ES2296419T3 - Reactivos de transfeccion. - Google Patents

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Abstract

Elemento de contacto con un terminal de tornillo para conductores eléctricos, presentando el elemento de contacto una pieza de conexión de conductor, que está provista de un taladro en el que el conductor puede insertarse y aprisionarse mediante un tornillo que puede atornillarse en la pieza de conexión de conductor, en un taladro roscado, transversalmente al eje del taladro o del conductor, estando prevista en el taladro, entre el conductor y el extremo del tornillo que está orientado hacia el conductor, una chapa protectora de hilo (9), que está configurada en esencia en forma de L y presenta un pie acodado (11), y estando la chapa protectora de hilo (9) insertada en el taladro (6) de tal modo que el pie (11) se halla en el fondo del taladro, caracterizado porque el pie (11) está provisto de unos elementos conformados laterales (12) en forma de garfio que, al insertar la chapa protectora de hilo (9), se entierran en la pared del taladro (6) y porque la chapa protectora de hilo (9) puede girar un poco a modo de un soporte pivotante alrededor de un eje (X) formado por los elementos conformados (12).

Description

Reactivos de transfección.
Antecedentes de la invención Ámbito de la invención
La presente invención está relacionada con lípidos catiónicos y composiciones de lípidos catiónicos que tienen utilidad en los agregados de lípidos para administrar macromoléculas y otros compuestos a las células.
Técnica relacionada
Se ha descubierto que los agregados de lípidos, como los liposomas, son útiles como agentes de administración para introducir macromoléculas (como ADN, ARN, proteínas y pequeños compuestos químicos como productos farmacéuticos) en las células. En particular, se ha demostrado que los agregados de lípidos contienen componentes lípidos catiónicos que son especialmente eficaces para administrar moléculas aniónicas a las células. En parte, se cree que la eficacia de los lípidos catiónicos es resultado de una mayor afinidad para las células, muchas de las cuales tienen una carga neta negativa. También en parte, la carga neta negativa de los agregados de lípidos que contienen un lípido catiónico permite que el agregado una polianiones, como los ácidos nucleicos. Se sabe que los agregados de lípidos que contienen ADN son agentes eficaces para una transfección eficiente de células diana.
La estructura de los distintos tipos de agregados de lípidos varía en función de la composición y método de formación del agregado. Esos agregados incluyen liposomas, vesículas unilamelares, vesículas multilamelares y similares, con tamaños particulares que oscilan entre el nanómetro y el micrómetro. En la técnica son bien conocidos los métodos para hacer agregados de lípidos. El principal inconveniente de utilizar liposomas que contengan fosfolípidos convencionales para la administración es que el material que se va a administrar debe estar encapsulado y la composición de liposoma tiene una carga neta negativa que no es atraída hacia la superficie celular cargada negativamente. Combinando compuestos de lípidos catiónicos con un fosfolípido, con vesículas cargadas positivamente y con otros tipos de agregados de lípidos que puedan unir ADN (el cual está cargado negativamente), pueden ser absorbidos por las células diana y pueden transfectar células diana (Felgner, P.L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417; Eppstein, D. et al., US Patente nº 4.897.355).
Un lípido catiónico muy conocido es N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio cloruro (DOTMA). La estructura del DOTMA es:
1
DOTMA, por si mismo o en combinación 1:1 con dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), se formula a liposomas utilizando técnicas estándares. Felgner et al. supra demostraron que esos liposomas proporcionaban una administración eficaz de ácidos nucleicos a algunos tipos de célula. Una formulación DOTMA:DOPE (1:1) se vende bajo el nombre comercial de LIPOFECTIN (Life Technologies, Inc., Rockville, MD). Otro lípido catiónico disponible en el mercado es 1,2-bis(oleoiloxi)-3-3(trimetilamoníaco)propano (DOTAP), el cual sólo se diferencia del DOTMA en que las fracciones oleoil están ligadas vía éster, en lugar de enlaces éter a la propilamina. Un grupo relacionado de compuestos se diferencia de DOTMA y de DOTAP en que uno de los grupos metil del grupo trimetilamonio es sustituido por un grupo hidroxietil. Los compuestos de este tipo son similares al Inhibidor Rosenthal (RI) de fosfolipasa A (Rosenthal, A.F., y Geyer, R.P. (1960) J. Biol. Chem. 235:2202-2206) que tiene ésteres de estearoil ligados al núcleo de propilamina. Los análogos dioleoil de RI se abrevian habitualmente como DORI-éter y DORI-éster, dependiendo del enlace de las fracciones de ácido graso con el núcleo de propilamina. El grupo hidroxi se puede utilizar como sitio para funcionalización adicional.
El análogo dimiristiloxi de RI se conoce como DMRIE. Con el nombre comercial DMRIE-C (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) se vende una formulación 1:1 (M/M) de DMRIE:colesterol. La estructura de DMRIE es:
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Otra clase de compuestos ha sido revelada por Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86:6982-6986; publicación EPO 0 394 111 (24 de octubre de 1990) en los que se ha conjugado carboxiespermina con dos tipos de lípidos. La estructura de 5-carboxiespermilglicina dioctadecilamida (DOGS) es:
3
La estructura de dipalmitoilfosfatidiletanolamina 5-carboxiespermilamida (DPPES) es:
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DOGS y DPPES se han utilizado para recubrir plásmidos, formando un complejo de agregado de lípidos que proporciona una transfección eficaz. Se afirma que los compuestos son más eficaces y menos tóxicos que DOTMA para la transfección de algunas líneas celulares. DOGS está disponible comercialmente como TRANSFECTAM^{TM} (Promega, Madison, Wis.).
También se ha descrito otra clase de compuestos en los que se ha conjugado carboxiespermina con lípidos vía un enlace amida (Gebeyehu, G. et al., US Patente nº 5.334.761). Estos compuestos son útiles para una administración eficaz de ácidos nucleicos a diversas células y también intermedia para hacer otros de esos lípidos. 2,3-di-oleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propano-aminio (DOSPA) está disponible como una formulación 3:1 (agua/agua) con DOPE con el nombre comercial LipofectAMINE (disponible en Life Technologies, Incl., Rockville, MD). La estructura de DOSPA es la siguiente:
5 
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También se han descrito compuestos lípidos con un grupo cabeza espermina (Haces, A., et al., US Patente nº 5.674.908). Estos compuestos son especialmente útiles para administrar ácidos nucleicos a células de insectos. Una formulación 1:1,5 (M/M) de tetrametiltetrapalmitil espermina (TM-TPS) y DOPE está disponible en el mercado con el nombre comercial CellFECTIN (Life Technologies Inc., Rockville, MD). La estructura de TM-TPS es la siguiente:
6
Un derivado de colesterol catiónico (DC-Chol) ha sido sintetizado y formulado en liposomas en combinación con DOPE (Gao, X. y Huang. L (1991) Biochim. Biophys. Res. Comm. 179:280-285). La estructura del compuesto es:
7
Se afirma que los liposomas formulados con DC-Chol proporcionan una transfección más eficaz y menor toxicidad que los liposomas que contienen DOTMA para algunas líneas celulares.
Se ha informado que la lipopolilisina, formada mediante conjugación de polilisina a DOPE, es especialmente eficaz para la transfección en presencia de suero, una condición que es probable encontrar in vivo (Zhou, X., et al. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065: 8-14).
WO 97/42819 describe otros tipos de lípidos catiónicos para la transfección de ácidos nucleicos al interior de células.
US 5.744.335 describe un método de transfección de una célula con un polinucleótido mezclado con uno o más compuestos amfipáticos y una proteína de unión de AND como H1, H2A o H2B. Los compuestos amfipáticos descritos incluyen compuestos amfipáticos catiónicos que tienen una fracción poliamina no natural y fracción hidrofóbica.
McCluskie et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Development (1998), 8(5), páginas 401-414, describe transferencia directa de ADN al interior del sistema respiratorio de ratones utilizando ADN desnudo y formulado como lípido. Los lípidos descritos incluyen análogos de tetrametiltetraalquilespermina y formulaciones de DMRIE/colesterol.
EP 0846680 describe otros lípidos catiónicos para administrar ácidos nucleicos a células, en particular, lípidos guanidino.
UR 5.830.430 describe lípidos catiónicos para administrar materiales bioactivos como ácidos nucleicos y compuestos farmacéuticos a células, en particular, células que contengan como mínimo dos grupos catiónicos.
WO98/40502 describe composiciones que comprenden péptidos y agentes de transfección como lípidos catiónicos y polímeros dendrímeros para la transfección de células eucarióticas. Los péptidos se pueden acoplar a los agentes de transfección.
WO 98/40499 describe métodos y composiciones para la transfección de mucosa epitelial múrida con complejos de ácido nucleico/lípido catiónico.
WO 98/02190 describe anfifilas catiónicas que facilitan el transporte de moléculas biológicamente activas (incluyendo polinucleótidos) a las células. Las anfifilas catiónicas contienen grupos lipofílicos derivados de esteroides, mono o dialquilaminas, grupos alquil o acil y grupos catiónicos derivados de aminas, alquilaminas o polialquilaminas.
FR 1567214 describe un detergente para uso en lavadoras que contiene moléculas catiónicas.
A pesar de los avances en el campo, sigue existiendo la necesidad de una variedad de compuestos de lípidos catiónicos mejorados. En particular, hasta la fecha no se ha encontrado ningún lípido catiónico sencillo que funcione bien con todo tipo de células. Como los distintos tipos de célula se diferencian entre sí por la composición de la membrana, no es sorprendente que diferentes composiciones y tipos de agregados de lípidos sean eficaces para diferentes tipos de célula, bien por su capacidad para entrar en contacto y fundirse con la membrana de las células diana, o por aspectos del propio proceso de transferencia. En la actualidad, estos procesos no son bien entendidos y en consecuencia, el diseño de precursores liposomiales eficaces es en gran medida empírico. Además del contenido y la transferencia hay otros factores de importancia, por ejemplo, la capacidad para formar agregados de lípidos idóneos para el propósito pretendido, la posibilidad de transfección de células en presencia de suero, toxicidad para la célula diana, estabilidad como portador para el compuesto que se va a administrar y la capacidad para funcionar en un entorno in vivo. Además, los agregados de lípidos se pueden mejorar ampliando la gama de sustancias que se pueden administrar a las células. Los compuestos de lípidos catiónicos de la presente invención tienen un mejor funcionamiento en relación con varios de los anteriores atributos.
Resumen de la invención
Un compuesto de fórmula:
8
donde
Q es N
L es un radical orgánico bivalente capaz de unirse a cada Q
R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6}, independientemente entre sí, se seleccionan del grupo formado por H y C_{8}-C_{24} alquenil, C_{8}-C_{24} aril y C_{8}-C_{24} alquil opcionalmente sustituidos por uno o más de un grupo alcohol, amina, amida, éter, poliéter, poliamida, éster, mercaptano, urea, tiourea, guanidil o carbamoil,
y donde como mínimo uno de R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6} es un grupo alquil o alquenil de cadena recta o ramificado o un grupo aril.
X' es un anión aceptable fisiológicamente
a es el número de carga positiva dividido por la valencia de X
r, s, u e y son 0 o 1, siempre que se satisfagan los requisitos de valencia del nitrógeno, y
R_{7} y R_{8} son H.
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Los compuestos de la invención son útiles, en solitario o en combinación con otros componentes que formen agregados de lípidos (p.ej., DOPE, DOPC o colesterol), para su formulación en liposomas u otros agregados de lípidos. Esos agregados son policatiónicos capaces de forma complejos estables con macromoléculas aniónicas, como ácidos nucleicos. El complejo macromolecular de agregado de lípidos interactúa con las células, poniendo las macromoléculas polianiónicas disponibles para absorción y asimilación por la célula.
La presente invención proporciona un agregado de lípidos que comprende uno o más de los compuestos de la presente invención. Preferentemente, el agregado de lípidos comprende como mínimo un compuesto de formación de agregados de lípidos. Preferentemente, el compuesto de formación de agregados de lípidos se selecciona del grupo formado por DOPE, DOPC y colesterol.
Los compuestos de la presente invención también se pueden conjugar o mezclar o utilizar en conjunción con diversas moléculas y sustancias útiles, como proteínas, péptidos, factores de crecimiento y similares para mejorar la selección de la célula (cell targeting), la absorción, internalización, la selección nuclear y la expresión.
Esta invención incluye también agregados de lípidos que comprenden uno o más compuestos de la presente invención o mezclas de ellos. Esos agregados de lípidos se pueden combinar con uno o más componentes de formación de agregados o potenciadores de la transfección.
Los métodos de transfección que aquí se revelan que emplean los compuestos o composiciones (como los descritos anteriormente) de la presente invención, o mezclas de ellos, se pueden aplicar a la transfección in vitro de células, en particular, para la transfección de células eucarióticas o tejidos, incluyendo células de animales, células humanas, células de insectos, células de plantas, células de aves, células de peces, células de mamíferos y similares.
En concordancia, la presente invención proporciona un método para introducir un polianión en una célula o células, método que comprende la formación de un liposoma a partir de un compuesto cargado positivamente de acuerdo con la invención, poniendo en contacto el liposoma con el polianión para formar un complejo polianión-liposoma cargado positivamente e incubar el complejo con una célula o células.
Los métodos que aquí se revelan se pueden utilizar para generar células transfectadas o tejidos que expresen productos génicos útiles. Los métodos que aquí se revelan se pueden utilizar también como paso en la producción de animales transgénicos. Los métodos que aquí se revelan son útiles en cualquier método terapéutico que requiera la introducción de ácidos nucleicos en células o tejidos. En particular, estos métodos son útiles en el tratamiento del cáncer, en terapia génica ex vivo y en métodos de diagnóstico. Véase, por ejemplo, la patente US nº 5.589.466 de Felgner, et al. Los compuestos o composiciones de transfección de la presente invención se pueden emplear como reactivos de investigación en cualquier transfección de células o tejidos que se realice a efectos de investigación. Los ácidos nucleicos que se pueden transfectar con los métodos de la presente invención incluyen ADN y ARN de cualquier origen que comprendan bases naturales o bases no naturales, e incluye aquéllos que codifiquen y sean capaces de expresar proteínas terapéuticas o de otra forma proteínas útiles en células o tejidos, aquéllos que inhiban la expresión de ácidos nucleicos en células o tejidos, aquéllos que inhiban la actividad enzimática o que activen enzimas, aquéllos que catalicen reacciones (ribozimas) y aquéllos que funcionen en ensayos de diagnóstico.
Los compuestos, composiciones y métodos que aquí se facilitan también se pueden adaptar fácilmente en vista de las revelaciones del presente documento para introducir sustancias o macromoléculas activas biológicamente distintas a ácidos nucleicos, incluyendo entre otros, poliaminas, ácidos de poliaminas, polipéptidos, proteínas, biotina y polisacáridos en células. Con los métodos de la presente revelación se pueden introducir en células otros materiales útiles, por ejemplo, agentes terapéuticos, materiales de diagnóstico y reactivos de investigación. En un aspecto preferente, mediante la presente invención se puede administrar a o en el interior de una célula cualquier vector de ácido nucleico.
En consecuencia, se revela un método para introducir una sustancia activa biológicamente en el interior de una célula, método que comprende la formación de un liposoma de un compuesto de acuerdo con la invención y una sustancia activa biológicamente e incubar el liposoma con una célula o cultivo celular.
La invención también está relacionada con composiciones que comprenden uno o más compuestos de la invención.
La invención está relacionada también con composiciones que comprenden uno o más compuestos de la invención y uno o más componentes adicionales seleccionados del grupo formado por ácidos nucleicos, una célula, un cultivo celular, células, tampones, medios de cultivo, sustancia activa biológicamente, lípidos neutros y potenciadores de la transfección, preferentemente, un ácido nucleico.
La presente invención incluye también kits de transfección que incluyen uno o más de los compuestos o composiciones de la presente invención o mezclas de ellos. En particular, la invención proporciona un kit formado por uno o más de los compuestos de la presente invención y como mínimo, un componente adicional seleccionado del grupo formado por una célula, células, un medio de cultivo celular, un ácido nucleico, un potenciador de la transfección e instrucciones para realizar la transfección de una célula o células.
La revelación está relacionada también con intermedios y métodos para utilizar esos intermedios para la preparación de los compuestos o composiciones de la invención. La revelación está relacionada también con las composiciones, compuestos o componentes obtenidos por la interacción de materiales (intermedios, compuestos, lípidos, etc.) utilizados en los métodos de síntesis de la invención.
Otras realizaciones preferentes de la presente invención resultarán evidentes para una persona con conocimientos habituales en la técnica en vista de los siguientes dibujos y descripción de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una gráfica que muestra la transfección de células HEK-293 con reactivos catiónicos de transfección.
La Figura 2 es una gráfica que muestra la transfección de células COS-7 con reactivos catiónicos de transfección.
La Figura 3 es una gráfica que muestra la transfección de células CHO-K1 con reactivos catiónicos de transfección.
La Figura 4 es una gráfica que muestra la transfección de células HeLa con reactivos catiónicos de transfección.
Descripción detallada de las realizaciones preferentes
La presente invención está relacionada con lípidos catiónicos y composiciones de lípidos catiónicos que tienen utilidad en agregados de lípidos para administrar macromoléculas y otros compuestos a células. Los compuestos se pueden utilizar en solitario o combinados con otros compuestos para preparar liposomas y otros agregados de lípidos adecuados para la transfección o administración de compuestos a células diana in vitro.
Los compuestos de la presente invención son preferentemente policatiónicos, y por tanto forman preferentemente complejos altamente estables con diversas macromoléculas aniónicas, en particular, polianiones como ácidos nucleicos. Estos compuestos tienen la propiedad, cuando se dispersan en agua, de formar agregados de lípidos que se asocian con vigor, vía su porción catiónica, a los polianiones. Utilizando un exceso de cargas catiónicas en relación con el compuesto aniónico, los complejos polianión-lípido pueden ser adsorbidos en membranas celulares, facilitando de esta manera la asimilación del compuesto deseado por las células.
La revelación está relacionada también con intermedios para preparar los compuestos y composiciones de la invención.
Más específicamente, la presente invención está relacionada con un lípido catiónico para transfección que tiene un eficacia de transfección más alta que los productos disponibles en el mercado en los tres tipos de células más comunes utilizados en investigación de expresiones (CHO-K1, COS-7 y HEK293), haciéndolo útil para aplicaciones de alta producción; y que tiene un sencillo protocolo de uso como define el hecho de que no se necesite ningún reactivo adicional (p.ej., como LipofectAMINE PLUS Reagent disponible en Life Technologies, Inc., Rockville, MD), ninguna eliminación del suero y por lo tanto, no se necesita realizar cambios del medio, y no es necesario retirar el complejo ADN/lípido de las células antes del ensayo.
En un aspecto, la presente invención está relacionada con compuestos que tienen la siguiente fórmula:
9
donde
Q es N
L es un radical orgánico bivalente capaz de unirse a cada Q
R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6}, independientemente entre sí, se seleccionan del grupo formado por H y C_{8}-C_{24} alquenil, C_{8}-C_{24} aril y C_{8}-C_{24} alquil, opcionalmente sustituidos por uno o más de un grupo alcohol, amina, amida, éter, poliéter, poliamida, éster, mercaptano, urea, tiourea, guanidil o carbamoil.
y donde como mínimo uno de R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6} es un grupo alquil o alquenil de cadena recta o ramificado o un grupo aril
r, s, u e y son 0 o 1, siempre que se satisfagan los requisitos de valencia del nitrógeno
R_{7} y R_{8} son H.
X' es un anión aceptable fisiológicamente
a es el número de carga positiva dividido por la valencia de X,
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En una realización, la invención proporciona compuestos de fórmula:
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donde 1 es un entero entre 1 y 4 y los demás símbolos son los definidos anteriormente.
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En una realización relacionada, la invención proporciona compuestos de fórmula:
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donde R_{7} y R_{8} son hidrógeno y los demás símbolos son los definidos anteriormente.
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Compuestos específicos dentro del alcance de la invención incluyen los siguientes ejemplos.
R_{7} y R_{8} en la fórmula son H.
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Ciertos compuestos de la invención pueden no ser lo suficientemente solubles en medios fisiológicos para emplearlos en métodos de administración y transfección. Las personas diestras en la técnica apreciarán que existe diversidad de técnicas disponibles en la técnica para mejorar la solubilidad de esos componentes en medios acuosos. Esos métodos se pueden aplicar rápidamente sin demasiada experimentación a los compuestos que aquí se describen.
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Definiciones
Grupos aril útiles son C_{6-24} aril. Los grupos aril típicos incluyen fenil, naftil, fenanantril, antracil, indenil, azulenil, bifenil, bifenilenil, fluorenil, pirenil, aceantrenil, colantrenil y acefenantrenil.
Grupos alquil útiles son C_{8-24} alquil de cadena recta o ramificado. Los grupos alquil típicos incluyen etil, propil, isopropil, butil- sec.-butil, terc.-butil, pentil, hexil, octil, decil, dodecil, tetradecil, hexadecil, octadecil, eicosil y docosil.
Grupos alquenil útiles son C_{8-24} alquenil de cadena recta o ramificado. Los grupos alquenil típicos incluyen etenil, propenil, isopropenil, butenil, sec.-butenil, hexenil, octenil, decenil, dodecenil, especialmente 9-dodecenil, tetradecenil, especialmente 9-tetradecenil, hexadecenil, especialmente 9-hexadecenil, octadecenil, especialmente 9-octadecenil, eicosenil y docosenil.
Grupos alquinil útiles son C_{8-24} alquinil de cadena recta o ramificado. Los grupos alquinil típicos incluyen etinil, propinil, butinil, hexinil, octinil, decinil, dodecinil, tetradecinil, hexadecinil, octadecinil, eicosinil y docosinil.
Los grupos alquil éter típicos incluyen cualquiera de los grupos alquil C_{2-100} que tenga un grupo éter.
Un grupo éter es -O-.
Los grupos poliéter típicos incluyen el -(CHR^{14}-CH_{2}-O)_{t}-, donde R^{14} es H o un grupo alquil C_{1-4} y t es un entero como se ha definido anteriormente; preferentemente t es de 2 a 5.
A los efectos de la invención, un grupo amida es un radical orgánico que tiene -NHC(O)- como grupo funcional. Los grupos amida típicos incluyen alquil amidas, alquenil amidas, alquinil amidas y aril amidas, donde alquil, alquenil, alquinil y aril son como se ha definido anteriormente.
Los grupos poliamida típicos incluyen radicales orgánicos que tienen dos o más grupos amida como se han definido anteriormente.
Típicamente, un grupo éster es un radical orgánico que tiene -C(O)-O- como grupo funcional. Los grupos éster típicos incluyen R^{14}-C(O)-O-R^{15}, donde R^{14} y R^{15} son grupos alquileno, alquenileno, alquinileno y arileno como se han definido anteriormente.
Típicamente, los grupos urea son radicales orgánicos que tienen -NH-C(O)-NH- como grupo funcional. Los grupos urea típicos incluyen R^{14}NH-C(O)-NHR^{14}, R^{14}NH-C(O)-NHR^{15}, R^{14}R^{15}N-C(O)-NR^{14}R^{15} donde R^{14} y R^{15} son grupos alquileno, alquenileno, alquinileno y arileno como se han definido anteriormente.
Típicamente, los grupos tiourea son radicales orgánicos que tienen grupo urea como se ha definido anteriormente en el que el oxígeno del grupo urea es sustituido por azufre.
Típicamente, los grupos guanidil son radicales orgánicos que tienen -NH-C(NH)-NH- como grupo funcional. Los grupos guanidil típicos incluyen R^{14}NH-C(NH)-NHR^{14}, R^{14}NH-C(NH)-NHR^{15} y R^{14}R^{15}N-C(NH)-NR^{14}R^{15} donde R^{14} y R^{15} son grupos alquileno, alquenileno, alquinileno y arileno como se han definido anteriormente.
Un grupo carbamoil es -NH-C(O)-O-.
Típicamente, los grupos carbonato incluyen radicales orgánicos que contienen un radical CO_{3}^{2-}, es decir, -O-C(O)-O.
Un grupo fosfato es un radical PO_{4}^{3}.
Un grupo sulfato es un radical SO_{4}^{2}.
Un grupo sulfóxido es -S(O)-.
Un grupo imina es -C(N)-.
Un grupo carbonil es -C(O)-.
Un grupo amino secundario es -NH-.
Típicamente, los grupos aminoalcohol son radicales orgánicos que tienen un grupo amino secundario como se ha definido anteriormente y un grupo hidroxil. Los aminoalcoholes típicos incluyen aminoetanol, aminopropanol y aminobutanol.
La definición "D es un enlace" significa que cuando D no es Q, existe un enlace simple entre (CH_{2})_{p} y Z.
Sustancia Activa Biológicamente hace referencia a cualquier molécula o mezcla o complejo de moléculas que ejerce un efecto biológico in vitro o in vivo, incluyendo productos farmacéuticos, drogas, proteínas, péptidos, polipéptidos, hormonas, vitaminas, esteroides, polianiones, nucleósidos, nucleótidos, ácidos nucleicos (p.ej., ADN o ARN), nucleótidos, polinucleótidos, etc.
Lípidos Catiónicos hace referencia a cualquier lípido catiónico que se pueda utilizar para transfección, incluyendo pero no quedando limitado a DOSPA, DOTMA, DMRIE, DOTAP, DOGS y TM-TPS.
Célula hace referencia a células eucarióticas de cualquier tipo y de cualquier origen. Tipos de células eucarióticas incluyen células epiteliales, fibroblásticas, neuronales, hematopoiéticas y similares a partir de células primarias, células tumorales o líneas celulares inmortalizadas. Fuente de esas células incluyen cualquier animal como humano, canino, ratón, hamster, gato, bovino, porcino, mono, simio, oveja, pez, insecto, hongo y cualquier planta, incluyendo plantas de cultivo, ornamentales y árboles.
Administración se utiliza para denotar un proceso mediante el cual es transferido un compuesto deseado a una célula diana de forma que el compuesto deseado se sitúe en última instancia en el interior de la célula diana o en o sobre la membrana de la célula diana. En muchos usos de los compuestos de la invención, el compuesto deseado no es realmente absorbido por la célula diana y la administración vía agregados de lípidos es un medio de introducir el compuesto deseado en la célula. En determinados usos, la administración a un tipo específico de célula diana es preferible y se puede facilitar mediante compuestos de la invención.
Droga hace referencia a cualquier agente terapéutico o profiláctico distinto a comida que se utilice en la prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o cura de enfermedades en personas o animales.
Kit hace referencia a kits de transfección o kits de expresión de proteínas que incluyen uno o más de los compuestos de la presente invención o mezclas de ellos. Esos kits pueden comprender un medio portador que es compartimentado para recibir en confinamiento cerrado uno o más medios contenedor como ampolletas, tubos de ensayo y similares. Cada uno de esos medios contenedor comprende componentes o mezcla de componentes necesarios para realizar la transfección. Esos kits puede incluir uno o más componentes seleccionados entre ácidos nucleicos (preferentemente uno o más vectores), células, uno o más compuestos de la presente invención, compuestos que formen agregados de lípidos, potenciadores de la transfección, sustancias activas biológicamente, etc.
Agregado de lípidos es un término genérico que incluye liposomas de todo tipo, unilamelares y multilamelares, así como micelos y agregados más amorfos de lípidos catiónicos o lípidos mezclados con lípidos amfifáticos como fosfolípidos y esteroides.
Compuestos que forman agregados de lípidos hace referencia a compuestos neutros o lípidos como DOPE, DOPC y colesterol, etc.
Célula diana hace referencia a cualquier célula a la que se administre un compuesto deseado utilizando un agregado de lípidos como portador para el compuesto deseado.
Transfección se utiliza en este documento para significar la administración de ácido nucleico, proteína u otra macromolécula a una célula diana, de forma que el ácido nucleico, proteína u otra macromolécula se exprese o tenga una función biológica en la célula. El término "ácido nucleico con capacidad de expresión" incluye ADN y ARN sin importar el peso molecular, y el término "expresión" significa cualquier manifestación de la presencia funcional del ácido nucleico dentro de la célula incluyendo, sin limitación, la expresión transiente y la expresión estable. Aspectos funcionales incluyen inhibición de la expresión mediante administración de oligonucleótidos o proteínas.
Potenciadores de la transfección hace referencia generalmente a moléculas y sustancias como proteínas, péptidos, factores de crecimiento y similares que mejoran la selección de la célula, la absorción, la internalización, la selección nuclear y la expresión. Esas moléculas y sustancias incluyen ligandos como insulina, transferrina y fibronectina que se dirigen a la superficie celular, péptidos que se dirigen a los receptores celulares de integrina, y otros compuestos como Plus Reagent (disponible en Life Technologies, Inc., Rockville, Maryland). Ejemplos de potenciadores de la transfección se pueden encontrar en la patente US nº 5.736.392 y la solicitud US Serie nº 09/039.780 presentada el 16 de marzo de 1998.
La invención quedará más clara con los siguientes ejemplos, los cuales sólo se pretende que sean a modo de ilustración de la invención. Los lípidos policatiónicos se prepararon siguiendo los esquemas generales de reacción que se describen a continuación.
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Ejemplo 1 Síntesis de N^{1},N^{4}-dioleoil-diaminobutano (I)
Una solución de 1,4-diaminobutano (4,28 g, 48,6 mmol) y trietilamina (20,3 ml, 146 mmol) en 10 ml de cloruro de metileno seco o se añadió lentamente a una solución de oleoil cloruro (30,0 g, 99,7 mmol) en 300 ml de cloruro de metileno anhidro en un baño helado a 0ºC. La mezcla de reacción se agitó vigorosamente con un agitador mecánico. Tras finalizar la adición, se retiró el baño helado y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 días. El análisis TLC confirmó que la reacción había finalizado y que se había precipitado el producto. El oleoil cloruro sobrante se eliminó mediante filtrado. El precipitado se lavó dos veces con 50 ml de cloruro de metileno. Se concentró el licor madre y se precipitó más producto. Este precipitado se filtró y combinó con el precipitado anterior. El sólido resultante se secó al vacío durante 4 horas. Se obtuvo un total de 27,0 g de un sólido blanco del producto deseado, N^{1},N^{4}-dioleoil-diaminobutano.
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Síntesis de N^{1},N^{4}-dioleoil-diaminobutano (II)
A una suspensión de N^{1},N^{4}-dioleoil-diaminobutano (27,0 g, 43,8 mmol) en 400 ml de dietil éter anhidro se le añadió cuidadosamente hidruro de litio y aluminio (8,62 g, 95%, 216 mmol) a 0ºC. Tras la adición se retiró el baño helado. La mezcla de reacción se calentó lentamente a temperatura ambiente y después se calentó suavemente hasta reflujo con un dispositivo de condensación adecuado, y se agitó durante 16 horas. La mezcla de reacción se templó y enfrió con cuidado a 0ºC con 70 ml de una solución de 1 N hidróxido de sodio. Se añadió 500 ml de dietil éter y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas más. La capa de éter superior se volvió clara gradualmente y entonces se separó. Se extrajo la capa acuosa tres veces con 100 ml de dietil éter cada vez. La solución combinada de éter se concentró y secó a alto vacío durante la noche. Se obtuvo un total de 17,0 g de N^{1},N^{4}-dioleoil-diaminobutano incoloro aceitoso.
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Síntesis de N^{1},N^{4}-dioleoil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-ftalamido)propil]-diamino-butano (III)
A una suspensión de N^{1},N^{4}-dioleoil-diaminobutano (15,5 g, 26,3 mmol) y N-(2,3-epoxipropil)-ftalimida (15,6 g, 76,8 mmol) en 110 ml de N,N-dimetilformamida seca se le añadió diisopropiletilamina (11,1 ml, 63,7 mmol). Después de purgar con nitrógeno, la mezcla de reacción fue sellada en un matraz de base redonda y calentada hasta 90ºC aproximadamente durante 24 horas. Se retiró N,N-dimetilformamida y diisopropiletilamina y se obtuvo un aceite amarillo. Este material crudo se recristalizó a partir de etanol. Se obtuvo un total de 18,6 g de un sólido blanco, N^{1},N^{4}-dioleoil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-ftalamido)propil]-diamino-butano.
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Síntesis de N^{1},N^{4}-dioleoil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano (IV) (en adelante citado como DHDOS)
A una suspensión de N^{1},N^{4}-dioleoil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-ftalamido)propil]-diaminobutano (17,0 g, 17,1
mmol) en 250 ml de etanol seco se le añadió hidracina (4,0 ml, 80% ac., 103 mmol) a temperatura ambiente. Con un dispositivo de condensación adecuado, la mezcla de reacción se calentó a reflujo, punto en el que la suspensión cambió a una solución clara. El baño de aceite se fijó a 85ºC. Transcurridos 45 minutos, de la solución se precipitó un sólido blanco. La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 4 horas antes de ser enfriada a -20ºC. El sólido blanco se depósito en el fondo. La solución de etanol claro de la parte superior se decantó. El residuo se lavó dos veces con etanol frío. La solución combinada de etanol se concentró y secó al vacío durante la noche. Se obtuvo 12,4 g de N^{1},N^{4}-dioleoil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano aceitoso.
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Se sintetizaron los siguientes compuestos mediante el método anterior utilizando la correspondiente diamina y un cloruro de acilo de cadena larga:
N^{1},N^{4}-dimiristil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano
N^{1},N^{4}-dipalmitil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano
N^{1},N^{4}-dipalmitolil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano
N^{1},N^{4}-distearil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano
N^{1},N^{4}-dilauril-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano
N^{1},N^{2}-dimiristil-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{2}-dipalmitil-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{2}-dipalmitolil-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{2}-distearil-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{2}-dilauril-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{2}-dioleil-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{9}-dimiristil-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
N^{1},N^{9}-dipalmitil-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
N^{1},N^{9}-dipalmitolil-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
N^{1},N^{9}-distearil-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
N^{1},N^{9}-dilauril-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
N^{1},N^{9}-dioleil-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Síntesis de dihidroxi-dioleiol-diesperminacarboxamida espermina y análogos
Esquema 1
22 
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Ejemplo 2 Síntesis de análogos poliméricos
Los análogos poliméricos de la presente invención se pueden sintetizar utilizando aminas poliméricas como PEI como material de inicio u poliaminas dendriméricas. Por ejemplo, se puede acilar PEI con alquiloil cloruro (p.ej., oleoil cloruro) y el PEI acilado se puede reducir después con hidruro de litio y aluminio para obtener compuestos de la invención.
Aunque los métodos anteriores ejemplifican la síntesis de compuestos específicos, los esquemas de reacciones proporcionan un método general para preparar diversos compuestos de acuerdo con la presente invención. Las personas con conocimientos normales en la técnica apreciarán que se pueden utilizar métodos y reactivos alternativos a los aquí detallados específicamente o se pueden adaptar fácilmente para producir compuestos de la invención.
Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar de la misma forma que los compuestos de la técnica anterior como DOTMA, DOTAP, DOGS, DOSPA y similares. En la técnica son bien conocidos métodos para incorporar esos lípidos catiónicos a agregados de lípidos. Métodos representativos se revelan en Felgner, et al., supra; Eppstein et al., supra; Behr et al., supra; Bangham, A. et al. (1965) M. Mol. Biol. 23:238-252; Olson, F. et al., (1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9-23; Szoka, F. et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; Mayhew, E. et al. (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169-175; Kim, S. et al. (1983) Biochim. Biophys. Acta 728:339-348; y Fukunaga, M. et al. (1984) Endocrinol. 115:757-761. Técnicas para preparar agregados de lípidos de tamaño apropiado para uso como vehículos de administración incluyen sonicación y congelación-descongelación más extrusión, como quizás los más comúnmente utilizados. Véase por ejemplo, Mayer, L. et al. (1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161-168. La microfluidización se utiliza cuando se desean agregados pequeños (50-200 mm) y relativamente uniformes (Mayhew, E., supra). Se prefieren agregados que oscilen entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 200 mm de diámetro; sin embargo, son funcionales tamaños más grandes y más pequeños.
En la técnica son bien conocidos métodos de transfección y administración de otros compuestos. Los compuestos y composiciones de la presente invención proporcionan agregados de lípidos que se pueden utilizar en los mismos procesos usados para otros agentes de transfección conocidos.
Resultará muy evidente para las personas con conocimientos normales en la técnica que para conseguir la óptima eficacia de la transfección o administración son importantes una serie de parámetros generales. Estos parámetros incluyen, por ejemplo, la concentración del lípido catiónico, la concentración del compuesto que se va a administrar, el número de células transfectadas, el medio empleado para la administración, el tiempo de incubación de las células con el complejo polianión-lípido, y las cantidades relativas de lípido catiónico y no catiónico. Puede ser necesario optimizar estos parámetros para cada tipo de célula específico. Esa optimización es rutinaria empleando la directriz que aquí se facilita y los conocimientos generalmente disponibles por la técnica.
El uso de compuestos representativos de la invención se detalla adicionalmente consultando los siguientes ejemplos. Todas las abreviaturas utilizadas en este documento son las abreviaturas estándares en la técnica. Procedimientos específicos que no se describen en detalle son bien referenciados o conocidos en la técnica.
Ejemplo 3
Este ejemplo compara la transfección de células HEK-293 (línea celular derivada de riñón embrionario humano), COS-7 (línea celular de mono transformada SV40), CHO-K1 (línea celular derivada de ovario de hamster chino) y HeLa (línea celular derivada de carcinoma de cuello de útero humano) con el plásmido "reporter" \beta-galactosidasa ADN pCMV\cdotSPORT-\beta-gal (Life Technologies, Rockville, MD) utilizando reactivos de transfección de lípidos catiónicos disponibles en el mercado y los compuestos de la presente invención.
Las células fueron colocadas el día anterior a la transfección en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos en un volumen total de 0,4 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Life Technologies, Rockville, MD), medio de cultivo que contenía una solución al 1% de aminoácido no esencial (NEAA) (Life Technologies) y 10% FBS. Para las células HEK-293 y COS-7, las placas de cultivo de tejidos fueron recubiertas previamente con Poli-L-Lisina para mejorar la adhesión de las células.
Al día siguiente se preparó el reactivo de transfección ADN de la siguiente forma:
Los reactivos de lípidos catiónicos y el ADN se diluyeron por separado en alícuotas de 25 \mul de DMEM sin suero que contenía 1% NEAA. Para LipofectAMINE PLUS, al ADN se añadió 7-14 \mul de reactivo PLUS, se mezcló y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. El ADN diluido se combinó con el lípido diluido y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos como mínimo para que el AND y el lípido formaran complejos. Tras esta incubación, los complejos fueron añadidos directamente al medio de cultivo gota a gota y se mezcló balanceando la placa de cultivo adelante y atrás. Las células fueron incubadas adicionalmente a 37ºC durante un total de 24 horas para permitir la expresión del transgen lacZ codificado por el plásmido "reporter", pCMV\cdotSPORT-\beta-gal. A las 24 horas de la transfección, el medio de crecimiento y los complejos de transfección se retiraron de los pocillos, y las células presentes en cada pocillo se enjuagaron brevemente con 1 ml de D-PBS (Dulbecco's PBS, Life Technologies, Rockville, MD). Las células de cada pocillo fueron sometidas a lisadas mediante la adición de 0,15 a 2,0 ml de 0,1% Tris, pH 8,0, que contenía 0,1 M Triton X-100. Las placas fueron congeladas a -80ºC durante un mínimo de 2 horas, y descongelados a temperatura ambiente o a 37ºC. Las células descongeladas sometidas a lisis fueron aclaradas mediante centrifugado y se ensayaron los supernatantes para detectar actividad de \beta-gal utilizando el sustrato enzimático ONPG. La concentración de proteínas totales en las células lisadas se determinó también utilizando un ensayo Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se calculó la actividad de \beta-gal en los extractos de células transfectadas con una curva estándar y se expresó como ng \beta-gal por área de superficie de placa de cultivo de tejidos (ng/cm^{2}) para reflejar la actividad total por transfección, o como ng \beta-gal por \mug de proteínas totales (ng/\mug) para reflejar la actividad específica.
La transfección de las células HEK-293 (Figura 1), COS-7 (Figura 2), CHO-K1 (Figura 3) y HeLa (Figura 4) se realizó con 0,4 a 0,8 \mug de ADN pCMV\cdotSPORT-\beta-gal y 0,2 a 4,0 \mul de reactivo de transfección. Los reactivos de transfección testados fueron DHDOS (IV) formulado a 2 mg/ml con el colípido neutro colesterol (a una relación de 1:15 (M/M) DHDOS-colesterol); DHDOS se formuló a 2 mg/ml con el colípido neutro DOPE (dioleil fosfatidil etanolamina) (a una relación de 1:1 (M/M) DHDOS-DOPE); LipofectAMINE PLUS (Life Technologies, Rockville, MD) y FuGENE^{TM} (Boehringer Mannheim, Alemania). Las formulaciones de DHDOS se testaron en el intervalo entre 0,2 y 1,5 \mul; LipofectAMINE PLUS y FuGENE-6 fueron testados en el intervalo entre 0,2 y 4,0 \mul. FuGENE-6 se utilizó de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. DHDOS y LipofectAMINE PLUS se utilizaron de acuerdo con el protocolo anterior. Los datos presentados en las Figuras son expresados como actividad total (ng/cm^{2}) para comparar mejor la expresión total del ADN transfectado. Sólo se muestran datos con 0,8 \mug de ADN, pues se obtuvieron resultados similares con 0,4 y 0,8 \mug de ADN.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de destreza de las personas diestras en la técnica a la que pertenece la presente invención.

Claims (35)

1. Compuesto de fórmula:
23
donde
Q es N
L es un radical orgánico bivalente capaz de unirse a cada Q
R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6} independientemente entre sí, se seleccionan del grupo formado por H y C_{8}-C_{24} alquenil, C_{8}-C_{24} aril y C_{8}-C_{24} alquil opcionalmente sustituidos por uno o más de un grupo alcohol, amina, amida, éter, poliéter, poliamida, éster, mercaptano, urea, tiourea, guanidil o carbamoil
y donde como mínimo uno de R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6} es un grupo alquil o alquenil de cadena recta o ramificado o un grupo aril
X' es un anión aceptable fisiológicamente
a es el número de carga positiva dividido por la valencia de X
r, s, u e y son 0 o 1, siempre que se satisfagan los requisitos de valencia del nitrógeno, y
R_{7} y R_{8} son H.
2. Compuesto de la reivindicación 1 en el que el mencionado compuesto tiene la fórmula:
24
donde 1 es un entero entre 1 y 4.
3. Compuesto de la reivindicación 2, es decir:
25
4. Compuesto de fórmula:
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26 
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donde R_{1}, R_{4}, R_{7} y R_{8} son como se ha definido en la reivindicación 1 y 1 es un entero entre 1 y 4.
5. Compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 en el que R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6} se seleccionan entre los mencionados grupos de alquil sustituido opcionalmente.
6. Compuesto de la reivindicación 4, es decir:
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27 
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7. Compuesto de la reivindicación 4, es decir:
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28 
\newpage
8. Compuesto de la reivindicación 4, es decir:
29
9. Compuesto de la reivindicación 4, es decir:
30
10. Compuesto de fórmula
31
donde R_{7} y R_{8} son H.
11. Compuesto de las reivindicaciones 1, 2 o 4 en el que R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6}, independientemente uno de otro, se seleccionan del grupo formado por H, C_{8} a C_{24} alquenil y C_{8}-C_{24} alquil.
12. Composición que comprende uno o más compuestos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
13. Composición de la reivindicación 12 que comprende además un componente adicional seleccionado del grupo formado por una célula, células, un cultivo celular, un medio de cultivo celular, un lípido neutro, un ácido nucleico y un potenciador de la transfección.
14. Composición de la reivindicación 13, el cual incluye un ácido nucleico.
15. Composición de las reivindicaciones 13 o 14 en la que, como mínimo, un componente adicional es un lípido neutro.
16. Composición de la reivindicación 15 en la que el lípido neutro es DOPE, DOPC o colesterol.
17. Agregado de lípidos que comprende uno o más compuestos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
18. Agregado de lípidos de la reivindicación 17, el cual incluye como mínimo un lípido neutro.
19. Agregado de lípidos de la reivindicación 18 en el que el mencionado compuesto de formación del agregado de lípidos se selecciona del grupo formado por DOPE, DOPC y colesterol.
20. Kit que comprende uno o más compuestos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y como mínimo un componente adicional seleccionado del grupo formado por una célula, células, un medio de cultivo celular, un ácido nucleico, un potenciador de transfección e instrucciones para realizar la transfección de una célula o células.
21. Método para introducir un polianión en una célula o células in vitro, comprendiendo el mencionado método la formación de un agregado de lípidos a partir de un compuesto cargado positivamente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, poniendo en contacto el agregado de lípidos con un polianión para formar un complejo polianión-liposoma cargado positivamente incubando el complejo con una célula o células.
22. Método de la reivindicación 21 en el que el polianión es un ácido nucleico.
23. Método de la reivindicación 21 o 22 en el que el agregado de lípidos es un liposoma.
24. Composición para uso en métodos de transfección que comprende:
un medio fisiológico
un compuesto policatiónico, y
un anión aceptable fisiológicamente en un número apropiado para equilibrar las cargas catiónicas del mencionado compuesto, siendo el compuesto policatiónico de formula:
32
donde
Q es N
L es un radical orgánico bivalente capaz de unirse a cada Q
R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6} independientemente entre sí, se seleccionan del grupo formado por H y C_{8}-C_{24} alquenil, C_{8}-C_{24} aril y C_{8}-C_{24} alquil opcionalmente sustituidos por uno o más de un grupo alcohol, amina, amida, éter, poliéter, poliamida, éster, mercaptano, urea, tiourea, guanidil o carbamoil.
y donde como mínimo uno de R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6} es un grupo alquil o alquenil de cadena recta o ramificado o un grupo aril
r, s, u e y son 0 o 1, siempre que se satisfagan los requisitos de valencia del nitrógeno, y
R_{7} y R_{8} son H.
25. Composiciones de la reivindicación 24 en las que el mencionado compuesto tiene la fórmula:
33
donde 1 es un entero entre 1 y 4.
26. Composición de la reivindicación 25 en la que el mencionado compuesto es:
34 
\vskip1.000000\baselineskip
27. Composición para uso en métodos de transfección que comprende un medio fisiológico y un compuesto de fórmula:
35
donde R_{1}, R_{4}, R_{7} y R_{8} son como se define en la reivindicación 24 y 1 es un entero entre 1 y 4.
28. Composición reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 24, 25 y 27 en la que R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6} se seleccionan de los mencionados grupos de alquil sustituido.
29. Composición de la reivindicación 27 en la que el mencionado compuesto es:
36
30. Composición de la reivindicación 27 en la que el mencionado compuesto es:
37 
\vskip1.000000\baselineskip
31. Composición de la reivindicación 27 en la que el mencionado compuesto es:
38 
\vskip1.000000\baselineskip
32. Composición de la reivindicación 27 en la que el mencionado compuesto es:
39 
\vskip1.000000\baselineskip
33. Composición para uso en métodos de transfección que comprende un medio fisiológico y un compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
40
donde R_{7} y R_{8} son H.
34. Composición de la reivindicaciones 24 o 25 donde R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6} se seleccionan del grupo formado por H, C_{8}-C_{24} alquenil, C_{8}-C_{24} aril y C_{8}-C_{24} alquil.
35. Uso de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 34 para realizar la transfección de un ácido nucleico a una célula o células in vitro.
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