JPH02503147A - 均一保護検定 - Google Patents

均一保護検定

Info

Publication number
JPH02503147A
JPH02503147A JP63508490A JP50849088A JPH02503147A JP H02503147 A JPH02503147 A JP H02503147A JP 63508490 A JP63508490 A JP 63508490A JP 50849088 A JP50849088 A JP 50849088A JP H02503147 A JPH02503147 A JP H02503147A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
analyte
binding partner
medium
substance
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP63508490A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3787352B2 (ja
Inventor
アーノルド、ライル・ジョン、ジュニア
ネルソン、ノーマン・シー
Original Assignee
ジェン―プローブ　インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジェン―プローブ　インコーポレイテッド filed Critical ジェン―プローブ　インコーポレイテッド
Publication of JPH02503147A publication Critical patent/JPH02503147A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3787352B2 publication Critical patent/JP3787352B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • Amplifiers (AREA)
  • Control Of Eletrric Generators (AREA)
  • Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
  • Emergency Protection Circuit Devices (AREA)
  • Oscillators With Electromechanical Resonators (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 均一保護検定 背景 本発明は診断方法および微少量の有機化合物を検知し、定量する技術の分野のも のである。
さらに詳しくは、本発明は、その非結合形と対立するものとしての結合形におけ るラベルの安定性に差がある均一診断検定に関する。
本発明はラベルがその非複合または非結合形と比べて、複合または結合形では異 なって分解する診断検定システム用の環境の構成に関する。
発明の背景 診断検定はラベルされた結合試薬を用いて生物学的物質を検出し、位置を定め、 または定量する一般的な分析技術である．ついで、ラベルされた試薬の存在を種 々の公知の方法を用いて検出できる．本発明は直接結合検定およびコンペティシ ョンアッセイおよ込次飽和（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　５ａｔｕｒａｔｉｏｎ）を 含め、制限なしに全ての公知の診断検定のフォーマットに適用できる。一つの具 体的な診断検定は核酸のハイブリッド化検定である。ハイブリッド化検定システ ムは一水銀核ｆｉ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が適当な環境の下で相補的−水銀核酸 によりハイブリッド化または組換えされる事寅に基づくものである。容易に検出 できるラベルで相補的プローブ核酸をラベルすることにより、−水銀核酸配列を 含むテスト試料中の目的とする標的ポリヌクレオチド配列の存在を検出すること が可能である。
検定システムは広範には、不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）または均一（ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）として特徴づけられる。検定システムに適用される「 不均一」なる語は検出すべきラベルされない物質からラベルされた物質の分離を 特徴とする特異結合検定のシステムを意味する。
一方、均一検定システムは何等、物理的分離工程を包含しない、均一検定システ ムは取扱い工程数が最小なので、一般に、不均一検定システムよりも便利で、使 用が容易である。
例えば、典を的なサンドインチイムノアッセイは固定化抗体をテスト媒体と共に インキュベイシ磨ンすることを包含する。もし、抗原が媒体中ｌこあれば、抗体 と結合する。インキュベイシＢン後、分離工程で非結合抗原を除去する。ラベル された抗体溶液との第２もしくは同時インキュベイジョンの後、結合抗原は固定 化抗体とラベルされた抗体の間で「サンドイッチ」される。第２の分離工程の後 、培地中の抗原の量として、ラベルされた抗体の量を測定できる。二ので時間が かかる。
診断検定に於は従来の技術における努力の焦点は均一検定と、非結合の目的物質 に対立するものとしての結合した物質の量のわずかな差を区別できるラベルの開 発に向けられている０本発明の一つの目的はラベル自体が、−例えば、非結合の ときに対して化学ルミネセンスの能力に検出できる変化を受ける検定システムで ある０本発明のもう一つの目的はラベルがその結合もしくは非結合形のいずれか で支質的に分解もしくは破壊され、それｌ二より、目的とする反応を同定し、定 量するすぐ使用できる手段を提供する検定システムである。
本発明は均一検定フォーマットを用いる分析物を感度良く検出する改良法を開示 することを目的とする。また、本発明は本明細書に開示した均一法と他の分離法 を組み合わせて非特異的バックグラウンドを減少させる分離を包含する検定の感 度を増加させる改良法の提供も目的とする。本発明の原理はラベルの化学的もし くは生化学は結合相手と結合するときはいつも、該結合相手がそれに対する結合 物質と結合するときに該ラベルの安定性が変化する、もしくは、しうろことを見 出した。また、本発明は該ラベル安定性の差を、均一診断検定システムを用いる 分析物の感度良好な検出に採用できる方法を開示することを目的とする０本発明 のさらにもう一つの目的は相補的標的ポリヌクレオチド配列の存在の感度良好な 検出用の該均一診断検定における化学ルミネセント、アクリジニウエステルーラ ペルＤＮＡプローブの使用を開示することである。
従来技術の記載 従来技術には複雑さの異なる種々の均一検定がある。幾つかのシステムでは、例 えば、ラベルは、他の成分の存在下に化学反応に関与できる触媒、例えば、酵素 、補酵素およびコファクターである。
関連するシステムであるが、他においては、ラベルは化学的もしくは生化学的反 応の基質である。これらのシステムでは、特異的な容易に検出できる物質、例え ば、グルコース、ラクテートまたはアルコールを用いて標的反応をモニターし、 測定する。他の検定システムでは、ラベルが独特の物理的性質を有し、直接それ を検出可能にしている。これらのラベルの例１；は、金属、ヘモグロビンおよび クロロフィルが包含される。
また、他の均一検定システムは酵素がカップリングした特異結合反応に基づくも ので、分析物は特異結合反応のリガンドとなる０分析物が存在する場合、それは 、特異的結合相手およびラベル物質からなる抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）との 特異的結合反応を受ける。同時あるいは続いて、ラベルと相互反応する他の物質 を加える。ラベルの活性は、ラベルがその一つの成分である抱合体が複合形と非 複合形の場合で異なる。このようなシステムは典型的にはラベル試薬として酵素 を、また、比色定量、蛍光定量または化学ルミネセント終点を生ずる基質を用い ている。均一エンザイムイムノアッセイの例には、米国特許第３６５４０９０号 、第３８１７８３７号および第４１９０４９６号が包含される。蛍光発光物質（ Ｎｕｏｒｅｓｃｅｒ）　／蛍光消光物質ペアを生じる発色団の使用を包含する均 一検定の他の例は米国特許第４１９９５５９号、第４１７１３８４号およびＭ４ ３１８７０７号に見られる。しかし、幾つかのシステムでは、ラベルは酵素以外 の物質、例えば、ビタミン、ＮＡＤ、ＦＡＤまたはビオチンであり、ｊ；もかか わらず、これらはｒモニター」反応４：連結できる。このタイプの例は米国特許 ８４３８３０３１号である。これらのシステムでは、モニター反応はラベルの活 性を変化させる構造的変化に基づく。
他の均一検定システムは偏光蛍光の技術を包含する。ここでは、分析物が低分子 量蛍光抱合体と、高分子量の結合相手に対する結合を争う。蛍光の偏光は小さい 分子が大きい分子の表面からずれるときに変化するので、溶液中の分析物の量を 測定するのが可能である。
このタイプの検定システムの例は米国特許第４６６８６４０号である。
均一検定システムのさらに他のタイプには非輻射性エネルギー転移を包含する。
これらのシステムでは、二つの分子が接近したときの一つの分子からの光の他へ の吸収をモニター反応として用いる。
一般に、これらの方法は二通りに記載されている。一つの方法では、第１の分子 が化学ルミネセントで、励起されると、発生した電磁気エネルギーの一部が、接 近しているべき嬉２の「吸収体」分子に転移される。Ｍ２の分子がエネルギーを 吸収し、異なる波長で発光すると、光の一部が、吸収体分子に接近している化学 ルミネセント分子の数に比例したスペクトルシフトを示す。
他のタイプの非輻射性エネルギー検定システムでは、第１の分子が蛍光体で、外 部の光の「吸収体」となる。搏２の蛍光分子の存在互いに接近しＩ；「吸収体」 および「発光体」分子の数に比例したスペクトルシフトを示す。
ダブル・プローブ検定システムの別のタイプが米国特許第４６７０３７９号に見 られる。第４のプローブは触媒でラベルされており、第２はアポ発光体（ａｐｏ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）でラベルされている。両方のプローブとも標的核酸配列 の隣合う区域を目標とする。両方のプローブが一旦標的とハイブリッド化したら 、基質を加える。触媒は基質を転換ラジカルに変え、これは順次、第２のグロー ブ上のアポ発光体を発光体（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）に変える。これはハイブリ ッド化が起こったときだけ生ずる。これらの原理を用いて、共通の分析物に同時 に結合する二つのラベルされＩ；物質に基づく検定が開発されている。
このエネルギー転移検定システムのタイプの具体例は１９８５年ｌθ月３０日比 発行されたイレイザーら（Ｅｌａｚａｒ　ｅｔ　ａｌ）のヨーロッパ特許出願第 ８５１０５１３０．０号（公開番号第０１５９７１９号）であり、標的遺伝子物 質の同一または対立鎖を相補する二つの一水銀核酸プローブの使用を開示してい る。各プローブは二つのラベルが集まったときだけシグナルを発生できる部分で ラベルされている。本発明と異なり、イレイザーらダブル・ハイブリッドまたは マルチ・ハイブリッドの形成および検出を包含する。同様に、１９８３年１月２ ６日に発行されたヘラ−ら（Ｈｅｉｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ）のヨーロッパ特許出ａ 第８２３０３６９９．１号（公開番号第００７０６８５号）および同日の関連す るモリソンら（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）のヨーロッパ特許出願第８２３ ０３７００．７号（公關番号第００７０６８６号）は二つの発光体プローブを用 いる均一検定システムを開示している。光ラベルの少なくとも一つが吸収体／発 光体タイプのもので、二つのプローブが標的とハイブリッド形成すると、二つラ ベルの間でエネルギー転移が起こるようになっている。＠２の発光がハイブリッ ド形成を検出する。このタイプの抗原検定は前記モリソンらに開示されている。
大部分の生物学的物質はいずれの合理的な感度レベルでは容易に直接検出できず 、あるタイプの結合反応が必要である。前記したところから明らかなように、従 来技術は、結合および非結合ラベルの間を有意に区別できない。かかる検定は高 濃度で存在する分析物の検出、例えば、血液御呼び尿中種々の薬剤のモニターの み有用である。
臨床診断の分野においては、二つの結合相手のラベルの安定性を変える能力、例 えば、結合まｔ；は非結合形におけるラベルの選択的除去まｔ；は破壊に基づく 直接検出均一検定を必要としている。ヒルシェフイールド（ｈｉｒｓｈｅｆｉｅ ｌｄ）　ｌまフルオレセンス・バンクブラウンＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｂａ ｃｋｇｒｏｕｎｄ　Ｄｉｓｃｒｉｆｆｉｉｎａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｐｒｅｂｌｅａ ｃｈｉｎｇ）　、ジャーナル・オプ・ヒストケミストリー・アンド・シトケミス トリー（Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ）、２７／１．９６−１０１（１９７９）はラベル分子まｔ；は少なくと もそれらの蛍光を破壊しうる光化学ブリーチングを包含する幾分関連した電子光 学技術を開示しているが、本発明は光化学ブリーチングまたは診断検定にお示ま たは示唆するものではない。本発明は従来技術よりも感度が数オーダー良好なの で診断検定における現在の要求を満たすものである。従来技術の感度範囲は１０ −”モルの範囲より瓜くはないが、本発明は１０−”モル範囲の感度である。
発明の概略 要約すると、本発明は診断検定御および方法からなる。該方法は媒体中の分析物 の検出に使用でき、該分析物は特異的結合ペアの一部である。分析物を含有する と思われる媒体を結合相手と合すると、結合相手に結合しているラベル物質は、 分析物が該特異的結合相手と結合するたびに安定性の検出できる変化または相違 する分解を受ける。具体例においては、−末鎖核酸プローブがその上の実質的に いずれの所望の部分まＩ；は場所にラベルを含むように修飾されている。プロー ブラベルは標的核酸配列がプローブとハイブリッド形成するか否かにより安定性 の異なるものまたは相違する分解に感受性のものである。
特に、本発明は結合プローブ上のラベルが非結合プローブに関して安定化されて いる検出システムからなる。この安定化は挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ） によって促進される。アクリジニウムエステルを含め、ＤＮＡ挿入化合物は特に 、しかし、専らではなく、本発明の検定システムに使用するのに適している。Ｄ 　Ｎ　Ａ挿入物は二本鎖ＤＮＡと非共有的に結合することが知られており、ＤＮ Ａの二重螺旋の塩基対間に挿入しうる特徴的な偏平分子である。本発明者らは、 アクリジニウムエステル類がアデニンとチミジンの塩基対に富む領域に好んで挿 入されるという証拠を持っている。
以下、特にアクリジニウムエステルでラベルされたプローブを参照して本発明を 記載するが、本発明はラベルが成分である抱合体に結合する場合に相違する分解 まｔ；は安定性の変化に感受性な均等なラベルおよび検定フォーマットの使用も 意図していると理解されるべきである。本明細書にさらに詳しく説明するように 、他の適当なラベル化合物には核酸に存在するアミン、特に、非ハイブリッド化 プローブ上のラベルの近傍のアミンにより不安定化される物質を包含する。さら に、疎水性環境と相互作用できる、例えば、塩基対の間への挿入によるラベル物 質も使用できる。
本発明は一般に、結合形と非結合抱合体形を比較したときに、ラベルの選択的な 実質的な分解を包含するいずれのシステムにも適用できる。さらに、いずれの分 離または洗浄工程も含まず、検定システムが比較的単純な故に、従来のシステム よりも迅速で、経費が少ない。ラベルの結合および非結合抱合体形間の安定性に 大きな差異がある場合、残余または非結合ラベル抱合体は全て破壊され、そのた め、検出されないので、該システムは従来のシステムよりさらに感度が良くなる 。最、後に、該システムは非常に融通性があり、単狭でも、まｔ；、他の分離方 法と組み合わせても使用でき、非常に低いバックグラウンドノイズを達成できる ０本発明は感染症、遺伝的およびウィルス病の検出および癌診断を含むプローブ 診断に有用である。
図面の簡単な説明 第１図はアクリジニウムエステルーラベルブロープのＨＰＬＣ精第２図は実施例 ２の結果を示すグラフである。
搏３〜５図は実施例３の結果を示すグラフである。
第６図は実施例４の結果を示すグラフである。
第７図は実施例５の結果を示すグラフである。
第８図は実施例６の結果を示すグラフであ′る。
ベスト・モードおよび好ましい態様の詳細な記載本記載では以下の定義を用いる 。
１、アクリジニウムエステル：第４級窒素中心を有し、その９−位で誘導体化さ れ、不安定なフェニルエステル基を生じるアクリジンの誘導体、具体的には、４ −（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１Ｏ−メチルア クリジアイニウム　９−カルボキシレート　フルオロサルフェート：２、アクリ ジニウムエステル類二次の一般式の部分：Ｒ８−アルキル、アルケニル、アリー ル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキ シまＩ；はＸ−ハロゲンの場合はなし。
Ｒ１−Ｈ，アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、 置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、もし、モしてＸ−Ｎのときだけ。
Ｒ，−Ｈ，アミノ、ヒドロキシ、チオール、ハロゲン、ニトロ、アミノ、アミド 、アセチル、アルキル、アルケニル、アリール、置換アセチル、置換アルキル、 置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ。
Ｒ４−アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換 アリール。
Ｘ−Ｏ％Ｎ％Ｓ１ハロゲン、置換リン、置換硫黄、置換ホウ素または置換ヒ素。
Ｙ−０％ＳまたはＮＨ。
Ｒ１および／またはＲ２および／まｌ；はＲ３および／まｌ；はＲ４化学的抱合 を可能にする反応性部位を有する。
３、分析物−特に制限するものではないが、抗原およびそれに対する抗体、ハプ テンおよびそれに対する抗体、ホルモン、医薬、代謝物、ビタミン、補酵素およ び受容体を含むその結合相手、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌ クレオチドまたはオリゴヌクレオチドのハイブリッドおよびそれらに対する抗体 および結合物質、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドおよびそれらとハ イブリッド形成するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、金属およびそ れに対するキレート剤を包含する一つ以上の特異的結合相手と結合反応する能力 のあるあらゆる物質。
４、結合相手−分析物と特異的結合反応することのできるあらゆる分子または物 質。
５、二本鎖構造：二つの相補−末鎖核酸分子のアニーリングにより形成される二 本鎖複合体。
６、ハイブリッド化ムコつの相補−末鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子間ま！：はＤＮ Ａと相補ＲＮＡ分千間の安定な二本鎖構造の形成。二本鎖構造形成は相補的塩基 対に特異なものであり、それにより、ハイブリッド化しｌ；特定の遺伝子の遺伝 コードが再生される。
７、結合：結合相互作用が分子とその特異結合相手の間で生ずる条件。
８、安定な：化学的または生化学的崩壊、反応、分解、置換または修飾に対する 耐性のある。
９、安定性：化学的まＩ；は生化学的崩壊、反応、分解、置換または修飾に対す る物質の耐性。
アクリジニウムエステル類は溶液中で対応する塩基と平衡して存在することが知 られている。高いｐＨにおいて、塩基形成が優性であり、第４級窒素種は低いｐ Ｈで再形成される。化学ルミネセンス反応が塩基、特に、過酸化水素を含む水酸 化ナトリウム水溶液の添加により影響されることも知られている。化学ルミネセ ンスはアクリジニウム種に対するヒドロベルオキサイドイオンによる攻撃を包含 し、電子的に励起したＮ−メチルアクリドンを生成する。総括的に、ウイークス （Ｗｅｅｋｓ）ら、「イムノアッセイにおける高特異的活性ラベルとしてのアク リジニウムエステル類」、クリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｗ、 ）、２９１８．１４７４−１４７９　（１９８３）参照。該反応を以下に図式化 する。
アクリジニウムエステル反応図 本発明は以下のように実施することができる。第１に、実施される検定用の結合 物質と１以上の結合パートナ−とからなる結合パートナ−を選択する。これらの 対は、抗原とその抗体；ハプテンとその抗体：ホルモン、薬剤、代ｉ！ｆ産物、 ビタミン、補酵素と受容体を包含するその結合パードナー：ポリヌクレオチド、 オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドまｔ二はオリゴヌクレオチドのハイ ブリッドと抗体およびその結合物質；ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ ドとそのハイブリッド化しうるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド；金 属とそのキレート化剤である。
第２に、用いられる検定フォーマットを選択する。これらは、直接結合検定、競 合検定、配列飽和法（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ｓａｔｕｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏ ｄｓ）およびサンドインチ検定からなる７オーマツトから選択することができる 。
第３に、実施される検定用のラベルを選択する。これは、直接または間接的に比 色定量法、蛍光分析法、化学ルミネッセンス法またはバイオルミネッセンス法に より検出できるラベルであればよい。
加えて、該ラベルは、その能力を修正し、検出されるように、化学的または生物 学的に減成しうる特性を有し、かかる減成は、ラベル化結合パートナ−とその結 合物質および反応に関与するかもしれない他の結合パートナ−とその結合物質の 間の結合に悪影響を及ぼさない条件下にて可能である。好ましいラベルは、酸、 塩基まｔ；はパーオキシデートまたは酵素のような選択的酸化剤を照射した後、 その能力に影響を及ぼし、検出されるものである。
第４に、光業者に公知の化学方法を用い、化学または生物学的減成に対するラベ ル感受性が、ラベル化結合パートナ−とその特異結合物質（類）との相互作用を 修正するその部位にて、ラベルを結合物質に付着させる。ある場合には、複数の 異なる部位をラベル結合について試験し、最も特異的な減成を与える部位を用い ることができる。
第５に、その結合物質と共に、またはなしでラベル化結合パートナ−の最適検出 識別を付与する化学的または生物学的減成条件を最大限に活用する。
最後に、予め選択した検定フォーマットを用いて検定系の能力を試験し、一般に ： ａ、インキュベートし、 ｂ６選択的に減成し、 Ｃ０検出するか、まｔ；は ａ、インキュベートと選択的減成を同時に行い、ｂ、検出する の工程を用い、分析物を定性的にまｔ；は定量的に検出するチルでラベル化した オリゴヌクレオチドプローブが、ノ１イブリダイゼーシロンを介する特異的ポリ ヌクレオチド配列の検出用に特に有用である。アクリジニウムエステルを、１９ ８７年９月２１日出願の米国特許出Ｉ！（まだ番号が付与されていない）、アー ノルドら（Ａｒｎｏｌｄ、　ｅｔ　ａｌ、）による「ヌクレオチドプローブ用の 非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように、ＤＮＡプローブおよび／ま たは混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー上の多くの異なる部位にて付着 させてもよい。これは、ヌクレオチド塩基、リン酸塩バックボーン、オリゴヌク レオチドの３′末端および５°末端ならびに混合ヌクレオチド／非ヌクレオチド ポリマーの非ヌクレオチドモノマ一単位をラベル化する能力を包含する。
かかるアクリジニウムエステルラベル化プローブは、それらが７１イブリツド化 された場合と比較して、それらが付着するプローブが溶液中にてフリーである場 合には、有意な異なる化学安定性を示しうる。この異なる安定性は、プローブに おけるアクリジニウムエステル、アクリジニウムエステルラベル付近のヌクレオ チド残基の位置およびターゲットポリヌクレオチドと安定したハイブリッド物を 形成する他のプローブ分子の存在に依存している。グラフ表示を以下に示す。
ＤＮＡプローブ分子におけるアクリジニウムエステルの異なる安定性に寄与する 因子を測定する方法において、非ハイブリッド化グローブ（ヌクレオチドおよび 混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドの両方）の塩基上の遊離アミンが、特にアル カリ性雰囲気下にてアクリジニウムエステルを不安定にすることが判明しｔ；。
同時に、アクリジニウムエステルがプローブの末端に隣接している場合、いった んハイブリッド化が起こると、それはターゲット配列により寄与されたアミンに よってアルカリに対して不安定となりうる。プローブが特異ポリヌクレオチド（ 結合物質）配列とハイブリッドを形成する場合、プローブアミンは相補性ヌクレ オチドと対をなす塩基と関係し、その能力は制限され、特にアルカリ性条件下、 アクリジニウムエステルを不安定にする。同時に、ハイブリッド・デュプレック ス（ｈｙｂｒｉｄ　ｄｕｐｌｅｘ）、特に、アデニン／チミジン塩基対密度の部 位に挿入することにより、アクリジニウムエステルはさらに減成に対して安定化 することが判明した。以下のセクシ謬ンにおいて説明されているように、多くの 他の挿入部位もまた、良好な種々の加水分解を提供することが判明した。
本発明をハイブリダイゼーシヨンに適用することができるいくつかの態様がある 。これらは限定するものではない。
１、アクリジニウムエステルをプローブの中心部位およびアデニン／チミジン塩 基対の隣接部位に付着させる。好ましい方法は、１９８７年９月２１日出願の米 国特許比Ｗｉｔ（まだ番号が付与されていない）、アーノルドら（Ａｒｎｏｌｄ 、　ｅｔ　ａｌ、）による「ヌクレオチドプローブ用の非ヌクレオチド結合試薬 」に記載されているように、アクリジニウムエステルを非ヌクレオチドモノマ一 単位に付着させ、すなわち、ターゲットポリヌクレオチド配列のすぐ隣くにある ヌクレオチドに対して相補的であるヌクレオチドモノマ一単位に挿入し、付着さ せることである。かかる配置は、アクリジニウムエステルの両端におけるヌクレ オチド塩基のアミンを制限し、挿入用部位を提供するのに役立つ。
２、アクリジニウムエステルをグローブの３′または５′末端のいずれかに付着 させ、第２のプローブとのターゲットポリヌクレオチドにより寄与されｔ；アミ ンの付近の作用を制限し、第１のプローブの付近をハイブリッド化する。該第２ プローブが、デュプレックス形成に基づ＜Ａ／Ｔ塩基対に冨んだ部位をクリエー トする場合、それもまｔこ望ましいことである。を二とえこのダブルプローブま にはサンドイッチ系が、１つだけではなく、２つのデュプレックスの形成に依存 しているとしても、非常に短いプローブ、すなわち、長さが約５〜１５ヌクレオ チドのプローブにより識別することができるマイナーな塩基対変化を敏感に検出 する方法を提供する。
３．７クリジニウムエステルを、所望のターゲットポリヌクレオチドでないポリ ヌクレオチド配列とのミスマツチ部位にて、または付近ｌ二て付着させる。この ように、ミスマツチ部位のまわりのデュプレックス域は有意に不安定化され、ア クリジニウムエステル（仮にそれがこの部位にて、または付近にて付着している 場合）は減成に対して影響されやすくなるため、わずか１つのヌクレオチドだけ が異なるポリヌクレオチド配列の間の識別をも達成することができる。
上記３つのフォーマットについて１つの好ましい態様は、ハイブリダイゼーシ厘 ン工程と同じ温度、典娶的には５０〜７０℃にて、異なる加水分解工程を行なう ことである。
別の態様は、別の異なる加水分解工程を室温にて行なうことである。これは、ｌ Ｏ〜１１の範囲のｐＨを用い、ハイブリッド化と非ハイブリッド化アクリジニウ ムエステルラベル化プローブの間の加水分解速度に、より大きな差異をもたらす 。
正常な状況下、かかる短いグローブは、適当なノ１イブリダイゼーシ震ン条件下 にて単一のミスマツチを識別する能力を有する。しかしながら、それらは単一ポ リヌクレオチド部位に対して有意に特異的ではないため、それらは常套手段とし ては用いられていない、すなわち、該短いプローブは、存在する多数の複合ＤＮ ＡまたはＲＮＡ配列内に含まれる複数の特異部位をハイブリッド化するかもしれ ない、２つの異なるプローブが、すぐ隣りのポリヌクレオチド部位をハイブリッ ド化しなければならないという条件下では、かかる部位は特異的にターゲットと され、同定することができる。したがうて、短プローブ識別の利点は、両方のプ ローブによりスパンされｔ；部位の特異性を維持しながら利用できることである 。
実験法および物質 以下の実施例は、例示であり、限定されるものではない、これらの実施例は、一 般に利用可能なデーターおよび最も適当な現象の説明に基づくものである。他の 因子および方法が、さらなる研究により明らかになるかもしれない。本発明はア クリジニウムエステルラベルを用いる例示および実施例により詳細に記載されて いるが、ある変形および修正を請求の範囲内で行なってもよく、他のラベル系も また請求の範囲内で用いてもよい。
実施例１ アクリジニウムエステル−ラベル化プローブの組立てデオキシオリゴヌクレオチ ドプローブを、プローブ内部の５°−末端、ポリリンａ鎖に沿ったある予め選択 した位置のいずれかに位置する、または１つのヌクレオチド塩基に付着するアミ ンりンカーア−ム（すなわち、アクリジニウムエステルでラベル化する第１級ア ミンにて終止するもの）を有するように合成した。
（ｉ） ５１−アミンリンカー−アームをプローブに付着させるのに、以下の化合物を用 いた： この化合物は、これまで、末端アミンリンカー−アーム試薬と称されている。こ の試薬を以下のように合成した：無水酢酸エチル中、６−アミノヘキサノールを Ｓ−二チルトリアルオロチオアセテートと反応させた０反応精製物が石油エーテ ル中にて沈澱し、水中ｌＯ％ピリジン混合物で１０分間処理し、形成した０−ト リフルオロアセチルを加水分解し、ガム状形に蒸発乾固した。ついで、この化合 物を、文献に記載されている標準的プロトコルに従ってホスフイチレ−）　（ｐ ｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｅ）　Ｌ、所望の化合物、すなわち、末端アミンリンカ ー−アーム試薬（１）を得た。
５°−アミンリンカー−アームを有するプローブを以下のように合成した。アプ ライド・バイオシステムズ・インシーボレイシ３ン（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ　１ｏ ｓｙｓｔｅ＋ｎｓ、　Ｉ　ｎｃ、）のモデル−３８ＯＡ　ＤＮＡシンセサイザー を用い、標準的ホスホルアミシト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学に従 い、所望のヌクレオチド配列のプローブを得、３°末端から５°末端のプローブ を形成した。所望の配列が完了しｔ；後、アミンリンカー−アームは、別のホス ホルアミシトヌクレオシドがカップリングするのと同じように、末端アミンリン カー−アーム試薬を用いて自動的にプローブの５′−ヒドロキシル基にカップリ ングした。標準的プロトコルを用い、ついで該プローブを固体担体から切断し、 脱保護し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、つづいてセファデックス（Ｓ　ｅ ｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５クロマトグラフイーにより精製した。
以下のプローブを合成し、この操作に従い精製した：５・−面２−（ＣＩ！２） ６−ＧＣ’ｌ’ＣＧＴＴＧＣ（２）ＡＣ費ＭＣＣ賜ＣＡＴ−３”（Ｎ　Ｈｘ−Ｃ ＣＨｘ）ａはアミンリンカー−アームを示す）（■） アミンリンカー−アームをプローブの内部に組入るため、内部アミンリンカー− アーム試薬、タイプｌまたはタイプ２を、１９８７年９月２１日出願の米国特許 出願番号第０９９０５０号、アーノルドらによる「ヌクレオチドプローブ用の非 ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように用いた。再度、プローブを標準 的ホスホルアミシト化学を用いて合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およ びセファデックスＧ２５クロマトグラフイーを用いて精製した。
以下のプローブはこの操作に従い合成しｌ２二１、）イー・コリー（Ｅ、Ｃｏ１ １）からの１６５サブユニツトｒＲＮＡに対する３０ｍａｒコンプレメンタリー は、内部アミンリンカー−アーム、タイプｌで、配列中の１８位のアデニン残基 を置き換える＝２、）クラミディアパトラコマテ（ス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔ ｒａｃｈｏｇｎａｔｉｓ）か内部アミンリンカー−アーム、タイプｌで、配列中 の２１位のアデニン残基を置き換えるか、 または残基２１と２２の間に挿入する：（ｍ） アミンリンカー−アームを有するヌクレオチド塩基を、以下のようにプローブに 挿入した。以下の配列を有する鋳型およびプリマーオリゴヌクレオチドを合成し た： 鋳型３°−ＧＣＡ　ＡＴＧ　ＡＧＣＣＴＡ　ＣＧＧ　ＧＴＴＴＡＴ　ＡＧＣＧＧ −５゜ プリマー５°−ＣＧＴ　ＴＡＣＴＣＧ　ＧＡＴ　ＧＣＣＣＡＡＡＴ−３’ （プリマーおよび伸長プリマーはシイ・トラコマテイスの１６５サブユニツトに 対して相補的である。） クレノー（Ｋ　１　ｅｎｏｗ）　７ラグメントを用いるプリマー伸長は、ＢＳＡ がｌＯ×ニック・トランスレージ震ン・バ７アーから省略することを除いて、マ ニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（ｒｅｆ、）に記載されているように行ない、 アミンリンカー−アーム修正塩基アミノ（１２）ｄＵＴＰ（カルバイオケム、カ リフォルニア）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を挿入した。
しｌ；がって、得られたオリゴマーの配列は：ＣＧＴ　　ＴＡＣＴＣＧ　　ＧＡ Ｔ　　ＧＣＣＣＡＡ　　ＡＴＡ（アミノ−１２−Ｕ）ＣＧ　ＣＣである。
プリマー伸長複合体の精製は、ＮＥＮＳＯＲＢ−２０カートリツジ（デュポン） （］）　ｕ　Ｐ　ｏｎｔ）を用い、製造業者の奨励する方法に従い実旅した。（ プリマー伸長反応体は、カラムに充填する前に、ＮＥＮＳＯＲＢ試薬Ａ９００試 薬全９００２ｇした。該精製オリゴマーを５０％メタノールで溶出し、ついでス ピード−バク（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ、）にて取り出しｊ；）。
Ｂ、アクリジニウムエステルを用いるアミノリンカー−アームプローブのラベル 化および精製 アクリジニウムエステルの２５ｍＭストック溶液を、蒸留ＤＭＳＯ中にて調製し た。所望量のプローブ（前記セクションＡにおけるラベル化した種々のプローブ のリスト参照）を、１．５ｍｌ＋の円錐形ポリプロピレン管にて蒸発乾固した。
カクテルは以下の成分を列挙した順序にて加えることにより構成した： ３μｇ水 １μ（ｌ　　ＩＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８，０）４ｐＱ　　ＤＭＳＯ（蒸留） ２μＱ　　ＤＭＳＯ（蒸留）中、２５ｍＭアクリジニウムエステル混合物を撹拌 し、マイクロ遠心分離機において２秒間スピンに付しく内審物を管の底に集中さ せる）、３７℃にて２０分間インキュベーションした。ついで、以下の成分を、 列挙した順序にて反応カクテルに加えｔ二： ３．０μ（ｌ　　ＤＭＳＯ（蒸留）中、２５＋ｎＭアクリジニウムエステ１．５ μｇ水 ０．５μＱ　　ＩＭ　　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８，０）カクテルを再度撹拌し、スピ ンし、３７℃にてさらに２０分間インキニベーシ層ンした。未反応ラベルは、５ 倍過剰のりシンを用い、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８，０）、５０％ＤＭＳＯ 中、０．１２５Ｍリシンを加えることによりクエンチし、室温にて５分間インキ ュベートした。
ついで、アクリダニ９ムエステルーモ の方法を用いて精製した。クエンチした反応混合物２０μｇに、担体として３Ｍ 　Ｎａ０Ａｃ（ｐＨ５，０）３０　ｐ　ｎ、水２０ｔｔ（ｌおよびグリコゲン５ μｇ加えた（グリコゲンは予め旭理し、いずれのヌクレアーゼ活性も除去した） 、試料を簡単に撹拌し、無水エタノール６４０μｇを加えた。該試料を簡単に撹 拌し、氷上にて５〜ｌＯ分間インキニベートシ、ついでマイクロ遠心分離機にお いて１５０００ｒｐＩＩ＋にて５分間遠心分離に付した。上澄液を注意して除去 し、ペレッ）を０．ｌｈｉ　Ｎａ０Ａｃ（ｐＨ５−０）２０μｍ２．０．１％Ｓ ＤＳに再度溶かしＩ；。ついで、試料を以下に記載のように高速液体クロマトグ ラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）により精製した。
（ｉ） ５′および内部アミンリンカー−アームを有するＡＥ−ラベル化プローブを以下 のように精製した：再度溶解したペレットを、ＩＢＭ就９５３３ＨＰＬＣ系に取 り付けＩ；ヌクレオゲンーＤＥＡＥ６０−フイオン交換ＨＰＬＣカラムに注入し た。すべてのバファーは、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆ　１ｓｈｅ ｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からのＨＰＬＣグレード水、アセトニトリル（ＣＨＩ ＣＮ）および酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、試薬グレードの氷酢酸（ＨＯＡｃ ）およびＬｉＣＱで調製した。すべてのバファーは、使用前に０．４５μｍ孔径 のナイロン−６６フイルターを介して濾過した。試料を、第１図の記載（この場 合、プローブは前記セクションＡにおいて記載された２６ｍａｒを含有する５゛ −アミンリンカー−アームであ・った）のように溶出した。５！！験の直後、１ ０％５Ｄ５５μｇを各試験管に加え、つづいて各試験管を撹拌した（これにより 、アクリジニウムエステルラベル化プローブを、試験管壁にこびりつけないよう にしｔ；）。フラクション２１〜４２から０．５μｇ部を取り出し、１２Ｘ７５ ｍｍ試験管の水２００ｐｆｆに加えた（各部において分離ピペットチップを用い 、キャリーオーバーの問題を回避した）。ついで、各部の化学ルミネッセンスを 、次の自動注入および読み配列を用いるバートホルト・クリニルマット（Ｂｅｒ ｔｈｏｌｄ　Ｃ１ｉｎＣ１１ｎｉｌｕにおいて測定した：０．２５Ｎ　ＨＮＯｓ ２００　ｐ　Ｑ、　Ｏ，１％Ｈ，Ｏ，（７）注入；１秒後；　ｌ　Ｎ　ＮａＯＨ ２００μｇの注入：１０秒間化学ルミネッセンス出力の読み。
ついで、フラクション２９〜３３を以下のようにＥｔＯ）Ｉ沈澱させた：各フラ クシ謄ンにグリコゲン５μｇを加え、撹拌し、ＥｔＯＨ１ｍ１２を加え、撹拌し 、氷上にて５〜ｌＯ分間インキュベージ層ンし、マイクロ遠心分離機中、１５０ ００ｒｐｍにて５分間遠心分離に付した。各上澄液を注意して除去し、ペレット を０．１Ｍ　Ｎａ０Ａｃ２０μＱｓ　ｐＨ５、Ｏ０１％ＳＤＳに再度溶かし、フ ラクションをプールしｔ二。
このようにして、高純度の７クリジニウムエステルラベル化プローブを得た。か かるプローブの特異活性は、典型的には、オリゴマー１ピコモル当ｔ；す、５〜 １０ｘｌＯ’化学ルミネツセンス光数（バートホルト・クリニルマット）であっ た。
（ｉｉ） アミンリンカー−アーム修正塩基（アミノ−１２−Ｕ）を有するＡＥ−ラベル化 プローブを、一般に、以下のことを除いて、前記のように精製した：バイダック （Ｖｙｄａｃ）　Ｃ４逆相カラムをもちいた；緩衝液Ａは０　、１　Ｍ酢酸トリ エチルアンモニウム（アプライド・バイオシステムズ、インシーポレイション、 カリフォルニア州、ホスター・シテ（−（Ｆ　ｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ））、緩衝 液ＢはｃＨｓＣＮであった；ラベル化プローブは、１ｍ１２／分の流速にて２５ 分間においてｌＯ〜１５％溶媒Ｂの直線勾配を用い、ハイブリッドとして溶出し た。ついで、主な化学ルミネッセンスピークを同定し、前記のように後処理しＩ ；。
一般に、前記ディスカッジョンは、アクリジニウムエステルでプローブを合成し 、ラベル化する方法を記載している。個々の実施例において、プローブは、末端 および内部ラベル化、ならびにヌクレオチド塩基にてラベル化されている。
実施例２ アクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド化プローブおよび非ハイ ブリッド化プローブのｐＨ６における安定性クラミジア・トラシーマティス（Ｃ ｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏ＋ｎａｔｉｓ）に対して特異的な内部標識化３ ３ｍａｒプローブを前記したごとく調製した（アデニン置換、タイプｌリンカー −アーム）。以下の手法に従い該プローブをそのターゲットｒＲＮＡ（この場合 はクラミジア・トラシーマティス）でハイブリッド化した。
ハイブリダイゼーシ纏ン混合物 ２μｍ２ＡＥ−グローブ（０，５ピコモル）０、：３μｍ　　４％（重量：容量 ）ＳＤＳ５．８μｍ２１ＭＰＢ％ｐＨ５ ４，４μＱ　シイ・□トラシーマティス　ｒＲＮＡ（２μｇ）、または対照につ いては４．４μＱ水 該ハイブリダイゼーシヨンおよび対照混合物を６０℃にて４０分ゼーシ薦ンにつ いて分析した。ハイブリッドまたは対照混合物の０１μＱ分を、２％ＨＡＰを含 有する０、１４Ｍ　　ＰＢ％　ｐＨ６，８゜２００μＱに添加した。得られＩ； 各混合物を５秒間攪拌し、６０℃ｌ；で５分間インキュベートし、２０秒間攪拌 し、次いで１ｓｏｏ。
ｒｐｍにてミクロ遠心機で３０秒間遠心した。上澄みを除去し、保？ＦＬ、０． １４Ｍ　　ＦＢ、ｐＨ６，８，２００／７１２をＨＡＰぺＬ／７トに添加し、混 合物を１０秒間攪拌し、次いで１５０００ｒｐｍにてミクロ遠心機で３０秒間遠 心した。上澄みを除去し、保存し、ペレットを０．１４Ｍ　　ＰＢ％ｐ）（６， ８，２００μｇに再懸濁した。再懸濁ＨＡＰの５０μｇおよび２の上澄みの各々 を以下に記載するごとく化学ルミネッセンスについて分析し、パーセントハイブ リッド化グローブ、すなわちＨＡＰに伴うパーセント化学ルミネッセンス信号を 計算した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の 安定性を以下の手順に従ってｐＨ６にて試験した。
安定性試験混合物 １２．３μｇ　前記からのハイブリッドまたは対照５０ｐＱ　　ＩＭ　　ＰＢ、 ｐＨ６ ２，５μＱ　４％　５ＤＳ ６５μｇ水 これらの混合物を軽く攪拌し、直ちに５μｇ分を取り出しくｔ、）、以下に記載 するごとく化学ルミネッセンスについて分析した。混合物の残りを６０℃でイン キュベートし、各時間（後記参照）において５μＱ分を取り出し、直ちに化学ル ミネッセンスにつし島て分析しｔ二。
各試料の化学ルミネッセンスは、試料の一部を１２ｘ７５ｍｍ試験管中の水２０ ０μｇに添加し、クリニルマート（Ｃｌｉｎｉｌｕｍａｔ）　（０。
２５Ｎ　　ＨＮＯＩ　　２００／Ｊ（１，０，１％Ｈ８０，を自動注入、１秒遅 れて２ＭＦＢカリウム２００μ（ｉ、ｐＨ１３−２を自動注入、１０秒間の化学 ルミネッセンスの読み取り）にて化学ルミネッセンスを測定することによって測 定した。
結果： １、パーゼントハイプリダイゼーシ鳳ン（ＨＡＰ分析）ハイブリッド−９６％ 対照−１，３％（非特異的結合） ２、安定性時間経緯 ′＃ｇ２図参照 これらの結果は、ハイブリッド化プローブは分解および続いての化学ルミネッセ ンスの喪失に対してよく保護されているが（化学ルミネッセンスの喪失の半減期 は３３７０分に等しい）、非ノーイブリッド化プローブは分解および化学ルミネ ッセンスの喪失に対して非常に敏感である（半減期は２９．２分に等しく、従っ て、ハイブリッド化および非ハイブリッド化の差は１１５倍に等しい）ことを示 す。
ド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ間に異なる安定性を付与し、それ を測定することによって、ターゲットＤＮＡ配列の位置を決める能力を証明する ものである。
実施例３ アクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド化プローブおよび非ハイ ブリッド化プローブのｐＨ９における安定性内部標識化プローブ（実施例１に記 載しｌ：すべての３つの内部標識化３３ｍｅｒプローブを試験した）をそのター ゲットｒＲＮＡ（この場合はクラミジア・トラコーマナイス）でハイブリッド化 し、実施例２に記載したごとくにパーセントハイブリダイゼーシ１ンについて分 析しＩ：。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の 安定性を以下のプロトコルに従ってｐＨ９にて試験した。
え主１区１邑１隻 ５μＱ　前記からのハイブリッドまたは対照４５Ｐρ　０　、２　Ｍホウ酸ナト リウム、ｐＨ９次いで、混合物をシンキュベートし、サンプリングし、実施例２ に記載しｔ；ごとくに化学ルミネッセンスについて分析した。
結果： １、パーゼントハイブリダイゼーシ１ン（ＨＡＰ分析）ａ、アデニン置換、タイ プｌリンカー−アームハイブリッド−９５％ ｂ、挿入、タイプｌリンカー−アーム ハイブリッド−９８％ 対照−０，３％ Ｃ０挿入、タイプ２リンカー−アーム ハイブリッド−９８％ 対照−０，２％ ２、安定性時間経緯 第３〜第５図参照。第３図はアデニン置換、タイプｌリンヵー−アームについて のグラフであり：Ｍ４図は挿入、タイプ１リンカー−アームについてのグラフで あり；第５図は挿入、タイプ２リンカー−アームについてのグラフである。
実施例２におけるごとく、ハイブリッド化プローブは分解から保護されるが、非 ハイブリッド化プローブは保護されない。これは、内部標識化プローブのすべて の３つのタイプについて当てはまる。
本実施例においては、高いｐＨにおけるホウ酸ナトリウムが、ハイブリッド化プ ローブと非ハイブリッド化プローブとの間にまだ異なる分解特性を保持しつつ、 （実施例２と比較して）この過程を加速することが示される。
実施例４ 隣接プローブをもつハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化した プローブ末端および非ハイブリッドのｐＨ６における安定性 本実施例は、本実施例で用いるＡＥ−標識グローブ（後記参照）の５°末端にす ぐ隣接するイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ｒ　ＲＮＡにハイブリダイズし、それ によってアクリジニウムエステル標識に近接するターゲットｒＲＮＡ中のすべて のアミンの「キャップ除去」に導く（標準的なホスホルアミディト化学を用いて 調製した）配列５″−ＣＣＧ　　ＧＡＣＣＧＣＴＧＧ　　ＣＡＡ　　ＣＡＡ　　 ＡＧＧ　　ＡＴＡ　　ＡＧＧ　　ＧＴＴ　　ＧＣ−３″のプローブの使用を含む 。
アクリジニウムエステルで標識化しＩ；プローブ末端（実施例１に記載した調製 ）（以下、ＡＥ−グローブという）および前記した隣接プローブを以下の手順に 従ってハイブリダイズした。
ハイブリダイイーシーン混合物　　　　　対照混合物１ｐＱ　　ＡＥ−プローブ 　　　　　　ｌμｌ２ＡＥ−グローブ（，２５ピコモル）　　　　　　　　　　 （，２５ピコモル）２ｐＱ　　イー・コリ　ｒＲＮＡ　　　　　５．４ｐ（ｌ水 （２μｍ２ｇ） ４．３μＱ隣接プローブ　　　　　　　５．８μＩＭＦＢ％ｐＨ５（１２ピコモ ル） ０．３ｐＱ４％ＳＤＳ　　　　　　　　　　Ｏ，３ｐＱ４％５ＤＳ７．５μρ　 １Ｍ％　ｐＨ５ 該ハイブリダイゼーシヨンおよび対照混合物を６０℃にて４０分間インキュベー トし、次いで、実施例２に記載しＩ；ごとくにヒドロキシアパタイトを用いてパ ーセントハイブリダイゼーションについて分析した。
隣接プローブをもつハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（ すなわち、対照）の安定性を実施例２に記載しｔ；ごとくにｐＨ６にて正確に試 験した。
結果： １、パーセントハイブリダイゼーション（ＨＡＰ分析）ハイブリッド−９３，５ ％ 対照−２，７％（非特異的結合） ２、安定性時間経緯 第６図参照 実施例２におけるごとく、ハイブリッド化ＡＥ−プローブ（この場合はやはりハ イブリッド化した隣接プローブをもつ）は分解から保護されたが、非ハイブリッ ド化プローブは保護されなかった。該保護は実施例２と同じ程度良好であった。
何故なら、１つの代わりに２つのハイブリダイゼーシ暦ンに依存するからである 。
実施例５ 「隣接」プローブをもつハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化 しｔ；プローブ末端および非ノーイブリッドのｐＨ９における安定性 実施例４に記載したごとくにハイブリダイゼーシヨンを正確に行った。以下に示 す安定性試験混合物の組成以外は、実施例２に記載しｔ；ごとくに、隣接プロー ブをもつノ１イブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわち 、対照）の安定性をｐＨ９において正確に行った。
５ｐｇハイブリッドまたは対照 ５０ｐＱ　０．２Ｍ　　ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９，０（やはりハイブリッド化 された）隣接プローブをもつノ（イブリッド化ＡＥ−プローブは再び分解から保 護されたが、非／ｑブリツド化プローブは保護されなかつＩ；。実施例３におけ るごとく、高いｐＨでのホウ酸ナトリウムは、ハイブリッド化プローブおよび非 ／−イブリッド化プローブ間に異なる分解特性をなお保持しつつ、過程を加速し ｔ；。これらの結果をグラフで示したものは第７図を参照されｌニレ１゜ 実施例６ ハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端および 非ハイブリッドのｐＨ６における安定性以下の手順に従ってプローブをそのター ゲットｒＲＮＡ（この場合はシー・コリ）にハイブリダイズした。
ハイブリダイイーシ■ン混合物　　　　　対照混合物１ｐＱ　　ＡＥ−プローブ 　　　　　１ｉｘＱＡＥ−プローブ（，２５ピコモル）　　　　　　　　　　（ ，２５ピコモル）２ｐ（１イー・コリ　ｒＲＮＡ　　　　　５．４ｐ（１水（２ μｇ） ５．８μＱ　ＩＭ　ＰＨ，ｐＨ５５，８μｍ２１ＭＰＢ％　ｐＨ５０，３μＱ４ ％ＳＤＳ　　　　　　　　　Ｏ，３μＱ４％５ＤＳ３．４μＣ水 該ハイブリダイゼーシヨンおよび対照混合物を６０℃にて４０分間インキュベー トし、次いで、実施例２に記載しｌ；ごとくヒドロキシアパタイトを用いてパー セントハイプリダイイーシ２ンについて分析しｔ；。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の 安定性を実施例２に記載しＩ；ごとくにｐＨ６にて正確に試験した。
結果： １、パーセントハイプリダイイーシーンハイブリッド−９４％ 対照−２，７％（非特異的結合） ２、安定性時間経緯 第８図参照。
非ハイブリダイズ化プローブは、これまでの実施例におけるほど分解の差は大き くなかったが、再び、ハイブリッド化プローブと比較してかなり分解しｔ；。こ れは、アミンの一部のみがアクリジニウムエステル標識の近接で「キャップ除去 」されたからである。事実、これは、さらに、ハイブリッド化隣接プローブの存 在下におけると非存在下におけるハイブリッド化末端−標識化プローブ間とを区 別する能力を証明する。
実施例７ アクリジニウムエステルでヌクレオチド塩基に標識化した／９ブリッド化プロー ブおよび非ハイブリッド化プローブのｐ）（７，６における安定性 実施例１に記載したアクリジニウムエステルでヌクレオチド塩基（アミノ−１２ −Ｕ）に標識化したプローブを、以下の手順に従りて、そのターゲットｒＲＮＡ （二の場合はシイ・トラコーマナイス）にハイブリダイスしに。
ハイブリダイゼータ１ン混合物 ０．１Ｍコハク酸リチウム、ｐＨ５，４１Ｏ％ラウリルｉ酸リチウム ２μｇ１．３ピコモルＡＥ−プローブ 合計容量−３０μＱ ハイブリダイゼーシヨンおよび対照混合物を８０℃にて５分間、続いて６０℃に て６０分間インキュベートした。得られた溶液を、０．１Ｍコハク酸リチウム、 ｐＨ５，４、ｌＯ％ラウリルＷＬ酸リチウムで各々３００μｇまで希釈し、実施 例２に記載したごとくにヒドロキシアパタイトを用いてパーゼントハイブリダイ イーシ■ンについて分析しｔ：。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ（すなわち、対照）の 安定性を、以下のプロトコルに従い、いくつかの同一に調製した試料とともにｐ Ｈ７，６で試験した。
天！匡に艷」立生 １５μｇ　前記からのハイブリッドまたは対照１００μｍ１　０．２％テトラホ ウ酸ナトリウム、ｐＨ７，６，５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　−１００次い で、これらの混合物を６０℃にてインキュベートし、試料を種々の時点で取り出 し、０．１Ｍ　Ｈ２Ｏ２２００μｇの自動注入、１秒遅れてのＩＮ　　ＮａＯＨ ２００μｇの自動注入、および５秒間の化学ルミネッセンスの読み取りを使用す るＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ　Ｌｅａｄｅｒ丁綽ｌ　ルミノメータ−（Ｌｕｍｉｎｏｍ ｅｔｅｒ）を用いて化学ルミネッセンスを測定した。これらのデータより、加水 分解速度を回帰分析によって決定した。
結果： １、パーセントハイプリダイイーシ１ン（ＨＡＰ分析）ハイブリッド−５３６８ ％ 対照−０，５％ ２、安定性 エステル加水分解の半減期（分）　　　半減期の比ハイブリッド　　　　対照　 　　　　　（ハイブリッド／対照）１３．６　　　　　１．３　　　　　　　　 １０．５これまでの実施例におけるごとく、これらのデータは、ハイブリッド化 プローブは分解から保護されるが、非ハイブリッド化プローブ（この場合はプロ ーブの塩基に付着した標識をもつ）は保護されないことを示す。これは、ＡＲ付 着についての多重部位が本明細書中にて記載する均一保護検定で使用できる原理 を示す。
実施例８ ｒ　Ｎ　、ＡおよびＤＮＡターゲットをともに用い各種配列ダイマ一部位にてア クリジニウムエステルで内部標識化しｔ；ハイブリッド化および非ハイブリッド 化プローブのｐＨ７，６における安定性種々の配列ダイマ一部位（以下、参照） に挿入した内部リンカー−アーム、タイプ「ｘ」を含有するプローブを合成し、 ＡＥで標識化し、実施例１に記載したごとくに精製した。これらのプローブの配 列およびリンカー−アームの位置は以下のとおりである。
プローブＮｏ、　　　配列ニリンカー−アーム位置（＃）ｌ　　　　　　　　　 ５°−ＧＣＴ　　ＣＧＣ丁ＧＣＧＧＡ　　ＣＴＴ＃ＡＡＡ　　ＣＣＡ　　ＡＣＡ 　　Ｔ−３’２　　　　　　　　５’　−ＡにＧ　　丁ＣＧ　　ＧＴＣＴ＃丁Ｔ 　　ＣＴＣＴＣＣＴＴＴ　　ＣＧＴ　　ＣＴＡ　　ＣＧ−３’３５°−ＣＡＡ　 ＴＣＧ　ＴＣＧ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＴＴ＃Ｇ　ＣＴＣＣＧＴ　ＴＣＧ　Ａ−３’ ４　　　　５’　−ＣＣＧ　ＣＴＡ＃ＣＣＣＧＧＴ　ＡＣＧ　ＴＴ−３″５　　 　　　　　　　５’−ＴＴＧ　　ＣＣＣＡＣＡ　　ＣＣＧ　　Ａ＃ＣＧ　　ＧＣ Ｇ−３’６　　　　５’−ＴＴＧ　ＣＣＣＡＣＡ　ＣＣＧ　Ｃ＃ＣＧ　ＧＣＧ− ３’８０℃インキュページ謬ン工程を省略し、かつ用いるターゲット核酸が以下 のものである以外は実施例７に記載したごとくにこれらのプローブをハイブリダ イズしｔ二。
プローブ＃　　　ターゲット核酸 ｌ　　　　　イー・コリｒＲＮＡ（７）ｌｕｇ２および３　　　キュー・トラシ ーマティス（Ｑ、　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｒＲＮＡのｌ、ｕｇ ４　　　　　エヌ・ボンドロエア（Ｎ、　ｇｏｎｄｒｒｈｏｅａｅ）　ｒ　ＲＮ 　Ａの１２ｇ ５および６　　　正確な合成りＮＡ補体の１．２ピコモル実施例７に記載したご とく、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブの安定性をｐＨ ７，６にて試験した。
結果： え！ｉ 半減期の比 １　　　　　４１．２　　０．９４　　　　４３．７２　　　　　２４．２　　 ０．７１　　　　３４．５３　　　　　４０．７　　０．９６　　　　４２．４ ４　　　　　１５．７　　１．２　　　　　１３．１５　　　　　１１．１　　 １．０　　　　　１１．１６　　　　　２２．６　　０．７４　　　　３０．５ これらのデータは、リンカー−アーム（および、従って該ＡＥ）が広範囲の配列 ダイマ一部位に挿入でき、ハイブリッド化形態においてもエステル加水分解から なお実質的に保護されることを示す。
さらに、本実施例は、これらの均一検定フォーマットで用いた場合、ＤＮＡター ゲットがハイブリッド化ＡＥ−プローブの良好な保護を提供することを示す、ま た、本実施例は、ここで用いた長い（９原子）リンカー−アームが、広範囲のリ ンカー−アーム長が本明細書中に記載するＨＰＡフォーマットで用いることがで きることを確立したこの特許で前で引用した他のリンカー−アームと実質的に同 等の微分加水分解比を生じることも示す。
実施例９ 完全ｌ；対合するターゲットでハイブリッド化したおよび単一のミス対合のター ゲットでハイブリッド化した内部標識化ＡＥ−プローブのｐＨ７，６における安 定性 残基６および７の間に挿入されｌ；内部アミンリンカー−アーム、タイプ「ｘ」 を有するイー・コリからのｒＲＮＡの１６ｓサブユニツトに相補的な２４ｍａｒ プローブを合成した。次いで、実施例１に記載したごとくに該プローブをアクリ ジニウムエステルで標識化し、精製した。その配列は以下のとおりである（＃− リンカーーアーム位置）。
５″−ＣＡＡ　ＧＣＴ＃　ＴＧＣＣＡＧ　ＴＡＴ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＣＡＧ−３ ’このプローブはシイ・ディベルシラス（Ｃ，ｄｉｖｅｒｓｉｕｓ）の１６５サ ブユニツトとともに、位置６（プローブストランドの５′末端からの番号）に単 一のＴ−Ｇミス対合を有する。
実施例８に記載した手順に従って、該プローブをターゲットｒＲＮＡ（この場合 はシー・コリまたはシイ・ディベルシラスいずれか）でハイブリダイズした。得 られｔ；ハイブリッド化プローブならびに非ハイブリッド化プローブの試料の安 定性を実施例７に記載したごとくにｐＨ７，６にて試験した。
安定性 半減期の比 イー・コリ　　１８．６　　０．８　　　　　２３．３シイ・ディ　　　　１． ｌ＊　　０−８　　　　　　　１．４ベルシウス ＊　（実施例２において記載したごとき）ＨＡＰ分析が７３％ハイブリダイゼー イーンを示すように、エステル加水分解の低い半減期は低いハイブリダイゼーシ ョン程度のためではない。
これらのデータは、完全に対合するターゲットでのノ％イブリッドの場合におい ても該ＡＥ−プローブは（これまでの実施例に記載したごとく）エステル加水分 解から保護されるが、単一の塩基のミス対合を含むターゲットでのハイブリッド はほとんど保護されないことを示す。これは完全なターゲットと単一部位ミス対 合ターゲットの間でＡＥ−プローブの加水分解速度１２１７倍の差を生じさせる 。
従って、本明細書中にて記載する方法は単一の塩基の差を含む核酸ターゲット間 を容易に識別区別できる。
実施例１０ 種々の条件下、室温におけるアクリジニウムエステルで内部ラベル化されたハイ ブリッド化および非ノーイブリッド化プローブの安定性 内部ラベル化されたグローブ（挿入、タイプ１、実施例１参照）を実施例８に記 載のシー・トラシーマテイス（Ｃ，ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）　ｒｌｔＮＡＩＰ ｇでハイブリッド化した。実施例７に記載の方法により、種々の試薬およびｐＨ 条件（「結果」参照）下、室温でハイブリッド化および非ハイブリッド化プロー ブの安定性を測定した。
結果： 緩衝液　　　　ｐＨ温度　ハイブリッド　　対照　比率０．２Ｍホウ酸塩　７． ６　　６０℃　　　　３４．１３　　　　０．８９　３８．０８５％トリトン ５％トリトン ０．２Ｍホウ酸塩　９．０　　　室温　　　４６８．７５　　　７．７　　６０ ．８７５％トリトン ５％トリトン ５０１１ＩＭフィチン１０．０　　　室温　　１４５．４８（ｆａｓｔ）本　２ ．１８　６６．７３酸、Ｏ，ＯＳ％ＳＤ５　　　　　　　　３９８．５５（ｓｌ ｏｗ）＊　　　　　（ｆａｓｔ）＊５０ＩＩＩＭフィチン　１１．０　　　室温 　　　１７５．４４　　　１．３１　１３３．９２酸、０．０５％ＳＤＳ ＊：フィチン酸系において、加水分解のカイネチックは２ｒ５１ｏｗＪは加水分 解の後期の遅い相を意味する。
これらのデータにより、広範囲の検定条件に適合できれば、ここに記載の均一保 護検定が機能する種々の条件が存在することが示される。さらに、ホＩ７ｒ！ｉ 塩以外のフィチン酸塩系も可能であり、例えば、非常に高い半減期比が得られる 室温でのフィチン酸系が挙げられる。
実施例１１ アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた緩衝液中のクラ ミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）ｒＲＮ　Ａの希釈系列の検出以下の方法により、 内部ラベル化されｔ；プローブ（実施例２と同様の）をハイブリッド化し、その 標的ｒＲＮ　Ａ（この場合、クラミジア・トラコーマナイス）の量を減少させた 。
ハイブリッド化混合物 ０．５．ｕｌ　プローブ（１２，５ｆｍｏｌ）ｌμＩ　ＲＮＡ（１０−ζ　１Ｏ −３，１０−’または１０−’／Ｊｇ）２μｍ２０％５ＤＳ １．７μｌ　Ｈ，０ ４，８μＩＩＭＰＢ％ｐＨ６，８ 対照混合物はｒＲＮＡの代わりに水を含有する以外はハイブリッド化混合物と同 じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混 合物と同じであった。混合物は６０℃で２０分間インキュベートした。
ハイブリッド化後％Ｉ）Ｈ９の０．２Ｍポレート９０．ｕｌを各サンプルに添加 し、６０℃で１４分間インキュベートした。ついで、インジェクシ１ンｌが０． １％Ｈ，Ｏ，のみであり、インジェクシヨン２のｐＨが１３．２の代わりに１３ ．８であり、読み取り時間が１０秒の代わりに７秒である以外は実施例２に記載 のようにケミルミネッセンスを読み取った。
結果： 試薬ブランク・・・１１６ｒｌｕ 対照・・・ｌ　２４　ｒｌｕ へ杖旦 １０−”ｐｇ　　ｒＲＮＡ−１２６ｒｌｕ　　　　　　２ｒｌ＊１０−’ｐｇ　 　ｒＲＮＡ−２１０ｒｌｕ　　　　　　８６ｒｌｕ１０−”ｐｇ　　ｒＲＮＡ・ ・・ｌ　ｌ　００ｒｌｕ　　　　９７６ｒｌｕＩ　Ｕ”ｐｇ　　ｒＲＮＡ−７８ ０９ｒｌｕ　　７６８５ｒｌｕ試薬ブランクおよび対照は３回平均を表し、その 他はすべて２回平均を表す。
これらの結果により、ここに記載の発明は純粋の緩衝液系において約１０−’μ ｇの感度限界まで標的ｒＲＮＡの線希釈系列を検出できｔ；。
＊何例１２ アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた臨床培地中のク ラミジアｒＲＮＡの希釈系列の検出以下の方法により、内部ラベル化されたプロ ーブ（！Ｊ施何例２ような）を臨床試料中でハイブリッド化し、その標的ｒＲＮ Ａ（この場合、クラミジア・トラコマチス）の量を減少させた。
５０／Ｊｌスロート・スワブ（ｔｈｒｏａｔ　５ｔａｂ）６μｍ　　４．８Ｍ　 　ＰＢ、ｐＨ４，７２／７１　ｒＲＮＡ（３Ｘ　１０−’、３ＸＩＯ−３，３Ｘ ｌＯ−’まＩ；は３×１０−１μｇ） ２μｌ　プローブ（１ｐｍｏｌ） 対照混合物はｒＲＮＡの代わりに水を含有する以外はハイブリッド化混合物と同 じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混 合物と同じであった。混合物は６０℃で２０分間インキュベートした。
ハイブリッド化後、各混合物の１／３（２０μｌ）を最終ｐＨ９の０．２Ｍポレ ート５０μｌに添加しくハイブリッド化混合物した混合物の添加後）、６０℃で ４０分間インキュベートした。ついで、各サンプルについて、実施例１１に記載 のようにケミルミネッセンスを読み取った。
結果： 試薬ブランク・・・１６３ｒｌｕ 対照−６５６０ｒｌｕ λ社風 １０−”ｐｇ　　ｒＲＮＡ−８５３５ｒｌｕ　　　　　　　　１９７５ｒｌｕ１ ０−コｐｇ　　ｒＲＮＡ−２７３０６ｒｌｕ　　　　　　２０７４６ｒｌｕ１０ −’／’ｇｒＲＮＡ−２５８１９４ｒｌｕ　　　２５１６３４ｒｌｕデータは２ 回測定値の平均を表す。
これらのデータにより、ここに記載の発明は臨床培地を含有する系において約１ ０”μｇの感度限界まで標的ｒＲＮＡの線希釈系列を検出できた。
実施例１３ アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた尿中の細菌ｒＲ ＮＡの希釈系列の検出 内部ラベル化されたイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）に対して特異的な３０ｍａｒプ ローブ（実施例２と同様の）を前記のように調製した（アデニン置換、タイプｌ のリンカ−・アーム）。以下の方法により、該プローブを尿中でハイブリッド化 し、その標的ｒＲＮＡ（この場合、イー・コリ）の量を減少させＩ；。
ハイブリッド化混合物 ７９．６μｌ塚 ０．４μｍ　０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ　ＥＧＴＡ１０μｌ、４．８Ｐ Ｂ、ｐＨ６，８ ５μｍ２０％５ＤＳ ５μｍプローブ（０，１２５ｐｍｏｌ）１　ｐｋ　ＲＮＡ（Ｉ　Ｏ−”、１０− ｊｔＶ：ハｌ　Ｏ−’μｇ）対照混合物はｒＲＮＡの代わりに水を含有する以外 はハイブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わり に水を含有する以外は対照混合物と同じであった。混合物は６０℃で３０分間イ ンキュベートした。
ハイブリッド化後、各サンプルにｐＨ９の０．２Ｍポウ酸塩３００μｌを添加し 、６０℃で１６分間インキュベートした。ついで、各サンプルについて、実ｍ例 １１に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。
結果： 試薬ブランク・・・６８４５ｒｌｕ 対照−９２５０ｒｌｕ 負対照 １０−”ｐｇ　　ｒＲＮＡ−９３５８ｒｌｕ　　　　　　　　８ｒｌｕ１０−２ ．ｕｇ　　ｒＲＮＡ−４４０５５ｒｌｕ　　　　４８０５ｒｌｕ１０”μｇ　　 ｒＲＮＡ−６１８００ｒｌｕ　　　５２５５０ｒｌｕ結果は２回測定値の平均を 表す。
これらの結果ｊ；より、ここに記載の発明は床を含有する系において約５ＸｌＯ −”μｇの感度限界まで標的ｒＲＮＡの線希釈系列を検出できた。
実施例１４ アクリジニウムエステルで内部ラベル化されＩ；プローブを用いた臨床培地中の クラミジアｒ　ＲＭ　Ａの希釈系列の検出のための分離工程と組み合わせて用い る選択的分解 内部ラベル化されたプローブ（実施例２のような）を、対照およびブランク混合 物を含む実施例８に記載するような臨床試料（スロート・スラブ）中でハイブリ ッド化した。ハイブリッド化後、各サンプルの１／３を取り除き、実施例８に記 載のように正確に選択的分解に付し、一方、１／３を巣純に取り除き、室温で保 持した（すなわち、選択的分解を行わなかった）。すなわち、選択的分解を行っ たサンプルと、行わなかったサンプルの両方を、以下の点で異なる以外は実施例 ２に記載のようにＨＡＰを用いて非ハイブリッド化プローブから分離しｔ；： ａ、１ｍｌのＨＡＰ溶液を用いた（２０Ｑμ＋の代わりに）、ｂ、ｌｌｌ１ｌの 洗浄液を用いた（２００μｍの代わりに）、ｃ、　３回洗浄した（１回の代わり に）、ｄ、最終のＨＡＰペレットを洗浄液１００μ】中で再懸濁させ、その全体 について、ケミルミネッセンスを測定した（！ｌ！施例何例記載のように）。
結果： 選択的分解 負　　　　　　　　　　ＳＯＢ　　　　正　　　　Ｓ二Ｂ対照（ｒＲＮＡなし） １８　　　−　　　　４．７　　　−１０−”ｐｇ　　ｒＲＮＡ　　　　　２７ 　　　１．５　　　　１０　　　２．１１０−２μｇ　　ｒＲＮＡ　　　１１７ 　　６．５　　　　７０　　　１５１Ｑ”２ｇ　　ｒＲＮＡ　　　９３３　　　 ５２　　　５９１　　１２６０．３３２ｇ　　ｒＲＮＡ　　２７５６　　１５３ 　１７９５　　３７３結果はすでに差し引いた試薬ブランクでを用いての２回測 定値の平均を表す。ＳＯＢはシグナルとバックグラウンドの比であり、すなわち 、対照のケミルミネッセンスにより分割された特定のｒＲＮＡ濃度でのケミルミ ネッセンスである。
これらのデータにより、分離前の選択的デグラデーシ履ンの付加によって高いシ グナル−バックグラウンド比をもたらす低バツクグラウンドとなるため、感受性 を改良する。
実施例１５ 示差加水分解を用いる改良されたストリンジエンシー以下のプローブをタイプ「 Ｘ」（以下の記号＃によって示される挿入位置）の内部リンカ−・アームを含有 するように構成させ、実施例１に記載のようにアクリジニウムエステルでラベル 化し、そして精製しに二 このプローブはナイセリア・ゴノルホエーエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒ ｒｈ。
−ｅａｅ）の１６５サブユニツトに正確に相補的である。しかしながら、それは エヌ・メニンギチディス（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）と密接に関係し、実 施例２および８で引用したハイブリッド化ストリンジエンシー条件下で交叉反応 が典型的に観察される。実施例８に記載のように（２００μｌフオーマツト中で ある以外は）、エヌ・メニンギティデイス０．５μｇを用いてこのプローブをハ イブリッド化し、ｐＨ７，６の０．２Ｍ四ホウ酸塩ナトリウム、５％トリトンＸ １００　　ｌｎｌ中、６０℃で１０分間インキュベートして示差加水分解（＋Ｄ 、Ｈ，）を行うか、またはこれらの示差加水分解条件（−Ｄ、Ｈ，）に付さなか った。
得られたハイブリッドを磁気マイクロスフェア上で分離し、以下に記載のように ケミルミネッセンスを測定した。
磁気アミンマイクロスフェア（米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのアドバ ンスト・マグネチックス社製バイオマグＭ４１００（ＢｉｏＭａｇ　１１４００ ．　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇ ｅ、　Ｍａｓｓ、））１５０μｇを含有するｐＨ６，０の０．４ＭＦＢ１ｍｌを 添加する。１０秒間撹拌する。６０℃で５分間インキュベートする。１０秒間撹 拌する。ペース・メー）　（Ｐａｃｅ−Ｍｔｅ）（登録商標）磁気分離ラック（ 米国カリフォルニア州、サンディエゴのケン・プローブ社（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ 。
Ｔｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）を用いて溶液から球体を磁気的に分 離する。
液体を廃棄する。ｐＨ６，０の０．３Ｍ　ＰＢ　　１ｍｌを添加し、１０秒間撹 拌し、磁気的に分離し、液体を廃棄することにより該球体を洗浄する６合計３回 、洗浄を繰り返す。ｐＨ６，０の０．２Ｍ　ＦＢ　　３００μｌおよび５０％ホ ルムアミドを添加し、１０秒間撹拌し、６０℃で５分間インキュベートし、１０ 秒間撹拌し、ついで溶液から球体を磁気的に分離することによりハイブリッドを 溶離する。該溶液をクリニルマット・チューブ（Ｃｌｉｎｉｌｕｍａｔ　ｔｕｂ ｅ）に移し、実施例７に記載のようにケミルミネッセンスを測定する。
結果： 条件　　　　　　ケミルミネッセンス本−Ｄ、Ｈ，１７８，０３４ ＋Ｄ、Ｈ，７４８ ＊：相対釣元単位（ｒｌｕ）で示されるハイブリッドシグナルから対照シグナル （すなわち、ｒＲＮＡなし）を差し引いたもの。このフォーマット中の正確な標 的（すなわち、エヌ・ゴノルホエーエ）からのシグナルは典型的に７〜１０ＸＩ Ｏｒｌｕである。
結論として、ここに記載の付加的なストリンジエンシー識別工程としての示差加 水分解技術の適用により、所望でない交叉反応配列からのシグナルを非常に減少 する０本案族例においては、エヌ・ゴルノホエーエ・プローブとエヌ・メニンギ ティディスの交叉反応は２００フオルト（ｆｏｌｄ）以上に低下した。示差加水 分解工程は、非ハイブリッド化形態にある場合にグローブのケミルミネッセンス を絶えず減少させ（加水分解により）ることにより、非ハイブリッド化されたプ ローブと平衡にある不安定なハイブリッドに対する感受性を増大させ、したがっ て、交叉反応によるケミルミネッセンスを低下させる。
実施例１６ アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた慢性骨髄性白血 病と合したキメラ標的配列の検出以下のように挿入したタイプｒＸＪの内部リン カ−・アームを含有する２４ＩＩｌｅｒのプローブ（以上に示す配列）を、実施 例１に記載のようにＡＥでラベル化し、精製した： このプローブは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）と合しｔ；キメラｍＲＮＡ転写（コ モン・ブレーク）に相補的であり、ｂｃｒ／ａｂｌプローブと呼ばれている。こ のキメラｍＲＮＡは、ａｂｌ遺伝子の部位をｂｃｒ遺伝子を含有する他の染色体 の部位に転座することにより形成されるキメラ遺伝子の産物である。
ｂｃｒ／ａｂＪｍ的の切断個所接合部位を表す合成りＮＡ　６０ｒＩｌｅｒｌｌ 的および同じ部位中の正常ｂｃｒおよびａｂｌ探的は、実施例１に記載のように 合成された（以下の配列）、また、０ＩＲＮＡ標的は、切断個所の中央付近に位 置するキメラｂａｒ／ａｂｌ遺伝子の４５０　ヌクレオチド断片を含有するｐＧ ＥＭクローンの転写によって生成させる。グローブ・センス（ｐｒｏｂｅ　５ｅ ｎｓｅ）中の同様の４５０ヌクレオチド断片のｍＲＮＡ転写を陰性対照として生 成した。
ＢＣＲ／ＡＢＬプローブ配列 合成標的配列 ＢＣＲ／ＡＢＬ標的 ＡＢＬ標的 前記のように挿入されｔ；星印（＊）はアクリジニウムエステル付加のためのリ ンカ−・アーム挿入位置を示し、下線部分はａｂｌ配列を示す。
実施例８に記載のようｌ二、前記の各探的約１ｐｍｏｌでｂｃｒ／ａｂｌグロー ブをハイブリッド化し、実施例７に記載のようにｐＨ７，６でこれら試験しｌ； 。
結果： 半減期（分）　　　　　　　　比率本 標的：　　　ｂａｒ／ａｂｌ＋＋ＲＮＡ　　　　　　　　２７．７　　３９．６ ｂａｒ／ａｂｌＤＮＡ　　　　　　　　１５．０　　２１．４対照：　　プロー ブ・センスｍＲＮＡ　　　　　Ｏ，７１ａｂｌ　ＤＮＡ　　　　　　　　　　　 　Ｏ，７１ｂｃｒＤＮＡ　　　　　　　　　　　　Ｏ−７１非ハイブリツド化プ ローブ　　　　　　　　０．７　　　　−ネ：探的または対照の半減期／非ハイ ブリッド化プローブの半減期これらのデータにより、ＣＭＬと合したキメラｂｃ ｒ／ａｂｌ　ｍＲＮ　Ａ転写の切断個所接合部位をつなぐために設計されたＡＨ ラベル化プルーブが、ここに記載のＨＰＡ技術によってキメラ標的と正常の配列 （および非ハイブリッド化プローブ）を識別できることが示された。
これは、正常な非キメラ核酸の存在下、特にキメラ標的（典型的には遺伝子疾患 と合した）を検出するのに使用できる証拠である。
さらに本寅何例により、ｒＲＮＡ以外の標的（この場合、１ａＲＮＡおよびＤＮ Ａ）は、ＡＥラベル化プローブにハイブリッド化された場合、ＡＥ加水分解に対 する保護を与えることが示された。
画分番号 第１図 内部標識化プローブ、アデニン置換、タイプ１分 第２図 分 第３図 内部標識化プローブ、挿入、タイプ１ 分 第４図 内部標識化プローブ、挿入、タイプ２ 分 第５図 隣接プローブを有する末端標識化プローブ分 第６図 隣接プローブを有する末端標識化プローブ分 第７図 隣接プローブを有しない末端標識化グローブ分 第８図 国際調査報告

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. １．ａ）媒体またはその一部を、（１）結合相手、分析物または該結合相手と結 合ペアを形成する分析物の類似体からなる部分であって、該部分が結合ペアの構 成員となったときに、非結合形の安定性と比較して安定性が異なる物質と抱合し ている部分と合し、（２）もし、該部分が該分析物または類似体である場合、該 媒体中で該結合相手を合し、 ｂ）該物資の安定性の少ない形を選択的に分解し、ｃ）該物質の分解後に残った 無傷の物質の量を媒体中の分析物の存在または量と関係付けることを特徴とする 媒体中で該結合相手と合して結合ペアを形成する分析物の存在または量を測定す る方法。
  2. ２．ａ）媒体またはその一部を、結合相手が結合ペアの構成員となったときに、 非結合形の安定性と比較して安定性が異なる物質と抱合している結合相手と合し 、 ｂ）該物質の安定性の少ない形を選択的に分解し、ｃ）該物質の分解後に残った 無傷の物質の量を媒体中の分析物の存在または量と関係付けることを特徴とする 媒体中で該結合相手と合して結合ペアを形成する分析物の存在または量を測定す る方法。
  3. ３．ａ）媒体またはその一部を、（１）分析物または結合相手と結合ペアを形成 する分析物の類似体からなる部分であって、該部分が結合ペアの構成員となった ときに、非結合形の安定性と比較して安定性が異なる物質と抱合している部分お よび（２）該結合相手を合し、ｂ）該物質の安定性の少ない形を選択的に分解し 、ｃ）該物質の分解後に残った無傷の物質の量を媒体中の分析物の存在または量 と関係付けることを特徴とする媒体中で該結合相手と合して結合ペアを形成する 分析物の存在または量を測定する方法。
  4. ４．ａ）媒体またはその一部を、分析物に対する第１の結合相手であって、該第 １の結合相手が結合ペアの構成員となったときに、非結合形の安定性と比較して 安定性が異なる物質と抱合している第１の結合相手および（２）該分析物に対す る該第１の結合相手と異なる第２の結合相手を合し、 ｂ）該物質の安定性の少ない形を選択的に分解し、ｃ）該物質の分解後に残った 無傷の物質の量を媒体中の分析物の存在または量と関係付けることを特徴とする 媒体中で該結合相手と合して結合ペアを形成する分析物の存在または量を測定す る方法。
  5. ５．ａ）媒体またはその一部を、ヌクレオチド配列、およびそれに実質的に相補 的なプローブであって、該プローブが該ヌクレオチド配列とハイブリッド形成し たときに、非ハイブリッド化形の安定性と比較して安定性が異なる物質と抱合し ているプローブと合し、ｂ）該物置の安定性の少ない形を選択的に分解し、ｃ） 該物質の分解後に残った無傷の物質の量を媒体中のヌクレオチド配列の存在また は量と関係付けることを特徴とする媒体中のヌクレオチド配列の測定方法。
  6. ６．ａ）媒体またはその一部を、（１）分析物に対する第１の結合相手または結 合反応に関与する結合ペアを形成する該第１の結合相手の類似体からなる部分で あって、該部分が結合ペアの構成員となったときに、非結合形の安定性と比較し て異なる安定性の物質と抱合している部分よび（２）該分析物に対する該第１の 結合相手と異なる第２の結合相手を合し、 ｂ）該物質の安定性の少ない形を選択的に分解し、ｃ）該物質の分解後に残った 無傷の物質の量を媒体中の分析物の存在または量と関係付けることを特徴とする 媒体中で該結合相手と合して結合ペアを形成する分析物の存在または量を測定す る方法。
  7. ７．該物質がＮ−アクリジニウムエステルである請求項１〜６いずれか１つに記 載の方法。
  8. ８．該物質が ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＸはＯ、Ｎ、Ｓ、ハロゲン、置換リン、置換硫黄、置換ホウ素または置 換ヒ素、 ＹはＯ、ＳまたはＮＨ、 Ｒ１はアルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換 アリール、アルコキシ、アリールオキシまたは、Ｘがハロゲンのときはなし、 Ｒ２はＨ、アルキル、アルケニル、アリール、置換アルケニル、置換アリール、 アルコキシ、または、もしそしてＸがＮのときだけ、アリールオキシ、 Ｒ２はＨ、アミノ、ヒドロキシ、チオール、ハロゲン、ニトロ、アミド、アセチ ル、アルキル、アルケニル、アリール、置換アセチル、置換アルキル、置換アル ケニル、置換アリール、アルコキシまたはアリールオキシ、 Ｒ４はアルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニルまたは 置換アリールを意味し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つは化学抱 合できる反応性部位を含む］からなる群から選ばれる請求項１〜６いずれか１つ に記載の方法。
JP50849088A 1987-09-21 1988-09-21 ハイブリダイゼーション保護検定 Expired - Lifetime JP3787352B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9939287A 1987-09-21 1987-09-21
US099,392 1987-09-21

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000133493A Division JP3483829B2 (ja) 1987-09-21 2000-05-02 均一保護検定用組成物
JP2000133506A Division JP3587762B2 (ja) 1987-09-21 2000-05-02 均一保護検定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02503147A true JPH02503147A (ja) 1990-10-04
JP3787352B2 JP3787352B2 (ja) 2006-06-21

Family

ID=22274800

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50849088A Expired - Lifetime JP3787352B2 (ja) 1987-09-21 1988-09-21 ハイブリダイゼーション保護検定
JP2000133506A Expired - Lifetime JP3587762B2 (ja) 1987-09-21 2000-05-02 均一保護検定方法
JP2000133493A Expired - Lifetime JP3483829B2 (ja) 1987-09-21 2000-05-02 均一保護検定用組成物

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000133506A Expired - Lifetime JP3587762B2 (ja) 1987-09-21 2000-05-02 均一保護検定方法
JP2000133493A Expired - Lifetime JP3483829B2 (ja) 1987-09-21 2000-05-02 均一保護検定用組成物

Country Status (12)

Country Link
EP (2) EP0309230B1 (ja)
JP (3) JP3787352B2 (ja)
KR (1) KR960002561B1 (ja)
AT (2) ATE124143T1 (ja)
AU (1) AU633474B2 (ja)
CA (1) CA1339872C (ja)
DE (2) DE3854029T2 (ja)
DK (1) DK244889A (ja)
ES (1) ES2074051T3 (ja)
FI (1) FI892435A (ja)
PT (1) PT88562B (ja)
WO (1) WO1989002476A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998000563A1 (fr) * 1996-06-28 1998-01-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procede de detection d'une activite telomerase

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4948882A (en) * 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
NZ227506A (en) * 1987-12-31 1992-06-25 London Diagnostics Inc Specific binding assays using chemiluminescent compounds
FR2625565A1 (fr) * 1987-12-31 1989-07-07 London Diagnostics Inc Esters, thioesters et amides chimioluminescents perfectionnes, et analyses les utilisant
US4950613A (en) * 1988-02-26 1990-08-21 Gen-Probe Incorporated Proteted chemiluminescent labels
WO1990015159A2 (en) * 1989-05-31 1990-12-13 Gene-Trak Systems Nucleic acid probes for the detection of chlamydia trachomatis
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US6589734B1 (en) 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
JPH03247300A (ja) * 1990-02-23 1991-11-05 Chugai Pharmaceut Co Ltd ヒト白血球抗原の型判定法
DE69132765T2 (de) * 1990-12-24 2002-02-21 Enzo Diagnostics Inc Verfahren zum Nachweis eines Zielpolynukleotids in einer Probe unter Verwendung eines Reagenz, das den Hintergrund verringert, und eine dieses Reagenz enthaltende Zusammensetzung und Kit.
GB9114525D0 (en) * 1991-07-05 1991-08-21 Delnatte Sabine Homogeneous nucleic acids probe based tests and substances
US5424413A (en) * 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
US6093538A (en) * 1992-05-06 2000-07-25 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to ureaplasma
AU681082B2 (en) * 1992-05-06 1997-08-21 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
CA2137563C (en) * 1992-06-08 2005-06-28 Thomas B. Ryder Preparation of nucleic acid from mononuclear cells
KR960704065A (ko) * 1993-07-19 1996-08-31 다니엘 엘. 캐시앙 올리고뉴클레오티드 스크리닝 검정법(Oligonucleotide Screening Assay)
US5739309A (en) * 1993-07-19 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enhancement of oligonucleotide inhibition of protein production, cell proliferation and / or multiplication of infectious disease pathogens
AU688364B2 (en) * 1993-07-19 1998-03-12 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides with activity against human immunodeficiency virus
WO1995003430A1 (en) * 1993-07-23 1995-02-02 Gen-Probe Incorporated Methods for enhancing nucleic acid amplification
JP3866762B2 (ja) * 1993-11-29 2007-01-10 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 広範な生物からの核酸抽出法
US5733781A (en) 1994-07-19 1998-03-31 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides and methods for inhibiting propagation of human immunodeficiency virus
US5514551A (en) * 1994-10-14 1996-05-07 Gen-Probe Incorporated Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis
DE69535240T2 (de) * 1994-10-28 2007-06-06 Gen-Probe Inc., San Diego Zusammensetzungen und Verfahren für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung von einer Mehrheit spezifischer Nuklein Säure Sequenzen
DE69609161T2 (de) * 1995-01-19 2001-03-22 Gen Probe Inc Amplifikationsoligonukleotide und sonden für borrelia, die mit lyme kranheit assoziiert sind
DE19519973A1 (de) * 1995-05-31 1996-12-05 Boehringer Mannheim Gmbh Entstörungsreagenz für die Bestimmung eines Analyten mit einem lumineszenzfähigen Metallkomplex
US5747252A (en) 1995-06-07 1998-05-05 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes and amplification oligonucleotides for Neisseria species
WO1996041178A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Gen-Probe Incorporated Micelle protection assay
US5731148A (en) * 1995-06-07 1998-03-24 Gen-Probe Incorporated Adduct protection assay
US5879885A (en) * 1995-06-07 1999-03-09 Gen-Probe Incorporated Compositions for detecting and quantifying biological samples
US5783453A (en) * 1995-06-29 1998-07-21 Chiron Diagnostics Corporation Non-separation specific binding chemiluminescent assay
ATE423622T1 (de) 1998-05-01 2009-03-15 Gen Probe Inc Automatisches isolierungs- und amplifizierungsverfahren für eine zielnukleinsäuresequenz
US7108980B1 (en) 1998-08-07 2006-09-19 Boston Probes, Inc. Methods for the analysis of microcolonies of bacteria and yeast
US6280946B2 (en) 1998-08-07 2001-08-28 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the universal detection of bacteria and eucarya
CA2286414A1 (en) * 1999-10-04 2001-04-04 Zhibo Gan Non-separation heterogenous assay for biological substance
ATE519861T1 (de) 2002-06-14 2011-08-15 Gen Probe Inc Zusammensetzungen zum nachweis von hepatitis-b- virus
WO2004106923A1 (en) * 2003-05-28 2004-12-09 Amersham Biosciences Uk Limited Differential analysis of cell surface proteins on closed membrane structures by labelling with dyes in the presence of an internal standard
JP5514401B2 (ja) 2005-09-21 2014-06-04 国立大学法人広島大学 Ｇテイル配列の長さ測定方法及びそれに用いるキット
CA2768768C (en) 2009-06-23 2021-08-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acid from mollicutes
WO2011103274A1 (en) 2010-02-17 2011-08-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid
EP2752671A3 (en) 2010-07-23 2016-08-24 Beckman Coulter, Inc. System or method of including analytical units
AU2012249751B2 (en) 2011-04-25 2016-11-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid
WO2013036928A1 (en) 2011-09-08 2013-03-14 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
BR112014010955A2 (pt) 2011-11-07 2017-06-06 Beckman Coulter Inc sistema e método para processar amostras
JP6190380B2 (ja) 2011-11-07 2017-08-30 ベックマン コールター， インコーポレイテッド 等分機システムおよびワークフロー
JP2014532881A (ja) 2011-11-07 2014-12-08 ベックマン コールター， インコーポレイテッド 標本輸送システムのための磁気制動
EP2776843B1 (en) 2011-11-07 2019-03-27 Beckman Coulter, Inc. Centrifuge system and workflow
CN104040352B (zh) 2011-11-07 2016-09-07 贝克曼考尔特公司 机械臂
EP2776844B1 (en) 2011-11-07 2020-09-30 Beckman Coulter, Inc. Specimen container detection
AU2013205122B2 (en) 2012-10-11 2016-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Human Papillomavirus Nucleic Acid
JP6898736B2 (ja) 2013-08-14 2021-07-07 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド Ｈｅｖ核酸を検出するための組成物および方法
US10865433B2 (en) 2015-01-09 2020-12-15 Gen-Probe Incorporated Reaction mixtures for diagnosing bacterial vaginosis
EP3910075A1 (en) 2015-03-16 2021-11-17 Gen-Probe Incorporated Kits for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis
CA3010232A1 (en) 2016-01-04 2017-07-13 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting candida species
AU2017278065B2 (en) 2016-06-10 2020-09-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Zika virus nucleic acid
EP3529381B1 (en) 2016-10-19 2022-07-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis c virus
WO2018094171A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis b virus
EP3601617B3 (en) 2017-03-24 2024-03-20 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus
CA3225653A1 (en) 2017-03-25 2018-10-04 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions to detect rhinovirus nucleic acids
JP7292217B2 (ja) 2017-06-07 2023-06-16 ジーイーエヌ－プローブ・インコーポレーテッド 試料中のバベシア種の核酸の検出
US11859257B2 (en) 2017-08-11 2024-01-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Staphylococcus aureus
EP3710595A1 (en) 2017-11-17 2020-09-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting c1orf43 nucleic acid
WO2019116234A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Nestec S.A. Methods for determining microbiome ribosomal rna composition changes
JP2021506274A (ja) 2017-12-15 2021-02-22 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 毒素産生Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを検出するための組成物および方法
AU2019286648B2 (en) 2018-06-13 2023-11-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group B Streptococcus nucleic acid
WO2020028631A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acids of epstein-barr virus
AU2019326462A1 (en) 2018-08-21 2021-03-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus
AU2019324196A1 (en) 2018-08-24 2021-03-18 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis
EP3856934A2 (en) 2018-09-27 2021-08-04 Gen-Probe Incorporated COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING BORDETELLA PERTUSSIS AND BORDETELLA
PARAPERTUSSIS NUCLEIC ACID
CN113195743A (zh) 2018-10-22 2021-07-30 简·探针公司 扩增，检测或定量人类多瘤病毒bk病毒的组合物和方法
TW202030333A (zh) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
EP3914732A1 (en) 2019-01-25 2021-12-01 Gen-Probe Incorporated Detection of drug-resistant mycoplasma genitalium
US20220098647A1 (en) 2019-03-22 2022-03-31 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Group A Streptococcus
WO2021178644A1 (en) 2020-03-04 2021-09-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting sars-cov-2 nucleic acid
EP4146821A1 (en) 2020-05-07 2023-03-15 Grifols Diagnostic Solutions Inc. Methods and compositions for detecting sars-cov-2 nucleic acid
US20240218469A1 (en) 2021-05-14 2024-07-04 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting human adenovirus nucleic acid
EP4382621A2 (en) 2021-07-27 2024-06-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting c. coli and at least one of salmonella, c. jejuni, shigella, and stec
WO2024054924A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers
WO2024081776A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Gen-Probe Incorporated Cellularity control for nucleic acid assays
WO2024137379A2 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4018530A (en) * 1975-11-18 1977-04-19 Block Engineering, Inc. Fluorescence spectrometry employing excitation of bleaching intensity
FR2422956A1 (fr) * 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
US4358535A (en) * 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
EP0082636B2 (en) * 1981-12-11 2006-10-18 The Welsh National School of Medicine Luminescent labelling materials and procedures
US4605735A (en) * 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4737454A (en) * 1983-07-14 1988-04-12 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
US4683194A (en) * 1984-05-29 1987-07-28 Cetus Corporation Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences
JP2509574B2 (ja) * 1985-08-15 1996-06-19 アモコ・コーポレーション 標識付けした核酸
AU630076B2 (en) * 1987-09-21 1992-10-22 Gen-Probe Incorporated Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998000563A1 (fr) * 1996-06-28 1998-01-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procede de detection d'une activite telomerase

Also Published As

Publication number Publication date
FI892435A0 (fi) 1989-05-19
JP3483829B2 (ja) 2004-01-06
ATE220796T1 (de) 2002-08-15
DE3854029D1 (de) 1995-07-27
JP2000350599A (ja) 2000-12-19
EP0638807B1 (en) 2002-07-17
EP0309230A2 (en) 1989-03-29
DK244889A (da) 1989-06-20
ES2074051T3 (es) 1995-09-01
JP3787352B2 (ja) 2006-06-21
WO1989002476A1 (en) 1989-03-23
DE3854029T2 (de) 1995-10-26
EP0638807A1 (en) 1995-02-15
AU2554188A (en) 1989-04-17
KR890701766A (ko) 1989-12-21
JP3587762B2 (ja) 2004-11-10
DK244889D0 (da) 1989-05-19
KR960002561B1 (ko) 1996-02-22
EP0309230B1 (en) 1995-06-21
DE3856535D1 (de) 2002-08-22
AU633474B2 (en) 1993-02-04
EP0309230A3 (en) 1990-07-11
ATE124143T1 (de) 1995-07-15
PT88562A (pt) 1989-07-31
CA1339872C (en) 1998-05-19
PT88562B (pt) 1994-02-28
JP2000350598A (ja) 2000-12-19
DE3856535T2 (de) 2002-11-14
FI892435A (fi) 1989-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH02503147A (ja) 均一保護検定
US5639604A (en) Homogeneous protection assay
US5283174A (en) Homogenous protection assay
US6004745A (en) Hybridization protection assay
EP0747706B1 (en) Adduct protection assay
US4743535A (en) Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid
US5705346A (en) Method for detecting a target nucleic acid by using an interaction of two kinds of reagents
US5688643A (en) Method of nucleic acid-differentiation and assay kit for nucleic acid differentiation
US6566068B2 (en) Process for detecting a nucleic acid of interest using an oligo- or polynucleotide probe and intercalators
CA2129444A1 (en) Amplification of assay reporters by nucleic acid replication
EP0144913A2 (en) Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid
JP5341291B2 (ja) ディップスティック検定における改良型結合相互作用
WO1995026416A1 (en) Nucleic acid biosensor diagnostics
JP3008690B2 (ja) リガンドまたはレセプターの測定法
JP4236281B2 (ja) ミセル保護アッセイ
JPS60179657A (ja) 標識プロ−ブ及び抗−ハイブリツドを用いるハイブリツド形成分析法
Bronstein et al. [29] Detection of DNA in southern blots with chemiluminescence
JP3706636B2 (ja) 核酸ハイブリッド体の検出方法、プローブ、標的核酸の有無の確認方法、および２本鎖核酸ハイブリッド内のミスマッチの検出方法
JP3618768B2 (ja) 標的核酸の検出方法、プローブ、２本鎖核酸ハイブリッド内のミスマッチの検出方法及びプローブの製造方法
NO892043L (no) Fremgangsmaate og preparat for diagnose.
CA1250230A (en) Hybridization assay employing labeled probe and anti- hybrid
WO1995018867A1 (en) Hydridisation assay and reagents

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060210

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20060327

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090331

Year of fee payment: 3