DE69816399T2

DE69816399T2 - Methode mit elektrochemilumineszenten markern und löschern

Info

Publication number: DE69816399T2
Application number: DE69816399T
Authority: DE
Inventors: M. Mark RICHTER; J. Michael POWELL; M. Christopher BELISLE
Original assignee: IGEN International Inc
Current assignee: Bioveris Corp
Priority date: 1997-05-23
Filing date: 1998-05-11
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2018-05-12
Also published as: EP0914612B1; JP2000517058A; US7314711B2; US20060035248A1; JP3951031B2; EP0914612A1; WO1998053316A1; ES2202860T3; US20010023063A1; DE69816399D1; CA2261758A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung gehört zu dem allgemeinen Gebiet der chemischen und biologischen Bestimmungen, die Elektrochemilumineszenz (ECL) verwenden, auf die auch Bezug genommen wird als elektrisch erzeugte Chemilumineszenz. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung bestimmte Klassen an chemischen Einheiten, die ECL stark auslöschen und die Verwendung dieser ECL-Löscher in Kombination mit ECL-Markierungen, z. B. ECL-Nachweisverfahren, die einen ECL-Löscher und eine ECL-Markierung verwenden. Eine Klasse solcher Löscheinheiten sind jene, die wenigstens eine Benzoleinheit umfassen. Unterklassen solcher Löscheinheiten, sind jene, die wenigstens eine Phenoleinheit, Chinoneinheit, Benzolcarbonsäure- und/oder Benzolcarboxylateinheit umfassen.
HINTERGRUND
In dieser Anmeldung wird durchweg auf zahlreiche Veröffentlichungen, Patente und veröffentlichte Patentanmeldungen durch ein identifizierendes Zitat Bezug genommen; die vollständigen Zitate für diese Dokumente können am Ende der Beschreibung, unmittelbar den Ansprüchen vorangehend, gefunden werden. Die Offenbarungen der Veröffentlichungen, Patente und veröffentlichten Patentbeschreibungen, auf die in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, sind hierin durch Bezugnahme in die vorliegende Offenbarung mit aufgenommen, um den Stand der Technik, zu dem diese Erfindung gehört, vollständiger zu beschreiben.
Lumineszenz ist der Begriff, der allgemein verwendet wird, um auf die Lichtemission einer Substanz, aus irgendeinem anderen Grund als einem Anstieg ihrer Temperatur, Bezug zu nehmen. Im Allgemeinen emittieren Atome oder Moleküle Photonen elektromagnetischer Energie (z. B. Licht), wenn sie sich aus einem „angeregten Zustand" zu einem Zustand niedrigerer Energie (gewöhnlich dem Ausgangszustand) bewegen; auf diesen Vorgang wird oftmals Bezug genommen als „radioaktiver Zerfall". Es gibt viele Ursachen für eine Anregung. Falls die Anregungsursache ein Photon ist, wird auf den Lumineszenzvorgang als „Photolumineszenz" Bezug genommen. Falls die Anregungsursache ein Elektron ist, so wird auf den Lumineszenzvorgang Bezug genommen als „Elektrolumineszenz". Genauer resultiert die Elektrolumineszenz aus dem direkten Einschuss und der Entfernung an Elektronen, um ein Elektron-Loch-Paar auszubilden und der anschließenden Rekombination des Elektron-Loch-Paars, um ein Photon zu emittieren. Auf Lumineszenz, die aus einer chemischen Reaktion resultiert, wird gewöhnlich Bezug genommen als „Chemilumineszenz". Auf Lumineszenz, die von einem lebenden Organismus erzeugt wird, wird gewöhnlich Bezug genommen als „Biolumineszenz". Falls die Photolumineszenz das Ergebnis eines Spinermöglichten Übergangs ist (z. B. einem Singlett-Singlett-Übergang, Triplett-Triplett-Übergang), wird auf den Photolumineszenzvorgang gewöhnlich Bezug genommen als „Fluoreszenz". Typischerweise bestehen Fluoreszenzemissionen nicht weiter, nachdem die Anregungsursache entfernt wurde, als ein Ergebnis der kurzlebigen Anregungszustände, die sich durch solche Spin-ermöglichten Übergänge schnell entspannen können. Falls Photolumineszenz das Ergebnis eines Spin-verbotenen Übergangs (z. B. eines Triplett-Singlett-Übergangs) ist, so wird auf den Photolumineszenzvorgang gewöhnlich Bezug genommen als „Phosphoreszenz". Typischerweise bestehen die Phosphoreszenzemissionen noch lange weiter nachdem die Anregungsursache entfernt wurde, als ein Ergebnis langlebiger Anregungszustände, die sich nur durch solche Spin-verbotenen Übergänge entspannen können.
Elektrochemilumineszenz („ECL"), auf die auch Bezug genommen wird als elektrisch erzeugte Chemilumineszenz, bezieht sich allgemein auf die Emission von Photonen elektromagnetischer Strahlung (z. B. Licht) aus einer elektronisch angeregten chemischen Spezies, die elektrochemisch erzeugt wurde. In einem einfachen Beispiel wird die Spezies A im Grundzustand zuerst elektrochemisch reduziert, um eine reduzierte Spezies A^– zu bilden, die sich dann von der Elektrodenoberfläche ausbreiten kann. Ähnlich wird eine Spezies A elektrochemisch oxidiert, um eine oxidierte Spezies A⁺ zu bilden. Die reduzierte Spezies A^– und die oxidierte Spezies A⁺ wandern dann zusammen und reagieren, um eine elektronisch angeregte Spezies, A^*, und eine Spezies im Grundzustand, A, zu bilden. Die elektronisch angeregte Spezies, A^*, entspannt sich dann zum Grundzustand durch Emittieren eines Photons. A + e^– → A^– A – e^– → A⁺ A^– + A⁺→ A* + A A* → A + hv
In üblichen, ähnlichen Beispielen reagiert ein Reaktionspartner, CR, mit entweder einer elektrochemisch erzeugten reduzierten oder oxidierten Spezies, A⁺ oder A^–, um eine elektronisch angeregte Spezies A* zu bilden, woraufhin sie dann zum Grundzustand zurückkehren unter Emittieren eines Photons.
ECL wurde zum ersten Mal in den späten 1920igern beobachtet und wurde detailliert während den späten 1960igern und 1970igern untersucht. Eine Anzahl an die Literatur zusammenfassenden Berichten, betreffend die natürliche ECL (z. B. den Emissionszustand, den Emissionsmechanismus, die Emissionseffizienz) wurden veröffentlicht. Siehe z. B. Knight et al., 1994 und die darin zitierten Verweise.
Die ECL polyaromatischer Kohlenwasserstoffe in sowohl wässrigen als auch in nichtwässrigen Medien, wurde umfassend untersucht. Beispiele solcher Verbindungen schließen Naphthalin, Anthracen, Phenanthren, Pyren, Chrysen, Perylen, Coronen und Rubren ein.
Ein typisches Beispiel ist die ECL von 9,10-Diphenylanthracen („DPA"). Ein doppelter Potentialschritt wird an einer Platinelektrode angelegt, wodurch anodische Oxidationsprodukte (d. h. das Radikalkation, DPA^.+) an dem positiven Potential und kathodische Reduktionsprodukte (d. h. das Radikalanion, DPA^.–) am negativen Potential erzeugt werden. Die Produkte machen einen Elektronentransfer durch, um DPA und den elektronisch angeregten (Singlett-) Zustand ¹DPA* zu ergeben, der ein Photon im Wege der Chemilumineszenz (in diesem Fall Fluoreszenz) emittiert. In diesem Beispiel wird der emittierende Zustand direkt über den Elektronentransfer (den sogenannten „S-Weg") gebildet. DPA – e^– → DPA^.+ (Elektrooxidation) DPA + e^– → DPA^.– (Elektroreduktion) DPA^.+ + DPA^.– → DPA + ¹DPA* (Elektronentransfer) ¹DPA^. → DPA^.– + hv (Chemilumineszenz)
ECL kann auch erzeugt werden, unter Verwendung polyaromatischer Kohlenwasserstoffe, in Verbindung mit anderen chemischen Spezies, die als geeignete Donor- oder Akzeptormoleküle im Elektronentransferschritt dienen können. So schließt zum Beispiel ein anderes gängiges ECL-System DPA und die Donor-Spezies, N, N', N'', N'''-Tetramethyl para-phenylendiamin („TMPD") ein. In diesem Fall wird der emittierende Zustand in einem zweiten (ineffizienten) Triplett-Triplett-Annihilationsschritt von dem Produkt des ersten Elektronentransferschrittes (dem sogenannten „T-Weg") gebildet. TMPD – e^– → TMPD + (Elektrooxidation) DPA + e^– → DPA^.– (Elektroreduktion) TMPD^.– + + DPA^.– → TMPD + ³DPA* (Elektronentransfer 1) ³DPA* + ³DPA* → DPA + ¹DPA* (Elektronentransfer 2) ¹DPA* → DPA^.– + hv (Chemilumineszenz)
Die ECL anorganischer und/oder organometallischer Verbindungen wurde ebenfalls umfassend untersucht. Eine wichtige Klasse solcher Verbindungen sind die 2,2'-Bipyridin („bpy")-Komplexe von Ruthenium und Osmium, wie zum Beispiel Ru(bpy)₃ ^2'und Os(bpy)₃ ²⁺. Andere Beispiele solcher Verbindungen schließen Tricarbonyl(chlor)(1,10-phenanthrolin)rhenium(I), rechtwinklig planare Platin(II)-Komplexe, Cr(bpy)₃ ²⁺, mehrkernige Komplexe, wie z. B. Pt₂(Diphosphonat)₄ ^4– und Cluster, wie z. B. Mo₆Cl₁₂ ² ^– ein. Siehe, zum Beispiel, Knight et al., 1994.
Die meisten Untersuchungen von anorganischen und/oder metallorganischen Verbindungen konzentrierten sich auf Ru(bpy)₃ ²⁺ und verwandte Verbindungen, vor allem wegen ihren intrinsischen und etwas außergewöhnlichen Eigenschaften, einschließlich der Fähigkeit, Lumineszenz bei Raumtemperatur in wässriger Lösung zu emittieren, der Fähigkeit, reversible Ein-Elektron-Übergangreaktionen bei leicht erreichbaren Potentialen durchzumachen, was zu ausreichend stabilen, reduzierten oder oxidierten Spezies führt, der Unempfindlichkeit für die Anwesenheit von Sauerstoff und einer Annihilationswirksamkeit von annähernd 100% unter bestimmten Bedingungen. Wenn zum Beispiel eine Lösung von Ru(bpy)₃ ²⁺ einem zyklischem Doppelschritt-Potential ausgesetzt wird, das zwischen dem Oxidations- und Reduktionspotential des Komplexes alterniert, wird eine orangefarbene Emission beobachtet (bei 620 nm). Ru(bpy)₃ ²⁺ – e^– → Ru(bpy)₃ ³⁺ (Elektrooxidation) Ru(bpy)3²⁺ + e^– → Ru(bpy)₃ + (Elektroreduktion) Ru(bpy)₃ ⁺ + Ru(bpy)₃ ³⁺ Ru(bpy)3²⁺ Ru(bpy)₃ ²⁺ * (Elektronentransfer) Ru(bpy)3²⁺ * → Ru(bpy)3²⁺ + hv (Chemilumineszenz)
ECL kann auch erzeugt werden unter Verwendung von Ru(bpy)₃ ²⁺ in Verbindung mit starken oxidierenden oder reduzierenden Spezies in Lösung; auf diesem Wege muss nur die Hälfte des Doppelschritt-Oxidations-Reduktions-Zyklus angewendet werden. Zum Beispiel werden die Reaktionspartner Peroxodisulfat (d. h. S₂O₈ ^2–, Persulfat) und Oxalat (d. h. C₂O₄ ^2–) irreversibel reduziert bzw. oxidiert, um oxidierende SO₄ ^.– - oder reduzierende CO₂ ^.–-Ionen zu bilden. Zum Beispiel: Ru(bpy)₃ ²⁺ + e^– → Ru(bpy)3⁺ (Elektroreduktion) S2O8^2– + e^– → SO₄ ^2– + SO₄ ^.– (Elektroreduktion) SO₄ ^.– + Ru(bpy)₃ ⁺ → SO₄ ² ^– + Ru(bpy)₃ ²⁺* (Elektronentransfer) SO₄ ^.– + Ru(bpy)₃ ²⁺ → SO₄ ^2– + Ru(bpy)₃ ³⁺* (Elektronentransfer) Ru(bpy)3⁺ + Ru(bpy)₃ ³⁺ → Ru(bpy)3²⁺ + Ru(bpy)3²⁺* (Elektronentransfer) Ru(bpy)₃ ²⁺* → Ru(bpy)₃ ²⁺ + hv (Chemilumineszenz)
Auf eine ähnliche Art und Weise kann ECL auch erzeugt werden unter Verwendung von Ru(bpy)₃ ²⁺ in Kombination mit Reaktionspartnern, wie z. B. Aminen, oder Verbindungen, die Amingruppen enthalten, die als Reduktionsmittel wirken. Im Allgemeinen steigt die Emission der Ru(bpy)₃ ²⁺-ECL-Reaktion mit Aminen in der Reihenfolge primär < sekundär < tertiär. Aliphatische oder alicylische Amine sind im Allgemeinen wirksamer als aromatische Amine. Ein Beispiel für ein gewöhnlich verwendetes Amin ist Tri-n-propylamin (d. h., N(CH₂CH₂CH₃)₃, „TPAH^"). Siehe, zum Beispiel Leland et al., 1990. Es wird allgemein angenommen, dass ein Proton von einem α-Kohlenstoff einer Propylgruppe bei der Elektrooxidation und anschließenden Reaktion verloren geht, um TPA^. (d. h. (CH₃CH₂CH₂)₂N(CHCH₂CH₃)') zu ergeben. Die ECL-Abfolge wird durch die unten angeführten Reaktionen zusammengefasst. Ru(bpy)3²+ – e → Ru(bpy)3³⁺ (Elektrooxidation) TPAH – e^– → [TPAH]⁺ → TPA^. + H⁺ (Elektroxidation und Reaktion) Ru(bpy)3³⁺ + TPA^. → Ru(bpy)₃ ²+* + Produkte (Elektronentransfer) Ru(bpy)3²⁺* → Ru(bpy)3 ²+ + hv (Chemilumineszenz)
Auf diesem Wege wurde die ECL von Ru(bpy)₃ ²⁺ bei der Bestimmung eines breiten Bereiches an Reaktionspartnern verwendet. Die Ru(bpy)₃ ²⁺-ECL wurde z. B. wirksam verwendet, um Oxalat und Persulfat auf Konzentrationen so gering wie 10^–13 Mol/Liter zu (bpy)₃ ²⁺-ECL verwendet bei der Bestimmung von bestimmen. Ähnlich wurde die Ru(bpy)₃ ²⁺ aliphatischen Aminen, alicylischen Aminen (wie z. B. Spartein, Nicotin und Atropin), Arzneimitteln wie z. B. Erythromycin (welches eine Trialkylamingruppe hat), Aminosäuren (wie z. B. Valin und Prolin) und Proteinen. Dies führte wiederum zu der Verwirklichung von Ru(bpy)₃ ²⁺, ebenso wie anderen Ruthenium- und Osmiumchelaten, als sensitive ECL-Markierungen für chemische und biochemische Bestimmungen.
Chemische und biologische Bestimmungen schließen im Allgemeinen das Kontaktieren des zu bestimmenden Stoffes von Interesse mit einer vorher bestimmten, nicht limitierenden Menge einer oder mehrerer Assayreagenzien ein, wobei eine oder mehrere Eigenschaften eines resultierenden Produktes (das/die Nachweisprodukt(e)) gemessen werden und der gemessene Wert mit der Menge des in der ursprünglichen Probe vorhandenen, zu bestimmenden Stoffes korreliert wird, typischerweise durch Verwenden einer Beziehung, die von Standardproben abgeleitet wird, die bekannte Mengen des zu bestimmenden Stoffes von Interesse in dem Bereich, der für die zu untersuchende Probe erwartet wird, enthalten. Typischerweise schließt das Detektionsprodukt eine oder mehrere nachweisbare Markierungen ein, die von einem oder mehreren Assayreagenzien bereitgestellt werden. Beispiele allgemein verwendeter Markierungen, schließen radioaktive Isotopenmarkierungen, wie z. B. ¹²⁵I und ³²P; Enzym (z. B. Peroxidase, ß-Galactosidase)- und Enzym-Substrat-Markierungen; Fluoreszenz-Markierungen (z. B. Fluorosceine, Rhodamine); Elektron-Spin-Resonanz-Markierungen (z. B. freie Radikale für Nitroxid); immunoreaktive Markierungen (z. B. Antikörper, Antigene); und Markierungen, die ein Glied eines Bindepaares sind (z. B. Biotin-Avidin, Biotin-Streptavidin), ein. Sandwichassays schließen typischerweise die Bildung eines Komplexes ein, bei dem das Analyt von Interesse zwischen einem ersten Assayreagenz, das schließlich verwendet wird für die Auftrennung (z. B. Antikörper, Antigen, ein Glied eines Bindepaares), und einem zweiten Assayreagenz, das eine detektierbare Markierung bereitstellt, eingeschoben ist. Kompetitionsassays schließen typischerweise ein System ein, in dem sowohl das Analyt von Interesse und ein Analogon des Analytes um eine Bindungsstelle an einem weiteren Reagenz (z. B. einem Antikörper) konkurrieren, worin entweder das Analyt, das Analogon oder das Bindungsreagenz eine detektierbare Markierung besitzen.
In jüngerer Zeit wurden ECL-Markierungen in chemischen und biologischen Nachweisen üblicher. So können z. B. ECL-Markierungen (z. B. jene, die eine Ru(bpy)₃ ²⁺-Einheit enthalten) modifiziert werden, indem reaktive Gruppen (z. B. an eine oder mehrere der Bipyridylliganden) angehängt werden, um aktivierte Markierungsreagenzien für Proteine, Nukleinsäuren und andere Moleküle zu bilden. Dieser Ansatz bietet viele Vorteile gegenüber anderen Detektionssystemen, wie z. B. ³²P-Radiomarkierung, einschließlich aber nicht beschränkt auf viele der Folgenden: (1) der Abwesenheit radioaktiver Isotope, wobei die Probleme reduziert werden, die im Zusammenhang stehen mit dem Handhaben und Entsorgen der Proben; (2) sehr niedrige Nachweisgrenzen für die ECL-Markierung, oftmals so niedrig wie 0,2 picomolar (2 × 10^–13 M), da jede Markierung zahlreiche Photonen pro Messzyklus emittieren kann; (3) einem dynamischen Bereich für die Quantifizierung der Markierung, der sich oftmals über sechs Größenordnungen erstreckt; (4) extrem stabile Markierungen, oftmals mit langen Lagerfähigkeiten; (5) Markierungen mit niedrigem Molekulargewicht (ungefähr 1000 Atomeinheiten), die an Proteine, Oligonukleotide, etc. gekoppelt werden können, oftmals ohne die Immunoreaktivität, Löslichkeit, Fähigkeit zu Hybridisieren, etc. anzugreifen; (6) hohe Selektivität und niedriger Hintergrund, da die ECL-Reaktionsfolge elektrochemisch initiiert wird und nur jene Spezies, mit geeigneten elektrochemischen Eigenschaften, in der Nähe der Elektrode detektiert werden; und (7) einfache und schnelle Messung, die typischerweise nur wenige Sekunden benötigt.
In den vergangenen Jahren wurde ECL bei der Entwicklung von Immunoassays und DNS-Sondenanalysen verwertet. Siehe, zum Beispiel, Blackburn et al., 1991, Kenten et al., 1991, 1992, Leland et al., 1992, und Yost, 1993.
In einem typischen und wohlbekannten DNS-Auftrennungsassay, der ECL verwendet, wird das Zieloligonukleotid amplifiziert (z. B. unter Verwendung von PCR), wobei ein Biotin-enthaltendes Primeroligonukleotid verwendet wird, um eine erhöhte Konzentration an Zieloligonukleotiden zu ergeben, die eine Biotineinheit enthalten; es wird dann ein Überschuss einer Oligonukleotid-Hybridisierungssonde hinzugegeben, an die eine ECL-Markierung angehängt ist, und die mit den Zieloligonukleotiden hybridisiert, um hybridisierte Sonden-Ziel-Doppelstränge zu bilden; es werden mit Streptavidin überzogene Perlen hinzugegeben, die stark und selektiv die Biotin-enthaltenden Doppelstränge binden; die Perlen werden von der Mischung abgetrennt (z. B. magnetisch, gravimetrisch), wobei die im Überschuss vorhandene, markierte Oligonukleotid-Hybridisierungssonde entfernt wird; und das Zieloligonukleotid, das an die Perlen gebunden ist und das mit einer ECL-markierten Hybridisierungssonde hybridisiert ist, wird detektiert und/oder quantifiziert unter Verwendung von ECL.
Blackburn et al. (1991) offenbaren anscheinend die Verwendung eines N-Succinimidylesterderivates von Ru(bpy)₃ ²⁺ als ein Mittel, um eine ECL-Markierung an eine Oligonukleotid-Hybridisierungssonde anzuhängen. Unter Verwendung eines Biotinmarkierten Oligonukleotidprimers können die Amplifikationsprodukte der Polymerasekettenreaktion („PCR") durch Binden an magnetische Perlen, die mit Streptavidin überzogen sind, abgetrennt werden. Sind sie einmal abgetrennt, wird die Ru(bpy)₃ ²⁺-markierte Oligonukleotidsonde an die gebundenen PCR-Produkte hybridisiert und durch ECL detektiert.
Kenten et al. (1991) offenbaren anscheinend ähnlich die Verwendung von ECL-Assays PCR-amplifizierter Produkte von Oncogenen, Viren und klonierten Genen. In einem Assay wird eine Ru(bpy)₃ ²⁺-Markierung an einen oder beide Oligonukleotidprimer angehängt; nach Amplifikation, Binden und Auftrennen werden die PCR-Produkte durch ECL detektiert. In einem anderen Assay wird eine Oligonukleotidsonde mit einer angehängten Ru(bpy)₃ ²⁺-Markierung mit magnetischen, an Perlen gebundenen PCR-Produkten hybridisiert, die im Überschuss vorhandene Sonde wurde durch Waschen entfernt und das hybridisierte Produkt durch ECL dedektiert. In einen dritten Assay wurde eine Oligonukleotidsonde mit einer angehängten Ru(bpy)₃ ²⁺-Markierung an ungebundene PCR-Produkte hybridisiert, das hybridisierte Produkt wurde an magnetische Perlen gebunden, die im Überschuss vorhandene Sonde wurde durch Waschen entfernt und das hybridisierte Produkt wurde durch ECL detektiert. In jedem Fall wurde das gewünschte Produkt durch die Anwesenheit einer ECL-Markierung detektiert.
Kenten et al. (1992) offenbaren anscheinend „Bindungsassays", die ECL-Markierungen verwenden. Anscheinend wird ein Komplex, der den Analyten von Interesse, eine ECL-Markierung und Partikel enthält, gebildet, und die Anwesenheit dieses Komplexes wird anschließend durch ECL nachgewiesen.
Chemische und biologische Assays können oftmals zweckdienlicherweise als „Trennungsassays" oder „Nicht-Trennungs-Assays" klassifiziert werden. Im Allgemeinen wird/werden in Trennungsassays das/die Detektionsprodukt(e) physikalisch von anderen Produkten und/oder nicht reagiertem Analyten von Interesse und nicht reagierten Assayreagenzien abgetrennt. (So ist es zum Beispiel oftmals notwendig, das Detektionsprodukt physikalisch abzutrennen, so dass nur jene Markierungen, die Teil des Detektionsproduktes sind, detektiert werden und nicht jene des im Überschuss vorhandenen Markierungsreagenz.) Die Menge des Analyten kann dann entweder direkt aus der Menge des markierten Detektionsproduktes bestimmt werden oder indirekt aus der Menge des nicht verwendeten Markierungsreagenz. Die Abtrennung kann oftmals durch Ausnützen einer selektiven Bindungsreaktion zwischen den Gliedern eines Bindungspaares (z. B. Biotin-Avidin, Antikörper-Antigen, Oligonukleotidhybridisierungssonde-Oligonukleotid) erreicht werden. Zum Beispiel kann ein markiertes Detektionsprodukt, das ein Glied eines Bindungspaares aufweist, zuerst in einer flüssigen Phase (z. B. in Lösung) gebildet werden und die Abtrennung kann dann zum Beispiel durch Einfangen des ECL-markierten Detektionsproduktes durch ein Festphasenreagenz, das das andere Glied des Bindungspaares aufweist, bewirkt werden; das Detektionsprodukt kann dann durch Freiwaschen der festen Phase von nicht reagiertem Analyten und nicht reagierten Reagenzien wiedergewonnen werden. Viele andere Trennungsstrategien, die Bindungspaare verwenden, sind im Stand der Technik wohlbekannt.
Nachweise, die keinen Trennungsschritt benötigen, sind höchst wünschenswert, da sie typischerweise weniger Probenmanipulation benötigen und oftmals leicht an „Echtzeit"-Bestimmungen angepasst werden. Solche Assays können oftmals gewöhnlich klassifiziert werden als „Nicht-Trennungs-Assays". In Nicht-Tennungs-Assays wird das Detektionsprodukt typischerweise nicht physikalisch von nicht verwendeten Assayreagenzien und nicht verwendetem Analyten abgetrennt. Stattdessen wird die Anwesenheit des Detektionsproduktes typischerweise durch eine Eigenschaft nachgewiesen, die wenigstens einen der Assay-Reaktionsteilnehmer erhält oder verliert, nur als ein Ergebnis des Kontaktierens des Analyten von Interesse. Eine Anzahl solcher Nicht-Trennungs-Assays wurde entwickelt.
In einem Beispiel eines Nicht-Trennungs-Assays werden sowohl ein Enzym als auch ein Enzyminhibitor verwendet. Nach Kontaktieren des Analyten von Interesse werden das Enzym und der Enzyminhibitor entweder zusammengebracht (um die Enzymaktivität zu reduzieren) oder voneinander getrennt (um die Enzymaktivität zu erhöhen). Jede Änderung in der Enzymaktivität wird dann mit der Anwesenheit und/oder der Menge des Analyten von Interesse korreliert. Siehe, zum Beispiel, Yoshida et al., 1980, und Zuk et al., 1980.
In einem weiteren Beispiel eines Nicht-Trennungs-Assays werden sowohl ein Chromophor als auch ein Chromophormodifikator verwendet. Wiederum werden nach dem Kontaktieren mit dem Analyten von Interesse, der Chromophor und der Chromophormodifikator entweder zusammenbracht oder voneinander getrennt, woraus sich eine Änderung in der Farbe oder eine Änderung in der Intensität einer bestimmten Farbe ergibt. Jede Änderung der Farbe und/oder Intensität einer Farbe wird dann mit der Anwesenheit und/oder Menge des Analyten von Interesse korreliert. Siehe, zum Beispiel, Zuk et al., 1980.
In noch einem weiteren Beispiel eines Nicht-Trennungs-Assays werden sowohl ein Fluorophor als auch ein Fluorophorlöscher verwendet. Nach dem Kontaktieren des Analyten von Interesse werden das Fluorophor und der Fluorophorlöscher entweder zusammengebracht (um die Fluoreszenz zu reduzieren) oder getrennt (um die Fluoreszenz zu erhöhen). Siehe, zum Beispiel, Ullman et al., 1976; Ullman, 1979; Zuk et al., 1981; und Ullman et al., 1981. Unten werden Beispiele der letzten Jahre an Photolumineszenzassays (z. B. Fluoreszenzassays), die Photolumineszenzlöscher ausnützen, diskutiert.
Tyagi et al. (1996) offenbaren anscheinend einen Assay für Oligonukleotide, der eine besondere Oligonukleotidsonde (auf die Bezug genommen wird als ein „molekulares Leuchtfeuer") verwendet, die sowohl ein Fluorophor (d. h. eine Markierung) als auch einen Fluoreszenzlöscher besitzt. In der Abwesenheit des Zieloligonukleotides hybridisieren Teile der Oligonukleotidsonde mit sich selber, wodurch das Fluorophor und der Fluoreszenzlöscher in enge Nachbarschaft gebracht werden; in dieser Form wird kein Fluoreszenzsignal beobachtet. In der Anwesenheit des Zieloligonukleotides dehybridisiert die Oligonukleotidsonde und hybridisiert vorzugsweise mit dem Zieloligonukleotid, wobei das Fluorophor und der Fluoreszenzlöscher getrennt werden; in dieser Form wird ein Fluoreszenzsignal beobachtet. Folglich wird Fluoreszenz nur beobachtet, von jenen Oligonukleotidsonden, die mit dem Zieloligonukleotid hybridisiert sind. Auf diesem Wege ist es nicht notwendig, die nicht hybridisierten Oligonukleotidsonden vor der Messung des Fluoreszenzsignals zu entfernen.
Heid et al. (1996) offenbaren anscheinend eine quantitative Bestimmung in Echtzeit für die DNS-Analyse unter Verwendung von doppelt markierten, fluorogenen Hybridisierungssonden. Eine Oligonukleotidsonde wird zubereitet mit einem ersten Fluoreszenzfarbstoff (FAM, 6-Carboxyfluorescein), der als ein Reporter wirkt, und einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff (TAMRA, 6-Carboxy-tetramethylrhodamin), der die Emissionsspektra des ersten Fluoreszenzfarbstoffes löscht. Die 5'-spezifische Exonuklease-Wirkung der Taq-Polymerase verursacht den Abbau nur von jenen Sonden, die mit einem Zieloligonukleotid hybridisiert wurden, wodurch die beiden Farbstoffe freigesetzt werden, was in einem Anstieg der FAM-Fluoreszenzemission resultiert.
Wittwer et al. (1997) offenbaren anscheinend Verfahren für die kontinuierliche Fluoreszenzüberwachung von PCR-Produkten während der Amplifikation. In einem Assay werden im Handel erhältliche doppeltmarkierte Oligonukleotidsonden, die sowohl eine „Donor"-Einheit (z. B. Fluorescein) als auch eine „Akzeptor"-Einheit (z. B. Rhodamin) aufweisen, mit einem Zieloligonukleotid hybridisiert. Die enge Nachbarschaft des Akzeptors schwächt das Fluoreszenzsignal des Donors offensichtlich ab. Es wird eine Polymerase mit 5'-spezifischer exo-Nukleoaseaktivität hinzugefügt, und während der Polymerisation wird die Oligonukleotidsonde abgebaut, wodurch sowohl der Donor als auch der Akzeptor freigesetzt werden. Nicht länger in enger Nachbarschaft zu dem Akzeptor, bringt der Donor dann ein gesteigertes Fluoreszenzsignal hervor. In einem anderen Ansatz, basierend auf der Übertragung von Resonanzenergie, werden zwei unterschiedliche Oligonukleotidsonden zubereitet, von denen eine eine „Donor"-Einheit (z. B. Fluorescein) und die andere eine „Akzeptor"-Einheit (z. B. den Cyaninfarbstoff Cy5^®) hat. Die beiden Oligonukleotidsonden werden so ausgewählt, dass, wenn sie mit dem Zieloligonukleotid hybridisiert sind, die Donor- und Akzeptoreinheiten in enge Nachbarschaft gebracht werden. Wenn der Donor mit Licht angeregt wird, wird ein Teil oder all seine Energie auf den Akzeptor übertragen und das Fluoreszenzsignal des Akzeptors steigt an. (Siehe auch, zum Beispiel, Maliwal, et al., 1995).
Auf diesem Wege wird das Zieloligonukleotid detektiert und durch einen Anstieg des Fluoreszenzsignals des Akzeptors quantifiziert.
Anders als das Auslöschen von ECL, wurde das Auslöschen von Photolumineszenz eingehend untersucht, und viele Verbindungen sind bekannt, die die Photolumineszenz unter einer Reihe an Bedingungen löschen. Im US-Patent Nr. 5,332,662 zum Beispiel, wird ein Verfahren zur Bestimmung einer peroxidativ aktiven Substanz offenbart, durch Detektion des Fluoreszenzsignals, das nach der Spaltung einer Substanz, die eine fluoreszierende und eine löschende Gruppe enthält, erzeugt wird. In starkem Gegensatz dazu sind nur wenige Verbindungen bekannt, um wirksam ECL zu löschen, und viele von denen, die wohlbekannt sind (z. B. Methylviologencarboxylat), löschen ECL entweder nur schlecht oder sind unpraktisch für die Verwendung in Bestimmungen.
Die Erfinder haben entdeckt, dass gewisse andere Verbindungsklassen ECL stark auslöschen, wie z. B. Verbindungen, die wenigstens eine Benzoleinheit umfassen und insbesondere Verbindungen, die wenigstens eine Phenoleinheit, Chinoneinheit, Benzolcarbonsäure- und/oder Benzolcarboxylateinheit enthalten.
Die ECL-Eigenschaften solcher Verbindungen wurden noch nicht umfassend untersucht. Die Verwendung stark fluoreszierender Verbindungen, wie z. B. Anthracenen, um die ECL-Emission zu erhöhen, ist bekannt, und sie werden in der Tat viel in den gängigen ECL-Assays verwendet. Chmura et al. (1994) untersuchten anscheinend Bestimmungen für Antioxidantien und freie Radikalfänger, wie z. B. Citrat, die auf der Fähigkeit dieser Verbindungen beruhen, die Anthracen-sensibilisierte ECL auszulöschen. Kricka et al. (1991) beschreiben anscheinend die Verwendung von p-Iodphenol als ein Chemilumineszenz-Verstärker, eher als ein Löscher. Hill et al. (1988) untersuchten anscheinend die ECL-Emisssion einer Anzahl dansylierter Derivate, in dem Bemühen, ECL an Umkehrphasenflüssigchromatographie (RPLC) anzupassen. Sie untersuchten anscheinend die Wirkung der Dansylgruppe (d. h. 5-Dimethylamino-l-naphthalansulfonyl), die eine wohlbekannte Fluoreszenzmarkierung ist, auf die ECL-Emission einer Anzahl an Aminosäuren und phenolischen Verbindungen und fanden heraus, dass die Anwesenheit einer Dansylgruppe, die ECL-Emission vieler der untersuchten Verbindungen erhöhte. In ihrer Untersuchung der ECL von Osmiumkomplexen beschreiben Abruna et al. (1985) anscheinend das Auslöschen (py)₂diphos -Spezies durch eine Ferricenium-Spezies (die oxidierte Form der ECL einer Os(bpy)₂diphos²⁺ eines Ferrocen), einer Spezies, die zwei Cyclopentadienyl-Ionen (d. h., C₅H₅ ^–) und ein dazwischen eingeschobenes Eisenion (d. h. Fe²⁺) enthält.
Unter Verwendung der hierin offenbaren effizienten ECL-Löscher können Assays entwickelt werden, die eine ECL-Markierung und einen ECL-Löscher verwenden und die inter alia Assays ermöglichen, die wie Nicht-Trennungs-Assays viele, wenn nicht alle der durch ECL-Nachweisverfahren angebotenen Vorteile gegenüber anderen Nachweisverfahren bieten. Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung im weiteren Sinne auf gewisse Klassen an chemischen Einheiten, die ECL stark auslöschen, und die Verwendung dieser ECL-Löscher, z. B. in ECL-Assays, die eine ECL-Markierung und einen ECL-Löscher verwenden. Eine Klasse solcher löschenden Einheiten sind jene, die wenigstens eine Benzoleinheit umfassen. Unterklassen solcher Löscheinheiten sind jene, die wenigstens eine Phenoleinheit, Chinoneinheit, Benzolcarbonsäure- und/oder Benzolcarboxylateinheit enthalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein gewisse Klassen an chemischen Einheiten, die ECL stark auslöschen, und die Verwendung dieser ECL-Löscher in Kombination mit ECL-Markierungen, zum Beispiel in ECL-Nachweisverfahren, die einen ECL-Löscher und eine ECL-Markierung verwenden. Eine Klasse solcher löschenden Einheiten sind jene, die wenigstens eine Benzoleinheit enthalten. Unterklassen solcher Löscheinheiten sind jene, die wenigstens eine Phenoleinheit, Chinoneinheit, Benzolcarbonsäure- und/oder Benzolcarboxylateinheit enthalten.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Detektieren eines Oligonukleotids in einer Probenzusammensetzung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Herstellen einer Assaymischung, die umfasst: diese Probenzusammensetzung; ein Reagenz mit einer chemischen Einheit, die Elektrochemilumineszenzeigenschaften aufweist (ECL-Markierung), und ein Reagenz mit einer chemischen Einheit, die beim Löschkontakt mit einer ECL-Markierung die beobachtete ECL-Emission abschwächt (ECL-Löscheinheit), wobei diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Benzoleinheit umfasst; (b) Bestimmen irgendeines Unterschiedes zwischen den ECL-Emissionen von: (i) der in Schritt (a) hergestellten Assaymischung; und (ii) einer Assaymischung, die umfasst: dieses Reagenz mit einer ECL-Markierung; dieses Reagenz mit einer ECL-Löscheinheit; und eine bekannte Menge dieses Oligonukleotides und (c) in Beziehung Setzen jeglichen in Schritt (b) bestimmten Unterschiedes mit der Menge des Oligonukleotides in dieser Probe.
In einem Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Einheit, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Phenoleinheiten, Chinoneinheiten, Benzolcarbonsäureeinheiten und Benzolcarboxylateinheiten. In einem Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Phenoleinheit. In einem Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Chinoneinheit. In einem Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Benzolcarbonsäureeinheit. In einem Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Benzolcarboxylateinheit.
In einem Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Markierung Ruthenium. In einem Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Markierung Osmium. In einem Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Markierung einen polyaromatischen Kohlenwasserstoff.
Der Analyt umfasst ein Oligonukleotid. In einem Ausführungsbeispiel umfasst dieser Analyt DNS. In einem Ausführungsbeispiel umfasst dieser Analyt RNS.
In einem Ausführungsbeispiel ist diese bekannte Menge des Analyten Null.
In einem Ausführungsbeispiel sind dieses Reagenz mit einer ECL-Markierung und dieses Reagenz mit einer ECL-Löscheinheit dasselbe Reagenz. In einem Ausführungsbeispiel sind dieses Reagenz mit einer ECL-Markierung und dieses Reagenz mit einer ECL-Löscheinheit unterschiedliche Reagenzien.
In einem Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren weiterhin die folgenden Schritte: Durchführen einer chemischen Reaktion auf einem Substrat, das in einer Anfangsprobenzusammensetzung enthalten ist, um diesen Analyten in dieser Probenzusammensetzung vor Schritt (a) herzustellen; und in Beziehung setzen jeglichen in Schritt (b) bestimmten Unterschiedes mit der Menge des Substrates in dieser Anfangsprobenzusammensetzung. In einem Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren weiterhin den folgenden Schritt: Durchführen einer chemischen Reaktion mit der in Schritt (a) hergestellten Assaymischung vor der Bestimmung in Schritt (b).
Wie offensichtlich werden wird, sind bevorzugte Merkmale und Eigenschaften eines Aspektes der Erfindung anwendbar auf jeden anderen Aspekt der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das die Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Intensität gegen die Phenolkonzentration (als ein Löschmittel), wie in Beispiel 1 unten beschrieben, darstellt.
2 ist ein Diagramm, das die Ru(bpy)₃ ²⁺/C₂O₈ ^–2-ECL-Intensität gegen die Phenolkonzentration (als ein Löschmittel), wie in Beispiel 2 unten beschrieben, darstellt.
3 ist ein Diagramm, das die Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Intensität gegen die Konzentration von Phenol, p-Hydroxybenzoesäure (PHBA) und p-Aminobenzoesäure (PABA) (als Löschmittel), wie in Beispiel 3 unten beschrieben, darstellt.
4 ist ein Diagramm, das die Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Intensität gegen die Konzentration von Phenol, Katechin, Hydrochinon und Chinon (als Löschmittel), wie in Beispiel 7 unten beschrieben, darstellt.
5 ist ein Diagramm, das die Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Intensität gegen die Konzentration von Phenol, Chinon und 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-l,4-benzochinon (DDQ) (als Löschmittel), wie in Beispiel 8 unten beschrieben, darstellt.
6 ist ein Diagramm, das die Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Intensität gegen die Konzentration von Phenol (als ein Löschmittel) und Methylviologencarboxylat (zum Vergleich), wie im Vergleichsbeispiel 1 unten beschrieben, darstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf gewisse Klassen an chemischen Einheiten, die ECL stark auslöschen, und die Verwendung dieser ECL-Löscher in Kombination mit ECL-Markierungen, z. B. in ECL-Assays, die einen ECL-Löscher und eine ECL-Markierung verwenden.
A. Elektrochemilumineszenzmarkierungen
Wie oben beschrieben, ist ECL die Emission von Photonen elektromagnetischer Strahlung (z. B. Licht) von einer elektronisch angeregten chemischen Spezies, die elektrochemisch erzeugt wurde.
Die Begriffe „Elektrochemilumineszenzmarkierung" und „ECL-Markierung", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf eine chemische Einheit, die Elektrochemilumineszenzeigenschaften hat. Genauer ist eine ECL-Markierung eine chemische Einheit, die elektrochemisch zu einer elektronisch angeregten Spezies umgewandelt werden kann, die entweder direkt oder nach einer weiteren chemischen Reaktion eine oder mehrere Photonen (z. B. Licht) emittiert, wenn sie in einen Zustand niedrigerer Energie übergeht.
Eine Anzahl an chemischen Einheiten können als eine ECL-Markierung dienen. Eine wichtige Klasse solcher Einheiten sind von Metallchelaten abgeleitet, die ein oder mehrere identische oder unterschiedliche Metallionen und ein oder mehrere identische oder unterschiedliche Liganden umfassen können.
In einem Ausführungsbeispiel wird das Metallion des Metallchelates aus der Gruppe bestehend aus Übergangsmetallionen und Seltenerdmetalionen in jedem ihrer Oxidationszustände ausgewählt. In einem anderen Ausführungsbeispiel wird das Metallion aus der Gruppe bestehend aus Ionen von Ruthenium, Osmium, Rhenium, Iridium, Rhodium, Platin, Indium, Palladium, Molybdän, Technetium, Kupfer, Chrom und Wolfram in irgendeinem ihrer Oxidationszustände ausgewählt. In einem anderen Ausführungsbeispiel wird das Metallion aus der Gruppe bestehend aus Ionen von Ruthenium und Osmium in irgendeinem ihrer Oxidationszustände ausgewählt.
Liganden der Metallchelate können einzählig oder vielzählig sein und sie können organisch (d. h. wenigstens ein Kohlenstoffatom aufweisend) oder anorganisch sein. Beispiele einzähliger Liganden schließen Kohlenmonoxid (d. h. CO), das Cyanidion (d. h. CN^–), Isocyanidion (d. h. NC^–), Halide (z. B. F^–, Cl^–, Br^–, I^–), Phosphine (z. B. PR₃), Amine (z. B. NR;), Stilbene (z. B. SbR₃) und Arsine (z. B. AsR₃) ein. Beispiele vielzähliger Liganden schließen aromatische heterozyklische Liganden, wie z. B. stickstoffenthaltende aromatische heterozyklische Liganden ein. Beispiele stickstoffenthaltender aromatischer heterozyklischer Liganden schließen nichtsubstituierte und substituierte Bipyridyle, Bipyrazyle, Terpyridyle und Phenanthrolyle ein. Beispiele für Substituenten schließen C_1–6-Alkyl, substituiertes C_1–6-Alkyl, C₆_₁₅-Aryl und -Heteroaryl, substituiertes C_6–15-Aryl und -Heteroaryl, C-Aralkyl und -Heteroaralkyl, substituiertes C_7–15-Aralkyl und -Heteroaralkyl, Carboxy (d. h. -COOH). Carboxylat (d. h. -COO^–)_; Carboxyester (d. h. -COOR, wie z. B. der N-Hydroxysuccinimidylester), Carboxaldehyd (d. h. -CHO), Carboxamid (d. h. -CONH₂), Hydroxy (d. h. -OH), Cyano (d. h. -CN), Isocyano (d. h. NC), Amino (d. h. -NH₂), Imino (d. h. =NH), Sulfhydryl (d. h. -SH) und Phosphino (d. h. -PH₂) ein.
In einem Ausführungsbeispiel wird die ECL-Markierung abgeleitet aus einem Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II)-Kation, Ru(bpy)₃ ²⁺, unten gezeigt, oder einem Derivat davon.
Salze von Ru(bpy)₃ ²⁺ und desssen Derivate sind gewöhnlich sehr stabile, wasserlösliche Verbindungen, die chemisch modifiziert werden können, um reaktive Gruppen aufzuweisen (d. h. um chemisch aktivierte Spezies zu bilden). Zum Beispiel können eine oder mehrere reaktive Gruppen angehängt werden an ein oder mehrere der Bipyridylliganden, die dann das Anhängen der Ru(bpy)₃ ²⁺-ähnlichen Einheit (als eine ECL-Markierung) an andere Moleküle ermöglicht. Siehe, zum Beispiel, Bard et al., 1993, und Blackburn et al., 1991.
Es können zum Beispiel eine der drei Bipyridylliganden derivatisiert werden, um einen N-Succinimidylester einer Carbonsäuregruppe aufzuweisen, der angehängt ist an eine der Bipyridylliganden über eine Linkergruppe. Solch eine Verbindung ist 4-(N-Succinimidyloxycarbonylpropyl)-4'-methyl-2,2'-bipyridin-bis-(2,2'-bipyridin)ruthenium(II)-dihexafluorophosphat, deren Kation unten gezeigt ist und die käuflich erwerblich ist von IGEN Inc. (Rockville, Maryland) unter der Produktbezeichnung Origen^®-ECL-Markierung. Dieser aktivierte Ester, unten gezeigt, erlaubt das leichte Anhängen der Ru(bpy)₃ ²⁺-ähnlichen ECL-Markierung an Moleküle, die z. B. eine Amingruppe (z. B. -NH₂) aufweisen.
In einem weiteren Beispiel kann einer der drei Bipyridylliganden derivatisiert werden, um eine Maleinimidgruppe, wahlweise über eine Linkergruppe, aufzuweisen. Dies kann erreicht werden, beispielsweise, indem man ein aktives Esterderivat, wie z. B. das oben gezeigte, mit einem Maleinimidoalkylamin (z. B. Maleinimidoethylamin) reagieren lässt. Solch eine Verbindung ist 4-(Maleinimido-ethylamino-carbonylpropyl)-4'-methyl-2,2'bipyridin-bis(2,2'-bipyridin)ruthenium(II)-dihexafluorophosphat, deren Kation unten gezeigt ist. Dieses Maleinimid ermöglicht das leichte Anhängen der Ru(bpy)₃ ²⁺-ähnlichen ECL-Markierung an Moleküle, die beispielsweise eine Thiolgruppe (z. B. -SH) aufweisen.
Andere Beispiele von Metallchelaten, aus denen Ru(bpy)₃ ²⁺-ähnliche ECL-Markierungen abgeleitet werden können, schließen ein:
Bis[(4,4'-carbomethoxy)-2,2'-bipyridin]-2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-dioxolanruthenium(II);
Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(butan-l-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]ruthenium(II);
Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)-Buttersäure]ruthenium(II);
Bis(2,2'-bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin)-butylamin]ruthenium(II);
Bis(2,2'-bipyridin)-[1-bromo-4(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)butan]-ruthenium(II); und
Bis[(2,2'-bipyridin)-maleinimidohexansäure]-4'-methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylamidruthenium(II).
Andere Beispiele an Metallchelaten, aus denen ECL-Markierungen abgeleitet werden können, schließen andere 2,2'-Bipyridylkomplexe, wie z. B. Os(bpy)₃ ²⁺ und dessen Derivate ein; Phenanthrolin (Phen) und dessen Derivate; andere Übergangsmetallfluorophore, wie z. B. Tricarbonyl(chloro)(1,10-phenanthrolin)rhenium(I), rechteckig planare Platin(II)-Komplexe, Cr(bpy)3²⁺; vielkernige Komplexe, wie z. B. Pt2(diphosphonat)₄4^–; und Cluster wie z. B. Mo₆Cl₁ ₂ ^2–.
Eine weitere wichtige Klasse an chemischen Einheiten, die als eine ECL-Markierung dienen können, sind jene, die abgeleitet sind aus polyaromatischen Kohlenwasserstoffen, wie z. B. Naphthalen, Anthracen, 9,10-Diphenylanthracen, Phenanthren, Pyren, Chrysen, Perylen, Coronen, Ruhren und ähnliche, und die aus organischen Laserfarbstoffen, wie z. B. Fluoroscein, Rhodamin und ähnlichen, abgeleitet sind, die in der Lage sind, Licht nach elektrochemischer Anregung zu emittieren.
Typischerweise werden eine oder mehrere ECL-Markierungen an ein weiteres Molekül (z. B. einen Antikörper, eine Oligonukleotidsonde) angehängt (z. B. konjugiert). ECL-Markierungen können an Moleküle unter Verwendung von synthetischen Standardverfahren, die Fachleuten wohlbekannt sind, angehängt werden (um markierte Moleküle zu bilden). So kann z. B., wie oben diskutiert, ein Molekül, das eine ECL-Markierung (z. B. Ru(bpy)₃ ²⁺oder ein Derivat davon) umfasst, derivatisiert werden, um eine chemisch aktivierte Spezies zu bilden (z. B. einen aktivierten Ester, ein Maleinimid), das dann reagiert werden kann mit, und folglich kovalent gebunden an, einem Molekül (z. B. um ein markiertes Assayreagenz zu ergeben).
B. Löscheinheiten
Wie oben beschrieben, ist ECL die Emission von Photonen mit elektromagnetischer Strahlung (z. B. Licht) von einer elektronisch angeregten chemischen Spezies, die elektrochemisch, entweder direkt oder indirekt, erzeugt worden war. Die beobachtete ECL-Emission kann teilweise vollständig abgeschwächt werden, durch eine Löscheinheit, die in Löschkontakt mit einer ECL-Markierung ist. Die Begriffe „Löscheinheit" und „Löscher", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf eine chemische Einheit, die, wenn sie in Löschkontakt mit einer ECL-Markierung ist, die beobachtete ECL-Emission abschwächt.
Die Formulierung „in Löschkontakt mit", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf den Zustand, bei dem die beobachtete ECL-Emission einer ECL-Markierung durch die Anwesenheit einer ECL-Löscheinheit abgeschwächt wird. Eine Löscheinheit, die in Löschkontakt mit einer ECL-Markierung ist, schwächt die beobachtete ECL-Emission jener Markierung um wenigstens 10% ab. Vorzugsweise schwächt eine Löscheinheit in Löschkontakt mit einer ECL-Markierung die beobachtete ECL-Emission jener Markierung um wenigstens 20%, bevorzugter um wenigstens 30%, noch bevorzugter um wenigstens 40%, und noch bevorzugter um wenigstens 50% ab. Typischerweise befindet sich eine Löscheinheit, die in Löschkontakt mit einer ECL-Markierung ist, physikalisch in räumlicher Nähe zu der ECL-Markierung. Zum Beispiel ist eine Löscheinheit, in Löschkontakt mit einer ECL-Markierung, typischerweise von einer ECL-Markierung durch eine Distanz von weniger als ungefähr 100 nm, noch typischer weniger als ungefähr 50 nm, noch viel typischer weniger als ungefähr 30 nm, und noch typischer weniger als ungefähr 10 nm, getrennt. Unter Verwendung von wohlbekannten und Standardverfahren kann ein Fachmann leicht bestimmen, ob eine potentielle Löscheinheit in der Tat die beobachtete ECL-Emission abschwächen wird, und auch, ob eine bestimmte Löscheinheit tatsächlich in Löschkontakt mit einer ECL-Markierung ist, oder nicht.
Ohne zu wünschen, an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, stellen die Anmelder fest, dass eine Anzahl an möglichen Mechanismen für die Löschwirkung postuliert worden sind. Nach einem Mechanismus, entspannt sich die elektronisch angeregte Markierung durch Übertragen eines Elektrons an den Löscher (vielleicht durch quantenmechanische Tunnelung), um einen elektronisch erregten Löscher zu ergeben, der sich nicht-strahlend (z. B. vibratorisch, rotatorisch) entspannt. Nach einem anderen Mechanismus, entspannt sich die elektronisch angeregte Markierung, indem ein Photon emittiert wird, das durch den Löscher absorbiert wird, um einen elektronisch angeregten Löscher zu ergeben, der sich wiederum nicht-strahlend entspannt. Nach noch einem weiteren Mechanismus, wird die Löscheinheit elektrochemisch in ein Elektrooxidations- oder Elektroreduktionsprodukt umgewandelt (typischerweise während der ECL-Messung) und dieses Produkt (oder das anschließende Reaktionsprodukt) löscht die ECL, zum Beispiel, durch einen der vorangegangenen Mechanismen. Nach noch einem weiteren Mechanismus, wirkt die Löscheinheit oder ein Elektrooxidations- oder Elektroreduktionsprodukt der Löscheinheit (oder das anschließende Reaktionsprodukt) als ein freier Radikalfänger und fängt eine oder mehrere der in die ECL-Reaktionsfolge involvierten Spezies ab (z. B. TPA^. kann vor der Reaktion mit Ru(bpy)₃ ²⁺ abgefangen werden, wodurch die Bildung von Ru(bpy)₃ ²⁺* verhindert wird) und löscht folglich die ECL.
Eine Anzahl an chemischen Einheiten kann als eine Löscheinheit dienen. Eine wichtige Klasse solcher Löscheinheiten sind jene, die wenigstens eine Benzoleinheit enthalten. Eine Unterklasse bevorzugter Löscheinheiten sind jene, die wenigstens eine Phenoleinheit enthalten. Eine weitere Unterklasse bevorzugter Löscheinheiten sind jene, die wenigstens eine Chinoneinheit (d. h. ein 1,4-Benzochinon oder ein 1,2-Benzochinon) enthalten. Noch eine weitere Unterklasse bevorzugter Löscheinheiten, sind jene, die wenigstens eine Benzolcarbonsäure- oder Benzolcarboxylateinheit enthalten.
Der Begriff „Löschmittel", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine chemische Verbindung, die eine Löscheinheit umfasst. Beispiele an Löschmitteln, die wenigstens eine Phenoleinheit enthalten und von denen Löscheinheiten, die wenigstens eine Phenoleinheit umfassen. abgeleitet werden können, schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf:
Phenol;
Alkylphenole, wie z. B. C₁_₆-Alkylphenole, einschließlich o-Alkylphenol, m-Alkylphenol und p-Alkylphenol, wie z. B. o-Methylphenol (d. h. o-Kresol), m-Methylphenol (d. h. m-Kresol), p-Methylphenol (d. h. o-Kresol), o-Ethylphenol, m-Ethylphenol, p-Ethylphenol, o-Propylphenol, m-Propylphenol und p-Propylphenol;
Arylphenole, wie z. B. C_7–10-Arylphenole, einschließlich o-Arylphenol, m-Arylphenol, und p-Arylphenol, wie z. B. p-Phenylphenol;
Halophenole, einschließlich o-Halophenol, m-Halophenol, und p-Halophenol, wie z. B. o-Fluorophenol, m-Fluorophenol und p-Fluorophenol;
Hydroxyphenole, einschließlich o-Hydroxyphenol (d. h. Katechin), m-Hydroxyphenol (d. h. Resorcinol) und p-Hydroxyphenol (d. h. Hydroxychinon); und
Biphenole, wie z. B. 4,4'-Biphenol.
Beispiele an Löschmitteln, die wenigstens eine Chinoneinheit umfassen und von denen Löscheinheiten, die wenigstens eine Chinoneinheit umfassen, abgeleitet werden können, schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf:
Chinone (d. h. Benzochinone), wie z. B. o-Chinon (d. h. 1,2-Benzochinon) und p-Chinon (d. h. 1,4-Benzochinon);
Alkylchinone, wie z. B. C₁_₆-Alkylchinone, einschließlich C₁_₆-Alkyl-1,4-benzochinone, wie z. B. 2-Methyl-1,4-Benzochinon, 2-Ethyl-1,4-Benzochinon, 2-n-Propyl-1,4-Benzochinon, 2,6-Dimethyl-l,4-Benzochinon und 2,5-Dimethyl-l,4-Benzochinon;
Halochinone, wie z. B. Halo-1,4-Benzochinon, einschließlich 2-Fluoro-l,4-benzochinon, 2-Chloro-l,4-Benzochinon, 2-Bromo-l,4-benzochinon, 2-Iod-1,4-Benzochinon, 2,6-Difluoro-l,4-Benzochinon, 2,5-Difluoro-l,4-Benzochinon; 2,6-Dichloro-l,4-Benzochinon, 2,5-Dichloro-l,4-Benzochinon; 2,6-Dibromo-l,4-Benzochinon, und 2,5-Dibromo-l,4-benzochinon;
Naphthochinone, wie z. B. 1,2-Napthochinone und 1,4-Naphthochinone, einschließlich 2-Methoxy-3-methyl-l,4-naphthochinon;
Anthrachinone, wie z. B. 1,2-Anthrachinone, 1,4-Anthrachinone, 9,10-Anthrachinone, einschließlich 1,5-Dihydroxy-9,10-anthrachinon, 1,2,3,4-Tetrafluoro-5,8-dihydroxy-9,10-anthrachinon, 9,10-Anthrachinon-2-carbonsäure, 9,10-Anthrachinon-2-sulfonsäure, 9,10-Anthrachinon-1,5-disulfonsäure und 9,10-Anthrachinon-2,6-disulfonsäure.
Beispiele an Löschmitteln, die wenigstens eine Benzolcarbonsäure- oder Benzolcarboxylateinheit aufweisen, und von denen Löscheinheiten, die wenigstens eine Benzolcarbonsäure- oder Benzolcarboxylateinheit abgeleitet werden können, schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf:
Benzoesäure;
Aminobenzoesäuren, wie z. B., o-Aminophenol, m-Aminophenol und p-Aminophenol;
Hydroxybenzoesäuren, wie z. B. o-Hydroxyphenol, m-Hydroxyphenol und p-Hydroxyphenol; und
Nitrobenzoesäure, wie z. B. o-Nitrophenol, m-Nitrophenol und p-Nitrophenol.
In einem Ausführungsbeispiel ist die Löscheinheit ein Chinon oder ein Derivat davon. Chinon und seine Derivate können gewöhnlich chemisch modifiziert werden, um reaktive Gruppen aufzuweisen (d. h., um chemisch aktivierte Spezies zu bilden). Zum Beispiel können eine oder mehrere reaktive Gruppen angehängt werden (z. B. an den ortho- oder meta-Positionen von 1,4-Benzochinon), wahlweise über eine Linkergruppe, was dann das Anhängen der Chinon-ähnlichen Einheit (als eine Löscheinheit) an die anderen Moleküle erlaubt.
Zum Beispiel kann ein 1,4-Benzochinon derivatisiert werden, um eine Carbonsäuregruppe (d. h. -COOH), angehängt an einen ortho- oder meta-Kohlenstoff über eine Linkergruppe, wie z. B. eine Alkylgruppe, aufzuweisen. Solch eine Verbindung ist 2-(1-Carboxy-but-2-yl)-5-methyl-l,4-benzochinon. Dieses Carbonsäurederivat kann derivatisiert werden, um den N-Succinimidylester (unten gezeigt) zu bilden, der das leichte Anhängen der Chinon-ährlichen Löscheinheit an Moleküle, die z. B. eine Aminogruppe aufweisen, erlaubt.
Löscheinheiten können an Moleküle angehängt werden unter Verwendung von Standard- und wohlbekannten synthetischen Verfahren. Zum Beispiel kam, wie oben diskutiert, ein Molekül, das eine Löscheinheit (z. B. Benzol oder ein Derivat, wie z. B. Phenol, Chinon, Benzolcarbonsäure, Benzolcarboxylat) umfasst, derivatisiert werden, um eine chemisch aktivierte Spezies (z. B. einen aktiven Ester, ein Maleinimid) zu bilden, die man dann mit einem Molekül reagieren lässt und die folglich an das Molekül kovalent gebunden wird.
C. Assays, die eine ECL-Markierung und einen ECL-Löscher verwenden
Die vorliegende Erfindung stellt neue Assay-Verfahren zum Detektieren und vorzugsweise Quantifizieren von einem oder mehreren Analyten von Interesse bereit, die in einer Probenzusammensetzung vorhanden sind. Die Begriffe „Assay" und „Assayverfahren", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf ein Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von (z. B. qualitativer Assay) und vorzugsweise zum Quantifizieren von (z. B. quantitative Assays) einem oder mehreren Analyten von Interesse.
Assays der vorliegenden Erfindung schließen im Allgemeinen das Kontaktieren des Analyten von Interesse (welcher typischerweise ein Bestandteil einer Probenzusammensetzung ist) mit einer vorbestimmten, nicht begrenzten Menge an einem oder an mehreren Assayreagenz/ien ein, wodurch die ECL-Eigenschaften eines resultierenden Produktes (dem/den Nachweisprodukt(en)) gemessen werden, und schließt das in Beziehung Setzen der gemessenen ECL mit der Menge des in der Ausgangsprobe vorhandenen Analyten ein, typischerweise unter Verwendung einer Beziehung, die aus Standardproben bestimmt wird, die bekannte Mengen des Analyten von Interesse in dem für die zu untersuchende Probe erwarteten Bereich enthält. In einem qualitativen Assay kann das einfache Bestimmen, ob die gemessene ECL über oder unter einem Schwellenwert liegt (festgesetzt, beispielsweise unter Verwendung von Proben, von denen bekannt ist, dass sie den Analyten von Interesse enthalten oder frei davon sind) ausreichend sein, um das Assayergebnis festzustellen. Folglich kann sich der Begriff „messen" bis es nicht anders notwendig ist, sowohl auf die qualitative als auch auf die quantitative Bestimmung beziehen. Assays der vorliegenden Erfindung können heterogene (Trennungs-) Assays oder homogene (Nicht-Trennungs-) Assays sein.
Die Begriffe „Analyt" und „Analyt von Interesse", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf ein Oligonukleotid, das detektiert und vorzugsweise quantifiziert werden soll.
Die Begriffe „Probe" und „Probenzusammensetzung", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf eine Zusammensetzung, die einen oder mehrere Analyten von Interesse umfassen, oder die bearbeitet sein können, um einen oder mehrere Analyten von Interesse zu umfassen. Die Probe kann in fester, Emulsions-, Suspensions-, flüssiger oder Gasform sein. Typischerweise ist die Probe behandelt (z. B. durch die Zugabe eines flüssigen Elektrolyten), um in einer fließenden (d. h. freiströmenden) Form (z. B. Emulsion, Suspension, Lösung) zu sein, um die Detektion und Quantifikation des Analysen von Interesse unter Verwendung von ECL-Verfahren leicht zu ermöglichen und zu vereinfachen. Typischerweise ist der Analyt von Interesse in der Probenzusammensetzung in einer Konzentration von 10^–3 M (mikromolar) oder geringer vorhanden, zum Beispiel oftmals so gering wie 10^–12 M (picomolar) und sogar so gering wie 10^–13 M (subpicomolar).
Die Assays der vorliegenden Erfindung können als ECL-Assays charakterisiert werden; dies bedeutet, dass in den Assays der vorliegenden Erfindung die Anwesenheit des Analyten von Interesse und vorzugsweise die Menge des Analysen von Interesse bestimmt wird unter Verwendung von ECL. Weiterhin beruhen die Assays der vorliegenden Erfindung auf der Verwendung von ECL-Markierung in Kombination mit bestimmten Klassen an ECL-Löschern. Eine Klasse solcher ECL-Löscheinheiten sind jene, die wenigstens eine Benzoleinheit enthalten. Unterklassen solcher Löscheinheiten sind jene, die wenigstens eine Phenoleinheit, Chinoneinheit, Benzolcarbonsäure- und/oder Benzolcarboxylateinheit, wie oben beschrieben, enthalten.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Bestimmen eines Analyten in einer Probenzusammensetzung bereit, das die Schritte aufweist:

(a) Herstellen einer Assaymischung, die: diese Probenzusammensetzung; ein Reagenz mit einer ECL-Markierung; ein Reagenz mit einer ECL-Löscheinheit, wobei diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Benzoleinheit umfasst;
(b) Bestimmen irgendeines Unterschiedes zwischen den ECL-Emissionen von
(i) der in Schritt (a) hergestellten Assaymischung; und
(ii) einer Assaymischung, die dieses Reagenz mit einer ECL-Markierung; dieses Reagenz mit einer ECL-Löscheinheit; und eine bekannte Menge dieses Analyten umfasst; und
(c) in Beziehung Setzen jeglichen in Schritt (b) bestimmten Unterschiedes mit der Menge des Analyten in dieser Probe.

In einem Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Einheit, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phenoleinheiten, Chinoneinheiten, Benzolcarbonsäureeinheiten und Benzolcarboxylateinheiten, wie oben beschrieben. In einem weiteren Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Phenoleinheit. In einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Chinoneinheit. In einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Benzolcarbonsäureeinheit. In einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst diese ECL-Löscheinheit wenigstens eine Benzolcarboxylateinheit.
In einem Ausführungsbeispiel ist diese bekannte Menge des Analyten Null.
In einem Auführungsbeispiel sind dieses Reagenz mit einer ECL-Markierung und dieses Reagenz mit einer ECL-Löscheinheit dasselbe Reagenz. In einem anderen Ausführungsbeispiel sind dieses Reagenz mit einer ECL-Markierung und dieses Reagenz mit einer ECL-Löscheinheit unterschiedliche Reagenzien.
In einem Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren weiterhin den einleitenden Schritt des Durchführens einer chemischen Reaktion auf einem Substrat, das in einer anfänglichen Probenzusammensetzung vorhanden ist, um diesen Analyten in dieser Probenzusammensetzung herzustellen, und den Endschritt des in Beziehung Setzens jeglichen in Schritt (b) bestimmten Unterschiedes mit der Menge des Substrates in dieser anfänglichen Probenzusammensetzung.
In einem Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt des Durchführens einer chemischen Reaktion mit der Assaymischung, die in Schritt (a) hergestellt wird, vor der Bestimmung von Schritt (b).
In einem Ausführungsbeispiel resultiert die Anwesenheit eines bestimmten Analyten von Interesse in einer Abnahme der ECL-Emission, was z. B. aus einer Abnahme in einer bestimmten ECL-Emission einer ECL-Markierung resultiert. Solch eine Änderung in der ECL-Emission kann z. B. daraus resultieren, dass eine Löscheinheit in Löschkontakt mit einer ECL-Markierung gebracht wird. Alternativ resultiert in einem anderen Ausführungsbeispiel, die Anwesenheit eines bestimmten Analyten von Interesse in einer Zunahme der ECL-Emission, die z. B. aus einem Anstieg einer bestimmten ECL-Emission einer ECL-Markierung resultiert. Solch eine Änderung in der ECL-Emission kann z. B. aus der Entfernung einer Löscheinheit von dem Löschkontakt mit einer ECL-Markierung resultieren.
In einem Ausführungsbeispiel nutzen die Assays der vorliegenden Erfindung Bindungspaare aus, um ECL-Markierungen und ECL-Löscheinheiten zusammenzubringen (in Löschkontakt) oder zu trennen (vom Löschkontakt). Beispiele von Bindungspaaren schließen Oligonukleotide und Oligonukleotid-Hybridisierungssonden; Antikörper und Antigene; Enzyme und Substrate; und starke Bindungspaare, wie z. B. Biotin-Avidin, ein. Solche Bindungspaare können typischerweise in Assays der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um den Nachweis eines Analyten von Interesse zu erlauben, der ein Glied eines Bindungspaares ist, oder der mit einem Glied eines Bindungspaares konjugiert ist.
Die Assays der vorliegenden Erfindung werden verwendet, um Oligonukleotide (z. B. DNS, RNS) zu detektieren. Desoxyribonukleinsäure (DNS) ist ein Polynukleotid, genauer ein Polymer aus Desoxyribonukleotideinheiten. Ein Desoxyribonukleotid besteht typischerweise aus einer Stickstoffbase, einem Zucker und einer oder mehreren Phosphatgruppen. Ein Desoxyribonukleosid besteht typischerweise aus einer Stickstoffnase und einem Zucker. In natürlich vorkommender DNS ist die Zuckergruppe typischerweise ß-D-2'-Desoxyribofuranose und die Stickstoffbase ist typischerweise ein Purin (z. B. Adenin, A, und Guanin, G) oder ein Pyrimidin (z. B. Thymin, T, oder Cytosin, C). Am häufigsten ist der C-1-Kohlenstoff der D-2 "-Desoxyribose mit dem N-1 eines Pyrimidins oder dem N-9 eines Purins verbunden; die Konfiguration dieser N-glykosidischen Bindung ist ß (die Base liegt oberhalb der Ebene des Zuckers). Die vier natürlich vorkommenden Desoxyribonukleoside werden Desoxyadenosin (dA), Desoxyguanosin (dG), Desoxythymidin (dT) und Desoxycytidin (dC) genannt. Desoxynukleotide sind Phosphatester der Desoxynukleoside. Am häufigsten wird der Phosphatester an der 5'-OH-Gruppe der Zuckergruppe gebildet (d. h. 5'-OH wird zu 5'-OPO₃ ^–2 umgewandelt); auf die resultierende Verbindung wird Bezug genommen als ein Nukleosid-5'-phosphat oder ein 5'-Nukleotid. Es können mehr als eine Phosphatgruppe angehängt werden (z. B. Diphosphat, 5'-OPO₂OPO₃ ^–3; Triphosphat, 5'-OPO₂OPO₂PO₃ ^.4). So ist zum Beispiel ein wichtiger aktivierter Vorläufer bei der Synthese von DNS Desoxyadenosin-5'-triphosphat (dATP).
Wie oben erwähnt, ist DNS ein Polymer aus Desoxyribonukleotideinheiten. Am häufigsten ist das polymerische Rückgrat der DNS konstant und besteht aus Desoxyribosegruppen, die durch Phosphatgruppen verbunden sind; genauer ist die 3'-Position einer Desoxyribosegruppe (sie war 3'-OH) mit der 5'-Position der benachbarten Desoxyribosegruppe (sie war 5'-OH) über eine Phosphodiestergruppe (d. h. -OP(=O)(O^–)O-) gekoppelt. Die variable Seite der DNS ist ihre Sequenz der Basen (z. B. A, G, C und T), die angehängt sind an die 1'-Position jeder Desoxyribosegruppe. Folglich wird auf die vier sich wiederholenden Einheiten (auf die oftmals Bezug genommen wird als Reste), die in DNS am häufigsten gefunden werden, Bezug genommen als Desoxyadenylat, Desoxyguanylat, Desoxycytidylat und Desoxythymidylat.
Ein DNS-Polymer kann gewöhnlich durch seine Teilbasen wiedergegeben werden, worauf oftmals Bezug genommen wird als seine „Sequenz". Da ein Ende des DNS-Moleküls mit einer Zuckergruppe mit einer freien 3'-Gruppe (z. B. 3'-OH, 3'-OPO₃ ^–2) endet, und da das andere Ende mit einer Zuckergruppe mit einer freien 5'-Gruppe (z. B. 5'-OH, 5'-OPO₃ ^–2) endet, ist es notwendig, unmissverständlich festzustellen, welches Ende welches ist. Als eine Sache allgemeiner Übereinkunft wird DNS von links nach rechts, von dem 5'-Ende zum 3'-Ende, wiedergegeben. Folglich bedeutet ACG 5'-ACG-3'oder 5'-A-3'-5'-C-3'-5'-G-3'. In einigen Fällen kann ein DNS-Polymer zyklisch sein und folglich kein Ende haben; in solchen Fällen wird die Sequenz von 5' nach 3" wiedergegeben, ausgehend von einem geeigneten, möglicherweise verzweigten Ausgangspunkt.
DNS tritt gewöhnlich in einer Doppelhelixform (Watson-Crick) auf, in der zwei helikale Polynukleotidketten (z. B. Stränge) um eine gemeinsame Achse gewunden sind, wobei jede Kette in unterschiedliche Richtungen („antiparallel") mit Bezug auf ihre 5'-3'-Polarität, wie oben diskutiert, verläuft. Die Purin- und Pyrimidinbasen befinden sich auf der Innenseite der Helix, wohingegen die Phosphat- und Desoxyribosegruppen auf der Außenseite sind. Die Ebenen der Basen verlaufen grob rechtwinklig zu der Helixachse und die Ebenen der Zucker annähernd parallel zu der Helixachse. Der Durchmesser der Helix ist ungefähr 20 Å. Benachbarte Basen werden entlang der Helixachse voneinander getrennt durch ungefähr 3,4 Å und stehen miteinander in Beziehung durch eine Rotation von ungefähr 36°. Folglich wiederholt sich die helikale Struktur nach zehn Resten auf jeder Kette, d. h. in Intervallen von 34 Å. Eine relativ kleine DNS-Helix, worin jeder Strang 1000 Reste hat, ist ungefähr 3,4 μm von einem Ende zum Nächsten lang.
Die beiden Ketten werden zusammengehalten durch Wasserstoffbrückenbindung zwischen den Paaren der Basen (oftmals bezeichnet als „Basenpaare") und durch Stapelwechselwirkung (Teilen der π-Elektronen) zwischen benachbarten Basenpaaren. Wegen sterischer Gründe und wegen der Wasserstoffbrückenbindung, ist ein Purin stets mit einem Pyrimidin gepaart; genauer ist ein Adenin stets mit einem Thymin gepaart (über zwei Wasserstoffbrücken) und Guanin ist stets mit Cytosin gepaart (über drei Wasserstoffbrücken). Folglich trägt jedes Basenpaar ungefähr 620 Dalton zum Molekulargewicht der Doppelhelix bei. Es ist jedoch festzustellen, dass es keine Beschränkung bezüglich der Sequenz der Basen entlang der Polynukleotidkette gibt. Es ist die genaue Sequenz der Basen, die die genetische Information trägt.
Die beiden Stränge einer DNS-Doppelhelix trennen sich leicht, wenn die Wasserstoffbrücken zwischen ihren gepaarten Basen unterbrochen werden, was durch Erhitzen einer DNS-Lösung oder durch das Zufügen von Säure oder Base, um die Basen zu ionisieren, durchgeführt werden kann. Das daraus resultierende Entwinden der Doppelhelix wird allgemein bezeichnet als „Schmelzen" oder „Denaturieren" und ist durch eine Schmelztemperatur charakterisiert, bei der die Hälfte der Moleküle einzelsträngig gemacht sind. Das Schmelzen ist gewöhnlich reversibel und die entwundenen Ketten können, um die Helix erneut auszubilden, in einem Vorgang, der allgemein bezeichnet wird als „Annealing", „Renaturierung" oder „Hybridisierung" zusammenkommen.
Ribonukleinsäure (RNS) ist ein weiteres Beispiel eines Polynukleotids. Ähnlich wie DNS ist RNS ein Polymer, das aus Nukleotiden besteht, die über 3'-5'-Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Die kovalente Struktur der RNS unterscheidet sich von jener der DNS in zwei wichtigen Hinsichten. In RNS ist die Zuckergruppe ß-D-Ribose (anstelle von ß-D-2'-Desoxyribose). Auch ist eine der vier Hauptbasen in RNS das Pyrimidin Uracil, U (welches das in DNS aufzufindende Thymin ersetzt). Folglich sind die Basenpaare in RNS, AU und GC, (anstelle von den in DNS gefundenen AT und GC). RNS kann einzelsträngig und doppelsträngig sein, obwohl sie gewöhnlich einzelsträngig ist. Obwohl RNS keine Doppelhelix des B-DNS-Typs ausbilden kann, bildet RNS oftmals Bereiche mit doppel helikaler Struktur aus, die durch Selbst-Hybridisierung und die Bildung von Haarnadelschleifen erzeugt wird.
DNS kann mit der Hilfe eines Enzyms, bezeichnet als eine DNS-Polymerase (z. B. DNS-Pol α, β, γ, δ, ε) repliziert werden. Typischerweise katalysiert eine DNS-Polymerase das schrittweise Anhängen der Desoxyribonukleotideinheiten an das 3'-Ende einer vorher vorhandenen DNS-Kette (oftmals bezeichnet als ein Primer) gemäß einer Matrize (typischerweise ein einzelner Strang von DNS), an welche der Primer hybridisiert worden war. Typischerweise ist die durch DNS-Polymerase katalysierte Kettenverlängerungsreaktion ein nukleophiler Angriff des 3'-OH-Endes des Primers am innersten (d. h. α-Phosphor) Phosphoratom eines Desoxyribonukleosidtriphosphates; eine Phosphordiesterbrücke wird gebildet und Pyrophosphat gleichzeitig entlassen. Die DNS-Polymerase katalysiert die Bildung der Phosphordiesterbindung nur, wenn die Base des ankommenden Nukleotids komplementär ist zu der Base des Matrizenstrangs; in der Tat werden falschgepaarte Basenpaare entfernt. Auf diesem Wege schreitet die matrizengetriebene Replikation mit sehr hoher Genauigkeit und mit einer Fehlerrate von weniger als 10^–8 pro Basenpaar fort.
Gene enthalten DNS. Eine bestimmte DNS-Sequenz kodiert eine bestimmte Aminosäuresequenz. Auf diesem Wege werden Proteine (Polyaminosäuren, Polypeptide) durch DNS kodiert. DNS, vorzugsweise doppelsträngige DNS, wird als eine Matrize für eine RNS-Polymerase (z. B. RNS-Pol I, II, III) verwendet, um Boten-RNS (mRNS) herzustellen, die ein bestimmtes Protein kodiert. Auf diesem Wege wird DNS in mRNS transkribiert. Tripletts aus mRNS-Resten, bezeichnet als „Codons", repräsentieren jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren, entsprechend dem genetischen Code. Die mRNS wird dann selber als eine Matrize verwendet und wird durch ein Ribosom (bestehend aus ribosomaler RNS, rRNS, und ribosomalen Proteinen) „gefädelt", um das durch die bestimmte mRNS kodierte Protein herzustellen. Auf diesem Wege wird mRNS in Protein übersetzt. Individuelle Aminosäuren, die an ein kurzes Stück Transfer-RNS (tRNS), welche auch ein bestimmtes Codon in der mRNS erkennt, angehängt werden, werden in das wachsende Protein durch das Ribosom eingebaut. Kodierte DNS (cDNS) kann aus mRNS (das als eine Matrize wirkt) unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase erhalten werden. Auf diesem Wege kann die Kodierung eines bestimmten Proteins in einer DNS-Form erhalten werden, die oftmals geeigneter ist für Klonieren und andere genetische Manipulationen.
Polymerasekettenreaktion (PCR), entwickelt in der Mitte der 1980iger, erlaubt die einfache und schnelle Herstellung großer Mengen einer bestimmen DNS-Sequenz, ohne vom Klonieren Gebrauch zu machen. PCR nützt die Fähigkeit der DNS-Polymerase (z. B. Taq-Polymerase) aus, DNS einer einzelsträngigen Matrizen-DNS zu replizieren. Beide DNS-Stränge können als Matrizen dienen; einzelsträngige Matrizen können leicht hergestellt werden, z. B., durch Erhitzen doppelsträngiger DNS auf eine Temperatur fast bis zum Kochen. PCR erfordert, dass bestimmte Reagenzien in der Reaktionsmischung vorhanden sind, einschließlich aktivierter Nukleotidmonomere (z. B. ATP, GTP, CTP, TTP) und Mg²⁺. PCR benötigt auch ein kleines Stück doppelsträngige DNS, an der die Replikation initiiert (d. h. geprimt) wird, welches gewöhnlich bereitgestellt wird durch Annealing (Hybridisieren) eines geeigneten Oligonukleotid-„Primers" an der Stelle, von der die Replikation beginnen soll. Da DNS-Polymerase DNS in 3'-5'-Richtung repliziert, können beide Stränge als Matrizen dienen, falls zwei Primer bereitgestellt werden, einer, der an einem Strang hybridisieren wird, und einer, der mit dem anderen Strang hybridisieren wird. Nach der Replikation wird die neu gewachsene doppelsträngige DNS (welche den Matrizenstrang und den neu gewachsenen Strang umfasst) geschmolzen (z. B. durch Erhitzen bis fast zum Kochen) und jeder der resultierenden Einzelstränge kann als eine Matrize in dem nächsten Zyklus dienen. Auf diesem Wege verdoppelt jeder Zyklus wirksam die Anzahl gewünschter einzelsträngiger DNS-Fragmente und erhöht den Anteil an DNS-Fragmente, die identisch sind (wie definiert durch die Positionen der beiden Primer).
PCR wird leicht an Automatisierung angepasst. Typischerweise wird eine DNS-Probe anfänglich erhitzt (z. B. 94°C, 5 min), um die Stränge zu trennen, und die Reagenzien (z. B. Taq-Polymerase, Primer, aktivierte Nukleotidmonomere im Überschuss, Mg²⁺, etc.). In einem ersten Heizschritt (z. B. 30–65°C, 30 s) binden die Primer an die DNS-Stränge. In einem zweiten Heizschritt (z. B. 65–75°C, 2–5 min), synthetisiert die Polymerase neue DNS-Stränge. In einem dritten Heizschritt (z. B. 94°C, 30 s) werden die Stränge der resultierenden doppelsträngigen DNS getrennt. Die drei Schritte werden für jeden Zyklus wiederholt. Typischerweise werden 10–60 Zyklen durchgeführt. Theoretisch ergeben 32 Zyklen ungefähr 10⁹ Kopien des gewünschten doppelsträngigen DNS-Fragmentes.
Spezifische Oligonukleotide (z. B. DNS, RNS) können oftmals direkt aus Monomeren, Dimeren, etc. synthetisiert werden, ohne die Hilfe einer Polymerase und ohne das Erfordernis eines Matrizenstrangs. Typischerweise wird ein Festphasenverfahren verwendet, bei dem Nukleotide zu einem entstehenden Oligonukleotid hinzugefügt werden, das an einen festen Untergrund angeheftet ist. Eine Anzahl an Festphasen-Oligonukleotidsynthesen sind bekannt, einschließlich Triester-, Phosphit- und Phosphoramidat-Verfahren, obwohl letzteres oftmals bevorzugt wird.
Typischerweise schließt die Festphasen-Oligonukleotidsynthese durch das Phosphoramidatverfahren die schrittweise Synthese des Oligonukleotids in der 5'-Richtung durch ständig wiederholendes Durchführen von vier Schritten ein: Deprotektion, Koppeln, Kappen und Oxidation. Im ersten Schritt („Deprotektion") wird das wachsende Oligonukleotid, das an das 3'-Ende über eine 3'-O-Gruppe an einen festen Untergrund geheftet ist, 5'-deprotektioniert, um eine reaktive Gruppe (d. h. eine 5'-OH-Gruppe) bereitzustellen. Im zweiten Schritt („Koppeln") lässt man das 5'-deprotektionierte, abgestützte Oligonukleotid mit dem gewünschten Nukleotidmonomer reagieren, welches selbst zuerst zu einem 5'-geschützten 3'-Phosphoramidit umgewandelt worden war. Die 5'-OH-Gruppe kann zum Beispiel in der Form einer 5'-ODMT-Gruppe (wo DMT 4,4'-Dimethoxytrityl ist) geschützt werden und die 3'-OH-Gruppe kann zu einem 3'-Phosphoramidit, wie z. B. -OP(OR')NR₂, wo R die Isopropyl-Gruppe, -CH(CH₃)₂, und R' zum Beispiel -H (was einen Phosphoramiditdiester ergibt), oder -CH₃, -CH₂CH₃, oder die beta-Cyanoethylgruppe, -CH₂CH₂CN (was einen Phosphoramidittriester ergibt), umgewandelt werden. Die 3'-Phosphoramiditgruppe des Monomers reagiert mit der deprotektionierten 5'-OH-Gruppe des wachsenden Oligonukleotids, um die Phosphitbindung 5'-OP(OR')O-3' zu ergeben. Nicht alle der wachsenden Oligonukleotide werden mit dem bereitgestellten Monomer koppeln; jene, die nicht „gewachsen" sind, würden unvollständige Oligonukleotide ergeben und müssen demzufolge von der weiteren Synthese entfernt werden. Dies wird durch den dritten Schritt („Kappen") erreicht, bei dem alle verbleibenden -OH-Gruppen (d. h. unreagierte 5'-OH-Gruppen) gekappt werden, zum Beispiel in der Form von Acetaten (5'-OC(O)CH₃) durch Reaktion mit Essigsäureanhydrid. Schließlich wird im Oxidationschritt die neugebildete Phosphitegruppe (d. h., 5'-OP(OR')O-3') des wachsenden Oligonukleotids in eine Phosphatgruppe (d. h., 5'-OP(=O)(OR')O-3') umgewandelt, z. B. durch Reaktion mit wässrigem Iod und Pyridin. Der Vier-Schritt-Vorgang kann dann wiederholt werden, da das nach der Oxidation erhaltene Oligonukleotid 5'-geschützt bleibt und fertig ist zur Verwendung im oben beschriebenen ersten Deprotektionsschritt. Wenn das gewünschte Oliognukleotid erhalten wurde, kann es von dem festen Untergrund abgespalten werden, zum Beispiel durch Behandlung mit Lauge und Hitze. Dieser Schritt kann auch dazu dienen, Phosphattriester (d. h. wenn R' nicht -H ist) in den Phposphatdiester (-OP(=O)₂O-) umzuwandeln, ebenso wie deprotektionierte hasenlabile geschützte Aminogruppen der Nukleotidbasen.
Die meisten Verfahren des Nachweises spezifischer DNS- und RNS-Sequenzen beruhen auf der Nukleinsäurehybridisierung. Typischerweise beruhen solche Verfahren auf der Bildung eines Doppelstranges zwischen einer Ziel-DNS- oder -RNS-Sequenz und einer markierten Nukleinsäurehybridisierungssonde. Hybridisierungssonden sind gewöhnlich komplementär zu einem bestimmten Teil der Zielnukleinsäure. Es ist jedoch anzumerken, dass eine Hybridisierungssonde nur teilweise komplementär sein kann und doch immer noch einen stabilen Doppelstrang mit der Zielsequenz ausbildet. Typischerweise sind Hybridisierungssonden wenigstens zu 70% komplementär, obwohl sie oftmals wenigstens zu 90% komplementär zu der Zielsequenz sind. Hybridisierungssonden haben gewöhnlich eine Sequenz, die lange genug ist, um sowohl eine selektive als auch eine stabile Hybridisierung sicherzustellen. Typischerweise weisen Hybridisierungssonden von 6 bis ungefähr 500 Monomereinheiten (z. B. Nukleotide) auf, obwohl sie typischerweise von ungefähr 10 bis ungefähr 100 Monomereinheiten haben. Spezifische Hybridisierungssonden mit der gewünschten Sequenz werden oftmals direkt unter Verwendung von Festphasen-Oligonukleotidsyntheseverfahren synthetisiert. Markierte Nukleinsäuresonden werden in einer Reihe an Assayformaten verwendet, einschließlich Dot-Blots, Southern-Blots, (DNS-Ziel), Northern-Blots (RNS-Ziel), in situ-Hybridisierung, Plaque-Hybridisierung und Kolonie-Hybridisierung. Eine Anzahl unterschiedlicher Substanzen wurde verwendet, um eine Nukleinsäuresonde zu markieren und eine Anzahl unterschiedlicher Verfahren wurde verwendet, um diese Markierungen nachzuweisen. Siehe, z. B. Kricka, 1992.
In einem Ausführungsbeispiel können die Assays der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um DNS nachzuweisen, indem zwei Oligonukleotid-Hybridisierungssonden verwendet werden, eine mit einer angehängten ECL-Markierung und die andere mit einer angehängten ECL-Löscheinheit. Die Sonden können spezifisch gewählt werden, so dass nach Annealing mit der Ziel-DNS, die ECL-Markierung und die ECL-Löscheinheit in Löschkontakt gebracht werden, wobei die beobachtete ECL-Emission reduziert wird. Folglich kann eine Abnahme in der ECL-Emission in Beziehung gesetzt werden mit der Menge an in der Probe vorhandener Ziel-DNS.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel können die Assay der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um DNS nachzuweisen, indem eine Oligonukleotid-Hybridisierungssonde, die sowohl eine ECL-Markierung als auch eine ECL-Löscheinheit besitzt, in Kombination mit einer DNS-Polymerase (typischerweise in einem Nicht-Trennungs-Assay) angewendet wird. Zum Beispiel kann eine Ziel-DNS in einer Probe nachgewiesen werden durch Bildung einer Mischung, die die Probe, eine geeignete Oligonukleotidhybridisierungssonde mit sowohl einer ECL-Markierung (L) als auch einer ECL-Löscheinheit (Q), einen geeigneten Oligonukleotidprimer, der mit der Ziel-DNS an einer Position stromaufwärts der Hybridisierungssonde hybridisiert, eine 5'-spezifische DNS-exo-Polymerase, wie z. B. die wohlbekannte Taq-Polymerase (erhalten von Thermus Aquaticus) und geeignete Konzentrationen aktivierter Nukleotidmonomere (z. B. ATP, GTP, CTP, TTP) und andere Reagenzien (z. B. KCl, Tris, HCl, MgCl₂) umfasst. Typischerweise sind die ECL-Markierung und die ECL-Löscheinheit der nicht hybridisierten Oligonukleotidhybridisierungssonde in Löschkontakt und eine geringe ECL-Emission wird beobachtet. Die Mischung wird behandelt, um der Hybridisierungssonde und dem Primer zu ermöglichen, mit der Ziel-DNS Doppelstränge zu bilden. Typischerweise sind die ECL-Markierung und die ECL-Löscheinheit der hybridisierten Sonde in Löschkontakt und wiederum wird eine geringe ECL-Emission beobachtet. Der Polymerasereaktion wird dann ermöglicht, fortzuschreiten. Beginnend an dem 3'-Ende des Primers verlängert die 5'-spezifische DNS-exo-Polymerase den Primer in der 5'-Richtung, jedesmal um ein Nukleotid, unter Verwendung der Ziel-DNS als eine Matrize. Falls die Polymerase, indem sie stromabwärts in der 5'-Richtung fortschreitet, auf eine gebundene Hybridisierungssonde trifft, wird die Polymerase die gebundene Sonde abbauen, indem sie den Primer verlängert. Die Hybridisierungssonde wird in kurze Oligonukleotidfragmente (typischerweise Monomere) umgewandelt, die von der Ziel-DNS freigesetzt werden und in die Lösungsmischung eingehen. Da die ECL-Markierung und die ECL-Löscheinheit an unterschiedliche Monomereinheiten angeheftet sind, werden sie nach dem Abbau in die Lösung freigesetzt und werden folglich nicht mehr länger in Löschkontakt gehalten. Folglich wird ein Anstieg in der ECL-Emission korreliert sein mit der Menge der in der Probe vorhandenen Ziel-DNS. Ein analoges Verfahren wurde für Fluoreszenzmarkierungen und Fluoreszenzlöscher erläutert. Siehe, z. B. Wittwer, 1997.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel können die Assays der vorliegenden Erfindung angewendet werden, um DNS nachzuweisen durch Verwenden einer Oligonukleotidhybridisierungssonde, die sowohl eine ECL-Markierung als auch eine ECL- Löscheinheit besitzt, und die selbsthybridisierende Sequenzen hat. In Abwesenheit der Ziel-DNS hybridisiert die Sonde mit sich selber (typischerweise unter Ausbildung einer Haarnadel- oder Haarnadelschleifenstruktur), wodurch die ECL-Markierung und die ECL-Löscheinheit in Löschkontakt gebracht werden. In Anwesenheit der Ziel-DNS bildet die Sonde vorzugsweise Doppelstränge mit der Ziel-DNS aus, und indem sie dies tut, wird die ECL-Markierung von der ECL-Löscheinheit getrennt, so dass sie nicht länger in Löschkontakt sind und die ECL-Emission steigt. Folglich kann ein Anstieg der ECL-Emission in Beziehung gesetzt werden mit der Menge an Ziel-DNS, die in der Probe vorhanden ist.
In einem Ausführungsbeispiel können die Assays der vorliegenden Erfindung angewendet werden, um Materialien nachzuweisen, die selektiv derivatisiert sein können, um ein Glied eines starken Bindungspaares zu besitzen. Beispiele starker Bindungspaare schließen Biotin-Avidin und Biotin-Avidin-Analoga, wie z. B. Biotin-Streptavidin, ein. Biotin, auch bekannt als Vitamin H des Vitamin B-Komplexes, ist eine Imidazolpentansäure der Summenformel C₁₀H₁₅O₃N₂S. Avidin, ein 70-Kilodalton Protein, das in Eiweiß gefunden wird, hat eine sehr hohe Bindungsaffinität für Biotin. Streptavidin, ein ähnliches in den Bakterien Streptomyces avidinii gefundenes Protein, hat sogar noch eine höhere Bindungsaffinität für Biotin, teilweise wegen seiner vier Biotinbindungsstellen.
Zum Beispiel kann ein (zu detektierendes) Zielmolekül selektiv derivatisiert werden, um sowohl eine Biotineinheit (unter Verwendung von z. B. eines im Handel erhältlichen biotinylierenden Mittels) als auch eine ECL-Markierung zu besitzen. Ein Streptavidinderivat kann zubereitet werden, das eine oder mehrere Löscheinheiten besitzt. Nach dem Mischen werden Biotin-Streptavidin-Komplexe gebildet, in denen die ECL-Markierung und eine oder mehrere ECL-Löscheinheiten in Löschkontakt gebracht werden, wobei die beobachtete ECL-Emission reduziert wird. Folglich wird eine Abnahme der ECL-Emission in Beziehung stehen mit der Menge des in der Probe vorhandenen Moleküls. Alternativ kann das Zielmolekül selektiv derivatisiert werden, um z. B. eine Biotin/ECL-Löscheinheit, eine Avidin/BCL-Markierung oder eine Avidin/ECL-Löscheinheit aufzuweisen; die Gegenreagenzien würden dann eine Avidin/ECL-Markierung, Biotin/ECL-Löscheinheit bzw. Biotin/ECL-Markierung umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Reagenzien, Reagenziensets, die mehr als ein Reagenz umfassen, und Reagenzienkits, die mehr als einen Reagenziensatz umfassen, zur Verwendung in den Assayverfahren der vorliegenden Erfindung bereit. Die Reagenzien können in festem, flüssigem oder gasförmigem Zustand sein, obwohl sie typischerweise in fester oder flüssiger Form sind. Beispiele von Reagenzien schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf, Reagenzien für die ECL-Markierung, Reagenzien für das Anhängen von ECL-Löscheinheiten, Elektrolytzusammensetzungen, Lösungsmittel und Puffer. Reagenzien und/oder Reagenziensets zur Verwendung in den Assays der vorliegenden Erfindung, sind typischerweise in einem oder mehreren geeigneten Behältern oder Vorrichtungen bereitgestellt. Reagenziensets werden typischerweise in handeslüblich verpackter Form angeboten, als eine Zusammensetzung oder Mischung, wo es die Berechenbarkeit der Reagenzien ermöglichen wird, oder als ein Reagenzienkit; z. B. als eine verpackte Kombination einer oder mehrerer Behälter, Vorrichtungen oder ähnlichen, die ein oder mehrere Reagenzien beinhalten, und die gewöhnlich schriftliche Anweisungen für das Durchführen der Assays einschließt.
D. Verfahren zum Messen von ECL
Eine Reihe von geeigneten Apparaten zum Messen der ECL einer Probe sind im Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Blackburn et al., 1991; Leland et al., 1990; Hall et al., 1991. Typischerweise wird ECL in einem Gerät gemessen, das umfasst (i) eine Aufnahme für die Probe (die typischerweise eine Flüssigkeit ist); (ii) zwei oder mehr Elektroden, die in der Aufnahme angeordnet sind, und die in Kontakt mit der zu untersuchenden Zusammensetzung stehen, von denen eine die „Arbeitselektrode" ist, an der elektrochemilumineszente Spezies erzeugt werden, und (iii) einen Detektor, der einen gewissen Bruchteil der während der Elektrochemilumineszenz emittierten Photonen detektiert.
Nach Belieben hat das ECL-Gerät typischerweise drei Elektroden: eine Arbeitselektrode, eine Gegenelektrode und eine Bezugselektrode. Oftmals ist die Bezugselektrode (z. B. eine Standard-Ag/AgCI-Elektrode) in einigem Abstand von, jedoch in Kontakt (über den Elektrolyten) mit der Arbeits- und der Gegenelektrode platziert. Die Arbeits- und Gegenelektroden sind typischerweise Edelmetalle oder vergleichsweise inerte Metalle, wie z. B. Platin und Gold.
Der Detektor kann jede Vorrichtung sein, die Photonen detektiert (und vorzugsweise quantifiziert), wie z. B. eine Photomultiplierröhre (PMT), eine Photodiode, eine ladungsgekoppelte Vorrichtung, ein photographischer oder lichtempfindlicher Film oder Emulsion. Typischerweise ist der Detektor eine PMT, die ausgewählt werden kann, um besonders empfindlich für einen gewissen Bereich an Photonen, zum Beispiel ultraviolett, sichtbar oder infrarot zu sein. Der Detektor ist typischerweise auf eine Art und Weise positioniert, so dass er leicht und wirksam die während der ECL emittierten Photonen detektieren kann. Zum Beispiel ist in einem Ausführungsbeispiel die Arbeitselektrode eine Gold- oder Platinscheibe, der PMT-Detektor wird direkt gegenüber von der flachen Frontfläche der Arbeitselektrode positioniert und die zu untersuchende Zusammensetzung fließt von der Seite her über die Scheibe, zwischen der Scheibe und dem PMT-Detektor.
Nach Belieben schließt das ECL-Gerät typischerweise Mittel zum Umgang mit Flüssigkeit ein, einschließlich z. B. Einlässen in und Auslässen von der Probenaufnahme, die verbunden sind mit Behältern (z. B. über Leitungen) für Reagenzien, Elektrolyt/Puffer und die Probenzusammensetzung, und Pumpen (z. B. einer Rollkolbenpumpe) zum Bewegen von Flüssigkeiten zwischen der Aufnahme und den Behältern. Auf diesem Wege kann das Gerät verwendet werden, um ECL in entweder einer statischen oder Durchflusskonfiguration zu messen.
Ein gut bekanntes und im Handel erhältliches ECL-Gerät ist der Origen I Analyzer®, der ein Photometer (als Detektor), eine elektrochemische Zelle (Aufnahme und Elektroden), einen Potentiostaten (zum Betreiben der elektrochemischen Zelle) und Mittel zum Handhaben von Flüssigkeit und Probe vereinigt. Der Analyzer verwendet ein Fließinjektionssystem, das schnelle und reproduzierbare Bestimmungen aufeinanderfolgender Proben erlaubt. Das Photometer ist eine Photomultiplierröhre (typischerweise rot-sensitiv für die optimale Detektion von Ru(bpy)₃ ²⁺-Markierungen), die unmittelbar über der Arbeitselektrode positioniert ist, so dass das Licht von der Elektrode während jeder Messung aufgenommen und integriert wird.
Wie oben diskutiert, ist ECL die Emission von Photonen elektromagnetischer Strahlung (z. B. Licht) einer elektronisch angeregten chemischen Spezies, die elektrochemisch erzeugt wurde. Folglich muss, um die ECL einer bestimmten Probe zu messen, die Probe elektrolytisch zerlegt werden, um elektrooxidierte und/oder elektroreduzierte Spezies zu erzeugen, die entweder direkt oder nach einer weiteren Reaktion Photonen emittieren. Die Probe wird typischerweise elektrolytisch zerlegt, indem ein elektrisches Potential an der Arbeitselektrode angelegt wird, z. B. mit einer Batterie oder einer anderen Quelle elektromotorischer Kraft (EMF). Nach Belieben wird die Potentialdifferenz als das Potential der Arbeits- bezüglich der Bezugselektrode angezeigt, mit elektrochemischem Stromfluss (Faradayscher Strom) zwischen der Arbeits- und den Hilfselektroden. Folglich bewegt sich das Potential der Arbeitselektrode typischerweise in einem Bereich von –10,00 bis +10,00 V, obwohl ein Bereich von –6,00 bis +6,00 V häufiger ist, und noch häufiger von –3,00 bis +3,00 V. Das Potential der Arbeitselektrode kann ein statisches sein, kann alternieren oder kann eine komplexere Funktion widerspiegeln. Mittel zum Anlegen eines bestimmten elektrischen Potentials (z. B. Wellenform) sind im Stand der Technik der Elektrochemie wohlbekannt. Siehe z. B. Kamin et al., 1992. Das Potential, das an der Arbeitselektrode angelegt werden muss, um ECL zu erzeugen, ist eine Funktion der genauen chemischen Spezies, die in die ECL-Reaktionsfolge verwickelt sind, ebenso wie andere Faktoren, wie der pH der Probenzusammensetzung und die Art der Elektrode. Es ist ECL-Fachleuten wohlbekannt, wie sowohl das optimale Potential zur Erzeugung von ECL als auch die optimale Wellenlänge, bei der die ECL detektiert wird, bestimmt wird.
Um die ECL einer bestimmten Probe zu messen, muss die Probe wiederum der Elektrolyse unterzogen werden, um elektrooxidierte und/oder elektroreduzierte Spezies zu erzeugen, die entweder direkt oder nach weiteren Reaktionen Photonen emittieren. Um eine optimale Elektrolyse zu bewirken, sollten Ionen in der Probenzusammensetzung vorhanden sein, die zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode wandern können, wobei die Ladungsübertragung bewirkt wird. Folglich wird, um die ECL-Messung zu erleichtern, die Probe typischerweise mit einem ECL-Assaymedium (z. B. ECL-Assaypuffer) vermischt, das Ionen enthält, die die Übertragung der Ladung während der ECL-Messung bewirken, aber nicht die ECL-Reaktionsfolge beeinträchtigen.
Der Begriff „ECL-Assaymedium", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die wahlweise (jedoch gewöhnlich) mit der Probe vor dem Durchführen der ECL-Messung vermischt wird. Im Allgemeinen ist das ECL-Assaymedium ein Fluid, obwohl es noch typischer eine Flüssigkeit ist, und es enthält eines oder mehrere gelöste Salze. Typischerweise ist der ECL-Assay eine Flüssigkeit und enthält eines oder mehrere Lösungsmittel und eines oder mehrere gelöste Salze. Typischerweise sind die Salze in millimolaren Konzentrationen vorhanden.
In einem Ausführungsbeispiel enthält der ECL-Assay Wasser (d. h. H₂O) und eines oder mehrere gelöste Salze. Beispiele von wasserlöslichen Salzen schließen ein Chloridsalze, wie z. B. NaCl, KCl, N(C₄H₉)₄Cl; Bromidsalze, wie z. B. NaBr, KBr, N(C₄H₉)₄Br; Nitratsalze, wie z. B. KNO₃, NaNO; und N(C₄H₉)₄NO₃; Phosphatsalze, wie z. B. Na₃PO₄, K₃PO₄, Na₂HPO₄, K₂HPO₄, NaH₂PO₄ und KH₂PO₄; und Sulfatsalze, wie z. B. Na₂SO₄ und K₂SO₄.
In einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst der ECL-Assay eines oder mehrere organische Lösungsmittel und eines oder mehrere gelöste Salze. Beispiele geeigneter organischer Lösungsmittel schließen Acetonitril (d. h. CH₃CN, ACN), Dimethylsulfoxid (d. h. (CH₃)₂SO, DMSO), N,N-Dimethylformamid (d. h. (CH₃)₂NCHO, DMF), Methanol (d. h. CH₃OH) und Ethanol (d. h. C₂H₅OH) ein. Beispiele von Salzen, die in typischen organischen Lösungsmitteln löslich sind, schließen Tetrabutylammoniumsalze ein, wie z. B. Tetrabutylammonium-tetrafluorborat (d. h. (C₄H₉)₄NBF₄) ein.
In einigen Ausführungsbeispielen, und insbesondere in jenen, in denen das ECL-Assaymedium Wasser enthält, ist das ECL-Assaymedium pH-gepuffert. Zum Beispiel kann ein wässriges ECL-Assaymedium gewöhnlich pH-gepuffert sein, durch die Zugabe eines Phosphates (z. B. KHP₂O₄, typischerweise von ungefähr 0,01 bis 0,05 M), gefolgt von Anpassen des pH auf einen gewünschten Wert (z. B. physiologischer pH 7,2) durch die Zugabe einer entsprechenden Menge einer geeigneten starken Säure (z. B. HCl) oder einer starken Base (z. B. NaOH). Gepuffert ist der pH des ECL-Assaymediums vergleichsweise wenig empfindlich für kleine Änderungen seiner chemischen Zusammensetzung, wie z. B. jener, die während der ECL-Messung geschehen kann.
Das ECL-Assaymedium kann auch eine oder mehrere ECL-Reaktionspartner enthalten, die an den chemischen Reaktionen, die die elektrooxidierten und/oder elektroreduzierten Spezies einschließen, teilnehmen, wobei das Endergebnis die Emission eines Photons ist (d. h. ECL). Der Begriff „ECL-Reaktionspartner" oder einfach „Reaktionspartner", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine chemische Verbindung, die entweder selber oder in Form ihrer elektrochemischen Reduktions/Oxidationsprodukt(e) eine Rolle in der ECL-Reaktionsfolge spielen.
Oftmals erlauben Reaktionspartner die Verwendung einfacherer Mittel zur Erzeugung von ECL (z. B. die Verwendung von nur der Hälfte des Doppelschritt-Oxidations-Reduktionszyklus) und/oder eine verbesserte ECL-Intensität. In einem Ausführungsbeispiel sind Reaktionspartner chemische Verbindungen, die nach elektrochemischer Oxidation/Reduktion entweder direkt oder nach weiterer Reaktion stark oxidierende oder reduzierende Spezies in Lösung ergeben. Ein Beispiel eines Reaktionspartners ist Peroxodisulfat (d. h. S₂O₈ ^2–, Persulfat), das irreversibel elektroreduziert wird, um oxidierende SO₄ ^.– -Ionen zu bilden. Ein weiteres Beispiel eines Reaktionspartners ist Oxalat (d. h. C₂O₄ ² ^–), das irreversibel elektrooxidiert wird, um reduzierende CO₂ ^.– -Ionen zu bilden. Ein Beispiel einer Klasse an Reaktionspartnern, die als reduzierende Mittel wirken, sind Amine oder Verbindungen, die Amingruppen enthalten, einschließlich z. B. Tri-n-propylamin (d. h. N(CH₂CH₂CH₃)₃, TPAH).
Beispiele an Reaktionspartnern schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf: Lincomycin, Clindamycin-2-phosphat; Spartein; Erythromycin; 1-Methylpyrrolidon; N-Ethylmorpholin; Diphenidol; Atropin; Trazodon; 1-Ethylpiperidin; Hydroflumethiazid; Hydrochlorothiazid; Clindamycin; Tetracylin; Streptomycin; Gentamycin; Reserpin; Trimethylamin; Tri-n-Butylamin; Triethanolamin; Piperidin; 1,4-Piperazin-bis(ethansulfonsäure); Tri-n-butylphosphin; N,N-Dimethylanilin; Pheniramin; Bromopheniramin; Chloropheniramin; Diphenylhydramin; Di-n-propylamin; 2-Dimethylaminopyridin; Pyrilamin; 2-Benzylaminopyridin; Leucin; Valin; Glutaminsäure; Phenylalanin; Alanin; Arginin; Histidin; Cystein; Tryptophan; Tyrosin; Hydroxyprolin; Asparagin; Methionin; Theonin; Serin; Cyclothiazin; Trichloromethiazid; 1,3-Diaminopropan; Piperazin; Chlorothiazid; Hydrozinothalanzin; Barbitursäure; Persulfat; Nicotinimidadenindinukleotid; Penicillin; 1-Piperidinylethanol; 1,4-Diazbicyclo(2.2.2)octan; 1,4-Diaminobutan; 1,5-Diaminopentan; 1,6-Diaminohexan; Ethylendiamin; Ethylendiamintetraessigsäure; Benzolsulfonamid; Tetramethylsulfon; Etylamin; n-Propylamin; n-Butylamin; s-Butylamin; t-Butylamin, n-Pentylamin; n-Hexylamin; Oxalsäure; Hydrazinsulfat; Glucose; Methylacetamid; und Phosphoressigsäure.
Die Konzentration des Reaktionspartners in der Probenzusammensetzung variiert gemäß dem spezifischen gewählten Reaktionspartner, und ein Fachmann ist leicht in der Lage, eine geeignete Konzentration zu bestimmen. Typischerweise wird die Konzentration des Reaktionspartners so gewählt, dass sie ungefähr 1000 mal größer ist, als die Konzentration der ECL-Markierung.
Das ECL-Assaymedium kann auch einen oder mehrere ECL-Verstärker enthalten, die die ECL-Emission erhöhen können, und die auch als oberflächenaktive oder benetzende Mittel dienen können, um die Absorption an die Elektrode und/oder den inneren Wänden des ECL-Gerätes zu verhindern oder zu reduzieren. Eine Reihe an ECL-Verstärkern sind im Stand der Technik wohl bekannt. Siehe, z. B. Shah et al., 1990. Eine Gruppe an ECL-Verstärkern kann als in para-Stellung substituierte Benzole beschrieben werden, bei denen ein Substituent (R₁) Wasserstoff oder eine C_1–20-Alkylgruppe ist, und bei denen der andere (para) Substituent (R₂) ein Poly(alkoxy)-Alkohol der Formel -[O-(CH₂)_n]_mOH ist, wobei n eine ganze Zahl von 1–20 und m eine ganze Zahl von 0–70 ist. Ein ECL-Verstärker, der im Handel erhältlich ist unter dem Namen Triton X-100®, hat R, als -C(CH₃)₂CH₂C(CH₃)₃ und R₂ als -(O-CH₂CH₂)₉_₁₀OH. Ein anderer, unter dem Namen Triton X-401® im Handel erhältlicher ECL-Verstärker hat R₁ als -C₉H₁₉ und R₂ als -(O-CH₂CH₂)₄₀OH. Falls er verwendet wird, so ist der ECL-Verstärker allgemein in einer Menge vorhanden, die die ECL-Emission erhöht. Typischerweise beträgt die Menge von ungefähr 0,01 bis ungefähr 5% (v/v) und oftmals von ungefähr 0,1 bis ungefähr 1% (v/v).
E. Beispiele
Zahlreiche Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben, die im Wege der Erläuterung und nicht im Wege der Beschränkung vorgebracht werden.
Beispiel 1
Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Löschen durch Phenol.
Eine geeignete Menge an Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II)-chloridhexahydrat (d. h. Ru(bpy)₃Cl₂•6H₂O, Aldrich® Chemical Co.) wurde in Elecsys®-Pufferlösung (Blitz-ECL Assaypuffernummer 1518–001; ein phosphatbasierter Puffer mit 0,18 M Tri-n-propylamin (TPAH) und Thesit® als ein Benetzungsmittel und ECL-Verstärker) gelöst und die Lösung wurde verdünnt, um eine Stammlösung von 0,4 μm Ru(bpy)₃ ²⁺ (als Luminophor) und 0,18 M TPAH (als Reaktionspartner) bei pH = 6,8 zu ergeben. Mikroliter-Mengen von in Ethanol gelöstem 1 M Phenol (d. h. C₆H₅OH, ultrarein, Clontech^®) (als ECL-Löscher) wurden hinzugefügt zu 1 ml-Aliquoten der Stammlösung, um Proben zu ergeben mit Phenolkonzentrationenen im Bereich von 2 bis 15 mM.
Die ECL-Intensität wurde gemessen und aufgenommen (in freigewählten Einheiten, d. h. Zählimpulsen) für jede der Proben unter Verwendung einer im Handel erhältlichen Elektrochemilumineszenz-Messzelle, den Origen I Analyzer®, die ein Photometer, einen Potentiostaten, eine elektrochemische Zelle und Mittel zum Handhaben von Fluid und Probe vereint. Die Messzelle verwendet ein Fließinjektionssystem, das schnelle und reproduzierbare Bestimmungen aufeinanderfolgender Proben erlaubt. Das Photometer ist eine rotempfindliche Photomultiplierröhre, die direkt oberhalb der Arbeitselektrode angeordnet ist, so dass das an oder in der Nähe der Elektrode erzeugte Licht aufgenommen und während jeder Messung integriert wird. Typischerweise wurde eine oxidative elektrochemische Folge/Potential an der Arbeitselektrode angelegt und die Lichtintensität wurde mit einer Photomultiplierröhre gemessen unter Verwendung von Origen® Standardparametern. Typischerweise ließ man das Potential in einer Rampe ansteigen von 0 auf 2800 mV mit einer Anstiegsrate von 4800 mV/s (Frequenz = 0,58 sec^–1). Vor und nach jedem Lauf wurde die Elektrode gereinigt unter Verwendung einer 0,176 M KOH-gepufferten Reinigungslösung (Blitz-ECL CS, von Boehringer Mannheim®, Artikelnummer 1518470). Ein EG&G PAR Model 263A® Potentiostat/Galvanostat wurde verwendet für alle elektrochemischen Messungen.
Die Daten sind in 1 dargestellt. Es ist festzustellen, dass das ECL-Signal der Probe ohne Phenol stärker war als die Detektionsfähigkeit des Instrumentes, 10 Millionen freigewählte Einheiten. Nur 2 mM Phenol bewirkten bei der ECL, dass diese auf weniger als 7% der ECL der Kontrollprobe reduziert wurde. Nur 5 mM Phenol bewirkte bei der ECL, das diese auf weniger als ungefähr 0,01% der ECL der Kontrollprobe reduziert wurde.
Dieses Beispiel zeigt, dass mikromolare Konzentrationen an Phenol wirksam die Lösungs-ECL mikromolarer Konzentrationen von Ru(bpy)3²⁺ in der Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Reaktionsfolge auslöschen. Dies bedeutet, dass nach elektrochemischer Oxidation die resultierende, sich im angeregten Zustand befindliche Spezies, Ru(bpy)₃ ² ^+*, wirksam ausgelöscht wird, so dass eine wesentlich geringere ECL-Intensität beobachtet wird, im Vergleich zu dem Fall, wo die Lösch-Spezies fehlt.
Beispiel 2
Löschen der Ru(bpy)₃ ²⁺/C₂O₈ ^–2-ECL durch Phenol.
Geeignete Mengen an Ru(bpy)₃Cl₂•6H₂O und Na₂C₂O₈ (Aldrich Chemical Company) wurde in phoshatgepufferter Salzlösung (d. h. „PBS"; 50 mM NaP₃O₄, 100 mM NaCl, pH 7,0, 0,2 μm gefiltert) gelöst und verdünnt, um eine Stammlösung von 0,4 μm Ru(bpy)₃ ²⁺ (als Luminophor) und 200 mM C₂O₈ ^2– (als Reaktionspartner) bei pH = 7,0 zu ergeben. Mikrolitermengen an 1 M Phenol (als ECL-Löscher), gelöst in Ethanol, wurden hinzugefügt zu 1 ml-Aliquoten der Stammlösung, um Proben zu ergeben mit Phenolkonzentration im Bereich von 2 bis 20 mM. Die ECL-Intensität wurde gemessen und aufgenommen (in freigewählten Einheiten) für jede der Proben. Die Daten sind in 2 dargestellt. 2 mM Phenol resultierte in einer ECL, die auf weniger als 6% der ECL der Kontrollprobe reduziert wurde. 8 mM Phenol resultierte in einer ECL, die auf weniger als ungefähr 0,1% der ECL der Kontrollprobe reduziert wurde.
Dieses Beispiel zeigt, dass mikromolare Konzentrationen an Phenol wirksam die Lösungs-ECL submikromolarer Konzentrationen an Ru(bpy)₃ ²⁺ in der Ru(bpy)₃ ²⁺/C₂Og² ^–-ECL-Reaktionsfolge löscht. Obwohl die ECL-Intensität des Ru(bpy)₃ ²⁺/C₂O₈ ² ^–-Systems an sich niedriger ist als die des Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-Systems (um einen Faktor von ungefähr 10-50) ergab die Verwendung von Phenol in dem C₂O₈ ² ^–-System eine ungefähr 5% höhere Löscheffizienz.
Beispiel 3
Löschen der Ru(bpy)₃ ²⁺-ECL durch p-Hydroxybenzoesäure und p-Aminobenzoesäure.
Eine geeignete Menge an Ru(bpy)₃Cl_Z•6H₂O wurde in Elecsys®-Pufferlösung gelöst und verdünnt, um eine Stammlösung von 0,3 μM Ru(bpy)₃ ²⁺ (als Luminophor) und 0,18 M TPAH (als Reaktionspartner) bei pH = 6,8 zu ergeben. Mikrolitermengen von 1 M p-Hydroxybenzoesäure (d. h. HOC₆H₄COOH, PHBA, 99+% Reinheit, Aldrich Chemical Company) oder von 1 M p-Aminobenzoesäure (d. h. H₂NC₆H₄COOH, PABA, 99+% Reinheit, Aldrich Chemical Company) (als ECL-Löscher), gelöst in Ethanol, wurden zu 1 ml-Aliquoten der Stammlösung hinzugegeben, um Proben zu ergeben, mit Konzentrationen des Löschmittels im Bereich von 2 bis 10 mM. Zum Vergleich wurden Mikrolitermengen an 1 M Phenol (als ECL-Löscher), gelöst in Ethanol, zu 1 ml-Aliquoten der Stammlösung hinzugegeben, um Proben zu ergeben mit Phenolkonzentrationen im Bereich von 2 bis 10 mM. Die ECL-Intensität wurde gemessen und aufgenommen (in freigewählten Einheiten) für jede der Proben. Die Daten sind in 3 dargestellt.
Dieses Beispiel zeigt, dass bei vergleichbaren Konzentrationen Phenol die ECL mikromolarer Konzentrationen Ru(bpy)₃ ²⁺ in der Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Reaktionsfolge viel wirksamer löscht, als entweder PHBA (um einen Faktor von wenigstens ungefähr 8) oder PABA (um einen Faktor von wenigstens ungefähr 2). Dieses Beispiel zeigt auch, dass im Wege der bekannten freien Radikalfänger PHBA und PABA, das Einfangen des TPA^.-Zwischenproduktes vor der Bildung des Ru(bpy)₃ ²⁺*-Anregungszustandes weniger wahrscheinlich ist, als das direkte Löschen des angeregten Zustandes.
Beispiel 4
Löschen der Ru(bpy)₃ ²⁺-ECL durch Phenolderivate.
Eine Anzahl an Phenolderivaten, die eine oder mehrere elektronenziehende und/oder elektronenschiebende Gruppen besitzen, wurden auf ihre Löschwirksamkeit auf eine Weise analog der, die in Beipspiel 3 verwendet worden war, untersucht. Löschmittel (alle mit einer Reinheit von >98%, von Aldrich Chemical Company) wurden gelöst bis zur geeigneten Konzentration in Ethanol und geeignete Aliquote wurden zu 1 ml-Aliquoten einer Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-Stammlösung übertragen. Jene Phenolderivate, die als Löschmittel untersucht worden waren, schlossen ein: o-Kresol, (d. h. 2-Methylphenol), m-Kresol (d. h. 3-Methylphenol), p-Kresol (d. h. 4-Methylphenol), p-Fluorophenol, m-Fluorophenol, o-Fluorophenol, o-Propylphenol, p-Propylphenol, p-Phenylphenol, o-Trifluoromethylphenol, m-Trifluoromethylphenol, p-Trifluoromethylphenol, p-Nitrophenol, p-Nitrobenzoesäure, p-Hydroxybenzoesäure und 4,4'-Biphenol.
Es wurden Tendenzen beobachtet bei der ECL-Löschwirksamkeit der unterschiedlichen Phenolderivate. Am bemerkenswertesten ist, dass wirksameres ECL-Löschen beobachtet wurde, wenn die Substituenten sich in meta-Stellung zu der Phenolhydroxylgruppe befanden. So übte z. B. m-Fluorophenol eine wirksamere ECL-Löschung aus, im Vergleich zu entweder o-Fluorophenol oder p-Fluorophenol. Überraschenderweise war Phenol um ungefähr einen Faktor von 3 wirksamer bei der ECL-Löschung als jedes der untersuchten Phenolderivate.
Beispiel 5
Die Wirkung von Phenol auf die Ru(bpy)₃ ²⁺-Photolumineszenz.
Eine geeignete Menge an Ru(bpy)₃Cl₂•6H₂O wurde in Elecsys®-Pufferlösung gelöst und verdünnt, um eine Stammlösung von 30 μM Ru(bpy)₃ ²⁺ (als Luminophor) und 0,18 M TPAH (als Reaktionspartner) bei pH = 6,8 zu ergeben. Mengen von 0,2–0,3 M Phenol, gelöst in Ethanol, wurden zu 10 ml-Aliquoten der Stammlösung hinzugefügt, um Proben zu ergeben mit Phenolkonzentrationen im Bereich von 0 bis 0,3 M. Die Photolumineszenz wurde gemessen für jede der Proben (ohne Elektrolyse) unter Verwendung eines Perkin Elmer LS-50B-Fluorimeters, wobei die Spannung des PMT auf ein Niveau von 850 V vorgespannt war. Angeregt wurde bei 452 nm, dem Peakmaximum der niedrigsten Metall-auf-Ligand-Ladungsübertragungs (MLCT)-Energieabsorption des Ru(bpy)₃ ²⁺-Luminophores, wobei die Detektion zwischen 550 und 650 nm (λ_em = 620 nm) war. Die Daten zeigten, dass die Photolumineszenz ständig anstieg, so wie die Konzentration des Phenols anstieg. Es ist zu bemerken, dass diese Tendenz gegenteilig ist zu der Wirkung, die für steigende Phenolkonzentration bei ECL beobachtet wurde. Auch zeigten die Daten, dass die Wirkung von Phenol auf die Fluoreszenz viel weniger dramatisch war als die Wirkung auf ECL.
Beispiel 6
Die Wirkung von Phenol auf Ru(bpy)₃ ²⁺-Photolumineszenz: Feststoffelektrolyse Eine geeignete Menge an Ru(bpy)₃Cl₂•6H₂O und TPAH wurde in Elecsys®-Pufferlösung gelöst und die Lösung wurde verdünnt, um eine Stammlösung von 30 μM Ru(bpy)₃2+ und 0,18 M TPAH bei pH = 6,8 zu ergeben. Zu einem 100 ml-Aliquot der Stammlösung wurden 6 ml 1 M Phenol zugegeben, was eine Phenolkonzentration von 60 mM ergab. Eine Photolumineszenzmessung der Basislinie wurde für diese anfängliche Lösung gemacht. Unter einem kontrollierten Potential wurde dann eine Coulometrie (Feststoffelektrolyse) für 3 Stunden durchgeführt mit fortwährendem Rühren unter Verwendung eines Standard-3-Elektrodensystems, erhältlich von BioAnalytical Systems® Inc. Eine netzartige, glasähnliche Kohlenstoffarbeitselektrode wurde vorgespannt auf ein oxidatives Potential von +1,3 V (gegen eine Ag/AgCl-Gelelektrode, die als Referenz verwendet wurde) um Elektrolyse zu bewirken. Eine Platindraht-Zählelektrode wurde von der Arbeitslösung abgetrennt über eine poröse Vycor®-Fritte und in eine geeignete Elektrolytlösung eingetaucht. Während der 3 Stunden dauernden Feststoffelektrolyse wurden 1 ml-Proben in ungefähr 30-minütigen Intervallen zur Photolumineszenzuntersuchung (λ_exz 452 nm; λ_em = 610 nm) genommen, wie in Beispiel 5. Ungefähr 50% des Photolumineszenzsignals waren nach 2 Std. 45 min. verloren gegangen, was zeigt, dass ein Produkt der Oxidation direkt verantwortlich ist für die Photolumineszenzlöschung. Es ist anzunehmen, dass dieses Produkt der Oxidation auch verantwortlich ist für das beobachtete ECL-Löschen.
Beispiel 7
Löschen der Ru(bpy)₃ ²⁺-ECL durch Katechin, Hydrochinon und 1,4-Benzochinon Eine geeignete Menge an Ru(bpy)₃Cl₂•6H₂O und TPAH wurde in Elecsys®-Pufferlösung gelöst und verdünnt, um eine Stammlösung von 0,3 μM Ru(bpy)₃ ²⁺ (als Luminophor) und 0,05 M TPAH (als Reaktionspartner) bei pH = 6,8 zu ergeben. Mikrolitermengen an 1 M Katechin (d. h. 1,2-Dihydroxybenzol), Hydrochinon (d. h. 1,4-Dihydroxybenzol) oder 1,4-Benzochinon (alle von Aldrich Chemical Company) (als ECL-Löscher), gelöst in Ethanol, wurden zu 1 ml-Aliguoten der Stammlösung hinzugefügt, um Proben zu ergeben, mit Löschmittelkonzentrationen im Bereich von 2 bis 11 mM. Zum Vergleich wurden Mikrolitermengen 1 M Phenol (als ECL-Löscher), gelöst in Ethanol, zu 1 ml-Aliquoten der Stammlösung hinzugefügt, um Proben zu ergeben mit Phenolkonzentrationen im Bereich von 2 bis 11 mM. Die ECL-Intensität wurde gemessen und aufgenommen (in freigewählten Einheiten) für jede der Proben. Die Daten sind in 4 dargestellt.
Dieses Beispiel zeigt, dass bei vergleichbaren Konzentrationen Katechin, Hydrochinon und 1,4-Benzochinon (die vermuteten Elektrooxidationsprodukte von Phenol) die ECL mikromolarer Konzentrationen Ru(bpy)₃ ²⁺ in der Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Reaktionsfolge wirksamer als Phenol löschen, unter denen Benzochinon das Wirksamste der drei Derivate ist, wobei es ungefähr 6 mal wirksamer ist als Phenol.
Beispiel 8
Löschen der Ru(bpy)₃ ²⁺-ECL durch 1,4-Benzochinonderivate.
Eine Anzahl an Benzochinonderivaten wurden auf ihre Löschwirksamkeit auf eine Weise analog zu der in Beispiel 7 verwendeten untersucht. Löschmittel wurden bis zur geeigneten Konzentration in Ethanol gelöst und geeignete Aliquote wurden auf 1 ml-Aliquote einer Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-Stammlösung übertragen. Jene Benzochinonderivate, die untersucht wurden als Löschmittel, schlossen ein: 2,3-Dichloro-5,6-dicyano-l,4-benzochinon (DDQ); 2,5-Dibromo-l,4-benzochinon (BRBQ); 1,2,3,4-Tetrafluoro-5,8-dihydroxy-anthrachinon (TFDAQ); 2-Methoxy-3-methyl-l,4-naphthochinon (MMNQ); und Anthrachinon-l,5-disulfonsäure (alle mit einer Reinheit von >98%, von Aldrich Chemical Company).
Die ECL-Löschdaten für Phenol, BQ und DDQ sind in 5 gezeigt. DDQ war, ähnlich wie viele der Benzochinonderivate, ungefähr um einen Faktor von 5 wirksamer bei dem ECL-Löschen als Phenol. Benzochinon war wenigstens um einen Faktor von 3 wirksamer beim ECL-Löschen als jedes der untersuchten Benzochinonderivate.
Beispiel 9
Die Wirkung von Hydrochinon, Katechin und Benzochinon auf die Ru(bpy)₃ ²⁺-Photolumineszenz Eine geeignete Menge an Ru(bpy)₃Cl₂•6H₂O wurde in Elecsys®-Pufferlösung gelöst und verdünnt, um eine Stammlösung von 30 μM Ru(bpy)₃ ²⁺ (als Luminophor) und 0,18 M TPAH (als Reaktionspartner) bei pH = 6,8 zu ergeben. Zu einer 1,2 ml-Probe der Stammlösung wurden 0,15 ml-Aliquote 1 M Hydrochinon (Aldrich Chemical Company), gelöst in Ethanol, hinzugefügt. Die Photolumineszenz wurde gemessen nachdem jedes Aliquot hinzugefügt worden war (ohne Elektrolyse und vor jeglicher Feststoffelektrolyse) unter Verwendung der in Beispiel 5 oben beschriebenen Verfahren. Die Daten zeigten einen ungefähr 10%igen Anstieg der Photolumineszenz auf die Zugabe von 0,45 ml der 1 M Hydrochinonlösung. Es ist festzustellen, dass diese Tendenz gegenteilig ist zu der Wirkung, die für eine steigende Hydrochinonkonzentration mit ECL beobachtet wurden.
Ein ähnliches Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung von 1 M Katechin (Aldrich Chemical Company) anstelle von Hydrochinon. Überraschenderweise resultierte der inkrementelle Anstieg an Katechin in einer Abnahme der Photolumineszenz, und es gingen ungefähr 70% des Photolumineszenzsignals nach der Zugabe von 1,2 ml 1 M Katechin verloren.
Ein anderes ähnliches Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung von 0,333 M Benzochinon (Aldrich Chemical Company) anstelle von Hydrochinon. Wiederum resultierte der inkrementelle Anstieg an Benzochinon in einer Abnahme der Photolumineszenz, und ungefähr 100% des Photolumineszenzsignals wurden verloren nach der Zugabe von 0,3 ml von 0,333 M Benzochinon. Diese Ergebnisse zeigen deutlich die Wirksamkeit von Benzochinon als einem Photolumineszenz-Löscher.
Beispiel 10
Die Wirkung von Hydrochinon, Katechin und Benzochinon auf die Ru(bpy)₃2+-Photolumineszenz: Feststoffelektrolyse Eine geeignete Menge an Ru(bpy)₃Cl₂•6H₂O und TPAH wurde in Elecsys®-Pufferlösung gelöst und verdünnt, um eine Stammlösung von 30 μM Ru(bpy)₃ ²⁺ (als Luminophor) und 0,05 M TPAH (als Reaktionspartner) bei pH = 6,8 zu ergeben. Zu einem 100 ml-Aliquot der Stammlösung wurden 6 ml 1 M Hydrochinon (Aldrich Chemical Company) hinzugefügt, was eine Phenolkonzentration von 60 mM ergab. Unter einem kontrollierten Potential wurde eine Coulometrie (Feststoffelektrolyse), wie oben in Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt. Nach 45 Minuten wechselte die Lösung zu einer rot-braunen Farbe, was kennzeichnend ist für die Bildung von Benzochinon oder einigen Derivaten. Auch wurde das vollständige Löschen der Photolumineszenz innerhalb von 45 Minuten beobachtet. Diese Daten sind ähnlich zu jenen, die für Phenol beobachtet wurden, wo eine Substanz, die Ru(bpy)₃ ²⁺-Lumineszenz verstärkt, elektrochemisch oxidiert ist, um ein Produkt zu bilden, das wirksam Lumineszenz löscht.
Ein ähnliches Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung von 6 ml 1 M Katechin anstelle von Hydrochinon. Ein vollständiger Verlust der Lumineszenz wurde innerhalb von 30 Minuten beobachtet unter gleichzeitiger Bildung einer rot-braunen Lösung. Obwohl Katechin selber die Photolumineszenz bei diesen Konzentrationen löscht (siehe Beispiel 10) ist das Elektrooxidationsprodukt von Katechin viel wirksamer beim Löschen von Photolumineszenz.
Ein anderes ähnliches Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung von 1 ml 0,333 M Benzochinon anstelle von Hydrochinon. Ein geringes oder kein verstärktes Löschen der Photolumineszenz wurde beobachtet nach Feststoffelektrooxidation. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit der Schlussfolgerung, dass Benzochinon verantwortlich ist für das beobachtete Löschen. In der Tat wurde ein leichter Anstieg der Photolumineszenz-Intensität beobachtet, was anzeigt, dass nach verlängerter Oxidation Benzochinon anfängt, sich zu zersetzen, um nicht-löschende Produkte zu bilden.
Beispiel 11
Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Löschen durch Phenol: Untersuchungen mit elektrischem Potential
Eine geeignete Menge an Ru(bpy)₃Cl₂•6H₂O und TPAH wurde in Elecsys®-Pufferlösung gelöst und verdünnt, um eine Stammlösung von 0,3 μM Ru(bpy)₃ ²⁺ (als Luminophor) und 0,05 M TPAH (als Reaktionspartner) bei pH = 6,8 zu ergeben. Mikrolitermengen 1 M Phenol (als ECL-Löscher), gelöst in Ethanol, wurden zu 1 ml-Aliquoten der Stammlösung hinzugefügt, um Proben zu ergeben, mit Phenolkonzentrationen in einem Bereich von 2 bis 6 mM. Die ECL-Intensität wurde gemessen und aufgenommen (in freigewählten Einheiten) für jede der Proben, unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren, jedoch mit Potentialen von 600, 1000 und 2800 mV, um den Grad des ECL-Löschens und die Potentiale, bei denen vollständiges ECL-Löschen geschah, abzuschätzen.
Von der Oxidation von Ru(bpy)₃ ²⁺ zu Ru(bpy)₃ ³⁺ ist bekannt, dass sie bei +1,3 V gegen Ag/AgCl geschieht. Die Oxidation von Phenol zu Produkten geschieht bei ungefähr +1,0 V gegen Ag/AgCl. Wie erwartet, wurde eine geringere ECL beobachtet bei Potentialen von weniger als +1,3 V gegen Ag/AgCl, da bei niedrigeren Potentialen Ru(bpy)₃ ²⁺ nicht oxidiert wird. Wie erwartet, wurde bei höheren Phenolkonzentrationen und bei höheren Potentialen stärkeres Löschen beobachtet, was die Schlussfolgerung unterstützt, dass die Oxidation von sowohl Phenol als auch Ru(bpy)₃ ²⁺ benötigt wird für wirksames ECL-Löschen.
Vergleichsbeispiel 1
Ru(bpy)₃ ²⁺-ECL-Löschen durch Methylviologencarboxylat.
Eine geeignete Menge an Ru(bpy)₃Cl₂•6H₂O wurde in Elecsys®-Pufferlösung gelöst und verdünnt, um eine Stammlösung von 0,3 μM Ru(bpy)₃ ²⁺ (als Luminophor) bei pH = 6,8 zu ergeben. Mikrolitermengen wässrigen 10 mM Methylviologencarboxylats (MV²⁺, 1,1-'Dimethyl-4,4'-bipyridiniumcarboxylatdichlorid) (als ECL-Löscher) wurde hinzugefügt zu 1 ml-Aliquoten der Stammlösung, um Proben zu ergeben mit MV²⁺-Konzentrationen im Bereich von 2 bis 10 mM. Zum Vergleich wurden Mikrolitermengen von 1 M Phenol (als ECL-Löscher), gelöst in Ethanol, zu 1 ml-Aliquoten der Stammlösung hinzugefügt, um Proben zu ergeben mit Phenol-Konzentrationen im Bereich von 2 bis 6 mM. ECL wurde gemessen für jede der Proben und die ECL-Intensität (in freigewählten Einheiten) wurde aufgenommen. Die Daten sind in 6 gezeigt.
Dieses Beispiel zeigt, dass bei vergleichbaren Konzentrationen, Phenol die ECL mikromolarer Konzentrationen Ru(bpy)₃ ²⁺ in der Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Reaktionsfolge annähernd 10 mal wirksamer löscht als Methylviologencarboxylat, der „goldene Standard" des Ru(bpy)₃ ²⁺-ECL-Löschens.
Beispiel 12
Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Löschen durch Phenol: Immobilisierter Luminophor (über magnetische Partikel) und Löschmittel in Lösung.
Dieses Beispiel erläutert das Löschen eines immobilisierten markierten Komplexes, in diesem Fall ein Oligonukleotid, das mit dem Luminophor Ru(bpy)₃ ²⁺ markiert und anschließend an paramegnetische Partikel angeheftet worden war, durch ein Löschmittel, in diesem Fall Phenol, das in der Lösung vorhanden ist.
Ein Testoligonukleotid, bestehend aus 20 Nukleotidresten wurde zubereitet, unter Verwendung von Standard-Festphasenverfahren mit einem Perkin Elmer ABI 394 Synthesizer® unter Verwendung der Beta-Cyanethylphosphoramidit-Chemie. Durch Verwendung eines im Handel erhältlichen (von Glen Research), derivatisierten Glasträgers mit kontrollierten Poren (unten dargestellt), der sowohl eine Biotin-TEG-Gruppe als auch eine DMT-geschützte Hydroxylgruppe (d. h. -ODMT) aufweist, hat das resultierende Oligonukleotid am 3'-Ende eine gebundene Biotingruppe.
Das Oligonukleotid wurde unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert. Wenn das 20-mer Oligonukleotid erst einmal synthetisiert worden war (mit einer DMTgeschützen 5'-Hydroxylgruppe), wurde eine End-Reaktionsfolge durchgeftihrt unter Verwendung des Synthesizers, wobei jedoch anstelle eines Nukleotidmonomerreagenz ein Phosphoramiditderivat eines Ru(bpy)₃ ²⁺, unten gezeigt, verwendet wurde.
Auf diesem Wege wurde das 20-mer Oligonukleotid (unten gezeigt) erhalten, welches am 3'-Ende eine gebundene Biotingruppe und an dem 5'-Ende eine gebundene Ru(bpy)₃ ²⁺ – Einheit aufweist.
Dieses derivatisierte Oligonukleotid kann, wie unten gezeigt, gekennzeichnet werden, worin R die Ru(bpy)₃ ²⁺-enthaltende Gruppe und B die Biotin-enthaltende Gruppe bezeichnet.
Superparamagnetische Partikel (von Dynal Corp., Lake Success, NY), die einen Magnetft (Fe₃O₄)-Kern und eine äußere Hülle aus Polystyrol aufweisen, und die eine Größe von ungefähr 2,8 μm haben, wurden mit Polystreptavidin (einem Protein, das zubereitet wurde aus dem Kulturüberstand von Streptomyces avidinii, das vier hochaffine Bindestellen für Biotin hat) überzogen. Eine Lösung der markierten Oligonukleotide wurde zu einer Suspension der mit Streptavidin überzogenen magnetischen Perlen hinzugefügt, um markierte magnetische Perlen, die markierte Oligonukleotide gebunden haben, zu ergeben.
Da Phenol zu einigen Proben hinzugefügt werden musste, wurde eine Pufferlösung zubereitet, basierend auf der Elecsys®-Pufferlösung und formuliert, um 27,19 g/l monobasisches Kaliumphosphat (KH₂PO₄); 0,2 g/l Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol); und 0,05 M TPAH aufzuweisen. Der pH der Pufferlösung wurde auf 7,0 angeglichen mit 4 M wässriger NaOH. Für jene Fälle, wo Phenol zu der Pufferlösung hinzugefügt werden musste, wurden 1,2 μl 1 M Phenol, gelöst in Ethanol, hinzugefügt, um 1 mM Phenol zu ergeben, und der pH wurde wiederum auf 7,0 mit 4 M wässriger NaOH angeglichen.
Ein 3 μl-Aliquot einer Suspension makierter magnetischer Perlen (546 pmol Ru(bpy)₃ ²⁺-Markierung) wurde hinzugefügt zu 1 ml einer Pufferlösung, um eine Perlenarbeitslösung zu ergeben. Diese Perlenarbeitslösung wurde in die ECL-Zelle gegeben und die markierten magnetischen Partikel wurden auf der Oberfläche der Arbeitselektrode immobilisiert. Pufferlösung, enthaltend Reaktionspartner (und in einigen Fällen Phenol) wurde in die Zelle gespült und ein geeignetes Potential wird angelegt, um ein Signal zu erzeugen. ECL wurde gemessen und aufgenommen (in freigewählten Einheiten) für fünf Kontrollfälle (unter Verwendung von Puffer ohne Phenol) und zehn Löschfällen (unter Verwendung von Puffer, zu dem Phenol hinzugefügt wurde). In den Kontrollfällen wurden ECL-Signale von ungefähr 75.000 freigewählten Einheiten von den markierten Perlen in der Abwesenheit von Phenol beobachtet. Praktisch kein ECL-Signal wurde beobachtet für die markierten Perlen in der Anwesenheit von Phenol.
Dieses Beispiel zeigt klar, dass in einem Format margnetischer Perlen, wo der ECL-Luminophor immobilisiert ist (in diesem Fall angeheftet an ein Oligonukleotid und das Oligonukleotid ist angeheftet an eine magnetische Perle) das Löschen des ECL-Luminophors immer noch geschieht.
Beispiel 13
Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Löschen durch ein Benzochinon: Sowohl der Luminophor als auch das Löschmittel sind immobilisiert (über magnetische Partikel).
Dieses Beispiel erläutert das Löschen eines immobilisierten, markierten Komplexes, in diesem Falle ein Oligonukleotid, das mit dem Luminophor Ru(bpy)₃2+ markiert und an paramagnetische Partikel angeheftet worden war, durch ein Löschmittel, in diesem Fall ein Benzochinon, das auch an das Oligonukleotid angeheftet worden war.
Drei Oligonukleotide, bestehend aus 21 Nukleotidresten, wurden zubereitet unter Verwendung von Standard-Festphasenverfahren mit einem Perkin Elmer ABI 394 Synthesizer® unter Verwendung der Beta-Cyanethylphosphoramidit-Chemie auf eine Art und Weise analog zu der, die in Beispiel 12 beschrieben ist. Die drei resultierenden, derivatisierten Oligonukleotide sind unten dargestellt, wo R die Ru(bpy)₃ ²⁺-enthaltende Gruppe und B die Biotin-enthaltende Gruppe bezeichnet.
In der obigen Formel bezeichnet T aminmodifiziertes C_G-dT", ein im Handel erhältlicher(von Glen Research) modifizierter Thyminnukleotidrest, unten dargestellt, der während der dargestellt, der Oligonukleotidsynthese eingeführt wurde war.
Auch bedeutet in der obigen Formel L „Label On", ein im Handel erhältliches (von Glen Research) Reagenz, unten dargestellt, das das Anhängen üblicher Markierungen erlaubt, und das während der Oligonukleotidsynthese eingeführt wurde.
Die obigen drei derivatisierten Oligonukleotide (jeder mit einer Ru(bpy)₃ ²⁺-Gruppe) wurden als Kontrollen verwendet. Drei Testoligonukleotide, unten gezeigt, wurden zubereitet durch Anhängen einer Benzochinoneinheit, die sich an der mit T markierten Position und an jeder mit L markierten Position befand.
Für T wurde die geschützte Amingruppe (d. h. -NHC(=O)CF₃) zuerst deprotektioniert und man ließ die freie Amingruppe anschließend mit dem N-Succinimidylester eines Benzochinonderivates, unten gezeigt, reagieren. Für L wurde die geschützte Amingruppe (d. h. -NHFMOC) zuerst deprotektioniert und man ließ das freie Amin anschließend mit demselben N-Succinimidylester des Benzochinonderivates reagieren.
Die drei Testoligonukleotide (und ihre Standards) wurden quantifiziert durch UV-VIS-Absorptionsspektroskopie unter Verwendung der Extinktion der Ru(bpy)3²⁺-Einheit bei 456 nm (ε = 13000 m^–1cm^–1), so dass äquivalente Mengen jedes Testoligonukleotids verwendet werden konnten für die ECL-Analyse. Auf eine Art und Weise analog zu der in Beispiel 12, wurden geeignete Mengen des Testoligonukleotides zu Suspensionen der Streptavidinüberzogenen magnetischen Perlen hinzugefügt, um markierte magnetische Perlen mit gebundenem, markiertem Oligonukleotid zu ergeben, so dass eine 1/3-Sättigung der Streptavidinstellen erreicht wurde (576 pmol Biotin/DNS-markierte Sonden).
Jede Suspension markierter magnetischer Perlen wurde untersucht. Ein 3 μl-Aliquot der Suspension markierter magnetischer Perlen wurde in 1 ml Elecsys®-Pufferlösung gegeben, um eine Perlenarbeitslösung zu ergeben. Diese Perlenarbeitslösung wurde in die ECL-Zelle des Origen-Analysegerätes gegeben und die markierten, magnetischen Partikel wurden auf der Oberfläche der Arbeitselektrode iminobilisiert. Elecsys®-Pufferlösung, die Reaktionspartner enthielt, wurde in die Zelle gespült und ein geeignetes Potential wurde angelegt, um ein Signal zu erzeugen. ECL wurde gemessen und aufgenommen (in freigewählten Einheiten) für fünf Kopien für jedes der vier Testoligonukleotide.
Für Testoligonukleotid 13-1-RQ, bei dem der Ru(bpy)₃ ²⁺-Luminophor von der löschenden Benzochinongruppe durch vier Nukleotidreste getrennt ist, war die beobachtete ECL-Intensität ungefähr 53% geringer als jene, die für das Kontrolloligonukleotid 13-1-R, das keine Löscheinheit hat, beobachtet wurde.
Für das Testoligonukleotid 13-2-RQ, bei dem der Ru(bpy)₃ ²⁺-Luminophor von der löschenden Benzochinongruppe durch 21 Nukleotidreste getrennt ist, war die beobachtete ECL-Intensität annähernd 49% geringer als jene, die beobachtet wurde für das Kontolloligonukleotid 13-2-R, das keine Löscheinheit hat.
Für das Testoligonukleotid 13-3-RQ₅, bei dem der Ru(bpy)₃ ²⁺-Luminophor von den (fünf) löschenden Benzochinongruppen durch 21 Nukleotidreste getrennt ist, war die beobachtete ECL-Intensität annähernd 20% geringer als jene, die beobachtet wurde für das Kontrolloligonukleotid 13-3-R, das keine Löscheinheit hat.
Dieses Beispiel zeigt deutlich, dass in einem Format magnetischer Perlen, wo sowohl der ECL-Luminophor als auch die Löscheinheit immobilisiert sind (in diesem Fall sind beide an ein Oligonukleotid angehängt, und das Oligonukleotid ist an eine magnetische Perle angehängt), das Löschen des ECL-Luminophors immer noch geschieht.
Beispiel 14
Ru(bpy)₃ ²⁺/TPAH-ECL-Löschen durch ein Benzochinon: Restriktionsenzymverfahren
Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von Restriktionsenzymen, gekoppelt mit dem Einfangen mit Perlen und anschließender ECL-Detektion. In diesem Fall werden Oligonukleotidhybridisierungssonden mit Ru(bpy)₃2+ und Biotin am 3 "-Ende und einer Löscheinheit am 5'-Ende markiert. Zwei Oligonukleotidpaare mit Biotingruppen, die am 3'-Ende gebunden sind, werden unter Verwendung von Standard-Festphasenverfahren, wie im Beispiel 12 beschrieben, synthetisiert.
Jedes Paar bezieht sich auf ein gesondertes Beispiel und jedes Glied eines bestimmten Paares umfasst dieselbe spezifische Sondensequenz, die komplementär ist zu einer Sequenz in einem zu detektierenden DNS-Ziel. Das zweite Glied jedes Paares, das nicht derivatisiert wird, um eine Löscheinheit aufzuweisen, wird verwendet zu Vergleichszwecken, um das Löschen zu belegen; das zweite Glied stellt das Anzeigen der ECL-Emission in Abwesenheit einer Löscheinheit bereit. Die unterstrichenen Reste, CCT AGG, identifizieren Teile der BamHl-Enzymrestriktionsstellen, wie unten diskutiert.
In der obigen Formel wird T wie oben in Beispiel 13 definiert und N bezeichnet „5'-Aminomodifikator", ein im Handel erhältliches (von Glen Research) Reagenz, unten dargestellt (wo MMT 4-Monomethoxytrityl ist), das während der Oligonukleotidsynthese eingeführt worden war.
Auch bedeutet in der obigen Formel Tc „carboxy-modifiziertes dT", ein im Handel erhältlicher (von Glen Research) modifizierter Thymin-Nukleotidrest, unten dargestellt, der während der Oligonukleotidsynthese eingeführt wurde.
Nach der Abspaltung der Oligonukleotide von dem Festphasenträger wird eine Ru(bpy)₃ ²⁺-Gruppe kovalent an das 3'-Ende angehängt, indem man das folgende N-Hydroxysuccinimidylesterderivat mit der Carboxygruppe von Tc reagieren lässt:
Eine Löscheinheit wird dann kovalent an das 5'-Ende des ersten Gliedes jedes Paares über die Aminogruppen von N und T angehängt, unter Verwendung des in Beispiel 13 dargestellten aktivierten Benzochinonderivates. Auf diesem Wege werden die folgenden beiden Paare derivatisierter Oligonukleotid-Hybridisierungssonden erhalten. Die ECL-Emission des ersten Gliedes jedes Paares wird gelöscht durch die Anwesenheit der Löscheinheit, wie gezeigt durch Vergleich mit der ECL-Emission des entsprechenden zweiten Gliedes, das keine Löscheinheit hat.
Das erste Glied eines Paares derivatisierter Oligonukleotid-Hybridisierungssonden (z. B. 14-A-1-BRQ oder 14-B-1-BRQ) wird dann zu einer Probe hinzugefügt, die einzelsträngige DNS enthält. Die derivatisierte Oligonukleotidsonde wird nur mit der komplementären Zielsequenz hybridisieren. Das Restriktionsenzym BamHl wird hinzugefügt. Dieses Enzym erkennt nur eine spezifische doppelsträngige DNS-Sequenz, wie unten gezeigt.
Das Restriktionsenzym schneidet diese Sequenz zwischen den GG-Resten, um zwei Fragmente zu ergeben, von denen jedes einen 5'-Überhang hat, wie unten gezeigt.
Auf diesem Wege führt jede DNS-Zielsequenz zu einem Spaltereignis und der Bildung eines Spaltfragmentes, das eine ECL-Markierung aufweist, die nicht länger in Löschkontakt mit einer ECL-Löscheinheit ist. Diese Spaltfragmente besitzen auch eine Biotingruppe (ebenso wie eine nicht-gelöschte ECL-Markierung), das ihr Einfangen (und wahlweise die Abtrennung) mit Hilfe von mit Streptavidin überzogenen magnetischen Perlen erlaubt, wie in Beispiel 12. Die ECL-Emission wird dann gemessen und in Beziehung gesetzt mit der Menge der Ziel-DNS in der ursprünglichen Probe. Natürlich kann das Einfangen mit Perlen auch durchgeführt werden vor oder nach der enzymatischen Spaltung.
Wiederum wird, für Vergleichszwecke, die ECL-Emission nach der Hybridisierung und vor der enzymatischen Spaltung für die ersten und zweiten Glieder eines bestimmten Paares gemessen. Wenn die Sonde mit der Ziel-DNS hybridisiert hat, bleibt die ECL-Emission des ersten Gliedes jedes Paares gelöscht durch die Anwesenheit der Löscheinheit, wie gezeigt durch Vergleich mit der ECL-Emission des entsprechenden zweiten Gliedes, das keine Löscheinheit hat.
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Claims

Verfahren zum Nachweis eines Oligonucleotids in einer Probenzusammensetzung, das die Schritte aufweist: (a) Herstellen einer Assay-Mischung, die die Probenzusammensetzung; ein Reagenz mit einer chemischen Einheit, die Elektrochemilumineszenzeigenschaften (ECL-Markierung) aufweist, und ein Reagent mit einer chemischen Einheit, die beim Löschkontakt mit einer ECL-Markierung die beobachtete ECL-Emission (ECL-Löscheinheit) abschwächt, wobei die ECL-Löscheinheit mindestens eine Benzoleinheit umfasst, aufweist; (b) Bestimmen irgendeines Unterschiedes zwischen den ECL-Emissionen von: (i) der in Stufe (a) hergestellten Assay-Mischung und (ii) einer Assay-Mischung, die dieses Reagent mit einer chemischen Einheit, die Elektrochemilumineszenzeigenschaften (ECL-Markierung) aufweist, dieses Reagenz mit einer chemischen Einheit, die beim Löschkontakt mit einer ECL-Markierung die beobachtete ECL-Emission (ECL-Löscheinheit) abschwächt und eine bekannte Menge des Oligonucleotids umfasst und (c) in Beziehung setzen des in Stufe (b) bestimmten Unterschiedes mit der Menge des Nucleotids in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ECL-Löscheinheit mindestens eine Einheit umfasst, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Phenoleinheiten, Chinoneinheiten, Berizolcarbonsäureeinheiten und Benzolcarboxylateinheiten besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ECL-Markierung Ruthenium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ECL-Markierung Osmium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ECL-Markierung einen polyaromatischen Kohlenwasserstoff umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Oligonucleotid DNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Oligonucleotid RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Menge des Nucleotids Null ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Reagent mit einer ECL-Markierung und das Reagent mit der ECL-Löscheinheit das gleiche Reagent sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Reagent mit einer ECL-Markierung und das Reagent mit der ECL-Löscheinheit unterschiedliche Reagenzien sind.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin die Schritte aufweist: Durchführen einer chemischen Reaktion auf einem Substrat, das in einer Anfangsprobenzusammensetzung enthalten ist, um das Oligonucleotid in der Probenzusammensetzung vor der Stufe (a) herzustellen und in Beziehung setzen des in Stufe (b) bestimmten Unterschiedes mit der Menge Substrat in der Anfangsprobenzusammensetzung.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin die Stufe aufweist: Durchführen einer chemischen Reaktion mit der Stufe (a) hergestellten Assay-Mischung vor der Bestimmung von Stufe (b).
Assayreagenzkit zur Anwendung in dem Verfahren nach Anspruch 1, worin das Assayreagenzkit ein Assayreagenz in einem geeigneten Behälter, wobei das Assayreagenz eine ECL-Löscheinheit und eine ECL-Markierung umfasst, und Anweisungen zur Durchführung des Verfahrens umfasst.