DE69609161T2

DE69609161T2 - Amplifikationsoligonukleotide und sonden für borrelia, die mit lyme kranheit assoziiert sind

Info

Publication number: DE69609161T2
Application number: DE69609161T
Authority: DE
Inventors: Nick Carter; J. Hogan; Yeasing Yang
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1995-01-19
Filing date: 1996-01-18
Publication date: 2001-03-22
Anticipated expiration: 2016-01-19
Also published as: JPH10503382A; JP4070394B2; US6074826A; AU689375B2; AU4764496A; CA2209991A1; CA2209991C; JP3124036B2; ATE194391T1; WO1996022392A2; WO1996022392A3; JP2008022858A; JP2001078789A; DK0805876T3; EP0805876B1; ES2150103T3; EP0805876A2; DE69609161D1

Description

Bereich der Erfindung

Die hier beschriebenen und beanspruchten Erfindungen beziehen sich auf den Entwurf und die Verwendung von Amplifikations- Oligonukleotiden und Nukleinsäure-Sonden für mit der Lyme- Krankheit assoziierte Borrelia Organismen, die die Detektion des Organismus in Testproben, zum Beispiel aus Gewebsproben, aus Körperflüssigkeiten und aus Kulturen erlauben.

Hintergrund der Erfindung

Die Lyme-Krankheit ist eine häufig diagnostizierte Krankheit des Menschen und ist die am stärksten verbreitete von Zecken übertragene Krankheit in Nordamerika, Europa und anderen Teilen der Welt mit einem gemäßigten Klima. Siehe, A. G. Barbour & D. Fish, Science 260: 1610-16 (1993); J. F. Anderson, Rev. Insect. Dis. 11: 51451-59 (1989); A. C. Steere, N. Engl. J. Med. 331: 586-96 (1989). Die Lyme-Krankheit oder Lyme borreliosis ist eine mehrstufige Infektion, die durch Borrelia-Spirochäten hervorgerufen wird. Der Borrelia-Organismus wird auf Menschen und Tiere durch infizierte Ixodes-Zecken übertragen. Der Weißschwanzhirsch und die Weißfußmaus, Peromyscus leucopus, dienen jeweils für die erwachsene Zecke und Larvenformen als primäre Sammelbecken in der Natur.
Die Lyme borreliosis Infektion in Menschen und Tieren ruft eine Anzahl von unterschiedlichen klinischen Erscheinungen, abhängend vom Stadium der Infektion, hervor. Die frühe Infektion bei Menschen ist gewöhnlich eine grippeartige Krankheit mit einem charakteristischen Hautausschlag, Erythema migrans genannt. Die Erythema migrans breitet sich kreisförmig aus und bildet gewöhnlich Ringe. Die Erythema migrans entwickelt sich üblicherweise innerhalb von 1-5 Wochen nach einem Zeckenbiss und löst sich spontan in einigen Wochen oder Monaten auf. Siehe, H. W. Pfister et al., Lancet 343: 1013 (1994).
Innerhalb von ein paar Wochen bis einigen Monaten nach der Infektion durch Borrelia kann sich die Infektion auf verschiedene Organe, einschließlich des Gehirns, der Nerven, der Augen, der Gelenke und des Herzens ausbreiten. Diese Ausbreitung der Infektion deutet darauf hin, dass die Krankheit sich im Stadium II befindet. Neurologische Kennzeichen der Lyme borreliosis schließen Meningoradiculoneuritis (Bannwarth's Syndrom), Meningitis, kraniale Neuritis des Gesichtsnerven, Neuritis plexus, Mononeuritis multiplex und seltener Enzephalitis, Myelitis, cerebrale Vasculitis, CSF Lymphozyten Pleozytose ein.
Lyme karditis ist ein ernsthafter Gesundheitszustand und zeichnet sich im allgemeinen durch den vorübergehenden atrioventrikulären Block verschiedenen Ausmaßes, Rythmusstörungen, Myoperikarditis und Herzversagen aus. Gewöhnliche Symptome der Lyme karditis schließen Herzklopfen, Brustkastenbeschwerden, Atemnot, Bewegungsschwindel und Adams- Stokes Anfälle ein.
Die Lyme borreliosis Infektion des Muskel/Skelett-Systems ruft Symptome wie z. B. Myalgie, Arthralgie, Arthritis, Myositis und Lymphadenopathie hervor. Die Borrelia-Infektion der Augen entwickelt Symptome wie z. B. Konjunktivitis, Iridozyklitis, Choroiditis, Neuropathie der Augen mit Pupillenödem, Panophthalmitis. Die Infektion der anderen Organe kann Hepatomegalie, Hepatitis, Husten und testikuläre Schwellungen hervorrufen.
Nach Monaten bis Jahren der Infektion kann chronische Organschädigung auftreten, die darauf hinweist, dass die Lyme borreliosis das Stadium III erreicht hat. Die Symptome dieses Stadiums schließen chronische Arthritis, monoartikuläre Arthritis, oligoartikuläre Arthritis, Akrodermatitis chronica atrophicans, Enzephalitis, Myositis, Keratitis, chronische Polyneuropathie und dilatative Kardiomyopathie ein.
Die als Verursacher der Lyme borreliosis bekannten Borrelia- Spirochäten wurden ursprünglich als Borrelia burgdorferi bezeichnet, die aber mittlerweile in drei wesentliche genomische Arten eingestuft sind. Siehe, R. T. Marconi & C. F. Guron, J. Clin. Microbiol., 30: 2830-34 (1992). Eine Gruppe behielt die Artenbezeichnung B. burgdorferi bei, eine zweite wurde als Borrelia aarinii bezeichnet und der dritten Gruppe wurde bis jetzt noch kein Artenname zugeordnet und es wird auf sie als die VS461 Gruppe verwiesen.
Die andere Borrelia-Art, B. hermsii, ist eng mit B. burgdorferi verwandt, wobei sie aber für eine andere Krankheit des Menschen, das Rückfallfieber, verantwortlich ist. Durch DNA- Hybridisierung wurde B. hermsii als zur gleichen Art wie B. parheri und B. turicatae gehörig charakterisiert, obwohl jede für einen speziellen Arthropoda als Vektor spezifisch ist (Barberi & Hayes, Microbiol. Rev. 50: 381-400, 1986). Zwei andere Borrelia-Arten, B. anserina und B. coriaceae, sind eng mit B. burgdorferi verwandt, wobei diese aber für Menschen nicht infektiös sind.
Borrelia-Organismen haben wie die anderen Spirochäten eine gewellte Gestalt und Flagellen. A. G. Barbour & S. F. Hayes, Microbiol. Rev., 50: 381-400 (1986). Diese Organismen besitzen zudem ein Chromosom und mehrere extrachromosomale Elemente, die eher linear als zirkulär sind. A. G. Barbour & C. F. Garon, Science, 237: 409 (1987). Verschiedene zur Oberfläche exponierte Lipoproteine, OspA und OspB, wurden identifiziert und als antigene Marker in serologischen Labortests verwendet.
Die Kultivierung von Borrelia-Organismen aus Körperflüssigkeiten ist schwierig, so dass die mikrobiologische Diagnose der Lyme borreliosis durch Kultivierung unbefriedigend ist. Serologische Tests zur Detektion von B. burgdorferi, einschließlich des Enzymimmunotests (ELISA), des indirekten Immunofluoreszenztests (IFA) und von Western-blots wurden entwickelt. Siehe M. G. Golightly, Am. J. Clin. Pathol., 99: 168- 74 (1993). Jedoch ist die Standardisierung gering, falsch- positive und falsch-negative Ergebnisse treten bei diesen serologischen Tests auf und begrenzen deren Anwendbarkeit. Siehe Barbour, Ann. Intern. Med., 110: 504 (1989). Patienten mit einer frühen Infektion (Stadium I) oder einer des Stadiums II können möglicherweise noch keine detektierbaren Mengen an Antikörpern entwickelt haben und Kreuzreaktionen mit Treponema oder anderen Borrelia, die nicht mit der Lyme-Krankheit assoziiert sind, könnten auftreten. Die Behandlung mit Antibiotika kann auch die Entwicklung von detektierbaren Antikörpern in Lyme borreliosis Patienten verhindern oder verzögern. Zusammengenommen begrenzen diese Unzulänglichkeiten die Anwendbarkeit und die Zuverlässigkeit der serologischen Tests in der Diagnose und der Behandlung von Lyme borreliosis.
Die Verwendung von Oligonukleotiden mit spezifischen Nukleotidsequenzen als Sonden für die Erkennung von infektiösen Agenzien entwickelt sich zu einer Alternative zu den problematischen immunologischen Nachweistests. Zumindest ein Teil der sowohl genomischen als plasmidischen DNA-Sequenzen von Borrelia liegen vor. Siehe Schwan et al., J. Clin, Microbiol., 27: 1734 (1989); Schwan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 539: 419 (1988). Nukleinsäure-Hybridisierungs-Sonden, die von dem linearen Plasmid aus B. burgdorferi abgeleitet wurden, wurden hergestellt und zum Identifizieren von B. burgdorferi neben einer Anzahl von Borrelia-Arten verwendet. Natürlicherweise waren diese Sonden nur begrenzt einsetzbar, da ihre Nukleotidsequenzen von Plasmiden abgeleitet wurden, welche mit der Zeit instabil werden können oder in pathogenen Borrelia- Isolaten fehlen können. Andere Nukleinsäure-Hybridisierungs- Sonden, die auf spezifische Borrelia-Gene gerichtet sind, sind natürlicherweise ebenfalls in der Anwendbarkeit durch das Ausmaß der evolutionären Stabilität der Target-Gene eingeschränkt. Siehe z. B. Malloy et al., J. Clin. Microbiol., 28: 1089 (1990), Lebach et al., J. Clin. Microbiol., 29: 731-737 (1991); und Goodman et al., Infect. Imun., 59: 269-278 (1991).
Zufällig klonierte B. burgdorferi DNA-Sequenzen wurden zur Konstruktion von Nukleinsäure-Primern verwendet und diese Primer wurden zum Amplifizieren von Target-DNA-Sequenzen in B. burgdorferi eingesetzt. Siehe Rosa et al., J. Infect. Dis., 160: 1018 (1989). Es wurden jedoch nicht alle B. burgdorferi Isolate detektiert, so dass diese Nukleinsäure-Primer zur Detektion von allen B. burgdorferi, die die Lyme-Krankheit hervorrufen, unbefriedigend sind.
Die ribosomalen RNA(rRNA)-Gene von B. burgdorferi wurden durch Fukunaga & Sohnaka und Postic et al. kartiert und kloniert, Fukunaga und Sohnaka, Biochem. Biophys. Res. Comm., 183: 952-57 (1992), Postic et al., Res. Microbiol., 141: 465-475 (1990). B. burgdorferi ist ungewöhnlich, indem es scheinbar pro Chromosom zwei Kopien des 23S rRNA-Gens enthält und nur eine Kopie des Gens, das für die 16S rRNA kodiert. (Fukanaga et al., J. Gen. Microbiol. 138: 871-877, 1992). Die Sequenz der Borrelia 16S rRNA wurde zur Konstruktion von Hybridisierungs-Sonden verwendet, welche kultivierte B. burgdorferi Organismen detektieren konnten. Siehe Marconi et al., J. Clin. Microbiol., 30: 628-32 (1992). Die Anwendbarkeit der Sonden zum Detektieren von B. burodorferi in klinischen Proben ohne Kultivierung der Organismen wurde nicht nachgewiesen.
Zur Überwindung dieser Einschränkungen wurde auch die Nukleinsäure-Amplifikation von ribosomalen RNA-Sequenzen beschrieben, wobei ein Primer-Paar mit umfassender Spezifität zum Amplifizieren der Borrelia 16S rDNA verwendet wurde. Siehe Malloy et al., J. Clin., Microbiol., 28: 1089-93 (1990). Jedoch amplifizierten die verwendeten Nukleinsäure-Primer auch S. aureus und P. aeruginosa und waren somit nicht spezifisch für Borrelia burgdorferi.
Vier, von den 16S rRNA Sequenzen abgeleitete Sätze an Primern, wurden zum Amplifizieren der DNA der drei verschiedenen genomischen Borrelia-Klassen verwendet. Siehe R. T. Marconi und C. F. Baron; J. ClintMicrobiol., 30: 2830-34 (1992). Nur ein Satz an Primern, welcher von den Positionen 819-842 und 1153- 1173 der Borrelia 16S rRNA abgeleitet wurde, detektierte alle Borrelia-Organismen, die in den verschiedenen getesteten, kultivierten Lyme-Krankheit Isolaten vorlagen. Die andere Primer-Sätze versagten entweder bei der Erkennung aller drei Gruppen der Lyme-Krankheit Borrelia oder erkannten auch Borrelia, die nicht mit der Lyme-Krankheit assoziiert sind. Die anderen Primer-Sätze versagten beim Amplifizieren der Gesamtheit der verschiedenen Borrelia-Organismen, die aus klinischen Isolaten kultiviert wurden.
Die Amplifikation einer 16S rRNA Untersequenz und die von Untertypen der Borrelia burgdorferi, welche in der V4-Region des 16S rRNA Gens variieren, wurde durch Adam et al. beschrieben, Adam et al., Infect. Immun., 59: 2579-85 (1991). Die PCR-Primer wurden zum amplifizieren einer spezifischen Region der 23S rRNA von B. burgdorferi und zum Unterscheiden von B. burgdorferi von anderen Borrelia-Arten verwendet. Siehe Schwartz et al., J. Clin. Micro. 30: 3082 (1992).
Andere zu Borrelia 16S rRNA Sequenzen komplementäre Sonden wurden durch Weisburg beschrieben, Weisburg, EP- Veröffentlichungs-Nr. 0421 725A, Anmeldungs-Nr. 90310766.2. White und Dodge, WO 91/14002 (PCT/US91/01574), offenbaren Primer und Sonden, die von dem 16S rRNA Gen aus B. burordorferi und B. hermsii abgeleitet wurden.
Wegen der gegenwärtigen Einschränkungen bei der serologischen Detektion und Identifikation der Lyme-Krankheit existiert ein Bedarf für ein empfindliches Verfahren zur Detektion sämtlicher geografischer Isolate von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia.

Beschreibung der Erfindung

Die vorgestellte Erfindung offenbart und beansprucht neue und nützliche Amplifikations-Oligonukleotide, Helfer- Oligonukleotide und Oligonukleotid-Hybridisierungstest-Sonden, welche so gestaltet sind, dass sie komplementär zu spezifischen Regionen der rRNA (ribosomale RNA) oder rDNA (ribosomale DNA) Nukleotidsequenzen von Borrelia sind oder Oligonukleotide mit einer Nukleinsäuresequenz, die im wesentlichen einem spezifischen Teil der Borrelia rRNA oder rDNA Nukleotidsequenz oder deren Komplementären entsprechen. Da diese Amplifikations- Oligonukleotide, Helfer-Oligonukleotide und Hybridisierungstest-Sonden von der 16S und 23S rRNA der pathogenen Borrelia abgeleitet sind, wurde aufgrund der höheren Menge an RNA, die von diesen rRNA Genen exprimiert wird, der langsamen Geschwindigkeit von Nukleinsäuresequenz-Veränderungen und des Fehlens der lateralen Übertragung von rRNA Sequenzen zwischen Organismen, ein hervorragender Detektionstest erhalten.
Die Amplifikations-Oligonukleotide und Oligonukleotid- Hybridisierungstest-Sonden werden zur Hybridisierung mit den Target-Gen-Sequenzen von Borrelia 16S und 23S rRNA und/oder rDNA unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen eingesetzt. In bevorzugten Ausführungsformen können die hier beschriebenen Sonden und Amplifikations-Oligonukleotide, die mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, einschließlich Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii und Borrelia der Gruppe V5461 von anderen, in klinischen Proben, wie z. B. im Blut oder in Geweben gefundenen Mikroorganismen und von anderen Arten der Borrelia unterscheiden. Dementsprechend können die Amplifikations-Oligonukleotide und die Hybridisierungstest- Sonden in einem Test zur spezifischen Detektion und/oder Quantifizierung von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen sind die hierin beschriebenen Hybridisierungstest-Sonden fähig, selektiv mit den Nukleinsäuren von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia zu hybridisieren und unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen nicht mit jenen von Borrelia hermsii. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst die Hybridisierungstest-Sonde ein Oligonukleotid, welches eine Reportergruppe enthält, wie z. B. einen Acridiniumester oder ein Radioisotop zur leichteren Identifizierung der Hybridisierung der Sonde an seine Target- Sequenz. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung besitzt das Amplifizierungs-Oligonukleotid wahlweise eine Nukleinsäuresequenz, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder welche die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA Polymerase verstärkt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Hybridisierungstest- Sonden, die zur Detektion auf die Anwesenheit von Nukleinsäuren aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia und Borrelia hermsii nützlich sind. Bevorzugt werden die Hybridisierungstest-Sonden aus den folgenden Nukleotidsequenzen ausgewählt:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,
SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC,
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,
SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Hybridisierungstest- Sonden, die zur Detektion von Nukleinsäuren aus mit der Lyme- Krankheit assoziierten Borrelia nützlich sind. Diese Hybridisierungstest-Sonden werden bevorzugt aus den folgenden Nukleotidsequenzen ausgewählt:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Hybridisierungstest- Sonden, die zur Detektion von Nukleinsäuren aus Borrelia hermsii nützlich sind. Diese Hybridisierungstest-Sonden weisen bevorzugt eine Nukleotidsequenz auf, die aus einer der folgenden Nukleotidsequenzen ausgewählt ist:
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,
SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,
SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sondenmischung, welche eine Hybridisierungstest-Sonde der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem Helfer-Oligonukleotid (Sonde) umfasst. Bevorzugt werden die Helfer-Oligonukleotide zum Erleichtern der spezifischen Hybridisierung der Testsonde mit deren Target-Nukleinsäure verwendet. Die Helfer- Oligonukleotide wurden durch Hogan and Milliman in U.S. Patent No. 5,030,557 beschrieben, welches sich mit der vorliegenden Erfindung der gleichen Eigentümerschaft erfreut. Die in dieser Erfindung als Helfer-Sonden verwendeten Oligonukleotide, schließen die folgenden Sequenzen ein:
SEQ ID NO 3: TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG,
SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA,
SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,
SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,
SEQ ID NO 14: UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG,
SEQ ID NO 15: CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA,
SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU,
SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG,
SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA,
SEQ ID NO 27: TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG,
SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUA und
SEQ ID NO 29: UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur Detektion von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, wobei Nukleinsäure-Hybride aus einem Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung und einer spezifischen Region eines Nukleotid-Polymers aus einer mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia gebildet werden. Im allgemeinen enthält das Nukleotid-Polymer eine Nukleinsäure- Sequenz, die wesentlich einer Oligonukleotid-Sequenz der vorliegenden Erfindung entspricht und die von der für die ribosomale RNA von Borrelia kodierende rRNA oder rDNA abgeleitet ist. Das in diesen Zusammensetzungen vorliegende Oligonukleotid kann ein Amplifikations-Oligonukleotid, ein Helfer-Oligonukleotid, eine Hybridisierungstest-Sonde oder eine Kombination dessen sein. Somit können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere Amplifikations- Oligdnukleotide, ein oder mehrere Helfer-Oligonukleotide und ein oder mehrere Hybridisierungstest-Sonden enthalten.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die eine mit deren Target-Sequenz hybridisierte Sonde enthalten, sind nützlich zur Detektion der Anwesenheit einer Nukleinsäure- Sequenz. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die ein Helfer-Oligonukleotid enthalten, das mit dessen Target- Nukleinsäure-Sequenz hybridisiert ist, sind nützlich für die Freilegung eines speziellen Abschnitts der Target-Nukleinsäure für die Hybridisierung. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung die einen Oligonukleotid-Primer enthalten, der mit dessen Target-Sequenz hybridisiert ist, sind für die Bildung einer Initiationsstelle am 3'-Ende des Primers für eine Polymerase nützlich.
Die vorliegende Erfindung betrachtet auch Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, in welchem eine Testprobe mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen zusammengebracht wird, wobei die Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde in der Lage ist, an Target-Nukleinsäure-Sequenzen von Borrelia burgdorferi und nicht an Nukleinsäure-Sequenzen von Borrelia hermsii zu hybridisieren. Die vorliegende Erfindung betrachtet auch Oligonukleotide und deren in diesen Verfahren verwendeten Äquivalente, welche wahlweise ein Reportermolekül enthalten, das die Identifikation der Hybridisierung der Sonde an deren Target-Sequenz erleichtert. Diese Erfindung ist nützlich zur Detektion auf die Anwesenheit von Borrelia-Nukleinsäuren in Testproben vom Menschen, wie z. B. Blut, aus dem Blut gewonnene Proben, Geweben, aus Geweben gewonnene Proben, andere Körperflüssigkeiten und Körperproben.
Die vorliegende Erfindung betrachtet auch Verfahren zur Detektion auf die Anwesenheit von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, in welchen die Nukleinsäure unter Verwendung mindestens eines Amplifikations-Oligonukleotids der vorliegenden Erfindung amplifiziert wird. In bevorzugten Ausführungsformen folgt dieser Amplifikation anschließend ein Detektions-Schritt, in welchem die amplifizierte Nukleinsäure unter Verwendung einer Oligonukleotid-Hybridisierungstest-Sonde der vorliegenden Erfindung detektiert wird. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung betrachten auch die Verwendung von Amplifikations-Oligonukleotiden, welche die Nukleotid-Sequenz für einen RNA-Promoter einschließen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Amplifikations- Oligonukleotide, die in einem Amplifikations-Test zur Detektion von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Spirochäten, einschließlich Borrelia burgdorferi, anwendbar sind. Diese Oligomere entsprechen im wesentlichen bevorzugt einer der folgenden Nukleotidsequenzen:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA,
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,
SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU,
SEQ ID NO 45: CCACCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA,
SEQ ID NO 46: CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACWCCUCUAUCA,
SEQ ID NO 47: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU,
SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGWCGGG,
SEQ ID NO 49: GCACUCAUCAUCACAUCAAAGCUC und
SEQ ID NO 50: CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG,
wobei das Oligomer nicht modifiziert sein muß oder eine Modifikation enthalten kann, wie z. B. die Erweiterung durch eine spezifische Nukleinsäuresequenz am 5-Terminus, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird (einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, der Promotersequenz für die T7, T3 oder SP6 RNA-Polymerase) und/oder Sequenzen, welche die Initiation oder Verlängerung der RNA-Transkription durch eine RNA-Polymerase verstärken. Ein Beispiel für eine Promotersequenz ist die Sequenz SEQ ID NO. 43 5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'. Andere Beispiele von nützlichen Promotersequenzen sind in verschiedenen kommerziell erhältlichen Vektoren, einschließlich z. B. in den pBluescript® Vektoren von Stratagene Cloning Systems oder in den pGEM® Vektoren von Promega Biotec enthalten.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung binden die Amplifikations-Oligonukleotide an Sequenzen oder verursachen die Verlängerung über Sequenzen, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entsprechen:
SEQ ID NO 36: ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT,
SEQ ID NO 37: TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATAGAGGAAG,
SEQ ID NO 38: TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGGGTGG,
SEQ ID NO 39: ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT,
SEQ ID NO 40: CCCGTTTCCCATCGACTACACTTTTCAG,
SEQ ID NO 41: GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC,
SEQ ID NO 42: CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG,
SEQ ID NO 27: TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG,
SEQ ID NO 51: ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU,
SEQ ID NO 52: UAUGWGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUAGAGGAAG,
SEQ ID NO 53: UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGGGUGG,
SEQ ID NO 54: ACGCUCGCCCCUUACGUAUAUUACCGCGGCU,
SEQ ID NO 55: CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG,
SEQ ID NO 56: GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC,
SEQ ID NO 29: UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG und
SEQ ID NO 57: CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet Kits, welche ein oder mehrere der Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung, einschließlich der Amplifikations-Oligonukleotide, der Helfer-Oligonukleotide und der Hybridisierungstest-Sonden enthalten. In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet ein Kit der vorliegenden Erfindung mindestens ein Amplifikations- Oligonukleotid und eine Hybridisierungstest-Sonde, die zum Unterscheiden von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia gegenüber anderen Mikroorganismen und anderen Borrelia-Arten fähig sind.
Hintergrundinformationen zur Verwendung der Nukleinsäure- Hybridisierung zum Auffinden einzelner Nukleinsäuresequenzen werden in Kohne, U.S. Patent No. 4,851,330, erteilt am 25. Juli 1989 und durch Hogan et al., (WO88/03957) (International Patent Application No. PCT/US87/03009), mit dem Titel "Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organisms", gegeben. Hogan et al., supra, beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines nicht-viralen Organismus oder einer Gruppe von nicht-viralen Organismen in einer Probe (z. B. Sputum, Urin, Blut- und Gewebesektionen, Nahrung, Boden und Wasser).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Die folgenden Ausdrücke besitzen in der Beschreibung die angegebenen Bedeutungen, sofern nicht ausdrücklich angegeben ist, dass ihnen eine andere Bedeutung zukommt.
Durch "Target-Nukleinsäure" ist eine Nukleinsäure gemeint, die eine Target-Nukleotidsequenz besitzt.
Durch "Oligonukleotid" ist ein Einzelstrang-Nukleotidpolymer gemeint, das aus mehr als zwei Nukleotid-Untereinheiten besteht, die kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt sind zwischen 10 und 100 Nukleotid-Einheiten vorhanden, wobei am bevorzugtesten zwischen 12 und 50 Nukleotid-Einheiten miteinander verbunden sind. Die Zucker-Gruppen der Nukleotid- Untereinheiten können Ribose, Deoxyribose oder modifizierte Derivate davon, wie z. B. o-Methyl-Ribose sein. Die Nukleotid- Untereinheiten eines Oligonukleotids können durch Phosphodiester-Verknüpfungen, Phosphorothioat-Verknüpfungen, Methylphosphonat-Verknüpfungen oder durch andere seltene oder nicht natürlich vorkommende Verknüpfungen verbunden sein, welche nicht die Hybridisierung des Oligonukleotids verhindern. Desweiteren kann ein Oligonukleotid ungewöhnliche Nukleotide oder Nichtnukleotid-Gruppen aufweisen. Ein Oligonukleotid entsprechend der hier angegebenen Definition ist eine Nukleinsäure, bevorzugt DNA, wobei diese aber auch RNA sein kann oder eine Kombination von kovalent verknüpften Ribo- oder Deoxyribonukleotiden aufweisen kann. Oligonukleotid-Sonden und Amplifikations-Oligonukleotide einer definierten Sequenz können über dem Fachmann bekannte Techniken, wie z. B. durch chemische oder biochemische Synthese und durch in vitro oder in vivo Expression von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, z. B. in bakteriellen oder retroviralen Vektoren hergestellt werden. Entsprechend der Zielrichtung dieser Offenbarung besteht ein Oligonukleotid nicht aus Wildtyp-chromosomaler DNA oder aus davon abgeleiteten in vivo Transkriptionsprodukten. Eine Anwendung einer Sonde ist die Verwendung als eine Hybridisierungstest-Sonde. Die Sonden können auch als in vivo oder in vitro therapeutische Amplifikations-Oligomere oder Gegensinn-Agenzien zum Blockieren oder Inhibieren der Gen- Transkription oder der Translation in erkrankten, infizierten oder pathogenen Zellen verwendet werden.
Mit "Target-Nukleinsäuresequenz", "Target-Nukleotidsequenz" oder "Target-Sequenz" ist eine spezifische Deoxyribonukleotid- oder Ribonukleotid-Sequenz gemeint, die die Nukleotidsequenz eines Einzelstrang-Nukleinsäuremoleküls und die dazu komplementäre Deoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidsequenz komplett oder teilweise umfasst.
Nukleinsäure-Hybridisierung ist der Vorgang, durch welchen zwei Nukleinsäure-Stränge, die vollständig oder teilweise komplementäre Nukleotidsequenzen besitzen, unter festgelegten Reaktionsbedingungen unter Ausbildung eines stabilen Doppelstrang-Hybrides mit spezifischen Wasserstoffbrücken- Bindungen zusammenkommen. Jeder der Nukleinsäurestränge kann eine Deoxyribonukleinsäure (DNA) oder eine Ribonukleinsäure (RNA) sein; die Hybridisierung kann somit RNA : RNA Hybride, DNA : DNA Hybride oder RNA : DNA Hybride betreffen.
Der in dieser Anmeldung verwendete Ausdruck "Hybridisierung" bezieht sich auf die Fähigkeit von zwei vollständig oder teilweise komplementären, einzelnen Nukleinsäuresträngen in einer antiparallelen Orientierung unter Ausbildung einer stabilen Struktur, die eine doppelsträngige Region aufweist, zusammenzukommen. Die diese doppelsträngige Struktur, gelegentlich Hybrid genannt, ausbildenden zwei Stränge werden durch Wasserstoffbrücken-Bindungen zusammengehalten. Obwohl diese Wasserstoffbrücken-Bindungen gewöhnlich meist zwischen den Nukleotiden an den einzelnen Nukleinsäuresträngen, die die Basen Adenin und Thymin oder Uracil (A und T oder U) oder Cytosin und Guanin (C und G) enthalten, ausgebildet sind, kann die Basenpaarung zwischen Basen ausgebildet werden, welche nicht Mitglieder dieser "kanonischen" Paare sind. Nichtkanonische Basenpaarung ist im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe z. B., "The Biochemistry of the Nucleic Acids" (Adams et al., eds., 1992).
"Stringente" Hybridisierungstest-Bedingungen beziehen sich auf Bedingungen, unter denen eine spezifische Hybridisierungstest- Sonde fähig ist, mit den Target-Nukleinsäuren (bevorzugt rRNA oder rDNA aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia) gegenüber anderen Nukleinsäuren, die in der Testprobe vorliegen, die entweder von anderen Mikroorganismen (z. B. Borrelia hermsii) oder von Menschen gewonnen wurden, zu hybridisieren. Es wird anerkannt werden, dass diese Bedingungen in Abhängigkeit von Faktoren, die den GC-Gehalt und die Länge der Sonde, die Hybridisierungs-Temperatur, die Zusammensetzung des Hybridisierungs-Reagens und den Grad der begehrten Hybridisierungs-Spezifität einschließen, variieren können. Spezifische stringente Hybridisierungs-Bedingungen werden nachfolgend in der Offenbarung zur Verfügung gestellt.
Durch "Sonde" ist ein Einzelstrang-Oligonukleotid gemeint, das eine Sequenz besitzt, die teilweise oder vollständig komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz ist, die detektiert werden sowie unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen daran hybridisieren soll. Der Ausdruck "Sonde" ist so gemeint, dass natürlich vorkommende Nukleinsäuren ausgeschlossen werden. Gereinigte Oligonukleotid-Sonden können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren, wie z. B. durch chemische Synthese und durch in vitro oder in vivo Expression über rekombinante Nukleinsäuremoleküle, z. B. retrovirale Vektoren hergestellt werden. Bevorzugte Sonden haben eine Länge von 10 bis 100 Nukleotiden. Die Sonden weisen gegebenenfalls Regionen auf, die nicht komplementär zu einer Target-Sequenz sind, solange wie diese Sequenzen die Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen nicht wesentlich beeinflussen. Wenn solche Regionen vorhanden sind, können sie eine 5'- Promotersequenz und/oder eine Bindestelle für die RNA- Transkription, eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease enthalten oder sie können Sequenzen enthalten, die eine gewünschte sekundäre oder tertiäre Struktur, wie z. B. eine katalytisch aktive Stelle oder eine Haarnadel-Struktur auf der Sonde, auf der Target-Nukleinsäure oder auf beiden verleihen. Eine Sonde kann mit einer Reportergruppe markiert sein, wie z. B. mit einem Radioisotop, mit einer fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Gruppe, mit einem Enzym oder einem anderen Liganden, welcher zur Detektion oder für die Bestätigung, dass die Probe an die Target-Sequenz hybridisiert ist, verwendet werden kann.
Der in dieser Offenbarung entsprechend verwendete Ausdruck "eine Sonde (oder Oligonukleotid) mit einer Nukleinsäuresequenz, die im wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die aus einer Gruppe spezifischer Sequenzen ausgewählt ist" bedeutet, dass die Sonde als ein grundlegendes und neues Charakteristikum fähig ist, unter stringenten Hybridisierungs- Bedingungen stabil an eine Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die das exakten Komplement bzgl. einer der aufgelisteten Nukleinsäuresequenzen der Gruppe darstellt. Ein exakter Gegenstrang beinhaltet die entsprechende DNA- oder RNA- Sequenz.
Der Ausdruck "im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entsprechend" bedeutet, dass die darauf bezogene Nukleinsäure gegenüber der Nukleinsäuresequenz hinreichend ähnlich ist, so dass die darauf bezogene Nukleinsäure ähnliche Hybridisierungs- Eigenschaften gegenüber einer Nukleinsäuresequenz aufweist, indem sie mit dergleichen Target-Nukleinsäuresequenz unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen hybridisieren würde.
Der Fachmann wird verstehen, dass sich weitgehend entsprechende Sonden und Primer der Erfindung von der darauf bezogenen Sequenz abweichen können und dennoch mit der gleichen Target- Nukleinsäuresequenz hybridisieren werden. Diese Abweichung von der Nukleinsäure kann als Prozentsatz an identischen Basen innerhalb der Sequenz oder als Prozentsatz an vollkommen komplementären Basen zwischen der Sonde oder dem Primer und seiner Target-Sequenz festgehalten werden. Der Fachmann wird auch verstehen, dass diese Abweichung als die Anzahl von nicht identischen Basen in einer Sonde oder in einem Primer oder als die Anzahl von falsch gepaarten Basen einer Sonde, welche nicht mit einer entsprechenden Base einer Target-Nukleinsäuresequenz hybridisieren, ausgedrückt werden kann. Sonden oder Primer der vorliegenden Erfindung entsprechen im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz, wenn diese Prozentsätze von 100% bis 80% oder von 0 Basen-Falschpaarungen in einer 10 Nukleotid-Target- Sequenz bis zwei Basen-Falschpaarungen in einer 10 Nukleotid- Target-Sequenz reichen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Prozentsatz von 100% bis 85%. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann dieser Prozentsatz von 90% bis 100% sein; in anderen bevorzugten Ausführungsformen ist dieser Prozentsatz von 95% bis 100%. Der Fachmann wird die verschiedenen Modifikationen der Hybridisierungs-Bedingungen verstehen, die bei verschiedenen Prozentsätzen an Komplementarität erforderlich sein können, um die Hybridisierung an eine spezifischen Target-Sequenz zu erlauben, ohne das ein nicht akzeptables Ausmaß an nicht spezifischer Hybridisierung hervorgerufen wird.
Mit "Nukleinsäurehybrid" oder "Hybrid" ist eine Nukleinsäurestruktur gemeint, die eine doppelsträngige Wasserstoffbrücken-gebundene Region, bevorzugt in der Länge zwischen 10 und 100 Nukleotiden, besonders bevorzugt in der Länge zwischen etwa 12 und 50 Nukleotiden enthält, worin jeder Strang komplementär zu dem anderen ist und worin die Region unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen hinreichend stabil ist, um durch Mittel detektiert zu werden, die Chemilumineszenz- oder Fluoreszenz-Licht-Detektion, Autoradiographie oder Gel-Elektrophorese einschließen, die aber nicht darauf beschränkt sind. Diese Hybride können RNA : RNA, RNA : DNA oder DNA : DNA Duplexmoleküle umfassen.
Mit "komplementär" ist gemeint, dass die Nukleotidsequenzen von ähnlichen Regionen zweier einzelsträngiger Nukleinsäuren oder von verschiedenen Regionen dergleichen einzelsträngigen Nukleinsäure eine Zusammensetzung der Nukleotidbasen aufweist, welche es erlaubt, dass die einzelnen Stränge unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen miteinander zu einer stabilen doppelsträngigen Wasserstoffbrücken-Bindungsregion hybridisieren. Wenn eine fortlaufende Sequenz von Nukleotiden einer einzelsträngigen Region zur Ausbildung einer Serie von "kanonischen" Basenpaarungen mittels Wasserstoffbrücken- Bindungen mit einer entsprechenden Sequenz von Nukleotiden der anderen einzelsträngigen Region in der Lage ist, so dass A mit U oder T gepaart und C mit G gepaart ist, sind die Nukleotidsequenzen "vollkommen" komplementär.
Mit "konservativ modifizierte Varianten" sind Nukleinsäuren oder Oligonukleotide gemeint, die eine Nukleotidsequenz besitzen, welche komplementär zu einer Nukleinsäure-Region einer anderen Nukleinsäure ist, wobei diese Region wiederum vollkommen komplementär zu einer Referenz-Nukleinsäure ist. Solche konservativ modifizierten Varianten sind in der Lage, an eine Target-Nukleinsäure-Region, die eine Borrelia- Nukleotidsequenz besitzt, unter stringenten Hybridisierungs- Bedingungen stabil zu hybridisieren.
Mit "Amplifikations-Oligonukleotid" ist ein Oligonukleotid gemeint, dass in der Lage ist, mit einer Target- Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren und zur Initiation der Nukleinsäuresynthese als ein Primer für die Nukleinsäuresynthese oder als ein Promoter-Template (z. B. für die Synthese eines komplementären Stranges, wodurch eine funktionsfähige Promoter-Sequenz ausgebildet wird) oder beidem aufzutreten. Wenn das Amplifikations-Oligonukleotid so gestaltet ist, dass es die RNA-Synthese initiiert, kann das Oligonukleotid Nukleotidsequenzen enthalten, welche nicht komplementär zu der Target-Sequenz sind, aber die durch eine RNA-Polymerase (wie z. B. die T7, die T3 und die SP6 RNA- Polymerase) erkannt werden. Ein Amplifikations-Oligonukleotid kann gegebenenfalls einen 3'-Terminus aufweisen, welcher zur Verhinderung oder zur Verringerung des Ausmaßes des Primer- Extension modifiziert ist. Ein Amplifikations-Oligonukleotid entsprechend der vorliegenden Definition ist bevorzugt zwischen 10 und 100 Nukleotiden, besonders bevorzugt zwischen ungefähr 12 und 50 Nukleotiden lang. Während die Amplifikations- Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung chemisch synthetisiert sein können oder über einen Vektor gewonnen wurden, sind diese Oligonukleotide nicht natürlich vorkommende Nukleinsäuren.
Mit "Nukleinsäure-Amplifikation" oder "Target-Amplifikation" ist die Erhöhung der Anzahl der Nukleinsäure-Moleküle, die mindestens eine Target-Nukleinsäuresequenz aufweisen, gemeint.
Mit "Gegensinn" oder "negativer Sinn" ist gemeint, dass eine Nukleinsäuresequenz vorliegt, die komplementär zu jener einer Referenz-Nukleinsäuresequenz ist.
Mit "Sinn", "gleicher Sinn" oder "positiver Sinn" ist gemeint, dass eine Nukleinsäuresequenz vorliegt, die jener einer Referenz-Nukleinsäuresequenz entspricht.
Mit "Helfer-Oligonukleotid" ist eine Nukleinsäure-Sonde gemeint, die so gestaltet ist, dass sie mit der Target- Nukleinsäure an einer anderen Stelle als jener der markierten Sonde hybridisiert, wodurch entweder die Geschwindigkeit der Hybridisierung der markierten Sonde, die Schmelztemperatur (Tm) des Hybrids aus Target und markierter Sonde oder beides erhöht wird.
"mit der Lyme-Krankheit assoziierte Borrelia" sind Arten, die die Lyme-Krankheit verursachen und die die Borrelia-Arten oder die Unterarten Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii und Borrelia VS461 einschließen. Typischerweise können die mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia aus einem die Lyme- Krankheit tragenden Säuger isoliert werden.
"Phylogenetisch eng verwandt" bedeutet, dass die Organismen im evolutionären Sinn eng miteinander verwandt sind und deswegen signifikante Ähnlichkeiten in der Morphologie aufweisen werden und eine höhere Sequenz-Homologie bezüglich aller Nukleinsäuren aufweisen werden, als Organismen, welche entfernter verwandt sind. Benachbarte und nachfolgende Organismen auf einem phylogenetischen Stammbaum sind eng verwandt. Organismen, die Positionen einnehmen, die im Unterschied zu den benachbarten oder nachfolgenden Positionen auf dem phylogenetischen Stammbaum weiter entfernt sind, gelten noch als eng verwandt, wenn sie eine signifikante Sequenz-Homologie bezüglich aller Nukleinsäuren aufweisen.

B. Hybridisierungs-Bedingungen und die Gestaltung der Sonden/Primer

Die Hybridisierungs-Reaktionsbedingungen, wobei die Temperatur der Hybridisierung und die Konzentration von Salz in der Hybridisierungslösung besonders bedeutsam sind, können so ausgewählt werden, dass den Amplifikations-Oligonukleotiden oder Hybridisierungs-Sonden der vorliegenden Erfindung erlaubt wird, bevorzugt an Nukleinsäuren zu hybridisieren, die eine Target-Borrelia-Nukleotidsequenz aufweisen und die nicht an andere nicht ausgewählte Nukleinsäuren hybridisieren, für die vermutet wird, dass sie in der Testprobe vorliegen. Bei niedrigen Salzkonzentrationen und/oder erhöhten Temperaturen (gesteigerte Stringenz genannt) sinkt das Ausmaß der Nukleinsäure-Hybridisierung entsprechend wie die Wasserstoffbrücken-Bindung zwischen gepaarten Nukleotid-Basen in dem doppelsträngigen Hybridmolekül unterbrochen wird; dieser Vorgang wird "Schmelzen" genannt.
Im allgemeinen sind die stabilsten Hybride jene, die die größte Anzahl an aufeinanderfolgenden, korrekt gepaarten (d. h. über Wasserstoffbrücken-Bindungen verbundenen) Nukleotid-Basenpaaren aufweisen. Somit wltd gewöhnlich zu erwarten sein, dass wenn die Stringenz der Hybridisierungs-Bedingungen zunimmt, diese Hybride zuletzt schmelzen werden. Jedoch kann eine doppelsträngige Nukleinsäureregion, die eine oder mehrere falsch gepaarte, "nicht kanonische" oder fehlerhafte Basenpaare (die zu einer schwächeren oder ausbleibenden Basenpaarung an dieser Position in der Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure führen) enthält, unter Bedingungen von relativ hoher Stringenz dennoch hinreichend stabil sein, und so gewährleistet wird, dass das Nukleinsäurehybrid in einem Hybridisierungstest detektiert werden kann, ohne das Kreuz-Reaktionen mit anderen, nicht gewollten Nukleinsäuren, die in der in der Testprobe vorliegen, auftreten.
In Abhängigkeit von dem Grad der Ähnlichkeit zwischen den Nukleotidsequenzen der Target-Nukleinsäure und jenen von Nicht- Target-Nukleinsäuren, die zu den phylogenetisch unterschiedlichen, aber eng verwandten Organismen gehören auf der einen Seite und dem Grad an Komplementarität zwischen den Nukleotidsequenzen eines speziellen Amplifikations- Oligonukleotids oder einer Hybridisierungs-Sonde und jenem der Target- und Nicht-Target-Nukleinsäuren auf der anderen Seite, werden folglich eine oder mehrere Falschpaarungen die Fähigkeit des Oligonukleotids, an jene Nukleinsäure und nicht an die Nicht-Target-Nukleinsäuren zu hybridisieren, nicht notwendigerweise verhindern.
Die Hybridisierungstest-Sonden der vorliegenden Erfindung wurden so festgelegt, ausgewählt und/oder gestaltet, damit der Unterschied zwischen den Schmelztemperaturen des Hybrids aus der Sonde und dem Target (Tm, definiert als die Temperatur, bei welcher in einer gegebenen Reaktionsmischung die Hälfte der potentiell doppelsträngigen Moleküle in einem einzelsträngigen, denaturierten Zustand vorliegen) und der Tm eines falsch gepaarten Hybrids, das zwischen der Sonde und der rRNA oder der rDNA eines phylogenetisch besonders eng verwandten Organismus, für welche erwartet wird, dass sie in der Testprobe vorliegt, wobei aber nicht darauf abgezielt wird, diese zu detektieren, ausgebildet ist. Während die nicht markierten Amplifikations- Oligonukleotide und die Helfer-Oligonukleotide keinen derartig extrem hohen Grad an Spezifität wie die markierte Hybridisierungstest-Sonde bedingen, um in der vorliegenden Erfindung anwendbar zu sein, sind diese dennoch in einer ähnlichen Art gestaltet, damit sie an einer oder mehreren Target-Nukleinsäuren gegenüber anderen Nukleinsäuren bevorzugt hybridisieren.
Nukleotidsequenzen von prokaryotischen Organismen enthalten rRNA Gene, die für die 5S, 16S und 23S rRNA kodieren. Die Borrelia Nukleinsäuresequenzen der ribosomalen RNA Gene (rDNA) aus Leptospira, Leptonema, Serpula, Spirochäten und die Treponema 16S Nukleinsäureseguenzen wurden ebenfalls zum Vergleich verwendet. Die Information zu Borrelia- Nukleinsäuresequenzen wurde aus der experimentellen Forschung und veröffentlichten Quellen erhalten (Marconi und Garon, J. Gen. Microbiol. 138: 533-536 (1992); Paster et al., J. Bacteriol. 173: 6161-6109 (1991); Marconi und Garon, J. Bacteriol. 174: 241-244 (1992); Marconi & Garow, J. Clin. Microbiol. 30: 2830-34 (1992); Davidson et al., J. Bacteriol. 174: 3766-74 (1992).
Zur Erleichterung der Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen die als Sonden und Amplifikations-Oligonukleotide verwendet werden können, wurden die Nukleotidsequenzen aus verschiedenen Arten von Organismen zuerst so ausgerichtet, dass die Homologie maximiert wird. Innerhalb eines rRNA Moleküls gibt es eine enge Verwandtschaft zwischen der Gesamtstruktur und der Funktion. Dies erzwingt Beschränkungen bezüglich evolutionärer Veränderungen in der Primärsequenz, so dass die Sekundärstruktur erhalten bleibt. Wenn beispielsweise auf der einen Seite der Helix eine Base ausgetauscht wird, erfolgt ein kompensierender Austausch auf der anderen Seite um die Komplementarität zu erhalten (dies wird als Kovarianz bezeichnet). Das ermöglicht, zwei sehr verschiedene Sequenzen, basierend auf der konservierten Primärsequenz und auch auf den konservierten Sekundärstruktur-Elementen, aneinander auszurichten. Unter Beachtung von Abweichungen in der Homologie der ausgerichteten Sequenzen wurden potentielle Target- Sequenzen für Hybridisierungs-Sonden identifiziert.
Die Sequenz-Evolution bezüglich jeder der variablen Regionen verläuft meistens auseinander. Wegen dieser Divergenz zeigen phylogenetisch entferntere Verwandte von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia eine größere Variabilität bezüglich der variablen Region als phylogenetisch engere Verwandte. Wir beobachteten eine hinreichende Abweichung zwischen den mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia und anderen Arten von Borrelia, die in derselben Probe gefunden werden könnten, um so bevorzugte Target-Stellen zu identifizieren und brauchbare Sonden zu entwerfen.
Wir haben durch vergleichende Analyse der rRNA-Sequenzen, die in der Literatur veröffentlicht sind oder experimentell bestimmt wurden, Sequenzen identifiziert, welche zwischen Arten der Borrelia, die mit der Lyme-Krankheit assoziiert sind und anderen Arten von Borrelia variieren. Computer und Computerprogramme, die für die hier angegebenen Zwecke verwendet oder angepasst werden können, sind kommerziell verfügbar. Zur Gestaltung der vorliegenden Sonden haben wir hinreichende Abweichungen zwischen den Target-Organismen und den engsten phylogenetischen Verwandten, für die es wahrscheinlich ist, in der gleichen Testprobe gefunden zu werden, gesehen.
Lediglich das Identifizieren von putativ einzigartigen, potentiellen Target-Nukleotidsequenzen garantiert nicht, dass eine funktionelle Art-spezifische Hybridisierungstest-Sonde, die diese Sequenz umfasst, zur Hybridisierung mit rRNA oder rDNA aus Borrelia gewonnen werden kann. Verschiedene andere Faktoren werden die Eignung einer Nukleinsäure-Stelle als Target-Stelle für Art-spezifische Sonden bestimmen. Da das Ausmaß und die Spezifität der Hybridisierungs-Reaktionen, wie beispielsweise bei den hier beschriebenen, durch eine Anzahl von Faktoren bestimmt wird, wird die Beeinflussung eines oder mehrerer dieser Faktoren die genaue Sensitivität und Spezifität eines spezifischen Oligonukleotids, unabhängig davon ob dieses zu seinem Target vollkommen komplementär ist oder nicht, bestimmen. Die Bedeutung und die Auswirkung verschiedener Testbedingungen sind dem Fachmann bekannt, so wie das in Hogan et al., welcher dergleiche Eigentümer wie bei der vorliegenden Anmeldung ist und in Hogan & Hammond, U.S. Patent No. 5,216,143, bezogen auf International Patent No. PCT/US87/03009, Kohne, U.S. Patent No. 4,851,330 beschrieben ist.
Anhand des folgenden Beispiels wird deutlich, dass ein höherer GC-Gehalt einer potentiellen Target-Nukleotidsequenz (und somit jener des doppelsträngigen Hybrids aus Sonde und Target) im allgemeinen die Stabilität und somit die Tm des Hybrides erhöht. Die Anzahl der Nukleotide innerhalb dieser Sequenz, die identisch bezüglich einer oder mehrerer der "nicht ausgewählten" Organismen sind, beeinflussen ebenfalls die Stabilität und somit die Tm eines zum Teil falsch gepaarten Hybrids aus einer Sonde, die vollkommen komplementär zur rRNA der Borrelia ist und einer Nukleinsäure, die die rRNA Nukleotidsequenzen eines nicht ausgewählten Organismus oder von nicht ausgewählten Organismen besitzt.
Die gewünschte Hybridisierungs-Temperatur und die Zusammensetzung der Hybridisierungslösung (wie z. B. Salzkonzentration, Detergenzien und andere gelöste Stoffe) beeinflussen ebenfalls entscheidend die Stabilität der doppelsträngigen Hybride. Die Bedingungen, wie z. B. die Ionenstärke und die Temperatur, bei welcher es einer Sonde erlaubt ist an das Target zu hybridisieren, müssen beim Konstruieren einer Gruppen- oder Art-spezifischen Sonde berücksichtigt werden. Die thermische Stabilität von hybridisierten Nukleinsäuren steigt im allgemeinen mit der Ionenstärke der Reaktionsmischung an. Auf der anderen Seite können chemische Reagenzien, wie z. B. Formamid, Harnstoff, Dimethylsulfoxid und Alkohole, welche Wasserstoffbrücken- Bindungen aufbrechen, die thermische Stabilität der Hybride stark reduzieren.
Um die Spezifität einer Sonde für deren Target zu maximieren, wurden die betreffenden Sonden der vorliegenden Erfindung so gestaltet, dass diese mit ihren Targets unter den Bedingungen einer hohen Stringenz hybridisieren. Unter diesen Bedingungen werden nur einzelne Nukleinsäurestränge, die einen hohen Grad an Komplementarität aufweisen, miteinander hybridisieren; einzelne Nukleinsäurestränge ohne einen derartig hohen Grad an Komplementarität werden keine Hybride ausbilden. Demzufolge bestimmt die Stringenz der Testbedingungen das Ausmaß an Komplementarität, das zwischen den zwei Nukleinsäuresträngen vorhanden sein sollte, damit ein Hybrid ausgebildet werden kann. Die Stringenz wird so ausgewählt, dass die Differenz hinsichtlich der Stabilität zwischen dem aus der Sonde und der Target-Nukleinsäure gebildeten Hybrids und den potentiellen Hybriden aus der Sonde und anderen noch vorliegenden Nicht- Target-Nukleinsäuren maximiert wird.
Die richtige Spezifität kann erreicht werden, indem der Abschnitt der Sonde, der gegenüber den Sequenzen der Nicht- Target-Organismen vollkommen komplementär ist, minimiert wird, ferner durch Vermeiden von G- und C-reichen homologen Regionen gegenüber Nicht-Target-Sequenzen und durch Konstruieren der Sonde in der Weise, dass so viel wie möglich destabilisierende Falschpaarungen gegenüber Nicht-Target-Sequenzen enthalten sind. Ob eine Sonden-Sequenz nur zur Detektion eines spezifischen Typus von Organismus nützlich ist, hängt größtenteils von der Differenz in der thermischen Stabilität von Hybriden aus Sonde/Target gegenüber potentiellen Hybriden aus Sonde/Nicht-Target ab. Beim Entwurf der Sonden sollten die Unterschiede in den Tm-Werten zwischen diese Hybriden so groß wie möglich gestaltet werden (bevorzugt etwa 5ºC oder mehr). Die Beeinflussung der Tm kann durch Veränderungen bei der Sondenlänge und bei der Zusammensetzung der Sonde (GC-Gehalt vs. AT-Gehalt) erreicht werden.
Die optimale Hybridisierungstemperatur für ungefähr 10-50 Nukleotide lange Oligonukleotid-Sonden liegt im allgemeinen ungefähr 5ºC unter der Schmelztemperatur für einen gegebenen Doppelstrang. Die Inkubation bei Temperaturen unterhalb der optimalen Temperatur kann ermöglichen, dass die Hybridisierung von falsch gepaarten Basensequenzen erfolgt und kann also folglich die Spezifität herabsenken. Je länger die Sonde ist, desto mehr Wasserstoffbrücken-Bindungen liegen zwischen den Basenpaaren vor und im allgemeinen umso höher wird die Tm sein. Das Steigern des Prozentsatzes an G und C erhöht auch die Tm, da G-C Basenpaare eine zusätzliche Wasserstoffbrücken-Bindung ausbilden und deshalb von größerer thermischer Stabilität als A-T Basenpaarungen sind.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Bestimmen der Tm misst die Hybridisierung, wobei ein "Hybridization Protection Assay (HPA)" nach Arnold et al., supra, bezeichnet als "Homogeneous Protection Assay" verwendet wird. Bei Benutzung des HPA kann die Tm in der folgenden Weise bestimmt werden. Es wird ein Hybrid aus der Sonde und dem Target in einer mit Li-Succinat gepufferten Lösung (0.1 M Li-Succinat-Puffer, pH 5.0, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 2 mM Ethylenglycol-bis(β- amino-ethyl-Ether), N,N,N',N'-tetra-Essigsäure (EGTA), 10% (w/v) Li-Laurylsulfat) ausgebildet, wobei eine überschüssige Menge an Target-Sequenz verwendet wird. Aliquots des Hybrids werden anschließend in der mit Li-Succinat gepufferten Lösung verdünnt und für fünf Minuten bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert, wobei unterhalb der vermuteten Tm (typischerweise 55ºC) gestartet wird und in 2-5ºC-Schritten gesteigert wird. Diese Lösung wird anschließend mit einem milden Alkali-Borat-Puffer (0.15 M Natriumtetraborat, pH 7.6, 5% (v/v) TRITON® X-100) verdünnt und bei einer niedrigeren Temperatur (z. B. 50ºC) für 10 Minuten inkubiert. Unter diesen Bedingungen wird der Acridiniumester, der mit der einzelsträngigen Sonde verbunden ist, hydrolisiert, während der mit der hybridisierten Sonde verbundene Acridiniumester vor der Hydrolyse relativ geschützt ist. Somit ist die Menge an verbleibendem Acridiniumester proportional zu der Menge an Hybrid und sie kann durch die Chemilumineszenz, die durch den Acridiniumester nach Zugabe von Wasserstoffperoxid und gefolgt von Alkali, hervorgerufen wird, gemessen werden. Die Chemilumineszenz kann in einem Luminometer (z. B. Gen-Probe LEADER® I oder LEADER® 50) gemessen werden. Die resultierenden Werte werden als Prozent des maximalen Signals (gewöhnlich bei der niedrigsten Temperatur) gegenüber der Temperatur aufgetragen. Tm ist als die Temperatur definiert, bei welcher 50% des maximalen Signals erhalten sind. Zusätzlich zu dem obigen Verfahren kann die Tm durch isotopische Verfahren bestimmt werden (z. B. Hogan et al., supra), die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Es sollte festgehalten werden, dass die Tm in Abhängigkeit von der verwendeten Hybridisierungslösung für ein gegebenes Hybrid variiert. Faktoren, wie z. B. die Salzkonzentration, Detergenzien und andere gelöste Stoffe können die Stabilität des Hybrids während der thermischen Denaturierung beeinflussen (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning, ch. 11 (2nd ed. 1989)). Bedingungen, wie z. B. die Ionenstärke und die Inkubationstemperatur, unter denen die Sonde für die Hybridisierung mit der Target-Sequenz verwendet wird, sollten bei der Konstruktion der Sonde berücksichtigt werden. Auf der anderen Seite können chemische Reagenzien, wie z. B. Formamid, Harnstoff, Dimethylsuloxid und Alkohole, welche Wasserstoffbrücken-Bindungen aufbrechen, entscheidend die thermische Stabilität der Hybride reduzieren.
Um zu gewährleisten, dass die Sonde Target-spezifisch ist, ist es wünschenswert, Sonden zu besitzen, welche nur unter Bedingungen einer hohen Stringenz hybridisieren. Unter Bedingungen einer hohen Stringenz werden nur besonders komplementäre Nukleinsäurehybride gebildet werden; Hybride ohne einen hinreichenden Grad an Komplementarität werden nicht gebildet werden. Demzufolge bestimmt die Stringenz der Testbedingungen das Ausmaß der erforderlichen Komplementarität bezüglich zweier Nukleinsäurestränge für die Ausbildung eines Hybrids. Die Stringenz wird so gewählt, dass die Differenz in der Stabilität zwischen dem mit der Target-Nukleinsäuresequenz gebildeten Hybrids zu denen mit anderen Nukleinsäuresequenzen maximiert wird.
Die richtige Spezifität kann durch Minimieren des Abschnitts mit vollkommener Komplementarität gegenüber Nicht-Target- Nukleinsäuren erzielt werden, wobei zu Nicht-Target-Sequenzen homologe G- und C-reiche Regionen vermieden werden und durch Konstruktion der Sonde in einer Weise, dass so viel wie möglich destabilisierende Falschpaarungen mit Nicht-Target-Sequenzen enthalten sind. Ob eine Sonden-Sequenz lediglich zur Detektion eines spezifischen Typus von Organismus nützlich ist, hängt größtenteils von der Differenz der thermischen Stabilität zwischen dem Hybrid aus Sonde und Target und dem Hybrid aus Sonde und Nicht-Target ab. Bei der Gestaltung der Sonden sollten die Differenzen in diesen Tm-Werten so groß wie möglich sein (bevorzugt etwa 5ºC oder mehr).
Die Länge der Target-Nukleinsäuresequenz und demzufolge die Länge der Sequenz der Sonde kann ebenfalls bedeutsam sein. In einigen Fällen können verschiedene Sequenzen von einer spezifischen Region, z. B. einer variablen Region sein, die bezüglich der Lage und der Länge variieren, wobei Sonden mit den gewünschten Eigenschaften für die Hybridisierung erhalten werden. In anderen Fällen kann eine Sonde gegenüber einer anderen Sonde mit einer Nukleotidsequenz, die sich durch eine einzige Base unterscheidet, signifikant überlegen sein. Während es für Nukleinsäuren möglich ist, dass sie nicht vollkommen komplementär hybridisieren, wird im allgemeinen der längste Abschnitt an vollkommen homologer Basensequenz die Hybridstabilität bestimmen, wobei auch die Zusammensetzung der Basenpaare eine Rolle spielt. Die Länge der Sequenz der Target- Nukleinsäure und demzufolge die Länge der Sequenz der Sonde kann ebenfalls bedeutsam sein. In einigen Fällen können verschiedene Sequenzen von einer spezifischen "variablen" Region, die hinsichtlich der Lage und der Länge variieren, für die Konstruktion von Sonden mit den gewünschten Eigenschaften für die Hybridisierung verwendet werden.
Die entsprechend der vorliegenden Erfindung als Sonden verwendeten Oligonukleotide weisen verschiedene Längen auf. Bevorzugte Sonden sind Oligonukleotide, die 10-100 Nukleotide lang sind. Noch bevorzugter sind Sonden von einer Länge von 15- 50 Basen.
Die Regionen der rRNA, die stabile interne Strukturen ausbilden, inhibieren die Hybridisierung und sind zumindest bei den Tests, in denen keine Helfer-Sonden verwendet werden, weniger bevorzugte Target-Regionen. Gleichermaßen sollten Konstruktionen von Sonden, die in einer ausgedehnten Selbstkomplementarität resultieren, vermieden werden. Die Hybridisierung ist, wie oben erläutert, die Verbindung von zwei einzelnen Strängen komplementärer Nukleinsäuren zur Ausbildung eines über Wasserstoffbrücken verbundenen doppelsträngigen Hybrids. Wenn einer der beiden Stränge in einem intramolekularen oder einem intermolekularen Hybrid vollständig oder zum Teil eingebunden ist, wird dieser nur noch bedingt zur Ausbildung eines neuen intermolekularen Hybrids aus Sonde und Target befähigt sein. Ribosomale RNA Moleküle sind dafür bekannt, dass sie durch Wasserstoffbrücken-Bindung sehr stabile intramolekulare Helices und Sekundärstrukturen ausbilden. Durch die Gestaltung des Hybridisierungstests in einer Weise, dass ein wesentlicher Anteil der Target-Sequenz im einzelsträngigen Zustand verbleibt, bis die Hybridisierung mit der Sonde erfolgt, kann die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Hybridisierung zwischen der Sonde und dem Target deutlich gesteigert werden. Ein erfolgversprechender Weg hierfür ist, dass eine Sequenz als Target-Nukleotidsequenz ausgewählt wird, die relativ wenig intramolekulare Wasserstoffbrücken-Bindungen aufweist. Als Alternative oder zusätzlich kann die Hybridisierungstest-Sonde als Sondenmischung zusammen mit Helfer-Oligonukleotiden, die die Target-Stelle besser für die Hybridisierung mit der Hybridisierungstest-Sonde zugänglich machen können, verwendet werden.
Entsprechend dem Produkt einer Polymerasekettenreaktion (PCR) liegt eine Target-DNA natürlicherweise in doppelsträngiger Form vor. Diese doppelsträngigen Targets wirken bezüglich der Hybridisierung mit einer Sonde demzufolge inhibierend und eine Denaturierung vor der Hybridisierung ist erforderlich. Geeignete Denaturierungs- und Hybridisierungs-Bedingungen sind im Stand der Technik bekannt (z. B., E. M. Southern, J. Mol. Biol. 98: 503 (1975).
Es stehen eine Reihe von Formeln zur Verfügung, über die eine Abschätzung der Schmelztemperatur für die an ihre Target- Nukleinsäuren perfekt gepaarte Oligonukleotide ermöglicht wird.
Eine dieser Formeln, Tm = 81,5 + 16,6(log&sub1;&sub0;[Na&spplus;]) + 0,41(Fraktion G + C)-(600/N) (wobei N = Länge des Oligonukleotids als Anzahl der Nukleotide) erlaubt eine gute Abschätzung der Tm für zwischen 14 und 60 oder 70 Nukleotiden lange Oligonukleotide. Ausgehend von diesen Berechnungen kann nachfolgend eine empirische Überprüfung oder ein Feineinstellen der Tm unter Verwendung von im Stand der Technik wohlbekannten Screening-Techniken erfolgen. Für weiterführende Informationen zur Hybridisierung und zu Oligonukleotid-Sonden wird z. B. auf Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Springs Harbor Laboratory Press 1989) (Kapitel 11) verwiesen. Neben anderen wohlbekannten Literaturstellen im Stand der Technik enthält diese auch Abschätzungen zum Einfluss von Falschpaarungen auf die Tm eines Hybrides. Folglich können also von der bekannten Nukleotidsegenz einer gegebenen Region einer ribosomalen RNA (oder rDNA) aus zwei oder mehreren Organismen, Oligonukleotide abgeleitet werden, die diese Organismen dann voneinander unterscheiden können.

C. Nukleinsäureamplifikation

Bevorzugt sind die Amplifikations-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung Oligodeoxynukleotide, die hinreichend lang sind, um als Substrat für die Synthese von Verlängerungsprodukten durch eine Nukleinsäure-Polymerase verwendet zu werden. Bei der optimalen Länge des Primers sollten verschiedene Faktoren, wie die Reaktionstemperatur, die Struktur und die Basenzusammensetzung des Primers und die Art und Weise der Verwendung des Primers berücksichtigt werden. Beispielsweise sollten für eine optimale Spezifität der Oligonukleotid-Primer, in Abhängigkeit von der Komplexität der Target-Nukleinsäuresequenzen, diese mindestens etwa 12 Oligonukleotide lang sein. Ist eine derartige Spezifität nicht essentiell, können kürzere Primer verwendet werden. In diesem Fall kann es erforderlich sein, dass die Reaktion bei tieferen Temperaturen ausgeführt wird, um so stabile Hybridkomplexe mit der Template-Nukleinsäure auszubilden.
Nützliche Richtlinien für das Entwerfen von Amplifikations- Oligonukleotiden und von Sonden mit den gewünschten Eigenschaften werden hier beschrieben. Die bevorzugtesten Regionen dafür enthalten zwei oder bevorzugt drei konservierte Bereiche der Nukleinsäure aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, die innerhalb von etwa 350 Basen bzw. bevorzugt innerhalb von 150 aufeinanderfolgenden Nukleotiden eines einzelnen Nukleinsäuremoleküls größer sind als etwa 15 Basen.
Das festgestellte Ausmaß der Amplifikation mit einem Satz Primer bzw. Promoter-Primern hängt von verschiedenen Faktoren ab, wobei darin die Fähigkeit der Oligonukleotide an deren komplementäre Sequenzen zu hybridisieren und deren Fähigkeit, enzymatisch verlängert oder kopiert zu werden eingeschlossen sind. Während Oligonukleotide verschiedener Länge und Basenzusammensetzung verwendet werden können, weisen die Oligonukleotide entsprechend dieser Erfindung bevorzugt Target- Bindungsregionen von 18-40 Basen mit einer vorbestimmten Tm zum Target von etwa 65ºC auf.
Die Parameter, welche die Hybridisierung einer Sonde beeinflussen, wie beispielsweise die Tm, die Komplementarität und die Sekundärstruktur der Target-Sequenz, üben ebenfalls einen Einfluss auf die Primer-Hybridisierung und damit auf die Anwendung an sich aus. Das Ausmaß der nichtspezifischen Verlängerung (Primer-Dimer oder das Kopieren eines Nicht- Targets) kann ebenfalls die Effizienz der Amplifikation beeinflussen, weshalb die Primer so ausgewählt werden, dass sie eine niedrige Selbst- oder Kreuz-Komplementarität, insbesondere an den 3'-Enden der Sequenz aufweisen. Lange homopolymere Bereiche und ein hoher GC-Gehalt sind zu vermeiden, um so ungewollte Primer-Verlängerung zu verringern. Computerprogramme stehen zur Verfügung, die hierzu bei der Konstruktion hilfreich sind.
Eine in Verbindung mit den Amplifikations-Oligonukleotiden der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure-Polymerase betrifft ein chemisches, physikalisches oder biologisches Agens, das entweder Ribo- oder Deoxyribonukleotide oder beide Komponenten in ein Nukleinsäurepolymer oder -strang in einer vom Template abhängigen Art und Weise einbaut. Beispiele für Nukleinsäure-Polymerasen schließen DNA-abhängige Polymerasen, RNA-abhängige DNA-Polymerasen und RNA-abhängige RNA-Polymerasen ein. DNA-Polymerasen vollziehen die Nukleinsäuresynthese in einer vom Template abhängigen Art und Weise in einer 5' zu 3' Richtung. Wegen der antiparallelen Orientierung der beiden Stränge in einer doppelsträngigen Nukleinsäure verläuft diese Richtung von 3' zu 5' an der Template-Region. Beispiele für die DNA-abhängige DNA-Polymerasen sind die E. coli DNA-Polymerase I, die thermostabile DNA-Polymerase von Thermus aquaticus (Taq) und das große Fragment der DNA-Polymerase I aus Bacillus stearothermohilus (Bst). Beispiele für die RNA-abhängigen DNA- Polymerasen sind verschiedene retrovirale reverse Transkriptasen, wie z. B. die reverse Transkriptase des Moloney Murine Leukemia Viris (MMLV) oder die reverse Transkriptase des Avian Myeloblastosis Virus (AMV).
Während der meisten Nukleinsäure-Amplifikations-Reaktionen fügt eine Nukleinsäure-Polymerase, wobei die Target-Nukleinsäure als ein Template verwendet wird, Nukleotidreste an das 3'-Ende des Primers an, so dass ein zweiter Nukleinsäurestrang synthetisiert wird, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die teilweise oder vollständig komplementär zu einer Region der Target-Nukleinsäure ist. In vielen Nukleinsäure-Amplifikations- Reaktionen müssen die zwei Stränge, die die resultierende Doppelstrangstruktur umfassen, durch chemische oder physikalische Mittel getrennt werden, damit die Fortsetzung der Amplifikationsreaktion erlaubt ist. Alternativ kann der neusynthetisierte Template-Strang für die Hybridisierung mit einem zweiten Primer oder Promoterprimer durch Strangverdrängung oder durch die Verwendung eines nukleolytischen Enzyms, welches vollständig oder zum Teil den ursprünglichen Target-Strang verdaut, verfügbar gemacht werden. Auf diese Weise kann der Vorgang über eine Anzahl von Zyklen wiederholt werden, wobei dies in einer deutlichen Zunahme der Anzahl an Nukleinsäuremolekülen, welche die Target-Nukleotidsequenz besitzen, resultiert.
Entweder können das erste oder das zweite Amplifikations- Oligonukleotid oder beide ein Promoter-Primer sein. Solch ein Promoter-Primer enthält gewöhnlich Nukleotidsequenzen, die zu jenen des Target-Nukleinsäuremoleküls oder zu Primer- Verlängerungsprodukt(en) nicht komplementär sind. Diese nicht komplementären Sequenzen können am 5'-Ende zu den komplementären Sequenzen auf dem Amplifikations-Oligonukleotid lokalisiert sein und im Fall das ein Doppelstrang durch die Aktion einer Nukleinsäure-Polymerase synthetisiert wurde, eine Initiationsstelle für die RNA-Synthese bereitstellen. Der so bereitgestellte Promoter kann die in vitro Transkription vielfacher RNA-Kopien der Target-Nukleinsäuresequenz erlauben. Es wird darauf hingewiesen, dass beim Verweis auf einen Primer in dieser Beschreibung, der Verweis so zu verstehen ist, dass der Aspekt des Primers mit einem Promoter-Primer immer mit einbezogen ist, es sei denn, der Kontext zu diesem Verweis weist das Gegenteil aus.
In einigen Amplifikations-Systemen, wie z. B. der Amplifikations-Methode nach Dattagupta et al., supra, können die Amplifikations-Oligonukleotide am 5'-Ende nicht komplementäre Nukleotide, die die Strangverdrängung unterstützen, enthalten. Wenn die Amplifikations- Oligonukleotide in Verbindung mit einer Nukleinsäure- Polymerase, die eine 5'-Exonukleaseaktivität aufweist, verwendet werden, können die Amplifikations-Oligonukleotide desweiteren Modifikationen an ihrem 5'-Ende aufweisen, wodurch der enzymatische Verdau verhindert wird. Alternativ kann die Nukleinsäure-Polymerase durch die Entfernung der 5'- Exonukleaseaktivität, z. B. durch Behandlung mit einer Protease, welche zu einem aktiven Fragment der Polymerase ohne diese Nukleaseaktivität führt, modifiziert sein. In solch einem Fall brauchen die Oligonukleotide nicht an ihrem 5'-Ende modifiziert sein.

1. Herstellung der Oligonukleotide

Ein Oligonukleotid besteht aus kovalent miteinander verbundenen Nukleotid-Untereinheiten. Die Zucker-Gruppen der Nukleotid- Untereinheiten können Ribose, Deoxyribose oder modifizierte Derivate davon, wie z. B. O-Methylribose sein. Die Nukleotid- Untereinheiten können durch Verknüpfungen, wie z. B. Phosphodiester-Bindungen, durch modifizierte Verknüpfungen oder durch Nicht-Nukleotideinheiten, die die Hybridisierung der Oligonukleotide nicht verhindern, verbunden sein. Modifizierte Verknüpfungen schließen jene Bindungen mit ein, in welchen eine übliche Phosphodiester-Bindung, durch eine andersartige Verknüpfung, z. B. eine Phosphorothioate-Bindung oder Methylphosphonat-Bindung ersetzt ist. Wenn das Oligonukleotid als eine Hybridisierungstest-Sonde verwendet wird, enthält das Oligonukleotid, wie oben erwähnt, bevorzugt eine Reportergruppe, wie z. B. einen Acridiniumester oder ein Radioisotop, wodurch die Identifizierung der Hybridisierung der Sonde mit ihrer Target-Sequenz erleichtert wird.
All diese Amplifikations-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren leicht hergestellt werden. Bevorzugt werden die Primer unter Verwendung des Festphasenverfahrens synthetisiert. Beispielsweise nach Carruthers, et al., wo die Anwendung des üblichen Phosphoroamidit-Festphasenverfahrens zur Verknüpfung der Nukleotide durch Phosphodiester-Bindungen beschrieben ist. Die automatisierte chemische Festphasen-Synthese unter Verwendung von Cyanoethylphosphoramidit-Vorläufern wurde durch Barone et al. beschrieben, Nucleic Acids Research, 12: 405 (1984) (Methods in Enzymology, Vol. 143, p. 287 (1987)). Bhatt beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Synthese von 1 Phosphorothioat-Bindungen enthaltenden Oligonukleotiden (U.S. Patent 5,449,769, welches zur Anmeldung der Nr. 07/319,570 korrespondiert, unter dem Titel "Method and Reagent for Sulphurization of Organophosphorous Compounds", welches sich der gleichen Eigentümerschaft wie die vorliegende Erfindung erfreut). Auch Klem et al. beschreibt in "Improved Process for the Synthesis of Oligomers", PCT WO 92/07864 die Synthese von Oligonukleotiden mit verschiedenen Verknüpfungen, wobei Methylphosphonat-Bindungen mit eingeschlossen sind. Die Verfahren für die organische Synthese von Oligonukleotiden sind in Sambrook, et al., supra, beschrieben und sie sind dem Fachmann bekannt.
Im Anschluss an die Synthese und die Reinigung eines spezifischen Oligonukleotids können mehrere unterschiedliche Verfahren zur Gütekontrolle der Sonde oder des Primers in Bezug auf Größe und Reinheit zum Einsatz gelangen. Geeignete Verfahren schließen die Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder Hochdruckflüssigchromatographie ein. Beide Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt.
Alle Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung, egal ob Hybridisierungstest-Sonden, Amplifikations-Oligonukleotide oder Helfer-Oligonukleotide können durch chemische Gruppen modifiziert sein, um so ihre Wirkung zu verstärken oder die Charakterisierung der Amplifikations-Produkte zu erleichtern. Beispielsweise erlauben Rückgrat-modifizierte Oligonukleotide, wie z. B. jene mit Phosphorothioat- oder Methylphosphonat- Gruppen, welche die Oligonukleotide resistent gegenüber der nukleolytischen Aktivität verschiedener Polymerasen machen, die Verwendung derartiger Enzyme bei der Amplifikation oder in anderen Reaktionen. Ein weiteres Modifikationsbeispiel betrifft die Verwendung von Nicht-Nukleotidverknüpfungen (z. B. Arnold et al., "Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes", Europäische Patentanmeldung, EP 0313 219, Anmeldungs- Nr. 88308766-0), die zwischen den Nukleotiden in der Nukleinsäurekette eingebaut sind und die nicht die Hybridisierung oder die Verlängerung der Primer stören. Amplifikations-Oligonukleotide können auch Mischungen von ausgesuchten modifizierten und natürlichen Nukleotiden enthalten.
Das 3'-Ende eines Amplifikations-Oligonukleotids kann blockiert sein, um so die Initiation der DNA-Synthese zu verhindern. Eine. Mischung von verschiedenen am 3'-Ende geblockten Amplifikations-Oligonukleotiden oder von am 3'-Ende geblockten und nicht geblockten Oligonukleotiden kann die Effizienz der Nukleinsäure-Amplifikation steigern.
Das 5'-Ende von Oligonukleotiden kann, wie oben offenbart, modifiziert sein, um so gegenüber der 5'-Exonukleaseaktivität resistent zu sein, die in einigen Nukleinsäure-Polymerasen vorliegt. Diese Modifikationen können durch Hinzufügung einer Nicht-Nukleotidgruppe an das terminale 5'-Nukleotid des Primers vollzogen werden, wobei solche Techniken verwendet werden, wie jene, die durch Arnold, et al., supra, unter dem Titel "Non- Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes" beschrieben wurden.
Nach erfolgter Synthese können ausgewählte Nukleotid-Sonden durch verschiedene wohlbekannte Verfahren (z. B. J. Sambrook, supra) markiert werden. Nützliche Marker beinhalten Radioisotope genauso wie nicht-radioaktive Reportergruppen. Isotopenmarker umfassen ³H, ³&sup5;S, ³²P, ¹²&sup5;I, &sup5;&sup7;Co und ¹&sup4;C. Isotopenmarker können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren, wie z. B. "nick-translation", Endmarkierung, Zweitstrangsynthese, die Verwendung der reversen Transkription und durch chemische Methoden in die Oligonukleotide eingebaut werden. Bei Verwendung radioaktiv markierter Sonden kann die Hybridisierung durch Autoradiographie, Szintillationszählung oder Gammazählung detektiert werden. Das ausgewählte Nachweisverfahren wird von dem zur Markierung verwendeten spezifischen Radioisotop abhängen.
Nicht-isotopische Materialien können ebenfalls zur Markierung verwendet werden und können innerhalb der Nukleinsäuresequenz oder am Ende der Nukleinsäuresequenz eingebaut werden. Modifizierte Nukleotide können enzymatisch oder chemisch eingefügt werden. Die chemischen Modifikationen an der Sonde können während oder nach der Synthese der Sonde, z. B. durch die Verwendung von Nicht-Nukleotidverknüpfungs-Gruppen, wie das bei Arnold et al., unter dem Titel "Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes", EP-Anmeldungs-Nr. 88308766.0, Veröffentlichungs-Nr. 313219 beschrieben ist, ausgeführt werden. Nicht-isotopische Marker umfassen fluoreszierende and chemilumineszierende Moleküle, Enzyme, Kofaktoren, Enzymsubstrate, Haptene oder andere Liganden.
Die Sonden werden bevorzugt mit einem Acridiniumester markiert. Die Markierung mit einem Acridiniumester kann wie durch Arnold et al., beschrieben, U.S. Patent No. 5,185,439 unter dem Titel "Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes", erteilt am 09. Februar 1993, ausgeführt werden.

2. Amplifikation von Borrelia rRNA und rDNA

Die Amplifikations-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung sind insbesondere auf Borrelia 16S oder 23S rRNA Nukleotidsequenzen und ihre rDNA Gegenstücke gerichtet. Diese Amplifikations-Oligonukleotide können von mindestens einer der Target-Nukleotidsequenzen umgeben sein oder können innerhalb mindestens einer der Target-Nukleotidsequenzen, die als ) Hybridisierungstest-Sonde zur Detektion auf die Anwesenheit von Borrelia in einem Nukleinsäure-Amplifikations-Test verwendet werden, enthalten sein. Die hier beschriebenen und beanspruchten Amplifikations-Oligonukleotide umfassen zwei Sätze von Amplifikations-Oligonukleotiden. Die Bestandteile des Satzes von Amplifikations-Oligonukleotiden sind in der Lage mit einer Nukleinsäure zu hybridisieren, die eine der folgenden Nukleotidsequenzen aufweist oder dieser im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 36: ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT,
SEQ ID NO 37: TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATAGAGGAAG,
SEQ ID NO 38: TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGGGTGG,
SEQ ID NO 39: ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT,
SEQ ID NO 40: CCCGTTTCCCATCGACTACACTTTTCAG,
SEQ ID NO 41: GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC,
SEQ ID NO 42: CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG,
SEQ ID NO 51: ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU,
SEQ ID NO 52: UAUGUUGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUAGAGGAAG,
SEQ ID NO 53: UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGGGUGG,
SEQ ID NO 54: ACGCUCGCCCCUUACGUAUUACCGCGGCU,
SEQ ID NO 55: CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG,
SEQ ID NO 56: GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC,
SEQ ID NO 27: TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG,
SEQ ID NO 57: CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG, und
SEQ ID NO 29: UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG.
In bevorzugten Ausführungsformen besitzen diese Amplifikations- Oligonukleotide eine der folgenden Sequenzen oder entsprechen diesen im wesentlichen:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,
SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA,
SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU,
SEQ ID NO 45: CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA,
SEQ ID NO 46: CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA,
SEQ ID NO 47: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU,
SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 49: GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC,
SEQ ID NO 50: CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG und
SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA.
Diese Oligonukleotide können zudem zusätzliche, nicht komplementäre Basen an ihrem 5-Ende aufweisen, wobei diese eine Promotersequenz umfassen, die in der Lage ist, an eine RNA-Polymerase zu binden und die RNA-Transkription unter Verwendung der Target-Nukleinsäure als Template zu steuern.
Bevorzugte, gegen die 16S rRNA aus Borrelia gerichtete Amplifikations-Primer besitzen die folgenden Nukleinsäuresequenzen oder entsprechen diesen im wesentlichen:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,
SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU,
SEQ ID NO 46: CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA,
SEQ ID NO 47: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU.
Diese 16S rRNA Amplifikations-Oligonukleotide können gegen eine spezifische Borrelia 16S rRNA Nukleinsäuresequenz bzw. gegen deren rDNA Gegenstücke gerichtet sein und zum Teil oder vollständig mit diesen Sequenzen überlappen.
Ebenfalls bevorzugt sind 16S Amplifikations-Oligonukleotide mit einer Nukleotidsequenz, die im wesentlichen der folgenden Nukleinsäuresequenz entspricht:
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA.
Am meisten bevorzugt sind 16S Amplifikations-Oligonukleotide mit einer Nukleotidsequenz, die im wesentlichen der folgenden Nukleinsäuresequenz entspricht:
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA,
worin die 19 nächsten 3' Nukleotide genau den oben gezeigten entsprechen.
Bevorzugte, gegen die 23S rRNA aus Borrelia gerichtete Amplifikations-Primer, besitzen die folgenden Nukleinsäuresequenzen oder entsprechen diesen im wesentlichen:
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,
SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 49: GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC und
SEQ ID NO 50: CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG.
Diese 23S rRNA Amplifikations-Oligonukleotide können gegen eine spezifische Borrelia 2% rRNA Nukleinsäuresequenz bzw. gegen deren rDNA Gegenstücke gerichtet sein und zum Teil oder vollständig mit diesen Sequenzen überlappen.
Alle Amplifikations-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung können Sequenzen besitzen, die keine Modifikationen oder Hinzufügungen zu diesen Sequenzen enthalten. Die Amplifikations-Oligonukleotide können ebenfalls oder alternativ Modifikationen, wie z. B. geblockte 3'- oder 5'-Enden oder Hinzufügungen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, der Hinzufügung einer spezifischen Nukleotidsequenz, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird (z. B. der Promoter-Sequenz für die T7, T3, oder SP6 RNA-Polymerase), der Hinzufügung von Sequenzen, die die Initiation oder Verlängerung der RNA- Transkription durch eine RNA-Polymerase verstärken oder von Sequenzen, die der intramolekularen Basenpaarung dienen und die die Ausbildung von Sekundär- oder Tertiärstrukturen der Nukleinsäure unterstützen, enthalten.
Amplifikations-Oligonukleotide werden in einem Nukleinsäure- Amplifikations-Verfahren, wie z. B. der Polymerasekettenreaktion oder einer Amplifikations-Reaktion, unter Verwendung der RNA-Polymerase, der DNA-Polymerase und der RNAse H oder seines Äquivalents, wie durch Kacian und Fultz supra, Dattagupta et al., supra, und durch Sninsky et al., U.S. Patent Nr. 5,089,351 beschrieben, wobei sich die ersten beiden Referenzen der gleichen Eigentümerschaft wie die vorliegende Erfindung erfreuen, eingesetzt.
Eine große Vielzahl an Verfahren zur Detektion einer amplifizierten Target-Sequenz stehen zur Verfügung. Beispielsweise können die Nukleotid-Substrate oder die Primer einen detektierbaren Marker, der in die neusynthetisierte DNA eingebaut wird, umfassen. Das resultierende markierte Amplifikations-Produkt wird anschließend von den nicht eingebauten markierten Nukleotiden oder Primern abgetrennt und der Marker wird in der abgetrennten Produktfraktion detektiert.
Substanzen, die als nützliche detektierbare Marker dienen können, sind im Stand der Technik wohlbekannt und umfassen radioaktive Isotope, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, Chromophore, genauso wie Liganden, wie z. B. Biotin und Haptene, die, obwohl nicht direkt detektierbar, jedoch jeweils über ihre spezifischen Bindungspartnern, wie z. B. Avidin und Antikörper leicht detektiert werden können.
Eine andere Vorgehensweise betrifft die Detektion des Amplifikations-Produktes durch die Hybridisierung mit einer detektierbaren Nukleinsäure-Sonde und dem Vermessen des resultierenden Hybrids nach einem konventionellen Verfahren.
Insbesondere kann das Produkt durch die Hybridisierung einer chemilumineszierenden, mit einem Acridiniumester markierten Nukleinsäure-Sonde an die Target-Sequenz bestimmt werden, wobei der an der nicht hybridisierten Sonde vorliegende Acridiniumester selektiv hydrolisiert wird und die von dem verbliebenen Acridiniumester hervorgerufene Chemilumineszenz in einem Luminometer vermessen wird (siehe z. B. Arnold, et al., supra, WO 89/02435, (PCT Anmeldung Nr. US88/02746) und Nelson, et al., "NonIsotopic DNA Probe Technologies", Academic Press, San Diego (Kricka, ed. 1992).

D. Test-Sonden für die Hybridisierung von Oligonukleotiden mit rRNA und rDNA aus Borrelia

Die hier offenbarten und beanspruchten Oligonukleotid- Hybridisierungstest-Sonden sind in der Lage, bevorzugt mit Target-Nukleinsäuren zu hybridisieren, die rRNA oder rDNA Nukleotidsequenzen aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia enthalten, gegenüber Nukleinsäuren von phylogenetisch eng verwandten Bakterienarten. Diese Hybridisierungstest-Sonden wurden, basierend auf einem Vergleich der Nukleotidsequenzen von sich entsprechenden Regionen der ribosomalen RNA aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia und den besagten phylogenetisch eng verwandten Arten konstruiert, ausgewählt und/oder ausgesucht. In bevorzugten Ausführungsformen hybridisieren diese Sonden selektiv mit den Nukleinsäuren aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia gegenüber den Nukleinsäuren aus Borrelia hermsii.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Oligonukleotid- Hybridisierungs-Sonden, die selektiv mit den Nukleinsäuren aus Borrelia-Arten, einschließlich aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia oder aus Borrelia hermsii, jedoch nicht mit den Nukleinsäuren aus eng verwandten Mikroorganismen hybridisieren und die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die die folgenden Nukleinsäuresequenzen besitzen oder diesen im wesentlichen entsprechen:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,
SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC,
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,
SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.
Die Hybridisierungstest-Sonden der vorliegenden Erfindung, die selektiv an die Nukleinsäure aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia hybridisieren, besitzen die folgenden Nukleotidsequenzen oder entsprechen diesen im wesentlichen:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC.
Gegenwärtig, bevorzugte Ausführungsformen dieser Oligonukleotid-Hybridisierungstest-Sonden, die gegen die 16S rRNA aus mit Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia gerichtet sind, besitzen die folgenden Nukleotidsequenzen oder entsprechen diesen im wesentlichen:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC und
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC.
Bevorzugte Ausführungsformen dieser Oligonukleotid- Hybridisierungstest-Sonden, die gegen die 23S rRNA aus mit Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia gerichtet sind, besitzen die folgenden Nukleotidsequenzen oder entsprechen diesen im wesentlichen:
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC.
Eine Reihe der Oligonukleotid-Hybridisierungstest-Sonden der vorliegenden Erfindung hybridisieren bevorzugt an Target- Nukleinsäuren, die rRNA oder rDNA Nukleotidsequenzen aus Borrelia hermsii enthalten, als gegenüber Nukleinsäuren aus anderen phylogenetisch eng verwandten Bakterienarten. In bevorzugten Ausführungsformen können diese Hybridisierungstest- Sonden, Nukleinsäuren aus Borrelia hermsii von anderen Borrelia Nukleinsäuren unterscheiden.
Die Hybridisierungs-Sonden der vorliegenden Erfindung, die selektiv an Nukleinsäuren hybridisieren, die aus Borrelia hermsii stammen, besitzen die folgenden Nukleotidsequenzen oder entsprechen diesen im wesentlichen:
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,
SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,
SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.
Bevorzugte Ausführungsformen dieser Oligonukleotid- Hybridisierungstest-Sonden, die gegen die 16S rRNA aus Borrelia hermsii gerichtet sind, besitzen die folgenden Nukleotidsequenzen oder entsprechen diesen im wesentlichen:
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,
SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC und
SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC.
Bevorzugte Ausführungsformen dieser Oligonukleotid- Hybridisierungstest-Sonden, die gegen die 23S rRNA aus Borrelia hermsii gerichtet sind, besitzen die folgenden Nukleotidsequenzen oder entsprechen diesen im wesentlichen:
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,
SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.
Die Oligonukleotid-Hybridisierungstest-Sonden der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt mit einem Reportergruppen-Element, wie z. B. einem Radioisotop, einer fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Gruppe, mit einem Enzym oder mit einem anderen Liganden markiert, welches zur Detektion oder für die Bestätigung, dass die Sonde an die Target-Sequenz hybridisiert ist, eingesetzt werden kann. Der Anmelder bevorzugt am meisten die Verwendung von chemilumineszierenden Acridiniumestern als Marker. Siehe Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,185,439, welches sich der gleichen Eigentümerschaft wie die vorliegende Erfindung erfreut. Die Testsonde wird mit einer Probe vermischt, für die vermutet wird, dass sie eine Nukleinsäure mit der Target-Sequenz enthält, wobei dies unter Hybridisierungs-Bedingungen erfolgt, die geeignet sind, um das Anlagern der beiden Strängen durch Wasserstoffbrücken-Bindung in der komplementären Region zu erlauben. Die Sonde kann auch mit einem oder mehreren nicht markierten Helfer- Oligonukleotiden kombiniert sein, um so die Anbindung an die Nukleinsäure mit der Target-Borrelia-Nukleotidsequenz zu erleichtern. Die Sonde hybridisiert anschließend mit der in der Probe vorliegenden Target-Nukleinsäure; die resultierende Hybrid-Duplex kann abgetrennt und durch verschiedene, im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren, wie z. B. der Hydroxyapatit-Adsorption und radioaktives Monitoring, detektiert werden. Bei diesen Verfahren sind auch jene Verfahren mit eingeschlossen, die den selektiven Abbau des an der nicht hybridisierten Sonde vorliegenden Markers und dem anschließenden Vermessen der Menge an mit der verbliebenen, hybridisierten Sonde verbundenen Markers beinhalten, wie das in Arnold et al., U.S. Patent Nr. 5,283,174, offenbart ist, welches sich der gleichen Eigentümerschaft wie die vorliegende Anmeldung erfreut. Hier wird das letztere Verfahren durch die Anmelder bevorzugt.

E. Helfer-Oligonukleotide in der Verwendung zur Detektion von Borrelia

Spezifische Helfer-Oligonukleotide wurden verwendet, um die Hybridisierung der Hybridisierungstest-Sonden an die Target- Nukleinsäure zu erleichtern. Helfer-Oligonukleotide werden in Hogen and Milliman, U.S. Patent Nr. 5,030,557, unter dem Titel "Means and Method for Enhancing Nucleic Acid Hybridization", welches sich der gleichen Eigentümerschaft wie die vorliegende Anmeldung erfreut, beschrieben.
Helfer-Sonden werden so ausgewählt, dass sie mit Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, die nahe bei der Region liegen, gegen die die Hybridisierungstest-Sonde gerichtet ist. Die Hybridisierung der Helfer-Sonde verändert die Sekundär- und Tertiärstruktur der Target-Nukleinsäure, so dass die Hybridisierung der Sonde an die Target-Nukleinsäure erleichtert wird.
Spezifische Helfer-Oligonukleotide zur Erleichterung der spezifischen Detektion von Borrelia Nukleinsäuren besitzen eine dieser Nukleotidsequenzen oder entsprechen einer dieser im wesentlichen:
SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA,
SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,
SEQ ID NO 15: CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA,
SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG,
SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA und
SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA.
In anderen Ausführungsformen besitzen spezifische Helfer- Oligonukleotide zur Erleichterung der spezifischen Detektion der Borrelia Nukleinsäure eine der folgenden Nukleotidsequenzen oder entsprechen einer dieser im wesentlichen:
SEQ ID NO 3: TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG,
SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,
SEQ ID NO 14: UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG,
SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU,
SEQ ID NO 27: TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG und
SEQ ID NO 29: UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG.
In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Hybridisierungstest- Sonde, die gegen die 16S ribosomalen Nukleinsäuren aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia gerichtet ist, in einer Sondenmischung zusammen mit einem Helfer-Oligonukleotid verwendet, welches eine der folgenden Nukleotidsequenzen besitzt oder im wesentlichen einer von diesen entspricht:
SEQ ID NO 3: TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG,
SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA,
SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,
SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,
SEQ ID NO 14: UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG,
SEQ ID NO 15: CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA,
SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU und
SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform wird die Hybridisierungs-Sonde, die gegen die 16S von mit der Lyme- Krankheit assoziierten Borrelia gerichtet ist und im wesentlichen:
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC
ribosomaler Nukleinsäure entspricht, in einer Sondenmischung zusammen mit einem Helfer-Oligonukleotid verwendet, dass die folgende Nukleotidsequenz besitzt oder dieser im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA,
SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,
SEQ ID NO 15: CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA und
SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform wird die Hybridisierungs-Sonde, die gegen die 16S von mit der Lyme- Krankheit assoziierten Borrelia gerichtet ist und im wesentlichen:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC
entspricht, in einer Sondenmischung zusammen mit einem Helfer- Oligonukleotid verwendet, dass die folgende Nukleotidsequenz besitzt oder dieser im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 3: TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG,
SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,
SEQ ID NO 14: UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG und
SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU.
In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Hybridisierungstest- Sonde, die gegen die 23S Nukleinsäuren von mit der Lyme- Krankheit assoziierten Borrelia gerichtet ist, in einer Sondenmischung zusammen mit einem Helfer-Oligonukleotid verwendet, dass die folgende Nukleotidsequenz besitzt oder dieser im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 23: GATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA,
SEQ ID NO 27: TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG,
SEQ ID NO 28: GAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA und
SEQ ID NO 29: UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform wird die Hybridisierungs-Sonde, die gegen die 23S von mit der Lyme- Krankheit assoziierten Borrelia gerichtet ist und im wesentlichen:
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
entspricht, in einer Mischung zusammen mit einem Helfer- Oligonukleotid verwendet, dass eine der folgenden Nukleotidsequenzen besitzt oder dieser im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 23: GATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA und
SEQ ID NO 28: GAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA.
In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Hybridisierungs- Sonde, die gegen die 16S ribosomalen Nukleinsäuren aus Borrelia hermsii gerichtet ist und im wesentlichen der SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 33 entspricht, in einer Sondenmischung zusammen mit einem Helfer-Oligonukleotid verwendet, dass eine der folgenden Nukleotidsequenzen besitzt oder dieser im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,
SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,
SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU und
SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG.
In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Hybridisierungs- Sonde, die gegen die 16S ribosomalen Nukleinsäuren aus Borrelia hermsii gerichtet ist und im wesentlichen:
SEQ ID NO 10: GCGGATATGCAAGTCTATGC,
entspricht, in einer Sondenmischung zusammen mit einem Helfer- Oligonukleotid verwendet, dass die folgende Nukleotidsequenz besitzt oder dieser im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG und
SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG.
In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Hybridisierungs- Sonde, die gegen die 23S ribosomalen Nukleinsäuren von Borrelia hermsii gerichtet ist, in einer Sondenmischung zusammen mit einem Helfer-Oligonukleotid verwendet, dass eine folgenden Nukleotidsequenzen besitzt oder dieser im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 23: GATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA,
SEQ ID NO 27: TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG,
SEQ ID NO 28: GAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA und
SEQ ID NO 29: UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG.
In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Hybridisierungs- Sonde, die gegen die 23S ribosomalen Nukleinsäuren aus Borrelia hermsii gerichtet ist und im wesentlichen:
SEQ ID NO 22: GTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
entspricht, in einer Sondenmischung zusammen mit einem Helfer- Oligonukleotid verwendet, dass die folgende Nukleotidsequenz besitzt oder dieser im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 23: GATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA und
SEQ ID NO 28: GAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA.
Helfer-Oligonukleotide können im allgemeinen unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen verwendet werden, wobei sie aber nicht notwendigerweise artspezifisch in der Selektivität sind; d. h., die Target-Nukleotidsequenzen für die Helfer- Oligonukleotide sind nicht notwendigerweise einzigartig für die Borrelia-Arten.

F. Nukleinsäure-Zusammensetzungen

In einem anderen verwandten Aspekt betrachtet die Erfindung Zusammensetzungen, die ein Nukleinsäurehybrid aus einer Hybridisierungstest-Sonde und einer hierzu im wesentlichen komplementären Nukleinsäuresequenz (Sonde: Target) umfassen. Eine Verwendung des aus der Sonde und dem Target gebildeten Hybrids besteht in der Detektion auf die Anwesenheit einer Target-Sequenz. Beispielsweise ist der in Hybriden vorliegende Acridiniumester ("AE") gegenüber der Hydrolyse in alkalischer Lösung resistent, wohingegen der in der Einzelstrang- Nukleinsäure vorliegende AE in alkalischer Lösung hydrolisiert wird (Arnold et al., unter dem Titel "Homogenous Protection Assay", EP-Anmeldungs-Nr. 88308767.8, Veröffentlichungs-Nr. 309230 und in U.S. Patent Nr. 5,238,174). Somit kann die Anwesenheit der Target-Nukleinsäuren nach der Hydrolyse der nicht gebundenen AE-markierten Sonde durch Messen der Chemilumineszenz des verbliebenen, mit dem Nukleinsäurehybrid assoziierten Acridiniumester, festgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenso Zusammensetzungen, die ein Nukleinsäurehybrid aus einem Amplifikations- Oligonukleotid und einer hierzu im wesentlichen komplementären Nukleinsäuresequenz (Primer: Target) umfassen. Eine Verwendung des aus dem Primer und dem Target gebildeten Nukleinsäurehybrides betrifft die Bereitstellung einer Initiationsstelle für eine Polymerase am 3'-Ende des Amplifikations-Oligonukleotides. Beispielsweise können die Hybride eine Initiationsstelle für die reverse Transkriptase, für DNA-Polymerasen, wie z. B. der Taq Polymerase oder der T4 DNA-Polymerase und für RNA-Polymerasen, wie z. B. der T7 Polymerase, der SP6 Polymerase, den T3 Polymerasen und dergleichen ausbilden.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Zusammensetzungen, die Nukleinsäurehybride aus einem Helfer- Oligonukleotid und einer hierzu im wesentlichen komplementären Nukleinsäuresequenz (Helfer-Oligonukleotid : Target) umfassen. Eine Verwendung des Hybrides aus dem Helfer-Oligonukleotid und dem Target besteht darin, dass eine spezifische Nukleinsäuresequenz für die Hybridisierung verfügbar gemacht wird. Beispielsweise kann ein Hybrid aus einem Helfer- Oligonukleotid und seinem Target eine Nukleinsäuresequenz in die Lage versetzen, an die Target-Sequenz zu hybridisieren, welche für die Hybridisierung mit einer Hybridisierungssonde zur Verfügung steht. Eine vollständige Beschreibung der Verwendung von Helfer-Oligonukleotiden wird in Hogan and Milliman, U.S. Patent Nr. 5,030,557 gegeben.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen Zusammensetzungen zur Detektion von Nukleinsäure aus Borrelia ein, wobei diese ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das aus einer Borrelia-Nukleinsäure und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gebildet wird, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,
SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC,
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,
SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG,
SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC,
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA,
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,
SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU,
SEQ ID NO 45: CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA,
SEQ ID NO 46: CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA,
SEQ ID NO 47: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU,
SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 49: GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC und
SEQ ID NO 50: CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG.
Bevorzugte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen Zusammensetzungen zur Detektion von mit der Lyme- Krankheit assoziierten Borrelia ein, wobei diese ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das aus einer Borrelis- Nukleinsäure und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gebildet wird, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACWAUAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,
SEQ ID NO 26: CGGAUUWCCUAUCAAGAUCAUCACC,
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA,
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,
SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU,
SEQ ID NO 45: CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA,
SEQ ID NO 46: CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA,
SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 49: GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC und
SEQ ID NO 50: CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG.
Bevorzugte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen Zusammensetzungen zur Detektion von mit der Lyme- Krankheit assoziierten Borrelia ein, wobei diese ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das aus einer Borrelis Nukleinsäure und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gebildet wird, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC und
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Zusammensetzungen zur Detektion von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, die ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das aus einer Borrelia-Nukleinsäure und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz ausgebildet ist, die im wesentlichen:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
entspricht und welche zudem ein Oligonukleotid beinhaltet, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
und
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Zusammensetzungen zur Detektion von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, die ein Nukleinsäurehybrid beinhalten, das aus einer Borrelia-Nukleinsäure und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz ausgebildet ist, die im wesentlichen:
SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU,
entspricht und welche zudem ein Oligonukleotid beinhalten, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 45: CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA oder
SEQ ID NO 46: CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA.
Bevorzugte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen Zusammensetzungen zur Detektion von Borrelia hermsii ein, die ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das aus einer Borrelia hermsii Nukleinsäure und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz ausgebildet ist, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,
SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,
SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG,
SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC,
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,
SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG und
SEQ ID NO 49: GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC.
Besonders bevorzugte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen Zusammensetzungen zur Detektion von Borrelia hermsii ein, die ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das aus einer Borrelia hermsii Nukleinsäure und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz ausgebildet ist, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG und
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Zusammensetzungen zur Detektion von Borrelia hermsii, die ein Nukleinsäurehybrid beinhalten, das aus einer Borrelia hermsii Nukleinsäure und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz ausgebildet ist, welche im wesentlichen:
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA,
entspricht und welche zudem ein Oligonukleotid beinhalten, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT und
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Zusammensetzungen zur Detektion von Borrelia hermsii, die ein Nukleinsäurehybrid beinhalten, das aus einer Borrelia hermsii Nukleinsäure und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz ausgebildet ist, welche im wesentlichen:
SEQ ID NO 45: CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA,
entspricht und welche zudem ein Oligonukleotid beinhalten, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU und
SEQ ID NO 47: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Nukleinsäurehybride, die Sonden der vorliegenden Erfindung und zudem zumindestens ein Helfer-Oligonukleotid umfassen, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 3: TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG,
SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA,
SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,
SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,
SEQ ID NO 14: UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG,
SEQ ID NO 15: CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA,
SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU,
SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG,
SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA,
SEQ ID NO 27: TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG,
SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA und
SEQ ID NO 29: UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Zusammensetzungen zur Detektion von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, die ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das aus einer Borrelia-Nukleinsäure und einem Oligonukleotid ausgebildet ist, welches Nukleinsäuresequenzen besitzt, die im wesentlichen:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT und
SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU,
entsprechen und welche zudem ein Oligonukleotid beinhalten, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA,
SEQ ID NO 45: CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA,
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA und
SEQ ID NO 46: CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA,
und wahlweise ein oder mehrere Oligonukleotide enthalten, die eine Sequenz besitzen, welche einer der folgenden Sequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA,
SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,
SEQ ID NO 15: CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA,
SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG,
SEQ ID NO 3: TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG,
SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,
SEQ ID NO 14: UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG und
SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Zusammensetzungen zur Detektion von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, die ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das aus einer Borrelia-Nukleinsäure und einem Oligonukleotid ausgebildet ist, welches Nukleinsäuresequenzen besitzt, die im wesentlichen:
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG und
SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG,
entsprechen und welche zudem ein Oligonukleotid beinhalten, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,
SEQ ID NO 49: GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC,
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG und
SEQ ID NO 50: CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG,
und wahlweise ein oder mehrere Oligonukleotide enthalten, die eine Sequenz besitzen, welche einer der folgenden Sequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC,
SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA,
SEQ ID NO 27: TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG,
SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA und
SEQ ID NO 29: UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Zusammensetzungen zur Detektion von Borrelia hermsii, die ein Nukleinsäurehybrid beinhalten, das aus einer Borrelia hermsii Nukleinsäure und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz ausgebildet ist, die im wesentlichen:
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA und
SEQ ID NO 45: CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA
entspricht und welche zudem ein Oligonukleotid beinhalten, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU,
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT und
SEQ ID NO 47: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU.
und wahlweise ein oder mehrere Oligonukleotide enthalten, die eine Sequenz besitzen, welche einer der folgenden Sequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,
SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,
SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,
SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU und
SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Zusammensetzungen zur Detektion von Borrelia hermsii, die ein Nukleinsäurehybrid beinhalten, das aus einer Borrelia hermsii Nukleinsäure und einem Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz ausgebildet ist, die im wesentlichen:
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG und
SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG,
entspricht und welche zudem ein Oligonukleotid beinhalten, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,
SEQ ID NO 49: GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC,
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG und
SEQ ID NO 50: CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG,
und wahlweise ein oder mehrere Oligonukleotide enthalten, die eine Sequenz besitzen, welche einer der folgenden Sequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG,
SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,
SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC,
SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA,
SEQ ID NO 27: TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG,
SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA und
SEQ ID NO 29: UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG.
In bevorzugten Ausführungsformen betrachtet die vorliegende Erfindung ebenfalls Nukleinsäurehybride, die Sonden der vorliegenden Erfindung umfassen und zudem mindestens ein Helfer-Oligonukleotid besitzen, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, welche mindestens einer der folgenden Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen entspricht:
SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA,
SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,
SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Zusammensetzungen zur Detektion von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, die ein Nukleinsäurehybrid umfassen, das aus einer Borrelia-Nukleinsäure und einem Oligonukleotid ausgebildet ist, das Nukleinsäuresequenzen besitzt, die im wesentlichen:
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA oder
SEQ ID NO 45: CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA,
entsprechen, wobei die 19 3' nächsten Nukleotide genau wie gezeigt sind.

G. Testverfahren

Die vorliegende Erfindung betrachtet verschiedene Verfahren zum Testen auf die Anwesenheit von Borrelia-Nukleinsäure innerhalb einer Probe. Der Fachmann wird verstehen, dass die genauen Testbedingungen, die verwendeten Sonden oder Primer in Abhängigkeit vom speziellen Zuschnitt des Testes und von der Herkunft der Probe variieren werden.
Allgemein betrachtet die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von Borrelia-Mikroorganismen durch das Kontaktieren einer Testprobe mit einer Nukleinsäure- Hybridisierungstest-Sonde unter stringenten Hybridisierungs- Bedingungen, wobei die Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde zur Hybridisierung an eine Borrelia Target-Nukleinsäure und nicht an Nukleinsäuren aus eng verwandten Mikroorganismen unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen in der Lage ist und die besagte Target-Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz besitzt, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,
SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC,
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,
SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.
Bevorzugte Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia beinhalten den Schritt des Kontaktierens einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen mit einer Nukleinsäure- Hybridisierungstest-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen zur Hybridisierung an eine Target-Nukleinsäuresequenz aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia und nicht an Nukleinsäuresequenzen aus eng verwandten Bakterien, wie z. B. Borrelia hermsii, in der Lage ist und die besagte Target-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC.
Besonders bevorzugte Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von mit der Krankheit assoziierten Borrelia beinhalten den Schritt des Kontaktierens einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen an eine Nukleinsäure- Hybridisierungstest-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen zur Hybridisierung an eine Target-Nukleinsäuresequenz aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia und nicht an eine Nukleinsäuresequenz aus eng verwandten Bakterien, wie z. B. Borrelia hermsii, in der Lage ist und die besagte Target-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG und
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von Borrelia Mikroorganismen durch Kontaktieren einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungs- Bedingungen mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen zur Hybridisierung an eine 16S ribosomale Nukleinsäuresequenz aus Borrelia und nicht an Nukleinsäuresequenzen aus eng verwandten Mikroorganismen in der Lage ist und die besagten Target- Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen einer Sequenz entsprechen, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,
SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC und
SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC.
Allgemein betrachtet die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von Borrelia Mikroorganismen durch Kontaktieren einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungs- Bedingungen mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen zur Hybridisierung an die 2% ribosomale Nukleinsäure aus Borrelia und nicht an Nukleinsäuresequenzen aus eng verwandten Mikroorganismen in der Lage ist und die besagte Target- Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAASATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC,
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,
SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von Borrelia hermsii Mikroorganismen durch Kontaktieren einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungs- Bedingungen mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen zur Hybridisierung an eine 16S ribosomale Nukleinsäuresequenz aus Borrelia und nicht an die Nukleinsäure aus eng verwandten Mikroorganismen, wie z. B. Borrelia burgdorferi und anderen mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, in der Lage ist und die besagte Target-Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz besitzt, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,
SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC und
SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von Borrelia hermsii Mikroorganismen durch Kontaktieren einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungs- Bedingungen mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen zur Hybridisierung an eine 23S ribosomale Nukleinsäuresequenz aus Borrelia und nicht an Nukleinsäuresequenzen aus eng verwandten Mikroorganismen, wie z. B. Borrelia burgdorferi und anderen mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, in der Lage ist und die besagte Target-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,
SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia Mikroorganismen durch Kontaktieren einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen zur Hybridisierung an eine 16S ribosomale Nukleinsäuresequenz aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia und nicht an Nukleinsäuresequenzen aus eng verwandten Mikroorganismen in der Lage ist und die besagte Target-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC und
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC.
Am meisten bevorzugt sind Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia Mikroorganismen durch Kontaktieren einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen mit einer Nukleinsäure- Hybridisierungstest-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen zur Hybridisierung an eine 16S ribosomale Nukleinsäuresequenz aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia und nicht an Nukleinsäuresequenzen aus eng verwandten Mikroorganismen in der Lage ist und die besagte Target-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC und
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia Mikroorganismen durch Kontaktieren einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen zur Hybridisierung an eine 23S ribosomale Nukleinsäuresequenz aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia und nicht an Nukleinsäuresequenzen aus eng verwandten Mikroorganismen in der Lage ist und die besagte Target-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC.
Am meisten bevorzugt sind Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia Mikroorganismen durch Kontaktieren einer Testprobe unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen mit einer Nukleinsäure- Hybridisierungstest-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen zur Hybridisierung an eine 23S ribosomale Nukleinsäuresequenz aus mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia und nicht an Nukleinsäuresequenzen aus eng verwandten Mikroorganismen in der Lage ist und die besagte Target-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen der folgenden Nukleotidsequenz entspricht:
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG.
Die vorliegende Erfindung betrachtet zudem Verfahren zur Detektion von Borrelia Mikroorganismen, bei dem zuerst ein Teil der Borrelia Nukleinsäure amplifiziert wird und anschließend hinsichtlich einer spezifischen Borrelia Nukleinsäure, die durch die Primer der vorliegenden Erfindung amplifiziert wurde, wahlweise eine Hybridisierungstest-Sonde der vorliegenden Erfindung verwendend, getestet wird. Die amplifzierte Nukleinsäure kann durch eine Anzahl von Verfahren, einschließlich der Gelelektrophorese, detektiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen betrachtet die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion von Borrelia Nukleinsäure, wobei zuerst die besagte Nukleinsäure mit mindestens einem Amplifikations-Oligonukleotid amplifiziert wird, das daran bindet oder eine Verlängerung durch eine oder mehrere der folgenden Sequenzen bewirkt:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA,
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,
worin das besagte Amplifikations-Oligonukleotid wahlweise eine Nukleinsäuesequenz besitzt, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder die Verlängerung durch eine RNA-Polymerase verstärkt.
Diesem ersten Verfahrensschritt folgt dann wahlweise die Detektion der amplifizierten, in dem Amplifikations-Schritt gebildeten Nukleinsäure mit einer Oligonukleotid- Hybridisierungstest-Sonde, die unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen in der Lage ist, spezifisch an Borrelia Nukleinsäuren zu hybridisieren.
Das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Amplifikations-Oligönukleotid kann wahlweise eine Nukleinsäuresequenz besitzen, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder die Verlängerung durch eine RNA-Polymerase verstärkt.

H. Diagnose-Systeme

Die vorliegende Erfindung betrachtet ebenfalls Diagnose-Systeme in Form eines Kits. Ein diagnostisches System der vorliegenden Erfindung kann einen Kit beinhalten, der in für mindestens einen Test ausreichender Menge Amplifikations-Primer und/oder Hybridisierungstest-Sonden der vorliegenden Erfindung in einem Verpackungsmaterial enthält. Typischerweise werden diese Kits zudem Anweisungen für die Anwendung der verpackten Primer und/oder Sonden enthalten.
Die verschiedenen Komponenten des Diagnose-Systems können in verschiedenen Formen bereitgestellt werden. Beispielsweise können die erforderlichen Enzyme, die Nukleotidtriphosphate, die Primer und die Sonden als ein lyophilisiertes Reagens bereitgestellt werden. Diese lyophilisierten Reagenzien können vor der Lyophilisierung vorgemischt werden, so dass diese nach Wiederherstellung eine vollständige Mischung mit dem richtigen Verhältnis jeder der Komponenten bilden, die bereit für den Einsatz in dem Test ist. Zusätzlich können die Diagnose-Systeme der vorliegenden Erfindung ein Wiederherstellungs-Reagens zur Wiederherstellung der lyophilisierten Reagenzien des Kits enthalten. In bevorzugten Kits werden die Enzyme, die Nukleotide, die Triphosphate und die für die Enzyme erforderlichen Kofaktoren als ein einzelnes lyophilisiertes Reagens bereitgestellt, das nach der Wiederherstellung ein geeignetes Reagens für die Verwendung in den vorliegenden Verfahren bildet. In diesen bevorzugten Kits kann zudem ein lyophilisiertes Primer-Agens bereitgestellt werden. In anderen bevorzugten Kits werden lyophilisierte Sonden-Reagenzien bereitgestellt.
Typische Verpackungsmaterialien werden stabile Grundgerüste, wie z. B. Glas, Kunststoff, Papier, Folie oder dergleichen einschließen, die in der Lage sind, innerhalb festgelegter Begrenzungen die Hybridisierungstest-Sonde oder den Amplifikations-Primer der vorliegenden Erfindung festzuhalten. Somit kann z. B. eine aus Verpackungsmaterialien hergestellte Verpackung ein Glasfläschchen sein, dass verwendet wird, um Mikrogramm- bis Milligramm-Mengen eines betreffenden Primers oder Hybridisierungstest-Sonde zu enthalten, oder es könnte eine Mikrotiterplattenvertiefung sein, in der die Sonden und/oder Primer der vorliegenden Erfindung wirksam angeheftet wurden, d. h. so verknüpft, das sie zur Teilnahme in einem Detektions-Verfahren der vorliegenden Erfindung befähigt sind.
Die Verwendungsvorschriften beinhalten typischerweise eine klare Darstellung, die die verschiedenen Reagenzien und/oder Konzentrationen der Reagenzien und mindestens einen Parameter des Testverfahrens, welcher zum Beispiel die relativen Mengen der Reagenzien für die Verwendung pro Menge an Probe sein könnte, beschreiben. Zusätzlich können zudem Daten wie die Haltbarkeit, Zeiträume, die Temperatur und Pufferbedingungen mit eingeschlossen sein.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Diagnose-Systeme oder Kits, die die Oligonukleotide einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten. Die vorliegende Erfindung betrachtet zudem Diagnose-Systeme oder Kits, die die Oligonukleotide enthalten, die für die Ausführung eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung erforderlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Diagnose-Systeme oder Kits, die mindestens ein Oligonukleotid enthalten, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,
SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG und
SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Diagnose-Systeme oder Kits, die wahlweise mindestens eine Helfer-Sonde aufweisen, die eine Nukleinsäuresequenz besitzt, die im wesentlichen der Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 3: TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG,
SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,
SEQ ID NO 14: UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG,
SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU,
wenn das besagte Oligonukleotid ist:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC oder
SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
oder
SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA,
SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,
SEQ ID NO 15: CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA,
SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG,
wenn das besagte Oligonukleotid ist:
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC oder
SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
oder
SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA,
SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA,
wenn das besagte Oligonukleotid ist:
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Diagnose-Systeme oder Kits, die mindestens ein Oligonukleotid enthalten, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC und
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,
und wahlweise eine 5'-Sequenz besitzt, die durch eine RNA- Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder die Verlängerung durch eine RNA-Polymerase verstärkt.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Diagnose-Systeme oder Kits, die wahlweise mindestens ein Oligonukleotid aufweisen, das eine Nukleinsäuresequenz besitzt, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC und
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,
wenn die besagten zwei Oligonukleotide ausgewählt sind aus der Gruppe aus:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,
oder
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG und
SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,
wenn die besagten Oligonukleotide ausgewählt sind aus der Gruppe aus:
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC und
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Diagnose-Systeme oder Kits, die Oligonukleotide enthalten, die eine Nukleinsäuresequenz besitzen, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entspricht:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA und
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC oder
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Diagnose-Systeme oder Kits, die Oligonukleotide enthalten, die eine Nukleinsäuresequenz besitzen, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entspricht:
SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,
SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA und
SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC oder
SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Diagnose-Systeme oder Kits, die Oligonukleotide enthalten, die eine Nukleinsäuresequenz besitzen, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entspricht:
SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,
SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA und
SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC oder
SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Diagnose-Systeme oder Kits, die Oligonukleotide enthalten, die eine Nukleinsäuresequenz besitzen, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entspricht:
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG oder
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC.
Die vorliegende Erfindung betrachtet Diagnose-Systeme oder Kits, die Oligonukleotide enthalten, die eine Nukleinsäuresequenz besitzen, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entspricht:
SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,
SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,
SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG oder
SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC.

Beispiele:

Es werden nachfolgend Beispiele zur Veranschaulichung verschiedener Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gegeben. Diese Beispiele sind nicht gedacht, die offenbarte Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
Die für die mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, einschließlich Borrelia burgdorferi, spezifischen Sonden wurden über die veröffentlichten und bestimmten 16S und 23S rRNA Sequenzen identifiziert. Die Nukleinsäuresequenz der phylogenetisch nahen Nachbarn B. hermsii, B. turicatae, B. anserina und B. coriaceae wurden als Vergleiche zu der Nukleinsäuresequenz aus B. burgdorferi für die Identifizierung variabler Regionen verwendet.
Die folgenden Hybridisierungstest-Sondensequenzen werden in den Beispielen, wie unten beschrieben, aufgeführt: SEQ ID NO. 1, SEQ ID No. 2 und SEQ ID NO. 21, die gegen B. burgdorferi Sequenzen gerichtet sind und SEQ ID NOS. 10 und 22, die gegen B. hermsii Sequenzen gerichtet sind.
Die Sonden wurden, wie durch Arnold et al., supra, "Non- Nucleotide Linking Reagents For Nucleotide Probes" beschrieben, mit einer Nicht-Nukleotid-Verknüpfung synthetisiert, anschließend, wie durch Arnold et al., supra, U.S. Patent Nr. 5,185,439 beschrieben, mit einem chemilumineszierenden Acridiniumester markiert. Die Reaktivität und die Spezifität der Sonden für die mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia wurden unter Verwendung eines homogenen Testformates, wie durch Arnold et al. supra, "Homogenous Protection Assay" und Arnold et al., Clin. Chem. 35: 1588 (1989) beschrieben, demonstriert. Die Ergebnisse werden in relativen Lichteinheiten (RLU) angegeben, einer Maßeinheit für Photonen, die durch einen Luminometer detektiert werden. Die Sonden hybridisierten an die Nukleinsäure eines Zell-Lysats oder an Produkten der Target- Amplifikations-Reaktionen. Die folgenden Beispiele beschreiben Hybridisierungstest-Sonden und Amplifikations-Oligonukleotide, die gegen die mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, einschließlich Borrelia burgdorferi, gerichtet sind und deren Verwendung in Hybridisierungs- und Amplifikations- /Hybridisierungstests.

Beispiel 1: Die Detektion von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia unter Verwendung einer gegen die 16S rRNA gerichtete Sonde

Dieses Beispiel veranschaulicht die Fähigkeit einer Sonde, die gegen die 16S rRNA aus von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia gerichtet ist, zur unmittelbaren Detektion der mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia Nukleinsäure aus B. burgdorferi, jedoch nicht der B. hermsii Nukleinsäure. Die Sondenlösung enthält eine Acridiniumester-markierte Sonde, die nach der Sequenz SEQ ID NO. 1 synthetisiert wurde und die entsprechenden nicht markierten Helfer-Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID NO. 3 und SEQ ID NO. 5. Die Target-Sequenz für die Sonde, die aus der SEQ ID NO. 1 besteht, wurde so ausgewählt, dass sie für die Stämme identisch ist, die die Gruppe der mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia repräsentieren und somit ist für diese Sonde zu erwarten, dass sie alle drei Unterarten oder Arten, die mit der Lyme-Krankheit assoziiert sind (VS461, B. burgdorferi sensu strictu und B. qarinii) detektiert.
Nachfolgend wird das Alignment einer Region der B. burgdorferi, B. hermsii und E. coli 16S Sequenzen gezeigt, wobei Punkte Ähnlichkeiten in der Sequenz anzeigen:
E. coli 16S
5'- GGCGGUUUGUUAAGUCUG-AU-3'
..... . .......
Bbu GGCGGAUAUAUAAGUCUUACG-3'
Bhe ......... GC...... ....
Im folgenden Experiment wurde die aus lysierten Zellen freigesetzte Nukleinsäure unmittelbar getestet. Ein Beispiel eines Verfahrens zur Präparation eines Lysats ist durch Murphy et al., EP-Veröffentlichungs-Nr. 288618 gegeben. Fünfzig ul eines jeden Zell-Lysats und 50 ul Sondenlösung, 100 mM Lithiumsuccinat pH 5, 2% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 1.2 M Lithiumchlorid, 20 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 20 mM Ethylenglykol-bis-(beta-amino-ethylether)-N,N,N',N'- Tetraessigsäure (EGTA) enthaltend, wurden vermischt und bei 60ºC für 20 Minuten inkubiert, gefolgt durch die Zugabe von 0.3 ml von 0.15 M Natriumtetraborat pH 8.5, 1% Triton® X-100 und der Inkubation bei 60ºC für 15 Minuten. Die Reaktionen wurden abgekühlt und die verbliebene Chemilumineszenz der hybridisierten Acridiniumester-markierten Sonde wurde in einem Luminometer nach automatischer Einspritzung von 0.1% Wasserstoffperoxid in 1 mM Salpetersäure, gefolgt durch die Einspritzung einer 1 N Natriumhydroxidlösung vermessen. Die Ergebnisse wurden in relativen Lichteinheiten oder RLU angegeben. Eine die SEQ ID NOS. 58-63 enthaltende All- Bakterien-/Hefe-Sondenmischung mit Helfer-Oligonukleotiden wurde als eine Kontrolle verwendet, um die Anwesenheit bakterieller Nukleinsäure zu demonstrieren. Hogan et al., supra, unter dem Titel "Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organisms" gibt Beispiele geeigneter All-Bakterien-/Hefe-Sondenmischungen an. Die Werte zeigen, dass die Sonde an die mit der Lyme-Krankheit assoziierte Borrelia-Art, Borrelia burordorferi hybridisiert und sie von deren phylogenetisch engen Verwandten, Borrelia hermsii unterscheidet. Tabelle 1. Die Hybridisierung der Sonde SEQ ID NO. 1 an die rRNA aus Borrelia burqdorferi und Borrelia hermsii.

Beispiel 2: Die Detektion von Borrelia-Organismen unter Anwendung der Amplifikation gefolgt durch die Hybridisierung mit einer Oligonukleotid-Sonde

Die Detektion einer kleinen Anzahl an Borrelia-Organismen kann durch Amplifikation der rRNA oder rDNA vor dem Hybridisierungstest verstärkt werden. In diesem Experiment wurde gereinigte B. burodorferi DNA aus ungefähr 30.000 Organismen mit zu B. burgdorferi rRNA Sequenzen komplementären oder homologen Oligonukleotiden amplifiziert. Ein Amplifikations-Oligonukleotid bestand aus einem Promoter- Primer, der am 3'-Ende nach der SEQ ID NO. 7 und am 5'-Ende nach einer T7-Promotersequenz der SEQ ID NO. 43 (nachfolgend werden die Promoter-Primer durch die SEQ ID NO. ihrer Target- Bindungsregion identifiziert) synthetisiert wurde und das zweite Oligonukleotid bestand aus einem Primer der Sequenz SEQ ID NO. 8 oder 9. Die Amplifikations-Mischung enthielt 50 mM Tris HCl, pH 8,5, 40 mM Kaliumacetat, 6 mM GTP, 6 mM ATP, 2.5 mM UTP, 2.5 mM CTP, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dTTP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dGTP, 17.5 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithiothreitol, 10% (v/v) Glyzerin, 2 mM Spermidin, 30 umol des Promoter-Primers der SEQ ID NO. 7 und 30 umol des Primers der SEQ ID NO. 8 oder 9 in einem Endvolumen von 100 ul. Die Mischung wurde für 8 Minuten auf 95ºC erhitzt, auf 42ºC abgekühlt und 900 Einheiten an MMLV reverser Transkriptase (RT) und 400 Einheiten an T7 RNA-Polymerase wurden hinzugefügt. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 42ºC wurden 20 ul der Amplifikations-Reaktion durch die Hybridisierung an die Acridiniumester-markierte Sonde der Sequenz SEQ ID NO. 1 und an nicht markierte Helfer der SEQ ID NO. 3 und 5 getestet. Die Ergebnisse von Doppel-Reaktionen wurden angegeben. Tabelle 2. Die Amplifikation der Borrelia burgdorferi rDNA und die Selektion mit der Sonde der SEQ ID NO. 1
Diese Daten zeigen, dass die zur Borrelia-RNA komplementäre Sonde der SEQ ID NO. 1 zur unmittelbaren Detektion der rRNA Sequenzen oder zur Detektion der Produkte der Amplifikations- Reaktionen verwendet werden kann. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass Primer-Sätze mit der SEQ ID NO. 7 (plus SEQ ID NO. 43 am 5'-Ende) und entweder der SEQ ID NO. 8 oder 9 zur Amplifikation der B. burgdorferi Nukleinsäure in der Lage sind. Es erscheint zudem, dass die SEQ ID NO: 9 der wirksamere Primer des negativen Sinns ist.

Beispiel 3: Die Amplifikation von Borrelia-Nukleinsäure unter Verwendung von Primern die an die 16S rRNA Sequenzen hybridisieren

In diesem Beispiel wurde Nukleinsäure aus Borrelia mit Primern amplifiziert, die zu 16S ribosomalen RNA-Sequenzen komplementär oder homolog sind. Lysat von B. burgdorferi oder von B. hermsii Zellen wurde durch Hybridisierung mit einer Sonde, die gegen eine konservierte Region der RNA gerichtet ist, quantifiziert. Die RNA wurde verdünnt und zu einer Reaktionsmischung, 30 umol des Promoter-Primers der SEQ ID NO. 8 mit der SEQ ID NO. 43 am 5'-Ende und 30 umol des Primers der SEQ ID NO. 7 enthaltend, hinzugefügt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen waren 100 mM Tris HCl, pH 8.5, 35 mM Kaliumchlorid, 4 mM GTP, 4 mM ATP, 4 mM UTP, 4 mM CTP, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dTTP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dGTP, 20 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithiothreitol, 10% Glyzerin, 2 mM Spermidin. Die Mischung wurde für 5 Minuten auf 95ºC erhitzt, auf 42ºC abgekühlt und 800 U an MMLV RT und 400 U an T7 RNA-Polymerase wurden hinzugefügt. Im Anschluss an eine zweistündige Inkubation bei 42ºC wurden 10 ul der Reaktion durch Hybridisierung, wie in Beispiel 1 beschrieben, in der Gegenwart von 15 mM Aldrithiol unter Verwendung einer Sonde, die nach der Sequenz SEQ ID NO. 2 synthetisiert wurde und von nicht markierten Helfer-Sonden der Sequenzen der SEQ ID NOS. 4 und 6, getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Primer die Borrelia burgdorferi-Nukleinsäure erfolgreich amplifiziert haben und so die Detektion kleiner Mengen von Borrelia rRNA erlaubt wurde. Sogar in Gegenwart eines gewaltigen Überschusses an B. hermsii-Nukleinsäuren wurde keine signifikante Kreuzreaktion beobachtet. Die Ergebnisse von Dreifachreaktionen sind dargestellt. Tabelle 3. Die Amplifikation von Borrelia burgdorferi und Borrelia hermsii Nukleinsäure mit Primern der SEQ ID NOS. 7/8 und der Detektion mit der Sonde der SEQ ID NO. 2.

Beispiel 4: Die Amplifikation und die Detektion von Borrelia unter Verwendung der Hybridisierungstest-Sonden Nr. 2 und 10

In diesem Beispiel wurde mit der Ausnahme, dass ein Promoter- Primer der SEQ ID NO. 8 (mit einer 5'-Promotersequenz der SEQ ID NO. 43), ein Primer der Sequenz SEQ ID NO. 11 und eine Sonde der SEQ ID NO. 10 verwendet wurden, die Amplifikation wie in Beispiel 3 durchgeführt. Die in diesem Beispiel verwendeten Acridiniumester-markierten Sonden und die nicht markierten Helfer-Sonden werden in der Tabelle gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Primer in der Lage sind, sowohl B. burgdorferi und B. hermsii rRNA Sequenzen zu amplifizieren und dass die Sonden zwischen den zwei Organismen in dem offenbarten Testsystem unterscheiden. Tabelle 4. Die Amplifikation von Borrelia burgdorferi und Borrelia hermsii Nukleinsäure und die Detektion mit der Sonde der SEQ ID NO. 2 und 10

Beispiel 5: Die Detektion von Borrelia unter Verwendung einer gegen die 23S ribosomale RNA gerichtete Sonde

Die 23S rRNA Sequenz aus B. burgdorferi wurde veröffentlicht, J. Clin. Microbiol. 30: 3082 (1992) und J. Bacteriol. 174: 3766- 3774 (1992). Zum Entwerfen der spezifischen, gegen die. 23S rRNA Sequenzen aus Borrelia gerichteten Primer und Sonden waren die Sequenzen von eng verwandten Organismen erforderlich. Borrelia hermsii, Borrelia coriaceae und Borrelia turicatae wurden in BSK H Medium (Sigma) für mehrere Tage angezogen, abzentrifugiert und in 50 mM Tris Rd pH 8.0 resuspendiert. Die DNA wurde im Anschluß an die Lyse in mit Tris Rd [pH 8.0] äquilibrierten Phenol präpariert. Das Endprodukt wurde durch Ethanolfällung isoliert. Die 5'- und 3'-Bereiche der 23S rDNA Sequenz wurden mit Primern, die gegen konservierte Regionen der Borrelia-Arten oder gegen die spezifische Sequenz von Borrelia burgdorferi gerichtet waren, unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und der AmpliTaq Polymerase (Perkin- Elmer) amplifiziert. Die gereinigten Amplifikations-Produkte wurden unter Verwendung der kommerziell verfügbaren Kits von Promega (fmol Kit) oder von New England Biolabs (Circumvent) Kit) und unter Verwendung des ³&sup5;S-dNTP Einbaus sequenziert. Die erhaltene Sequenz wurde mit der veröffentlichten Borrelia burpdorferi-Sequenz (Genbank Accession Numbers M88330, J. Clin. Microbiol. 3: 3082 (1992) und M93664 J. Bacteriol., 174: 3766-74 (1992)verglichen.
Eine spezifische Sequenz, in welcher B. burgdorferi zu B. hermsii und zu B. turicatae variiert, wurde für die Gestaltung der Sonde für die 23S ausgewählt. Diese Region korrespondiert zu den Basen 1478-1500 von E. coli, B. hermsii und B. turicatae besitzen identische Nukleotidsequenzen in dieser Region, welche zu der B. burgdorferi-RNA in 4 Basen variiert. Eine Sonde wurde gegen B. burgdorferi (SEQ ID NO. 21) und eine zweite Sonde wurde gegen B. hermsii/B. turicatae (SEQ ID NO. 22)entworfen. Die rRNA Sequenzen sind nachfolgend gezeigt:
E. coli · GGC- - -UGGUUUUCCAGGCAAAUCCG
.. .. ... .......
Bbu GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG (SEQ ID NO. 25)
.... ..... .. ............
Bhe GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG (SEQ ID NO. 31)
Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um die Effizienz der Amplifikation und die Spezifität der Sonde zu demonstrieren. Lysate wurden aus Kulturen von B. burgdorferi, Stamm N40, und von B. turicatae durch Resuspendieren der Zellen aus 7 ml einer Kultur in 0.75 ml einer 10 mM N-Acetyl-L- Cystein, 2 mM EDTA, 40 mM Tris HCl pH 8 enthaltenden Lösung und durch Erhitzen für fünf Minuten auf 60ºC präpariert. Zum Quantifizieren der Menge der Nukleinsäure in jeder Probe wurden Hybridisierungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit verschiedenen Mengen der Probe und einer Sonde, die gegen eine konservierte Region der Borrelia 23S rRNA gerichtet ist, ausgeführt. Die erhaltenen Werte wurden mit den Ergebnissen eines bekannten Standards verglichen.
Bekannte Mengen der Nukleinsäure in sowohl einem B. burgdorferi und einem B. turicatae Lysat wurden in einer 100 ul Reaktion mit 30 umol eines Promoter-Primers, mit einer 5'- Promotersequenz (SEQ ID NO. 43) und einer 3'-Target- Hybridisierungs-Region die entweder nach der SEQ ID NO. 19 oder der SEQ ID NO. 20 synthetisiert wurde und einem Primer mit der SEQ ID NO. 18 amplifiziert. Die Lysate wurden in Wasser auf die geeignete Konzentration verdünnt und zu einer den Primer und den Promoter-Primer enthaltenden Lösung hinzugefügt, für 15 Minuten auf 95ºC erhitzt und für fünf Minuten auf 42ºC abgekühlt. 900 Einheiten an Moloney Murine Leukemia Virus reverser Transkriptase (MMLV RT) und 400 Einheiten an T7 RNA- Polymerase wurden hinzugefügt. Die endgültige Amplifikations- Mischung enthielt 50 mM Tris Hei, pH 8.5, 35 mM Kaliumchlorid, 4 mM GTP, 4 mM ATP, 4 mM UTP, 4 mM CTP und 1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 20 mM Magnesiumchlorid, 20 mM N- Acetyl-L-Cystein und 5% Glyzerin. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 42ºC wurden die gesamten 100 ul der Amplifikations-Reaktion durch Hybridisierung mit einer Acridiniumester-markierten Sonde der SEQ ID NO. 21 getestet.
Die Hybridisierung wurde in 200 ul einer 0.05 M Lithiumsuccinat pH 5, 0.6 M LiCl, 1% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA enthaltenden Lösung für 10 Minuten bei 60ºC, gefolgt durch die Zugabe von 300 ul von 0.15 M Natriumtetraborat pH 8.5, 1% TRITON® X-100 durchgeführt. Diese Mischung wurde für 10 Minuten bei 60ºC inkubiert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die in jedem Röhrchen verbliebene Chemilumineszenz wurde in einem Gen-Probe LEADER® I Luminometer, der ausgerüstet ist mit der automatischen Einspritzung von 1 mM Salpetersäure und 0.1% Wasserstoffperoxid, gefolgt durch die Einspritzung einer 1 N Natriumhydroxid enthaltenden Lösung, getestet. Die Ergebnisse sind als RLU angegeben. Tabelle 5: Die Amplifikation von Borrelia burgdorferi-Nukleinsäure mit Amplifikations-Oligonukleotiden, die die SEQ ID NO. 19 und 18 oder 20 und 18 umfassen, gefolgt durch die Detektion mit einer die SEQ ID NO. 21 umfassenden Sonde.
In anderen Experimenten wurde ein Oligonukleotid mit der Sequenz der SEQ ID NO. 19 als ein Primer verwendet. Für die Primer mit den SEQ ID NOS. 18 und 19 und den SEQ ID NO. 23 und 19 wurde gezeigt, dass sie rRNA Sequenzen der beiden B. burgdorferi Stämme B31 und BN40 amplifizieren (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 6: Die spezifische Detektion von Borrelia hermsii unter Verwendung einer gegen die 23S rRNA gerichteten Hybridisierungstest-Sonde

In diesem Beispiel wurde die Spezifität einer Sonde gegenüber B. hermsii demonstriert. B. burgdorferi, B. hermsi und B. turicatae sind im Hinblick auf die 23S rRNA Nukleinsäuresequenz sehr eng verwandt. Es wurde eine Sonde entworfen, um sowohl B. hermsii als auch B. turicatae in der gleichen Region der 23S rRNA wie die B. burgdorferi 23S rRNA Sonde zu detektieren. Zwei synthetische, entweder die B. burgdorferi oder die B. hermsii/B. turicatae Sequenz enthaltenden Targets wurden synthetisiert und jedes Target wurde mit der Sonde der SEQ ID NO. 22 unter den beschrieben Bedingungen hybridisiert, mit der Ausnahme, dass die Hybridisierung für 15 Minuten bei 55ºC durchgeführt wurde. Nachdem 300 ul einer 0.15 M Natriumtetraborat pH 8.5, 1% TRITON® X-100 enthaltenden Lösung hinzugefügt wurden, wurden die Reaktionen für 5 Minuten bei 55ºC inkubiert. Die Proben wurden in einem Luminometer, wie oben beschrieben, eingelesen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Sonde B. hermsii Sequenzen von B, burgdorferi Sequenzen unterscheiden kann. Tabelle 6: Die Hybridisierung der B. hermsii/R. turicatae Sonde mit B. hermsii und B. burgdorferi synthetischen DNA Tarpets

Beispiel 7: Die Amplifikation und die Detektion von Borrelia unter Verwenduno einer 23S rRNA Hybridisierungstest-Sonde

Als nächstes wurde die Amplifikation und die Detektion von B. turicatae-Nukleinsäüre demonstriert. B. turiatae Zell-Lysat wurde mit 30 umol eines Primers, der nach der SEQ ID NO. 18 synthetisiert wurde und 30 umol eines Promoter-Primers mit einer 5'-Sequenz der SEQ ID NO. 43 und einer 3'-Target- Hybridisierungs-Region der SEQ ID NO. 19 amplifiziert. Die gesamte Amplifikations-Reaktion wurde mit einer Sonde der SEQ ID NO. 22 in Gegenwart von 2.5 umol einer nicht markierten Helfer-Soride der SEQ ID NO. 23 für 15 Minuten bei 55ºC hybridisiert und anschließend für 5 Minuten bei 55C, der Zugabe von 0.15 mol Natriumtetraborat pH 8.5, 1% TRITON® X-100 folgend, inkubiert und in einem Luminometer eingelesen. Identische Signale wurden für B. hermsii erwartet, da die Sequenzen der beiden Organismen in dieser Region der 23S rRNA identisch sind. Tabelle 7: Die Amplifikation von B. turicatae rRNA Sequenzen

Beispiel 8 Die spezifische Amplifikation und die spezifische Detektion von Borrelia in Gegenwart von im Blut gefundenen Mikroorganismen

Der Primer der SEQ ID NO. 18 und der Promoter-Primer mit der SEQ ID NO. 20 am 3'-Ende wurden zur Amplifikation von Zell- Lysaten verwendet, die von einer Reihe von Organismen präpariert wurden, für welche erwartet wird, dass sie in Blut- Isolaten gefunden werden. Mindestens 3 · 10&supmin;¹&sup9; mol an rRNA aus jedem Zell-Lysat wurden mit einer Sonde getestet, die nach der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO. 21 (Tabelle 8) oder der SEQ ID NO. 22 synthetisiert wurden (Daten nicht gezeigt). Mit jeder der Sonden wurde keine Kreuzreaktion gegenüber Nicht-Borrelia- Arten beobachtet. Die Sonde der Sequenz der SEQ ID NO. 22 ergab ein starkes Signal (> 2,000,000 RLU) mit der B. turicatae- Kultur, welches die Anwesenheit von B. turicatae-Zellen bestätigte. Die Ergebnisse der Detektion mit der SEQ ID NO. 22 werden in der nachfolgenden Tabelle gezeigt. Tabelle 8: Die Amplifikation von Sequenzen von aus Blutproben isolierten Mikroorganismen
Die obigen Ergebnisse bestätigen, dass die neuen Amplifikations-Oligonukleotide und Sonden, die hier offenbart und beansprucht werden, in der Lage sind, Borrelia rRNA Sequenzen zu amplifizieren und in der Lage sind, die mit der Lyme-Krankheit assoziierte Borrelia, Borrelia burgdorferi von anderen Bakterien und anderen Mitgliedern der Gattung Borrelia zu unterscheiden.

Beispiel 9: Die Amplifikation und die spezifische Detektion von Borrelia unter Verwendung einer 16S ribosomalen Sonde

Die Hybridisierungstest-Sonde der SEQ ID No. 1, die für die 16S ribosomale Nukleinsäure spezifisch ist, wurde zur Detektion der Anwesenheit von Borrelia und zur Bestimmung, dass diese Hybridisierungstest-Sonde keine Kreuz-Reaktionen mit anderen, allgemein im Blut gefundenen Organismen zeigt, verwendet. Die Hybridisierungs-Sonde wurde mit Borrelia-Nukleinsäure in Zell- Lysaten in der Gegenwart von Helfer-Oligonukleotiden der SEQ ID NO. 3 und 5 hybridisiert. Der Test wurde, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung eines unmittelbaren Hybridisierungs-Formats durchgeführt. Die Anwesenheit von ribosomaler RNA wurde in jeder Probe durch Hybridisierung der Probe mit der All-Bakterien-Sonde und den Helfer- Oligonukleotiden der SEQ ID NOS. 58, 59, 60 und 61 oder mit einer Pilz-Sonde und den Helfer-Sonden der SEQ ID NOS. 62 und 63 bestätigt. In diesem Test wird ein Wert von größer als 30.000 relative Lichteinheiten (RLU) als positiv angesehen. Die Ergebnisse aus diesem Test werden unten in der Tabelle 9 gezeigt. Beispiel 9: Die spezifische Detektion von Borrelia unter Verwendung einer 16S ribosomalen RNA Sonde der SEQ ID NO. 1

Beispiel 10: Die Amplifikation und die Detektion von mit Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia aus drei verschiedenen phylogenetischen Gruppen

Die veröffentlichten Sequenzen weisen auf die Konservierung der rRNA Sequenz unter verschiedenen, mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia an der Stelle hin, auf die die Sonde der SEQ ID NO. 2 gerichtet ist. Die folgenden Daten demonstrieren, dass die Primer und die Sonden dieser Erfindung für die Amplifikation und die Detektion von Isolaten von mehr als einer geographischen Lokalisierung, repräsentierend die drei phylogenetischen Gruppierungen der mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia, anwendbar sind. Die Lysate wurden aus Kulturen von B. burgdorferi, Stamm N40 (Gruppe I), von B. garinii, Stamm IP-90 (ein russisches Isolat) und vom Stamm 014A (NBS16) (Gruppe II) und von B. afzelii, Stamm IP-3 (ein russisches Isolat) und vom Stamm 09A (ACA1, ein schwedisches Isolat) durch Resuspendieren der Zellen aus etwa 15 ml einer Kultur in 0.1 ml einer 30 mM Natriumphosphat pH 6.8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA und 3% (w/v) Lithiumlaurylsulfat enthaltenden Lösung, präpariert. Zur Quantifizierung der Menge an Nukleinsäure in jedem Lysat wurden Hybridisierungen mit verschiedenen Mengen des Lysats und einer, gegen eine konservierte Region der 23S rRNA gerichtete Sonde ausgeführt. Die erhaltenen Werte wurden mit den Ergebnissen eines bekannten Standards verglichen. Bekannte Mengen an B. burgdorferi, B. garinii und B. afzelli Lysat (ungefähr 3 · 10&supmin;¹&sup9; mol an rRNA repräsentierend) wurden in einer Polymerasekettenreaktion amplifiziert, die 50 umol eines Primers mit einer 3'-Target-Hybridisierungs-Region der SEQ ID NO. 8, die gegenüber der 16S rRNA von B. burgdorferi komplementär ist und einen Primer des gleichen Sinns wie die rRNA der SEQ ID NO. 11 und 50 mM Tris HCl pH 8, 25 mM KCl, 2 mM Magnesiumchlorid und 2.5 U an AmpliTaq Polymerase (Perkin- Elmer) enthielt. Die Reaktionen wurden für zwei Minuten auf 95ºC erhitzt und anschließend 35 mal einem Zyklus über die Temperaturen von 55ºC/1 min. 72ºC/1 min und 95ºC/0.5 min unterworfen, gefolgt durch das Abkühlen auf 4ºC bis zum Test. Die Agarose-Gel-Analyse zeigte, dass die Nukleinsäure aus allen drei phylogenetischen Gruppen zu einem, durch Ethidiumbromid- Färbung detektierbaren 175 Basenpaar-Fragment geführt hat. Die Hybridisierung der Proben, die Nukleinsäuren des B. afzelii Stammes 09A enthielfen, mit der Acridiniumester-markierten Sonde der SEQ ID NO. 2 bei 56ºC ergab ein positives Signal mit dieser Sonde (mindestens 19fach zum Hintergrund). Die Proben, die Nukleinsäuren aus B. burqdorferi, B. aarinii, Stamm IP-90 oder 014A oder aus B. afzelli IP-3 enthielten, ergaben ein Signal, dass sogar bei einer Hybridisierung bei 60ºC mindestens 178fach zum Hintergrund war. Der B. afzelli Stamm 098 ergab ein niedrigeres Hybridisierungs-Signal als die anderen Isolate, wurde aber dennoch deutlich gegenüber dem Hintergrund detektiert.

Beispiel 11: Die spezifische Amplifikation und die Detektion von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia bei 56ºC

In diesem Beispiel wurde eine 100 ul Reaktion, die 30 umol eines Promoter-Primers, der nach der Sequenz der SEQ ID NO. 8 synthetisiert wurde und einen Primer der Sequenz der SEQ ID NO. 11 enthielt, verwendet. Die Lysate wurden auf die geeignete Konzentration in Wasser verdünnt und zu einer den Primer und den Promoter-Primer enthaltenden Lösung hinzugefügt, für 15 Minuten auf 95ºC erhitzt und für 5 Minuten auf 42ºC abgekühlt. 900 Einheiten an Moloney Murine Leukemia Virus reverser Transkriptase (MMLV RT) und 400 Einheiten an T7 RNA-Polymerase wurden hinzugefügt. Die endgültige Amplifikationsmischung enthielt 50 mM Tris HCl pH 8.5, 35 mM Kaliumchlorid, 4 mM GTP, 4 mM ATP, 4 mM UTP, 4 mM CTP, 1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 20 mM MgCl&sub2;, 20 mM N-Acetyl-L-Cystein und 5% Glyzerin. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 42ºC wurde die gesamte 100 ul Amplifikations-Reaktion durch Hybridisierung mit einer Acridiniumester-markierten Sonde der Sequenz der SEQ ID NO. 2 und nicht markierten Helfer-Sonden der SEQ ID NOS. 4 und 6 oder der SEQ ID NO. 10 mit nicht markierten Helfern der SEQ ID NOS. 4 und 6 getestet. Die Hybridisierung wurde in 200 ul einer 0.05 M Lithiumsuccinat pH 5, 0.6 M LiCl, 1% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 10 mM EDTA und 10 mM EGTA enthaltenden Lösung, für 15 Minuten bei 56ºC, gefolgt durch die Zugabe von 300 ul von 0.15 M Natriumtetraborat pH 8.5, 1% Triton® X-100 durchgeführt. Diese Mischung wurde für 15 Minuten bei 56ºC inkubiert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die verbliebene Chemilumineszenz in jedem Röhrchen wurde in einem Gen-Probe LEADER® I Luminometer, der mit der automatischen Einspritzung von 1 mM Salpetersäure und 0.1% Wasserstoffperoxid, gefolgt durch die Einspritzung einer 1 N Natriumhydroxid enthaltenden Lösung ausgerüstet ist, getestet. Die Ergebnisse sind als RLU angegeben.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Hybridisierung der Sonde der SEQ ID NO. 2 bei 56ºC noch eine deutliche Unterscheidung zwischen B. burgdorferi und B. hermsii erlaubt. Tabelle 10: Die spezifische Amplifikation und die Detektion von mit der Lyme-Krankheit assoziierten Borrelia bei 56ºC

Beispiel 12: Die Amplifikation von Borrelia-Nukleinsäure unter Verwendung von Amplifikations- Primern, die eine Promotersequenz enthalten

Die Amplifikations-Oligos und Sonden können auch in einem Format eingesetzt werden, bei dem nur ein Promoter-Primer und kein Primer verwendet wird. Dieses Format wird durch die PCT- Veröffentlichung WO 93/22461 beschrieben. Zwei Promoter-Primer wurden so synthetisiert, dass jeder eine T7 RNA-Polymerase Promotersequenz der SEQ ID NO. 43, 5'- AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3' am 5'-Ende enthält, die kovalent an eine zum Target komplementäre Sequenz (SEQ ID NO. 8) am 3'- Ende angefügt ist. Ein Promoter-Primer wurde mit einer freien 3' OH-Gruppe synthetisiert und wurde zu 4 umol pro 100 ul Reaktion verwendet. Der zweite Promoter-Primer wurde mit einem Alkandiol am 3'-Ende synthetisiert und wurde zu 26 umol pro 100 ul Reaktion verwendet. Die Borrelia-Lysate wurden auf die geeignete Konzentration in Wasser verdünnt und zu einer den Promoter-Primer enthaltenden Lösung hinzugefügt, für fünf Minuten auf 95ºC erhitzt und für 15 Minuten auf 42ºC abgekühlt. 900 Einheiten an Moloney Murine Leukemia Virus reverser Transkriptase (MMLV RT) und 400 Einheiten an T7 RNA-Polymerase wurden hinzugefügt. Die endgültige Amplifikations-Mischung enthielt 50 mM Tris HCl, pH 8.5, 35 mM Kaliumchlorid, 4 mM GTP, 4 mN ATP, 4 mM UTP, 4 mM CTP, 1 mM dATP, 1 mMdTTP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 20 mM MgCl&sub2;, 20 mM N-Acetyl-L-Cystein und 5% Glyzerin. Nach einer 3.5-stündigen Inkubation bei 42ºC wurden 30 ul der Amplifikations-Reaktion durch Hybridisierung mit einer Acridiniumester-markierten Sonde der Sequenz der SEQ ID NO.2 und nicht markierten Helfer-Sonden der SEQ ID NOS. 4 und 6 getestet. Die Hybridisierung wurde in 200 ul einer 0.05 M Lithiumsuccinat pH 5, 0.6 M LiCl, 1% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA enthaltenden Lösung für 15 Minuten bei 60ºC, gefolgt durch die Zugabe von 300 ul von 0.15 M Natrium für 15 Minuten bei 60ºC und auf Raumtemperatur abgekühlt, durchgeführt. Die verbliebene Chemilumineszenz in jedem Röhrchen wurde in einem Gen-Probe LEADER® I Luminometer getestet. Die Tabelle zeigt auch Ergebnisse, die unter den gleichen Bedingungen erzielt wurden, wobei ein Paar an Promoter-Primern verwendet wurde, dass die gleiche Promoter- Sequenz der SEQ ID NO. 43, 5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3' und eine 3' Target komplementäre Region der SEQ ID NO. 9 enthielt. Vier pmol des Promoter-Primers mit einer freien 3' OH-Gruppe und 26 umol des gleichen Promoter-Primers, der mit einer 3' Alkandiol-Gruppe synthetisiert wurde, wurde pro 100 ul Reaktion verwendet. Tabelle 11: Die Amplifikation von Borrelia-Nukleinsäuren unter Verwendung von Amplifikations-Primern, die eine Promotersequenz enthalten
Andere Ausführungsformen sind innerhalb der folgenden Ansprüche enthalten.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: Gen-Probe Incorporated
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: NUKLEINSÄURESONDEN UND AMPLIFIKATIONSOLIGONUKLEOTIDE FÜR MIT DER LYME- KRANKHEIT ASSOZIIERTE BORRELIA
(iii) SEQUENZANZAHL: 63
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) NAME: Lyon & Lyon
(B) STRASSE: 633 West Fifth Street, Suite 4700
(C) ORT: Los Angeles
(D) STAAT: California
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): 90071-2066
(G) TELEFON: (213) 489-1600
(H) TELEFAX: (213) 955-0440
(I) TELEX: 67-3510
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUM: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) OPEPATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

GCATAGACTT ATATATCCGC C 21

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

GGCGGATATA TAAGTCTATG C 21

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure ·
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

TACTCACCCT TTACGCCCAA TAATCCCG 28

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

CGGGATTATT GGGCGTAAAG GGTGAGTA 28

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

CCAACATAGG TCCACAGTTG AGCTGTGGTA TTTTAT 36

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare ·
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

ATAAAATACC ACAGCTCAAC TGTGGACCTA TGTTGG 36

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 7:

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

AGCCGCGGTA ATACGTAAGG GTTTAGCGT 29

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

CTTCCTCTAT CAGACTCTAG ACATATAGTT TCCAACATA 39

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 9:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

CCACCCTTAC ACCAGAAATT CTAACTTCCT CTATCA 36

(2)INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 10:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

GGCGGATATG CAAGTCTATG C 21

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

AGCCGCGGTA ATACGTAAGG GGCGAGCGT 29

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 12:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

GCAUAGACUU AUAUAUCCGC C 21

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 13:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

GGCGGAUAUA UAAGUCUAUG C 21

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 14:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

UACUCACCCU UUACGCCCAA UAAUCCCG 28

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 15:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

CGGGAUUAUU GGGCGUAAAG GGUGAGUA 28

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 16:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

CCAACAUAGG UCCACAGUUG AGCUGUGGUA UUUAU 36

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 17:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

AUAAAAUACC ACAGCUCAAC UGUGGACCUA UGUUGG 36

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 18:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

CTGAAAAGTG TAGTCGATGG GAAACGGG 35

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

GCACTCATCA TCACATCTTA GCTC 24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 20:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

CGTATTTTGC AGAGTTCCTT AACG 24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

GGTGATGATC TTGATAGGAA AATCCG 26

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 22:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

GGTGTTGATT TTAGTAGGAA AATCCG 26

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

CGATGGTTGT CCTAGTTTAA GCATTAA 27

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 24:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

CGGATTTTCC TATCAAGATC ATCACC 26

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 25:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(11) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:

GGUGAUGAUC UTJGAUAGGAA AAUCCG 26

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 26:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

CGGAUUUUCC UAUCAAGAUC AUCACC 26

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 27:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:

TTAATGCTTA AACTAGGACA ACCATCG 27

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

CGAUGGUUGU CCUAGUUUAA GCAUUAA 27

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 29

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:

UUAAUGCUUA AACUAGGACA ACCAUCG 27

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 30:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

CGGATTTTCC TACTAAAATC AACACC 26

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 31:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:

GGUGUUGAUU UUAGUAGGAA AAUCCG 26

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 32:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:

CGGAUUUUCC UACUAAAAUC AACACC 26

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 33:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:

GCATAGACTT GCATATCCGC C 21

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 34

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:

GGCGGAUAUG CAAGUCUAUG C 21

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 35:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP; DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:

GCAUAGACUU GCAUAUCCGC C 21

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 36:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:

ACGCTAAACC CTTACGTATT ACCGCGGCT 29

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 37:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:

TATGTTGGAA ACTATATGTC TAGAGTCTGA TAGAGGAAG 39

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 38:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:

TGATAGAGGA AGTTAGAATT TCTGGTGTAA GGGTGG 36

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 39:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:

ACGCTCGCCC CTTACGTATT ACCGCGGCT 29

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 40:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:

CCCGTTTCCC ATCGACTACA CTTTTCAG 28

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 41:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:

GAGCTAAGAT GTGATGATGA GTGC 24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 42:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:

CGTTAAGGAA CTCTGCAAAA TACG 24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 43:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGA 27

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 44:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:

AGCCGCGGUA AUACGUAAGG GUUUAGCGU 29

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 45:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:

CUUCCUCUAU CAGACUCUAG ACAUAUAGUU UCCAACAUA 39

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 46:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:

CCACCCUUAC ACCAGAAAUU CUAACUUCCU CUAUCA 36

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 47:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:

AGCCGCGGUA AUACGUAAGG GGCGAGCGU 29

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 48:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:

CUGAAAAGUG UAGUCGAUGG GAAACGGG 28

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 49:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:

GCACUCAUCA UCACAUCUUA GCUC 24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 50:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 24 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:

CGUAUUUUGC AGAGUUCCUU AACG 24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 51:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:

ACGCUAAACC CUUACGUAUU ACCGCGGCU 29

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 52:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52:

UAUGUUGGAA ACUAUAUGUC-UAGAGUCUGA UAGAGGAAG 39

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 53:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:

UGAUAGAGGA AGUUAGAAUU UCUGGUGTJAA GGGUGG 36

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 54:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 54:

ACGCUCGCCC CUUACGUAUU ACCGCGGCU 29

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 55:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 55:

CCCGUUUCCC AUCGACUACA CUUUUCAG 28

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 56:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 56:

GAGCUAAGAU GUGAUGAUGA GUGC 24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 57:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 57:

CGUUAAGGAA CUCUGCAAAA UACG 24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 58:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 58:

GGAACTTACC CGACAAGGAA TTTCGCTACC TTAGG 35

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 59:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 59:

ACCGTTATAG TTACGGCCGC CGTTTACTGG GGCTTC 36

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 60:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 60:

GCCTGGCCAT CGTTACGCCA TTCGTGCAGG TC 32

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 61:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 61:

GCCCAAATCG TTACGCCTTT CGTGCGGGTC 30

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 62:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANOFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 62:

CCCGACCGTC CCTATTAATC ATTACGATGG 30

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 63:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 46 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 63:

CTACGACGGT ATCTGATCAT CTTCGATCCC CTAACTTTCG TTCTTG 46

Claims

1. Eine Hybridisierungstest-Sonde zur Detektion eines Mitglieds der Gattung Borrelia umfassend eine Oligonukleotidsonde mit einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, die unter stringenten Hybridizierungstest-Bedingungen zumindest an einem Bereich einer Borrelia-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wobei die Borrelia-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,

SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,

SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,

SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC,

SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC,

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,

SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,

SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC,

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,

SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und

SEQ ID NO32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.

2. Die Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde nach Anspruch 1, wobei unter diesen stringenten Hybridisierungsbedingungen die Sonde vorzugsweise an eine Borrelia-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, jedoch nicht an die Nukleinsäuren von phylogenetisch eng verwandten Mikroorganismen.

3. Eine Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde zur Detektion eines Mitglieds der Gattung Borrelia unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, die im wesentlichen einer Oligonukleotidsonde entspricht, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG und

SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC.

4. Eine Sondenmischung, die ein Oligonukleotid nach Anspruch 1 und zumindest ein Helfer-Oligonukleotid umfaßt.

5. Die Sondenmischung nach Anspruch 4, wobei das Helfer- Oligonukleotid ein Oligonukleotid mit einer Länge von 10-100 Nukleotiden ist und unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine Borrelia-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wobei das Helfer-Oligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 3: TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG,

SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA,

SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,

SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,

SEQ ID NO 14: UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG,

SEQ ID NO 15: CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA,

SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU,

SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG,

SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA und

SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA.

6. Die Sondenmischung nach Anspruch 4, wobei das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC entspricht,

und wobei das Helfer-Oligonukleotid ein Oligonukleotid ist, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA und

SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG besteht.

7. Die Sondenmischung nach Anspruch 4, wobei das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC entspricht,

und wobei das Helfer-Oligonukleotid ein Oligonukleotid ist, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 3: TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG und

SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT besteht.

8. Die Sondenmischung nach Anspruch 4, wobei das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen

SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC entspricht,

und wobei das Helfer-Oligonukleotid ein Oligonukleotid ist, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz

SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG entspricht.

9. Die Sondenmischung nach Anspruch 4, wobei das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG oder

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG entspricht,

SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA entspricht.

10. Eine Hybridisierungstest-Sonde zur Detektion von mit Lyme-Krankheit assoziierter Borrelia, umfassend eine Oligonukleotid-Sonde mit einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen vorzugsweise an eine mit Lyme-Krankheit assoziierte Borrelia- Nukleinsäuresequenz hybridisiert, jedoch nicht an eine Nukleinsäuresequenzt die in Borrelia hermsii vorkommt, wobei die Borrelia-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC und

SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC.

11. Eine Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde zur Detektion von mit Lyme-Krankheit assoziierter Borrelia unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen, die im wesentlichen einer Oligonukleotidsonde entspricht, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC und

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC besteht.

12. Eine Sondenmischung, die ein Oligonukleotid nach Anspruch 10 und zumindest ein Helfer-Oligonukleotid umfaßt.

13. Die Sondenmischung nach Anspruch 12, wobei die Sonde eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen.

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC oder

SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC entspricht,

wobei das Helfer-Oligonukleotid ein Oligonukleotid mit einer Länge von 10-100 Nukleotiden ist und an eine mit Lyme-Krankheit assoziierte Borrelia-Nukleinsäuresequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, wobei das Helfer- Oligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 3: TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG,

SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,

SEQ ID NO 14: UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG und

SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU besteht.

14. Die Sondenmischung nach Anspruch 12, wobei die Sonde eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen:

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC oder

SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC entspricht,

und wobei das Helfer-Oligonukleotid ein Oligonukleotid mit einer Länge von 10-100 Nukleotiden ist, und an eine mit Lyme- Krankheit assoziierte Borrelia-Nukleinsäuresequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, wobei das Helfer-Oligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA,

SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,

SEQ ID NO 15: CGGGAWAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA und

SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG besteht.

15. Eine Hybridisierungstest-Sonde zur Detektion von mit Lyme-Krankheit assoziierte Borrelia umfassend eine Oligonukleotidsonde mit einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen vorzugsweise an eine mit Lyme-Krankheit assoziierte Borrelia- Nukleinsäuresequenz hybridisiert, jedoch nicht an eine Nukleinsäuresequenz, die in Borrelia hermsii vorkommt, wobei die Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,

SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,

SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC besteht.

16. Eine Sondenmischung, die ein Oligonukleotid nach Anspruch 15 und zumindest ein Helfer-Oligonukleotid umfaßt.

17. Die Sondenmischung nach Anspruch 16, wobei die Sonde eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG oder

SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG entspricht,

und wobei das Helfer-Oligonukleotid ein Oligonukleotid mit einer Länge von 10-100 Nukleotiden ist, das an einer mit Lyme- Krankheit assozierte Borrelia-Nukleinsäuresequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, wobei das Helfer-Oligonucleotid eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA und

SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA besteht.

18. Eine Zusammensetzung zur Detektion eines Mitglieds der Gattung Borrelia, die ein Nukleinsäurehybrid umfaßt, das zwischen einer Borrelia-Nukleinsäure und einem Oligonukleotid gebildet wird, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,

SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,

SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,

SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,

SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC,

SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC,

SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,

SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC,

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,

SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und

SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.

19. Eine Zusammensetzung zur Amplifizierung von Borrelia- Nukleinsäuren, die ein Nukleinsäurehybrid umfaßt, das zwischen einer Borrelis-Nukleinsäure und einem Oligonukleotid gebildet wird, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,

SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,

SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,

SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,

SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,

SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,

SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU,

SEQ ID NO 46: CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA,

SEQ ID NO 47: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU,

SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG,

SEQ ID NO 49: GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC und

SEQ ID NO 50: CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG.

20. Eine Zusammensetzung, die ein Nukleinsäurehybrid umfaßt, das zwischen einer Borrelia-Nukleinsäure und einem Oligonukleotid gebildet wird, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen der Nukleinsäuresequenz

SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA

entspricht, und die weiterhin ein Oligonukleotid umfaßt, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT und

SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT besteht.

21. Die Zusammensetzung nach Anspruch 18, die weiterhin ein Helfer-Oligonukleotid umfaßt.

22. Eine Zusammensetzung zur Detektion von mit Lyme- Krankheit assoziierter Borrelia, umfassend ein Nukleinsäurehybrid, das zwischen einer Borrelia-Nukleinsäure und einem Oligonukleotid gebildet wird, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,

SEQ ID NO 12: GCAUÄGACUUAUAUAUCCGCC,

SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,

SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG und

SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC.

23. Ein Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von mit Lyme-Krankheit assoziierter Borrelia, das den Schritt umfaßt, eine Testprobe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde in Kontakt zu bringen, die in der Lage ist, unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen an eine mit Lyme-Krankheit assoziierte Borrelia 16S Target-Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, und nicht an eine Nukleinsäuresequenz aus Borrelia hermsii, wobei die Target-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC und

SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC besteht.

24. Ein Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von mit Lyme-Krankheit assoziierter Borrelia, das den Schritt umfaßt, eine Testprobe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure-Hybridisierungstest-Sonde in Kontakt zu bringen, die in der Lage ist, unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen an eine mit Lyme-Krankheit assoziierte Borrelia Target 23S Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren und nicht an eine Nukleinsäuresequenz aus Borrelia hermsii, wobei die Target-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG

SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,

SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,

SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC besteht.

25. Ein Verfahren zur Erhöhung der Anzahl von Borrelia- Nukleinsäuren in einer Testprobe, das umfaßt

a) Amplifizieren der Nukleinsäure mit einem oder mehreren Amplifikations-Oligonukleotiden, die daran binden oder eine Verlängerung durch eine Nukleinsäuresequenz bewirken, die im wesentlichen einer oder mehrerer der folgenden Nukleotidsequenzen entspricht:

SEQ ID NO 36: ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT,

SEQ ID NO 38: TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGGGTGG,

SEQ ID NO 39: ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT,

SEQ ID NO 40: CCCGTTTCCCATCGACTACACTTTTCAG,

SEQ ID NO 41: GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC,

SEQ ID NO 42: CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG,

SEQ ID NO 27: TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG,

SEQ ID NO 51: ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU,

SEQ ID NO 53: UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGGGUGG,

SEQ ID NO 54: ACGCUCGCCCCUUACGUAUUACCGCGGCU,

SEQ ID NO 55: CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG,

SEQ ID NO 56: GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC,

SEQ ID NO 57: CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG, und

SEQ ID NO 29: UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG,

wobei das Amplifikations-Oligonukleotid gegebenenfalls eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die von einer RNA Polymerase erkannt wird oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA Polymerase verstärkt.

26. Das Verfahren nach Anspruch 25, das weiterhin den Schritt umfaßt:

b) Detektieren der amplifizierten Nukleinsäure mit einer Oligonukleotid-Hybridisierungtest-Sonde, die in der Lage ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch an Borrelia-Nukleinsäuren zu hybridisieren.

27. Ein Verfahren zum Amplifizieren von Borrelia- Nukleinsäuren in einer Testprobe, das umfaßt Amplifizieren dieser Nukleinsäure mit einem oder mehreren Amplifikations- Oligonukleotiden, die daran binden oder eine Verlängerung durch eine Nukleinsäuresequenz bewirken, die im wesentlichen den folgenden Nukleotidsequenzen entspricht:

SEQ ID NO 36: ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT

SEQ ID NO 51: ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU, und

mit einem zweiten Amplifikations-Oligonukleotid, das daran bindet oder eine Verlängerung durch eine Nukleinsäuresequenz bewirkt, die im wesentlichen einer der folgenden Sequenzen entspricht:

SEQ ID NO 37: TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATAGAGGAAG,

SEQ ID NO 52: UAUGUUGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUAGAGGAAG,

SEQ ID NO 38: TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGGGTGG und

SEQ ID NO 53: UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGGGUGG,

wobei eines der Amplifikations-Oligonukleotide gegebenenfalls eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch eine RNA Polymerase erkannt wird, oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA Polymerase verstärkt.

28. Das Verfahren nach Anspruch 27, das weiterhin den Schritt umfaßt:

29. Ein Verfahren zum Amplifizieren von Borrelia- Nukleinsäuren in einer Testprobe, das umfaßt Amplifizieren der Nukleinsäuren mit einem oder mehreren Amplifikations- Oligonukleotiden, die daran binden oder Verlängerung durch eine Nukleinsäuresequenz bewirken, die im wesentlichen einer der folgenden Nukleotidsequenzen entspricht:

SEQ ID NO 36: ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT,

SEQ ID NO 51: ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU,

SEQ ID NO 39: ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT,

SEQ ID NO 54: ACGCUCGCCCCUUACGUAUUACCGCGGCU,

und mit einem zweiten Amplifikations-Oligonukleotid, das daran bindet oder Verlängerung durch eine Nukleinsäuresequenz bewirkt, die im wesentlichen einer der folgenden Sequenzen entspricht:

SEQ ID NO 37: TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATAGAGGAAG,

SEQ ID NO 52: UAUGUUGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUAGAGGAAG,

30. Das Verfahren nach Anspruch 29, das weiterhin den Schritt umfaßt:

31. Ein Verfahren zur Erhöhung der Anzahl von Borrelia- Nukleinsäuresequenzen in einer Testprobe, die umfaßt Amplifizieren der Nukleinsäure mit einem oder mehreren Amplifikations-Oligonukleotiden, die daran binden oder Verlängerung durch eine Nukleinsäuresequenz bewirken, die im wesentlichen der folgenden Nukleinsäuresequenzen entspricht:

SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG,

SEQ ID NO 55: CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG,

und mit einem zweiten Amplifikations-Oligonukleotid, das daran bindet oder Verlängerung durch eine Nukleinsäuresequenz bewirkt, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entspricht:

SEQ ID NO 41: GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC oder

SEQ ID NO 56: GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC und

SEQ ID NO 42: CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG oder

SEQ ID NO 57: CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG,

wobei eine der Amplifikations-Oligonukleotide gegebenenfalls eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch eine RNA Polymerase erkannt wird, oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA Polymerase verstärkt.

32. Das Verfahren nach Anspruch 31, das weiterhin den Schritt umfaßt:

b) Detektieren der amplifizierten Nukleinsäure mit einer Oligonukleotid-Hybridisierungstest-Sonde, die in der Lage ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch an Borrelia-Nukleinsäüfen zu hybridisieren.

33. Das Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Borrelia- Nukleinsäuren mit Lyme-Krankheit assoziierte Borrelia oder Borrelia hermsii Nukleinsäuren sind.

34. Das Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Oligonukleotid-Hybridisierungstest-Sonde eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,

SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG,

SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC,

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,

SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und

SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.

35. Ein Amplifikations-Oligonukleotid mit einer Sequenz, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,

SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,

SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,

SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,

SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,

SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,

SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA,

SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA,

SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU,

SEQ ID NO 46: CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA,

SEQ ID NO 47: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU,

SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG,

SEQ ID NO 49: GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC und

SEQ ID NO 50: CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG.

36. Ein Amplifikations-Oligonukleotid, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen den Nukleotidsequenzen:

SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA oder

SEQ ID NO 45: CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA

entspricht, oder worin die 19 3'-nächsten Nukleotide genau wie gezeigt sind.

37. Das Oligonukleotid nach Anspruch 35 oder 36, das weiterhin eine 5'-Sequenz umfaßt, die durch eine RNA Polymerase erkannt wird, oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA Polymerase verstärkt.

38. Eine Zusammensetzung zum Amplifizieren von Borrelia- Nukleinsäuren, die ein Nukleinsäurehybrid umfaßt, das zwischen einer Borrelia-Nukleinsäure und einem Oligonukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 36 oder 37 aufweist, gebildet wird.

39. Ein Kit, das zumindest ein Oligonukleotid enthält, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC,

SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC,

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,

SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG und

SEQ ID NO 26: CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC.

40. Das Kit nach Anspruch 39, das zumindest ein Helfer- Oligonukleotid besitzt, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen der Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus:

SEQ ID NO 3: TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG,

SEQ ID NO 5: CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT,

SEQ ID NO 14: UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG und

SEQ ID NO 16: CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU besteht,

wenn das Oligonukleotid ist:

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC oder

SEQ ID NO 12: GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC;

oder

SEQ ID NO 4: CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA,

SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG,

SEQ ID NO 15: CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA und

SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG;

wenn das Oligonukleotid ist:

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC oder

SEQ ID NO 13: GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC;

oder

SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA und

SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA,

wenn das Oligonukleotid ist:

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG oder

SEQ ID NO 25: GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG.

41. Ein Kit, das zwei Oligonukleotide enthält, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus:

SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,

SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA,

SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,

SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT,

SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,

SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC und

SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,

die gegebenenfalls eine 5'-Sequenz aufweist, die durch eine RNA Polymerase erkannt wird, oder die die Initiation oder Verlängerung durch eine RNA Polymerase verstärkt.

42. Das Kit nach Anspruch 41, das weiterhin zumindest ein Oligonukleotid umfaßt, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus:

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC,

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC und

SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC besteht,

wenn die zwei Oligonukleotide aus der Gruppe von:

SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,

SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA,

SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA,

SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT ausgewählt werden;

oder

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG und

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,

wenn die zwei Oligonukleotide aus der Gruppe von:

SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,

SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC und

SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG ausgewählt werden.

43. Ein Kit, das Oligonukleotide enthält, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entsprechen:

SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT

SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA und

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC oder

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC.

44. Ein Kit, das Oligonukleotide enthält, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entsprechen:

SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT,

SEQ ID NO 9: CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA und

SEQ ID NO 1: GCATAGACTTATATATCCGCC oder

SEQ ID NO 2: GGCGGATATATAAGTCTATGC.

45. Ein Kit, das ein Oligonukleotid enthält, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entspricht:

SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA

und

SEQ ID NO 45: CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA,

wobei die 19 3' nächsten Nukleinsäuren genau wie gezeigt sind.

46. Ein Kit, das Oligonukleotide enthält, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entspricht:

SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT

SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA und

SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC oder

SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC.

47. Ein Kit, das Oligonukleotide enthält, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entsprechen:

SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,

SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC,

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG und

SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG.

48. Ein Kit, das Oligonukleotide enthält, die eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, die im wesentlichen den folgenden Sequenzen entsprechen:

SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG,

SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG,

SEQ ID NO 21: GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 24: CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC,

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG oder

SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG.

49. Eine Hybridisierungstest-Sonde zum Detektieren von Borrelia hermsii, umfassend eine Oligonukleotidsonde mit einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen vorzugsweise an eine Borrelia hermsii Nukleinsäuresequenz hybridisiert, jedoch nicht an eine Nukleinsäuresequenz, die in Borrelia burodorferi vorkommt, wobei die Borrelia hermsii Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,

SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC und

SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC.

50. Eine Sondenmischung, die eine Hybridisierungstest-Sonde nach Anspruch 49 und zumindest ein Helfer-Oligonukleotid umfaßt.

51. Die Sondenmischung nach Anspruch 50, wobei die Sonde eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen

SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC oder

SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC entspricht,

und das Helfer-Oligonukleotid ein Oligonukleotid mit einer Länge von 10-100 Nukleotiden ist und unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine Borrelia hermsii Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wobei das Helfer- Oligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG und

SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG besteht.

52. Eine Hybridisierungstest-Sonde zum Detektieren von Borrelia hermsii, umfassend eine Oligonukleotidsonde mit einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen vorzugsweise an eine Borrelia hermsii Nukleinsäuresequenz hybridisiert, jedoch nicht an eine Nukleinsäuresequenz, die in Borrelia burodorferi vorkommt, wobei die Borrelia hermsii Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG.

SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,

SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und

SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.

53. Eine Sondenmischung, die ein Oligonukleotid nach Anspruch 52 und zumindest ein Helfer-Oligonukleotid umfaßt.

54. Die Sondenmischung nach Anspruch 53, wobei das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG oder

SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG entspricht,

wobei das Helfer-Oligonukleotid ein Oligonukleotid mit einer Länge von 10-100 Nukleotiden ist, das unter stringenten Bedingungen an eine Borrelia hermsii Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wobei das Helfer-Oligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus:

SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA und

SEQ ID NO 28: CGAUGGWGUCCUAGUUUAAGCAUUAA besteht.

55. Ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit von Borrelia hermsii, das den Schritt umfaßt, eine Testprobe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure- Hybridisierungstest-Sonde in Kontakt zu bringen, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen an eine Borrelia hermsii Target-Nukleinsäuresequenz hybridisiert und nicht an eine Nukleinsäuresequenz aus Borrelia burgdorferi, wobei die Borrelia hermsii Target-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,

SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC und

SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC besteht.

56. Ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit von Borrelia hermsii, das den Schritt umfaßt, eine Testprobe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure- Hybridisierungstest-Sonde in Kontakt zu bringen, die unter stringenten Hybridisierungstest-Bedingungen an eine Borrelia hermsii Target-Nukleinsäuresequenz hybridisiert und nicht an eine Nukleinsäuresequenz auf Borrelia burgdorferi, wobei die Borrelia hermsii Target-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,

SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und

SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC besteht.

57. Eine Zusammensetzung, die ein Nukleinsäurehybrid umfaßt, das zwischen einer Borrelia hermsii Nukleinsäure und einem Oligonukleotid gebildet wird, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 10: GGCGGATATGCAAGTCTATGC,

SEQ ID NO 33: GCATAGACTTGCATATCCGCC,

SEQ ID NO 34: GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC,

SEQ ID NO 35: GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC,

SEQ ID NO 22: GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG,

SEQ ID NO 30: CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC,

SEQ ID NO 31: GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG und

SEQ ID NO 32: CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC.

58. Die Zusammensetzung nach Anspruch 57, die weiterhin zumindest ein Helfer-Oligonukleotid umfaßt.

59. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 58, die weiterhin eine zweites Oligonukleotid umfaßt, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 7: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT oder

SEQ ID NO 44: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU und

SEQ ID NO 8: CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA oder

SEQ ID NO 45: CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA,

und

SEQ ID NO 11: AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT oder

SEQ ID NO 47: AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU,

wobei das Helfer-Oligonukleotid ein Oligonukleotid ist, das im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus

SEQ ID NO 6: ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG und

SEQ ID NO 17: AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG besteht.

60. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 58, die weiterhin ein zweites Oligonukleotid umfaßt, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die im wesentlichen einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

SEQ ID NO 18: CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG oder

SEQ ID NO 48: CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG und

SEQ ID NO 19: GCACTCATCATCACATCTTAGCTC oder

SEQ ID NO 49: GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC und

SEQ ID NO 20: CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG oder

SEQ ID NO 50: CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG,

SEQ ID NO 23: CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA und

SEQ ID NO 28: CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA besteht.