassen einen Marker, der mit einem Bindungspartner verbunden ist. Die Binderegion ermöglicht dem Bindungspartner, an einen Analyten zu binden, während der Marker getriggert werden kann, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen.
Der Addukt-Schutz-Assay kann mit einer überschüssigen Menge eines markierten Bindungspartners oder einer überschüssigen Menge eines Analyten durchgeführt werden. Das Bereitstellen einer überschüssigen Menge eines markierten Bindungspartners bietet den Vorteil einer gesteigerten Empfindlichkeit bei niedrigen Analytkonzentrationen. Ein möglicher Nachteil beim Vorhandensein des Markers im Überschuss ist, dass mehr markierter Bindungspartner vorhanden ist, wodurch eine größere Menge des Liganden benötigt wird, um den Hintergrund zu reduzieren. Wegen der hohen Empfindlichkeit, die mit dem Addukt-Schutz-Assay erzielt werden kann, ist nichtsdestotrotz eine überschüssige Menge des markierten Bindungspartners zur Durchführung des Assays bevorzugt.
A. Marker
Der Addukt-Schutz-Assay kann unter Verwendung verschiedener Arten von Markern wie z. B. kolorimetrischen, biolumineszierenden, fluoreszierenden und chemilumineszierenden Markern durchgeführt werden. Faktoren, die bei der Selektion der Marker berücksichtigt werden müssen, beinhalten die folgenden: (1) der Marker sollte so ausgewählt werden, dass seine Fähigkeit getriggert zu werden, um ein Signal zu erzeugen, durch Adduktbildung verändert werden kann, (2) der Marker kann vor der Adduktbildung durch die geschützte Mikroumgebung, die beim Binden des Bindungspartners an den Analyten gebildet wird, geschützt werden und (3) der Marker hält den Bindungspartner nicht davon ab, den Analyten zu erkennen.
Beispiele für kolorimetrische Marker beinhalten Marker, die ein Enzym beinhalten, das sich mit einem Substrat verbinden kann, um ein Produkt zu erzeugen, das eine Veränderung in der Extinktion verursachen kann und Marker, die ein Substrat enthalten, das sich mit einem Enzym verbinden kann, um eine Veränderung in der Extinktion zu erzeugen. Zum Beispiel kann der signalverändernde Ligand das Signal des Enzym/Substrates durch Bildung eines Adduktes mit dem Enzym/Substrat verändern, wobei die enzymkatalysierte Reaktion verändert wird. Ein weiteres Beispiel sind Marker, die Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbieren, und diese Extinktion wird durch Reaktion mit einem Liganden verändert.
Die vorliegende Erfindung wird vorzugsweise mittels Nukleinsäuresonden, die einen lichtemittierenden Marker aufweisen, der von der Adduktbildung durch Hybridisierung einer Sonde mit einer Targetnukleinsäure geschützt wird, durchgeführt. Bevorzugte lichtemittierende Marker sind chemilumineszierend oder fluoreszierend. Chemilumineszierende Marker können durch eine chemische Reaktion wie z. B. Erhitzen und Oxidation getriggert werden, während Fluoreszenzmarker durch Licht getriggert werden. Marker, die zur Lichtemission veranlasst werden können, sind für gewöhnlich in der Lage, zu fluoreszieren, obwohl in einigen Fällen das Triggern eines „chemilumineszierenden" Markers durch Licht zu einer geringeren Lichtemission führen kann als Chemilumineszenz.
1. Chemilumineszierende Marker
Chemilumineszierende Marker werden getriggert, um Licht durch einen Trigger-Wirkstoff zu emittieren, der die Bildung eines Moleküls im angeregten Zustand zur Folge hat, der zerfällt, wobei Licht emittiert wird. Der Chemilumineszierende Marker kann eine mit einem chemilumineszierenden Molekül verbundene Abgangsgruppe enthalten, die während der chemischen Reaktion abgespalten wird und dabei Licht emittiert. Der Chemilumineszierende Marker kann alternativ dazu keine Abgangsggruppe enthalten, die während des Triggerns der Lichtemission abgespalten wird. Beispiele für Chemilumineszierende Moleküle mit einer Abgangsgruppe, die während des Triggerns der Lichtemission abgespalten werden können, werden weiter unten stehend beschrieben. Beispiele für Chemilumineszierende Moleküle, die keine Abgangsgruppe besitzen, die während des Triggerns abgespalten werden kann, beinhalten Dioxetane, Oxalate, Dioxetanone und Rhuteniumchelate. Beispiele für unterschiedliche Arten von chemilumineszierenden Molekülen werden aufgeführt in Campbell, Chemiluminescence: Principles and Application in Biology and Medicine, Ellis Horwood Ldt. Chichester England, 1988.
2 stellt die lichtemittierende Reaktion eines chemilumineszierenden Markers unter Verwendung von Wasserstoffperoxid als Trigger-Wirkstoff dar. Vorteilhafte Bedingungen zum Triggern eines chemilumineszierenden Markers und Verfahren zum Nachweis von emittiertem Licht sind im Stand der Technik bekannt. Z. B. siehe Nelson et al., „Detection of Acridiniumesters By Chemiluminescence" siehe oben, und Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,283,174, siehe oben.
Beispiele für chemilumineszierende Marker, die Herstellung solcher Marker, das Verbinden der Marker mit Bindungspartnern und Faktoren, die für gewöhnlich die Stabilität von chemilumineszierenden Markern beeinflussen, sind im Stand der Technik bekannt. Siehe Beheshti et al., U.S. Patent Nr. 5,290,936; Campbell et al., U.S. Patent Nr. 4,946,958; Law et al., U.S. Patent Nr. 4,918,192, 4,745,181, 5,110,932 und 5,241,070; Mattingly et al., mit dem Titel "Chemiluminscent Acridinium and Phenantridinium Salts", europäische Veröffentlichung Nr. 0 273 115; McCapra et al., U.S. Patent Nr. 5,281,712; McCapra, U.S. Patent Nr. 5,283,334; McCapra et al., U.S. Patent Nr. 5,284,951; McCapra et al., U.S. Patent Nr. 5,321,136; McCapra et al., mit dem Titel „Assays Utilizing Improved Chemiluminescent Esters, Thioesters and Amides", europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 322 926; Ramakrishnan et al., U.S. Patent Nr. 5,284,952; Reddy et al., mit dem Titel „Chemiluminescent Compounds", internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/09580; Sato et al., mit dem Titel "Acridinium Compounds and Conjugates Thereof", europäische Veröffentlichung Nr. 0 609 885; und Sheehan et al., U.S. Patent Nr. 3,539,574. Diese Faktoren beinhalten die Struktur der chemilumineszierenden Moleküle, die Art und Position der Substituenten an dem chemilumineszierenden Molekül Lind an der Abgangsgruppe und die Struktur der verbindenden Gruppe, die eine Abgangsgruppe mit einem chemilumineszierenden Molekül verbindet. Zum Beispiel können verschiedene Arten von Verbindungsgruppen, die Ester, Amide, Thiolester und Sulfonylamide beinhalten, vorhanden sein; die Stabilität der chemilumineszierenden Moleküle kann durch die Platzierung von sperrigen Gruppen und Elektronen-anziehenden oder abgebenden Gruppen an bestimmte Positionen beeinflusst werden; und bevorzugte Ausgangsgruppen für eine wirksame Chemilumineszenz haben einen pK_a ≤ 11, bevorzugter < 11, noch bevorzugter 5 bis 8 und bestehen noch bevorzugter aus einem Arylring oder einem Ringsystem.
Aizawa et al., mit dem Titel „Method of Making Acridinium Derivatives. Luminescence and Method of Detecting Test Material Therewith", europäische Veröffentlichung Nr. 0 617 107 A1, beschreibt die Herstellung und Verwendung eines Superoxidanions (O^2–) zum Triggern der Lichtemission von Acridiniumderivaten. Die von Aizawa et al. beschriebenen Verfahren lassen erkennen, dass sie für eine Signalbildung bei neutralem pH geeignet sind.
Bevorzugte chemilumineszierende Marker beinhalten ein chemilumineszierendes Molekül mit einem Aryl-Ringsystem und einer Ausgangsgruppe. Das Aryl-Ringsystem hat vorzugsweise 1 bis 4 Aryl-Gruppen und enthält eine positive Ladung (z. B. die positive Ladung ist entweder durch ihre Lokalisierung auf einem Ring oder durch ihre Lokalisierung auf einem Ringsubstituenten vorhanden). Vorzugsweise enthält das positiv geladene Aryl-Ringsystem einen substituierten heterozyklischen Aryl.
Noch mehr bevorzugte chemilumineszierende Moleküle mit einer Ausgangsgruppe haben die folgende Struktur: Struktur I
wobei das Aryl-Ringsystem 1 bis 4 zyklische Gruppen umfasst und eine der Gruppen an den verbindenden Kohlenstoff „C" gebunden ist, vorzugsweise ist das Aryl-Ringsystem positiv geladen, vorzugsweise enthält das Aryl-Ringsystem einen positiv geladenen, mit „C" verbundenen Aryl; Beispiele für heterozyklische Aryle beinhalten Acridinium, Benz[a]acridinium, Benz[b]acridinium, Benz[c]acridinium, ein Benzimidazolkation, Chinolinium, Isochinolinium, Chinolizinium, zyklisch substituiertes Chinolinium, Pyridinium, Pyrimidinium, Pyridazinium, Pyrazininium, Phenathridinium und Chinozalinium; R₂ wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus S, Ound NH besteht, vorzugsweise ist R₂ O;
R₃ wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus O, N, S, Halogen, substituiertem Phosphor, substituiertem Schwefel, substituiertem Bor und substituiertem Arsen besteht, bevorzugt ist R₃ entweder O, N oder S, noch bevorzugter ist R₃ O oder S, am meisten bevorzugt ist R₃ O;
R₄ wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus Alkyl, Alkenyl, Aryl, Alkoxyl und Aryloxyl besteht oder ist nicht vorhanden, wenn R₃ ein Halogen ist, R₄ ist bevorzugt ein Aryl, noch bevorzugter ist R₄ wahlweise ein substituiertes Phenyl; und
R₅ steht für nichts, wenn nicht R₃ N ist, wenn R₃ N ist, dann wird R₅ aus der Gruppe ausgewählt, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Aryl, Alkoxyl und Aryloxyl besteht, bevorzugt steht R₅ für nichts.
Positiv geladene Verbindungen der Struktur I sind mit einem Gegenion ionisch verbunden. Zahlreiche verschiedene Anionen wie z. B. ein Halogen, Sulfat, Alkylsulfat, Halosulfat, Halobor, Haloacetat, Halophosphat und Phosphat können als Gegenion dienen.
Vorzugsweise besteht ein chemilumineszierender Marker aus einem Acridinium, das an seine Abgangsgruppe gebunden ist, wie es in Struktur II dargestellt wird. Struktur II
wobei R₁ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus H, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl und Aryl besteht; R₁ ist bevorzugt ein niederes Alkyl, noch bevorzugter Methyl;
n ist entweder 0, 1, 2, 3 oder 4, vorzugsweise ist n entweder 0, 1 oder 2,
m ist entweder 0, 1, 2, 3 oder 4; vorzugsweise ist m entweder 0, 1 oder 2;
jedes X wird unabhängig aus der Gruppe ausgewählt, die aus Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Amino, substituiertem Amino, Carboxyl, Hydroxyl, Alkoxyl, Nitro, Sulfonyl, Halogen, Thiol, Amido, Acetyl, substituiertem Acetyl und Aryloxyl besteht und die verbleibenden A-Ring-Substituenten sind Wasserstoff, vorzugsweise ist jedes X unabhängig ein Alkyl oder ein Alkoxyl, noch mehr bevorzugt ist jedes X ein niederes Alkyl oder ein niederes Alkoxyl, am meisten bevorzugt ist jedes X unabhängig Methyl oder Methoxyl;
jedes Y wird unabhängig aus der Gruppe ausgewählt, die aus Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Amino, substituiertem Amino, Carboxyl, Hydroxyl, Alkoxyl, Nitro, Sulfonyl, Halogen, Thiol und Aryloxyl besteht, und die verbleibenden C-Ring-Substituenten sind Wasserstoff, bevorzugt ist jedes Y unabhängig ein Alkyl oder ein Alkoxyl, noch mehr bevorzugt ist jedes Y ein niederes Alkyl oder ein niederes Alkoxyl und am meisten bevorzugt ist jedes Y unabhängig Methyl oder Methoxyl; und
R₂, R₃, R₄ und R₅ werden wie oben beschrieben für eine Verbindung der Struktur I definiert.
Andere bevorzugtere mit Ausgangsgruppen verbundene chemilumineszierende Moleküle haben ein heterozyklisches Ringsystem, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: Benz[a]acridinium, Benz[b]acridinium, Benz[c]acridinium, einem Benzimidazolkation, Chinolinium, Isochinolinium, Chinolizinium, zyklisch substituiertem Chinolinium, Pyridinium, Pyrimidinium, Pyridazinium, Pyrazininium, Phenathridinium und Chinozalinium; wobei jeder Ring des Ringsystems in gleicher Weise substituiert ist wie eine Verbindung der Struktur II, wobei jedes zugängliche Kohlenstoffatom jeweils unabhängig einen X/Y-Substituenten haben kann, noch bevorzugter enthält jeder Ring 0 bis 2 Substituenten, und einer der Ringe ist ein positiv geladener heterozyklischer Ring, der ein mit R₁ verbundenes N und ein mit einer Verbindungsgruppe verbundenes Kohlenstoffatom enthält.
2. Fluoreszierende Marker
Fluoreszierende Marker enthalten für gewöhnlich eine aromatische Gruppe, die durch Licht angeregt werden kann, um einen angeregten Molekülzustand zu erzeugen. Das Binden des signalverändernden Liganden kann die Fluoreszenz verändern. Wie oben beschrieben können chemilumineszierende Marker, wie z. B. Acridiniumester, auch fluoreszierende Marker sein. Daher beinhalten Beispiele für fluoreszierende Marker solche Marker, die in Abschnitt III.A.1 siehe oben, als chemilumineszierend beschrieben worden sind. Beispiele für fluoreszierende Marker beinhalten auch Intercalate oder Furchen-Binder (groove binder) wie z. B. Rhodamin, Fluoreszein, Ruthenium, Ethidiumhalogenide und Acridin.
Bevorzugte fluoreszierende Marker haben ein konjugiertes pi Elektronensystem, vorzugsweise einen aromatischen Ring. Fluoreszenz vom aromatischen Ring kann durch Zerstören der Aromatizität des aromatischen Ringes, z. B. durch Adduktbildung, verändert werden.
3. Chemische Definitionen
Es folgt eine Beschreibung einiger chemischer Gruppen, die in den verschiedenen Markern vorhanden sein können. Die verschiedenen, hier bereitgestellten, grundlegenden chemischen Strukturen können durch verschiedene Gruppen substituiert werden. Substitutionen jeder der unten beschriebenen verschiedenen Gruppen können mit einem Atom oder mit Atomen, die nicht reaktiv sind, vorgenommen werden (d. h. reagiert nicht mit dem Analyten, verhindert eine signalverändernde Adduktbildung oder verhindert eine Signalbildung). Beispiele für Substitutionen an der Grundstruktur werden ebenfalls unten dargestellt.
Ein „Acetyl" bezieht sich auf C(=O)-CH₃.
Ein „Amino" bezieht sich auf -NH₂.
Ein „Amido" bezieht sich auf C(=O)-NH₂.
Eine „Alkyl"-Gruppe bezieht sich auf einen optional substituierten, gesättigten, aliphatischen Kohlenwasserstoff, der eine gerade Kette, eine verzweigte Kette und zyklische Alkylgruppen beinhaltet. Die Alkylgruppe hat bevorzugt 1 bis 25 Kohlenstoffatome und enthält nicht mehr als 20 Heteroatome. Noch bevorzugter ist es ein niederes Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Heteroatome werden bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Sauerstoff besteht.
Eine „Alkenyl"-Gruppe bezieht sich auf einen optional substituierten Kohlenwasserstoff, der mindestens eine Doppelbindung enthält, wobei es eine gerade Kette, eine verzweigte Kette und zyklische Alkenylgruppen beinhaltet, von denen alle optional substituiert sein können. Die Alkenylgruppe hat bevorzugt 2 bis 25 Kohlenstoffatome und enthält nicht mehr als 20 Heteroatome. Noch bevorzugter ist es ein niederes Alkenyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Heteroatome werden bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Sauerstoff besteht.
Eine „Alkynyl"-Gruppe bezieht sich auf einen optional substituierten, ungesättigten Kohlenwasserstoff, der mindestens eine Dreifachbindung enthält, wobei es eine gerade Kette, verzweigte Kette und zyklische Alkenylgruppen, von denen alle optional substituiert sein können. Die Alkenylgruppe hat bevorzugt 2 bis 25 Kohlenstoffatome und enthält nicht mehr als 20 Heteroatome. Noch bevorzugter ist es ein niederes Alkenyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Heteroatome werden bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Sauerstoff besteht.
Ein „Aryl" bezieht sich auf eine optional substituierte aromatische Gruppe, die mindestens einen Ring mit einem konjugierten pi Elektronensystem hat und isozyklisches Aryl, heterozyklisches Aryl, Biaryl und TriAryl-Gruppen beinhaltet. Beispiele für Substituenten einer Arylsubstitution beinhalten Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Amino, substituiertes Amino, Carboxyl, Hydroxyl, Alkoxyl, Nitro, Sulfonyl, Halogen, Thiol und Aryloxyl.
Ein „isozyklisches Aryl" bezieht sich auf ein Aryl, in dem alle Atome im aromatischen Ring Kohlenstoffatome sind. Die Kohlenstoffatome sind, wie bereits oben für ein Aryl beschrieben, optional substituiert. Das isozyklische Aryl ist bevorzugt ein optional substituiertes Phenyl.
Ein „heterozyklisches Aryl" bezieht sich auf ein Aryl, das im aromatischen Ring 1 bis 3 Heteroatome als Ringatome aufweist und bei dem die Reste der Ringatome Kohlenstoffatome sind. Geeignete Heteroatome beinhalten Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff. Beispiele für heterozyklische Aryle beinhalten Furanyl, Thienyl, Pyridyl, Pyrrolyl, N-niedere Alkylpyrrolo, Pyrimidyl, Pyrazinyl und Imidazolyl. Das heterozyklische Aryl ist, wie oben bereits für ein Aryl beschrieben, optional substituiert.
Ein „Alkoxyl" bezieht sich auf „-O-Alkyl", wobei „Alkyl" wie bereits oben beschrieben definiert wird und „O" ein Sauerstoff ist. Das Alkoxyl ist bevorzugt ein O-niederes Alkyl.
Ein „Aryloxyl" bezieht sich auf ein „-O-Aryl", wobei das „Aryl" wie oben beschrieben definiert wird und „O" ein Sauerstoff ist.
„Nitro" bezieht sich auf NO₂.
„Sulfonyl" bezieht sich auf S(O)₂-R, wobei R ein nicht reaktives Atom oder Atome ist. Beispiele für R beinhalten Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Halogen, Amino und substituiertes Amino.
Ein „substituiertes Acetyl" bezieht sich auf C(=O)-CH(R)₂, wobei jedes R jedes nichtreaktive chemische Atom oder Atome ist, vorausgesetzt, dass zumindest ein R kein Wasserstoff ist. Beispiele für solche Substitutionen beinhalten Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Amino, Carboxyl und Alkoxyl.
Ein „substituiertes Amino" bezieht sich auf -NH-R, wobei R jedes nichtreaktive chemische Atom oder Atome ist. Beispiele für solche Substitutionen beinhalten Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Amino, Carboxyl und Alkoxyl.
Ein „substituiertes Phosphor" bezieht sich auf -P(R)₃, wobei jedes R jedes nichtreaktive chemische Atom oder Atome ist. Beispiele für R beinhalten O, =O, S, CH₃, Se und As.
Ein „substituierter Schwefel" bezieht sich auf die Anwesenheit eines jeden Atoms oder Atome, das nicht Wasserstoff ist, das einer chemischen Stöchiometrie gehorcht und nicht reaktiv ist.
Ein „substituiertes Bor" bezieht sich auf die Anwesenheit eines jeden Atoms oder Atome, das nicht Wasserstoff ist, das einer chemischen Stöchiometrie gehorcht und nicht reaktiv ist.
Ein „substituiertes Arsen" bezieht sich auf die Anwesenheit eines jeden Atoms oder Atome, das nicht Wasserstoff ist, das einer chemischen Stöchiometrie gehorcht und nicht reaktiv ist.
B. Binderegion
Eine Binderegion ist so gestaltet, einen Teil des Analyten wiederzuerkennen und die Bildung einer Mikroumgebung mit einem Analyten zu ermöglichen, der den Marker vor einer Signalveränderung durch Adduktbildung schützt. Die Binderegion enthält bevorzugt eine Nukleinsäuresequenz, die zu einem gewissen Grade zu einer Target-Nukleinsäuresequenz komplementär ist. Zum Beispiel kann eine Oligonukleotidsonde so gestaltet sein, um spezifisch mit einer Target-Nukleinsäuresequenz, die für einen bestimmten Mikroorganismus charakteristisch ist, zu hybridisieren. Auf der anderen Seite kann eine Hybridisierungssonde ohne einen hohen Spezifitätsgrad in verschiedenen Assays verwendet werden. Beispiele für Anwendungen, in denen ein hoher Spezifitätsgrad der Sonde nicht erforderlich ist, beinhalten die, in denen die Sonde so gestaltet ist, um an mehr als eine verwandte Sequenz zu hybridisieren und in denen die Target-Nukleinsäuresequenz von Kontaminanten separiert ist. Eine Targetnukleinsäure kann z. B. unter Verwendung einer Einfangsonde (z. B. siehe Collins mit dem Titel „Target and Background Capture Methods and Apparatus for Affinity Assays", europäische Veröffentlichung Nr. 0 265 244 B1) von Kontaminanten abgetrennt werden.
Ein anderes Beispiel für eine Binderegion ist eine Antikörper-Epitop-Bindedomäne. Antikörper können dazu verwendet werden, um die Anwesenheit eines bestimmten Epitops, das auf einem Antigen vorhanden ist, nachzuweisen. Zum Beispiel können Antikörper dazu verwendet werden, um bestimmte Antigenproteine nachzuweisen. Harlow et al., Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, beschreibt die Herstellung und Verwendung von Antikörpern.
C. Synthese eines markierten Bindungspartnes
Bindungspartner, die Marker enthalten, können mittels Standardtechniken hergestellt werden. Insgesamt sollte. der Marker eine Struktur aufweisen, die es ihm erlaubt, in der geschützten Mikro-Umgebung, die durch Binden des Bindungspartners an den Analyten gebildet wird, präsent zu sein, während zur gleichen Zeit einem Trigger-Wirkstoff ermöglicht wird, eine Signalbildung zu verursachen. Wenn z. B. die Lichtemission von chemilumineszierenden Molekülen durch oxidativen Angriff getriggert wird, sollte die Verknüpfungsgruppe gegenüber einem oxidativen Angriff empfänglich bleiben, wenn sie in der Mikroumgebung präsent ist.
Der Marker sollte den Bindungspartner nicht davon abhalten, an den Analyten zu binden und daran, den Analyten von den Kontaminanten zu unterscheiden. Zum Beispiel sollte die Fähigkeit einer markierten Nukleinsäuresonde, auf die Anwesenheit eines bestimmten Organismus hinzuweisen, bestehen bleiben.
Nukleinsäuresonden mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz und Basenzusammensetzung können mittels Standardtechniken konstruiert werden. Eine Modifikation der Basenzusammensetzung kann z. B. durchgeführt werden, um die Stabilität des Oligonukleotids durch Alkylierung der 2'-O-Position (z. B. eine 2'-Methoxylgruppe) zu erhöhen (siehe Miller et al., mit dem Titel „Oligonucleotides Modified to Improve Stability at Acid pH", internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/15619. Organische Synthesen von Oligonukleotiden können durch schrittweise Zugabe der Nukleotide durchgeführt werden. Eckstein, F., Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach, Kapitel 1–5, 1991, Reviews organic synthesis of oligonucleotides: Caruthers et al., in Methods In Enzymology Vol. l54, 5.287 (1987) beschreibt ein Verfahren zur organischen Synthese von Oligonukleotiden, die Phosphodiester-Bindungen enthalten mittels Standard-Phosphoramidit-Festphasenchemie; Bhatt, U.S. Patent Nr. 5,252,723 beschreibt ein Verfahren zur organischen Synthese von Oligonukleotiden, die Phosphortioatbindungen enthalten; und Klem et al., mit dem Titel „Improved Process for the Synthesis fo Oligomers", internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/07864 beschreibt eine organische Synthese von Oligonukleotiden, die verschiedene Internukleotidbindungen, die Methylphosphonatbindungen beinhalten, aufweisen.
Ein Marker kann an einen Nukleinsäurebindungspartner unter Verwendung von Techniken, wie denen, die von Arnold et al., mit dem Titel „Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes", europäische Veröffentlichung Nr. 0 313 219; Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,185,439 und Nelson et al., „Detection Of Acridiniumesters By Chemiluminescence" in: Nonisotopic DNA Probe Techniques, (Kricka ed., Academic Press, 1992) S. 275–311 beschrieben werden. Diese Dokumente konzentrieren sich auf die Herstellung eines Bindungspartners, der einen Acridiniumester an eine Nukleinsäurebinderegion bindet. Jedoch können analoge Techniken verwendet werden, um andere Marker an andere Bindungspartner zu binden. (Zusätzliche Dokumente zur Herstellung von Bindungspartnern, die an Marker gebunden sind, werden in Abschnitt III.A.1 erwähnt, siehe oben).
Lichtemittierende Moleküle können mittels Techniken wie denen, die von Weeks et al., Immunoassays using Acridiniumesters, Methods Enzymol 133: 366–368 (1986) und in Dokumenten beschrieben werden, die in Abschnitt III.A.1 siehe oben erwähnt werden und die sich mit dem Binden von lichtemittierenden Markern an Antikörper beschäftigen, gebunden werden. Antikörper können mittels Standardtechniken z. B. solchen, die von Harlow et al., siehe oben, beschrieben werden, hergestellt werden.
IV. Signalverändernde Liganden
Signalverändernde Liganden, die für den Addukt-Schutz-Assay geeignet sind, können zwischen einem Marker, der auf einem ungebundenen Bindungspartner vorhanden ist und einem Marker, der auf einem an einen Analyten gebundenen Bindungspartner vorhanden ist, unterscheiden. Die Menge des Liganden, die in einem Assay verwendet wird, kann den Assay auf verschiedene Arten beeinflussen. Zum Beispiel kann das Bereitstellen von mehr Liganden die Anzahl der veränderten Marker, die auf gebundenen und ungebundenen Bindungspartnern vorhanden sind, erhöhen.
Bevorzugte Liganden sind solche, die mit einem auf einem ungebundenen Bindungspartner vorhandenen Marker schnell reagieren, und/oder die eine hohe Gleichgewichtskonstante in der Formel 1 aufweisen, während sie mit Markern, die auf einem an einen Analyten gebundenen Bindungspartner vorhanden sind, sehr langsam reagieren, und/oder die eine niedrige Gleichgewichtskonstante in der Formel 2 aufweisen. Noch bevorzugter reagiert der signalverändernde Ligand sehr schnell mit einem Marker, der auf einem nicht an einen Analyten gebundenen Bindungspartner vorhanden ist, der eine hohe Gleichgewichtskonstante in der Formel 1 aufweist und mit einem auf einem gebundenem Bindungspartner vorhandenen Marker, der eine niedrige Gleichgewichtskonstante in der Formel 2 aufweist, langsam reagiert.
Bevorzugte signalverändernde Liganden sind Nukleophile, die in der Lage sind, zwischen Markern, die auf gebundenen und ungebundenen Bindungspartnern vorhanden sind, unter Assay-Bedingungen zu unterscheiden und die ein starkes Addukt mit einem Marker, der auf einem ungebundenen Bindungspartner vorhanden ist, bilden. Im Falle von bevorzugten lichtemittierenden Markern mit einer Verbindungsgruppe, die mit einer Ausgangsgruppe verbunden ist, sollte z. B. das gebildete Addukt die Verbindungsgruppe davon abhalten, durch oxidative Wirkstoffe wie z. B. Wasserstoffperoxid und einem Superoxidion oxidiert zu werden. Arnold et al., U.S. Patent Nr. 4,950,613 und Hammond et al., J. Biolumin. Chemilumin. 6: 35–43, 1991, beschreiben Liganden, die in der Lage sind, ein schützendes Addukt mit einem Acridiniumester zu bilden, wodurch ein Lichtemission verhindert wird.
Bevorzugte Liganden haben ein einsames Elektronenpaar, die es dem Liganden erlauben, als ein starkes Nukleophil zu fungieren. Noch bevorzugter ist das einsame Elektronenpaar an einem Gruppe VI Element vorhanden, am meisten bevorzugt ist das Element Schwefel. Vorzugsweise ist das Element, welches das einsame Elektronenpaar enthält, nicht mit einem konjugierten pi-Elektronensystem oder einer Nitrilgruppe benachbart. Das Element beispielsweise, das das einsame Elektronenpaar enthält, sollte nicht einem aromatischen Ring benachbart sein. Beispiele für geeignete signalverändernde Liganden beinhalten Tetrahydrothiophen, Propanthiol, Benzylmercaptan, Sulfit, Glycolsulfit, Hydrogensulfit, Metabisulfit, Thiosulfat, Thiophosphat, Metaarsenit, Tellurit, Arsenit und Thiocyanat.
V. Nachweis von Nukleinsäure-Target-Sequenzen
Der Addukt-Schutz-Assay wird bevorzugt mittels einer Nukleinsäuresonde durchgeführt, um die Anwesenheit einer Target-Nukleinsäuresequenz nachzuweisen. Der durch eine markierte Sonde : Target-Hybrid verliehene Schutzgrad für einen Marker wird durch Faktoren beeinflusst, welche die Art der vorhandenen Nukleotidbasen und der Nukleotidsequenzen der Sonde und des Hybrids mit einschließen.
Der Addukt-Schutz-Assay kann verwendet werden, um verschiedene Nukleinsäure-Targets wie z. B. DNA und RNA nachzuweisen. Der Assay wird bevorzugt unter Verwendung von RNA-Targets ausgeführt. Verfahren zur Herstellung von RNA und zum Amplifizieren von RNA-Targets, die mit einer DNA starten, oder zur Amplifizierung von RNA-Targets, die mit einer RNA starten, sind im Stand der Technik bekannt, z. B. Kacian et al., U.S. Patent Nr. 5,399,491.
VI. Beispiele
Weiter unten werden Beispiele gegeben, um verschiedene Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen. Diese Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung unter Verwendung von Acridiniumestern als Marker. Acridiniumester wie viele kationische heteroaromatische Arten reagieren reversibel mit Nukleophilen, um Addukte zu bilden. Eines der Ergebnisse der Adduktbildung ist, dass zahlreiche wichtige Eigenschaften des Acridiniumesters deutlich verändert werden. Die bevorzugte Stelle zur Adduktbildung an einem Acridiniumester ist die C-9 Position. Eine Adduktbildung verändert das sichtbare Spektrum des Acridiniumesters, inhibiert stark die Acridiniumester-Fluoreszenz, stabilisiert die Esterbindung des Acridiniumesters gegen eine Hydrolyse und inhibiert die Reaktion eines Trigger-Wirkstoffes, wie z. B. einem Peroxidion oder einem Superoxidion, mit einem Acridiniumester zur Erzeugung von Chemilumineszenz.
Diese Beispiele sind in keinem Fall dazu gedacht, die offenbarte Erfindung einzuschränken. Die Beispiele stellen die Methodologie dar, durch die verschiedene Marker und signalverändernde Liganden durch Routineverfahren ohne weiteres identifiziert werden können, um sicherzustellen, dass sie die gewünschte Aktivität aufweisen. Zum Beispiel können Marker aus der hier beschriebenen Herstellungsvorschrift untersucht werden, um solche Marker mit der geeignetsten Aktivität zu bestimmen.
Beispiel 1: Bevorzugte Unterscheidung eines Markers auf gebundenen und ungebundenen Bindungspartnern
Bei Verbindungen, die Schwefelatome mit einem freien Elektronenpaar enthalten, die nicht mit einem aromatischen Ring oder einer Nitrilgruppe konjugiert sind, stellte sich heraus, dass sie starke Addukte mit Acridiniumester markierten Einzelstrangsonden, jedoch nicht mit den gleichen Sonden, die an einen Target-Nukleinsäureanalyten hybridisiert sind, bilden. Dieses Beispiel stellt die Verwendung eines signalverändernden Liganden dar, um vorzugsweise einen Marker zu verändern, der auf einem ungebundenen Bindungspartner vorhanden ist.
Hybridisierung
Zu 15 μl eines 2 × Hybridisierungspuffers (100 mM Lithiumsuccinat (pH 5.2), 8.5% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 1.5 mM EDTA, 1.5 mM EGTA) wurde 1 pmol der Acridiniumester(AE)-markierten Sonde (7 × 10⁷ RLU/pmol) und 4 pmol des Targets gegeben. Die AE-markierte Sondensequenz wird dargestellt durch SEQ. ID. Nr. 1: 5'-GGGGTTCTT*T TCGCCTTTCC CTCACGG, wobei das * auf die Position des Acridiniumester-Markers hinweist. Die Targetsequenz wird dargestellt durch SEQ. ID. Nr. 2: 5'-CCGTGAGGGA AAGGCGAAAA GAACCCC.
Die sich daraus ergebende Lösung wurde mit Wasser auf 30 μl eingestellt, bei 60°C für 30 Minuten erhitzt und auf 500 μl mit einem 1 × Hybridisierungspuffer verdünnt.
Adduktschutz
In ein 12 × 75 mm Reaktionsröhrchen (Sarstedt) wurden 2 μl der AE-markierten Sonde oder des Hybrids (400,000 RLU) gegeben. Zu dieser Lösung wurden 100 μl eines Addukt-Bildungspuffers (10 mM Natriumsulfit, 30 mM Boratpuffer (pH 8.7), 1.5% Triton (TX100) gegeben. Die Lösung wurde dann geschüttelt und für unterschiedliche Zeitabschnitte bei Raumtemperatur (ca. 22–25°C) stehen gelassen. Die Chemilumineszenz der sich daraus ergebenden Lösung wurde durch Injektion von Nachweisreagenz I (0.1% (v/v) H₂O₂ in 0.001 N NHNO₃), 0.5–2 Sekunden später gefolgt durch eine Injektion von Nachweisreagenz II (200 μl von 1 N NaOH) gemessen. Die Lichtemission wurde über einen Zeitabschnitt von 5 Sekunden integriert.
Ergebnisse
Wie in 1 dargestellt, reagiert Natriumsulfit sehr schnell mit der AE-Sonde, und nach 150 Sekunden erreicht die Reaktion ihr Gleichgewicht. Wenn hingegen die gleiche AE-Sonde mit einer komplementären Target-Nukleinsäure hybridisiert, reagiert das sich daraus ergebenden AE-Hybrid viel langsamer mit Natriumsulfit.
Bei niedrigeren Konzentrationen von Natriumsulfit bildet sich weniger Addukt mit Acridiniumester, jedoch ist die Adduktbildung immer noch stärker und schneller bei einer AE-Sonde gegen ein AE-Hybrid. Bei höheren Konzentrationen von Natriumsulfit (200 mM) bildet sich mehr Addukt mit dem Acridiniumester, jedoch wird der Unterschied zwischen AE-Sonde und AE-Hybrid verringert.
Beispiel 2: Nachweis einer Targetsequenz
Die Fähigkeit des Nachweises der Anwesenheit einer Target-Sequenz durch das Addukt-Schutz-Assays wurde mittels eines großen Überschusses einer Acridiniumester-markierten Sonde und fallenden Mengen des komplementären Targets untersucht.
Hybridisierung
Zu 20 μl eines Hybridisierungspuffers wurden unterschiedliche Mengen des Targets und 0.05 pmol der Sonde gegeben. Die AE-markierte Sonden-Sequenz wird dargestellt durch SEQ. ID. Nr. 3: 5'- ATCATCCATG TATTGAT*AGA TAACTATGTC TGG, wobei das * auf die Position des Acridiniumester-Markers hinweist. Die Targetsequenz wird dargestellt durch SEQ. ID. Nr. 4: 5'-CCAGACATAG TTATCTATCA ATACATGGAT GAT. Die sich daraus ergebende Lösung wurde dann bei 60°C für 30 Minuten erhitzt.
Adduktionsschutz
In ein 12 × 75 mm Reaktionsröhrchen (Sarstedt) wurden 200 μl einer Lösung zur Bildung eines Adduktes (60 mM Natriumtetraborat (pH 8.8), 2% (v/v) TX100, 20 mM Natriumsulfit) gegeben. Die Lösung wurde geschüttelt und bei Raumtemperatur für 15 Sekunden inkubiert. Die Chemilumineszenz der sich daraus ergebenden Lösung wurde durch Injektion von Nachweisreagenz I, 0.5 Sekunden später gefolgt durch eine Injektion von Nachweisreagenz II, gemessen. Die Lichtemission wurde über einen Zeitabschnitt von 5 Sekunden integriert.
Ergebnisse
Wie in 3 dargestellt, war der Addukt-Schutz-Assay in der Lage, das Vorhandensein einer Targetsequenz mittels eines großen Überschusses an Acridiniumester-markierter Sonde und abnehmenden Mengen eines komplementären Targets nachzuweisen.
Beispiel 3: Verschiedene Acridiniumester-Strukturen
Dieses Beispiel stellt die Verwendung von verschiedenen Acridiniumester-Derivaten im Addukt-Schutz-Assay und den Effekt dar, den unterschiedliche Acridiniumester-Derivatstrukturen auf Addukt-Bildungsraten haben. Die Wirkung von Elektronendonorgruppen auf den Acridiniumring wurden mittels 1-Methyl-AE und 2,7-Dimethyl-AE untersucht. Die Wirkung von verschiedenen mit Nukleinsäure verbundenen Ausgangsgruppen wurden mittels o-AE, Naphtyl-AE, o-Me-Cin-AE, o-diMe-AE und o-diBr-AE untersucht. Die Struktur dieser verschiedenen Acridiniumester werden in 4 und 5 dargestellt. Natriumsulfit oder Natrium-Metabisulfit wurden als signalverändernder Ligand verwendet.
Hybridisierung
Zu 15 μl eines 2 × Hybridisierungspuffers (0.2 M Lithiumsuccinat (pH 5.2), 1.0 M LiCl, 0.2% Triton X-100) wurden 0.1 pmol der Sonde (7 × 10⁷ RLU/pmol) und 0.1 pmol des DNA-Targets gegeben. Die AE-markierte Sondensequenz wird dargestellt durch SEQ. ID. Nr. 5: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT*AACC CAACAT, wobei das * auf die Position des Acridiniumester-Markers hinweist. Die Targetsequenz wird bereitgestellt durch SEQ. ID. Nr. 6: 5'-ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGC. Die sich daraus ergebende Lösung wurde mit Wasser auf 30 μl eingestellt, für 60 Minuten bei 60°C erhitzt und mit 1 × Hybridisierungspuffer auf 500 μl verdünnt.
Adduktschutz
In ein 12 × 75 mm Reaktionsröhrchen (Sarstedt) wurden 30 μl eines Boratpuffers (30 mM Borat (pH 8.8), 1% Triton X-100) und 3 bis 5 μl der Sonde oder des Hybrids (200,000– 300,000 RLU) gegeben. Zu dieser Lösung wurden 10 μl 0.1 M Natriumsulfit oder 0.1 M Natrium-Metabisulfit gegeben. Die Lösung wurde dann geschüttelt und über verschiedene Zeitabschnitte bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Chemilumineszenz der sich daraus ergebenden Lösung wurde durch Injektion des Nachweisreagenz I, 0.5–2 Sekunden später gefolgt durch eine Injektion des Nachweisreagenz II, gemessen. Die Lichtemission wurde über einen Zeitabschnitt von 5 Sekunden integriert.
Ergebnisse
Wenn ein Acridiniumester mit substituierten Acridiniumringen (AE, o-AE, Naphtyl-AE, o-Me-Cin-AE, o-diMe-AE und o-diBr-AE) entweder an eine Sonde oder an ein Hybrid gebunden ist, bildete es mit etwa der gleichen Rate (innerhalb eines Faktors von 10) mit Natriumsulfit und Natrium-Metabisulfit Addukte. Hingegen bildeten 1-Me-AE und 2,7-di-Me-AE die Addukte mehr als zehnmal langsamer als die unsubstituierten Acridiniumester-Derivate. Die geringere Addukt-Bildungsrate durch diese methylierten Derivate kann durch die Elektronendonoreigenschaften der Methylgruppen erklärt werden, welche die positive Veränderung an der C-9-Position des Acridiniumester verringern kann, wodurch wiederum die Addukt-Bildungsraten verringert werden.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle I dargestellt.
Tabelle I

DA: beschreibt eine differentielle Markerveränderung der Signalbildung für das Addukt-Schutz-Assay

Daher beeinflusst die Struktur des Markers seine Fähigkeit, ein Addukt zu bilden. Zum Beispiel ist für einen Marker, der an eine Sonde oder ein Hybrid gebunden ist, die Rate der Adduktbildung durch o-diBr-AE 24 bzw. 45 mal schneller als die Rate der Adduktbildung durch 2,7-diMe-AE, das an die gleiche Sonde oder Hybrid gebunden ist.
Beispiel 4: Nachweis einer Einzelbasen-Fehlpaarung
Dieses Beispiel stellt die Fähigkeit des Addukt-Schutz-Assays dar, einzelne Basenpaar-Fehlpaarungen nachzuweisen.
Eine Sonde wurde durch drei verschiedene Targetsequenzen hybridisiert, die als TW (Wildtyp-Target), TM1 (fehlgepaartes Target 1) und TM2 (fehlgepaartes Target 2) bezeichnet werden. Die Hybridisierung der Sonde mit TW erzielte ein Hybrid ohne Fehlpaarungen, die Hybridisierung der Sonde mit TM1 erzielt ein Hybrid mit einer Fehlpaarung und die Hybridisierung der Sonde mit TM2 erzielte ein Hybrid mit zwei benachbarten Fehlpaarungen.
Die Adduktbildungsrate der mit TW, TM1 und TM2 hybridisierten Sonde wurde gemessen. Zur Vergleichszwecken wurden ebenso die Hydrolysierungsrate für jede Sonde und Target unter Verwendung einer Alkalilösung in einem hydrolytischen Assay bestimmt.
Sonde und Targetsequenzen
Die folgenden Sonden- und Target-Sequenzen wurden in diesem Beispiel verwendet (wobei das * auf die Position des Acridiniumester-Markers hinweist):
AE-Sonde
Wildtyp-Target (TW)
Mutanten-Target 1 (TM1)
Mutanten-Target 2 (TM2)
Hybridisierung
Zu 60 μl des Hybridisierungspuffers (100 mM Lithiumsuccinat (pH 5.2), 8.5% Lithiumlaurylsulfat, 1.5 mM EDTA, 1.5 mM EGTA) wurden 2.5 pmol des Targets und 0.05 pmol der Sonde gegeben. Die sich daraus ergebende Lösung wurde für 30 Minuten bei 60°C erhitzt und dann in 500 μl einer Lösung mit 50 mM Lithiumsuccinat (pH 5.2) und 250 mM Lithiumchlorid verdünnt.
Adduktschutz
In ein 12 × 75 mm Reaktionsröhrchen (Sarstedt) wurden 100 μl eines Boratpuffers (60 mM Borat (pH 8.8), 2% (v/v) TX100) und 10 μl der Sonde oder des Hybrids gegeben. Zu dieser Lösung wurden 100 μl 20 mM Natriumsulfit zugegeben. Die Lösung wurde dann geschüttelt und für verschiedene Zeitabschnitte bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Chemilumineszenz der sich daraus ergebenden Lösung wurde durch Injektion von Nachweisreagenz I, 0.5 Sekunden später gefolgt durch eine Injektion von Nachweisreagenz II, gemessen. Die Lichtemission wurde über einen Zeitabschnitt von 5 Sekunden integriert.
Hydrolyse
In ein 12 × 75 mm Reaktionsröhrchen (Sarstedt) wurden 100 μl eines Boratpuffers (190 mM Natriumtetraborat (pH 7.6), 6.9% (v/v) TX100, 0.02% Fischgelatine (Fisher) und 10 μl der Sonde oder des Hybrids gegeben. Die sich daraus ergebende Lösung wurde auf 60°C erhitzt, und zu verschiedenen Zeitpunkten wurde eine Probe entnommen und zu 200 μl 0.4 NHCl, die 0.1% (v/v) H₂O₂ enthält, gegeben. Die Chemilumineszenz der sich daraus ergebenden Lösung wurde durch Injektion von Nachweisreagenz II gemessen und die Lichtemission wurde über einen Zeitabschnitt von 5 Sekunden integriert.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in Tabelle II dargestellt.
Tabelle II

"S": beschreibt eine Sonde.
„ASA": beschreibt ein Addukt-Schutz-Assay.
„HA": beschreibt ein Hydrolyse-Assay.

In dem Hydrolyse-Assay hydrolysierten fehlgepaarte Hybride schneller als die gleichen Hybride ohne eine Fehlpaarung und eine einzelne Basenpaar-Fehlpaarung im Assay reduzierte wesentlich die Signalbildung des fehlgepaarten Hybrids.
Die Wirkung einer Fehlpaarung im Addukt-Schutz-Assay unterscheidet sich deutlich von der Wirkung einer Fehlpaarung im Hydrolyse-Assay. Im Gegensatz zu den aus dem Hydrolyse-Assay erhaltenen Ergebnissen kann eine einzelne Fehlpaarung eine größere oder geringere Unterscheidung zwischen einem auf gebundenen oder ungebundenen Sonden vorhandenen Marker im Addukt-Schutz-Assay bewirken. Obwohl für ein bestimmtes fehlgepaartes Sonden : Target-Hybrid reproduzierbar, kann die Wirkung einer Fehlpaarung auf den Addukt-Schutz-Assay daher für verschiedene Sonden-Targethybride (d. h. kann den Schutz erhöhen oder erniedrigen) variieren.
Tabelle II stellt auch den Unterschied in der Veränderung der Signalbildungsraten für den Addukt-Schutz-Assay und das Hydrolyse-Assay dar. In Tabelle II wird die Rate der differentiellen Veränderung der Signalbildung für das Adduktions-Schutz-Assay in Sekunden gemessen, während die Hydrolyseveränderung der Signalbildung srate in Minuten gemessen wird. Insgesamt war die Veränderung der Signalbildung Brate im Vergleich mit dem Hydrolyse-Assay im Addukt-Schutz-Assay ca. 12 bis 32 mal schneller.
Beispiel 5: Verschiedene Nukleinsäurestrukturen
Die Beziehung zwischen Addukt-Bildungsraten und der Art der Nukleinsäure (RNA oder DNA), die in der Sonde oder im Target vorhanden ist, wird in diesem Beispiel zusammengefasst. In diesen Experimenten wurde eine kleine RNA- oder DNA-markierte Sonde mit einem kleinen komplementären RNA oder DNA-Target oder mit einem großen ribosomalen RNA-Target hybridisiert. Zu Vergleichszwecken wurden ebenso die Hydrolyseraten jeder Sonden und das sich daraus ergebende Hybrid bestimmt. Falls nicht anders angegeben, wurden die Assays unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt:
(I) Sonden
SEQ. ID. Nr. 5, DNA-Sonde, die mit einem Acridiniumester in der 16/17 Position markiert ist; und
SEQ. ID. Nr. 11: GCUCGUUGCG GGACUU*AACC CAACAU, wobei das * auf die Position des Acridiniumester-Markers hinweist.
(II) Targets:
SEQ. ID. Nr. 6 (DNA-Target); und
SEQ. ID. Nr. 12 (RNA-Target); 5'-AUGUUGGGUU AAGUCCCGCA ACGAGC.
Hybridisierung mit rRNA-Target
Zu 15 μl eines 2 × Hybridisationspuffers wurden 2 μg (1.25 pmol) E. coli rRNA gegeben. Die sich daraus ergebende Lösung wurde mit Wasser auf 30 μl eingestellt und für 10 Minuten bei 70°C erhitzt. Ein Zehntel pmol der SEQ. ID. Nr. 5 Sonde, die mit einem Acridiniumester in der 16/17 Position markiert worden ist, wurde dann zu der Lösung gegeben. Die Lösung wurde für 1 Stunde bei 60°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit einem 1 × Hybridisierungspuffer auf 500 μl verdünnt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in Tabelle III dargestellt.
Tabelle III

„DA": beschreibt eine differentielle Adduktbildungsrate.
„DH": beschreibt eine differentielle Hydrolyserate.
DA und DH sind: beides Maßeinheiten für eine differentielle Veränderung der Verhältnisse.
„RNA¹": beschreibt eine Sonde der SEQ. ID. Nr. 5.
„RNA³": beschreibt ein Target der SEQ. ID. Nr. 12.
„DNA⁴": beschreibt ein Target der SEQ. ID. Nr. 6.

Das in Tabelle III beobachtete Verhalten könnte sich auf die Konformation der unterschiedlichen Nukleinsäure-Hybride beziehen. DNA/DNA-Hybride liegen in einer B-Konformation vor, RNA/RNA-Hybride liegen in einer A-Konformation vor und Nukleinsäure-Hybride, die einen Strang DNA und einen Strang RNA enthalten, haben wahrscheinlich eine A-ähnliche Konformation angenommen.
Die Wirkung eines RNA-Targets und/oder RNA-Sonde auf die Unterscheidung unterscheidet sich beim Addukt-Schutz-Assay und einem Hydrolyse-Assay. Im Addukt-Schutz-Assay erhöht sich die Unterscheidung, wenn sowohl das Target als auch die Sonde RNA sind. Hingegen wurde für das Hydrolyse-Assay die größte Menge der Unterscheidung für eine DNA-Sonde und ein RNA-Target beobachtet. Darüber hinaus bietet der Addukt-Schutz-Assay unter den im Beispiel verwendeten experimentellen Bedingungen eine größere Unterscheidung als das Hydrolyse-Assay.
Insgesamt zeigen die A-ähnlichen Konformationen Addukt-Bildungsraten, die A-Konformationen ähnlich sind. Hingegen ähneln die Hydrolyseraten dieser A-ähnlichen Konformationen der Hydrolyserate einer B-Konformation, wenn der Targetstrang DNA ist, während sie der Hydrolyserate einer A-Konformation ähneln, wenn der Targetstrang RNA ist. Daher hängen die Addukt-Bildungsraten davon ab, ob eine Sonde und/oder Target DNA oder RNA ist und diese Raten korrelieren nicht direkt mit den entsprechenden Hydrolyseraten der Marker, die auf genau die gleiche Weise mit diesen Molekülen verbunden sind.
Beispiel 6: Marker-Platzierungswirkungen bei Verwendung eines AE-Markers
Um die Abhängigkeit der Addukt-Bildungsraten auf die Lokalisation der Acridiniumester-Bindungsstelle zu untersuchen, wurde ein Satz von Sonden, die eine Acridiniumester-Bindungsstelle in unterschiedlichen Positionen entlang der Sonde enthalten, vorbereitet. Dieser Satz von Sonden wurde dann mit komplementären Targets hybridisiert und die sich daraus ergebenden AE-markierten Hybride und AE-markierten Sonden ließ man mit Natriumsulfit reagieren. Für Vergleichszwecke wurden die Hydrolyseraten des gleichen Satzes von Sonden und Hybriden mit einem Hydrolyse-Assay gemessen. Wie weiter unten zusammengefasst, variieren die Addukt-Bildungsraten stark (10-fach) von einer Base zur nächsten entlang eines Hybrids und weniger (2.6-fach) von einer Base zur nächsten entlang einer Sonde. Im Gegensatz dazu sind die Variationen der Hydrolyseraten entlang eines Hybrids oder einer Sonde kleiner (2-fach bzw. 1.6-fach). Daher kann die Fähigkeit eines Adduktes, zwischen einer AE-markierten Sonde und einem AE-markierten Hybrid zu unterscheiden, durch Verändern der Position der AE-Bindungsstelle stark gesteigert werden.
Tabelle IV
Die Assays wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt.
Beispiel 7: Leistungfähigkeit verschiedener signalverändernder Liganden
Um den Nachweis eines Analyten durch bevorzugte Veränderung der Signalbildung durch einen ungebundenen Marker zu erleichtern, ist es wichtig, dass eine Addukt-bildende Verbindung mit dem Marker stark reagiert. Tabelle V fasst Experimente zusammen, in denen verschiedenartige Nukleophile mit einer ungebundenen AE-markierten Sonde umgesetzt werden.
Für jedes Nukleophil wurde der Prozentsatz der Sonde, die kein Addukt bildet, über einen Bereich einer nukleophilen Konzentration bestimmt. Verbindungen, die ein freies Elektronenpaar an den Atomen, die keine Schwefelatome (Sulfat, Hypophosphit) sind, enthalten, bilden keine starken Addukte mit einem Acridiniumester.
Im Gegensatz dazu bilden Verbindungen, die Schwefelatome mit einem freien Elektronenpaar enthalten, starke Addukte mit Acridiniumestern (Tetrahydrothiophen, Propanthiol, Natriumsulfit, Benzylmercaptan, Natriumhydrosulfit, Glycolsulfit, Metabisulfit, Natriumthiophosphat und Natriumthiosulfat). Nur eine Verbindung die Schwefel enthält, Propyldisulfid, bildete aufgrund ihrer starken Wasserlöslichkeit kein starkes Addukt mit einem Acridinium. Zusätzlich zum Schwefel bildeten Verbindungen, die ein anderes VIb-Atom (Kaliumtellurit) oder ein Gruppe VIb-Atom (Metaarsenit) enthalten, ebenfalls starke Addukte mit einem Acridiniumester.
Um die Fähigkeit der signalverändernden Liganden zu messen, um vorzugsweise ungebundene AE-markierte Sonden zu inhibieren, wurden äquivalente Mengen einer ungebundenen und einer gebundenen Sonde (AE-Hybrid) mit verschiedenen Konzentrationen der einzelnen signalverändernden Liganden mittels der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zur Reaktion gebracht. Die Unterscheidung wurde entweder kinetisch durch Berechnen eines DA-Verhältnisses oder thermodynamisch durch Berechnen des Prozentsatzes des Hybrids und der Sonde, die im Gleichgewicht (% Hybrid/% Sonde) kein Addukt bilden, gemessen. Signalverändernde Liganden, die nicht zwischen einer ungebundenen AE-Sonde und einem AE-Hybrid unterscheiden, zeigen einen DA oder (% Hybrid/% Sonde)-Verhältnis von 1, während diejenigen, die zwischen Markern, die auf ungebundenen oder gebundenen Sonden vorhanden sind, unterscheiden, Verhältnisse von mehr als 1 zeigen.
Wie in Tabelle V zusammengefasst, bildeten nahezu alle Verbindungen, die starke Addukte mit einem auf einer ungebundenen Sonde vorhandenen Marker bildeten, noch leichter Addukte mit einem auf einer ungebundenen Sonde vorhandenen Marker als mit einem Marker, der auf einer gebundenen Sonde vorhanden war. Verbindungen, die nicht unterschieden, enthielten entweder ein Schwefelatom, das mit einem aromatischen Ring (Thiophenol, 5-Mercapto-1-methyltetrazol oder 2-Mercaptoimidazol) konjugiert war oder ein Schwefelatom, das mit einer Nitrilgruppe (Thiocyanat) konjugiert war.
Tabelle V
Beispiel 8: Wirkung einer Sequenz auf das ASA
Um die Abhängigkeit der Addukt-Bildungsraten auf die Sequenz einer Nukleinsäure zu untersuchen, wurden DNA-Sonden: SEQ. ID. Nr. 1 (markiert mit AE in der 7/8-Position). SEQ.
ID. Nr. 5 (markiert mit AE in der 16/17 Position) und SEQ. ID. Nr. 13 (SEQ. ID. Nr. 13: 5'-CTAAAGCGCT T*TCCACCACA AGAC, wobei das * auf die Position des Acridiniumester-Markers hinweist) mit komplementären DNA-Targets (SEQ. ID. Nr. 2, SEQ. ID. Nr. 6 oder SEQ. ID. Nr. 14 (5'-GTCTTGTGGT GGAAAGCGCT TTAG) hybridisiert und mit Natriumsulfit zur Reaktion gebracht.
Verfahren A
Verfahren A wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt.
Verfahren B
Verfahren B wurde wie folgt durchgeführt:
Hybridisierung
Zu 15 μl eines 2 × Hybridisierungspuffers wurden 1 pmol der AE-markierten Sonde (7 × 10⁷ RLU/pmol) und 4 pmol des Targets gegeben. Die sich daraus ergebende Lösung wurde mit Wasser auf 30 μl eingestellt, für 30 Minuten bei 60°C erhitzt und mit 1 × Hybridisierungspuffer auf 500 μl verdünnt.
Adduktschutz
In ein 12 × 75 mm Reaktionsröhrchen (Sarstedt) wurden 2 μl einer AE-markierten Sonde oder eines Hybrids (400,000 RLU) gegeben. Zu dieser Lösung wurden 100 μl des Addukt-Bildungspuffers (10 mM Natriumsulfit, 30 mM Boratpuffer (pH 8.7) und 1.5% Triton TX100) gegeben. Die sich daraus ergebende Lösung wurde dann geschüttelt und für verschiedene Zeitabschnitte bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Chemilumineszenz der resultierenden Lösung wurde durch Injektion des Nachweisreagenz I, 0.5–2 Sekunden später gefolgt von einer Injektion des Nachweisreagenz II, gemessen.
Die Lichtemission wurde über einen Zeitabschnitt von 5 Sekunden integriert.
Ergebnisse
Die Ergebnisse dieser Experimente werden in Tabelle VI dargestellt.
Tabelle VI
SEQ. ID. Nr. 1 wurde mit AE in der 7/8 Position markiert, SEQ. ID. Nr. 5 wurde mit AE in der 16/17 Position markiert und SEQ. ID. Nr. 13 wurde mit AE in der 11/12 Position markiert.
Die drei verschiedenen AE-markierten Sondensequenzen als auch ihre korrespondierenden Hybride reagieren mit Natriumsulfit in unterschiedlichem Maße. Die Sonde der SEQ. ID. Nr. 5 reagiert langsamer als die Sonde der SEQ. ID. Nr. 1, die wiederum langsamer reagiert als die Sonde der SEQ. ID. Nr. 13. Daher werden die Addukt-Bildungsraten durch die Sequenz der AE-markierten Sande als auch der Sequenz des korrespondierenden Hybrids beeinflusst.

Claims

Ein Verfahren zur Untersuchung auf einen Analyten in einer Probe, das die Schritte umfasst: a) Aussetzen der Probe gegenüber einem markierten Bindungspartner, der eine Analyten-Bindungsregion und einen Marker umfasst; b) Behandeln der gegenüber dem markierten Bindungspartner ausgesetzten Probe mit einem signalverändernden Liganden, der ein Adukt mit dem Marker des markierten Bindungspartners bildet, wenn der markierte Bindungspartner nicht an den Analyten gebunden ist, wobei der Marker des markierten Bindungspartners vorzugsweise davor geschützt ist, ein Adukt mit dem signalverändernden Liganden zu bilden, wenn der markierte Bindungspartner an den Analyten gebunden ist, so dass der signalverändernde Ligand die Signalbildung des markierten Bindungspartners, der nicht an den Analyten gebunden ist, in einem größeren Ausmass verändert, als er die Signalbildung des an den Analyten gebundenen markierten Bindungspartners verändert; und c) Nachweisen des vom Marker erzeugten Signals, welches nicht verändert worden ist, als ein Hinweis auf die Anwesenheit oder Menge des Analyten in der Probe.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bindungspartner eine Nukleinsäuresonde ist und der Analyt eine Target-Nukleinsäuresequenz.
Ein Verfahren zur Untersuchung auf eine Target-Nukleinsäure-Targetregion in einer Probe, das die Schritte umfasst a) Aussetzen der Probe gegenüber einer Nukleinsäuresonde, die ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz umfasst, die in der Lage ist, an die Targetregion und einen Marker zu binden; b) Behandeln der der Sonde ausgesetzten Probe mit einem signalverändernden Liganden, der ein Adukt mit dem Marker der Sonde bildet, wenn die Sonde nicht an die Targetregion gebunden ist, wobei der Marker der Sonde vorzugsweise davor geschützt ist, ein Adukt mit dem signalverändernden Liganden zu bilden, wenn die Sonde an die Targetregion gebunden ist, so dass der signalverändernde Ligand die Signalbildung der Sonde, die nicht an die Targetregion gebunden ist, in einem größeren Ausmass verändert, als er die Signalbildung der an die Targetregion gebundenen Sonde verändert; und c) Nachweisen des von einem Marker erzeugten Signals, welches nicht verändert worden ist, als ein Hinweis auf die Anwesenheit oder Menge der Targetregion in der Probe.
Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Targetregion RNA ist.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 3, wobei der Test durchgeführt wird, ohne den Bindungspartner oder die Sonde, die an den Analyten bzw. die Targetregion gebunden sind, von einem Bindungspartner oder einer Sonde, die nicht an den Analyten bzw. die Targetregion gebunden sind, zu trennen.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 3, das ferner vor dem Schritt (c) das Trennen des Bindungspartners oder der Sonde, die an den Analyten bzw. die Targetregion gebunden sind, von einem Bindungspartner oder einer Sonde, die nicht an den Analyten bzw. die Targetregion gebunden sind, umfasst.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 3, wobei die Schritte (b) und (c) bei einer im Wesentlichen konstanten Temperatur ausgeführt werden.
Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Assay bei Raumtemperatur durchgeführt wird.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 3, wobei im Schritt (c) eine Lichtabsorption nachgewiesen wird.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 3, wobei im Schritt (c) eine Lichtemission nachgewiesen wird.
Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Marker die chemische Struktur hat:
wobei das Aryl-Ringsystem eine bis vier zyklische Gruppen umfasst und sich eine der Gruppen an den verbindenden Kohlenstoff „C" bindet, R₂ aus der Gruppe, die aus S, O und NH besteht, ausgewählt wird; R₃ aus der Gruppe, die aus O, N, S, einem Halogen, substituiertem Phosphor, substituiertem Schwefel, substituiertem Bor und substituiertem Arsen besteht, ausgewählt wird; R₄ aus der Gruppe, die aus Alkyl, Alkenyl, Aryl, Alkoxyl und Aryloxyl besteht, ausgewählt wird oder nicht vorhanden ist, wenn R₃ ein Halogen ist; und R₅ für Nichts steht, solange R₃ nicht N ist, aber wenn R₃ N ist, dann R₅ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Aryl, Alkoxyl und Aryloxyl besteht, ausgewählt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Arylsystem positiv geladen ist.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Aryl-Ringsystem eine bis vier zyklische Gruppen hat; R₃ aus der Gruppe, die aus 0, N und S besteht, ausgewählt wird, R₄ Aryl ist, und R₅ für Nichts steht.
Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Marker die Struktur hat:
wobei R₁ aus der Gruppe, die aus H, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl und Aryl besteht, ausgewählt wird; n entweder 0, 1, 2, 3 oder 4 ist; m entweder 0, 1, 2, 3 oder 4 ist; jedes X unabhängig aus der Gruppe, die aus Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Amino, substituiertem Amino, Carboxyl, Hydroxyl, Alkoxyl, Nitro, Sulfonyl, Halogen, Thiol, Amido, Acetyl, substituiertem Acetyl und Aryloxyl besteht, ausgewählt wird; und jedes Y unabhängig aus der Gruppe, die aus Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Amino, substituiertem Amino, Carboxyl, Hydroxyl, Alkoxyl, Nitro, Sulfonyl, Halogen, Thiol, Amido, Acetyl, substituiertem Acetyl und Aryloxyl besteht, ausgewählt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei n entweder 0, 1 oder 2 ist; m entweder 0, 1 oder 2 ist; R₃ O ist, R₄ Aryl ist, und R₅ für Nichts steht.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei jedes X unabhängig entweder Alkyl oder Alkoxyl ist; jedes Y unabhängig entweder Alkyl oder Alkoxyl ist; und R₄ ein wahlweise substituiertes Phenyl ist.
Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei R₄ aus der Gruppe, die aus ortho-Methylzinnamatphenyl, ortho-Dimethylphenyl, ortho-Dibromphenyl und unsubstituiertem Phenyl besteht, ausgewählt wird.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 3, wobei der Ligand aus der Gruppe, die aus Tetrahydrothiophen, Propanthiol, Benzylmercaptan, Sulfit, Glycolsulfit, Hydrosulfit, Metabisulfit, Thiosulfat, Thiophosphat, Metaarsenit, Tellurit, Arsenit und Thiocyanat besteht, ausgewählt wird.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 3, wobei der Ligand entweder ein Schwefelatom mit einem freien Elektronenpaar, ein Telluratom mit einem freien Elektronenpaar oder ein Arsenatom mit einem freien Elektronenpaar umfasst, wobei das Schwefelatom, das Telluratom oder das Arsenatom nicht an einen aromatischen Ring oder Nitril konjugiert ist.
Das Verfahren nach jedem der Ansprüche 1 bis 19, wobei das Adukt ein reversibles Adukt ist.