JPH07501314A

JPH07501314A - ３′−末端封鎖されたオリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JPH07501314A
Application number: JP5500109A
Authority: JP
Inventors: アグラワル、　スディール; テンサマニ、　ジャマル; タン、ジン−ヤン
Original assignee: ハイブライドン　インコーポレイテッド
Priority date: 1991-05-10
Filing date: 1992-05-08
Publication date: 1995-02-09
Also published as: EP0588881A1; WO1992020697A1; CA2102804A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３′−末端封鎖されたオリゴヌクレオチド発明の技術分野本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチド療法に関するものである。より詳細には本発明はインビボの治療用−途に適するオリゴヌクレオチドの生産および人間の病気の治療処置におけるこれらオリゴヌクレオチドの使用に関するものである。

関連技術の要約人間の病気を処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド手法の使用は、抗ウイルス治療および遺伝子障害の治療に関連する医薬の分野にて有望な開発である。

過去数年間において、オリゴヌクレオチドは組織培養系における成る種のウィルスの複製を抑制しうろことが示されている。

ザメクニクおよびステフエンソン、プロシーディング・ナショナル・アカデミ− ・サイエンス、ＵＳＡ、第７５巻、第２８０〜２８４頁（１９７８）は初めて、ラウス肉腫ウィルスを用い、組織培養におけるウィルス複製のオリゴヌクレオチド媒介の抑制を示した。

ザメクニク等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８３巻、第４１４３〜４１４６頁（ｉ−９８６）は、エイズに関連するＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルス（現在はＨＩ　Ｖ−［と呼ばれる）の組織培養における抑制を示している。

極く最近、変化したヌクレオシド間の結合を有する改変オリゴヌクレオチドがインビトロ組織培養系にて一層高いウィルス抑制効能を与えることが示された。

アグローワル等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８５巻、第７０７９〜７０８３頁（１９８８）は、オリゴヌクレオシド・ホスホルアミデートおよびホスホロチオエートを用い、向上した効能をもってＨＩＶ−１の組織培養における抑制を教示している。

サリン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８５巻、第７４４８〜７４５１頁（１９８８）は、オリゴヌクレオシド・メチルホスホネートを用い、向上した効能をもってＨＩＶ−Ｉの組織培養における抑制を教示している。

アグローワル等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８６巻、第７７９０〜７７９４頁（１９８９）は、オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートを用い、初期感染および慢性感染の両細胞培養物におけるＨＩＶ−１のヌクレオチド配列特異性の抑制を教示している。

ライター等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８７巻、第３４３０〜３４３４頁（１，９９０）は、オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートによるインフルエンザウィルス復製の組織培養における抑制を教示している。

さらにオリゴヌクレオチドは正常な細胞過程を調整するために使用され、遺伝子障害の治療における潜在的な用途を示唆している。

グツドチャイルド等、＾ｒＣｈ、Ｂ１０ｅｈｅ−，ＢＩＯｐｂ）’Ｓ、　、第２６４巻、第４０１〜４０９頁（１９８８）は、無細胞系にてオリゴヌクレオチドによるウサギβ−グロブリン合成の抑制を教示している。

テムサマニ等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＵＳＡ）、第２６６巻、第４６８〜４７２頁（１９９１）は、オリゴヌクレオシド・メチルホスホネートによるスプライスオソーム（ｓｐＨｃｅｏｓｏｗｅ　）　ＩＩＩ築の抑制を教示している。

ウィルスの抑制および正常細胞過程の調整は、ウィルス病および遺伝子障害の治療に関するアンチセンスオリゴヌクレオチド手法の使用につき有望視される。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法はオリゴヌクレオチドのインビボ特異性および効能に依存し、その両者はオリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成およびハイブリッド化特性に関連する。したがって、オリゴヌクレオチドが生体内で急速に減成して短い減成生成物を生成すれば、効能が低下すると共に特異性の損失が毒性の副作用をもたらしうる。その結果、インビボ減成に対し耐性であるオリゴヌクレオチドを開発することに関心が寄せられる。改変したヌクレオシド間の結合を有するオリゴヌクレオチドが、この目的で上記研究者等により使用されている。

アグローワルおよびプリン、アドバンスト・ドラッグ・デリバリ−・レビュー、エルセビールブレス社（出版中）（１９９０）は、未改変オリゴヌクレオチドが改変（耐性）オリゴヌクレオチドと対比して劣るウィルス複製の抑制剤であることを教示している。

ショー等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１９巻、第７４７〜７５０頁（１９９１）は、未改変オリゴヌクレオチドが成る種のキャッピング構造により３′末端で封鎖されればインビトロにてヌクレアーゼに対し一層耐性となることを教示し、さらにアンキャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートもインビトロにて減成しないことを教示している。

残念ながら、実際には改変もしくは未改変オリゴヌクレオチドのインビボ安定性もしくは生物分布（これは人間の治療にオリゴヌクレオチドを使用する際に特に関連する）につき何も知られていない。インビトロモデルを作成してインビボにおけるオリゴヌクレオチドの安定性および生物利用性を予測することはできないので、この種の情報を直接与えうるようなシステムが必要とされる。

さらに現存するオリゴヌクレオチドが充分には安定でないことをインビボのデータは示し、インビボにおける固有の酵素活性の減成作用に抗しうるオリゴヌクレオチドについてもニーズが存在するであろう。理想的には、インビボ安定性の増大に関連する構造モチーフを確認すべきてあり、さらにインビボ安定性の最適化を簡単かつ便利に比較しうるようなインビボ系を開発すべきである。

図面の簡単な説明第１図：実施例１〜７に使用したオリゴヌクレオチドの構造。

第２図；本発明のオリゴヌクレオチドを生成させるのに有用な３′　ヒドロキシルキャップ構造の例。Ｒ−有機基、たとえばアルキル、アリール、環式、コレステリルなど；Ｘ−０、Ｓ、Ｓｅもしく　＋、ｔＮＨＲ；　Ｙ−０，Ｓ。

Ｓｅもしく　はＮＨＲ、Ｚ−０，Ｓ、もしくはＮＨ、Ｂ−プリンもしくはピリミジン塩基。

第３図：アンキャップド、５′−キャップド、３′　−キャップドおよび３’　、５’　−キャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートのサル血清における安定性比較。オリゴヌクレオチドを３７℃にてサル血清で培養し、所定時点（レーンの上方に時間で示す）で１部を抜き取り、抽出し、次いでゲル電気泳動て分析した。５′−キャップドのレーン６時間において、大部分の培養混合物は取扱いの際に損失した。

第４図：３０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドを静脈内投与したマウスから集められた尿におけるオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートの安定性。尿は投与後の２４時間まで集め、抽出し、次いてゲル電気泳動により分析した。比較の下のレーンは投与前のオリゴヌクレオチドであり、尿の下のレーン（０〜２４時間）は尿がら回収したオリゴヌクレオチドである。３′　−キャップドオリゴヌクレオチドの拡散バンドは低い比活性に基づく（第１表）。

第５図：静脈内投与の２４時間後におけるマウス腎臓のオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートの状態。比較を示すレーンは投与前のオリゴヌクレオシドであり、腎臓の下のレーン（２４時間）は腎臓から抽出されたオリゴヌクレオシドである。

第６図：マウスに静脈内投与してがら２４時間後に肝臓から抽出されたオリゴヌクレオシド・ボスホロチオエートのゲル電気泳動。比較の下のレーンは投与前のオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートであり、肝臓の下のレーン（２４時間）は肝臓から抽出されたオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートである。

発明の要点本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく治療手法に有用なオリゴヌクレオチドに関するものである。より詳細には本発明は、人間の病気の治療処置に有用であるよう充分な特異性および効能を有するオリゴヌクレオチドに関するものである。本発明は、従来公知のオリゴヌクレオチドよりも高いインビボ特異性および効能を有するオリゴヌクレオチドを堤供する。本発明によるオリゴヌクレオチドの一層高い特異性および効能は、固有のヌクレアーゼによる核外（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｌｃ）切断に対する固有の耐性から生ずる。この耐性は本発明によるオリゴヌクレオチドの２つの構造的特徴の産物である：すなわち（１）］−個もしくはそれ以上の人工ヌクレオシド間結合の存在、および（２）分子の３′末端における特定キャップ構造の存在。

本発明は初めて改変および未改変オリゴヌクレオチドに関するインビボの薬物動態情報を与える。この情報はインビトロの結果からは外挿することができず、実際にはインビボの結果とインビトロの結果との間には驚異的な差が観察される。

本発明は、任意所定のオリゴヌクレオチドが人間の病気の処置に対する治療手法にアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するのに要する特異性および効能を与えるのに必要な核分解減成に対し耐性を有するかどうかを評価するための便利な方法を用いて、この種の情報を提供する。この方法は、尿および各器官のホモゲナイズ組織に存在するオリゴヌクレオチドの状態を検査することにより、インビボのヌクレアーゼに対する放射能標識されたオリゴヌクレオチドの耐性を評価するためマウスモデルを使用する。さらに、この方法は各器官のオリゴヌクレオチド含有量を測定することにより、オリゴヌクレオチドの生物利用性を評価することもてきる。本発明の方法を用いることにより、当業者は本発明によるオリゴヌクレオチドの構造的特徴を有するオリゴヌクレオチドがインビボにて核分解減成に対し耐性であるかどうか容易に決定することができる。この方法は、当業者が不当な実験なしに計画にしたがいこの種の測定を行うことを可能にする。

第１面において本発明は、固有の酵素活性による減成および拡大の両者に対しインビボにて耐性であるオリゴヌクレオチドを提供する。これら本発明によるオリゴヌクレオチドは、現存するオリゴヌクレオチドと対比し一層高い特異性および増大した半減期を有する。この種のオリゴヌクレオチドは、ウィルス感染または遺伝子発現の障害の処置に使用するのに極めて適している。ウィルス感染はＤＮＡ、ＲＮＡおよびレトロウィルスによる感染を包含する。遺伝子発現の障害は、継承した遺伝子欠陥および異常な遺伝子発現から生ずる障害または異常な遺伝子の発現（たとえば腫瘍形成に関連するオンコジーン発現）から生ずる障害を包含する。

アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる治療手法は、標的に対し相補的な適する長さのオリゴヌクレオチドがウィルスもしくは細胞遺伝子である標的の機能を破壊すると言う原理に基づいている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性は、オリゴヌクレオチドにおける複素環式塩基と標的核酸における相補的塩基との間のワトソン中クリック塩基対の形成から生ずる。長さ１６ヌクレオチドのヌクレオチド配列は、約４１６もしくは４×１０９ヌクレオチド毎にランダムに生ずると予想される。すなわち、この種の配列はヒトゲノムにおいて１回のみ生ずると予想される。これに対し、長さ１０ヌクレオチドのヌクレオチド配列は約４　もしくは１×１０６ヌクレオチド毎にランダムに生ずる。すなわち、この種の配列はヒトゲノムにて数千回生ずるであろう。その結果、より大きい長さのオリゴヌクレオチドはより短い長さのオリゴヌクレオチドよりも特異性が大となり、非特異的ハイブリッド化から生じうる有害な合併症をもたらす傾向が低いと思われる。さらに、より長いオリゴヌクレオチドは組織培養におけるＨＩＶに対し所定の範囲内で高い抑制作用を示す（すなわち、２５−ｍａ　ｒ　＞２０−ｍａｒ＞１５−ｍｅｒ＞１０−ｍｅｒ）。したがってオリゴヌクレオチド長さは特異性および効果の目的で所定の範囲を越えねばならない。

オリゴヌクレオチドのインビボ減成は、減少した長さのオリゴヌクレオヂド分解生成物を生成する。この種の分解生成物は、非特異的なハイブリダイゼーションを起こしやすくその完全長さの対応物に比べ効果が低いと思われる。すなわち、人体内での減成に対し耐性であるオリゴヌクレオチドを産生させることが望ましい。好ましくは、この種のオリゴヌクレオチドは、人体における各種の器官および組織に対しても生物利用性でなければならない。本発明によるオリゴヌクレオチドは固有の核分解活性による減成に対し耐性であって、多くの器官および組織に対し生物利用性である。すなわち、この而において本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療手法にて効果的かつ特異的に作用するのに極めて適したオリゴヌクレオチドを提供する。さらに、オリゴヌクレオチドのインビボ代謝は少なくとも肝臓、腎臓、小腸および大腸を包含する成る種の組織にてオリゴヌクレオチドの拡大をもたらす。これは、特定のオリゴヌクレオチドの生物利用性を低下させると共に低下した特異性および潜在的な突然変異副作用をもたらしうる。

本発明によるオリゴヌクレオチドは、２つの構造的特徴によりインビボ減成および拡大の両者に対し耐性である。第１の特徴は、１個もしくはそれ以上の内部人工ヌクレオシド間結合の存在である。ホスホジエステル結合の代りに用いうろこの種の結合の例はホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、サルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、各種のホスホルアミデート、ホスフェートエステル、架橋ホスホロチオエートおよび架橋ホスホルアミデートを包含する。これらの例は単に例示に過ぎず、他のヌクレオシド間結合も当業界で知られているので限定を意味するものでない［たとえばコーヘン、ｌ・レンズ・イン・バイオテクノロジー（１９９０）参照コ。ホスホジエステル結合に代わるこれらヌクレオシド間結合の１個もしくはそれ以上を有するヌクレオチドの合成は当業界では周知であり、混合ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを産生ずるための合成経路を包含する。本発明によるオリゴヌクレオチドの第２の特徴は、分子の３’　−ＯＨにキャップ構造が存在することである。このキャップは３′　ヒドロキシル官能基への接近を封鎖し、したがって拡大３′咳外活性そしてこれはインビボオリゴヌクレオチド減成の主たる固有の媒介であるが、この両者に対し分子を一層耐性にする。本発明によるキャップ構造はＮ−Ｆｍｏｃ−０ ’−ＤＭＴ　ｒ−３−アミノ−１，２−プロパンジオール、並びに第２図に示した構造を包含する。しかしながら、これらの例は単に例示に過ぎない。何故なら、多くの封鎖基が当業界で知られており、当業者はどのようにこの種の基をオリゴヌクレオチドの３′末端に付着されるかを認識できるからである。すなわち本発明の目的で、キャップ構造は、オリゴヌクレオチドの３′　ヒドロキシルに対する接近を制限することによりオリゴヌクレオチドをインビボ減成もしくは拡大に対し耐性にするような任意の封鎖基を包含すると解釈される。本発明の目的でオリゴヌクレオチドは、そのインビボ半減期が全ホスホジエステルヌクレオシド間結合を有するが同一の長さおよび配列を有するオリゴヌクレオチドの半減期よりも長ければ、インビボ減成に対し耐性になると思われる。好ましくは、耐性オリゴヌクレオチドは、同一の長さおよび配列を有するアンキャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートの半減期よりも長いインビボ半減期を有する。

第２面において本発明は、どの特定オリゴヌクレオチドが本発明によるオリゴヌクレオチドを構成するかを評価するための便利な方法を提供する。より詳細には本発明は、ホスホジエスル結合でない１個もしくはそれ以上の内部ヌクレオシド間結合を有すると共に３′キヤツプ構造をも有するオリゴヌクレオチドがインビボ減成に対し耐性であるかどうか決定する便利な方法を提供する。

さらに本発明の方法はこの種のオリゴヌクレオチドの生物利用性に関する便利な評価をも可能にし、これは本発明によるオリゴヌクレオチドの成る種の具体例にて好適である。すなわち本発明は、特定オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む治療手法に使用するのに望ましい特徴を有するかどうか不当な実験なしに評価する便利な方法を提供する。

この面において本発明は、ホスホジエステル結合でない１個もしくはそれ以上の内部ヌクレオシド間結合を有すると共に３′末端に結合したキャップ構造をも有する放射能標識したオリゴヌクレオチドの合成につき当業界で知られた方法を利用する。この種のオリゴヌクレオチドは、静脈内もしくは腹腔内注射のいずれかにより、生理学上許容しうるキャリヤにてマウスに投与される。適当な時間の後、尿を処理マウスから集め、そこに存在するオリゴヌクレオチドの状態をＰＡＧＥおよび放射能写真技術によって測定する。生物利用性は、器官をホモゲナイズすると共にその放射能を測定して決定される。最後に、各器官におけるオリゴヌクレオチドの状態を、ホモゲナイスされた器官組織からオリゴヌクレオチドを抽出した後にＰＡＧＥおよび放射能写真技術を用いて分析することにより測定する。

さらに本発明は、オリゴヌクレオチド安定性に関する予備的情報を与える一層簡単な分析法を提供する。この分析法は、サル血清の存在下にオリゴヌクレオチドを培養し、次いてオリゴヌクレオチドを抽出すると共にＰＡＧＥおよび放射能写真技術を用いて減成を分析することを含む。

以下、限定はしないが実施例により本発明をさらに説オリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートの合成オリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートをモデル８７００型自動合成装置（ミリゲン・バイオサーチ社、１＜−リントン、ＭＡ）にて合成し、その際調節ボアガラス（ＣＰＧ）におけるＨ−ホスホネート化学を用い、次いて二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン（９：　９　：１、ｖ　／　ｖ　）中で０．２Ｍ硫黄により酸化した。合成は５×１０μモル規模で行った。オリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートを、低圧イオン交換クロマトグラフィー　（ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥ−５０ワツトマン）に続く逆相クロマトグラフィー（Ｃ１８）および透析によって精製した。オリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートを合成するＨ−ホスホネート手法の詳細な説明についてはアグローワルおよびタング、テトラヘドロン慟しタース、第３１巻、第７５４１〜７５４４頁（１９９０）に示されている。さらに、オリゴヌクレオシド・メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステル、架橋ホスホルアミデートおよび架橋ホスホロチオエートの合成も当業界で知られている。たとえばアグローワルおよびグツドチャイルド、テトラヘドロン・レタース、第２８巻、第３５３９頁（１９８７）；ニールセン等、テトラヘドロン・レタース、第２９巻、第２９１１頁（１９８８）　；ジャガー等、バイオケミストリー、第２７巻、第７２３７頁（１９８８）；ウズナンスキー等、テトラヘドロン・レタース、第２８巻、第３４０１頁（１９８７）、パンワース、エルベチ力・ヒミカ・アクタ、第７１巻、第１５１７頁（１９８８）；クロスチックおよびパイル、テトラヘドロン・レタース、第３０巻、第４６９３頁（１９８９）；アグローワル等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８７巻、第１４０１〜１４０５頁（１９９０）参照。

Ｎ−Ｆｍｏｃ−０’　−ＤＭＴｒ−３−アミノ−１，２−プロパンジオール−Ｈ −ホスホネートと、所要の配列を組立てた後で最後のカップリングを行うことにより、５′−キャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートを作成した。

次いて５′−キャップドオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを硫黄で酸化した。３′−キャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートはＮ−Ｆｍｏｃ− ０’　−ＤＭＴ　ｒ−３−アミノ−１，２−プロパンジオール−ＣＰＧに対し組立てた後、硫黄酸化を行った。これら手順の組合せを用いて、３’、５’　−キャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートを作成した（第１図参照）。

代案として、他の３′　もしくは５′−キャップ構造を有するオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエート（たとえば第２図参照）を、Ｎ−Ｆｍｏｃ−０’　−ＤＭＴｒ　−３−アミノ−１，２−プロパンジオール−■−ホスホネートもしくはＣＰＧＯ代わりにホスホネートもしくはＣＰＧ−誘導のキャップ構造をキャッピング過程で用いて作成した。同様に、オリゴヌクレオシド・ホスホロチオエート以外のキャップド改変オリゴヌクレオチドを同様に作成し、その際キャッピング手順に適する合成手順を５ｍｇのＣＰＧ−結合オリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを４０μｌの二硫化炭素／ピリジン／トリエチルｍｇ１アメルシャム社、アーリントンハイツ、イリノイ州）の混合物で酸化させた。３０分間の後、同じ溶剤混液における１００μｌの冷Ｓ８を添加し、反応を６０分間にわたり継続させた。この溶液を除去し、支持体を５００μｌの二硫化炭素で３回および７００μ ｍのアセトニトリルで３回洗浄した。生成物を濃アンモニア中で５５℃にて１４時間にわたり保護解除し、蒸発させ、次いでＳｅｐ　ｐａＫ　（登録商標）０１８カラム（ウォータース社、ミルホード、ＭＡ）を用いて脱塩した。得られた生成物をＰＡＧＥ　（２０％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素）によって精製した。

適するバンドをＵＶ陰影下で切ｍ／μモルもしくは４４０ｎＣｉ／μｇであった。

他の改変オリゴヌクレオチドは、Ｈ３もしくはＣＩ４を標識として用いる標準的手順にしたがって標識すること８μｇの３５８−標識オリゴヌクレオシド・ホスホロチオエート（キャソプドもしくはアンキャップド、比活性１．３ｍＣ１／ｍｇ）を５０μｌのサル血清と共に３７℃で培養した。種々の時点て１部を抜取り、０．５％ＳＤ　Ｓ　、１０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ＋　、　２０　ｍ　Ｍ　）リス・Ｃ１（ｐＨ７，６）　、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ中でプロテナーゼＫ（最終濃度２　ｍ　ｇ　／　ｍ　１　）により３７℃にて１時間処理し、次いてフェノール −クロロホルムで抽出し、さらにエタノール沈殿させた。次いてオリゴヌクレオチドを回収してＰＡＧＥ　（２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素）により分析し、次いで放射能写真技術にかけた。

結果を第３図に示す。アンキャップドおよび５′−キャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートは２４時間以内に著しく減成した。これに対し、３′− キャップドおよび３’、５’　−キャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートは２４時間後に安定であった。

これは、サル血清における減成が主として３′エキソヌクレアーゼに基づくことを示す。ラダー形成は、顕著なレベルの核内分解活性が存在しないことを示す。

Ｈ３もしくはＣ１４−標識オリゴヌクレオチドを用いた場合、適する増大蛍光団を用いて放射能写真技術を行った。

実施例５尿分析により評価されるインビボオリゴヌクレオチド安定性雄ＣＤＣ２Ｆ１マウス（平均体重２０ｇ）を、２００μｍの生理食塩水に溶解された３０ｍｇ／ｋｇ量のオリゴヌクレオチドを静脈内もしくは腹腔内注射して処理した。各キャップドもしくはアンキャ・ンブトオリコ゛ヌクレオチドを３匹のマウスに投与した。各動物から投与後の２４時間まで別々に尿を集め、次いて実施例４におけると同様に抽出し、放射能につき分析した。さらに籠を濯いて放射能を測定し、採取できなかった尿量を計算した。

分析はＰＡＧＥ　（２０％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素）により行い、次いて放射能写真技術にかけた。結果を下表１に示す。

投与してから２４時間後、オリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートの約３０％がキャップドであってもアンキャップドであっても排泄された。排泄されたアンキャップドおよび５′−キャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートは第４図に示すように著しく減成した。

これに対し、排泄された３′−キャ・ノブドおよび３′。

５′−キャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートは実質的に減成を示さなかった。このことは、尿中に排泄されるオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートのインビボ減成が３′　−エキソヌクレアーゼ活性により媒介され、これはキャップがオリゴヌクレオチドの３′ヒドロキシル基に付加して抑制しうることを示す。

第１表マウスにおけるオリゴヌクレオチドの尿排泄本静脈内投与マウス　オリゴ　投与量　回収量％１　アンキャップド　８．６１　１８．７　ｇ、４８　２７．２２　アンキャップド　８．６１　２［ｉ、４　ｇ、５５　３５．０３　アンキャップド　８．８１　２２．５　３．０８　２５．６４５′　−キャップド　９．３９　２２．２　３．９１　２［１，１５５′　−キャップド　９．３９　１８．４　８．４２　２４．８６５′　−キャップド　９．３９　１１．４　＋１．９　２３．３７３′　−キャップド　４．９９　２５．９　５．７５　３１．７８３′　−キャップド　４．９９　１８．１　７．７０　２５．８９３′　−キャップド　４．９９　２３．３　４．８９　２８．２１０　３’、５’　６．４７　１７．８　８Ｊ８　２６．０−キャップド１１　３’、５’　６．４７　２２．１　７．５９　２９．７−キヤツブド１２　３’、５’　６．４７　１２．７　＋０．７０　２３．４−キャップド実施例６実施例５の尿オリゴヌクレオチド分析に続き、各動物を殺して解剖し、全器官を副出した。各器官をホモゲナイズし、緩衝液中に溶解させ、放射能につき分析した。

オリゴヌクレオチドの生物分布を下表２に示す。試験した全種類のキャップドおよびアンキャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートは、投与してから２４時間後における各器官の大部分の組織にて生物利用性であった。各組織におけるオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートの濃度は、キャップの存在、不存在もしくは位置に無関係であった。オリゴヌクレオチド濃度は腎臓にて最高であったが、オリゴヌクレオチドの全重量は肝臓にて最高であった。

第２表マウスにおけるオリゴヌクレオチドの組織レベル（投与後２４時間）＊（オリゴヌクレオチドμｇ当量／組織ｇ）アンキャップド　５’−３’−３′、５’−組織　キャップド　キャップド　キャップド腎臓　１９５．００　２３０．００　１ｇ４．６７　２００．３３肝臓　２７．３３　４３．６０　３４．９３　３７．７０大腸　１５．０３　２１．０３　１９．５０　２３．３２小腸　１．０．８８　１４．２０　１２．８７　１２．９１胃　６．２８　７．２６　８．５９　７．５９牌臓　６．０３　＋、２．４０　９．４１　１３．１３心臓　４．１１３　７．０２　５．２３　６．３１肺　３，８１　５．４１　４．３３　５．９０筋肉　３．２９　４．３８　３．３９　４．６１血漿　２゜８５　１．９８　３．１６　１．７０翠丸　１．６４　２．１４　１．５Ｂ　１．７３脳　０．２７　０．２Ｂ　０．３４　０．２３＊−３０ｍｇオリゴヌクレオチド／ｋｇ体重、静脈内。

実施例７実施例６からのホモゲナイズした腎臓もしくは組織を、抽出緩衝液（０，５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ）リス・ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）中でプロテナーゼＫ（２ｍｇ／ｍ＋の最終濃度）により３７℃ にて２時間処理した。次いで試料をフェノール−クロロホルムで２回およびクロロホルムで１回抽出し、次いでエタノール沈殿させた。オリゴヌクレオチドを回収し、ＰＡＧＥ　（２０％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素）で分画した。次いてゲルを１０％酢酸、１０％メタノールにて固定し、放射能写真技術にかけた。結果を腎臓につき第５図に示す。腎臓組織からアンキャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートは約５０％まて減成し、より遅い移動バンド（長さ２〜２３ヌクレオチド）も検出された。すなわちアンキャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートの減成および拡大の両者が腎臓で生ずる。５′−キャップドオリゴヌクレオシト・ホスホロチオエートはほぼ同一の結果を与えた。

これに対し、生物利用性オリゴヌクレオチドの大部分は、３′−キャップドもしくは３’、５’　−キャップドオリゴヌクレオシドを用いた際は減成されず、いずれも何ら拡大の徴候を示さなかった。第６図に示したように、肝臓についても同様な結果が得られた。３′　もしくは３′。

５′　−キャップドオリゴヌクレオシド・ホスホロチオエ−トの拡大は小腸においても観察されなかった。

跡９！可ネベ巨回隔〜込盈を司　アンキャップドＸ−レ回猷工９！１■Ｊψ不〜寸回司　５′−キャップド区ψ頭戸ネに頁回範Ｎ込べ国司−Ｘ　３’−キャップド×−区車！ｑ坏メ巨！頃々込恒覆司−Ｘ　３’、５’−キャップド＄ ■ Ｈ゛　に−− ρＣＴ／ＵＳ　９２１０３８６７フロントページの続き（７２）発明者　テンサマニ、　ジャマルアメリカ合衆国　０１５４５　マサチューセッツ州　シュルーズベリー　ナンバー７　グラフトン　ストリート　１（７２）発明者　タン、ジンーヤンアメリカ合衆国　０６１０４　マサチューセッツ州　ワーセスター　ナンバー２エル　ウェルズ　ストリート　１６

Claims

【特許請求の範囲】

１．１個もしくはそれ以上のヌクレオシド間の結合が人工結合であり、さらにオリゴヌクレオチドが３′ヒドロキシルにキャップ構造を有し、これによりオリゴヌクレオチドがインビボ核分解滅成に対し耐性であることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
２．人工結合である１個もしくはそれ以上のヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、サルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステル、架橋ホスホルアミデートおよび架橋ホスホロチオエートよりなる群から選択される請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
３．キャップ構造がＮ−Ｆｍｏｃ−Ｏ′−ＤＭＴｒ−３−アミノ−１，２−プロパンジオールおよび第２図に示した構造よりなる群から選択される請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
４．生理学上許容しうるキャリヤにおける請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチドからなる治療組成物。
５．生理学上許容しうるキャリヤにおける請求の範囲第２項に記載のオリゴヌクレオチドからなる治療組成物。
６．生理学上許容しうるキャリヤにおける請求の範囲第３項に記載のオリゴヌクレオチドからなる治療組成物。
７．請求の範囲第４項に記載の治療組成物を投与することを特徴とするウィルスに感染した哺乳動物の処置方法。
８．請求の範囲第５項に記載の治療組成物を投与することを特徴とするウィルスに感染した哺乳動物の処置方法。
９．請求の範囲第６項に記載の治療組成物を投与することを特徴とするウィルスに感染した哺乳動物の処置方法。
１０．請求の範囲第４項に記載の治療組成物を投与することを特徴とする遺伝子発現の障害を有する哺乳動物の処置方法。