DE3854029T2 - Homogener Abschirmungstest. - Google Patents

Homogener Abschirmungstest.

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Description

    Hintergrund
  • Diese Erfindung liegt im Gebiet diagnostischer Verfahren und Techniken zur Detektion und Quantifizierung kleinster Mengen organischer Verbindungen.
  • Im genaueren bezieht sich die Erfindung auf homogene diagnostische Tests, bei denen ein Unterschied in der Stabilität der Markierung in ihren ungebundenen Formen im Vergleich zu ihren gebundenen Formen besteht. Diese Erfindung bezieht sich auf die Konstruktion von Umgebungen für diagnostische Testsysteme, in denen eine Markierung, entweder in ihrer komplexierten oder gebundenen Form im Vergleich zu ihrer unkomplexierten oder ungebundenen Form, differentiell abgebaut wird.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Diagnostische Tests sind ein gebräuchliches analytisches Verfahren zur Detektion, Lokalisation oder Quantifizierung biologischer Substanzen unter Verwendung markierter Bindungsreagentien. Die Anwesenheit des markierten Reagens kann dann unter Verwendung einer Vielzahl bekannter Verfahren nachgewiesen werden. Diese Erfindung kann auf alle bekannten diagnostischen Testformate angewendet werden; eingeschlossen sind ohne Einschränkung direkte Bindungs- und Kompetitionstests, und sequentielle Sättigungstests. Eine besondere Art eines diagnostischen Tests ist der Nukleinsäurehybridisierungs-Test. Hybridisierungs-Testsysteme beruhen auf der Tatsache, daß einzelsträngige Nukleinsäuren (DNA oder RNA) unter geeigneten Umständen mit komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuren hybridisieren oder rekombinieren. Durch Markieren der komplementären Nukleinsäure-Sonde mit einer leicht nachweisbaren Markierung ist es möglich, die Anwesenheit der interessierenden Zielpolynukleotidsequenz in einer Test-Probe, die einzelsträngige Nukleinsäuresequenzen enthält, nachzuweisen.
  • Testsysteme können grob gesehen als heterogen oder homogen charakterisiert werden. Der Ausdruck "heterogen", angewandt auf Testsysteme, bezeichnet jene spezifischen Bindungstests, die eine Trennung der markierten von der unmarkierten nachzuweisenden Substanz benötigen. Homogene Testsysteme andererseits beinhalten keinerlei physikalische Trennungsschritte. Weil homogene Testsysteme eine minimale Anzahl an Arbeitsschritten beinhalten, sind sie im allgemeinen bequemer und einfacher anzuwenden als heterogene Testsysteme.
  • Zum Beispiel kann ein typischer Sandwichimmunoassay die Inkubation eines immobilisierten Antikörpers mit einem Testmedium einschließen. Antigene, wenn im Medium vorhanden, werden an den Antikörper binden. Nach der Inkubation wird ungebundenes Antigen in einem Trennungsschritt entfernt. Nach einer zweiten, oder simultanen Inkubation mit einer Lösung von markiertem Antikörper wird das gebundene Antigen zwischen dem immobilisierten Antikörper und dem markierten Antikörper "gesandwicht". Nach einem zweiten Trennungsschritt kann die Menge an markiertem Antikörper als Maß für das Antigen im Medium bestimmt werden. Dieses System ist zeitaufwendig, da es eine Reihe von Inkubations- und Trennungsschritten einschließt.
  • Die Bemühungen in diagnostischen Tests nach dem Stand der Technik wurden dahingehend konzentriert, homogene Tests und Markierungen zu entwickeln, die zwischen kleinen Differenzen in der Menge gebundener im Vergleich zu ungebundener Substanzen von Interesse unterscheiden können. Eines der Ziele der vorliegenden Erfindung ist ein Testsystem, in dem die Markierung selbst eine nachweisbare Veränderung erfährt, die z.B. in ihrer Fähigkeit zur Chemolumineszenz, wenn sie in ihrem gebundenen Zustand vorliegt im Vergleich dazu, wenn sie in ihrem ungebundenen Zustand ist, liegen kann. Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Testsystem, in dem die Markierung entweder in ihrer gebundenen oder ungebundenen Form im wesentlichen abgebaut oder zerstört wird, wodurch ein einfaches Mittel zur Identifizierung und Quantifizierung einer interessierenden Reaktion geschaffen wird.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfihren zum empfindlichen Nachweis von Analyten unter Verwendung eines homogenen Testformates zu offenbaren. Es ist ebenso ein Ziel dieser Erfindung, verbesserte Verfahren zur Erhöhung der Empfindlichkeit von Tests zu ermöglichen, die eine Abtrennung unter Kombination des hier gezeigten homogenen Verfahrens mit anderen Trennverfahren beinhalten, um den unspezifischen Hintergrund zu reduzieren. Das Prinzip der hier gezeigten Erfindung beruht auf der differentiellen Stabilität einer Markierung gegenüber chemischen oder biochemischen Reagenzien. Wo auch immer bestimmte Markierungen an Bindungspartner konjugiert werden, haben wir gefunden, daß die Stabilität erwähnter Markierungen verändert wird, oder verändert werden kann, wenn der erwähnte Bindungspartner an eine Bindungssubstanz des erwähnten Bindungspartners bindet. Es ist ebenso das Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zu offenbaren bzw. zu erschließen, in dem die erwähnte differentielle Stabilität der Markierung zum empfindlichen Nachweis eines Analyten unter Verwendung eines homogenen diagnostischen Testsystems verwendet werden kann. Weiter ist es ein anderes Ziel der Erfindung, den Gebrauch von chemolumineszierenden, acridiniumestermarkierten DNA-Sonden in erwähnten homogenen diagnostischen Tests zum empfindlichen Nachweis der Anwesenheit komplementärer Zielpolynükleotidsequenzen zu offenbaren.
    • Beschreibung des Stands der Technik
  • Es gibt eine Vielzahl homogener Tests nach dem Stand der Technik, die in ihrer Komplexität variieren. In einigen Systemen ist zum Beispiel die Markierung ein Katalysator, der an einer chemischen Reaktion in der Gegenwart anderer Komponenten teilnehmen kann, zum Beispiel Enzyme, Coenzyme und Cofaktoren. In anderen, jedoch verwandten Systemen, ist die Markierung ein Substrat für eine chemische oder biochemische Reaktion. In diesen Systemen wird die Bildung einer spezifischen, einfach nachzuweisenden Substanz wie zum Beispiel Glucose, Lactat oder Alkohol dazu benutzt, die Zielreaktion zu überwachen und nachzuweisen. In anderen Testsystemen besitzt der Analyt einzigartige physikalische Eigenschaften, die es erlauben, ihn direkt nachzuweisen. Beispiele dieser Arten von Markierungen umfassen Metalle, Hämoglobin und Chlorophyll.
  • Noch weitere homogene Testsysteme beruhen auf enzymgebundenen spezifischen Bindungsreaktionen, wobei der Analyt ein Ligand für eine spezifische Bindungsreaktion ist. Ist der Analyt anwesend, erfut er eine spezifische Bindungsreaktion mit einem Konjugat, welches einen spezifischen Bindungspartner und eine Markierungssubstanz umfaßt. Entweder konkurrierend, oder darauf folgend, werden andere Substituenten, die mit der Markierung interagieren, zugesetzt. Die Aktivität der Markierung ist, wenn das Konjugat, von dem die Markierung eine Komponente ist, in einer komplexierten Form vorliegt verschieden gegenüber einer unkomplexierten Form. Solche Systeme verwenden charakteristischerweise Enzyme als Markierungssubstanz, und Substrate, die einen kolorimetrischen, fluorimetrischen oder chemolumineszenten Endpunkt produzieren. Beispiele von homogenen Enzymimmunoassays beinhaften die U.S.-Patente Nr. 3 654 090, 3 817 837 und 4 190 496. Andere Beispiele homogener Tests, die den Gebrauch von Chromophoren beinhalten, die Fluoreszenz/Quencher-Paare bilden, können in den U.S.-Patenten Nr. 4 199 559, 4 174 384 und 4 318 707 gefunden werden. In einigen Systemen jedoch ist die Markierung eine von einem Enzym verschiedene Substanz gewesen, zum Beispiel ein Vitamin, NAD, FAD oder Biotin, welches nichtsdestoweniger an eine "Monitoring"-Reaktion geknüpft sein kann. Ein Beispiel dieses Typs ist das U.S.-Patent Nr. 4 383 031. In diesen Systemen beruht die "Monitoring"-Reaktion auf einer strukturellen Änderung, die die Aktivtät der Markierung ändert.
  • Andere homogene Testsysteme schließen die Technik der Polarisationsfluoreszenz ein. Hier kompetitiert der Analyt mit einem Fluoreszenzkonjugat niedrigen Molekulargewichts um die Bindung an einen spezifischen Bindungspartner hohen Molekulargewichts. Da die Polarisation der Fluoreszenz sich ändert, wenn das kleine Molekül von der Oberfläche des großen Moleküls verdrängt wird, ist es möglich, die Menge des Analyts in Lösung zu bestimmen. Ein Beispiel dieses Typs von Testsystem ist das U.S.- Patent Nr. 4 668 640.
  • Noch ein anderer Typ eines homogenen Testsystems umfaßt nicht-radiativen Energietransfer. In diesen Systemen wird die Absorption von Licht von einem Molekül auf ein anderes, wenn die zwei Moleküle in enge Nachbarschaft kommen, als die "Monitoring"- Reaktion benutzt. Im allgemeinen wurden diese Verfahren in zwei Arten beschrieben. In einem Verfahren ist das erste Molekül chemolumineszent, und nach Anregung wird ein Teil der erzeugten elektromagnetischen Energie auf ein zweites "Absorber"-Molekül übertragen, welches in enger Nachbarschaft sein muß. Wird die Energie von dem zweiten Molekül absorbiert, und bei einer verschiedenen Wellenlänge emittiert, wird ein Teil des Lichtes eine spektrale Verschiebung proportional der Anzahl chemolumineszenter Moleküle in enger Nachbarschaft zu Absorbermolekülen zeigen.
  • In einem anderen Typ eines nicht-radiativen Energietestsystems ist das erste Molekül fluoreszierend, und dient als ein "Absorbierer" externen Lichtes. In Gegenwart eines zweiten fluoreszierenden Moleküls wird ein Teil der Energie übertragen, und Licht bei einer anderen Wellenlänge ausgestrahlt. Das ausgestrahlte Licht wird eine spektrale Verschiebung proportional der Anzahl von "Absorber"- und "Emitter"-Molekülen in enger Nachbarschaft zueinander zeigen.
  • Ein verschiedener Typ eines Testsystems mit doppelten Sonden ist in dem U.S.-Patent Nr. 4 670 379 zu ersehen. Die erste Sonde ist mit einem Katalysator markiert, die zweite mit einem Apolumineszenzstoff. Beide Sonden zielen auf benachbarte Bereiche auf der Ziel-Nukleinsäuresequenz. Wenn beide Sonden zusammen mit dem Ziel hybridisiert sind, wird das Substrat zugegeben. Der Katalysator konvertiert das Substrat in ein Transformationsradikal, welches dann seinerseits den Apolumineszenzer an der zweiten Sonde in einen Lumineszenzer überfüt. Dies passiert nur, wenn die Hybridisierung stattgefunden hat. Unter Verwendung dieser Prinzipien wurden Tests entwickelt, die auf zwei markierten Substanzen basieren, die gleichzeitig an einen gemeinsamen Analyt binden.
  • Ein spezifisches Beispiel dieses Typs eines Energietransfer-Testsystems zeigt Elazar et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 85105130.0, Publikations-Nr. 0159719, veröffentlicht am 30. Oktober 1985, welches den Gebrauch zweier einzelsträngiger Nukleinsäuresonden offenlegt, die komplementär zu den gleichen oder den entgegengesetzten Strängen des genetischen Zielmaterials sind. Jede der Sonden ist mit einer Gruppe bzw. Funktion markiert, die nur zur Erzeugung eines Signals fähig ist, wenn beide Markierungen zusammenkommen. Anders als in der hier beschriebenen Erfindung beinhaltet Elazar et al. die Bildung und den Nachweis doppelter Hybride oder Multihybride. Gleicherweise offenbaren Heller et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 82303699.1, Publikations-Nr. 0070685 vom 26. Januar 1983 und die verwandte Europäische Patentanmeldung Nr. 82303700.7, Publikations-Nr. 0070686 gleichen Datums von Morrison et al. homogene Testsysteme unter Verwendung zweier lumineszenter Sonden. Mindestens eine der Lichtmarkierungen ist vom Typ eines Absorber/Emitters, so daß, wenn die zwei Sonden an das Ziel hybridisiert werden, Energietransfer zwischen den zwei Markierungen stattfindet. Dies veranlaßt den Absorber/Emitter zur Re-Emission bei einer anderen Wellenlänge. Die zweite Emission verrät die Hybridisierung. Ein Antigenassay dieses Typs ist in Morrison et al., siehe oben, offenbart.
  • Viele biologische Substanzen können nicht einfach direkt bei jedwedem vernünftigen Grad an Empfindlichkeit nachgewiesen werden, und benötigen eine Bindungsreaktion irgendeines Typs. Wie aus vorheriger Diskussion ersichtlich, beruht der Stand der Technik auf der Detektion kleiner Abschwächungen zwischen gebundener und ungebundener Markierung. Die Systeme nach dem Stand der Technik sind nicht fähig, signifikant zwischen gebundener und ungebundener Markierung zu unterscheiden. Solche Tests haben sich als nützlich herausgestellt zur Detektion von Analyten, die nur in hohen Konzentrationen anwesend sind, zum Beispiel beim Monitoring verschiedener Arzneistoffe bzw. Drogen in Blut und Urin.
  • Auf dem Gebiet klinischer Diagnostika besteht ein Bedarf an einem direkten homogenen Detektionstest, der auf der Fähigkeit zweier Bindungspartner beruht, die Stabilität der Markierung zu modifizieren, zum Beispiel resultierend in selektivem Entfernen oder Zerstören der Markierung in entweder der gebundenen oder ungebundenen Form. Hirschfeld beschreibt in Fluorescence Background Discrimination by Prebleaching, J. Histochemistry and Cytochemistry, 27/1 96-101 (1979), ein gewissermaßen verwandtes elektrooptisches Verfahren, das photochemisches Bleichen, das Markierungsmoleküle, oder zumindest ihre Fluoreszenz, zerstören kann, einschließt. Die darin dargelegte Erfindung zeigt weder, noch schlägt sie die Verwendung photochemischen Bleichens oder irgendeiner anderen Technik vor, um selektiv eine Markierung in einem diagnostischen Test zu entfernen oder zu zerstören. Die vorliegende Erfindung erfüllt einen bestehenden Bedarf in diagnostischen Tests, da sie um Größenordnungen empfindlicher als nach dem Stand der Technik ist. Der Bereich der Sensitivität nach dem Stand der Technik ist nicht besser als bis in den Bereich von 10&supmin;¹³ mol hinein, während die vorliegende Erfindung sensitiv bis in den Bereich von 10&supmin;¹&sup6; mol ist.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Kurz gefaßt, beinhaltet diese Erfindung diagnostische Tests und Verfahren, wie sie in den beiliegenden Ansprüchen definiert sind. Das Verfahren kann zur Detektion eines Analyten in einem Medium verwendet werden, wobei besagter Analyt ein Teil eines spezifischen Bindungspaares ist. Wird das Medium, in dem der Analyt vermutet wird, mit einem Bindungspartner kombiniert, ist eine an den Bindungspartner geknüpfte Markierung fähig, eine nachweisbare Veränderung in ihrer Stabilität oder in ihrem differentiellem Abbau zu erfahren, wann immer der Analyt an den spezifischen Bindungspartner bindet. In einer spezifischen Ausführungsform wurden einzelsträngige Nukleinsäuresonden so modifiziert, um Markierungen an praktisch jeder gewünschten Position oder Stelle der Sonde zu enthalten. Die Sondenmarkierungen sind von unterschiedlicher Stabilität oder empfindlich gegenüber differentieller Degradierung, abhängig davon, ob die Zielnukleotidsequenz an die Sonde hybridisiert ist.
  • Bemerkenswerterweise umfaßt die vorliegende Erfindung Testsysteme, in denen die Markierung an der gebundenen Sonde relativ zur ungebundenen Sonde stabilisiert wird. Diese Stabilisierung kann durch Interkalation unterstützt werden. DNA-interkalierende Verbindungen, eingeschlossen Acridiniumester, sind besonders, aber nicht ausschließlich, zum Gebrauch in diesem Testsystem der Erfindung geeignet. DNA-Interkalatoren sind dafür bekannt, nichtkovalent an Duplex-DNA zu binden, und sind charakteristischerweise flache Moleküle, die sich zwischen die Basenpaare der DNA-Doppelhelix einlagern können. Wir haben Beweise, die zeigen, daß Acridiniumester sich bevorzugt in Regionen einlagern, die reich an Adenin- und Thymidinbasenpaaren sind.
  • Es sollte verstanden werden, daß, während die vorliegende Erfindung nachfolgend mit besonderem Verweis auf acridiniumestermarkierte Sonden beschrieben werden wird, die vorliegende Erfindung den Gebrauch äquivalenter Markierungen und Testformate, betrachtet, die empfänglich gegenüber einer differentiellen Degradierung oder Veränderung in ihrer Stabilität sind, wenn das Konjugat, von dem die Markierung eine Komponente ist, gebunden wird. Wie hier noch genauer beschrieben wird, umfassen andere geeignete Markierungsverbindungen Substanzen, die durch die in den Nukleinsäuren anwesenden Amine destabilisiert werden, insbesondere durch die in der Nachbarschaft der Markierung auf unhybridisierten Sonden. Darüberhinaus können auch Markierungsverbindungen verwendet werden, die mit hydrophoben Umgebungen interagieren, wie zum Beispiel durch Interkalation zwischen Basenpaaren.
  • Diese Erfindung findet ihre Anwendung im allgemeinen auf jedes System, das den selektiven substantiellen Abbau der Markierung im Vergleich von ihren gebundenen zu ihren ungebundenen konjugierten Formen einschließt. Darüberhinaus ist aufgrund der relativen Einfachheit des Testsystems, das keine Trennungs- oder Waschschritte einschließt, dieses schneller und auch billiger als herkömmliche Testsysteme. Das System kann in den Fällen sensitiver sein als herkömmliche Systeme, in denen große Unterschiede in der Stabilität zwischen den gebundenen und ungebundenen Konjugatformen der Markierung bestehen, weil praktisch das gesamte restliche oder ungebundene Markierungskonjugat zerstört und deshalb nicht nachgewiesen wird. Zuguterletzt ist das System sehr vielseitig, und kann entweder allein oder in Kombination mit anderen Trennungsverfahren verwendet werden, um sehr geringe Hintergrundstörung zu erreichen. Die vorliegende Erfindung ist nützlich bei Sondendiagnostika, einschließlich des Nachweises infektiöser, genetischer und viraler Erkränkungen und der Krebsdiagnose.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Figur 1 zeigt eine graphische Darstellung der HPLC-Reinigung einer acridiniumestermarkierten Sonde.
  • Die Figur 2 zeigt eine graphische Darstellung der Ergebnisse, die in Beispiel 2 dargelegt werden.
  • Die Figuren 3-5 zeigen graphische Darstellungen der Ergebnisse, die in Beispiel 3 dargelegt werden.
  • Die Figur 6 zeigt eine graphische Darstellung der Ergebnisse, die in Beispiel 4 dargelegt werden.
  • Die Figur 7 zeigt eine graphische Darstellung der Ergebnisse, die in Beispiel 5 dargelegt werden.
  • Die Figur 8 zeigt eine graphische Darstellung der Ergebnisse, die in Beispiel 6 dargelegt werden.
  • Beste Vorgehensweise und genaue Beschreibung der bevorzugten Ausfürungsformen
  • Die folgenden Definitionen sollen in dieser Beschreibung verwendet werden:
  • 1. Acridiniumester: Ein Derivat von Acridin, welches ein quarternäres Stickstoffzentrum besitzt und an der 9-Position unter Erhalt einer labilen Phenylesterfunktion derivatisiert ist, spezifischerweise 4-(2-Succinimidyloxycarbonyl-ethyl)-phenyl-10- methylacridinium-9-carboxylat-fluorsulfonat:
  • 2. Acridiniumester: Funktionen bzw. Gruppen des folgenden allgemeinen Typs:
  • R&sub1;= ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUIERTES ALKYL, SUBSTITUIERTES ALKENYL, SUBSTITUIERTES ARYL, ALKOXY, ARYLOXY, ODER FEHLEND, WENN X=HALOGEN.
  • R&sub2;= H, ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUIERTES ALKYL, SUBSTITUIERTES ALKENYL, SUBSTITUIERTES ARYL, ALKOXY, ARYLOXY, WENN UND NUR DANN, WENN X=N.
  • R&sub3;= H, AMINO, HYDROXY, THIOL, HALOGEN, NITRO, AMINO, AMIDO, ACETYL, ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUIERTES ACETYL, SUBSTITUIERTES ALKYL, SUBSTITUIERTES ALKENYL, SUBSTITUIERTES ARYL, ALKOXY, ARYLOXY.
  • R&sub4;= ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUIERTES ALKYL, SUBSTITUIERTES ALKENYL, SUBSTITUIERTES ARYL.
  • X=O, N, S, HALOGEN; SUBSTITUIERTER PHOSPHOR, SUBSTITUIERTER SCHWEFEL, SUBSTITUIERTES BOR, ODER SUBSTITUIERTES ARSEN.
  • Y=O, S, ODER NH.
  • R&sub1; UND/ODER R&sub2; UND/ODER R&sub3; UND/ODER R&sub4; HABEN EINE REAKTIVE STELLE, DIE CHEMISCHE KONJUGATION ERLAUBT.
  • 3. Analyt - jede Substanz, die fähig ist, eine Bindungsreaktion mit einem oder mehreren spezifischen Bindungspartnern einzugehen, eingeschlossen, aber nicht hierdurch begrenzt, Antigene und ihre Antikörper, Haptene und ihre Antikörper; Hormone, Arzneistoffe, Metaboliten, Vitamine, Coenzyme und ihre Bindungspartner, eingeschlossen Rezeptoren; Polynukleotide, Oligonukleotide, und Hybride von Polynukleotiden oder Oligonukleotiden und Antikörper und Bindungssubstanzen hierzu; Polynukleotide oder Oligonukleotide und hybridisierbare Polynukleotide oder Oligonukleotide hierzu; Metalle und chelatisierende Agentien hierzu.
  • 4. Bindungspartner - jedes Molekül oder jede Substanz, die fähig ist, eine spezifische Bindungsreaktion mit einem Analyten einzugehen.
  • 5. Duplex: Doppelsträngiger Komplex, gebildet aus der Zusammenlagerung zweier komplementärer, einzelsträngiger Nukleinsäuremoleküle.
  • 6. Hybridisierung: Die Bildung stabiler Duplexe zwischen 2 komplementären, einzelsträngigen DNA- oder RNA-Molekülen, oder zwischen einem DNA- und komplementären RNA-Molekül. Duplexbildung ist spezifisch für komplementäre Basenpaare, wodurch der genetische Code des spezifischen hybridisierten Gens reproduziert wird.
  • 7. Gebunden: Zustand, in dem eine Bindungsinteraktion zwischen einem Molekül und seinem spezifischen Bindungspartner gebildet wurde.
  • 8. Stabil: Resistent gegen chemische oder biochemische Degradierung, Reaktion, Dekomposition bzw. Zerlegung, Verdrängung oder Modifikation.
  • 9. Stabilität: Die Resistenz einer Substanz gegen chemische oder biochemische Degradierung, Reaktion, Dekomposition, Verdrängung oder Modifikation.
  • Es ist bekannt, daß Acridiniumester in Lösung im Gleichgewicht mit ihrer korrespondierenden Base vorliegen. Bei hohem pH wird die Bildung der Base begünstigt; die quarternäre Stickstoffspezies bildet sich wieder bei niedrigem pH. Es ist ebenso bekannt, daß die Chemolumineszenzreaktion durch Basenzusatz beeinflußt bzw. beeinträchtigt werden kann, spezifischerweise einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxid, die Wasserstoffperoxid enthält. Die Chemolumineszenz beinhaltet den Angriff von Wasserstoffperoxidionen auf die Acridinspezies, was zur Bildung von elektronisch angeregtem N-Methylacridon führt. Siehe, im allgemeinen Weeks, et al. Acridinium- Esters as High-Spezific Activity Labels in Immunoassay, Clin. Chem. 2918, 1474-1479 (1983). Die Reaktion ist nachfolgend aufgeführt. ACRIDINIUMESTERREAKTIONSSCHEMA
  • Die vorliegende Erfindung kann wie folgt ausgefürt werden. Zuerst wählt man Bindungspartner, die eine Bindungssubstanz und einen oder mehrere Bindungspartner für den durchzuführenden Test beinhalten. Diese Paare können sein: Antigene und ihre Antikörper, Haptene und ihre Antikörper; Hormone, Arzneistoffe, Metaboliten, Vitamine, Coenzyme und ihre Bindungspartner, eingeschlossen Rezeptoren; Polynukleotide, Oligonukleotide, und Hybride von Polynükleotiden oder Oligonukleotiden und Antikörper und Bindungssubstanzen hierzu; Polynukleotide oder Oligonukleotide und hybridisierbare Polynukleotide oder Oligonukleotide hierzu; Metalle und chelatisierende Agentien hierzu.
  • Zweitens wählt man das zu verwendende Testformat. Dieses kann aus Formaten gewählt werden, die direkte Bindungsassays unmissen, Kompetitionsassays, sequentielle Sättigungsverfahren und Sandwichassays.
  • Drittens wählt man eine Markierung für den durchzuführenden Test. Dies kann eine Markierung sein, die direkt oder indirekt durch kolorimetrische, fluorometrische, chemolumineszente oder biolumineszente Mittel nachgewiesen werden kann. Die Markierung sollte zusätzlich die Eigenschaft besitzen, daß sie chemisch oder biochemisch abgebaut werden kann, um ihre Fähigkeit, nachgewiesen zu werden, zu modifizieren, wobei besagter Abbau unter Bedingungen möglich ist, welche nicht die Bindung zwischen dem markierten Bindungspartner und seiner Bindungssubstanz und anderen Bindungspartnern und Bindungssubstanzen, die in der Reaktion teilnehmen können, ungünstig beeinflussen. Bevorzugte Markierungen sind solche, die in ihrer Fähigkeit, nachgewiesen zu werden, nach Exposition mit Säuren, Basen oder selektiv oxidierenden Substanzen wie Peroxidate oder Enzyme, beeniträchtigt werden.
  • Viertens knüpft man unter Verwendung im Fachgebiet bekannter chemischer Verfahren die Markierung so an die Bindungssubstanz an eine Stelle, daß die Empfindlichkeit der Markierung gegen chemische oder biochemische Degradierung nach Interaktion des markierten Bindungspartners mit seiner (seinen) spezifischen Bindungssubstanz(en) modifiziert wird. In einigen Fällen können mehrere verschiedene Stellen zum Anknüpfen der Markierung getestet, und die Stelle, die zum besten differentiellen Abbau führt, verwendet werden.
  • Fünftens optimiert man die Abbaubedingungen, die chemisch oder biochemisch sein können, um den besten Unterschied im Nachweis des markierten Bindungspartners in Anwesenheit und Abwesenheit seiner Bindungssubstanz zu erhalten.
  • Zuletzt testet man unter Verwendung des vorher gewählten Testformates die Fähigkeit des Testsystems zum quantitativen oder qualitativen Nachweis des Analyten, im allgemeinen unter Verwendung folgender Schritte:
  • a. Inkubation
  • b. Selektiver Abbau
  • e. Nachweis, oder:
  • a. Simultane Inkubation und selektive Degradierung
  • b. Nachweis
  • Unter Verwendung dieser Erfindung sind mit chemolumineszenten Acridiniumestern markierte Oligonukleotidsonden besonders nützlich zum Nachweis sequenzspezifischer Polynukleotide durch Hybridisierung. Acridiniumester können an eine Anzahl verschiedener Stellen an DNA-Sonden und/oder gemischten Nukleotid/nicht-Nukleotidpolymeren geheftet werden, wie beschrieben in WO 89/02439. Dies beinhaftet die Fähigkeit, die Nukleotidbasen, das Phosphatrückgrat, die Zuckerreste, den 3'-Terminus und den 5'-Terminus von Oligonukleotiden genauso zu markieren, wie auch die monomeren Nicht-Nukleotideinheiten gemischter Nukleotid/nicht-Nukleotidpolymere.
  • Eine monomere Nicht-Nukleotideinheit ist eine monomere Einheit, die nicht wesentlich an der Hybridisierung eines Polymers teilnimmt. Solche monomeren Einheiten dürfen z.B. nicht an einer wesentlichen Wasserstofflbrückenbindung mit einem Nukleotid teilnehmen, und würden monomere Einheiten ausschließen, die als Komponente eine der 5 Nukleotidbasen oder eines ihrer Analoga besitzen.
  • Solche acridiniumestermarkierten Sonden können signifikante differentielle chemische Stabilität zeigen, wenn die Sonden, an die diese gebunden sind, frei in Lösung sind, verglichen dazu, wenn sie hybridisiert sind. Diese differentielle Stabilität ist abhängig von der Position des des Acridiniumesters in der Sonde, den Nukleotidresten in der Nachbarschaft zur Acridiniumestermarkierung und der Anwesenheit anderer Sondenmoleküle, die stabile Hybride mit dem Zielpolynukleotid bilden. Eine graphische Darstellung ist nachfolgend gezeigt.
  • Während der Bestimmung der Faktoren, die zur differentiellen Stabilität des Acridiniumesters an DNA-Sondenmolekülen beitragen, fanden wir, daß die freien Amine an den Basen der unhybridisierten Sonden (Nukleotide sowie gemischte Nukleotide/- Nicht-Nukleotide) den Acridiniumester besonders in einer alkalischer Umgebung destabilisierten. Zur gleichen Zeit kann, wenn der Acridiniumester nahe dem Terminus der Sonde ist, dieser ebenso in Alkali durch Amine destabilisiert werden, die von Zielsequenzen bei stattfindender Hybridisierung beigesteuert werden. Wenn die Sonde mit einem sequenzspezifischen Polynukleotid (Bindungssubstanz) hybridisiert, nehmen die Sondenamine an der Basenpaarung mit komplementären Nukleotiden teil, und werden in ihrer Fähigkeit zur Destabilisierung des Acridiniumesters insbesondere in alkalischer Umgebung eingeschränkt. Zur gleichen Zeit wurde gefunden, daß der Acridiniumester durch Interkalation in die Hybridduplex weiter gegen Abbau stabilisiert wurde, insbesondere in Regionen hoher Adenin/Thymidinbasenpaar-Dichte. Wir fanden, daß eine Anzahl anderer Insertionsregionen ebenso gute differentielle Hydrolyse ergeben, wie in dem folgenden Abschnitt erklärt wird.
  • Es gibt verschiedene Weisen, mit denen diese Erfindung für die Hybridisierung angewendet werden kann. Diese beinhalten, jedoch nicht hierdurch beschränkt:
  • 1. Anheften des Acridiniumesters an die zentrale Region der Sonde, und nahe einer Stelle mit Adenin/Thymidinbasenpaaren. Ein bevorzugtes Verfahren ist, einen Acridiniumester an eine monomere Nicht-Nukleotideinheit anzuheften, wie in WO 8902439 beschrieben, die als Insert an monomere Nukleotideinheiten verknüpft ist, welche komplementär zu unmittelbar benachbarten Nukleotiden der Zielpolynukleotidsequenz sind. Solche Plazierung dient dazu, die Amine der Nukleotidbasen an beiden Seiten des Acridiniumesters einzuschränken bzw. zu restringieren, und eine Stelle zur Interkalation zur Verfügung zu stellen.
  • 2. Anheften des Acridiniumesters an entweder den 3'- oder 5'-Terminus der Sonde, und Einschränken der Effekte nahegelegener vom Zielpolynukleotid beigesteuerter Amine mit einer zweiten, an die erste Sonde anschließend hybridisierten Sonde. Es kann ebenso erwünscht sein, daß die besagte zweite Sonde eine A/T-Basenpaar-reiche Region nach der Duplexbildung schafft. Obwohl dieses Doppelsonden- oder Sandwichsystem abhängig von der Ausbildung zweier Duplexe, anstatt nur einer Duplex ist, kann es ein Verfahren zur Verfügung stellen, sensitiv geringste Basenpaaraustausche nachzuweisen, die mit sehr kurzen Sonden unterschieden werden können, d.h. Sonden von ungefähr 5- 15 Nukleotiden Länge.
  • Unter normalen Bedingungen haben solch kurze Sonden die Fähigkeit, einzelne Fehlpaarungen unter angemessenen Hybridisierungsbedingungen zu unterscheiden. In der Praxis werden sie jedoch nicht angewandt, da sie nicht ausreichend spezifisch für einzelne Polynukleotidstellen sind. Das heißt, daß die kurze Sonde an mehrere spezifische, in einer Vielzahl vorliegender komplexer DNA- oder RNA-Sequenzen enthaltene Stellen hybridisieren kann. Mit der zusätzlichen Vorraussetzung, daß zwei verschiedene Sonden unmittelbar an benachbarte Polynukleotidregionen hybridisieren müssen, können solche Regionen spezifisch erfaßt und identifiziert werden. So können die Vorteile der Unterscheidung mittels kurzer Sonden verwendet werden, während die Spezifität der von beiden Sonden erfaßten Region gewährleistet bleibt.
  • 3. Anheften des Acridiniumesters an oder nahe der Stelle einer Fehlpaarung mit einer Polynukleotidsequenz, die nicht das gewünschte Zielpolynukleotid ist. In dieser Weise kann eine Unterscheidung zwischen Polynukleotidsequenzen, die sich in nur einem Nukleotid unterscheiden, erreicht werden, da die Umgebung der Duplex um eine Fehlpaarungsstelle ausreichend destabilisiert ist, um den Acridiniumester (wenn er an oder nahe dieser Stelle angeheftet ist), empfänglich für einen Abbau zu machen.
  • 4. Anheften des Acridiniumesters an eine Sondenregion, um die lokale Stabilität eines Sonden-Ziel-Hybrids zu verfolgen. In dieser Weise kann der Acridiniumester dazu dienen, die lokale Stabilität des Hybrides unter den Bedingungen genau zu verfolgen, zu denen die gesamte Hybridduplex nicht, aber unter denen die lokale Hybridregion teilweise aufschmilzt.
  • Eine bevorzugte Vorgehensweise für die obengenannten drei Formate ist es, den Schritt der differentiellen Hydrolyse bei der gleichen Temperatur stattfinden zu lassen, wie den Hybridisierungsschritt, charakteristischerweise bei 50 bis 70ºC.
  • Eine andere Vorgehensweise ist es, einen zweiten differentiellen Hydrolyseschritt bei Raumtemperatur stattfinden zu lassen. Dies erlaubt die Verwendung von pH's in der Größenordnung von von 10-11, was zu sogar noch größeren Unterschieden im Verhältnis der Hydrolyse zwischen hybridisierter und unhybridisierter acridiniumestermarkierter Sonde führt.
    • Experimentelle Verfahren und Materialien
  • Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung, und nicht zur Beschränkung angeboten. Diese Beispiele beruhen auf zur Zeit verfügbaren Daten, und den wahrscheinlichsten Erklärungen der Phänomene. Andere Faktoren und Verfahren können bei weitergehender Forschungsarbeit offensichtlich werden. Obwohl die Erfindung im Detail beschrieben wurde durch die Veranschaulichung und die Beispiele unter Verwendung von Acridiniumestermarkierungen, können gewisse Veränderungen und Modiftkationen innerhalb des Umfangs der Ansprüche durchgeführt werden, und andere Markierungssysteme können ebenso innerhalb des Umfangs der Ansprüche verwendet werden.
    • Beispiel 1. KONSTRUKTION VON ACRIDINIUMESTERMARKIERTEN SONDEN
  • A. Synthese und Reinigung von Amin-Verbindungsarm-Sonden
  • Desoxyoligonukleotidsonden wurden synthetisiert, die einen Amin-Verbindungsarm (d.h. einer, der in einem primären Amin zur Markierung mit einem Acridiniumester endet) enthalten, der sich entweder am 5'-Terminus, an einer spezifisch vorbestimmten Stelle an der Polyphosphatkette, im inneren Bereich der Sonde, oder angeheftet an an eine der Nukleotidbasen befindet.
  • Um einen 5'-Amin-Verbindungsarm an eine Sonde zu heften, wurde die folgende Verbindung verwendet:
  • Diese Verbindung wird hier im folgenden als terminales Amin-Verbindungsarmreagens bezeichnet werden. Dieses Reagens wurde wie folgt synthetisiert: 6-Aminohexanol wurde mit S-Ethyltrifluorthioacetat in wasserfreiem Ethylacetat zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsprodukt wurde in Petrolether gefällt, mit einer 10%igen Pyridin-in- Wasser-Mischung 10 Minuten lang zur Hydrolyse jeglichen möglicherweise gebildeten O-Trifluoracetats behandelt, und zur Trockenheit in Form einer gummiartigen Masse eingedampft. Diese Verbindung wurde dann gemäß Standardprotokollen in der Literatur (siehe Nukleic Acids Research, 12 (11), 4539 (1984)) phosphityliert, um das gewunschte Produkt, nämlich das terminale Amin-Verbindungsarmreagens zu ergeben (1).
  • Sonden, die einen 5'-Amin-Verbindungsarm enthalten, wurden wie folgt synthetisiert. Mit einem Applied Biosystems Inc. Model 380A DNA-Synthesizer wurden Sonden der gewünschten Nukleotidsequenz unter Verwendung der Standard-Phosphoramiditchemie hergestellt, wobei der Aufbau vom 3'-zum 5'-Ende stattfand. Nachdem die gewünschte Sequenz komplettiert war, wurde der Amin-Verbindungsarm automatisch an die 5'- Hydroxylgruppe der Sonde gekoppelt, indem das terminale Amin-Verbindungsarmreagens in der gleichen Weise, wie ein weiteres Phosphoramiditnukleosid angekoppelt worden wäre, verwendet wurde. Unter Verwendung von Standardprotokollen wurde die Sonde dann von der Festphase getrennt, unter Verwendung von NH&sub4;OH entschützt, und durch Polyacrylamid-gelelektrophorese, gefolgt von Sephadex G-25-Chromatographie gereinigt.
  • Die folgende Sonde wurde synthetisiert und unter Verwendung dieses Verfahrens gereinigt:
  • wobei NH&sub2;-(CH&sub2;)&sub6; den Aminverbindungsarm darstellt.
    • (ii)
  • Um den Aminverbindungsarm in den inneren Teil der Sonde zu inkorporieren, wurde intemes Aminverbindungsarmreagens Typ 1 (4-atomiger Spacer; siehe L1 in der unten angeführten Patentschrift), oder Typ 2 (2-atomiger Spacer; siehe L3 in der unten angeführten Patentschrift), oder L7 (9-atomiger Spacer) so verwendet, wie in der WO 8902439 mit der Priorität der U.S. Patentanmeldung Serien-Nr. 099 050 mit dem Titel "Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes", eingereicht am 21. September 1978 von Arnold et al., beschrieben ist. Wieder wurden Sonden unter Verwendung der Standardphosphoramiditchemie synthetisiert, und unter Verwendung einer Polyacrylamidgelelektrophorese und Sephadex G-25-Chromatographie gereinigt.
  • Die folgenden Sonden wurden unter Verwendung dieses Vorgehens Synthetisiert:
  • 1.) Ein 30mer komplementär zur 16S-Untereinheit der rRNA von E. coli, mit einem internen Aminverbindungsarm Typ 1, der einen Adeninrest an der Position 18 der Sequenz ersetzt: Ersetzt durch einen internen Aminverbindungsarm Typ 1
  • 2.) Ein 33mer komplementär zur 16S-Untereinheit der rRNA von Chlamydia trachomatis, mit einem internen Aminverbindungsarm Typ 1, der einen Adeninrest an der Position 21 der Sequenz ersetzt: Ersetzt durch einen internen Aminverbindungsarm Typ 1 der zwischen die Reste 21 und 22 inseriert Ein interner Aminverbindungsarm Typ 1 oder Typ 2, hier inseriert
    • (iii)
  • Nukleotidbasen, die einen Aminverbindungsarm besitzen, wurden wie folgt in eine Sonde inkorporiert. Template- und Primer-Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen wurden synthetisiert:
  • Template 3' - GCA ATG AGC CTA CGG GTT TAT AGC GG - 5'
  • Primer 5' - CGT TAC TCG GAT GCC CAA AT - 3'
  • (Die Primer- und verlängerte Primersequenzen sind komplementär zur 16S-Untereinheit von C. trachomatis.)
  • Primerverlängerung unter Verwendung des Klenow-Fragments wurde wie in Maniatis (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis, 1982, Cold Spring Harbour Laboratories, Pubs.) durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das BSA im 10 x "Nick- Translation"-Puffer weggelassen wurde, um die mit einem Aminverbindungsarm modifizierte Base Amino-(12)-dUTP (Calbiochem, California) zu inkorporieren. Die Sequenz des resultierenden Oligomers ist deshalb:
  • CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA (amino-12-U)CG CC.
  • Die Reinigung des primerverlängerten Komplexes wurde unter Verwendung einer NENSORB-20-Patrone (DuPont) folgend der vom Hersteller vorgeschriebenen Prozedur erreicht. (Die Primerverlängerungsreaktion wurde durch die Zugabe von 900µl NENSORB Reagens A vor dem Laden auf die Säule verdünnt. Die gereinigten Oligomere wurden mit 50%igem Methanol eluiert, welches dann in einer Speedvac entfernt wurde.)
  • B. Markierung der Aminverbindungsarmreagens-Sonde mit Acridiniumester und folgende Reinigung.
  • Eine 25 mM Stammlösung von Acridiniumester wurde in destilliertem DMSO bereitet. Die gewünschte Menge der Sonde (siehe eine Auflistung der verschiedenen markierten Sonden in der Sektion A oben) wurde in einem konischen 1,5 ml Polypropylengefäß zur Trockenheit eingedampft. Die folgende Mischung wurde durch Zugabe folgender Zutaten in der aufgelisteten Reiheufolge bereitet:
  • 3 µl H&sub2;O
  • 1 µl 1M HEPES (pH 8,0)
  • 4 µl DMSO (destilliert)
  • 2 µl 25 mM Acridiniumester in DMSO (destilliert)
  • Die Mischung wurde auf dem Vortex geschüttelt, in einer Mikrozentrifuge 2 Sekunden lang zentrifugiert (um den Inhalt an den Boden des Behälters zu bringen), und bei 37ºC 20 Minuten lang inkubiert. Die folgenden Zutaten wurden dann der Reaktionsmischung in der aufgelisteten Reihenfolge zugesetzt:
  • 3,0 µl 25mM Acridiniumester in DMSO (destiliert)
  • 1,5 µl H&sub2;O
  • 0,5 µl 1M HEPES (pH 8,0)
  • Die Mischung wurde wieder geschüttelt, zentrifügiert, und bei 37ºC weitere 20 Minuten inkubiert. Die nicht-reagierte Markierung wurde unter Verwendung eines 5-fachen Überschusses von Lysin beseitigt bzw. gequencht, indem 5 µl 0,125 M Lysin in 0,1 M HEPES (pH 8,0), 50% DMSO zugegeben, und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden.
  • Das acridiniumestermarkierte Oligomer wurde dann unter Verwendung folgenden Verfahrens gereinigt. Zu den 20 µl der bereinigten bzw. gequenchten Reaktionsmischung wurden 30 µl 3 M NaOAc (pH 5,0), 245 µl H&sub2;O und 5 µl Glycogen als Träger zugegeben (das Glycogen wurde zum Entfernen jeglicher Nukleaseaktivität vorbehandelt). Die Probe wurde kurz gevortext bzw. geschüttelt, und 640 µl absoluten Ethanols zugesetzt. Die Probe wurde kurz geschüttelt, und auf Eis 5-10 Minuten lang inkubiert, dann 5 Minuten lang bei 15 000 Upm in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen, und das Pellet in 20 µl 0, 1 M NaOAc (pH 5,0), 0,1% SDS gelöst. Die Proben wurden dann wie obenstehend beschrieben durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt.
    • (i)
  • Die AE-markierten Sonden, die den 5'- und internen Aminverbindungsarm enthielten, wurden wie folgt gereinigt: Die 20 µl gelöstes Pellet wurden auf eine Nukleogen-DEAE 60-7 Ionenaustauscher-HPLC-Säule in einem IBM 9533 HPLC-System gegeben. Alle Puffer wurden mit "HPLC-Grade"-Wasser, Acetonitril (CH&sub3;CN) und Natriumacetat (NaOAc) von Fisher Scientific, analysenreinem Eisessig (HOAc) und Lithiumchlorid hergestellt. Alle Puffer wurden vor Gebrauch durch Nylon-66-Filter mit 0,45 µm Porengröße filtriert. Die Probe wurde eluiert, wie in Figur 1 der Zeichnung beschrieben (in diesem Fall war die Probe der 5'-Aminverbindungsarm, der das in obenstehender Sektion A beschriebene 26mer enthielt). Sofort nach dem Lauf wurden je 5 µl 10% SDS jedem Gefäß zugesetzt, gefolgt von Vortexen jeden Gefäßes (dies wurde getan, um sicherzustellen, daß die acridiniumestermarkierte Sonde nicht an den Wänden des Gefäßes hängenblieb). Ein 0,5 µl Aliquot wurde von den Fraktionen 21-42 entnommen, und zu 200 µl Wasser in einem 12x75 mm-Gefäß gegeben (je eine neue Pipettenspitze wurde für jedes Aliquot verwendet, um Kontaminationsprobleme zu vermeiden). Die Chemolumineszenz jeden Aliquots wurde dann in einem Berthold Clinilumat unter Verwendung der folgenden automatischen Injektions- und Leseabfolge bestimmt: Injektion von 200 µl 0,25 N HNO&sub3;, 0,1% H&sub2;O&sub2;; eine 1 sekündige Verzögerung; eine 200 µl-Injek:ion von 1 N NaOH; Lesen des Chemolumineszenzoutputs für 10 Sekunden.
  • Die Fraktionen 29-33 wurden dann wie folgt ethanolpräzipitiert: Zugabe von 5 µl Glycogen zu jeder Fraktion, auf Vortex mischen, 1 ml Ethanol zugeben, mischen, 5-10 Minuten auf Eis inkubieren, und 5 Minuten lang bei 15 000 Upm in einer Mikrozentrifuge zentrifügieren. Jeder Überstand wurde sorgfältig abgenommen, das Pellet in 20 µl 0,1 M NaOAc, pH 5,0, 0,1% SDS rückgelöst, und die Fraktionen wurden vereinigt.
  • In dieser Weise wurden hochreine acridiniumestermarkierte Sonden erhalten. Die spezifische Aktivität solcher Sonden betrug typischerweise 5-10x10&sup7; chemolumineszente Lichtzähleinheiten (Berthold Clinilumat) pro Picomol Oligomer.
    • (ii)
  • Die AE-markierte Sonde, welche die mit einem Aminverbindungsarm modifizierte Base (Amino-12-U) enthielt, wurde im allgemeinen wie oben beschrieben gereinigt, mit den folgenden Ausnahmen: Eine Vydac C4 Umkehrphasen-Säule wurde benutzt; Puffer A war 0,1 M Triethylammoniumacetat (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) und Puffer B war CH&sub3;CN; die markierte Sonde wurde als ein Hybrid unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10 bis 15% Lösung B uber 25 Minuten bei einer Flußrate von 1 ml/min eluiert. Das Hauptmaximum der Chemolumineszenz wurde sodann identifiziert, und wie oben beschrieben weiterverarbeitet.
  • Die vorhergehende Diskussion beschreibt im allgemeinen, wie Sonden hergestellt und mit Acridiniumester markiert werden können. In dem hier aufgeführten spezifischen Beispiel wurden Sonden end- und intern, sowie auch an einer Nuklotidbase markiert.
    • Beispiel 2. STABILITÄT VON HYBRIDISIERTER IM VERGLEICH ZU UNHYBRIDISIERTER, INTERN MIT ACRIDINIUMESTER MARKIERTER SONDE BEI pH 6
  • Eine für Chlamydia trachomatis spezifische, intern markierte 33mer Sonde wurde wie im vorigen beschrieben hergestellt, (Adeninersatz, Typ 1-Verbindungsarm). Die Sonde wurde mit ihrer Ziel-rRNA (in diesem Fall Chlamydia trachomatis) gemäß folgendem Verfahren hybridisiert:
    • Hybridisierungsmischung
  • 2 µl AE-Sonde (0,5 pmol)
  • 0,3 µl 4% (w/v) SDS
  • 5,8 µl 1 M Phosphatpuffer (PB)
  • 4,4 µl C. trachomatis-rRNA (2 µg),
  • oder 4,4 µl H&sub2;O zur Kontrolle.
  • Die Hybridisierungs- und Kontrollmischungen wurden 40 Minuten lang bei 60ºC inkubiert, an diesem Zeitpunkt wurde dann jede Mischung unter Verwendung von Hydroxyapatit (HAP) auf Prozentsatz der Hybridisierung wie folgt untersucht. Ein 0,1 µl Aliquot des Hybrids oder der Kontrollmischung wurde zu 200 µl 0,14 M PB, pH 6,8 mit 2% HAP gegeben. Jede resultierende Mischung wurde 5 Sekunden lang auf dem Vortex geschüttelt, 5 Minuten bei 60ºC inkubiert, 20 Sekunden geschüttelt, dann 30 Sekunden in einer Mikrozentrifuge bei 15 000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und aufgehoben, 200 µl 0,14 M PB, pH 6,8 dem HAP-Pellet zugegeben, die Mischung 10 Sekunden lang geschüttelt, dann 30 Sekunden lang in einer Mikrozentrifuge bei 15 000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und aufgehoben, und das Pellet in 200 µl 0,14 M PB, pH 6,8 resuspendiert. Ein 50 µl Aliquot des resuspendierten HAP's und jeder der 2 Überstände wurden wie folgend beschrieben auf ihre Chemolumineszenz untersucht, und die Prozentsätze hybridisierter Sonde, d.h. die Prozentwerte des chemolumineszenten, mit dem HAP assoziierten Signals berechnet.
  • Die Stabilität von hybridisierter zu unhybridisierter Sonde (d.h. Kontrolle) wurde bei pH 6 gemäß folgendem Verfahren getestet:
    • Stabilitätstestmischung
  • 12,3 µl Hybrid oder Kontrolle von oben
  • 50 µl 1 M PB, pH 6
  • 2,5 µl 4% SDS
  • 65 µl H&sub2;O
  • Diese Mischungen wurden kurz gevortext, 5 µl Aliquots sofort entnommen (t&sub0;), und wie oben beschrieben auf ihre Chemolumineszenz untersucht. Der Rest der Mischungen wurden bei 60ºC inkubiert, 5 µl Aliquots zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen (siehe untenstehend), und sofort auf ihre Chemolumineszenz untersucht.
  • Die Chemolumineszenz jeder Probe wurde durch Zugabe eines Probenaliquots zu 200 µl H&sub2;O in einem 12 x 75 mm-Gefäß und Messung der Chemolumineszenz in einem Clinilumat (automatische Injektion von 200 µl 0,25 N HNO&sub3;, 0,1% H&sub2;O&sub2;, nach einer 1 sekündigen Verzögerung folgend Autoinjektion von 200 µl 2 M Kalium-PB, pH 13,2, und Lesen der Chemolumineszenz 1ur 10 Sekunden).
    • ERGEBNISSE:
  • 1. Prozentsatz der Hybridisierung (HAP-Analyse)
  • Hybrid - 96%
  • Kontrolle - 1,3% (nicht-spezifische Bindung)
  • 2. Stabilitäts-Zeit-Kurve
  • Siehe Fig. 2 der Zeichnung.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß die hybridisierte Sonde gut vor Zerstörung und folgendem Verlust der Chemolumineszenz geschützt ist (Die Halbwertszeit des Verlustes der Chemolumineszenz entspricht 3370 Minuten), während die unhybridisierte Sonde sehr empfindlich für Zerstörung und Verlust der Chemolumineszenz ist (Die Halbwertszeit entspricht 29,2 Minuten; deshalb ist der Unterschied zwischen hybridisiert und unhybridisiert entsprechend 115-fach). Diese Daten demonstrieren die Fähigkeit des hier beschriebenen homogenen Tests zur Lokalisation von DNA-Zielsequenzen durch Erzeugen differentieller Stabilität zwischen hybridisierter und unhybridisierter Sonde, und Messung derselben.
    • Beispiel 3. STABILITÄT VON HYBRIDISIERTER IM VERGLEICH ZU UNHYBRIDISIERTER, INTERN MIT ACRIDINIUMESTER MARKIERTER SONDE BEI pH 9
  • Intem markierte Sonde (alle 3 intern markierten, in Beispiel 1 beschriebenen 33mer Sonden wurden getestet) wurde mit ihrer Ziel-rRNA (in diesem Fall Chlamydia trachomatis) hybridisiert, und wie in Beispiel 2 beschrieben, auf Prozentsatz der Hybridisierung getestet.
  • Die Stabilität von hybridisierter im Vergleich zu unhybridisierter Sonde (d.h. Kontrolle) wurde bei pH 9 gemäß folgendem Protokoll getestet:
    • Stabilitätstestmischung
  • 5 µl Hybrid oder Kontrolle, siehe oben
  • 45 µl 0,2 M Natriumborat, pH 9
  • Die Mischungen wurden dann inkubiert, gesammelt, und wie in Beispiel 2 beschrieben auf ihre Chemolumineszenz untersucht.
    • ERGEBNISSE:
  • 1. Prozentsatz der Hybridisierung (HAP-Analyse)
  • a. Adeninersatz, Typ 1-Verbindungsarm
  • Hybrid - 95%
  • Kontrolle - 0,5% (nicht-spezifische Bindung)
  • b. Insertion, Typ 1-Verbindungsarm
  • Hybrid - 98%
  • Kontrolle - 0,3%
  • c. Insertion, Typ 2 Verbindungsarm
  • Hybrid - 98%
  • Kontrolle - 0,2%
  • 2. Stabilitäts-Zeit-Kurve
  • Siehe Figuren 3-5 der Zeichnung. Fig. 3 zeigt einen Graphen für Adeninersatz, Typ 1 Verbindungsarm; Fig. 4 zeigt einen Graphen für Insertion, Typ 1-Verbindungsarm; Fig. 5 zeigt einen Graphen für Insertion, Typ 2-Verbindungsarm.
  • Wie in Beispiel 2 ist die hybridisierte Sonde gegen Abbau geschützt, während die unhybridisierte Sonde dies nicht ist. Dies gilt für alle drei Typen intern markierter Sonden. In diesem Beispiel wird gezeigt, daß Natriumborat bei erhöhtem pH diesen Prozeß beschleunigt (verglichen mit Beispiel 2), während die differentiellen Degradierungscharakteristika zwischen hybridisierter und unhybridisierter Sonde weiterhin erhaften bleiben.
    • Beispiel 4. STABILITÄT VON MIT ACRIDINIMESTER ENDMARKIERTER SONDE ALS HYBRID MIT BENACHBARTER SONDE IM VERGLEICH ZUM NICHT-HYBRID BEI pH 6
  • Dieses Beispiel beinhaltet die Verwendung einer Sonde der Sequenz 5'-CCG GAC CGC TGG CAA CAA AGG ATA AGG GTT GC-3' (hergestellt unter Verwendung der Standardphosphoramiditchemie), die an E. coli - rRNA unmittelbar benachbart an das 5'- Ende der AE-markierten, in diesem Beispiel verwendeten Sonde (siehe unten) hybridisiert, was zum "Abdecken" aller Amine der Ziel-rRNA in der Nachbarschaft der Acridiniumestermarkierung führt.
  • Die mit Acridiniumester endmarkierte Sonde (Herstellung beschrieben in Beispiel 1) (nachfolgend als AE-Sonde bezeichnet) und die oben beschriebene Nachbarsonde wurden gemäß folgendem Verfahren hybridisiert: Hybridisierungsmischung Kontrollmischung AE-Sonde (0,25 pmol) E.coli-rRNA (2 µg) benachbarte Sonde (12 pmol)
  • Die Hybridisierungs- und Kontrollmischungen wurden 40 Minuten lang bei 60ºC inkubiert, und dann auf den Prozentsatz der Hybridisierung unter Verwendung von Hydroxyapatit wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert.
  • Die Stabilität der hybridisierten Sonde mit der benachbarten Sonde im Vergleich zur unhybridisierten Sonde (d.h. Kontrolle) wurde bei pH 6 genau wie in Beispiel 2 beschrieben getestet.
    • ERGEBNISSE:
  • 1. Prozentsatz der Hybridisierung (HAP-Analyse)
  • Hybrid- 93,5%
  • Kontrolle - 2,7% (nicht-spezifische Bindung)
  • 2. Stabilitäts-Zeit-Kurve
  • Siehe Fig. 6 der Zeichnung.
  • Wie in Beispiel 2 wurde die hybridisierte AE-Sonde, in diesem Fall mit einer benachbarten, ebenso hybridisierten Sonde, vor Abbau geschützt, während dies die unhybridisierte Sonde nicht wurde. Der Schutz war genauso gut wie in Beispiel 2, da er von zwei Hybridisierungen, anstatt einer abhängig war.
    • Beispiel 5. STABILITÄT VON MIT ACRIDINIUMSTER ENDMARKIERTER SONDE ALS HYBRID MIT "BENACHBARTER" SONDE IM VERGLEICH ZUM NICHT- HYBRID BEI pH 9
  • Die Hybridisierung wurde genau wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Die Stabilität der hybridisierten Sonde mit der benachbarten Sonde im Vergleich zur unhybridisierten Sonde (d.h. Kontrolle) wurde bei pH 9 genau wie in Beispiel 2 beschrieben getestet, mit Ausnahme der Zusammensetzung der Stabilitätstestmischung, die wie folgt war:
  • 5 µl Hybrid oder Kontrolle
  • 50 µl 0,2 M Natriumborat, pH 9
  • Die hybridisierte AE-Sonde mit einer benachbarten (ebenso hybridisierten) Sonde war wieder vor Abbau geschützt, während dies die unhybridisierte Sonde nicht war. Wie in Beispiel 3 beschleunigte Natriumborat bei erhöhtem pH diesen Prozeß, während die differentiellen Degradierungscharakteristika zwischen hybridisierter und unhybridisierter Sonde weiterhin erhalten bleiben. Siehe Fig. 7 zur graphischen Darstellung dieser Ergebnisse.
    • Beispiel 6. STABILITÄT VON MIT ACRIDINIUMESTER ENDMARKIERTER SONDE ALS HYBRID IM VERGLEICH ZUM NICHT-HYBRID BEI pH 6
  • Die Sonde wurde an ihre Ziel-rRNA (in diesem Fall E. coli) gemäß folgendem Verfahren hybridisiert: Hybridisierungsmischung Kontrollmischung AE-Sonde (0,25 pmol) E.coli-rRNA (2 µg)
  • Die Hybridisierungs- und Kontrollmischungen wurden 40 Minuten lang bei 60ºC inkubiert, und dann auf den Prozentsatz der Hybridisierung unter Verwendung von Hydroxyapatit wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert.
  • Die Stabilität der hybridisierten Sonde gegen die der unhybridisierten Sonde (d.h. Kontrolle) wurde bei pH 6 genau wie in Beispiel 2 beschrieben getestet
    • ERGEBNISSE:
  • 1. Prozentsatz der Hybridisierung
  • Hybrid - 94%
  • Kontrolle - 2,7% (nicht-spezifische Bindung)
  • 2. Stabilitäts-Zeit-Kurve
  • Siehe Fig. 8 der Zeichnung.
  • Wieder wurde die unhybridisierte Sonde im Vergleich zur hybridisierten Sonde bevorzugterweise abgebaut, obwohl die Differenz im Abbau nicht so groß wie in den vorherigen Beispielen ist. Dies ist so, weil nur ein Teil der Amine in der Nachbarschaft der Acridiniumestermarkierung "abgedeckt" wurde. Tatsächlich zeigt dies zusätzlich die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen hybridisierter endmarkierter Sonde in der Anwesenheit oder Abwesenheit von benachbarter hybridisierter Sonde.
    • Beispiel 7. STABILITÄT VON HYBRIDISIERTER IM VERGLEICH ZU UNHYBRIDISIERTER SONDE, DIE AN EINER NUCLEOTIDBASE MIT ACRIDINIUMESTER MARKIERT IST, BEI pH 7,6
  • Die wie in Beispiel 1 beschrieben an einer Nukleotidbase (Amino-12-U) mit Acridiniumester markierte Sonde wurde mit ihrer Ziel-rRNA (in diesem Fall C. trachomatis) gemäß folgenden Verfahrens hybridisiert:
    • Hybridisierungsmischung
  • 0,1 M Lithiumsuccinat, pH 5,4
  • 10% Lithiumlaurylsulfat
  • 2 µg (1,3 pmol) C. trachomatis-rRNA oder Wasser als Kontrolle
  • 0,1 pmol AE-Sonde
  • Gesamtvolumen - 30 µl
  • Die Hybridisierungs- und Kontrollmischungen wurden 5 Minuten lang bei 80ºC inkubiert, gefolgt von 60 Minuten bei 60ºC. Die erhaltenen Lösungen wurden jede auf 300 µl mit 0, 1 M Lithiumsuccinat pH 5,4 und 10% Lithiumlaurylsulfät verdünnt, und auf den Prozentsatz der Hybridisierung unter Verwendung von Hydroxyapatit wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert.
  • Die Stabilität von hybridisierter im Vergleich zu unhybridisierter Sonde (d.h. Kontrolle) wurde bei pH 7,6 mit verschiedenen identisch präparierten Proben gemäß folgendem Protokoll getestet:
    • Stabilitätstestmischung
  • 15 µl Hybrid oder Kontrolle von oben
  • 100 µl 0,2 M Natriumtetraborat, pH 7,6, 5% Triton X-100
  • Diese Mischungen wurden dann bei 60ºC inkubiert, Proben zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen, und die Chemolumineszenz unter Verwendung eines Gen- Probe Leader I Luminometers unter Verwendung der automatischen Injektion von 200 µl 0,1 M H&sub2;O&sub2;, einer 1 sekündigen Verzögerung, automatischer Injektion von 200 µl 1 N NaOH und Lesen der Chemolumineszenz für 5 Sekunden bestimmt. Aus diesen Daten wurden die Raten der Hydrolyse durch Regressionsanalyse bestimmt.
    • ERGEBNISSE:
  • 1. Prozentsatz der Hybridisierung (HAP-Analyse)
  • Hybrid- 53,8%
  • Kontrolle - 0,5% 2. Stabilität Halbwertszeit der Esterhydrolyse (min) Verhältnis der Halbwertszeiten Hybrid Kontrolle (Hybrid/Kontrolle)
  • Wie in den vorherigen Beispielen zeigen diese Daten, daß die hybridisierte Sonde gegen Abbau geschützt wird, während die unhybridisierte Sonde dies nicht ist, in diesem Fall mit der Markierung gebunden an eine Base der Sonde. Dies zeigt das Prinzip, daß verschiedene Arten von Stellen zur Anheftung von AE akzeptabel sind, um sie in dem hier beschriebenen homogenen Protektionstest zu verwenden.
    • Beispiel 8. STABILITÄT VON HYBRIDISIERTEN IM VERGLEICH ZU UNHYBRIDISIERTEN SONDEN, DIE INTERN AN EINER VIELZAHL VON SEQUENZDIMERSTELLEN MIT ACRIDINIUMESTER MARKIERT SIND, UNTER VERWENDUNG VON rRNA- SOWIE DNA-ZIELEN BEI pH 7,6
  • Sonden, die den internen Aminverbindungsarm-Typ L7 an einer Vielzahl von Sequenzdimerstellen (siehe unten) inseriert besitzen, wurden synthetisiert, mit AE markiert, und wie in Beispiel 1 gereinigt. Die Sequenz und die Verbindungsarmpositionen dieser Sonden sind wie folgt: Sonde Nr. Sequenz: Verbindungsarmposition (#)
  • Diese Sonden wurden wie in Beispiel 7 beschrieben hybridisiert, mit der Ausnahme, daß der 80ºC-Inkubationsschritt weggelassen wurde, und die Mengen und Typen der verwendeten Zielnukleinsäuren wie folgt waren: Sonde # Zielnükleinsäure E.coli rRNA C. trachomatis rRNA N. gonnorhoea rRNA pmol des exakten synthetischen DNA-Komplements
  • Die Stabilität von hybridisierter im Vergleich zu unhybridisierter Sonde wurde wie in Beispiel 7 beschrieben bei pH 7,6 getestet. ERGEBNISSE Stabilität Halbwertszeit der Esterhydrolyse (min) Verhältnis der Halbwertszeiten Hybrid/Kontrolle Sonden # Hybrid Kontrolle
  • Diese Daten zeigen, daß der Verbindungsarm (und deshalb der AE) an einer breiten Vielzahl von Sequenzdimerstellen eingefügt werden kann, und immer noch im wesentlichen gegen Esterhydrolyse in der hybridisierten Form geschützt ist. Darüberhinaus zeigt dieses Beispiel, daß DNA-Ziele hybridisierten AE-Sonden guten Schutz bieten, wenn sie in diesen homogenen Testformaten angewendet werden. Dieses Beispiel zeigt auch, daß der lange (9-atomige), hier angewendete Verbindungsarm differentielle Hydrolyseverhältnisse ergibt, die im wesentlichen äquivalent zu denen von vorher in diesem Patent aufgefürten Verbindungsarmen sind, was bedeutet, daß eine breite Vielzahl von Verbindungsarmlängen in dem hier beschriebenen HAP-Format verwendet werden kann.
    • Beispiel 9. STABILITÄT VON INTERN MARKIERTER AE-SONDE, HYBRIDISIERT MIT PERFEKT PASSENDEM ZIEL IM VERGLEICH ZU ZIEL MIT EINER EINZELFEHLPAARUNG BEI pH 7,6
  • Eine 24mer-Sonde komplementär zur 16S-Untereinheit der rRNA von E. coli, mit einem internen Aminverbindungsarm, Typ L 7, eingefügt zwischen die Reste 6 und 7, wurde synthetisiert. Die Sonde wurde dann mit Acridiniumester markiert und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Sequenz ist wie folgt (# = Verbindungsarmposition):
  • 5'-CAA GCT# TGC CAG TAT CAG ATG CAG-3'
  • Diese Sonde hat eine einzige T-G-Fehlpaarung an der Position 6 (nummeriert vom 5'- Ende des Sondenstrangs) mit der 16S-Untereinheit von C. diversius.
  • Die Sonde wurde mit ihrer Ziel-rRNA (in diesem Fall entweder E. coli oder C. diversius) gemäß dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren hybridisiert. Die Stabilität der erhaltenen hybridisierten Sonden sowie einer Probe der unhybridisierten Sonde wurden wie in Beispiel 7 beschrieben bei pH 7,6 getestet. Stabilität Halbwertszeit der Esterhydrolyse (min) Verhältnis der Halbwertszeiten Hybrid/Kontrolle Ziel Hybrid Kontrolle E. coli C. diversius
  • * Die geringe Halbwertszeit der Esterhydrolyse war nicht bedingt durch das geringe Ausmaß an Hybridisierung, da die HAP-Analyse (wie in Beispiel 2 beschrieben) 73% Hybridisierung aufzeigte.
  • Diese Daten zeigen, daß im Falle des Hybrids mit dem perfekt gepaarten Ziel die AE- Sonde vor der Esterhydrolyse geschützt ist (wie in vorhergehenden Beispielen beschrieben), wahrend in dem Hybrid mit dem Ziel, das eine einzelne Basenfehlpaarung enthält, die AE-Sonde kaum geschützt ist. Dies führt zu einer 17-fachen Differenz in der Hydrolyserate der AE-Sonde zwischen dem perfekten Ziel und dem an einer Einzelstelle fehlgepaarten Ziel. Deshalb ist das hier beschriebene Verfahren gut dazu geeignet, zwischen Nukleinsäurezielen zu unterscheiden, die einzelne Basenunterschiede enthalten.
    • Beispiel 10 STABILITÄT BEI RAUMTEMPERATUR UNTER VERSCHIEDENEN BEDINGUNGEN VON HYBRIDISIERTER IM VERGLEICH ZU UNHYBRIDISIERTER, INTERN MIT ACRIDINIUMESTER MARKIERTER SONDE
  • Intern markierte Sonde (Insertion Typ 1; siehe Beispiel 1) wurde mit 1 µg C. trachomatis rRNA, wie in Beispiel 8 beschrieben, hybridisiert. Die Stabilität der hybridisierten im Vergleich zur unhybridisierten Sonde wurde bei Raumtemperatur unter einer Vielzahl von Reagenz- und pH- Bedingungen (siehe "Ergebnisse") gemäß gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren gemessen. ERGEBNISSE: HALBWERTSZEITEN (MINUTEN) PUFFER pH TEMP HYBRID KONTROLLE HALBWERTSZEITVERHÄLTNISSE Borat 5% Triton Raumtemp. Borat 5% Triton Raumtemp. Phytinsäure (schnell)* (langsam)*
  • * Im Phytinsäuresystem waren die Hydrolysekinetiken biphasisch. "Schnell" bezieht sich auf die frühe, schnelle Phase der Hydrolyse, und "langsam" bezieht sich auf die spätere, langsame Phase der Hydrolyse.
  • Diese Daten zeigen, daß es ein breites Spektrum an Bedingungen gibt, unter denen der hier beschriebene homogene Protektionstest funktionieren wird, was diesen an eine breite Reihe von Testbedingungen adaptierfähig macht. Darüberhinaus sind auch andere Systeme als Borat akzeptabel, z.B. das Phytinsäuresystem bei Raumtemperatur, bei dem sehr große Halbwertszeitverhältnisse erreicht werden.
    • Beispiel 11. NACHWEIS EINER VERDÜNNUNGSREIHE VON CHAMYDIA rRNA IN PUFFER UNTER VERWENDUNG EINER INTERN MIT ACRIDINIUMESTER MARKIERTEN SONDE
  • Intern markierte Sonde (wie in Beispiel 2) wurde an immer kleinere Mengen ihrer Ziel- rRNA (in diesem Fall Chlamydia trachomatis) gemäß dem folgenden Verfahren hybridisiert: Hybridisierungsmischung Sonde
  • Die Kontrollmischung war identisch zur Hybridisierungsmischung, mit der Ausnahme, daß sie Wasser statt rRNA enthielt, und die Nur-Reagenzmischung war gleich zur Kontrollmischung, mit der Ausnahme, daß sie Wasser statt der Sonde enthielt. Die Mischungen wurden 20 Minuten lang bei 60ºC inkubiert.
  • Nach der Hybridisierung wurden 90 µl 0,2 M Borat, pH 9, jeder Probe zugesetzt, gefolgt von einer Inkubation bei 60ºC für 14 Minuten. Von jeder Probe wurde dann die Chemolumineszenz wie in Beispiel 2 beschrieben gelesen, mit der Ausnahme, daß in der Injektion 1 nur 0,1% H&sub2;O&sub2; waren, der pH der Injektion 2 13,8 statt 13,2 betrug, und die Lesezeit 7 statt 10 Sekunden dauerte. ERGEBNISSE: Nur-Reagenz Kontrolle Abzüglich der Kontrolle
  • Nur-Reagenz und die Kontrolle stehen für gemittelte Tripelwerte; alle anderen stehen für gemittelte Doppelwerte.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß die hier beschriebene Erfindung fähig war, eine lineare Verdünnungsreihe von Ziel-rRNA bis zu einem Sensitivitätslimit von ungefahr 10&supmin;&sup4; µg in einem reinen Puffersystem nachzuweisen.
    • Beispiel 12. NACHWEIS EINER VERDÜNNUNGSREIHE VON CHLAMYDIA rRNA IN KLINISCHEN MEDIEN UNTER VERWENDUNG EINER INTERN MIT ACRIDINIUMESTER MARKIERTEN SONDE
  • Intern markierte Sonde (wie in Beispiel 2) wurde in klinischen Proben (Rachenspülungen) an immer kleinere Mengen ihrer Ziel-rRNA (in diesem Fall Chlamydia trachomatis) gemäß folgendem Verfahren hybridisiert: Hybridisierungsmischung Rachenspülung Sonde
  • Die Kontrollmischung war identisch zur Hybridisierungsmischung, mit der Ausnahme, daß sie Wasser statt rRNA enthielt, und die Nur-Reagenzmischung war gleich zur Kontrollmischung, mit der Ausnahme, daß sie Wasser statt der Sonde enthielt. Die Mischungen wurden 60 Minuten lang bei 60ºC inkubiert.
  • Nach der Hybridisierung wurde ein Drittel jeder Probe (20 µl) zu 50 µl 0,2 M Borat, End-pH = 9 (nach der Zugabe der Hybridisierungsmischungen) zugesetzt, gefolgt von einer Inkubation bei 60ºC für 40 Minuten. Von jeder Probe wurde dann die Chemolumineszenz wie in Beispiel 1 l gelesen. ERGEBNISSE: Nurreagenz Kontrolle Abzüglich der Kontrolle
  • Die Daten repräsentieren gemittelte Doppelwerte.
  • Diese Daten zeigen, daß die hier beschriebene Erfindung fähig war, eine lineare Verdünnungsreihe von Ziel-RNA bis zu einem Sensitivitätslimit von ungefahr 10&supmin;³ µg in einem System nachzuweisen, das klinische Medien enthält.
    • Beispiel 13. NACHWEIS EINER VERDÜNNUNGSREIHE VON BAKTERIELLER rRNA IN URIN UNTER VERWENDUNG EINER INTERN MIT ACRIDINIUMESTER MARKIERTEN SONDE
  • Eine intern markierte 30mer-Sonde spezifsch für E. coli wurde wie vorher beschrieben hergestellt (Adeninersatz, Typ 1 Verbindungsarm). Die Sonde wurde in Urin an immer kleinere Mengen ihrer Ziel-rRNA (in diesem Fall E. coli) gemäß folgendem Verfahren hybridisiert:
    • Hybridisierungsmischung
  • 79,6 µl Urin
  • 0,4 µl 0,25 M EDTA, 0,25 M EGTA
  • 10 µl 4,8 M PB, pH 6,8
  • 5 µl 20% SDS
  • 5 µl Sonde (0,125 pmol)
  • 1 µl rRNA (10&supmin;³, 10&supmin;² oder 10&supmin;¹ µg)
  • Die Kontrollmischung war identisch zur Hybridisierungsmischung, mit der Ausnahme, daß sie Wasser statt rRNA enthielt, und die Nur-Reagenzmischung war gleich zur Kontrollmischung, mit der Ausnahme, daß sie Wasser statt der Sonde enthielt. Die Mischungen wurden 30 Minuten lang bei 60ºC inkubiert.
  • Nach der Hybridisierung wurden 300 µl 0,2 M Borat, pH 9 jeder Probe zugesetzt, gefolgt von einer Inkubation bei 60ºC für 1 6 Minuten. Von jeder Probe wurde dann die Chemolumineszenz wie in Beispiel 11 beschrieben gelesen. ERGEBNISSE: Nur Reagenz Kontrolle Abzüglich der Kontrolle
  • Die Ergebnisse repräsentieren gemittelte Doppelwerte.
  • Diese Daten zeigen, daß die hier beschriebene Erfindung fähig war, eine lineare Verdünnungsreihe von Ziel-RNA bis zu einem Sensitivitätslimit von ungefähr 5x10&supmin;³ µg RNA in einem System nachzuweisen, das Urin enthält.
    • Beispiel 14. SELEKTIVER ABBAU, VERWENDET IN KOMBINATION MIT EINEM TRENNUNGSSCHRITT, ZUM NACHWEIS EINER VERDÜNNUNGSREIHE VON CHLAMYDIA-rRNA IN KLINISCHEN MEDIEN UNTER VERWENDUNG EINER INTERN MIT ACRIDINIUMESTER MARKIERTEN SONDE
  • Intern markierte Sonde (wie in Beispiel 2) wurde in klinischen Proben (Rachenspülungen) wie in Beispiel 8 beschrieben, hybridisiert, einschließlich von Kontroll- und Nur-Reagenz-Mischungen. Nach der Hybridisierung wurde ein Drittel jeder Mischung entnommen, und einem selektiven Abbau genau wie in Beispiel 8 beschrieben, unterworfen, während ein Drittel nur entnommen, und bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde (d.h., kein selektiver Abbau). Beide Reihen von Proben, nämlich mit und ohne selektiven Abbau, wurden dann einer Trennung von hybridisierter von unhybridisierter Sonde unter Verwendung von HAP wie in Beispiel 2 beschrieben, unterworfen, mit den folgenden Ausnahmen:
  • a. 1ml HAP-Lösung wurde verwendet (anstatt 200 µl),
  • b. 1ml Waschlösung wurde verwendet (anstatt 200 µl),
  • c. 3 Waschschritte wurden durchgeführt (anstatt von einem),
  • d. die endgültigen HAP-Pellets wurden in 100 µl Waschlösung resuspendiert, deren Gesamtheit auf ihre Chemolumineszenz gemessen wurde (wie in Beispiel 2 beschrieben). ERGEBNISSE: SELEKTIVER ABBAU Minus S:B Plus Kontrolle (keine RNA)
  • Die Ergebnisse repräsentieren die Mittel aus doppelten Werten mit bereits subtrahiertem Nur-Reagenz-Wert. S:B = Signal- zu Hintergrund-Verhältnis, d.h. Chemolumineszenz bei einer bestimmten rRNA-Konzentration, geteilt durch die Chemolumineszenz der Kontrolle.
  • Diese Daten zeigen, daß die Einfügung des selektiven Abbaus vor der Trennung zu geringeren Hintergrundwerten führt, was größere Signal- zu Hintergrund-Verhältnisse und deshalb verbesserte Sensitivität ergibt.
    • Beispiel 15. VERBESSERTE SRINGENZ UNTER VERWENDUNG DIFFERENTIELLER HYROLYSE
  • Die folgende Sonde wurde konstruiert, um einen internen Verbindungsarm, Typ L7 (Die Position der Insertion ist nachfolgend durch # angezeigt), zu enthalten, markiert mit einem Acridiniumester, und gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben:
  • ATT CCG CAC A#TG TCA AAA CCA G
  • Diese Sonde ist exakt komplementär zur 16S-Untereinheit von Neisseria gonnorhoeae. Jedoch ist sie auch eng verwandt zu N. meningitidis, und eine Kreuzreaktion wird typischerweise unter den in den Beispielen 2 und 8 erwännten Stringenzbedingungen für die Hybridisierung beobachtet. Diese Sonde wurde mit 0,5 µg N. meningitidis, wie in Beispiel 8 beschrieben, hybridisiert (mit der Ausnahrne des 200 µl-Formats), und dann entweder 10 Minuten lang bei 60ºC in 1 ml 0,2 M Natriumtetraborat, pH 7,6, 5% Triton X-100 inkubiert, um differentielle Hydrolyse zu bewirken, (+ D.H), oder nicht diesen differentiellen Hydrolysebedingungen unterworfen (- D.H). Die resultierenden Hybride wurden dann auf magnetischen Mikrosphären getrennt, und auf ihre Chemolumineszenz hin wie nachfolgend beschrieben gemessen.
  • Zugabe von 1 ml 0,4 M PB, pH 6,0, enthaltend 150 µg magnetischer Aminmikrosphären (BioMag M4100, Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, Mass.). 10 Sekunden lang auf einem Vortex mischen. Bei 60ºC 5 Minuten lang inkubieren. 10 Sekunden mischen. Trennen der Sphären magnetisch von der Lösung unter Verwendung des Pace-Mate magnetischen Trennungs-"Rack" (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA). Verwerfen der Flüssigkeit. Waschen der Sphären durch Zugabe von 1 ml 0,3 M PB, pH 6,0, Mischen für 10 Sekunden, magnetisches Trennen, und Verwerfen der Flüssigkeit. Wiederholen bis zu einer Gesamtheit von 3 Waschgängen. Eluieren des Hybrids durch Zugabe von 300 µl 0,2 M PB, pH 6,0, 50% Formamid, 10-sekündiges Mischen, 5-minütiges Inkubieren bei 60ºC, 10-sekündiges Mischen und magnetische Trennung der Sphären von der Lösung. Überführen der Lösung in ein Clinilumat-Röhrchen, und Messen der Chemolumineszenz wie in Beispiel 7 beschrieben. ERGEBNISSE: Bedingung Chemolumineszenz* *Hybridsignal minus Kontrollsignal (d.h., keine RNA), angegeben in relativen Lichteinheiten (rlu). Das Signal des exakten Ziels (d.h., N. gonnorrhoeae) ist in diesem Format typischerweise 7-10 x 10&sup6; rlu.
  • Als Schlußfolgerung führt die Anwendung des hier beschriebenen differentiellen Hydrolyseverfahrens als ein zusätzlicher Stringenz-Unterscheidungsschritt zur starken Reduktion des Signals von unerwünschten, kreuzreagierenden Sequenzen. In diesem Beispiel wurde die Kreuzreaktion einer N. gonnorrhoeae-Sonde mit N. meningitdis um mehr als das 200fache gesenkt. Der differentielle Hydrolyseschritt erhöht die Sensitivität für instabile Hybride, welche im Gleichgewicht mit unhybridsierter Sonde sind, durch konstante Reduktion der Chemolumineszenz (durch Hydrolyse) der Sonde, wenn sie in ihrer unhybridisierten Form vorliegt, und somit Verringerung der durch die Kreuzreaktion bedingten Chemolumineszenz.
    • Beispiel 16. NACHWEIS EINER MIT CHRONlSCHER MYELOGENER LEUKÄMIE ASSOZIIERTEN CHIMÄREN ZIELSEQUENZ UNTER VERWENDUNG EINER INTERN MIT ACRIDINIUMESTER MARKIERTEN SONDE
  • Eine 24mer-Sonde (Sequenz nachfolgend gezeigt) mit einem wie angezeigt inserierten internen Verbindungsarm, Typ 7, wurde synthetisiert, mit AE markiert, und gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben. Diese Sonde ist komplementär zu dem chimären, mit chronischer myelogener Leukämie (CML) assoziierten mRNA-Transkript (gewöhnlicher Bruch), und wird als die bcr/abl-Sonde bezeichnet werden. Diese chimäre mRNA ist ein Produkt des chimären Gens, welches durch die Translokation einer Region des abl-Gens auf dem Chromosom 9 in eine Region des Chromosoms 22, die das bcr-Gen enthält, gebildet wird.
  • Synthetische DNA-60mer-Ziele, die die Region der Bruchstellenverbindung des chimären bcr/abl-Zieles darstellen, sowie die normalen bcr- und abl-Ziele in derselben Region, wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt (die Sequenzen sind unten gezeigt). Ebenso wurde ein mRNA-Ziel produziert durch Transkription eines pGEM-Klons, der ein 450 Nukleotide langes Segment des chimären bcr/abl-Gens, zentrisch rings um die Bruchstelle, enthält. Ein mRNA-Transkript desselben 450 Nukleotide langen Segments in Sonden-Richtung (probe sense) wurde ebenso als Negativkontrolle produziert.
  • BCR/ABL-SONDENSEQUENZ
  • 5'-CCGCTGAAGGGCTTTT*GAACTCTGC-3'
  • SYNTHETISCHE ZIELSEQUENZ
  • BCR/ABL-ZIEL
  • 5'-ACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACT--
  • ABL-ZIEL
  • 5'-ACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAATCTGTACTGCACCCTGGAGGTGGATTCCT
  • Der obenstehend inserierte Asterisk steht für eine Verbindungsarm-Insertionsstelle zur Anheftung von Acridiniumester, und die Unterstreichung zeigt die abl-Sequenzen.
  • Die bcr/abl-Sonde wurde mit ungefähr 1 pmol jedes der oben aufgeführten Ziele wie in Beispiel 8 beschrieben hybridisiert, und die Stabilität dieser Hybride und der unhybridisierten Sonde bei pH 7,6 wie in Beispiel 7 beschrieben getestet. ERGEBNISSE: Halbwertszeit (min) Verhältnis* Ziele Kontrollen Sonden-Sense-mRNA Unhybridisierte Sonde *Ziel- oder Kontrollhalbwertszeit geteilt durch Halbwertszeit der unhybridisierten Sonde.
  • Diese Daten zeigen, daß eine AE-markierte Sonde, die entworfen wurde, die Region der Bruchstellenverbindung des chimären mit CML assoziierten bcr/abl-mRNA-Transkripts abzudeken, fähig war, zwuschen chimärem Ziel und normalen Sequenzen (sowie unhybridisierter Sonde) zu unterscheiden, indem die heir beschriebene HPA-Technologie verwendet wurde. Dies ist eine Demonstration, daß das Verfahren der Erfindung benuzt werden kann, um spezifisch chimäre Ziele (typischerweise assoziiert mit genetischen Leiden) in Gegenwart der normalen, nicht-chimären Nukleinsäurekomponenten nachzuweisen.
  • Dieses Beispiel zeigt weiterhin, daß von rRNA vershiedene Ziele - in diesem Fall sowohl mRNA als auch DNA - Schutz gegen AE-Hydrolyse bieten, wenn sie an eine AE-markierte Sonde hybridisiert werden.

Claims (1)

1. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge eines Analyts, welcher mit einem Bindungspartner unter Bildung eines Bindungspaares kombiniert bzw. eine Bindung eingeht, in einem Medium, wobei das Verfahren ein homogenes Testverfahren umfaßt, umfassend:
a) das Zusammenbringen mit dem Medium oder einer Portion davon (1) eines den Bindungspartner, den Analyt oder ein Analoges des Analyts umfassenden Teils, welcher ein Bindungspaar mit dem Bindungspartner ausbildet, wobei der Teil an eine Substanz gebunden ist, deren Stabilität eine andere ist, wenn der Teil ein Bestandteil eines Bindungspaares ist im Vergleich zu ihrer Stabilität in ungebundener Form; und (2), wenn der Teil der Analyt oder das Analoge ist, das Zusammenbringen mit dem Medium den Bindungspartner;
b) den selektiven Abbau der weniger stabilen Form der Substanz; und
c) das In-Beziehung-Setzen der Menge der nach dem Substanzabbau verbliebenen intakten Substanz mit der Gegenwart oder Menge des Analyts im Medium.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, welches folgendes umfaßt:
a) das Zusammenbringen des Bindungspartners, welcher mit einer Substanz verbunden ist, deren Stabilität eine andere ist, wenn der Bindungspartner ein Bestandteil eines Bindungspaares ist im Vergleich zu seiner Stabilität in ungebundener Form, mit dem Medium oder einer Portion davon.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, welches folgendes umfaßt:
a) das Zusammenbringen (1) eines den Analyt oder ein Analog des Analyts umfassenden Teils, welcher ein Bindungspaar mit dem Bindungspartner ausbildet, mit dem Medium oder einer Portion davon, wobei der Teil mit einer Substanz verbunden ist, deren Stabilität eine andere ist, wenn der Teil ein Bestandteil eines Bindungspaares ist im Vergleich zu ihrer Stabilität in ungebundener Form; und (2) des Bindungspartners.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, welches folgendes umfaßt:
a) das Zusammenbringen mit dem Medium oder einer Portion davon eines ersten Bindungspartners für den Analyt, wobei der erste Bindungspartner an eine Substanz gebunden ist, deren Stabilität eine andere ist, wenn der erste Bindungspartner ein Bestandteil eines Bindungspaares ist im Vergleich zu ihrer Stabilität in ungebundener Form; und (2) eines zweiten Bindungspartners für den Analyt, der sich von dem ersten Bindungspartner unterscheidet.
5. Verlahren gemäß Anspruch 1 zur Detektion einer Nukleotidsequenz in einem Medium, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
a) das Zusammenbringen mit dem Medium oder einer Portion davon der Nukleotidsequenz und einer im wesentlichen dazu komplementären Sonde, wobei die Sonde an eine Substanz gebunden ist, deren Stabilität eine andere ist, wenn die Sonde mit der Nukleotidsequenz hybridisiert ist im Vergleich zu ihrer Stabilität in unhybridisierter Form;
b) den selektiven Abbau der weniger stabilen Form der Substanz; und
c) das In-Beziehung-Setzen der Menge der nach dem Substanzabbau verbliebenen intakten Substanz mit der Gegenwart oder Menge der Nukleotidsequenz in einem Medium.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, welches folgendes umfaßt:
a) das Zusammenbringen mit dem Medium oder einer Portion davon (1) eines einen ersten Bindungspartner für den Analyt oder ein Analoges des ersten Bindungspartners umfassenden Teils, welcher ein Bindungspaar ausbildet, das an einer Bindungsreaktion teilnimmt, wobei der Teil an eine Substanz gebunden ist, deren Stabilität unterschiedlich ist, wenn der Teil ein Bestandteil eines Bindungspaares ist im Vergleich zu seiner Stabilität in ungebundener Form; und (2) eines für den Analyt zweiten Bindungspartners, der sich von dem ersten Bindungspartner in der Bindungsreaktion unterscheidet;
b) den selektiver Abbau der weniger stabilen Form der Substanz; und
c) das In-Beziehung-Setzen der Menge der nach dem Substanzabbau verbliebenen intakten Substanz zur Gegenwart oder Menge des Analyts im Medium.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, in dem die Substanz ein Acridiniumester ist.
8. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, in dem die Substanz ein Vertreter ist, der aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus:
worin X O, N, S, Halogen, substituierter Phosphor, substituierter Schwefel, substituiertes Bor oder substituiertes Arsen ist;
worin Y O, S oder NH ist;
worin R&sub1; Alkyl, Alkenyl, Aryl, substituiertes Alkyl, substituiertes Alkenyl, substituiertes Aryl, Alkoxy, Aryloxy oder nicht vorhanden ist, wenn X ein Halogen ist;
worin R&sub2; H, Alkyl, Alkenyl, Aryl, substituiertes Alkenyl, substituiertes Aryl, Alkoxy oder Aryloxy ist, wenn und nur wenn X N ist;
worin R&sub3; H, Amino, Hydroxyl, Thiol, Halogen, Nitro, Amido, Acetyl, Alkyl, Alkenyl, Aryl, substituiertes Acetyl, substituiertes Alkyl, substituiertes Alkenyl, substituiertes Aryl, Alkoxy oder Aryloxy ist;
worin R&sub4; Alkyl, Alkenyl, Aryl, substituiertes Alkyl, substituiertes Alkenyl oder substituiertes Aryl ist; und
worin mindestens eines von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; oder R&sub4; eine reaktive Stelle enthält, welche eine chemische Paarung bzw. Konjugation erlaubt.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, das einen weiteren Schritt der Abtrennung zur Verbesserung der Schärfe und/oder der Abschwächung des Hintergrundrauschens aufweist.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der Abtrennungsschritt aus der aus Gelfiltration, Hydroxyapatit, magnetischen Microsphären, kationischen Abtrennungsträgern, Trennmembranen und Abtrennungsträgern auf Antikörperbasis bestehenden Gruppe gewählt ist.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, durchgeführt bei Raumtemperatur.
12. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Detektion von chimären Ziel-Nukleinsäuresequenzen.
13. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 mit einer Sonde, die in der Lage ist, zwischen Ziel-Nukleinsäuresequenzen und Nicht- Ziel-Sequenzen zu unterscheiden, welche sich von den Ziel-Nukleinsäuresequenzen durch ein einziges Nukleotid innerhalb des Hybridisierungsbereichs unterscheiden.
14. Verwendung einer einzelsträngigen polymeren Sequenz, umfässend mindestens zwei Nukleotidmonomere oder mindestens ein Nukleotidmonomer und ein Nicht- Nukleotidmonomer, wobei die Sequenz mindestens eine sterisch tolerante bzw. zugängliche Markierungs-Bindungsstelle aufweist, die in der Lage ist, die Hybridisierung der polymeren Sequenz an eine im wesentlichen komplementäre Nukleinsäuresequenz zu ermöglichen, wobei die Markierungs-Bindungsstelle mit einer Markierung verknüpft ist, die in der Lage ist, einen selektiven Abbau zu erleiden, in Abhängigkeit davon, ob die Hybridisierung aufgetreten ist, als ein Bindungspartner in einem Testverfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11.
15. Verwendung gemäß Anspruch 14, worin die sterisch tolerante Stelle am 3'-Ende der polymeren Sequenz lokalisiert ist.
16. Verwendung gemäß Anspruch 14, worin die sterisch tolerante Stelle am 5'-Ende der polymeren Sequenz lokalisiert ist.
17. Verwendung gemäß Anspruch 14 worin die sterisch tolerante Stelle auf der Nukleotidbase eines der Nukleotidmonomeren, die die polymere Sequenz umfassen, lokalisiert ist.
18. Verwendung gemäß Anspruch 14, worin die sterisch tolerante Stelle auf dem Phosphatgerüst auf einem der Nukleotidmonomeren oder auf einem der Nicht- Nukleotidmonomeren, die die polymere Sequenz umfassen, lokalisiert ist.
19. Verwendung gemäß Anspruch 14, worin die sterisch tolerante Stelle auf einem der Zucker auf einem der Nukleotidmonomere, die die polymere Sequenz umfassen, lokalisiert ist.
20. Verwendung gemäß Anspruch 14, worin die sterisch tolerante Stelle auf einem der Nicht-Nukleotidmonomere, die die polymere Sequenz umfassen, lokalisiert ist.
21. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 14 bis 20, worin die Stelle mit einem Acridiniumester markiert ist.
22. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 14 bis 20, worin die Stelle mit einem Vertreter markiert ist, der aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus:
worin X O, N, S, Halogen, substituierter Phosphor, substituierter Schwefel, substiruiertes Bor oder substituiertes Arsen ist;
worin Y O, S oder NH ist;
worin R&sub1; Alkyl, Alkenyl, Aryl, substituiertes Alkyl, substituiertes Alkenyl, substituiertes Aryl, Alkoxy, Aryloxy oder nicht vorhanden ist, wenn X ein Halogen ist;
worin R&sub2; H, Alkyl, Alkenyl, Aryl, substituiertes Alkenyl, substituiertes Aryl, Alkoxy oder Aryloxy ist, wenn und nur wenn X N ist;
worin R&sub3; H, Amino, Hydroxyl, Thiol, Halogen, Nitro, Amido, Acetyl, Alkyl, Alkenyl, Aryl, substhuiertes Acetyl, substituiertes Alkyl, substituiertes Alkenyl, substituiertes Aryl, Alkoxy oder Aryloxy ist;
worin R&sub4; Alkyl, Alkenyl, Aryl, substituiertes Aikyl, substituiertes Alkenyl oder substituiertes Aryl ist; und
worin mindestens eines von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; oder R&sub4; eine reaktive Stelle enthält, welche eine chemische Paarung erlaubt.
26. Verwendung gemäß Anspruch 24, worin der Acridiniumester an mindestens einer Nukleotidmonomereinheit der polymeren Sequenz gebunden ist.
27. Verwendung gemäß Anspruch 25, worin die Markierung an mindestens einer Nicht- Nukleotidmonomereinheit der polymeren Sequenz gebunden ist.
28. Verwendung gemäß Anspruch 24, worin ein Acridiniumester an mindestens einer Nicht-Nukleotidmonomereinheit gebunden ist, welche mindestens eine ursprünglich vorliegende Monomereinheit der polymeren Sequenz ersetzt.
29. Verwendung gemäß Anspruch 25, worin die Markierung an mindestens einer Nicht- Nukleotidmonomereinheit gebunden ist, welche mindestens eine ursprünglich vorliegende Monomereinheit der polymeren Sequenz ersetzt.
30. Verwendung gemäß Anspruch 24, worin ein Acridiniumester an mindestens einer Nicht-Nukleotidmonomereinheit gebunden ist, welche zwischen zwei ursprünglich vorliegenden benachbarten Nukleotidmonomeren der polymeren Sequenz eingefägt ist.
31. Verwendung gemäß Anspruch 25, worin die Markierung an mindestens einer Nicht- Nukleotidmonomereinheit gebunden ist, welche zwischen zwei ursprünglich vorliegenden benachbarten Nukleotidmonomeren der polymeren Sequenz eingefügt ist.
32. Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 26 bis 31 bei einem Verfahren zur Detektion lokaler Hybridstabilität innerhalb eines Sonden-Ziel-Doppelstranges unter Anwendung differenziellen Abbaus.
33. Verwendung gemäß Anspruch 12 zur Detektion von chronischer myelogener Leukämie.
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Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4948882A (en) * 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
NZ227506A (en) * 1987-12-31 1992-06-25 London Diagnostics Inc Specific binding assays using chemiluminescent compounds
FR2625565A1 (fr) * 1987-12-31 1989-07-07 London Diagnostics Inc Esters, thioesters et amides chimioluminescents perfectionnes, et analyses les utilisant
US4950613A (en) * 1988-02-26 1990-08-21 Gen-Probe Incorporated Proteted chemiluminescent labels
CA2031503A1 (en) * 1989-05-31 1990-12-01 Jyotsna Shah Nucleic acid probes for the detection of chlamydia trachomatis
US6589734B1 (en) 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
JPH03247300A (ja) * 1990-02-23 1991-11-05 Chugai Pharmaceut Co Ltd ヒト白血球抗原の型判定法
EP0492570B1 (de) * 1990-12-24 2001-05-02 Enzo Diagnostics, Inc. Verfahren zum Nachweis eines Zielpolynukleotids in einer Probe unter Verwendung eines Reagenz, das den Hintergrund verringert, und eine dieses Reagenz enthaltende Zusammensetzung und Kit
GB9114525D0 (en) * 1991-07-05 1991-08-21 Delnatte Sabine Homogeneous nucleic acids probe based tests and substances
US5424413A (en) * 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
US6093538A (en) * 1992-05-06 2000-07-25 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to ureaplasma
CA2135073C (en) * 1992-05-06 2002-11-19 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
CA2137563C (en) * 1992-06-08 2005-06-28 Thomas B. Ryder Preparation of nucleic acid from mononuclear cells
CA2166889C (en) * 1993-07-19 2001-09-11 Todd C. Peterson Oligonucleotides with activity against human immunodeficiency virus
WO1995003427A2 (en) * 1993-07-19 1995-02-02 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide screening assay
US5739309A (en) * 1993-07-19 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enhancement of oligonucleotide inhibition of protein production, cell proliferation and / or multiplication of infectious disease pathogens
KR100189229B1 (ko) * 1993-07-23 1999-06-01 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프 핵산 증폭을 강화하는 방법
JP3866762B2 (ja) * 1993-11-29 2007-01-10 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 広範な生物からの核酸抽出法
US5733781A (en) 1994-07-19 1998-03-31 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides and methods for inhibiting propagation of human immunodeficiency virus
US5514551A (en) * 1994-10-14 1996-05-07 Gen-Probe Incorporated Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis
EP0709466B1 (de) * 1994-10-28 2006-09-27 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und Verfahren für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung von einer Mehrheit spezifischer Nuklein Säure Sequenzen
ATE194391T1 (de) * 1995-01-19 2000-07-15 Gen Probe Inc Amplifikationsoligonukleotide und sonden für borrelia, die mit lyme kranheit assoziiert sind
DE19519973A1 (de) * 1995-05-31 1996-12-05 Boehringer Mannheim Gmbh Entstörungsreagenz für die Bestimmung eines Analyten mit einem lumineszenzfähigen Metallkomplex
US5879885A (en) * 1995-06-07 1999-03-09 Gen-Probe Incorporated Compositions for detecting and quantifying biological samples
US5731148A (en) * 1995-06-07 1998-03-24 Gen-Probe Incorporated Adduct protection assay
US5747252A (en) * 1995-06-07 1998-05-05 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes and amplification oligonucleotides for Neisseria species
CA2223047C (en) * 1995-06-07 2008-11-18 Gen-Probe Incorporated Micelle protection assay
US5783453A (en) * 1995-06-29 1998-07-21 Chiron Diagnostics Corporation Non-separation specific binding chemiluminescent assay
US6489097B2 (en) 1996-06-28 2002-12-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for the detection of telomerase activity
ATE363339T1 (de) 1998-05-01 2007-06-15 Gen Probe Inc Rührvorrichtung für den fluiden inhalt eines behälters
US7108980B1 (en) 1998-08-07 2006-09-19 Boston Probes, Inc. Methods for the analysis of microcolonies of bacteria and yeast
US6280946B2 (en) 1998-08-07 2001-08-28 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the universal detection of bacteria and eucarya
CA2286414A1 (en) * 1999-10-04 2001-04-04 Zhibo Gan Non-separation heterogenous assay for biological substance
AU2003253651C1 (en) 2002-06-14 2010-06-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting hepatitis B virus
JP2006526137A (ja) * 2003-05-28 2006-11-16 ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド 内部標準の存在下で色素を標識することによる閉じた膜構造上の細胞表面タンパク質の示差分析
US20090298062A1 (en) 2005-09-21 2009-12-03 Hiroshima University Method for determination of the length of the g-tail sequence and kit for the method
EP2446057B1 (de) 2009-06-23 2014-11-19 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und verfahren für den nukleinsäurenachweis aus mollicutes
EP3604558B1 (de) 2010-02-17 2022-10-12 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von atopobium-vaginae-nukleinsäure
CN103543282A (zh) 2010-07-23 2014-01-29 贝克曼考尔特公司 用于处理化验盒的系统
EP3272886B1 (de) 2011-04-25 2019-09-25 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von bv-assoziierter bakterieller nukleinsäure
AU2012304327B2 (en) 2011-09-08 2015-07-09 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid
KR20140091033A (ko) 2011-11-07 2014-07-18 베크만 컬터, 인코포레이티드 검체 컨테이너 검출
BR112014011035A2 (pt) 2011-11-07 2017-06-13 Beckman Coulter, Inc. sistema de aliquotagem e fluxo de trabalho
BR112014010955A2 (pt) 2011-11-07 2017-06-06 Beckman Coulter Inc sistema e método para processar amostras
US8973736B2 (en) 2011-11-07 2015-03-10 Beckman Coulter, Inc. Magnetic damping for specimen transport system
ES2844324T3 (es) 2011-11-07 2021-07-21 Beckman Coulter Inc Brazo robótico
ES2729283T3 (es) 2011-11-07 2019-10-31 Beckman Coulter Inc Sistema de centrífuga y flujo de trabajo
AU2013205122B2 (en) 2012-10-11 2016-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Human Papillomavirus Nucleic Acid
CA2920672C (en) 2013-08-14 2022-12-13 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting hev nucleic acid
JP6944873B2 (ja) 2015-01-09 2021-10-06 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 細菌性膣症を診断するための方法および組成物
AU2016233298B2 (en) 2015-03-16 2021-09-02 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis
CA3010232A1 (en) 2016-01-04 2017-07-13 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting candida species
US10508312B2 (en) 2016-06-10 2019-12-17 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Zika virus nucleic acid
EP3529381B1 (de) 2016-10-19 2022-07-06 Gen-Probe Incorporated Mischungen und verfahren zur detektion und quantifizierung von hepatitis c viren
CN110088302A (zh) 2016-11-21 2019-08-02 简·探针公司 用于检测或定量乙型肝炎病毒的组合物和方法
US10844425B2 (en) 2017-03-24 2020-11-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus
CA3225845A1 (en) 2017-03-25 2018-10-04 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions to detect combinations of viral nucleic acids
AU2018281196B2 (en) 2017-06-07 2022-04-28 Gen-Probe Incorporated Detecting Babesia species nucleic acid in a sample
AU2018316218B2 (en) 2017-08-11 2024-07-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Staphylococcus aureus
CA3082909C (en) 2017-11-17 2023-07-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting c1orf43 nucleic acid
WO2019116234A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Nestec S.A. Methods for determining microbiome ribosomal rna composition changes
EP3724354A1 (de) 2017-12-15 2020-10-21 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von toxigenem clostridium difficile
GB2597569B (en) 2018-06-13 2023-01-25 Gen Probe Inc Compositions and methods for detecting group B streptococcus nucleic acid
AU2019314449A1 (en) 2018-08-01 2021-03-11 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acids of Epstein-Barr virus
AU2019326462A1 (en) 2018-08-21 2021-03-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus
EP3841222A1 (de) 2018-08-24 2021-06-30 Gen-Probe Incorporated Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis von bakterieller nukleinsäure und zur diagnose von bakterieller vaginose
EP3856934A2 (de) 2018-09-27 2021-08-04 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und verfahren zur detektion von bordetella-pertussis- und bordetella-parapertussis-nukleinsäure
AU2019365821A1 (en) 2018-10-22 2021-06-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human polyomavirus BK virus
TW202030333A (zh) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
AU2020210753A1 (en) 2019-01-25 2021-09-02 Gen-Probe Incorporated Detection of drug-resistant mycoplasma genitalium
EP3942078A1 (de) 2019-03-22 2022-01-26 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und verfahren zur detektion von gruppe-a-streptococcus
EP4114985A1 (de) 2020-03-04 2023-01-11 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von sars-cov-2-nukleinsäure
US20230220499A1 (en) 2020-05-07 2023-07-13 Grifols Diagnostic Solutions Inc. Methods and compositions for detecting sars-cov-2 nucleic acid
US20240218469A1 (en) 2021-05-14 2024-07-04 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting human adenovirus nucleic acid
EP4382620A3 (de) 2021-07-27 2024-08-07 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von c. jejuni und mindestens einer von salmonella, c. coli, shigella und stec.
WO2024054924A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers
WO2024081776A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Gen-Probe Incorporated Cellularity control for nucleic acid assays
WO2024137379A2 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens
WO2024192338A1 (en) 2023-03-16 2024-09-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal parasites

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4018530A (en) * 1975-11-18 1977-04-19 Block Engineering, Inc. Fluorescence spectrometry employing excitation of bleaching intensity
FR2422956A1 (fr) * 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
US4358535A (en) * 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
GB2112779B (en) * 1981-12-11 1986-10-15 Welsh Nat School Med Aryl acridinium esters as luminescent labelling materials
US4605735A (en) * 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4737454A (en) * 1983-07-14 1988-04-12 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
US4683194A (en) * 1984-05-29 1987-07-28 Cetus Corporation Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences
JP2509574B2 (ja) * 1985-08-15 1996-06-19 アモコ・コーポレーション 標識付けした核酸
KR970005898B1 (ko) * 1987-09-21 1997-04-21 젠- 프로우브 인코퍼레이티드 뉴클레오티드 프로브에 대한 비-뉴클레오티드 연결시약

Also Published As

Publication number Publication date
EP0638807A1 (de) 1995-02-15
FI892435A (fi) 1989-05-19
JP2000350598A (ja) 2000-12-19
ES2074051T3 (es) 1995-09-01
JP3587762B2 (ja) 2004-11-10
JP3787352B2 (ja) 2006-06-21
AU633474B2 (en) 1993-02-04
PT88562B (pt) 1994-02-28
WO1989002476A1 (en) 1989-03-23
KR960002561B1 (ko) 1996-02-22
JP3483829B2 (ja) 2004-01-06
EP0638807B1 (de) 2002-07-17
DK244889A (da) 1989-06-20
DE3854029D1 (de) 1995-07-27
DK244889D0 (da) 1989-05-19
FI892435A0 (fi) 1989-05-19
EP0309230B1 (de) 1995-06-21
ATE124143T1 (de) 1995-07-15
JP2000350599A (ja) 2000-12-19
DE3856535D1 (de) 2002-08-22
KR890701766A (ko) 1989-12-21
EP0309230A2 (de) 1989-03-29
DE3856535T2 (de) 2002-11-14
JPH02503147A (ja) 1990-10-04
PT88562A (pt) 1989-07-31
EP0309230A3 (en) 1990-07-11
ATE220796T1 (de) 2002-08-15
CA1339872C (en) 1998-05-19
AU2554188A (en) 1989-04-17

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