KR102647743B1 - Bmp 인코딩 rna의 전달에 의한 골형성 유도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 환자에서 (i) 골 질환, 골 장애 또는 골 손상을 치료 또는 예방하고/하거나; (ii) 골형성 분화, 골형성 (osteogenesis), 골화 (ossification), 골 재생 및/또는 골 형태형성을 유도 또는 증강시키는데 사용하기 위한, 골 형태형성 단백질 (BMP)을 인코딩하는 서열을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 (RNA)를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 그의 화학적으로 변형된 형태인, 각각의 BMP 인코딩 rna (BMP rna)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 BMP RNA를 포함하거나 이와 복합체화된 복합체, 특히 리포펙션 (lipofection), 마그네토펙션 (magnetofection) 및 마그네토리포펙션 (magnetolipofection) 복합체와 같은 각각의 형질감염 복합체에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 RNA 또는 복합체가 로딩되어 있는 담체 또는 담체 본체 및 상기 담체 또는 담체 본체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 연장된 mRNA 전달을 위한 매트릭스 또는 스캐폴드 및 이의 골 재생에 있어 생체 내, 생체 외 및 시험관 내 적용에 관한 것이다.
Description
본 발명은 골 형태형성 단백질 (bone morphogenetic protein: BMP)을 인코딩하는 서열을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 (RNA)를 포함하는, 환자에서 (i) 골 질환, 골 장애 또는 골 손상을 치료 또는 예방하고/하거나; (ii) 골형성 분화, 골형성 (osteogenesis), 골화 (ossification), 골 재생 및/또는 골 형태형성을 유도 또는 증강시키는데 사용하기 위한, 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 특히 그의 화학적으로 변형된 형태인, 각각의 BMP 인코딩 rna (BMP rna)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 BMP RNA를 포함하거나 이와 복합체화된 복합체, 특히 리포펙션 (lipofection), 마그네토펙션 (magnetofection) 및 마그네토리포펙션 (magnetolipofection) 복합체와 같은 각각의 형질감염 복합체에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 RNA 또는 복합체가 로딩되어 있는 담체 또는 담체 본체 및 상기 담체 또는 담체 본체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 연장된 mRNA 전달을 위한 매트릭스 또는 스캐폴드 및 이의 골 재생에 있어 생체 내, 생체 외 및 시험관 내 적용에 관한 것이다.
골조직은 주로 콜라겐 및 히드록시아파타이트로 이루어진 조밀한 결합조직의 일 유형이다. 3종의 주요 세포 유형, 골아세포, 파골세포 및 골세포에 의해 집단화되고, 다른 장기에 보호를 제공하고, 신체를 지지하며, 운동을 가능케 한다 (Balmayor, Stem Cell Therapy for Bone Disorders. In: Chase & Vemuri (eds) Mesenchymal Stem Cell Therapy. Humana Press, New York 2012, 101-116). 뼈는 또한 골수 내에서 적혈구 및 백혈구 세포를 생산하고 생명에 필수적인 모든 무기질을 저장한다 (Carmona, Bone Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General 2004, U.S. Department of Health and Human Services, Office of the Surgeon General., Rockville, MD). 골조직이 손상되는 경우, 조직의 정상적 기능의 복원을 시도하면서 골화 과정이 일어난다. 치유 과정은 일반적으로 세포 증식, 이동 및 분화의 조절을 비롯한, 골수, 골 피질 (bone cortex), 골막 및 주변 연조직의 동조 반응 (coordinated respons)을 포함한다 (Dimitriou, Injury 36(12), 2005, 1392-1404; Einhorn, Clin Orthop Relat Res 355, 1998, 7-21). 다수의 시그널링 분자, 예컨대 섬유모세포 성장인자 (FGF), 골 형태형성 단백질 (bmp), 혈소판-유래 성장인자 및 혈관 내피 성장인자 (VEGF)가 새로운 골형성의 조절에 관여한다. 사이토카인의 방출, 저산소증 및 혈관 파괴를 통해 세포는 골절 부위에 동원된다.
골절 치유는 복잡한 생리학적 과정이다. 다양한 이유로 인해, 이 과정은 실패할 수 있고, 예를 들어 지연 유합 (delayed union) 또는 비-유합 골절을 초래할 수 있다. 치료적 선택은 주로 골절 복구를 초래하는 세포 과정을 증강시키도록 고안된다. 이와 동시에, 생체물질이 종종 골절 부위에 기계적 지지 (Tanner, J R Soc Interface 5, 2010, 541-557; Tanner, Proc Inst Mech Eng H 224(12), 2010, 1359-1372) 뿐만 아니라 필요한 성장인자를 위한 전달 플랫폼 (Mourino, Expert Opin Drug Deliv 10(10), 2013, 1353-1365; Romagnoli, Clin Cases Miner Bone Metab 10(3), 2013, 155-161)을 제공하기 위해 사용된다.
bmp는 아마도 골 재생에 관여하는 가장 중요한 성장인자일 것이다 (Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(2-3), 2008, 81-96; Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(1), 2008, 1-13; Urist, Clin Orthop Relat Res 53, 1967, 243-283). 이들은 2개의 상이한 수준에서 골형성을 조절한다: (1) 골격 전구세포의 위임 (commitment) 및 (2) 출생 후 발달 시 골아세포의 성숙 (Yamaguchi, Endocr Rev 21(4), 2000, 393-411). 구체적으로, BMP-2는 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 골형성을 유도하는데 효과적인 것으로 나타났다 (Keibl, Injury 42(8), 2011, 814-820; Katagiri, J Cell Biol 127(6 Pt 1), 1994, 1755-1766; Shekaran, Bone regeneration using an alpha 2 beta 1 integrin-specific hydrogel as a BMP-2 delivery vehicle. Biomaterials, 2014). 그러나, BMP 단백질 (특히, 재조합 BMP-2)을 이용한 골 결함의 치료는 고가이고 염증 및 구조적으로 비정상적인 뼈의 형성과 같은 심각한 부작용을 초래하는 위험을 감수하는 초생리학적 (supraphysiological) 농도를 요구한다 (Zara, Tissue Engineering: Part A 17 (9 & 10), 2011, 1389-1399).
현재, 몇몇 과학자들은 치료적 목적으로 골조직으로의 유전자 전달 가능성을 탐구하고 있다. 단백질 전달에 비해 유전자 전달이 갖는 몇 가지 이점이 입증되어 있다. 이에는 필요에 따라서, 국소적 및 집중적으로, 또는 산재된 방식으로 단백질을 발현하는 유연성이 포함된다. 또한, 단백질은 세포 내에서 생산된다. 따라서, 이는 치료적 경로가 진행되도록 촉진한다. 그의 재조합 등가물과는 달리, 유전자 전달을 통해 전달된 단백질은 신생일 것이고, 다양한 비율의 부정확하게 중첩된, 어쩌면 항원성인 분자로 오염되지 않을 것이다 (Evans, Adv Drug Deliv Rev 64(12), 2012, 1331-1340). 또한, 단백질은 연장된 기간 동안 발현될 수 있고 전이유전자 발현의 수준을 조절할 수 있다. 따라서, 치료 동안에 사용되는 치료적 단백질의 용량이 감소된다 (Evans, 2012, 상기 인용문 중). 구체적으로, BMP-2를 인코딩하는 플라스미드 DNA를 사용한 유전자 전달은 골 치유 및 재생에 대해 약간의 가능성을 갖는 것으로 나타났다 (Lu, J Biomater Sci Polym Ed 23(1-4), 2012, 509-526; Chang, Neurosurgery 65, 2009, 75-81; Park, Gene Ther 10(13), 2003, 1089-1098).
그러나, 몇몇 이점에도 불구하고, 현재 유전자 전달용 바이러스 벡터는 강력한 면역원성 및 삽입 돌연변이를 비롯한 안정성 우려와 연관된다. 비-바이러스 벡터는 낮은 유전자 전달 효율에 의해 제한된다 (Evans, 2012, 상기 인용문 중). 후자는 주로 플라스미드 DNA의 핵 내로의 불충분한 수송에 기인되고 있다.
DNA-기반 유전자 요법의 대안은 메신저 RNA (mRNA) 전달이다. 최근에, mRNA를 사용하는 전사물 요법 (transcript therapy)이 유전자 및 재조합 단백질 요법에 대한 더 안전한 대체물로서 급격한 관심을 받고 있다. mrna는 각각 재조합 단백질 및 유전자 전달에 의해 수반되는, 면역원성의 위험성도, 잠재적인 돌연변이 유발성 (mutagenicity)도 갖지 않는다. 추가적인 기술적 이점은, DNA는 핵에 도달할 것이 요구되지만, mrna는 단지 활성이 되기 위해 세포질에 도달할 것이 요구된다는 점이다 (Yamamoto, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 71, 2009, 484-489; Tavernier, Journal of Controlled Release 150, 2011, 238-247). 따라서, mrna는 매우 다양한 의학적 징후에서 선구적 치료제로서 부상하고 있다 (Yamamoto, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 71, 2009, 484-4891; Tavernier, Journal of Controlled Release 150, 2011, 238-247; Kormann, Nature Biotechnology 29, 2011, 154-157; Esteller, Nature Review Genetics 12, 2011, 861-874). 특히, mRNA는 최근에 비-바이러스 유전자 요법에 대한 대안으로서 부상하고 있다. mRNA는 세포질에서 기능을 발휘하기 때문에, 핵막을 가로지르는 수송과 관련된 제한을 극복하고; 이들은 mRNA-기반 전사물 요법과는 무관하다.
mRNA가 명백히 다수의 치료를 위한 잠재적 도구를 나타내지만, 임상적 적용 (예를 들어, 암 백신접종)은 통상적인 mrna의 강력한 면역원성 및 제한된 안정성으로 인해 아직까지는 제한되고 있다 (Van Tendeloo, Curr Opin Mol Ther 9(5), 2007, 423-431).
Holtkamp는 120개 뉴클레오티드 길이의 폴리(A) 테일의 부가에 의한 mRNA 안정성의 증가를 입증하였다 (Blood 108(13), 2006, 4009-4017). 또한, Holtkamp는 안정성 및 번역 효율을 달성하기 위해 UTR의 최적화에 대한 연구를 보고하였다 (Holtkamp 상기 인용문 중). 나아가, 선천적 면역 체계의 증가된 안정성 및 감소된 활성화를 초래하는 mRNA의 화학적 변형이 보고되었다. 구체적으로, 치료적 마우스 에리쓰로포이에틴 (EPO) 및 계면활성제 단백질 B (SP-B)를 코딩하는 화학적으로 변형된 mRNA (cmRNA)의 생성 및 치료적 가능성이 각각 조혈을 유도하고 치사적 선천성 폐질환의 치료에 잠재력을 갖는 것으로 보고된 바 있다 (Kormann, Nat Biotechnol 29(2), 2011, 154-157). 또한, 콜라겐 스폰지는 DNA 또는 cmRNA를 로딩하고, 또한 이들 위에 세포를 접종하기 위한 3D 매트릭스로 사용되고 있다 (Chevallay, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218; Reckhenrich, Biomaterials 32, 2011, 1996-2003; Scherer, The Journal of Gene Medicine 4, 2002, 634-643; Elangovan, Journal of Controlled Release 218, 2015, 22-28; WO 01/00708). '페트리 디쉬'-기반 2D 세포 배양과 비교하여, 3D 스캐폴드 내에서의 세포 배양은 세포 모양, 세포 시그널링 및 세포 행동과 관련하여 생체 내 상황에 더 근접하게 유사하고, 이는 세포에서 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있음이 최근 연구에서 나타났다 (Mueller-Klieser, American Journal of Pysiology-Cell Physiology, 273, 1997, C1109-C1123). 콜라겐 스폰지는 세포의 이동, 부착, 점착, 및 특정한 경우에는, 분화를 변경할 수 있는 3D 매트릭스의 일종이다 (Chevallay, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218). 나아가, T 세포 전사인자 FOXP3를 인코딩하는 cmRNA에 의한 알레르기 천식의 치료가 Mays에 의해 제안된 바 있다 (J Clin Invest 123(3), 2013, 1216-1228). 결핍 또는 결손 유전자 또는 단백질과 관련된 질환을 위한 개선된 치료적 수단으로서 cmRNA가 또한 WO 2011/012316에 기술되어 있다. 일반적으로, cmRNA을 사용하는 전사물 요법이 유전자 및 재조합 단백질 요법에 대한 더 안전하고 유망한 대안으로 부상하고 있다. 그러나, 이들의 적용은 DNA에 비해 cmrna의 일시적 번역 및 상대적으로 낮은 안정성으로 인해 제한되고 있다. 또한, 예를 들어 EPO cmRNA가 사용되는 경우, 성공적인 치료 (요구되는 헤마토크릿 (hematocrit)의 지속적 순응)를 위해 반복된 적용/투여가 필요할 것으로 추정된다.
유전자 요법에서 더욱 진보된 접근법은 결손 유전자를 복구하기 위한 유전적으로 변형된 자가 조직 그라프트의 사용이다. 이 치료적 전략은 전구세포를 함유하고 공간 충진형, 유도성 또는 전도성 스캐폴드의 특성을 보유하는 최소한으로 조작된 자가 조직을 통해 유전자를 전달함으로써 치유 과정을 촉진하는 것을 추구한다 (Evans, Eur Cell Mater 18, 2009, 96-111; Evans, Tissue Eng 13(8), 2007, 1987-1993). 예를 들어, 지방 조직은 골전구세포 세포를 보유하는 것으로 알려져 있고; 이는 천연 스캐폴딩 재료로서 제공되는 눙력을 가지며 용이하게 적출될 수 있다 (Evans, 2009, 상기 인용문 중; Dragoo, Plast Reconstr Surg 115(6), 2005, 1665-1673). Evans (2009, 상기 인용문 중)는 뼈 및 연골 결함을 복구하기 위해 인간 BMP-2 cDNA를 보유하는 아데노바이러스로 형질도입된 지방 및 근육 조직 그라프트를 사용하였다. 그러나, 이 접근법은 또한 상기에 기술된 단점으로 문제가 되고 있다.
연장된 유전자 또는 약물 전달 시스템은 반복적 투약의 적용을 요구하지 않기 때문에, 수년간 이들은 점차 많은 관심을 끌고 있다. 그 결과, 환자는 더 쉽게 자신의 약물을 사용할 수 있고, 이는 치료적 접근법의 더 나은 수용을 초래할 수 있다 (Bartus, Science 281, 1998, 1161). RNA 요법의 경우, 이러한 지연 전달 시스템은, 예를 들어 골 질환에서 장기간 단백질 발현을 목표로 하는 경우에 특히 적합할 것이다. 그럼에도 불구하고, RNA의 연장된 전달을 위한 효율적인 방법이 아직까지는 부족하다.
따라서, 본 발명의 내재하는 기술적 과제는 뼈와 관련된 의학적 중재를 위한 개선된 수단 및 방법의 제공이다.
기술적 과제는 청구범위에 특정된 실시양태의 제공에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명은 골 형태형성 단백질 (BMP)을 인코딩하는 서열을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 (RNA)를 포함하는, 환자에서
(i) 골 질환, 골 장애 또는 골 손상을 치료 또는 예방하고/하거나;
(ii) 골형성 분화, 골형성, 골화, 골 재생 및/또는 골 형태형성을 유도 또는 증강시키는데 사용하기 위한, 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 (이를 필요로 하는 환자에서)
(i) 골 질환, 골 장애 또는 골 손상을 치료 또는 예방하고/하거나;
(ii) 골형성 분화, 골형성, 골화, 골 재생 및/또는 골 형태형성을 유도 또는 증강시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 뼈 BMP를 인코딩하는 서열을 갖는 RNA(를 포함하는 약제학적 조성물)의 약제학적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
본원의 하기 및 첨부된 실시예에 입증된 바와 같이, 놀랍게도 (a) BMP를 코딩하는 RNA, 특히 인간 BMP-2 (서열번호 1에 의해 인코딩되는 서열번호 3; hBMP-2 cmRNA) 또는 인간 BMP-7 (서열번호 2에 의해 인코딩되는 서열번호 4; hBMP-7 cmRNA)을 코딩하는 cmRNA가 골형성을 유도/증강시킨다는 것을 확인함에 따라, 본 발명은 상기에 기재된 기술적 과제를 해결한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, BMP를 인코딩하는 RNA가 골 재생을 위한 전사물 요법 및 뼈-관련 질환, 장애 또는 손상의 치료 또는 예방에서 각각 성공적으로 이용될 수 있다는 원리가 증명되었다.
나아가, 본 발명의 맥락에서, BMP-인코딩 RNA (BMP RNA)를 이용한 단일 치료가 뼈-관련 질환, 장애 또는 손상의 적절하고/완전한 치료 (또는 예방)에 충분하다는 증거가 제공된다. 따라서, 본 발명의 수단 및 방법의 하나의 이점은 BMP RNA의 단 1회 투여를 요구한다는 것이다.
본 발명의 수단 및 방법의 또 다른 이점은, DNA-기반 유전자 요법 및 통상적인 전사물 요법에 대한 대안이, 예를 들어, 바이러스 및 비-바이러스 벡터의 각각의 제한 없이, 그리고 안전성 우려 및/또는 제한된 안정성/발현 등의 단점 없이 적용될 수 있다는 것이다.
본 발명에 따라 RNA를 사용하는 또 다른 이점은 (예를 들어, DNA 벡터의 사용과는 달리) 치료 지속기간의 조정이 가능하다는 것이다. 예를 들어, 줄기세포의 유도 경우에는, 체세포를 줄기세포로 리프로그래밍하기 위하여, 전사인자가 단지 일시적으로 활성인 것이 바람직한 규칙이다. BMP를 인코딩하는 관련 RNA의 용량 투여를 통해, 시간의 경과에 따라 활성을 제어할 수 있다. 이와 달리, 이전에 알려진 방법은 투여된 유전자의 통합 위험성을 감수해야 하고, 이는 종양형성과 같은 합병증을 초래할 수 있고, 나아가 지속기간을 제어하는 것을 불가능하게 만들 수 있다.
본 발명은 특히 첨부된 실시예에 기술된 실험을 토대로 한다.
그 중에서도 이들 실시예는, BMP RNA (예컨대, hBMP-2 또는 -7 cmRNA)로 형질감염된 세포 (예컨대, BMSC 및 AMSC와 같은 MSC)가 특히 장기간 기준 (예컨대, 7일 초과 동안)으로 증가된 수준의 생물학적 활성 BMP (예컨대, BMP-2 또는 BMP-7)를 분비하였음을 나타낸다. 이들 분비된 단백질의 수준은 (시험관 내 실험에서) 골형성 분화를 유도하는데 효과적이었다. 이는 특히 형질감염된 세포에서 드러났던 증가된 알칼라인 포스파타제 (ALP) 수준의 결정에 의한 골형성 마커의 발현에 의해, 그리고 RunX2, ALP, 오스테릭스 (Osterix), 오스테오칼린 (Osteocalcin), 오스테오폰틴 (Osteopontin) 및 콜라겐 타입 I의 증강된 발현 (정량적 RT-PCR에 의해 검출됨)에 의해 표시되었다. 더욱이, 이는 무기질화 (mineralization) (침착된 무기질화 매트릭스)에 의해 (시험관 내에서) 표시된다. (각각의 cmRNA로의 MSC) 형질감염 2주 후에 달성되었던 양성 알리자린 레드 (Alizarin red) 염색에 의해 무기질화가 나타났다. BMP RNA (예컨대, hBMP-2 및 -7 cmRNA)의 골형성 가능성이 또한 각각의 BMP RNA로 (생체 외) 형질감염된 인간 유지/지방 (fat/adipose) 조직에 대해 입증된다. 인간 유지/지방 조직은 또한 hBMP-2, RunX2, ALP 및 콜라겐 타입 I의 발현에 의해 표시되는 바와 같이, 골형성 반응을 (시험관 내) 양산하였다.
본 발명의 맥락에서 형질감염 조건이 심지어 최소한의 세포독성으로 더 높은 형질감염 효율을 얻도록 최적화될 수 있음이 또한 입증되었다. 이 맥락에서, 몇몇 형질감염 시약 및 상이한 리포터 cmrna (형광 단백질)을 사용하여 cmRNA를 이용한 MSC의 형질감염을 먼저 연구하였다. 연장된 단백질 발현 (최대 5일)을 초래하는 높은 형질감염 효율이 달성되었다. 발현 피크는 전형적으로 형질감염 후 24시간과 48시간 사이에서 관찰되었다.
나아가, MSC를 형질감염시키는데 사용된 복합체의 생체적합성을 시험하기 위하여 세포독성 스크리닝을 수행하였다. 발현 및 세포 생존력의 결과로부터, BMP RNA (예컨대, hBMP-2 또는 -7 cmRNA)로 세포 (MSC)를 더욱 형질감염시키기 위한 최선의 형질감염 프로토콜이 선택되었다. 구체적으로, 리포터 시스템으로서 메트리디아 (Metridia) 루시퍼라제를 사용하여 DreamFect Gold (DF-Gold)가 세포 내로 (cm)rna를 전달하는데 고도로 적합한 비-바이러스 지질 인핸서임을 확인하였다. DF-Gold/(cm)RNA 복합체는 (cm)RNA 형질감염에 고도로 효율적이었지만 세포에 매우 온건(mild)하였다.
형질감염 목적을 위해, 리포펙션 및 마그네토펙션 과정이 본 발명의 맥락 및 첨부된 실시예에서 사용되었다. 그로 인해, 형질감염 효율의 강건한 증대가 다양한 (cm)rna를 이용해, 특히 상이한 2종의 일차 세포 유형, AMSC 및 BMSC에서 수득되었다. 구체적으로, 리포펙션 및 마그네토펙션 둘 다에 의한 BMP RNA (예컨대, hBMP-2 또는 -7 cmRNA)의 세포 (예컨대, BMSC 및 AMSC와 같은 MSC)로의 전달이 시험관 내 골형성을 지지한 것으로 나타났다.
가장 높은 형질감염 효율이 마그네토펙션을 이용해, 특히 마그네토펙션이 MSC (예컨대, BMSC 또는 AMSC)에 적용되었던 경우에 달성되었다.
특히, BMSC는 형질감염되기 어려운 것으로 간주된다 (Lakshmipathy, Stem cells 22(4), 2004, 531-543). 그러나, 본 발명의 맥락에서는 BMSC를 이용한 경우조차도, eGFP cmRNA 자성 리포플렉스 (magnetic lipoplex)로의 마그네토펙션을 통한 효율적인 형질전환이 달성될 수 있고, 이는 24시간 후 80% 양성 세포를 초래하는 것으로 나타났다. 유사하게, hBMP-2 cmRNA가 사용되었던 경우에, 마그네토펙션 우위 지수 (Magnetofection Advantage Index, MAI)에서의 6배 증가가 AMSC에서 측정되었다. 구체적으로, hBMP-2-형질감염된 AMSC는 7일의 기간 동안 비형질감염된 세포에 비해 상당히 더 많은 양의 hBMP-2를 분비할 수 있었다. 이 경우에, 단백질 발현에서의 정체기 (plateau)가 24시간과 72시간 사이에서 관찰되었다. 이 효과는 또한 본 발명에 따라서 hBMP-2 cmRNA (또는 다른 BMP RNA)의 치료적 작용에 유익할 수 있다. 실제로, 형질감염된 세포에 의한 hBMP-2 (또는 다른 BMP)의 일정한 생산의 결과로서, 골형성 유전자 발현 및 무기질화가 또한 증강되었다.
또한, 마그네토펙션을 통해 형질감염된 AMSC는 전사인자 RunX2, 오스테오폰틴 및 알칼라인 포스파타제의 더 높은 발현뿐만 아니라 더 많은 무기질 침착을 나타내었다. 이론에 결부됨 없이, RunX2의 발현은 골형성 분화의 진행을 제어하는데 있어 전사인자 RunX2의 역할을 반영한다. 마그네토펙션을 통해 hBMP-2 cmRNA로 형질감염된 AMSC는 RunX2의 가장 높고 연장된 발현을 나타내었고, 이는, 그 결과로, 이들 샘플에서 시험관 내 관찰되는 더욱 뚜렷한 골형성과 상당히 연관된다.
원칙적으로, BMP-2와 관련하여 상기에 언급되었던 것들이 BMP-7과 관련하여 본 발명의 맥락에서 역시 마찬가지로 나타났다. 구체적으로, hBMP-7-형질감염된 AMSC는 3일이 넘는 기간 동안에 비형질감염된 세포에 비해 상당히 더 많은 양의 hBMP-7을 분비할 수 있었다. 이 경우에, 최대 단백질 발현이 형질감염 24시간 후에 관찰되었다. 2종의 상이한 hBMP-7 cmRNA 용량, 즉 20 및 32 pg/세포를 시험하였다. 20 pg/세포로 형질감염된 세포는 32 pg/세포 용량과 비교할 때 유의미하게 더 많은 hBMP-7 분비를 초래하였다. 형질감염된 AMSC는 무기질화 매트릭스를 침착시킬 수 있었고, 이는 이들 샘플에서 시험관 내 증강된 골형성을 나타낸다.
언급한 바와 같이, hBMP-2 cmRNA (또는 다른 BMP RNA)로 형질감염된 지방 조직 생검이 증가된 hBMP-2 수준 (또는 다른 BMP의 수준)을 발현하였고, 이는 이어서 최대 7일까지 동안에 시험관 내로 배양되는 경우 여러 골형성 마커의 발현을 상향-조절하였음이 본 발명의 맥락에서 추가로 입증되었다. 이들 결과를 토대로, hBMP-2 형질감염된 지방 임플란트 (또는 다른 BMP로 형질감염된 지방 임플란트)가 자가 조직 복구를 위한 hBMP-2 (또는 다른 BMP) 및 각각의 전구세포의 효율적인 공급원으로서 작용할 수 있는 것으로 결론지을 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 달성된 시험관 내 결과는 BMP RNA, 특히 hBMP-2 및 -7 cmRNA가 골 재생을 위한 자가 조직 그라프트 기법의 적용에 있어 진일보를 나타냄을 보여준다. 이는 바이러스 벡터의 사용 및 이들의 연관된 결점 (안전성 우려 등, 상기 참조)을 회피한다.
본원에 제공된 첨부의 실시예 및 발명의 개시는 또한 임상적으로 관련된 동물 모델에서 골형성을 다루는 연구의 합리적인 기초를 제공한다. 따라서, 이러한 연구는 통상의 기술자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
대표적인 비-제한적 예시로서, hBMP-2 cmRNA를 뼈 임플란트 재료 위에 그라프트하고 래트의 대퇴골 내 치명적이지 않은 크기의 골 결함에 생체 내로 투여하였다. 수득된 마이크로 컴퓨터 단층촬영 (Micro Computer Tomography, μCT) 결과는 골 치유에 있어 hBMP-2 cmRNA의 치료 효과를 지지한다. hBMP-2 cmRNA로 처리된 이들 동물에서, 생체 내 골형성의 자극이 관찰되었다. 반면, 비특이적 cmRNA (예컨대, 초파리 루시퍼라제 (FFL)를 인코딩하는 cmRNA)로 처리된 동물에서는 어떠한 골형성도 관찰되지 않았다. 이는 hBMP-2 cmRNA가 골 결함 부위에서 골형성의 유발을 초래하는 hBMP-2의 생체 내 치료적 발현을 매개함을 입증한다.
본 발명의 맥락에서, 담체/담체 바디 (예를 들어, 콜라겐 스폰지 또는 피브린 클롯)는 RNA, 특히 BMP-인코딩 RNA와 함께 로딩되는 경우, 그리고 또한 형질감염되는 세포가 그들 위에 접종된 경우에 효과적인 형질감염 시스템의 일부일 수 있는 것으로 입증되었다. 따라서, 담체/담체 바디는 골 재생에서 3D 매트릭스로 기능할 수 있다. 또한, 본 발명의 맥락에서, 담체/담체 바디 (예컨대, 콜라겐 스폰지 또는 피브린 클롯)가 세포를 접종하기 위한 3D 스캐폴드로서 뿐만 아니라 RNA (특히, BMP-코딩 RNA, 예컨대, cmRNA 또는 심지어 비-화학적으로 변형된 BMP-인코딩 RNA)의 연장된 전달을 위한 데포 (depot)로서 사용될 수 있다는 증거를 제공하였다.
구체적으로, 그리고 첨부의 실시예에서 입증된 바와 같이, 먼저 콜라겐 스폰지에 (m)RNA 함유 리포플렉스를 사전-로딩하고 진공-건조시켰다. 이어서, 건조된, 로딩된 스폰지를 세포 접종을 위한 3D 매트릭스로 사용하였다. 따라서, 본 발명은 또한 세포 접종 및 (m)RNA 형질감염 단계를 하나의 단일 단계로 조합하고 단순화하는 전달 시스템에 관한 것이다. 부가적으로, (m)RNA-로딩된 콜라겐 스폰지는 지연된 전달 특성을 나타내었다. 따라서, 이들은 전통적인 2D mRNA 형질감염 후 단백질의 신속하고 일시적인 생산을 극복할 수 있다. 임상적 적용의 예시로서, hBMP2 (m)RNA-로딩된 콜라겐 스폰지를 사용한 골 재생을 시험관 내 및 생체 내에서 조사하였다. 또한, 바로 사용 가능한 (ready-to-use) 생체물질로서 진공-건조된 (m)RNA-로딩된 콜라겐 스폰지의 가능성을 조사하기 위하여, 이들의 유효 기간 (shelf life)을 성공적인 장기간 안정성 어세이에서 평가하였다. 따라서, 본 발명은 또한 연장된 (m)RNA 전달 데포를 제공한다. 이는 임상적 접근법에서 유전자 요법을 위한 편리하지만 안전한 대안에 대해 새로운 방식을 개척한다.
놀랍게도, 본 발명의 맥락에서 비변형된 (m)RNA가 또한 유전자 요법 목적을 위해 특히 본원에 기술된 바와 같은 연장된 전달 시스템/데포의 일부분으로서 이 시스템/데포에 의해 투여되는 경우에, 성공적으로 사용될 수 있음을 입증할 수 있었다.
본 발명의 다른 이점은 높은 세포 형질감염 효율 (100%에 근접함) 및 낮은 세포 독성이었다. 언급된 바와 같이, 안전성 문제를 고려할 때, 특히 콜라겐 스폰지 상에 로딩되는 경우, 진공-건조된 rna는 장기간 (예컨대, RT에서 적어도 6개월)에 걸쳐서 안정하였다. 또한, 본 발명의 맥락에서, hBMP2 rna를 사용한 시험관 내 (MC3T3-E1 세포 및 MSC 이용) 및 생체 내 (래트 대퇴부 결함에서) 골 재생은 전임상 적용에서 이 시스템의 능력을 입증하였다.
전반적으로, 본 발명은 그 중에서도 연장된 단백질 발현을 위한 안정하고 효율적인 RNA 전달 시스템으로서 RNA-로딩된 (진공-건조된) 담체 (콜라겐 스폰지)를 제공하고, 그로써 전사물 요법이 임상적 접근법에 한걸을 더 가까이 갈 수 있게 한다. 구체적으로, 본 발명은 바로 사용 가능한 생체물질로서 RNA-로딩된 진공-건조된 콜라겐 스폰지의 안전성, 효율성 및 안정성을 규명하였다. 각각의 바이러스-무함유, 및 유전자-무함유 기법은 RNA 연장된 전달 시스템을 제공하는데, 이는 RNA 변형, 세포 유형 및 세포 밀도로부터 독립적이다. 이 기법을 이용한 시험관 내 및 생체 내 골 분화의 연구는, 연장된 단백질 전달이 요법의 목적을 만족하는 경우, 임상적 적용을 위한 RNA-로딩된 진공-건조된 콜라겐 스폰지의 능력을 입증하였다. 이 연구는 메신저 RNA의 더 쉽지만 유망한 적용에 대해 새로운 방식을 개척하고, 이는 안전성 측면에서 DNA-기반 유전자 요법을 능가한다.
본 발명은 또한 하기 항목에 관한 것이다:
1. 골 형태형성 단백질 (BMP)을 인코딩하는 폴리리보뉴클레오티드 (RNA)를 포함하는, 환자에서
(i) 골 질환, 골 장애 또는 골 손상을 치료 또는 예방하고/하거나;
(ii) 골형성 분화, 골형성, 골화, 골 재생 및/또는 골 형태형성을 유도 또는 증강시키는데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
2. 항목 1에 있어서, 상기 BMP가 BMP-2 또는 BMP-7인 것인, 약제학적 조성물.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, RNA가 피막화되는 (encapsulated) 것인, 약제학적 조성물.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA가 리포펙틴에 의해 형질감염되는 것인, 약제학적 조성물.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA가 마그네토펙션에 의해 형질감염되는 것인, 약제학적 조성물.
6. 항목 5에 있어서, 자성 나노입자 (mnp)를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
7. 항목 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 리포좀 형질감염 시약 (LTR)을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
8. 항목 7에 있어서, 상기 RNA에 대한 상기 LTR의 w/w 비가 RNA의 μg 당 2 내지 20 μg의 LTR인 것인, 약제학적 조성물.
9. 항목 7 또는 8에 있어서, 상기 mnp 대 상기 LTR 대 상기 RNA의 비가 각각 약 0.5 (철 중량) : 약 2 내지 5 또는 4 내지 7 (중량) : 약 1 (중량)인 것인, 약제학적 조성물.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA가 생체 내로 전달되는 것인, 약제학적 조성물.
11. 항목 10에 있어서, 상기 RNA가 상기 환자의 뼈 또는 뼈 조직 내로 직접적으로 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
12. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA가 상기 환자 내로 도입되는 것인 세포에 생체 외로 전달되는 것인, 약제학적 조성물.
13. 항목 12에 있어서, 상기 RNA가 상기 환자의 세포에 생체 외로 전달되고 상기 RNA가 전달된 상기 세포가 상기 환자 내로 재도입되는 것인, 약제학적 조성물.
14. 항목 12 또는 13에 있어서, 상기 세포가 골전구세포 세포인 것인, 약제학적 조성물.
15. 항목 12 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 중간엽 줄기세포 (MSC)인 것인, 약제학적 조성물.
16. 항목 15에 있어서, 상기 MSC가 지방-유래 중간엽 줄기세포 (AMSC) 또는 골수-유래 MSC (BMSC)인 것인, 약제학적 조성물.
17. BMP-2 또는 BMP-7을 인코딩하는 서열을 갖는 RNA로서, 상기 RNA의 시티딘의 25%가 5-메틸시티딘 (m5C)이고 상기 RNA의 유리딘의 25%가 2-티오유리딘 (s2U)인 것인, RNA.
18. 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA가 항목 17의 RNA인 것인, 약제학적 조성물.
원칙적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 뼈와 관련되거나, 그와 연관되거나, 그와 생리학적으로 연계되거나 또는 그에 영향을 미치는 임의의 질환, 장애, 결함 또는 손상 (본원에서는 또한 간단히 골 질환으로 언급됨)을 치료 또는 예방하는데 사용된다. 이 맥락에서, 본 발명에 따른 RNA는 RNA가 도입되는 세포 또는 조직에서, 자연적으로는 바람직한 정도로 또는 전혀 발현되지 않는 BMP가 형성될 수 있도록 요법 또는 예방에 사용될 수 있다. RNA는 다음의 두 경우 모두에 사용될 수 있다: (i) BMP가 유전자의 결핍으로 인해서, 그리고 또한 질환으로 인해서 형성되지 않는 경우, 또는 (ii) BMP의 도입이 신체에 유리한 경우. RNA는 또한 적합한 수준으로 발현되지 않는 BMP를 보충하기 위해 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따라 치료 또는 예방되는 골 질환은, 예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8a, BMP-8b, BMP-10 및/또는 BMP-15, 바람직하게는 BMP-7, 더욱 바람직하게는, BMP-2와 같은, 하나 이상의 BMP(의 기능)과 관련되거나, 그와 연관되거나 또는 그와 생리학적으로 연계된다. 더욱 구체적으로, 본 발명에 따라 치료되는 골 질환은 하나 이상의 BMP(의 기능)의 전달, 유도 및/또는 증가에 의해 치료, 예방 또는 호전될 수 있는 골 질환(의 증상)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 특히 환자에서, 더욱 구체적으로 본 발명의 맥락에서 골 질환의 치료 또는 예방의 맥락에서 골형성 분화 (예컨대, MSC의 골형성 세포로의 분화), 골형성, 골화, 골 재생, 골 형태형성 골 형성, 골 성장, 무기질화 및/또는 석회화를 유도 또는 증강시키는데 사용된다.
많은 종류의 골 질환이 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들어, Evans (2012, 상기 인용문 중), 특히 그의 표 1에 기술된다. 본 발명의 맥락에서 치료 또는 예방되는 골 질환의 예시는 골형성 부전증 (단일유전자, 우성 음성, 유전적 질환), (퇴행성) 골다공증, (골다공증성) 골절, 불유합 (non-unions), 골 결손, 분절 골절, 골낭종, 척추 융합, 무혈관 괴사, 골종양 (예컨대, 골육종, 유잉 육종), 골용해 (예컨대, 암 유도성 골용해, 무균성 이완)이다.
BMP RNA가 본 발명에 따라 사용될 수 있는 하나의 특정 분야는 골-관련 재생 의학 분야이다. 질환 과정 또는 노화의 맥락에서, 특히 BMP가 질환 또는 노화 과정으로 인해 너무 적게 또는 전혀 생산되지 않는 경우, BMP의 도입에 의해 치료되고, 완화되고, 예방되거나, 또는 심지어 치유될 수 있는 퇴행성 골 질환이 발생한다. BMP를 인코딩하는 관련 BMP RNA의 도입에 의해, 퇴행성 과정이 정지될 수 있거나 또는 심지어 재생이 개시될 수 있다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명에 따라 치료 또는 예방되는 골 질환은 퇴행성 골 질환이다. 퇴행성 골 질환의 예시는, 그 중에서 퇴행성 골다공증, 파제트병, 척추증 (진행 퇴행성 관절염으로도 알려짐), 골연화증 및 구루병 (Rickets)이다.
일 측면에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 골 치유에 사용된다. 예를 들어, (골다공증성) 골절, 불유합, 분절 골절, 골낭종, 척추 융합, 무혈관 괴사가 이 맥락에서 치유되게 된다.
구체적으로, 불유합, 분절 골 결손 및 골절, 더욱 구체적으로 골다공증성 골절은 본 발명에 따라서 치료되고, 예방되고/되거나 치유되는 것으로 예상된다.
본 발명에 따라 사용되는 RNA는 또한 골 질환의 진행에 영향을 미칠 수 있다. 유전자 결함이 직접적인 원인은 아니지만 질환 과정이 BMP RNA 발현에 의해 긍정적으로 영향을 받을 수 있는 골 질환의 예시이다. "조직 공학 (tissue engineering)"의 인자로서 골 치유를 위한 bmp가 예시이다.
본 발명에 따른 RNA에 의해 인코딩되는 BMP는 BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8a, BMP-8b, BMP-10 및/또는 BMP-15, 바람직하게는 BMP-7, 더욱 바람직하게는, BMP-2일 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 바람직한 BMP는 인간 bmp (hbmp)이다. bmp는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 (Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(2-3) loc. cit; Bessa, J Tissue Eng Regen Med 2(1) loc. cit; Urist, 상기 인용문 중)에 기술되어 있다. (h)bmp의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당해 분야에 공지된 데이터베이스를 통해 이용가능하다 (예컨대, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 하의 NCBI). 각 데이터베이스 엔트리의 예시는 아래의 표 5에 열거되어 있다.
hBMP-2의 특정 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1로 표시된다. hBMP-7의 특정 뉴클레오티드 서열이 서열번호 2로 표시된다. hBMP-2의 특정 아미노산 서열이 서열번호 3으로 표시된다. hBMP-7의 특정 아미노산 서열이 서열번호 4로 표시된다.
본 발명의 맥락에서 용어 "BMP" (또는 "BMP RNA")는 또한 각각의 BMP (또는 각각의 BMP RNA)의 기능적 단편 및 변이체를 포함하는 것으로 고려된다.
BMP RNA 그 자체 외에, 또한 BMP RNA의 변이체가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. BMP RNA의 변이체는 BMP RNA 자체와 구조적으로 상이할 수 있지만 여전히 BMP RNA 자체와 동일한 방식으로 기능적으로 활성일 수 있다. 구체적으로, BMP RNA의 변이체는 각각의 BMP 자체로 기능할 수 있는, 즉 골 형태형성 활성을 나타낼 수 있는 단백질을 인코딩하는 것으로 의도된다. 더욱 구체적으로, BMP RNA의 변이체는 골형성을 조절할 수 있는 단백질을 인코딩하는 것으로 의도된다. 이 맥락에서, 골형성은 상이한 2개 수준에서 조절될 수 있다: (i) 골격 전구세포의 위임; 및/또는 (ii) 출생 후 발달 시 골아세포 성숙. 따라서, BMP RNA의 변이체는 골형성 분화, 골형성, 골화, 골 재생 및/또는 골 형태형성을 유도 또는 증강시킬 수 있는 단백질을 인코딩하는 것으로 의도된다. 당업자는 BMP RNA의 소정의 변이체가 각각의 BMP RNA 그 자체로서 기능하는지, 예를 들어, 골 형태형성 활성을 나타낼 수 있는 단백질을 인코딩하는지 여부를 결정하는데 용이한 입장에 있다. 이 목적을 위해, 당업자는 (예컨대, 상기 인용문 중에 Yamaguchi에 기술된 바와 같은) 당해 분야에 공지되고 첨부의 실시예에 제공된 각각의 수단 및 방법에 의존할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 (예컨대, 각각 첨부의 실시예 5 또는 7에서 결정되는 바와 같은) BMP RNA의 소정의 변이체가 시험관 내, 생체 외 및/또는 생체 내에서 골형성을 유도하는지 여부를 결정할 수 있다.
원칙적으로, BMP RNA의 변이체가 각각의 BMP RNA 그 자체와 더 유사할수록, 그 변이체는 더 바람직하다.
본 발명에 따른 특정 BMP RNA 또는 BMP RNA의 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA일 수 있다:
(a) BMP-1, BMP-2 (특히 바람직함), BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (바람직함), BMP-8a, BMP-8b, BMP-10 또는 BMP-15의 아미노산 서열을 인코딩하는, 예컨대, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA;
(b) 치환, 삽입 및/또는 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 BMP-1, BMP-2 (특히 바람직함), BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (바람직함), BMP-8a, BMP-8b, BMP-10 또는 BMP-15의 아미노산 서열을 인코딩하는, 예컨대, 치환, 삽입 및/또는 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA (여기서, 상기 RNA는 골 형태형성 활성을 나타낼 수 있는 단백질을 인코딩함);
(c) BMP-1, BMP-2 (특히 바람직함), BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (바람직함), BMP-8a, BMP-8b, BMP-10 또는 BMP-15의 아미노산 서열을 인코딩하는, 예컨대, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상보적 가닥에 혼성화하는 (뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는) RNA (여기서 상기 RNA는 골 형태형성 활성을 나타낼 수 있는 단백질을 인코딩함); 및
(d) BMP-1, BMP-2 (특히 바람직함), BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (바람직함), BMP-8a, BMP-8b, BMP-10 또는 BMP-15의 (전장) 아미노산 서열에, 예컨대, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 바와 같은 (전장) 아미노산 서열에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 RNA (여기서 상기 RNA는 골 형태형성 활성을 나타낼 수 있는 단백질을 인코딩함).
본 발명의 맥락에서, "치환, 삽입 및/또는 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는"은 구체적으로 치환, 삽입 및/또는 결실된 최대 500개, 최대 400개, 최대 300개, 최대 200개, 최대 100개, 최대 50개, 최대 30개, 최대 20개, 최대 10개, 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 1개의 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 일 특정한 측면에서, 이 용어는 하나 이상의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 예컨대, 최대 500개, 최대 400개, 최대 300개, 최대 200개, 최대 100개, 최대 50개, 최대 30개, 최대 20개, 최대 10개, 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 1개의; (보존적) 아미노산 교환을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, "혼성화하는"은 혼성화가 하나의 핵산 분자와 다른 (상보적인) 핵산 분자 사이에서 일어날 수 있음을 의미한다. 2개 핵산 분자의 혼성화는 일반적으로 통상적인 혼성화 조건에서 일어난다. 본 발명의 맥락에서, 엄격한 (stringent) 혼성화 조건이 바람직하다. 혼성화 조건은, 예를 들어, 문헌 [Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA]에 기술되어 있다. 특정 실시양태에서, "혼성화하는"은 혼성화가 하기의 (엄격한) 혼성화 조건에서 일어남을 의미한다:
언급된 바와 같이, BMP의 기능적 단편을 인코딩하는 RNA가 또한 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 이 맥락에서 "기능적"은 단편이 각각의 전장 BMP RNA와 동일한 방식으로 기능적으로 활성인 것을 의미한다. 구체적으로, BMP의 기능적 활성 단편은 여전히 골 형태형성 활성을 나타낼 수 있는 BMP의 단편이다. 본원에서 BMP RNA의 변이체의 기능적 활성과 관련하여 상기에 언급되었던 것들이 또한, 필요한 변경을 가하여, BMP의 기능적 단편에 적용된다.
BMP의 특정 (기능적) 단편은 각각의 BMP의 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 500개 또는 적어도 700개의 (연속) 아미노산 잔기 잔기의 아미노산 신장 (stretch)일 수 있다.
본원에 기술된 BMP RNA의 임의의 변이체에 의해 인코딩된 단백질의 기능적 단편을 인코딩하는 BMP RNA가 또한 본 발명의 맥락에서 이용될 수 있다. 또한 이러한 BMP RNA는 각각의 BMP로서 기능할 수 있는, 즉 골 형태형성 활성을 나타낼 수 있는 단백질을 인코딩하도록 특별히 의도된다. 본원에서 BMP RNA의 변이체 및 BMP 단편의 기능적 활성과 관련하여 상기에 언급되었던 것들이 또한, 필요한 변경을 가하여, 이러한 BMP RNA에 적용된다.
원칙적으로, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "BMP RNA"의 의미는, (i) BMP 자체 및 전장 BMP 각각을 인코딩하는 본원에 기술된 RNA, (ii) BMP 변이체를 인코딩하는 본원에 기술된 변이체 RNA, 및 (iii) BMP의 기능적 단편(의 변이체)을 인코딩하는 본원에 기술된 RNA 모두를 포함한다.
본 발명에 따라 이용되는 BMP RNA/BMP RNA 컨스트럭트의 예시된 뉴클레오티드 서열이 서열번호 29 또는 30 (둘 다 hBMP-2 (cm)rna) 및 서열번호 29 (hBMP-7 (cm)RNA)로 표시된다.
본 발명의 맥락에서, RNA는 세포 내로 유입되는 경우, 단백질 또는 이의 기능적 단편을 발현하는데 적합하거나 단백질 또는 이의 기능적 단편으로 번역 가능한 임의의 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 용어 "단백질"은 임의의 종류의 아미노산 서열, 즉, 펩티드 결합을 통해 각각 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기들의 사슬을 포함하고, 또한 펩티드 및 융합 단백질을 포함한다.
특히 바람직한 측면에서, 본 발명에 따라 이용되는, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 RNA는 메신저 RNA (mRNA)이다. 이는, 이 측면에 따르면, 본원에 정의된 임의의 RNA가 mRNA의 형태일 수 있음을 의미한다.
이용되는 RNA는 이중-가닥 RNA (예를 들어, 분자간 또는 분자내 혼성화에 의해) 또는, 바람직하게는, 단일-가닥 RNA (그러나, 이는 적어도 분자내 혼성화에 기인한 이중 가닥 부분을 포함할 수 있음; 예를 들어 헤어핀 구조)일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명에 따라 이용되는 RNA는 비-자연적으로 발생하는 RNA, 특히 비-자연적으로 발생하는 mRNA이다.
본 발명에 따라 이용되는 RNA는 화학적으로 변형된 RNA (cmRNA)일 수 있다. 원칙적으로, 이것이 바람직하다. cmrna는 당해 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 Kormann (상기 인용문 중), Mays (상기 인용문 중) 및 WO 2011/012316에 기술되어 있다. 구체적으로, 이용되는 cmRNA는 WO 2011/012316에 기술된 바와 같은 cmRNA일 수 있다.
본 발명에 따라 이용되는 RNA 및, 특히 cmRNA는 증가된 안정성 및/또는 감소된 면역원성을 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로, RNA, 특히 cmRNA는 Toll-유사 수용체 및/또는 레티노이드-유도가능 유전자 I (RIG-I)과의 RNA 상호작용을 무력화하는 것으로 고려된다. 원칙적으로, 이는 본원에 정의된 바와 같은 임의의 (cm)RNA에 적용된다.
면역원성 및 안정성은 그 자체가 공지된 방식으로 결정될 수 있다.
RNA의 면역원성을 결정하기 위하여, 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려진 다양한 방법이 사용될 수 있다. 매우 적합한 방법은 RNA의 투여에 대한 반응으로서 세포 내 염증성 마커의 결정이다. 염증과 관련된 사이토카인, 예를 들어 TNF-α, IFN-α, IFN-β, IL-8, IL-6, IL-12 또는 당해 분야의 숙련자에게 알려진 다른 사이토카인이 일반적으로 측정된다. DC 활성화 마커의 발현이 또한 면역원성의 추정을 위해 사용될 수 있다. 면역반응의 추가의 징후는 Toll-유사 수용체 TLR-3, TLR-7 및 TLR-8과 헬리케이즈 (helicase) RIG-1에 대한 결합의 검출이다.
면역원성은 일반적으로 대조군과 비교하여 결정된다. 통상적인 방법에서, 본 발명에 따라 이용되는 RNA를 세포에 투여하고 RNA의 투여에 대한 반응으로서 지정된 시간에 염증성 마커의 분비를 측정한다. 비교를 위해 사용된 표준으로서, 약간의 면역반응을 초래하거나 면역반응을 전혀 초래하지 않는 것으로 알려진 RNA가 사용될 수 있고, 이 경우에 그러면 본 발명에 따라 이용되는 RNA에 대한 면역반응이 동일한 범위에 속해야 하고 상승하지 않아야 한다. 본 발명에 따라 이용되는 RNA의 경우, 예를 들어 면역반응을 적어도 30%, 일반적으로 적어도 50% 또는 심지어 75% 저하시키거나 또는 심지어 이를 완전히 방지하는 것으로 고려된다.
면역원성은 상기에 언급된 인자의 측정에 의해, 특히 TNF-α 및 IL-8 수준과 TLR-3, TLR-7, TLR-8 및 헬리케이즈 RIG-1에 대한 결합능의 측정에 의해 결정될 수 있다. 그로써 (m)RNA가 바람직하게 낮은 면역원성을 갖는지 여부를 확립하기 위하여, 고려된 폴리리보뉴클레오티드의 투여 후 상기에 언급된 인자의 하나 이상의 양을 측정할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 시험되는 (m)RNA의 양을 꼬리 정맥 또는 i.p.를 통해 마우스에 투여할 수 있고, 그 후에 상기에 언급된 인자의 하나 이상을 미리 지정된 기간 후, 예컨대, 7 또는 14일 후에 혈액 내에서 측정할 수 있다. 그 후에 인자의 양을 비처리된 동물의 혈액 내 존재하는 인자의 양과 비교한다. 면역원성의 결정을 위해 TLR-3, TLR-7, TLR-8 및/또는 헬리케이즈 RIG-1에 대한 결합능을 측정하는 것이 매우 유용한 것으로 확인된 바 있다. TNF-α 수준 및 IL-8 수준이 또한 매우 우수한 징후를 제공한다. 본 발명에 따라 이용되는 (m)RNA의 경우, 예를 들어, 비변형된 RNA에 비해 TLR-3, TLR-7, TLR-8 및 RIG-1에 대한 결합능을 적어도 50% 저하시킬 수 있다. 일반적으로, 상기 인자에 대한 결합을 적어도 75% 또는 심지어 80% 저하시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TLR-3, TLR-7, TLR-8 및 RIG-1에 대한 결합능은 본 발명에 따라 이용되는 (m)RNA가 투여된 동물 및 mRNA가 투여되지 않은 동물의 경우에 동일한 범위에 속한다. 다시 말하면, 일 특정 측면에서, 본 발명에 따라 이용되는 (m)RNA는 실질적으로 어떠한 염증성 반응 또는 면역반응도 야기하지 않는 것으로 고려된다.
구체적으로, 본 발명에 따라 이용되는 RNA는 환자의 일반적 상태가 영향을 받지 않는 그렇게 낮은 면역원성을 갖는 것으로 고려된다. 따라서 상기에 언급된 인자의 약간의 증가는 일반적 상태가 그 결과로서 악화되지 않는 한 허용될 수 있다.
본 발명에 따라 이용되는 (m)RNA의 추가의 특성은 이의 효율성 및 안정성이다. 이를 위해, 전사 효율, 형질감염 효율, 변역 효율 및 단백질 발현의 지속기간이 중요하고 그 자체가 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
전사 효율은 RNA가 얼마나 효율적으로 DNA로부터 생산될 수 있는지를 나타낸다. 이때 고 함량의 변형된 뉴클레오티드의 사용과 관련된 문제가 발생할 수 있다. 본 발명에 따라 변형된 RNA는 높은 전사 효율로 생산될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따라 이용되는 RNA는 (화학적으로) 변형된 시티딘 뉴클레오티드 및/또는 (화학적으로) 변형된 유리딘 뉴클레오티드를 갖는 RNA이다. 이러한 rna가, 예를 들어, WO 2011/012316에 기술되어 있다.
적합한 (화학적) 변형의 예시가 표 4에 개시되어 있다. 바람직한 변형된 시티딘은 5-메틸시티딘 (m5C)이다. 바람직한 변형된 유리딘은 2-티오유리딘 (s2U)이다.
구체적으로, 본 발명에 따라 이용되는 cmRNA는 5 내지 50%의 변형된 시티딘 뉴클레오티드 및/또는 5 내지 50%의 변형된 유리딘 뉴클레오티드, 및 50 내지 95%의 비변형된 시티딘 뉴클레오티드 및/또는 50 내지 95%의 비변형된 유리딘 뉴클레오티드를 갖는 RNA일 수 있다. 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드는 비변형되거나 부분적으로 변형되지만, 이들은 바람직하게는 비변형된 형태로 존재한다. 바람직하게는, 7.5 내지 35%의 시티딘 및/또는 유리딘 뉴클레오티드가 변형되고, 더욱 바람직하게는, 변형된 시티딘 뉴클레오티드의 함량은 15% 내지 25%의 범위에 속하고/하거나 변형된 유리딘 뉴클레오티드의 함량은 15% 내지 25%의 범위에 속한다.
본 발명에 따라 이용되는 cmRNA의 하나의 비-제한적인 예시는, RNA의 시티딘의 약 25%가 변형된 시티딘 (예컨대, 5-메틸시티딘 (m5C))이고/이거나 RNA의 유리딘의 약 25%가 변형된 유리딘 (예컨대, 2-티오유리딘 (s2U)) (m5C(0.25)s2U(0.25) RNA)인, RNA이다. 각각의 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드는 바람직하게는 비변형된 형태로 존재한다.
그러나, 다른 측면에서, 본 발명에 따라 이용되는 RNA는 또한 cmRNA가 아닐 수 있고, 즉 RNA는 비-화학적으로 변형된 RNA일 수 있다. 이 측면에 대하여, 비-화학적으로 변형된 RNA는 비-자연적으로 또는, 바람직하게는, 자연적으로 발생하는 RNA일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 이용되는 비-화학적으로 변형된 RNA는 단지 비-변형된, 즉 자연적으로 발생하는, 뉴클레오시드 잔기들, 즉 자연적으로 발생하는 아데노신, 구아노신, 시티딘 및 유리딘을 포함하는 것으로 특히 고려된다. 다른 자연적으로 발생하는 뉴클레오시드 (예컨대, 이노신, 티미딘 등)가 또한, 원칙적으로, 포함될 수 있다. 구체적으로, RNA는 상기에 기술된 바와 같은 cmRNA가 아닐 수 있고, 예를 들어, WO 2011/012316에 기술된 바와 같은 cmRNA가 아닐 수 있다. 그러나, 본 발명에 따라 이용되는 비-화학적으로 변형된 RNA 조차도 감소된 면역원성을 가질 수 있고, 예를 들어 Toll-유사 수용체 및 레티노이드-유도가능 유전자 I (RIG-I)과의 (m)RNA 상호작용을 무력화할 수 있다. 특히, 본 발명에 따라서, 그리고 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 매트릭스 또는 스캐폴드, 즉 담체 상에 로딩되는 경우, 비-화학적으로 변형된 RNA가 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 비-화학적으로 변형된 RNA 또한, 예를 들어, 연장된 수명을 나타낸다. 이는 각각의 비-화학적으로 변형된 RNA-로딩된 담체를 연장/지연된 RNA 전달을 위한 바람직한 데포로 만든다. 비-화학적으로 변형된 RNA의 다른 이점은 사용되는 RNA를 화학적으로 변형하는 단계가 요구되지 않는다는 점이다.
따라서, 사용을 위한 약제학적 조성물, 매트릭스 또는 스캐폴드, 즉, 담체, 및 본원에 기술된 약제학적 조성물이 RNA, 특히, 본 발명에 따라 이용되는 비-화학적으로 변형된 RNA의 연장 및/또는 지연된 전달을 위해 제제화되는 것이 또한 본 발명의 맥락에서 고려된다. 더욱 구체적으로, 약제학적 조성물 또는 매트릭스/스캐폴드는 RNA의 연장 및/또는 지연된 전달을 위한 시스템, 예컨대 데포로서 제제화될 수 있다. 본원의 하기에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, RNA가 본 발명에 따른 복합체의 형태이고, 매트릭스/스캐폴드가 진공 및/또는 냉동-건조될 수 있고 RNA가 로딩되어 있는 콜라겐 스폰지인 것이 이 측면과 관련하여 또한 바람직하다.
원칙적으로, 본 발명에 따라 이용되는 (m)RNA는 이와 같이 직접적으로 사용될 수 있다. 그러나, 예를 들어 (추가의) 유익한 특성을 도입하기 위하여 mRNA를 (추가로) 변형할 가능성이 또한 존재한다. 첫 번째로, mRNA는 코딩 가닥에 다른 코딩 또는 비-코딩 가닥을 부착함으로써 변형될 수 있다. 두 번째로, 이는 또한 변형된 뉴클레오티드 내에 제공된 기능적 그룹에 추가의 분자를 결합시킴으로써 변형될 수 있다.
이 맥락에서, 본 발명에 따라 이용되는 RNA는 추가의 기능적 영역 및/또는 3' 또는 5' 비코딩 영역을 가질 수 있다. 3' 및/또는 5' 비코딩 영역은 인코딩된 단백질 (BMP)에 자연적으로 연접한 영역 또는 RNA의 안정화에 기여하는 다른 인공적 서열일 수 있다. 당업자는 통상적인 실험에 의해 각각의 경우에서 이에 적합한 서열을 발견할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, RNA는 특히 번역을 개선하기 위해 3' 말단에 m7GpppG 캡 (cap), 내부 리포좀 진입 부위 (IRES) 및/또는 폴리A 테일을 함유한다. RNA는 번역을 촉진하는 추가의 영역을 가질 수 있다.
본질은 그에 대해 (m)RNA가 사용되는 골 질환을 치료, 완화 또는 예방하는 BMP, 또는 이의 기능적 단편의 기능이 제공될 수 있다는 것이다.
일 실시양태에서, 이용되는 (m)RNA는 표적 세포에 특이적인 표면 수용체에 결합하는 표적화 리간드와 조합될 수 있고, 그로써 표적 세포의 수용체-매개 형질감염이 가능하다. 이 목적을 위해, 세포 내로 (m)RNA의 도입에 적합한 비히클, 아니면 (m)RNA 자체가 먼저 리간드로 변형될 수 있다. 세포 내로 (m)RNA의 도입에 적합한 비히클의 예시는 양이온성 제제이다. 이들은 양이온성 지질, 양이온성 중합체 또는 또한 나노입자, 나노캡슐, 자성 나노입자 및 나노에멀젼을 포함한다. 적합한 비히클이 당해 분야의 숙련자에게 알려져 있고 전문가의 문헌에 기술되어 있다. 적합한 리간드가 또한 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고 문헌에 기술되어 있으며 이용가능하다. 리간드로서, 예를 들어 트랜스페린, 락토페린, 클렌부테롤, 당, 우론산, 항체, 앱타머 등이 사용될 수 있다. 이러한 비히클 및 리간드의 예시가 또한 본원의 다른 곳에 기술되어 있다.
언급된 바와 같이, (m)RNA 자체가 리간드로 변형될 수 있다. 이 목적을 위해, 리보스의 2' 위치에 일차 아미노기 또는 아지도기를 보유하는 변형된 뉴클레오시드를 갖는 (m)rna가 바람직하다. 예시는 표 4에서 확인할 수 있다. 이러한 변형은 이들이 생물학적 활성에 기여하기 때문에 특히 바람직하다. 이들 변형을 통해, 리간드는 아미드 형성 또는 "클릭 (click)" 화학에 의해, 예컨대, 생체접합 (bioconjugate) 기법에 의해 용이하게 도입될 수 있다.
특정 실시양태에서, 단백질, 예컨대, 수용체에 결합할 수 있는 RNA 서열 (앱타머)이 (m)RNA의 5' 말단에 도입된다. 이 과정은 리간드가 이미 DNA 수준에서 매트릭스 내로 직접적으로 도입되고, 예컨대, 시험관 내 번역 (IVT)에 의해 (m)RNA 내로 클로닝되고 도입될 수 있다는 이점을 갖는다. 따라서 리간드를 이용한 (m)RNA의 후속 변형이 더이상 요구되지 않는다.
추가의 실시양태에서, (m)RNA는 불활성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 이용한 추가적인 변형에 의해 변형된다. 이를 위한 방법이 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 리간드에 대해 공지된 것과 같은 과정이 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 전사 후 PEG가 결합되는 폴리에틸렌 글리콜에 대한 결합 부위가 (m)RNA에 대해 사용된 변형된 뉴클레오티드의 작은 부분에 제공될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 (m)RNA의 세포외 안정화를 위해 제공되고, 즉 폴리리보뉴클레오티드 분자가 세포 내에 도달할 때까지 이를 보호한다. 세포 내로의 진입 시, PEG는 절단된다. 따라서 PEG와 RNA 사이의 결합은, 바람직하게는 세포 내로의 진입 시 용이하게 절단되도록 고안된다. 이를 위해, 예를 들어 pH-의존적으로 절단되는 관능기가 제공될 수 있다. RNA를 안정화시키는 다른 분자가 또한 변형된 뉴클레오티드 상의 적합한 활성 부위를 통해 제공될 수 있다. 이 방식으로, (m)RNA는 효소적 분해에 대한 입체적 안정화 및 방지된 생체유액 성분과의 상호작용에 의해 보호될 수 있다. 그렇게 변형된 (m)RNA는 "스텔스 (stealth)" (m)RNA로 명명될 수 있다.
RNA의 보호 및 안정화에 바람직한 방법이 EP 11 98 489에 기술되어 있고, 그의 내용에 대한 참조가 본원에 명백히 이루어진다. 본 발명에 따라 이용되는 RNA는 EP 11 98 489에 기술된 방법에 의해 보호될 수 있다. 첫 번째로 RNA가 또한 이 방법에 의해 유리하게 안정화되고 보호될 수 있으며, 두 번째로 그렇게 처리된 RNA의 활성이 전혀 또는 유의미하게 제한되지 않는다는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, RNA는 EP 11 98 489에 따라서 처리된다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따라 이용되는 RNA (mRNA, cmRNA 등)는 피막화, 즉 캡슐 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 나노캡슐일 수 있다. 적합한 캡슐이 당해 분야에 공지되어 있고 또한 본원의 다른 곳에 기술되어 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 표적 세포 또는 표적 조직 내로 RNA를 전달 및/또는 도입하기 위한 하나 이상의 제제 또는 하나 이상의 시약을 추가로 포함한다. 구체적으로, 이/이들 제제 또는 시약은 세포 또는 조직 내로 RNA의 전달 및/또는 도입을 지지하는 것으로 고려된다. 이/이들 제제 또는 시약은 RNA와 함께 투여될 수 있다. 전달/도입되는 RNA는 또한 이/이들 제제 또는 시약과 결합되거나 (예컨대, 공유적으로 결합되거나 그와 복합체화됨) 또는 비-결합될 (예를 들어, 단지 그와 혼합됨) 수 있다. 각각의 제제 또는 시약은 당해 분야에 알려져 있으며 (예컨대, Tavernier, J Control Release 150(3) (2011), 238-47), 예를 들어, 그 중에서도 특히 지질, 리포좀, 미셀 (micelles), 중합체 및 덴드리머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 각각의 제제 또는 시약의 특정 예시는 DOTAP (1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판), DODAP (1,2-디올레일-3-디메틸암모늄 프로판), DOTMA (1,2-디-0-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판), XTC (2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란) 및 MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트), ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d] [1,3]디옥솔-5-아민)), NC98-5 (4,7,13-트리스(3-옥소-3-(운데실아미노)프로필)-Nl,N16-디운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-디아미드), C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, 1,2-디스테로일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DSDMA", 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DODMA", 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DLinDMA", 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DLenDMA", N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 또는 "DODAC", N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 또는 "DDAB", N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시 에틸 암모늄 브로마이드 또는 "DMRIE", 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판 또는 "CLinDMA", 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카디엔옥시)프로판 또는 "CpLinDMA", N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 또는 "DMOBA", 1,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DOcarbDAP", 2,3-디리놀레오일옥시-N,N-디메틸프로필아민 또는 "DLinDAP", 1,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DLincarbDAP", 1,2-디리놀레오일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DLinCDAP", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 또는 "DLin-K-DMA", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[l,3]-디옥솔란 또는 "DLin-K-XTC2-DMA", 또는 이들의 혼합물이다 (Heyes, J Controlled Release 107 (2005), 276-287; Morrissey, Nat. Biotechnol. 23(8) (2005), 1003-1007; WO2005/121348). 추가의 예시는 DC-Chol (N,N-디메틸-N-에틸카르복스아미도콜레스테롤), 1,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진이다 (Gao, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179 (1991), 280; Wolf, et al BioTechniques 23 (1997), 139; U.S. Pat. No. 5,744,335). 추가의 예시는 리포펙틴 (DOTMA:DOPE) (Invitrogen, Carlsbad, Calif), 리포펙타민 (DOSPA:DOPE) (Invitrogen), 리포펙타민 2000. (Invitrogen), 퓨진 (FUGENE), 트랜스펙탐 (DOGS), 및 이펙텐 (EFFECTENE)이다. 추가의 예시는 변형 및 비변형된 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락타이드, 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 공중합체, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 시클로덱스티린, 폴리리신, 폴리아르기닌, 올리고/폴리아민 및 폴리에틸렌이민이다.
제제 또는 시약은 올리고머, 중합체 또는 리피도이드 (lipidoid)일 수 있다. 이들은 예를 들어, PCT/EP2014/063756에 기술된 바와 같은 특징적 올리고(알킬렌 아민) 모이어티와 같은, 올리고(알킬렌 아민) 모이어티를 포함할 수 있다. 구체적으로, 제제 또는 시약은 PCT/EP2014/063756에 기술된 바와 같은 올리고머, 중합체 또는 리피도이드일 수 있다. 이들 특정 제제 또는 시약의 하나의 주된 특징은 이들이 하기 화학식 (I)의 공통의 구조적 본질을 함유한다는 것이다:
이러한 제제 또는 시약은 하기로부터 선택된 올리고(알킬렌 아민)(을 포함하는 성분)일 수 있다:
a) 측쇄 및/또는 말단기로서 복수의 화학식 (II)의 기를 포함하는 올리고머 또는 중합체:
여기서 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R6은, 복수의 이러한 기에서 화학식 (II)의 각 기에 대해 독립적으로, 다음과 같이 정의됨:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥2이고;
R2 내지 R5는, 서로에 독립적으로, 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
R6은 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고,
화학식 (II)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 화학식 (II)의 양이온성기를 제공하도록 양성자화될 수 있음;
b) 반복 단위로서 화학식 (III)의 복수의 기를 포함하는 올리고머 또는 중합체:
여기서 변수 a, b, p, m, n 및 R2 내지 R5는, 복수의 이러한 기에서 화학식 (III)의 각 기에 대해 독립적으로, 다음과 같이 정의됨:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥2이고;
R2 내지 R5는, 서로에 독립적으로, 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7 또는 -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 및 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄로부터 선택되고;
화학식 (III)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 화학식 (III)의 양이온성기를 제공하도록 양성자화될 수 있음; 및
c) 화학식 (IV)의 구조를 갖는 리피도이드:
여기서 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 하기와 같이 정의됨:
a는 1이고 b는 2 내지 4의 정수이거나; 또는 a는 2 내지 4의 정수이고 b는 1이고ㅊ,
p는 1 또는 2이고,
m은 1 또는 2이고; n은 0 또는 1이고 m+n은 ≥2이고;
R1 내지 R6은 서로에 독립적으로 수소; 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨); 아미노기에 대한 보호기; -C(NH)-NH2; 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄; 및 수용체 리간드로부터 선택되고, 단 R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 기 -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 또는 -CH2-R7 (여기서 R7은 C3-C18 알킬 또는 하나의 C-C 이중 결합을 갖는 C3-C18 알케닐로부터 선택됨)이고;
화학식 (IV)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 화학식 (IV)의 양이온성 리피도이드를 제공하도록 양성자화될 수 있음.
더욱 특정한 측면에서, 이러한 제제 또는 시약은 a) 및 b)로부터 선택된 올리고(알킬렌 아민)(을 포함하는 성분)일 수 있고, 여기서
a)는 측쇄 및/또는 말단기로서 복수의 화학식 (IIa)의 기를 포함하는 올리고머 또는 중합체이고:
여기서 a, b, m, n, 및 R2 내지 R6은 상기에 정의된 바와 같고, 화학식 (IIa)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 양이온성 올리고머 또는 중합체 구조를 제공하도록 양성자화될 수 있음; 및
b)는 반복 단위로 복수의 화학식 (IIIa)의 기를 포함하는 올리고머 또는 중합체를 포함하는 것이다:
여기서 a, b, m, n, 및 R2 내지 R5는 상기에 기술된 바와 같이 정의되고, 화학식 (IIIa)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 양이온성 올리고머 또는 중합체 구조를 제공하도록 양성자화될 수 있음.
더욱 특정한 다른 측면에서, 이러한 제제 또는 시약은 화학식 (IVa)의 구조를 갖는 리피도이드로부터 선택되는 올리고(알킬렌 아민)(을 포함하는 성분)일 수 있다:
여기서 a, b, m, n, 및 R1 내지 R6은 상기에 기술된 바와 같이 정의되고, 화학식 (IVa)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은 양이온성 리피도이드를 제공하도록 양성자화될 수 있음.
이러한 제제 또는 시약과 관련하여, 화학식 (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) 또는 (IVa)에서 n은 1일 수 있거나; 또는 m은 1일 수 있고 n은 1일 수 있다.
또한, 이러한 제제 또는 시약과 관련하여, 화학식 (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV) 또는 (IVa)에서 a는 1일 수 있고 b는 2일 수 있거나; 또는 a는 2일 수 있고 b는 1일 수 있다.
일 특정 측면에서, 올리고머, 중합체 또는 리피도이드는 양이온성 (예컨대, 양성자화된) 올리고머, 중합체 또는 리피도이드일 수 있다.
본 발명의 맥락에서 이용되는 이러한 올리고머, 중합체 또는 리피도이드의 하나의 비-제한적인 예시는 100 mg의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623 mmol)을 575.07 mg의 1,2-에폭시도데칸 (3.12 mmol, (N-1) 당량 (여기서 N은 올리고(알킬렌 아민) 당 일차 아민의 2× 양 + 이차 아민의 1× 양임)과 혼합하여 제조되고 일정한 교반 중의 80℃에서 96시간 동안 혼합된 양이온성 지질이다. 이러한 올리고머, 중합체 또는 리피도이드는 또한 리피도이드 "C12-(2-3-2)"로도 언급된다.
본 발명에 따라 이용되는 제제 또는 시약, 특히 중합체는 공중합체, 특히 통계적 (statistical) 공중합체일 수 있다. 이러한 공중합체는 (예컨대, 비-교호적 길이의 알킬렌 아민 반복 단위의 유사한 배열을 함유하는 덜 바람직한 중합체와 달리) 교호적 길이 (alternating length)의 알킬렌 아민 반복 단위의 통계적/무작위 배열을 함유하는 공중합체일 수 있다. 공중합체는 양이온성 (예컨대, 양성자화된) 공중합체일 수 있다. 본 발명에 따라 이용되는 공중합체는 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들어, EP 14 19 9439.2, WO 01/00708, EP-A1 1 198 489 및 CA-A1 2,377,207에 기술되어 있다.
구체적으로, 공중합체는 하기를 포함하는 통계적 공중합체일 수 있다:
하기 화학식 (a1) 및 (a2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수의 반복 단위:
및
하기 화학식 (b1) 내지 (b4)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수의 반복 단위:
여기서 반복 단위들 (b)의 합에 대한 반복 단위들 (a)의 합의 몰비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내에 속하고,
공중합체 내에 함유된 반복 단위 (a) 및/또는 (b)의 질소 원소의 하나 이상은 양이온성 공중합체를 제공하도록 양성자화될 수 있음.
공중합체는 임의의 반복 단위 (a) 및 임의의 반복 단위 (b)가 공중합체 거대분자 내에 통계적으로 분포되어 있는 통계적 공중합체일 수 있다. 이는 전형적으로 중합화 반응 동안에, 반복 단위 (a)를 생성하는 단량체와, 중합화 반응 동안에, 반복 단위 (b)를 생성하는 단량체의 혼합물의 공중합화로부터 수득된다. 바람직하게는, 공중합체는 임의의 반복 단위 (a) 및 임의의 반복 단위 (b)가 중합체 거대분자 내에 무작위로 분포되어 있는 랜덤 공중합체이다.
본 발명에 따른 공중합체는 선형, 분지된 또는 수지상 공중합체일 수 있다. 당업자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 2 원자가를 갖는 화학식 (a1), (b1) 또는 (b3)의 반복 단위 (즉, 이웃하는 단위에 개방된 결합)는 선형 방식으로 공중합체 구조의 전파를 초래한다. 따라서, 본 발명의 선형 공중합체는 화학식 (a1)의 반복 단위 및 화학식 (b1) 및 (b3)의 반복 단위의 하나 이상의 유형을 포함하지만, 화학식 (a2), (b2) 또는 (b4)의 반복 단위는 포함하지 않는다. 더욱 이해될 것인 바와 같이, 3 원자가를 갖는 화학식 (a2), (b2) 또는 (b4)의 반복 단위의 존재는 공중합체 구조 내 분지점을 제공한다. 따라서, 분지된 공중합체는 화학식 (a2), (b2) 및 (b4)의 반복 단위의 하나 이상의 유형을 포함하고, 화학식 (a1), (b1) 및 (b3)의 반복 단위의 하나 이상의 유형을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 공중합체는 상기에 정의된 화학식 (a1) 및 (a2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수의 반복 단위 (a), 및 상기에 정의된 화학식 (b1) 내지 (b4)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수의 반복 단위 (b)를 포함한다. 상기에 정의된 화학식 (a1) 및 (a2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택되는 복수의 반복 단위들 (a) 및 상기에 정의된 화학식 (b1) 및 (b2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수의 반복 단위 (b)를 포함하는 공중합체가 바람직하다.
본 발명에 따른 공중합체는 반복 단위 (a2), (b2) 및 (b4)로부터 선택된 하나 이상의 반복 단위를 포함하고, 선택적으로 화학식 (a1), (b1) 및 (b3)의 반복 단위의 하나 이상을 추가로 포함하는 분지된 공중합체, 및 특히 화학식 (a2)의 반복 단위와, 화학식 (b2) 및 (b4)의 반복 단위의 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 화학식 (a1), (b1) 및 (b3)의 반복 단위의 하나 이상을 추가로 포함하는 공중합체인 것이 또한 바람직하다. 상기와 부합하여, 더 바람직한 공중합체는 따라서 화학식 (a2)의 반복 단위 및 화학식 (b2)의 반복 단위를 포함하고, 선택적으로 화학식 (a1) 및 (b1)의 반복 단위의 하나 이상의 유형을 추가로 포함하는 분지된 공중합체이다.
본 발명에 따른 공중합체에 있어서, 반복 단위 (a) 및 반복 단위 (b)의 총 개수는 전형적으로 20개 이상, 바람직하게는 50개 이상 및 더욱 바람직하게는 100개 이상이다. 전형적으로, 반복 단위 (a) 및 반복 단위 (b)의 총 개수는 10,000개 이하, 바람직하게는 5,000개 이하, 더욱 바람직하게는 1,000개 이하이다.
나아가, 반복 단위 (a) 및 (b)가 공중합체 내 전체 반복 단위의 80 mol% 이상, 더욱 바람직하게는 90 mol% 이상을 차지하는 것이 본 발명에 따른 공중합체의 경우에 바람직하다. (a1) 및 (a2)로부터 선택된 반복 단위 (a)와, (b1) 및 (b2)로부터 선택된 반복 단위 (b)가 공중합체 내 전체 반복 단위의 80 mol% 이상, 더욱 바람직하게는 90 mol% 이상을 차지하는 공중합체가 더욱 바람직하다. 공중합체 내 반복 단위의 전부가 반복 단위 (a) 또는 (b)이고, 특히 공중합체 내 반복 단위의 전부가 (a1) 및 (a2)로부터 선택된 반복 단위 (a) 또는 (b1) 및 (b2)로부터 선택된 반복 단위 (b)인 것이 가장 바람직하다.
예컨대, 선형 폴리(에틸렌 옥사이드) 표준품에 비해 크기 배제 크로마토그래피를 통해 측정되는 바와 같은, 본 발명에 따른 공중합체의 중량 평균 분자량은 일반적으로 1,000 내지 500,000 Da, 바람직하게는 2,500 내지 250,000 Da 및 더욱 바람직하게는 5,000 내지 50,000 미만의 범위이다.
본 발명에 따른 공중합체의 말단기는 전형적으로 하기 화학식 (c1) 내지 (c3)의 그룹으로부터, 바람직하게는 하기 화학식 (c1) 및 (c2)의 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 유형의 기 (c)를 포함한다:
바람직하게는, 공중합체 내 말단기는 하기 화학식 (c1) 내지 (c3)의 그룹, 바람직하게는 화학식 (c1) 및 (c2)의 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 유형의 기 (c)로 이루어진다. 당업자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 말단기의 개수는 본 발명에 따른 공중합체의 구조에 좌우된다. 선형 공중합체가 단지 2개의 말단을 갖는 반면, 더 큰 수의 말단 기가 분지된, 특히 수지상 공중합체에 포함된다. 더욱 이해될 것인 바와 같이, 공중합체 내에 포함된 말단기 (c)의 하나 이상의 질소 원자는 또한 양이온성 공중합체를 제공하도록 양성자화될 수 있다.
본 발명에 따른 공중합체에서, 반복 단위 (b)의 합에 대한 반복 단위 (a)의 합의 몰비는 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내, 및 바람직하게는 0.8/1.0 내지 1.0/0.8의 범위 내에 속한다. 이 몰비는, 예컨대, NMR을 통해 결정될 수 있다. 따라서 비는 일반적으로 본 발명에 따른 공중합체의 복수의 거대분자에 대해 결정되고, 전형적으로 복수의 거대분자 내 반복 단위 (b)의 합에 대한 반복 단위 (a)의 합의 전체 비를 나타내는 것으로 이해될 것이다.
상기에 지시된 바와 같이, 본 발명에 따른 공중합체의 하나 이상의 질소 원자는 양성자화되어 양이온성 형태, 전형적으로 올리고양이온성 또는 폴리양이온성 형태의 공중합체를 초래할 수 있다. 반복 단위 (a) 또는 (b) 내 또는 말단기 (c) 내 일차, 이차, 또는 삼차 아미노기가 물 및 특히 생리학적 유액을 포함하는 수용액 중에서 양성자 수용체 (acceptors)로 작용할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 공중합체는 전형적으로 7.5 미만의 pH에서 수용액 중에 전체적으로 양성 전하를 갖는다. 본원에 언급되는 바와 같이, 수용액은 용매가 50% (vol./vol) 이상, 바람직하게는 80 또는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 100 %의 물을 포함하는 용액이다. 또한, 본 발명에 따른 조성물이, 예컨대, 혈액 및 폐액을 비롯한, 7.5 미만의 pH를 갖는 생리학적 유액과 접촉하는 경우, 이들은 전형적으로 질소 원자가 양성자화되는 반복 단위 (a) 및 (b)를 함유한다. 본 발명에 따른 조성물에 사용된 공중합체의 pKa 값은 자동화 pKa 적정기 (titrator)를 사용하여 산-염기 적정에 의해 결정될 수 있다. 그 후에 소정의 pH 값에서 순 전하를 예컨대, 헨더슨-하셀바흐 방정식 (Henderson-Hasselbach equation)으로부터 계산할 수 있다. 임의의 전하는 몇몇의 염기성 중심에 걸쳐서 공유될 수 있으며 반드시 단일 지점으로 귀속될 수 있는 것은 아니다. 전형적으로, 생리학적 pH의 용액 중에서, 본 발명에 따른 조성물에 사용된 공중합체는 양성자화된 상태에서 아미노기를 갖는 반복 단위 및 비양성자화된 상태에서 아미노기를 갖는 반복 단위를 포함한다.
그러나, 당업자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 본 발명에 따른 공중합체뿐만 아니라 본 발명에 따른 조성물은 또한 양이온성 형태로 공중합체를 함유하는 건식 염 형태로서 제공될 수 있다.
더욱 이해될 것인 바와 같이, 공중합체 및 핵산, 특히 RNA, 바람직하게는 mRNA와 같은 단일-가닥 RNA를 포함하는 본 발명에 따른 조성물에서 양성자화된 아미노기의 양성 전하에 대한 반대 이온(counterion) (음이온)은 전형적으로 핵산에 함유된 음이온성 모이어티에 의해 제공된다. 만약 양성적으로 하전된 기가 핵산 내 음이온성 모이어티에 비해 과량으로 존재한다면, 양성 전하는 다른 음이온, 특히 생리학적 유액에서 전형적으로 접하게 되는 것들, 예컨대 Cl- 또는 HCO3 -에 의해 균형이 잡힐 수 있다.
상기와 부합하여, 본 발명에 따른 바람직한 공중합체는 램덤 공중합체이고, 여기서 전체 반복 단위의 80 mol% 이상, 더욱 바람직하게는 전체 반복 단위가 하기에 의해 형성되고:
하기 화학식 (a1) 및 (a2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택된 복수의 반복 단위 (a):
및
하기 화학식 (b1) 및 (b2)의 반복 단위로부터 독립적으로 선택되는 복수의 반복 단위 (b):
여기서 반복 단위 (b)의 합에 대한 반복 단위 (a)의 합의 몰비가 0.7/1.0 내지 1.0/0.7의 범위 내, 더욱 바람직하게는 0.8/1.0 내지 1.0/0.8의 범위 내에 속하고;
공중합체의 말단기가 하기에 의해 형성되며:
화학식 (c1) 및 (c2)의 그룹으로부터 독립적으로 선택된 기 (c):
및
여기서 공중합체에 함유된 반복 단위 (a) 및/또는 (b) 및/또는 말단기 (c)의 하나 이상의 질소 원자는 양이온성 공중합체를 제공하도록 양성자화될 수 있다. 공중합체는 선택적으로 단위 (a1) 및/또는 (b1)와 함께, 단위 (a2) 및 (b2)를 포함하는, 분지된 공중합체인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 공중합체는 분지된 또는 선형 폴리에틸렌이민 (PEI)과 같은 폴리알킬렌이민의 제조를 위해 공지된 것들과 유사한 과정을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 공중합체의 생산에 사용되는 단량체가 적절히 조정되어야 할 것임이 이해될 것이다. 본 발명의 맥락에서, 단량체는 정량적 방식으로 편리하게 반응될 수 있고, 그로써 공중합체 내 단위 (a) 및 (b)의 비가 중합화에 적용되는 단량체 혼합물 내 단량체 비를 적절히 조정함으로써 조정될 수 있음이 발견되었다. 폴리에틸렌이민이, 예컨대 아지리딘의 고리-개환 (ring-opening) 중합화를 통해 제조될 수 있는 반면, 본 발명에 따른 공중합체는 아지리딘, 아제티딘 및, 적용 가능한 경우 피롤리딘, 또는 바람직한 실시양태에서, 아지리딘 및 아제티딘을 포함하거나 이로 이루어진 단량체 혼합물의 고리 개환 중합화를 통해 제조될 수 있다. 표현 "적용 가능한 경우"는 피롤리딘에 의해 형성될 것인 반복 단위 (b3) 및 (b4) 또는 말단기 (c3)의 존재 또는 부재를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 비-치환된 시클릭 아민의 고리 개환 중합화는 일반적으로 분지된 공중합체를 초래한다. 본 발명에 따른 선형 공중합체는, 예컨대, 적합한 N-치환된 아지리딘, N-치환된 아제티딘 및 N-치환된 피롤리딘, 또는 N-치환된 아지리딘 및 N-치환된 아제티딘의 중합화를 통해 제조될 수 있고, 이는 예컨대, 문헌 [Katrien F. Weyts, Eric J. Goethals, New synthesis of linear polyethyleneimine, Polymer Bulletin, January 1988, Volume 19, Issue 1, pp 13-19]에 공개된 과정과 유사하게 결과의 폴리알킬렌이민 쇄에 부착된 N-치환체의 가수분해 절단에 의해 수반될 수 있다.
덴드리머 (또는 수지상 공중합체)의 제조를 위해, 폴리에틸렌이민 또는 폴리프로필렌아민 덴드리머의 생산에 대해 공지된 합성 전략이 유리하게 적용될 수 있다. 폴리프로필렌이민 덴드리머는 일차 아민에 대한 반복 순서의 마이클 부가 (Michael addition)를 사용하여 아크릴로니트릴 빌딩 블록으로부터 합성될 수 있고, 이어서 폴리(아미도아민), 폴리프로필렌이민, 및 상이한 1→2 분지 모티프를 보유하는 관련 덴드리머 및 덴드론의 불균질 촉매화 수소화 (Newkome and Shreiner)가 수반된다: An overview of the divergent procedures (Polymer 49 (2008) 1-173; De Brabander-Van Den Berg et al. Large-scale production of polypropylenimine dendrimers, Macromolecular Symposia (1994) 77 (1) 51-62). 폴리에틸렌이민 덴드리머는 일차 아민에 대한 비닐 브로마이드 빌딩 블록의 반복 순서의 마이클 부가에 이어서 가브리엘 (Gabriel) 아민 합성 방법을 이용한 알킬브로마이드의 아민으로의 전환에 의해 생산될 수 있다 (Yemul & Imae, Synthesis and characterization of poly(ethyleneimine) dendrimers, Colloid Polym Sci (2008) 286: 747-752). 따라서, 당해 분야의 숙련자는 생산될 수 있는, 예컨대, 프로필렌이민 및 에틸렌이민의 정확히 교대하는 층들의 덴드리머를 또한 생산할 수 있다. 유사하게, 화학식 (a2), (b2) 및 (b4)의 반복 단위 및 바람직하게는 반복 단위 (a2) 및 (b2)의 무작위 조성을 포함하거나 이로 이루어진 층을 갖는 덴드리머 생성이 이루어질 수 있다.
아지리딘 및 아제티딘, 또는 아지리딘, 아제티딘 및 피롤리딘의 고리 개환 중합화가 용액, 예컨대 물 중에서 수행될 수 있다. 총 단량체 농도는 10% wt/wt 내지 80% wt/wt, 바람직하게는 30% wt/wt 내지 60% wt/wt의 전형적인 농도 범위로 특별히 제한되지 않는다. 전형적으로, 중합화는 양성자에 의해 개시되고, 그로써 브렌스퇴드 (Brønsted) 산, 특히 황산과 같은 무기산을 반응계에 첨가하는 것이 바람직하다. 단량체의 총 농도를 기준으로 0.001 내지 0.01 당량과 같은, 소량의 산이 일반적으로 충분하다. 반응은 예컨대, 50 내지 150℃, 특히 90 내지 140℃의 온도 범위에서 용이한 비율로 진행된다. 이들 범위에서, 더 높은 분자량의 공중합체는 일반적으로 더 높은 온도에서이고, 더 낮은 분자량의 공중합체는 더 낮은 온도에서이다.
원칙적으로, 리피도이드가 특히 올리고머 및, 더욱 구체적으로, 중합체에 비해 본 발명에 따라 이용되는 바람직한 제제 또는 시약이다.
표적 세포 또는 표적 조직 내로 RNA를 전달 및/또는 도입하기 위한 하나 이상의 제제 또는 하나 이상의 시약의 추가의 예시가 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 리포좀 형질감염 시약 (LTR'S) 및 자성 입자 (MPs)이다.
표적 세포 또는 표적 조직 내로 RNA를 전달 및/또는 도입하는 하나의 특정한 방식이 형질감염이다. 따라서, 일 측면에서, 이용되는 RNA는 ((표적) 세포 또는 조직 내로) 형질감염되고, 형질감염을 통해 전달/투여되고/되거나, 형질감염을 위해 준비되는 것으로 고려된다. RNA의 형질감염을 위한 수단 및 방법이 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Tavernier (상기 인용문 중), Yamamoto (Eur J Pharm Biopharm. 71(3) (2009), 484-9) 및 Kormann (Nat Biotechnol. 29(2) (2011), 154-7)에 기술되어 있다.
형질감염의 특정한 방식이 리포펙션, 마그네토펙션 또는 마그네토리포펙션이다. 본 발명의 맥락에서 이들 종류의 형질감염으로 우수한 결과가 달성된 바 있다. 마그네토펙션을 이용한 결과가 특히 우수하였고, 마그네토리포펙션을 이용한 결과는 현저히 우수하였다.
따라서, 일 측면에서, 이용되는 RNA는 리포펙션을 위해 제조되고, 리포펙션에 의해 형질감염되도록 제조되고, 리포펙션을 통해 전달/도입되고/되거나 리포펙션을 통해 투여될 수 있다.
이 측면에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 적어도 하나의 지질 또는 리포좀 형질감염 시약 또는 인핸서 (LTR; 리포좀 형질감염 시약)를 (추가로) 포함할 수 있다. 이용되는 RNA는 LTR 내에 포함되고, 그와 복합체화되고/되거나 그에 의해 전달될 수 있다. 구체적으로, 이용되는 RNA는 RNA 및 LTR을 포함하는 (각각의) 리포펙션 복합체 내에 포함되고/되거나 그에 의해 전달될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 리포펙션 복합체를 (추가로) 포함할 수 있다.
LTRs은 당해 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, OzBiosciences (Marseille, France)에 의해 판매되고 있다. 본 발명에 따라 이용되는 LTRs은 표적 세포 또는 표적 조직 내로 RNA를 전달 및/또는 도입하기 위해 상기에 기술된 제제 또는 시약으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 이러한 LTRs은 지질 또는 리피도이드, 바람직하게는 양이온성 지질 또는 양이온성 리피도이드, 예컨대 PCT/EP2014/063756에 기술된 바와 같은 리피도이드 (예컨대, C12-(2-3-2), EP2285772에 기술된 지질 (예컨대, Dogtor) 및 EP1003711에 기술된 바와 같은 리포폴리아민 (예컨대, DreamFectTM 및 DreamFect GoldTM)일 수 있다. 특정한 LTR이 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
(i) C12-(2-3-2);
(ii) DreamFectTM, 바람직하게는 DreamFect GoldTM (DFTM/DF-GoldTM; OzBiosciences, Marseille, France);
(iii) Dogtor (OzBiosciences, Marseille, France); 및
(iv) 예를 들어, 리포펙타민 2000 (Invitrogene, CA, USA)과 같은 리포펙타민.
원칙적으로, Dogtor이 바람직하고, DreamFectTM가 더욱 바람직하고 DF-GoldTM 및 C12-(2-3-2)이 더 더욱 바람직한 LTR이다.
Dogtor와 같은 LTRs은, 예를 들어, EP2285772에 기술되어 있다. DFTM 또는 DF-GoldTM와 같은 LTRs, 예를 들어, EP1003711에 기술되어 있다. 원칙적으로, PCT/EP2014/063756에 기술된 바와 같은 올리고머, 중합체 또는 리피도이드, EP2285772에 기술된 바와 같은 특정 양이온성 지질 및 EP1003711에 기술된 바와 같은 특정한 리포폴리아민이 본 발명에 따른 바람직한 LTR이다. C12-(2-3-2) 및 DF-GoldTM와 같은 LTR이 가장 바람직하다.
리포펙션 복합체의 비-제한적인 예시는 DF-GoldTM/RNA 리포플렉스 및 C12-(2-3-2)/RNA 리포플렉스이다.
표적 세포 또는 표적 조직 내로 RNA를 전달 및/또는 도입하기 위해 본원에 기술된 제제 및 시약 및 본원에 기술된 LTRs은 하나 이상의 (예컨대, 2개, 3개 또는 4개) 추가의 지질 (예컨대, 예를 들어, 콜레스테롤, DOPE 및/또는 PEG-지질 (예컨대, DMPE-PEG))과 조합될 수 있다. 이들 추가의 지질은 제제/시약 및 LTRs의 바람직한 기능 (각각 세포 또는 조직 내로 RNA의 전달 및/또는 도입을 지지하고/하거나 증가시키고 형질감염 효율을 개선함)을 지지하고 각각의 "헬퍼 지질 (helper lipids)"로서 기능할 수 있다. 이러한 "헬퍼 지질"의 특정 예시는 콜레스테롤, DPPC, DOPE 및/또는 PEG-지질 (예컨대, DMPE-PEG, DMG-PEG (예컨대, DMG-PEG2k))이다. 추가의 지질 (예컨대, "헬퍼 지질")이 또한 본원에 기술된 복합체/입자의 부분일 수 있다. 당업자는 본 발명에 따른 복합체/입자를 제조하는데 용이한 입장에 있다. 추가의 지질 (예컨대, "헬퍼 지질")의 예시가 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 당업자는 적합한 추가의 지질 (예컨대, "헬퍼 지질") 및 제제/시약/LTRs 및 추가의 지질 (예컨대, "헬퍼 지질")의 비를 선택하는데 용이한 입장에 있다. 이러한 비는 제제/시약/LTRs : 추가의 지질의 1-4 : 1-5, 3-4 : 4-6, 약 4 : 약 5, 약 4 : 약 5.3의 몰비 (더 좁은 범위가 바람직함)일 수 있다. 예를 들어, 제제/시약//LTRs은 콜레스테롤, DOPE 및 DMPE-PEG와 같은 3종의 추가의 지질과 각각 8 : 5.3 : 4.4 : 0.9, 또는 더욱 구체적으로는, 각각 8 : 5.29 : 4.41 : 0.88의 몰비로 조합될 수 있다.
다른 측면에서, 이용되는 RNA는 마그네토펙션을 위해 제조되고, 마그네토펙션에 의해 형질감염되도록 제조되고, 마그네토펙션을 통해 전달/도입되고/되거나 마그네토펙션을 통해 투여될 수 있다. 마그네토펙션의 원리는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, WO 02/00870에 기술되어 있다.
이 측면에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 적어도 한 종류의 자성 입자 (MPs), 특히 적어도 한 종류의 자성 나노입자 (mnp)를 (추가로) 포함할 수 있다. 이용되는 RNA는 MP 내에 포함되고, 그와 복합체화되고/되거나 그에 의해 전달될 수 있다. 구체적으로, 이용되는 RNA는 RNA 및 MP를 포함하는 (각각의) 마그네토펙션 복합체 내에 포함되고/되거나 그에 의해 전달될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 마그네토펙션 복합체를 (추가로) 포함할 수 있다.
이용되는 MPs (또는 mnp)는 코어-쉘 (core-shell) MPs, 산화철 실리카 MPs, 및/또는 (분지된) PEI-가식된 (decorated) MPs일 수 있다. 특정 MPs (또는 mnp)는 SO-Mag6-115 MPs (또는 mnp)로도 또한 언급되는, SiOx/포스포네이트-PEI 코팅을 갖는 MPs (또는 mnp)일 수 있다. MPs (또는 mnp)는 첨부의 실시예에 따라서, 그리고, 예를 들어, Mykhaylyk (Liposomal magnetofection. In: Weissig V (ed) Liposomes, Methods in Molecular Biology, vol. 605. Humana Press-Springer, New York 2010, 487-525; Pharm Res 29(5), 2012, 1344-1365)에 따라서 생산될 수 있다.
마그네토펙션 복합체의 하나의 비-제한적인 예시는 SO-Mag6-115 MPs (또는 mnp)/RNA 마그네토펙션 복합체이다. 추가의 MP (또는 mnp), 및 각각의 마그네토펙션 복합체가 또한 WO 02/00870에 기술되어 있다.
더욱 특정한 측면에서, 마그네토펙션 복합체는 제3의 성분을 포함할 수 있고, 따라서 자성 트리플렉스의 형태일 수 있다. 제3의 성분은 (예를 들어, 상기에서 본원에 기술된 바와 같은) LTR일 수 있다. 자성 트리플렉스는 그 후에 마그네토리포펙션 복합체로 명명될 수 있고, 예를 들어, 상기에서 본원에 정의된 바와 같은 마그네토리포펙션 복합체일 수 있다.
또 다른, 더욱 특정한 측면에서, 이용되는 RNA는 마그네토리포펙션을 위해 제조되고, 마그네토리포펙션에 의해 형질감염되도록 제조되고, 마그네토리포펙션을 통해 전달/도입되고/되거나 마그네토리포펙션을 통해 투여될 수 있다.
원칙적으로, 마그네토리포펙션은 리포펙션과 마그네토펙션, 특히 두 형질감염 접근법의 이점을 조합한다. 따라서, 원칙적으로, 리포펙션 및 마그네토펙션에 대해 상기 본원에서 언급되었던 것들이 또한, 필요한 변경을 가하여, 마그네토리포펙션에 적용된다.
마그네토리포펙션의 측면에 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 적어도 한 종류의 마그네토리포펙션 복합체 (또한, 자성 리포플렉스로도 불림)을 (추가로) 포함할 수 있다. 이용되는 RNA는 이러한 복합체 내에 포함되고, 이와 함께 복합체화되고/되거나 이에 위해 전달될 수 있다. 마그네토리포펙션 복합체는 자성 트리플렉스일 수 있고, 예를 들어, RNA, 적어도 한 종류의 MP (상기 본원에 정의된 바와 같음) 및 적어도 한 종류의 LTR (상기 본원에 정의된 바와 같음)을 포함할 수 있다.
마그네토리포펙션 복합체의 하나의 비-제한적인 예시는 SO-Mag6-115 MPs (또는 mnp)/DF-Gold/RNA 마그네토리포펙션 복합체이다.
원칙적으로, 본 발명에 따라 이용되는 형질감염 복합체의 성분들 (예컨대, RNA, LTRs, MPs) 사이의 적합한 비는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 각각의 지침이, 예를 들어, Kormann (상기 인용문 중), Mays (상기 인용문 중), WO 02/00870 및 첨부의 실시예에 제공된다.
그러나, 언급된 바와 같이, 특정한 비가 특별히 유용함이, 예컨대, 고도로 효과적 및/또는 효율적인 형질감염을 초래하는 것이 본 발명의 맥락에서 확인되었다.
이러한 특정한 비는 RNA의 μg당 대략 1 내지 40 μg, 5 내지 35 μg, 10 내지 30 μg, 15 내지 25 μg, 17 내지 23 μg, 18 내지 22 μg, 19 내지 21 μg, 1 내지 20 μg, 2 내지 20 μg, 3 내지 20 μg, 1 내지 15 μg, 2 내지 15 μg, 3 내지 15 μg, 1 내지 10 μg, 2 내지 10 μg, 3 내지 10 μg, 4 내지 10 μg, 5 내지 10 μg, 4 내지 12 μg, 5 내지 11 μg, 6 내지 10 μg 또는 7 내지 9 μg의 LTR 범위인 RNA에 대한 LTR의 w/w 비이다. 유사하게, 특히 LTR이 (예컨대, 첨부의 실시예에서와 같이) LTR 용액으로 제조되는 경우, 이러한 비는 RNA의 μg당 0.5 내지 15 μl, 0.5 내지 10 μl, 0.5 내지 8 μl, 1 내지 15 μl, 1 내지 10 μl, 1 내지 8 μl, 1 내지 6 μl, 1.5 내지 5.5 μl, 2 내지 5 μl, 3 내지 4 μl, 1 내지 3 μl, 4 내지 6 μl, 1.5 내지 2.5 μl, 4.5 내지 5.5 μl, 1.7 내지 2.3 μl 또는 4.7 내지 5.3 μl의 LTR 용액 범위인 RNA에 대한 LTR 용액의 v/w 비이다. 원칙적으로, 더 좁은 범위가 바람직하다. 이 맥락에서, 바람직한 LTR은 DreamFectTM이거나, 또는, 더욱 바람직하게는 DF-GoldTM 또는 C12-(2-3-2)이다. 바람직한 RNA는 BMP-7 RNA이거나, 또는 더욱 바람직하게는 BMP-2 RNA이다.
RNA에 대한 LTR의 다른 특정한 비는 약 4 내지 12, 바람직하게는 약 6 내지 10, 바람직하게는 약 9 내지 11 및 더욱 바람직하게는 약 8의 N/P 비이고, 여기서 N/P는 RNA의 포스페이트기에 대한 LTR의 아미노기의 몰비를 나타낸다.
구체적으로, 지방-유래 중간엽 줄기세포 (AMSC)와 같은 세포가 형질감염되는 경우, 이러한 특정한 비는 RNA의 μg당 대략 5 내지 35 μg, 10 내지 30 μg, 15 내지 25 μg, 17 내지 23 μg, 18 내지 22 μg 또는 19 내지 21 μg의 LTR 범위인 RNA에 대한 LTR의 w/w 비이다. 유사하게, LTR이 (예컨대, 첨부의 실시예에서와 같이) LTR 용액으로 제조되는 경우, 이러한 특정한 비는 RNA의 μg당 4 내지 6 μl, 4.5 내지 5.5 μl 또는 4.7 내지 5.3 μl의 LTR 용액 범위인 RNA에 대한 LTR 용액의 v/w 비이다. 원칙적으로, 더 좁은 범위가 바람직하다. (AMSC의 고도로 효과적이고 효율적인 형질감염을 초래하는) 가장 바람직한 비는 RNA의 μg당 약 20 μg의 LTR인 RNA에 대한 LTR의 w/w 비 및/또는 RNA의 μg당 약 5 μl의 LTR 용액인 RNA에 대한 LTR 용액의 v/w 비이다. 바람직한 LTR 및/또는 RNA와 관련하여 상기에 언급된 것들이 또한, 필요한 변경을 가하여, 여기에 적용된다.
구체적으로, 골수-유래 MSC (BMSC)와 같은 세포가 형질감염되는 경우, 이러한 특정한 비는 RNA의 μg당 대략 4 내지 12 μg, 5 내지 11 μg, 6 내지 10 μg 또는 7 내지 9 μg의 LTR 범위인 RNA에 대한 LTR의 w/w 비이다. 유사하게, 특히, LTR이 (예컨대, 첨부의 실시예에서와 같이) LTR 용액으로 제조되는 경우, 이러한 특정한 비는 RNA의 μg당 1 내지 3 μl, 1.5 내지 2.5 μl 또는 1.7 내지 2.3 μl의 LTR 용액 범위인 RNA에 대한 LTR 용액의 v/w 비이다. 원칙적으로, 더 좁은 범위가 바람직하다. (BMSC의 고도로 효과적이고 효율적인 형질감염을 초래하는) 가장 바람직한 범위는 RNA의 μg당 약 8 μg의 LTR인 RNA에 대한 LTR의 w/w 비 및/또는 RNA의 μg당 약 2 μl의 LTR 용액인 RNA에 대한 LTR 용액의 v/w 비이다. 바람직한 LTR 및/또는 RNA와 관련하여 상기에 언급된 것들이 또한, 필요한 변경을 가하여, 여기에 적용된다.
또한, 이러한 특정한 비는 RNA의 μg당 0.05 내지 5 μg, 0.05 내지 3 μg, 0.05 내지 1 μg, 0.07 내지 5 μg, 0.1 내지 5 μg, 0.1 내지 1 μg, 0.2 내지 0.8 μg, 0.3 내지 0.7 μg 또는 0.4 내지 0.6 μg (철 중량)의 MPs 범위인 RNA에 대한 MPs의 철 w/w 비이다. 원칙적으로, 더 좁은 범위가 바람직하다. 가장 바람직한 비는 RNA의 μg당 약 0.5 μg의 MPs인 RNA에 대한 MPs의 철 w/w 비이다. 이 맥락에서, 바람직한 MPs는 SO-Mag6-115 MPs (또는, 더욱 바람직하게는, mnp)이다. 바람직한 RNA는 BMP-7이고, 또는 더욱 바람직하게는 BMP-2 RNA이다.
또한, 이러한 특정한 비는 LTR의 약 12 내지 20 μg당 (바람직하게는 약 16 μg당) 대략 0.05 내지 5 μg, 0.05 내지 3 μg, 0.05 내지 1 μg, 0.07 내지 5 μg, 0.1 내지 5 μg, 0.1 내지 1 μg, 0.2 내지 0.8 μg, 0.3 내지 0.7 μg 또는 0.4 내지 0.6 μg (철 중량)의 MPs 범위인 LTR에 대한 MPs의 철 w/w/ 비이다. 유사하게, 특히 LTR이 (예컨대, 첨부의 실시예에서와 같이) LTR 용액으로 제조되는 경우, 이러한 비는 LTR 용액의 4 μl당 0.05 내지 5 μg, 0.05 내지 3 μg, 0.05 내지 1 μg, 0.07 내지 5 μg, 0.1 내지 5 μg, 0.1 내지 1 μg, 0.2 내지 0.8 μg, 0.3 내지 0.7 μg 또는 0.4 내지 0.6 μg (철 중량)의 MPs 범위인 LTR 용액에 대한 MPs의 철 v/w 비이다. 원칙적으로, 더 좁은 범위가 바람직하다. 가장 바람직한 비는 LTR의 약 12 내지 20 μg당 (바람직하게는 약 16 μg당) 약 0.5 μg의 MPs인 LTR에 대한 MPs의 철 w/w 비 및/또는 LTR 용액의 4 μl당 약 0.5 μg의 MPs인 LTR 용액에 대한 MPs의 철 v/w 비이다. 이 맥락에서, 바람직한 MPs는 SO-Mag6-115 MPs (또는 더욱 바람직하게는 mnp)이다. 바람직한 LTR은 DreamFectTM 또는, 더욱 바람직하게는, DF-GoldTM C12-(2-3-2)이다.
또한, 이러한 특정한 비는 0.05 내지 5 μg, 0.05 내지 3 μg, 0.05 내지 1 μg, 0.07 내지 5 μg, 0.1 내지 5 μg, 0.1 내지 1 μg, 0.2 내지 0.8 μg, 0.3 내지 0.7 μg or 0.4 내지 0.6 μg (철 중량)의 MPs : 1 내지 40 μg, 5 내지 35 μg, 10 내지 30 μg, 15 내지 25 μg, 17 내지 23 μg, 18 내지 22 μg, 19 내지 21 μg, 1 내지 20 μg, 2 내지 20 μg, 3 내지 20 μg, 1 내지 15 μg, 2 내지 15 μg, 3 내지 15 μg, 1 내지 10 μg, 2 내지 10 μg, 3 내지 10 μg, 4 내지 10 μg, 5 내지 10 μg, 4 내지 12 μg, 5 내지 11 μg, 6 내지 10 μg 또는 7 내지 9 μg의 LTR: 0.1 내지 10 μg, 0.1 내지 7 μg, 0.1 내지 4 μg, 0.4 내지 10 μg, 0.7 내지 10 μg, 0.7 내지 4 μg, 0.8 내지 3 μg, 0.9 내지 2 μg, 0.5 내지 1.5 μg 또는 0.7 내지 1.3 μg의 RNA 범위인 MPs 대 LTR 대 RNA의 철 w/w/w 비이다. 유사하게, 특히 LTR이 (예컨대, 첨부의 실시예서와 같이) LTR 용액으로 제조되는 경우, 이러한 비는 0.05 내지 5 μg, 0.05 내지 3 μg, 0.05 내지 1 μg, 0.07 내지 5 μg, 0.1 내지 5 μg, 0.1 내지 1 μg, 0.2 내지 0.8 μg, 0.3 내지 0.7 μg 또는 0.4 내지 0.6 μg (철 중량)의 MPs : 0.4 내지 40 μl, 0.4 내지 20 μl, 0.4 내지 10 μl, 0.8 내지 40 μl, 2 내지 40 μl, 2 내지 10 μl, 2 내지 8 μl, 2 내지 6 μl, 또는 3 내지 5 μl의 LTR 용액 : 0.1 내지 10 μg, 0.1 내지 7 μg, 0.1 내지 4 μg, 0.4 내지 10 μg, 0.7 내지 10 μg, 0.7 내지 4 μg, 0.8 내지 3 μg, 0.9 내지 2 μg, 0.5 내지 1.5 μg 또는 0.7 내지 1.3 μg의 RNA 범위인 MPs 대 LTR 용액 대 RNA의 철 w/v/w 비이다. 원칙적으로, 더 좁은 범위가 바람직하다. 가장 바람직한 범위는 약 0.5 μg의 MPs : 약 12 내지 20 μg (바람직하게는 약 16 μg당)의 LTR : 약 1 μg의 RNA인 MPs 대 LTR 대 RNA의 철 w/w/w 비 및/또는 약 0.5 μg의 MPs : 약 4 μl의 LTR 용액 : 약 1 μg의 RNA인 MPs 대 LTR 용액 대 RNA의 철 w/w/w 비이다. 바람직한 LTR, RNA 및/또는 MPs와 관련하여 상기에 언급된 것들이 또한, 필요한 변경을 가하여. 여기에 적용된다.
본 발명에 따라 이용되는 LTR 용액의 농도는 μl당 약 0.1 내지 10, 0.5 내지 8, 1 내지 7, 2 내지 6, 3 내지 5 또는 1 내지 2 μg의 LTR (더 좁은 범위가 바람직함)의 범위일 수 있다. 특정 농도의 비-제한적인 예시는 μl당 약 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 μg의 LTR이다. μl당 2 또는 4 μg의 LTR이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서 이용되는 복합체의 형성은, 예를 들어, 약 50 μg/ml 내지 약 350 μg/ml, 바람직하게는 약 100 μg/ml 내지 약 300 μg/ml, 더욱 바람직하게는 약 150 μg/ml 내지 약 250 μg/ml 및 가장 바람직하게는 약 200 μg/ml의 RNA 농도에서 일어날 수 있다.
RNA에 의해 인코딩되는 단백질의 안정하고 적당한 발현을 달성하기 위하여, 충분한 RNA가 목적하는 세포에 도달하는 것이 중요하다. 이는, 그로써 형질감염의 효율이, 표지된 RNA의 투여 후, 세포에 도달한 RNA의 함량을 표지의 측정에 의해 결정하는 것으로 결정될 수 있다. 표지의 측정을 위해 유세포분석이 사용될 수 있다. 표지가 형광 분자로 효력이 나타나는 경우, 형질감염 효율은, 예를 들어, 형광 강도가 PBS로만 처리되었던 대조군 세포에 비해 더 높은 세포 집단의 비율로서 계산될 수 있다. 본 발명에 따라 이용되는 RNA는 효과적으로 생산될 수 있고 형질감염 효율은 높다.
번역 효율은 그에 의해 RNA가 단백질로 번역되는 효율을 나타낸다. 번역 효율이 더 높을수록, 치료에 사용되어야 하는 RNA의 용량을 더 낮출 수 있다. 번역 효율은 이용된 RNA에 대한 번역의 비율을 대조군 RNA에 대한 번역 비와 비교함으로써 결정될 수 있다. 원칙적으로, 이용되는 RNA를 이용한 번역 효율은 다소 낮을 수 있다. 그러나, 이는 단백질 발현의 지속기간에 나타나는 더 높은 안정성에 의해 그 이상으로 보완될 수 있다.
원칙적으로, 본 발명의 활성 화합물/약제학적 조성물의 투여 용법 (dosage regimen)은, 예를 들어 임상적 요인을 토대로 주치의에 의해 결정될 수 있다. 의학 분야에 공지된 바와 같이, 임의의 환자 한명에 대한 복용량은 환자의 몸집, 체중, 체표면적, 연령, 투여될 수 있는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 전반적인 건강상태, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯한 다수의 요인에 좌우된다. 그러나, 당업자/주치의는 예컨대, 시험관 내 또는 생체 외에서 (이론적으로) 효과적인 농도 및/또는 복용량을 감소시키는데 용이한 입장에 있다. 상응하는 샘플을 (예컨대, 적합한 프로브에 의해) 예를 들어, 뼈로부터 취할 수 있고 활성 화합물 (bmp 및/또는 적합한 마커)을 검출할 수 있으며, 이들의 상응하는 농도를 예를 들어 HPLC에 의해 상기 샘플에서 결정할 수 있다.
활성 화합물 농도의 결정은 실험실 동물, 비-인간 형질전환 동물 (예컨대, 형질전환 마우스, 래트, 돼지 등)과 같은 동물에서뿐만 아니라 인간 환자, 건강한 (인간) 개인에서 수득될 수 있다. 예컨대, 뼈에서 활성 화합물 농도의 결정은, 예를 들어 (건강한) 지원자에서 추론될 수 있고 (인간) 환자에 대한 상응하는 투여 계획이 확립될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 용량 의존성 (예컨대, 투여된 복용량 대 농도-/뼈의 다양한 부위에서 검출된 복용량)은 당해 분야의 공지된 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 추가의 방법은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 생체 내에서 표지된 펩티드의 검출 (예컨대, 방사능 표지, 형광 표지 등과 같은 상응하는 표지 기법에 의해) 또는 생리학적/생화학적 분석을 포함한다. 따라서, 뼈의 특정 부분에서 활성 화합물의 바람직한 농도를 달성하기 위해 투여되는 활성 화합물의 복용량을 추론할 수 있다. 이러한 농도를 추론하기 위한 이들 및 다른 방법이 또한 당해 분야에 알려져 있다.
구체적으로, 본 발명에 따라 형질감염되는 RNA의 적합한 용량 (예컨대, 세포당 μg RNA)은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 각각의 지침이, 예를 들어, Kormann (상기 인용문 중), Mays (상기 인용문 중), WO 02/00870 및 첨부의 실시예에 제공된다.
각 경우에 사용된 용량은 BMP RNA가 충족시켜야 하는 기능에 좌우될 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 또한 RNA의 작용 지속기간이 의도적으로 조정될 수 있다. 처리 용량 및/또는 지속기간이 또한 특정 징후에 따라 좌우될 수 있다. 예를 들어, RNA가 결핍 BMP 유전자로 인한 골 질환의 만성 요법에 사용되는 경우, 작용의 지속기간은 가능한 오래 유지될 것인 반면, 다른 징후에 대해서는, 적합한 시간대 (time window)로 의도적으로 조정될 수 있다. 따라서 각각의 용량이 설정될 수 있다.
그러나, 언급된 바와 같이, 특히 이들이 매우 효과적이고/이거나 효율적인 형질감염을 초래하므로, 특정 용량이 현저히 유용함이 본 발명의 맥락에서 확인되었다.
형질감염되는 RNA의 이러한 특정 용량은 (형질감염되는) 세포당 0.5 내지 100 pg, 0.5 내지 70 pg, 0.5 내지 40 pg, 5 내지 100 pg, 10 내지 100 pg, 1 내지 50 pg, 5 내지 40 pg, 10 내지 30 또는 15 내지 25 pg RNA의 범위이다. 원칙적으로, 더 좁은 범위가 바람직하다. 가장 바람직한 용량은 (형질감염되는) 세포당 약 20 pg RNA의 용량이다. RNA가 생체 외 또는 시험관 내로 (세포 또는 조직에) 전달되는 경우에 상기 (범위의) 용량이 특히 유용하다.
일 측면에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본원의 다른 곳에서, 그리고 당해 분야에서 "담체"로도 지칭되는, 매트릭스 또는 스캐폴드를 포함한다. 사용되는 RNA가 담체에 첨가되거나 담체 내로/위에 로딩되었던 적이 있는 것이 이 맥락에 따라서 특히 고려된다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 담체 및 이용되는 RNA를 함유하고 마찬가지로 담체에 첨가될 수 있거나 그 내로/위에 로딩되었던 적이 있는 본원에 기술된 바와 같은 복합체의 조합을 포함하는 것으로 고려된다. 다시 말해, RNA가 이 복합체의 형태로 담체 내로/위에 로딩되었거나 담체에 첨가되었던 적이 있는 것으로 고려된다. 본원의 다른 곳에서 복합체 및 RNA와 관련하여 기술된 것들이 또한, 필요한 변경을 가하여, 여기에 적용된다.
본 발명의 맥락에서, 담체는 형질전환/형질감염되는 세포 또는 조직과 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 접촉될 수 있는 몸체 또는 물질이다. 담체는 본 발명에 따라 사용되는 RNA를 운반하고, 선택적으로, 형질전환/형질감염되는 세포와 함께 접종되는 것으로 고려된다. 따라서, RNA가 본원에 기술된 복합체 내에 포함되는 것으로 특히 고려된다. 본 발명에 따라 사용되는 담체는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, WO 01/00708 및 [10-12]에 기술되어 있다. RNA 이외에, 또한, 예컨대, 소분자 및/또는 사이토카인과 같은 화합물이 담체 내로/위에 로딩될 수 있다. 이는, 예를 들어, (담체 내로) 접종되는 세포의 이동을 증강시키고/시키거나 형질감염 효율을 향상시킬 수 있다.
담체는 코히어런트 (coherent) 방식으로 연결된 재료, 즉 고체 물질일 수 있고, 특히 바람직하게는 가소성 또는 변형가능 (deformable) 고체 물질, 예컨대, 겔, 스폰지, 호일, 분말, 과립 또는 밴드 (fascia)일 수 있다. 담체는 생물학적으로 비-흡수성 또는, 생물학적으로 흡수성 재료로 이루어질 수 있다.
담체는 또한 바람직하게는 RNA의 존재하에서 본 발명에 따라 (공)중합체의 교차-결합에 의해 생산된 담체일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 교차-결합된 중합체 내, 화학적으로 비변형되거나 또는 화학적으로 변형된 공지의 유전자 벡터 (노출된) RNA, 리포플렉스, 폴리플렉스 등의 도입 가능성이 존재한다. 이 목적을 위해, 교차-결합이, 예컨대, 수성 또는 유기 용매에서 교차-결합을 유발하는 제제의 첨가에 의해 유전자 벡터, 올리고뉴클레오티드 등의 존재하에서, 인 시츄로 (in situ) 일어난다. 교차-결합 제제의 성질은 공중합체의 구조에 좌우된다. 따라서, 예컨대, 중합체 골격 (예를 들어, WO 01/00708의 도 2에 나타난 바와 같음)은, 예컨대, 시테이닐-시스테인 또는 비-아미노산-유사 디티올과 같은 디티올의 첨가에 의해 교차-결합될 수 있다. 카르복실산을 함유하는 (공)중합체의 교차-결합은 카르복실산의 활성화 도중에 임의의 디아민의 첨가에 의해 일어날 수 있다 (예컨대, 인 시츄에서 활성화된 에스테르에 대한 카르복실산의 반응) (Nathan et al., Macromolecules 25 (1992), 4476-4484). 일차 또는 이차 아민을 갖는 중합체 골격은, 예컨대, 활성화된 디카르복실산의 첨가에 의해 일어날 수 있다. 교차-결합 후, 필름이 형성될 때까지 제조물을 건조시킬 수 있다.
생물학적 비-흡수성 재료의 예시는 실리콘 (예컨대, 카테터용)이다. 그러나, 또한 임플란트로서 신체 내로 도입될 수 있고/있거나, 예컨대 성형 수술에서 이미 사용되고 있는 상이한 생물학적 비-흡수성 재료를 사용할 수 있다. 이의 예시는 PTFE (예컨대, 혈관 교체용), 폴리우레탄 (예컨대, 카테터용), 금속 재료 (예컨대, 의학적 강철, 관내인공삽입물 (endoprostheses)용 티탄 합금; 혈관 지지체 (스텐트)로 사용되는 금속 메쉬)이다.
바람직하게는, 담체는 생물학적 흡수성 재료이다. 이의 예시는 피브린 글루 또는 피브린 클롯 (예를 들어, 트롬빈 또는 피브리노겐으로부터 생산됨), 키틴, 옥시셀룰로스, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜 카보네이트, 예컨대 폴리락트산과 같은 지방족 폴리에스테르, 폴리글리콜산 및 이들로부터 유래된 아미노산 화합물, 예컨대 폴리아미드 및 폴리우레탄 또는 폴리에테르 및 상응하는 혼합 중합물 (polymerisates)이다. 나아가, 임의의 다른 생물학적 흡수성 중합체, 특히 히드로겔에 기초한 소위 자가-경화 (self-curing) 접착제가 담체로 사용될 수 있다. 구체적으로, 신체 내에서 효소적으로 및/또는 가수분해 과정에 의해 분해될 수 있는 임의의 재료가 생물학적 흡수성 재료로서 적합하다. 이의 예시는 또한 생체-흡수성 화학적으로 정의된 칼슘 설페이트, 트리칼슘 포스페이트, 히드록시 아파타이트, 폴리언하이드라이드, 정제된 단백질 또는 부분적으로 정제된 세포외 기질로 만들어진 담체이다. 담체 콜라겐이 특히 바람직하고, 더욱 바람직하게는 Sigma 또는 콜라겐 회사에 의해 공급되는 바와 같은, 연골 및 피부 콜라겐으로부터 생산된 콜라겐 매트릭스이다. 콜라겐 매트릭스의 생산에 대한 예시가, 예컨대, 미국특허 제4,394,370호 및 제4,975,527호에 개시되어 있다. 담체는 피브린일 수 있고, 특히 피브린 클롯일 수 있다.
담체는 콜라겐으로부터인 것이 특히 바람직하고, 콜라겐 스폰지로부터인 것이 더욱 바람직하다. 콜라겐 스폰지는 당해 분야에 알려져 있고 (예컨대, WO 01/00708 및 Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752; Meinel, Biomaterials 27, 2006, 4993-5002; Kempen, Biomaterials 30, 2009, 2816-2825), 예를 들어, Resorba (Nurenburg, Germany)로부터 "KOLLAGEN resorb TM"으로 구입할 수 있다.
일반적으로, 글루코사미노글리칸과 같이 음으로 하전된 다당류는 이온성 상호작용을 통해 콜라겐에 결합한다. 결합은 콜라겐 피브릴 내 양으로 하전된 아미노산 (리신, 히드록시리신 및 아르기닌)에 대해 또는 심지어 칼슘과 같은 이가 양이온에 의해 매개되는, 음으로 하전된 아미노산에 대해 일어날 수 있다. 나아가, 콜라겐의 이온 결합 특성은 산 또는 알칼라인 용액을 이용한 사전-처리 및 후속 동결-건조에 의해 의도적으로 영향을 받을 수 있다. 콜라겐 화학에 공지된 이들 기법에 의해, 본 발명에 따른 RNA (예를 들어, 본원에 기술된 복합체 내)의 현탁액으로 콜라겐을 담지하여 담체 재료로서 콜라겐과, 본 발명에 따라 이용되는 RNA 및 RNA 복합체 각각 사이의 이온 결합을 생성할 수 있다.
콜라겐에서, 양으로 하전된 아미노산은 짧은 양이온성 부분에 집중되지 않는다. 그러나, 담체의 이러한 구조적 특성은 RNA의 효율적인 결합에 유리하다. 담체 재료에 대한 더 단단한 결합을 달성하기 위하여, 펩티드 (Plank et al., Human Gene Therapy 10 (1999), 319-333) 또는 폴리에틸렌이민 (PEI)과 같이 RNA에 결합하는 양이온성 물질로 더욱 유도체화될 수 있다. 이 목적을 위해, 콜라겐 스폰지는, 예컨대, 이관능성 커플링 시약인 석시니미딜-피리딜-디티오프로피오네이트 (SPDP)로 변형된다. 폴리에틸렌 이민은 이미노티올란으로 유도체화되고, 이는 티올기의 도입을 초래한다. 결합된 양이온성 펩티드는 C-말단에 시스테인을 보유한다. 티올기는 디설파이드 다리를 형성함으로써 SPDP-유도체화된 콜라겐 스폰지와 반응한다. 이 방식으로 수득된 스폰지 유도체는 RNA에 단단히 결합해야 하고, RNA의 방출이 요구되는 장기간으로 일어날 것이 예상된다.
본 발명에 따라 사용된 RNA가 로딩된, 매트릭스/스캐폴드, 즉, 담체의 생산을 위해, 예를 들어, 건식 (콜라겐) 재료가, 예를 들어 동결보호제 (lyoprotectant) 용액 약 5%, 바람직하게는 약 2%, 글루코스 중에서 RNA/(중합체) 복합체와 인큐베이션될 수 있다. 로딩된 담체, 예컨대, 스폰지는 그 후에 동결-건조 및/또는 진공 건조될 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따른 RNA-로딩된 담체는 상응하는 담체를, 특히 본원에 기술된 복합체 내에 포함된 바와 같은, RNA와 접촉시켜 제조될 수 있고, 그로써 담체는 RNA, 또는 각각의 복합체를 흡수하거나, 바람직하게는 지연된 방식으로, 다시 방출될 수 있는 그러한 방식으로 RNA에 결합한다. 상응하는 방법이 당해 분야의 숙련자에게 알려져 있다 (Bonadio et al. (1999), Nat. Med. 5(7): 753-759; Shea, L.D. et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17 (6): 551-554). 예를 들어, 담체로서 콜라겐 스폰지 또는 피브린 클롯과 RNA/LTR 복합체의 조합의 생산이 본원에 기술된다.
원칙적으로, 본 발명에 따라 이용되는 RNA는 전달/경로의 임의의 적합한 경로 또는 방식으로 전달/투여될 수 있다.
본 발명에 따라 이용되는 RNA는, 예컨대, 이들이 결핍 유전자로 인한 질환을 앓고 있기 때문에, RNA에 의해 인코딩되는 단백질 또는 단백질 절편을 필요로 하는 환자에게 그 자체로 공지된 방식으로 투여될 수 있다. 이를 위해, RNA는 통상의 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 약제학적 제제로 제제화될 수 있다. 제제의 형태는 투여의 위치 및 성질에 좌우된다. 일 측면에서, 본 발명에 따라 이용되는 RNA는 특히 높은 안정성을 특징으로 하기 때문에, 그것이 사용되는 부위 및 그의 형태에 따라서 이는 다양한 방식으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, RNA는 동결-건조되고, 이 형태로 가공되고, 예컨대 분쇄되거나 밀링되고, 보관될 수 있으며, 그 후에 요구될 때 재구성되고 그의 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 약제학적 조성물 (또는 그 안에 포함된 RNA)은 유전자 요법을 통해 전달/투여되거나 유전자 요법을 위해 제조되는 것이다. 구체적으로, 유전자 요법은 전사물 요법, 더욱 구체적으로, 전사물 대체 요법인 것이 고려된다.
예를 들어, 담체 위에 (예컨대, 복합체의 형태로) 로딩되는 경우, RNA는 생체 내 또는 생체 외로 전달/투여될 수 있다. 전달/투여의 적합한 경로 또는 방식은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, Mitragotri (Nat Rev Drug Discov 13(9) (2014), 55-72), Tavernier G (상기 인용문 중) 및 Yin (Nat Rev Genet 15(8) (2014), 541-55)에 기술되어 있다. 예를 들어, 담체 위에 (예컨대, 복합체의 형태로) 로딩되는 경우, RNA는 세포, 바람직하게는 고등 진핵생물의 세포, 바람직하게는, 척추동물의 세포, 특히 포유동물의 세포 내로 시험관 내, 생체 내 및 생체 외로 전달될 수 있다. 제공된 수단 및 방법이 생체 내 및 생체 외 전달/투여 접근법의 맥락에서 특히 유용하다는 것이 이 발명에 따라서 입증된 바 있다.
일 측면에서, RNA는 생체 내로 전달/투여될 수 있다. 이 측면에 따라서, RNA (또는 이를 포함하는 약제학적 조성물)는 생체 내 전달/투여용으로 제조될 수 있고/있거나 생체 내로 전달/투여되게 된다.
시험관 내 적용과 관련하여, 예를 들어, 담체 위에 (예컨대, 복합체의 형태로) 로딩되는 경우, RNA를, 예컨대 스폰지 또는 클롯의 형태인 임플란트로서, 또는 예컨대 관절 대체물 위의 코팅으로서, 또는 관내인공삽입물 (예컨대, 조직 통합의 개선을 위한)로서 직접적으로 도입할 수 있다. 나아가, 코팅된 재료의 가공은 통상적인 조직 글루 시스템 (예컨대, 피브린 글루)에 의해 유기체 내로 의도적으로 도입되고 그 안에 고정되며 데포 (형질감염)의 형태로 효과적이 되는 분말의 형태일 수 있다.
구체적으로, RNA는 환자의 조직, 특히 골 성장, 골 재생, 골 형성, 골형성 골화 등의 도입이 바람직한 조직 내로 또는 그 바로 가까이에 전달/투여되는 것으로 고려된다. 이러한 조직은, 예를 들어, 그 자체가 골 조직일 수 있다. 따라서, RNA는 환자의 뼈 또는 골 조직 내로 직접적으로 전달/투여될 수 있다. 예를 들어, RNA는 골 결손 내로 또는 그 바로 가까이에 직접적으로 적용될 수 있다. 조직은 또한 다른 조직, 예를 들어 근육 조직일 수 있다. 이러한 경우에, 이소성 (ectopic) 골 형성이, 예를 들어, RNA에 의해 유도될 수 있다. 이들 목적을 위하여, 그러나 또한 생체 내 전달/투여의 다른 목적을 위하여, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 복합체의 형태로, RNA는 매트릭스 또는 스캐폴드, 즉 상기 본원에 기술된 바와 같은 담체 (예컨대, 콜라겐/콜라겐 스폰지, 피브린/피브린 클롯, 티타늄 필름, 헤파린-키토산 매트릭스, 히드록시아파타이트)에 첨가되거나 그 내로 로딩될 수 있다. 이식 전에 이 과정이 일어나는 것이 특히 고려된다. 그러나, RNA는 또한 매트릭스 또는 스캐폴드 없이 전달/투여될 수 있다. 원칙적으로, 골 질환 (예컨대, 골 결손 또는 골절)을 치료 (예방 또는 치유)하기 위한 RNA의 (직접적인) 적용은, 예를 들어, 재조합 hBMP-2 및 재조합 hBMP-7과 같은 재조합 단백질의 (직접적인) 투여를 위해 기술된 바와 같은 동일한 절차를 따를 수 있다 (예를 들어 Katanec, Coll Antropol 38(1) (2014), 325-30; Cicciu, Open Dent J 6 (2012), 51-5; Docherty Skogh, Plast Reconstr Surg 123(6) (2009), 192e-3e; Baltzer, Orthop Rev (Pavia) 4(1) (2012), e4; Heliotis M, Int J Oral Maxillofac Surg 35(3) (2006), 265-9; van den Bergh JP, J Clin Periodontol 27(9) (2000), 627-36 참조). RNA는 또한 골 시멘트 또는 골 충진재에 첨가될 수 있다. 이 맥락에서, 페이스트-유사 산물이 생산될 수 있다. 이는 더 나아가 골 결손에 적용될 수 있다. 원칙적으로, RNA는 또한, 예를 들어 매트릭스 또는 스캐폴드 없이, 뼈 내로 직접적으로 주입될 수 있다. 그러나, 매트릭스 또는 스캐폴드를 이용한 직접 주입이 또한, 원칙적으로, 가능하다.
다른 측면에서, RNA는 생체 외로 전달/투여될 수 있다. 이 측면에 따르면, RNA (또는 이를 포함하는 약제학적 조성물)는 생체 외 전달/투여용으로 제조될 수 있고/있거나 생체 외로 전달/투여되게 된다. 예를 들어, RNA는 환자 내로 도입되는, 즉 형질감염된 (유전적으로 변형된) 형태로, 환자 내로 도입될 수 있는 세포 내로 (예컨대, 골 세포) 생체 외 전달/투여될 수 있다. 하나의 특정 실시양태에서, RNA는 환자의 세포 (예컨대, 골 세포) 내로 생체 외에서 전달/투여되고 상기 RNA가 전달/투여된 상기 세포는 상기, 즉 동일한 환자 내로 재도입되는 것이고, 즉 이는 형질감염된 (유전적으로 변형된) 형태로, 상기 환자 내로 재도입될 수 있다. 따라서, 일 바람직한 실시양태에서, 세포는 치료되는 바로 그 환자로부터 유래한다.
환자 내로 (재)도입되는 세포는 이 목적에 적합한 임의의 세포일 수 있다. 세포는, 예를 들어, 골전구세포 세포일 수 있다. 이들은 중간엽 줄기세포 (MSC), 예를 들어 근육-유래 중간엽 줄기세포 (MMSC) 또는, 바람직하게는, 지방-유래 중간엽 줄기세포 (AMSC) 또는 골수-유래 MSC (BMSC)일 수 있다.
생체 외 전달/투여의 더욱 특이적인 실시양태에서, RNA (또는 이를 포함하는 약제학적 조성물)는 자가조직 그라프트를 통한 전달/투여를 위해 제조되고/되거나 자가조직 그라프트를 통해 전달/투여되게 된다. 자가조직 그라프트, 특히 그에 포함된 세포가 형질감염되고, 따라서 본원에 기술된 수단 및 방법에 따라서 유전적으로 변형되고, 즉, 본 발명에 따른 RNA (또는 이를 포함하는 약제학적 조성물)의 생체 외 전달/투여의 결과로서 본원에 기술된 하나 이상의 bmp를 발현하는 것으로 특히 고려된다. 더욱 구체적으로, 자가조직 그라프트, 특히 그에 포함된 세포가, 본 발명에 따라서, 즉 본원에 기술된 BMP rna 및 각각의 형질감염 수단 및 방법에 의해 형질감염되거나 형질감염되게 된다. 본원의 다른 곳에 이들 수단 및 방법과 관련하여 상기에 언급된 것들이 또한, 필요한 변경을 가하여, 여기에 적용된다.
본 발명에 따라 이용되는 자가조직 그라프트는 전구세포를 포함할 수 있다. 골전구세포 세포가 포함되는 것이 특히 고려된다. 자가조직 그라프트는 근육세포 또는 지방세포 (예컨대, AMSC)를 포함할 수 있다. 자가조직 그라프트는, 예를 들어, 골아세포, 파골세포 및/또는 골세포와 같은 골 세포를 포함할 수 있디. 특정 측면에서, 자가조직 그라프트는 골-조직 속질 (pulp)이거나 이를 포함한다. 골 조직 속질은 본원에 정의된 임의의 (골) 세포, 및 특히, 본 발명에 따라 형질감염되게 되거나 형질감염된, 즉 BMP를 발현하도록 본 발명에 따라 유전적으로 변형되게 되거나 변형된 본원에 정의된 임의의 (골) 세포를 포함할 수 있다.
원칙적으로, BMP RNA의 생체 외 전달/형질감염에 적합한 수단 및 방법이 당해 분야에 공지되어 있고, 또한 첨부의 실시예로부터 자명하다. 그러나, 본 발명의 하나의 특정 실시양태에서, BMP RNA가 Opti-MEM 배지 (GibcoTM, Invitrogen, CA, USA)에서 전달/형질감염되는 것이 고려된다. 언급된 바와 같이, 현저히 우수한 전달/형질감염 효율이 이 종류의 전달/형질감염 배지로 달성되었다.
생체 외 전달/투여의 목적을 위해서 또한, RNA는, 예를 들어, 복합체의 형태로, 매트릭스 또는 스캐폴드, 즉 상기 본원에 기술된 바와 같은 담체 (예컨대, 콜라겐/콜라겐 스폰지, 피브린/피브린 클롯, 티타늄 필름, 헤파린-키토산 매트릭스, 히드록시아파타이트) 내로/위에 첨가되거나 로딩될 수 있다.
이 맥락에서, 담체/담체 바디가, 제1 단계에서, RNA 또는, 바람직하게는, RNA 복합체로 사전-로딩되고, 선택적으로 건조되고 (예를 들어, 진공 및/또는 동결-건조), 제2 단계에서, 그 내로 RNA가 전달/투여되는 (예컨대, 형질감염되는) 세포로 접종되는 것이 특히 고려된다.
건조 목적을 위하여, 동결보호제 (lyoprotectant) (예를 들어, 수크로스)가 적합한 농도 (예컨대, 약 1% 내지 약 6%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 5% 또는, 특히, 약 5%, 약 3% 또는, 가장 바람직하게는, 약 2%)로 RNA/RNA 복합체에 첨가될 수 있다.
RNA-로딩된 담체 상에서 형질감염 효율 및/또는 세포 생존력을 (예를 들어, 첨부의 실시예에 기술된 바와 같이) 모니터링할 수 있다. 이 측면에서 성능이 약한 담체를 가려낼 수 있다.
구체적으로, RNA-로딩된 담체는, 우수한 성능을 나타내는 경우, 환자에 투여될 수 있다. 원칙적으로, 본원에 기술된 생체 외 목적의 맥락에서 RNA로 형질감염되어 있는 세포는, 그 후에 생체 내 목적과 관련하여 상기 본원에 기술된 바와 동일한 방식으로, 바람직하게는 그 내로/위에 이들이 로딩되어 있는 매트릭스/스캐폴드와 함께 전달/투여될 수 있다. 예를 들어, 이는 환자의 조직, 특히 골 성장, 골 재생, 골 형성, 골형성, 골화 등의 유도가 요구되는 조직 내로 또는 그 바로 가까이에 투여될 수 있다. 다시, 이 조직은 골 조직 자체일 수 있지만, 또한 근육 조직과 같은 다른 조직일 수 있다. 일 특정 측면에서, 이는 골 결손 내로 또는 그의 옆쪽 부위에 직접적으로 배치/이식될 수 있다.
상기에 기술된 RNA-로딩된 담체, 및 이들의 전달/투여 및 생산을 위한 수단 및 방법은 자가조직 그라프팅, 특히 본원에 기술된 자가조직 그라프팅에 특히 유용하다. 본원의 다른 곳에 이와 관련하여 언급된 것들이, 필요한 변경을 가하여, 여기에 적용된다. 구체적으로, 담체는 예를 들어, 골전구세포 세포와 같은 각각의 전구세포, 또는 예를 들어, 골아세포, 파골세포 및/또는 골세포와 같은 골 세포, MMSC 또는 AMSC 등과 같은 MSC로 접종될 수 있다.
본원에 기술된 RNA-로딩된 담체는 각각, 예를 들어, RNA 전달용 데포로서, 연장 및/또는 지연된 RNA 전달, 특히 (연장/지연된) RNA 전달 시스템으로서, 연장 및/또는 지연된 RNA 전달에 특히 유용하다. 원칙적으로, 이는 생체 내, 시험관 내 및 생체 외 전달/투여를 위해 적용되지만, 특히 본원에 기술된 생체 내 전달/투여 목적에 적용된다.
연장/지연된 전달의 의미는 당해 분야에 공지되어 있으며 본 발명의 맥락에서 각각 적용된다. 예를 들어, 연장/지연된 RNA 전달은 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월의 기간에 걸쳐 RNA 전달, 특히 약제학적 활성 양의 RNA의 전달일 수 있다. 원칙적으로, 더 긴 기간이 바람직하다.
당업자는 본 발명의 관점에서 적합한 RNA-로딩된 담체/담체 바디를 용이하게 생산할 수 있다. 이 목적을 위해, 당업자는 당해 분야에 공지되고 (Chevally, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218) 본원 및 첨부의 실시예에 기술된 각각의 수단 및 방법에 의존할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 상기에 기술된 방법 단계를 적용할 수 있다. 예를 들어, 세포 접종 단계 (및 아마도 이와 관련된 단계)는 RNA-로딩된 담체가 본원에 기술된 생체 내 전달/투여 목적을 위해 생산되는 경우 생략될 수 있다. 본 발명은 또한 RNA-로딩된 담체를 생산하기 위한 각각의 수단 및 방법에 관한 것이다.
예를 들어, RNA 또는 본 발명에 따라 담체/담체 바디 상에 로딩된 RNA의 양은 담체/담체 바디당 약 0.1 μg 내지 약 10 μg, 바람직하게는 약 0.5 μg 내지 약 8 μg, 바람직하게는 약 1 μg 내지 약 6 μg, 바람직하게는 약 1.5 μg 내지 약 5 μg 및 가장 바람직하게는 약 2 내지 약 3.5 μg의 범위일 수 있다. 담체/담체 바디 내로/위에 접종되는 세포의 양은, 예를 들어, 담체/담체 바디당 약 5,000 내지 약 50,000개, 바람직하게는 약 7,500 내지 약 40,000개, 바람직하게는 약 10,000 내지 약 30,000개일 수 있다. 특정 예시는 담체 바디당 약 10,000개, 약 20,000개 및 약 30,000개이다.
비-제한적 예시로서, 상기 값은 본 발명의 맥락에서 예시된 담체 바디 (즉, 5 내지 7 mm의 직경 및 약 1 내지 2 mm의 두께 및 대략 약 50 mm3의 용적)에 특별히 적용된다. 본 발명에 따라 이용되는 담체 바디는, 예를 들어, 형태 및 예컨대, 치유되는 골 분절의 직경에 의존적인 약 1 mm 내지 수 센티미터의 직경 (예컨대, 약 5 cm의 직경) 및 약 2 mm 내지 2 cm의 두께의 디스크일 수 있다. 이는 대략 수 mm3 내지 cm3의 용적으로 추정된다. 원칙적으로, 담체 바디의 모양 (예컨대, 디스크)은, 예를 들어 골 분절 (bone fraction)의 모양에 따라 개조될 수 있거나 또는 다르게는 적합한 모양으로 개조될 수 있다. 예를 들어, 이는 원형이 아니고 불규칙적일 수 있다.
일반적으로, 담체 바디 (예컨대, (콜라겐) 스폰지)는 그의 특정 용도로 개조될 수 있다. 예를 들어, 이의 모양은 치료되는 골 분절, 골 병변, 골강 (bone cavity) (예를 들어, 골 분절, 골 손상, (치아) 낭종 등에 의해서 야기됨), 골 손상 등에 대해 개조될 수 있다. 일 측면에서, 담체 바디의 모양이 골 분절/골강에 맞게 변화함이 고려된다. 다시 말해, 담체 바디는 골 분절/골강과 동일한 모양을 가질 수 있다. 구체적으로, 일단 뼈의 손상된 부위 (예컨대, 골 분절/골 병변) 내로/근처에 이식되면, 담체 바디는 뼈의 나머지 부분과 함께, 뼈의 원래 모양을 닮아 가는 것으로 고려된다.
전형적인 담체 바디는 압착가능 (squeezable) (예컨대, (콜라겐) 스폰지)할 수 있다. 따라서, 담체 바디의 초기 모양은 치료되는 골 분절, 골강 등에 비해 다소 확장될 수 있으나, 이식 후 뼈의 원래 모양을 닮아 가도록 골 분절, 골강 등 내로 압착될 수 있다.
또한 이들 측면에 대하여, 담체 바디는, 예를 들어, 콜라겐 스폰지 또는 피브린 클롯 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같음)일 수 있다. 예를 들어, 특정 담체 바디 내로/위에 로딩되는 RNA 및/또는 세포의 양의 값은 당업자/주치의에 의해 그에 대해 용이하게 조정될 수 있다.
추가의 실시양태에서, RNA는, 예를 들어 임플란트의 코팅용 담체로서 지연 방출 중합체 내에 제공된다. 이 목적을 위하여, RNA는 그것 자체로서 또는, 예를 들어, 코팅 중합체 및/또는 중합체 복합체로 보호되는 RNA로서 사용될 수 있다.
더욱이, 임플란트는 RNA의 투여를 위한 추가의 옵션이다. 각각의 임플란트의 표면 위에, 예컨대, 임플란트의 내부성장을 위한 유익한 인자로서, BMP를 인코딩하는 RNA를 함유하는 지연 방출 중합체의 코팅이 존재할 수 있다. 본 발명에 따르면, 단 하나의 인자 (BMP)를 인코딩하는 (m)RNA를 함유하는 코팅, 및 또한 여러 인자들 (bmp)을 인코딩하는 (m)rna를 함유하는 코팅 둘 다가 고려된다. 다양한 인자들 (bmp)이 또한 이들을 시차적 (staggered) 간격으로 방출되게 하는 형태로 제공될 수 있다.
표현 "하나 이상의 인자 (bmp)를 인코딩하는 RNA"는, 단독 형태로 또는 융합 단백질로서, 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 RNA 서열, 및 또한 각각의 RNA 서열이 하나의 단백질을 인코딩하는, 상이한 (BMP) 단백질을 인코딩하는 상이한 RNA 서열의 혼합물 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따라 이용되는 (m)RNA는 이식된 인공삽입물 (prostheses)의 내부성장을 촉진하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 치아 임플란트, 엉덩이 내부인공삽입물, 무릎 내부인공삽입물 또는 척추 융합 바디 (vertebral fusion body)와 같은 인공삽입물의 표면이 이용가능한 경우, 본 발명에 따라 이용되는 (m)RNA는 내부성장 및 새로이 삽입된 인공삽입물에 요구되는 다른 기능을 촉진할 수 있는 BMP를 방출할 수 있다. 따라서, 예를 들어 인공삽입물의 이식 또는 그 후의 맥락에서 BMP-2 또는 BMP-7과 같은 성장 인자와 같은 생물학적 활성 물질의 투여가 본 발명에 따라서 적용될 수 있다. 이 실시양태에서, BMP를 인코딩하는 본 발명에 따라 이용되는 RNA는 (측정된 방식으로) RNA를 방출하는 코팅 중의 임플란트 상에 적용될 수 있고, 그 후에 예를 들어 임플란트 주변의 세포가 바람직한 인자를 지속적으로 또는 간헐적으로 생산하고, 필요하다면, 이를 방출하도록, 그로부터 점차적으로 (측정된 방식으로) 방출될 수 있다. (m)RNA의 전신 투여가 또한 가능하다. 예컨대, 원치 않는 부작용의 발생으로 인해, 유전자 결함에 의해 영향을 받지 않는 세포 내 (m)RNA 번역이 바람직하지 않을 수 있는 경우가 있을 수 있다. 단지 인코딩된 단백질을 필요로 하는 세포에서만, 예컨대, 유전자 결함이 존재하는 세포에서만 선택적으로 번역되는 (m)RNA를 갖기 위하여, 상응하는 벡터가 또한, 예컨대 리간드를 통해 이환된 조직의 어드레싱 (addressing)을 가능케 하는 서열에 의해 보완될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 표적 세포에서는 발현되지 않는, 내인성 마이크로-rna가 결합하는 서열이 (m)RNA를 함유하는 벡터에 부가될 수 있고, 그로써 (m)RNA는 표적 세포에서는 유지되면서 관련 내인성 마이크로-rna를 함유하는 모든 세포에서 분해된다. 따라서 부작용이 최소화될 수 있다.
RNA가 전신적으로 투여되는 경우, 이는 일반적으로 바람직하게는 단위 투약 형태로서 장성 조절제 및 안정화제와 같은 통상의 첨가제와 함께 주사가능 액체로 제제화된다. 안정화제로서, 예를 들어 지질, 중합체 및 나노시스템 또는 리포좀과 같이 일반적으로 알려진 것들이 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 조성물이 제공된다.
일반적인 담체, 대개 생체적합인, 즉 약제학적으로 허용가능한, 합성, 천연 또는 혼합 천연-합성 중합체, 특이적으로 조절될 수 있는 이들의 방출 특성은 잘 알려져 있고, 따라서 본원에서 더 상세한 설명은 요구되지 않는다. 예를 들어, 폴리락타이드 또는 폴리락타이드/글리콜라이드 중합체가 사용된다. 이 방식으로, 선택적으로 더 길거나 더 짧은 시간 동안에 원하는 부위에서 원하는 인자를 지속적으로, 간헐적으로 방출할 수 있다.
본 발명에 따라 이용되는 RNA는 높은 안정성을 특별히 제공할 수 있고, 이는 장기-지속적인 단백질 발현을 초래한다. 예를 들어, RNA가 유전자 결함으로 인한 골 질환의 치료 또는 예방을 위해 의도되는 경우, RNA가 세포에 더 오래 잔류할수록 더 유용할 수 있다. RNA가 더 신속히 분해될수록, 단백질 발현이 더 신속히 종료되고, 어떤 경우에는 RNA가 더 자주 투여되어야 한다. 반대로, 세포에서 더 긴 시간 동안 잔류하는 안정한 RNA를 이용하는 경우, 투약 빈도가 현저히 감소될 수 있다. 본 발명에 따라 이용되는 RNA (특히 cmRNA)는 최대 4주간 안정적으로 발현되는 것으로 확인되었다. 따라서, 매우 장시간-작용하는 RNA가 필요한 경우에 사용될 수 있다. 따라서, 최대 4주간 지속할 수 있는 RNA 발현은 만성 골 질환의 치료에 이상적으로 적합하다. 각각의 RNA는 단지 드물게 (예컨대, 매 4주 마다) 또는 심지어 단 1회 제공되기만 하면 된다.
이 맥락에서, BMP RNA를 이용한 단독 치료가 골-관련된 질환, 장애 또는 손상의 적절한, 심지어 완전한 치료 (또는 예방)에 충분하다는 증거가 본원에 제공된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 단독 투여/처리용으로 제조되고/되거나 단 1회/단독 처리로서 투여되게 된다. 후속 제2 투여/처리 (또는 심지어 추가의 후속 투여/처리)는 이 특정 실시양태에서 요구되지 않는다.
다른 실시양태의 경우, 예컨대, RNA가 단지 일시적 발현으로 의도되는 경우, 단백질 발현의 지속기간은 안정성에 영향을 미침으로써 조정될 수 있다. 이용되는 RNA의 추가의 유용한 특성은 단백질 발현이 원하는 시간대에서 일어나도록 단백질 발현의 지속기간이 맞춤화될 수 있게, 작용의 지속기간이 안정성을 통해 선택적으로 조정될 수 있다는 것이다 (상기 참조).
본 발명에 따라 이용되는 mRNA의 안정성은 그 자체로 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. RNA를 함유하지 않는 세포에 비해 RNA를 함유하는 세포의 생존력을 결정하기 위한 방법이 특히 적합하다. 시간의 경과에 따라서 인코딩된 단백질 (BMP)의 생산이 또한 모니터링될 수 있다. 이때, RNA의 안정성은, 세포 내로 도입되어 있는 경우, 원하는 단백질을 발현할 수 있거나 그 단백질 또는 그의 기능적 단편으로 번역될 수 있는 RNA가 연장된 기간에 걸쳐서 여전히 발현할 수 있고, 즉시 분해되지 않으며 불활성화되지 않는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
따라서, 세포에서 RNA의 안정성 및 생존 시간을 시험하는 방법은 RNA에 의해 인코딩된 단백질이 얼마나 오래 세포 내에서 검출 가능한지, 또는 그의 기능을 발휘하는지 여부를 결정하는데 있다. 이를 위한 방법이 실시예에 기술되어 있다. 따라서, 예를 들어, 리포터 분자를 인코딩하는 서열을 갖는 (m)RNA는 선택적으로 원하는 단백질을 인코딩하는 RNA와 함께 세포 내로 도입될 수 있고, 그리고 나서, 미리 결정된 기간 후에, 리포터 분자, 및 선택적으로 인코딩된 단백질의 존재가 결정될 수 있다. 적합한 리포터 분자는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 통상적으로 사용되는 것들이 또한 본원에 사용된다. 바람직한 실시양태에서, RFP, 적색 형광 단백질 (red fluorescing protein)이 리포터 분자로 사용된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 환자, 바람직하게는 인간 환자/인간에 투여되게 된다. 그러나, 본원에 기술된 골 질환 (및 관련된 병태)은 또한, 예를 들어, 애완동물 (예컨대, 개, 고양이, 토끼, 래트 및 마우스), 가축 (예컨대, 소, 돼지, 양), 말 또는 조랑말 또는 새 (예컨대, 닭, 칠면조, 앵무새)와 같은 비-인간 동물 개체/환자에서 치료 또는 예방될 수 있다.
본 발명에 따른 임의의 약제학적 조성물은 사용 안내서 또는 사용 전단지와 함께 제공될 수 있다. 사용 안내서/전단지는 본 발명에 따라서 본원에 기술된 바와 같은 질환 또는 장애 (골 질환)를 치료 또는 예방하는 방법에 대해 당업자/주치의를 위한 지침을 포함할 수 있다. 구체적으로, 사용 안내서/전단지는 본원에 기술된 각각의 전달/투여의 방식 및 전달/투여 용법 (예를 들어, 전달/투여의 경로, 용량 용법, 전달/투여 기간, 전달/투여 빈도)에 대한 안내를 포함할 수 있다. 구체적으로, 사용 안내서/전단지는 약제학적 조성물이 단독 투여/치료용으로 제조되고/되거나 단 1회/단독 처리로서 투여되는 지침을 포함할 수 있다. 사용 안내서/전단지는 후속 제2 투여/처리 (또는 심지어 추가의 후속 투여/처리)가 요구되지 않는다는 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 원칙적으로, 각각의 전달/투여의 방식 및 전달/투여 용법과 관련하여, 예를 들어 생체 외 또는 생체 내 전달/투여, MPs, LTR 및/또는 RNA의 비 및 용량과 관련하여 본원의 다른 곳에 언급된 것들이 사용 안내서/전단지 내에 각각의 지침으로서 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술되고 정의된 바와 같은 BMP (cm)rna에 관한 것이다. bmp 및 RNA와 관련하여 본원의 다른 곳에 언급된 것들이 또한, 필요한 변경을 가하여, 여기에 적용된다.
본 발명의 (cm)BMP rna의 하나의 비-제한적이지만 바람직한 예시가 BMP (예를 들어, BMP-2 또는 BMP-7), 또는 BMP의 기능적 단편을 인코딩하는 서열을 갖는 RNA이고, 여기서 상기 RNA의 시티딘의 5 내지 50%, 7,5 내지 30%, 15 내지 25 또는, 바람직하게는, 약 25%는 화학적으로 변형된 시티딘 (예컨대, 5-메틸시티딘; m5C)이고/이거나 상기 RNA의 유리딘의 5 내지 50%, 7,5 내지 30%, 15 내지 25 또는, 바람직하게는, 약 25%는 화학적으로 변형된 유리딘 (예컨대, 2-티오유리딘; s2U)이다.
일 측면에서, 본 발명은 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 복합체의 형태로, 더욱 바람직하게는, 본원에 기술된 RNA-로딩된 담체의 형태로 약제학적 조성물, 구체적으로 BMP-인코딩 RNA, 특히 상기에 기술된 BMP 인코딩 RNA를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기술되고 정의된 바와 같은 복합체, 즉 본원에 기술된 바와 같은 (cm)RNA를 포함하거나 이와 복합체화되는 복합체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 본원에 기술되고 정의된 바와 같은 형질감염 복합체 (예컨대, 리포펙션, 마그네토펙션 및 마그네토리포펙션 복합체)에 관한 것이다. 원칙적으로, bmp, RNA, LTRs, MPs 및 복합체의 다른 필수적 요소와 관련하여 본원의 다른 곳에 언급된 것들이 또한, 필요한 변경을 가하여, 여기에 적용된다.
본 발명의 복합체의 하나의 비-제한적이지만 바람직한 예시는 BMP (예를 들어, BMP-2 또는 BMP-7), 또는 BMP의 기능적 단편을 인코딩하는 서열을 포함하거나 이와 복합체화된 복합체이고, 여기서 상기 RNA의 시티딘의 5 내지 50%, 7,5 내지 30%, 15 내지 25 또는, 바람직하게는, 약 25%는 화학적으로 변형된 시티딘 (예컨대, 5-메틸시티딘 m5C)이고/이거나 상기 RNA의 유리딘의 5 내지 50%, 7,5 내지 30%, 15 내지 25 또는, 바람직하게는, 약 25%는 화학적으로 변형된 유리딘 (예컨대, 2-티오유리딘; s2U)이다. 더욱 구체적으로, 이러한 복합체는 본원에 기술되고 정의된 바와 같이 하나 이상의 LTR (예컨대, 리포펙타민 2000, Dogtor, DreamFectTM 또는, 바람직하게는, DF-GoldTM 또는 C12-(2-3-2)) 및/또는 MPs (예컨대, 코어-쉘 MPs, 산화철 실리카 MPs 및/또는 (분지된) PEI-가식된 MPs, 예컨대 SiOx/포스포네이트-PEI 코팅을 갖는 MPs (예컨대, SO-Mag6-115 MPs))를 포함할 수 있다. 더욱 더 구체적으로, MPs, LTR 및/또는 RNA는 상기 본원에 기술된 바와 같은 각각의 비율로 이러한 복합체 (또는 본 발명의 다른 복합체)에 포함될 수 있다. 구체적으로, 이들 비는 RNA의 μg당 약 8 μg 또는 약 20 μg의 LTR인 RNA에 대한 LTR의 w/w 비, RNA의 μg당 약 2 μl 또는 약 5 μl의 LTR 용액인 RNA에 대한 LTR 용액의 v/w 비, RNA μg당 약 0.5 μg의 MPs인 RNA에 대한 MPs의 철 w/w 비, LTR의 약 12 내지 20 μg당 (바람직하게는 약 16 μg당) 약 0.5 μg의 MPs인 LTR에 대한 MPs의 철 w/w/ 비, LTR 용액의 4 μl당 약 0.5 μg의 MPs인 LTR 용액에 대한 MPs의 철 w/v 비, 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 철 w/w/w 비, 예를 들어 약 0.5 μg의 MPs : 약 12 내지 20 μg (바람직하게는 약 16 μg당)의 LTR : 약 1 μg의 RNA의 철 w/v/w 비, 및/또는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 철 w/v/w 비, 예를 들어 약 0.5 μg의 MPs : 약 4 μl의 LTR 용액 : 약 1 μg의 RNA의 철 w/v/w 비일 수 있다.
이러한 복합체 (또는 본 발명의 다른 복합체)는 또한 하나 이상의 추가의 지질 (예컨대, "헬퍼 지질")을 포함할 수 있다. 추가의 지질 (예컨대, "헬퍼 지질")과 관련하여 상기 본원에 언급된 것들이 또한, 필요한 변경을 가하여, 여기에 적용된다.
또한 상기에 기술된 RNA 또는 복합체는 본 발명의 수단 및 방법에 따라 사용되는 것으로 의도된다. 이 맥락에서, RNA 또는 복합체는 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명은 또한 본원에 기술되고 정의된 바와 같은 BMP (cm)RNA 또는 복합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
BMP RNA 및 각각의 복합체는 당해 분야에 공지된 수단 및 방법에 따라서, 또한 본원 및 첨부의 실시예에 기술된 수단 및 방법에 따라서 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, BMP RNA는 시험관 내 전사 시스템에 의해 제조될 수 있고, 따라서 시험관 내 전사된 BMP RNA (IVT BMP RNA)일 수 있다. 이 맥락에서, 예를 들어, 본 발명에 따라 이용되는 BMP RNA가 ATP, CTP, GTP 및 UTP의 혼합물로부터 시험관 내 전사에 의해 생산되는 방법이 적합하다. 시험관 내 전사를 수행하는데 필요한 재료, 특히 완충제, 효소 및 뉴클레오티드 혼합물은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며 상업적으로 이용가능하다. 본 발명에 따라 이용되는 RNA의 생산에 사용되는 DNA의 특성은 또한 중요하지 않다. 일반적으로, 이는 클로닝된 DNA일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 예를 들어 본원에 기술되고, 선택적으로 본원에 기술된 바와 같은 세포로 추가 접종된 복합체의 형태로, 본원에 기술된 매트릭스 또는 스캐폴드/담체/담체 바디, 즉 본 발명에 따라 이용되는 RNA가 로딩된 매트릭스/스캐폴드/담체/담체 바디에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한, 본원에 정의된 RNA-로딩된 매트릭스/스캐폴드/담체/담체 바디를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 골 재생 및/또는 본원에 기술된 골 질환에 사용하기 위한 바로 사용 가능한 생체물질 (bioproduct)로서 본원에 기술된 RNA-로딩된 담체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 연장 및/또는 지연된 전달을 위해, 그리고 각각 연장된 전달 시스템/데포로서 제제화된 매트릭스/스캐폴드/담체/담체 바디, 약제학적 조성물 또는 생체물질의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 하기의 비-제한적인 도면 및 실시예를 참조하여 더욱 기술된다.
도면은 하기와 같다:
도 1. 천연 아가로스 겔 전기영동을 사용한 변형된 mrna의 온전성 및 크기의 결정. cmrna 및 RiboRuler RNA 레더 (ladder) 고범위를 로딩 염료를 함유하는 RiboRuler 포름아미드와 혼합하고 70℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 이어서 샘플을 얼음 중에서 냉각시키고 아가로스 겔에 적용하였다. 에티디움브로마이드 염색 및 Gel 영상 시스템 상에서 가시화하여 검출을 수행하였다.
도 2. (A) 20 pg/세포의 cmRNA 용량에서 인핸서로서 리포펙타민 2000 (LF), Dogtor, DF-Gold 또는 bPEI를 사용하여 형성된 MetLuc cmRNA 복합체로 형질감염된 AMSC에서 메트리디아 (Metridia) 루시퍼라제 발현 역학 및 (B) 형질감염 5 및 24시간 후 세포의 생존력. 비형질감염된 대조군 (100% 세포 생존력) 및 형질감염된 세포 사이의 유의미한 차이를 (*)로 표시한다. (C) 둘 다 MetLuc를 인코딩하는 pDNA 또는 cmRNA의 DF-Gold 리포플렉스로 형질감염 후 AMSC에서 리포터 발현에 대한 시간 프로파일의 비교. "pDNA" 및 "cmRNA" 곡선하 면적, AUC pDNA 및 AUC cmRDNA 를 제로 및 120시간 시점 사이에서 데이터를 적분하여 계산하였다. pDNA와 cmRNA 데이터 사이의 유의미한 차이를 (*)로 표시한다.
도 3. DF-Gold/cmRNA 리포플렉스 및 DF-Gold/SO-Mag6-115/cmRNA 자성 트리플렉스로의 형질감염 후 AMSC 및 BMSC에서 Tomato, eGFP 및 MetLuc 리포터의 발현. 적용된 cmRNA 용량은 20 pg/세포였다. (A) tomato N1 cmRNA 및 (B) eGFP cmRNA의 복합체로의 형질감염 24시간 후 취해진 세포의 형광 현미경 영상. 스케일 바 (scale bar)는 250 μm를 나타낸다. (C) eGFP cmRNA의 복합체로의 형질감염 24시간 후 eGFP를 발현하는 세포의 비율에 대한 FACS 결과. 비형질감염된 세포와 리포펙션된 (*) 또는 마그네토펙션된 세포 (**) 사이뿐만 아니라 리포펙션과 마그네토펙션 사이(‡)의 유의미한 차이를 도면에 나타내었다. (D) 메트리디아 루시퍼라제 발현의 시간의 경과를 MetLuc cmRNA의 복합체로 형질감염된 두 세포 유형 모두에 대해 나타내었다. 마그네토펙션과 리포펙션 사이의 유의미한 차이를 AMSC 및 BMSC 각각에 대해 (*) 및 (**)로 표시한다. MAI를 계산하기 위하여, "마그네토펙션" 곡선하 면적 AUC MF 를 BMSC 및 AMSC 둘 모두의 경우에서 "리포펙션" 곡선하 면적 AUC LF 에 대해 정규화하였다.
도 4. DF-Gold/cmRNA 리포플렉스 및 DF-Gold/SO-Mag6-115/cmRNA 자성 트리플렉스로의 형질감염 후 상이한 시점에서 AMSC 내 생산된 hBMP-2. 생산된 hBMP-2를 적용된 hBMP-2 cmRNA 용량 (20 pg/세포)에 대해 정규화하였다. (A) 상청액에서 측정된 분비된 hBMP-2의 함량에 대한 형질감염 시 사용된 배양 배지 (골형성 배지 vs. Opti-MEM)의 효과; (*)는 비교된 그룹들 사이에 유의미한 차이를 나타낸다. (B) 형질감염 후 1, 2, 및 3일째에 상청액 내 (분비된 hBMP-2) 및 세포 용해물 내 (세포내 hBMP-2)에서 측정된 형질감염된 세포 (cmRNA (+))에 의해 생산된 내인성 hBMP-2 (cmRNA (-)) 및 hBMP-2의 함량. (*)는 비처리된 세포와 형질감염된 세포 사이에서 분비된 hBMP-2에 대한 유의미한 차이를 나타낸다. (**)는 소정의 관찰 시점에서 형질감염된 세포에 대한 분비된 hBMP-2와 세포내 hBMP-2 사이의 유의미한 차이를 나타낸다. (#)는 리포펙션과 마그네토펙션 사이의 분비된 hBMP-2에 대한 유의미한 차이를 나타낸다. (C) 형질감염된 세포에서 총 (분비된 + 세포내) hBMP-2 함량의 시간의 경과. MAI=6.0을 계산하기 위하여, "마그네토펙션" 곡선하 면적, AUC MF 를 내인성 hBMP-2의 수준을 보여주는 "비처리된 세포" 곡선하 면적, AUC ref 의 공제 후, "리포펙션" 곡선하 면적, AUC LF 에 대해 정규화하였다.
도 5. DF-Gold/cmRNA 리포플렉스로 형질감염된 세포의 알칼라인 포스파타제 (ALP) 활성. (A) 형질감염 12일 후 ALP 염색. (B) 형질감염 후 3, 7 및 12일째의 ALP 활성. (*)는 비형질감염된 세포와 형질감염된 세포 사이의 유의미한 차이를 나타내고 (**)는 형질감염 후 3일째와 12일째 사이의 유의미한 차이를 나타낸다. 20 pg/세포의 적용된 cmRNA 용량에서 hBMP-2 cmRNA의 복합체를 이용한 AMSC의 리포펙션 및 마그네토펙션 후 골-관련 유전자의 발현에 있어서의 증가. 형질감염 후 3, 7, 14 및 21일째에 (C) RunX2, (D) Osx, (E) ALP, (F) Coll I, (G) OPN 및 (H) OCN의 발현에 있어서의 배수 증가. 회색 막대는 DF-Gold/cmRNA 복합체를 이용한 리포펙션을 나타내는 반면, 점선 막대는 SO-Mag6-115/DF-Gold/cmRNA 트리플렉스를 이용한 마그네토펙션을 상징한다. (*)는 동일한 관찰 시점에서 리포펙션 그룹과 마그네토펙션 그룹 사이(‡)의 유의미한 차이를 나타낸다. (**)는 리포펙션 그룹과 마그네토펙션 그룹에 대한 형질감염 후 상이한 시점을 비교한 경우의 유의미한 차이를 나타낸다.
도 6. 리포펙션 및 마그네토펙션 후 AMSC의 무기질화. 형질감염 21일 후 알리자린 레드 염색: (A) 비형질감염된 세포, (B) 마그네토펙션 후 세포 및 (C) 리포펙션 후 세포. (D) 형질감염 후 14일 및 21일째 알리자린 레드 염색의 정량. 비형질감염된 세포와 형질감염된 세포 사이의 유의미한 차이를 (*)로 표시하고 상이한 형질감염된 세포들 간의 비교를 (
)로 표시하였다.
도 7. 인핸서-대-cmRNA v/w 비 4와 5 μg hBMP-2-또는 tomato N1-cmrna/디스크의 용량으로 DF-Gold/cmrna 리포플렉스를 이용한 3 mm 지방 디스크의 형질감염. (A) tomato N1 cmRNA의 복합체로의 형질감염 후 24시간째에 취해진 지방 디스크의 형광 현미경 영상. 스케일 바는 500 μm를 나타낸다. DF-Gold/hBMP-2 cmRNA 복합체를 이용한 지방 디스크 리포펙션 후 골-관련 유전자 발현의 유도. (B) hBMP-2, (C) RunX2, (D) ALP 및 (E) Coll I의 발현에 있어서 배수 증가. 총 RNA를 추출하고 형질감염 후 3일 및 7일째에 RT-PCR을 수행하였다. 발현은 비형질감염된 대조군 대비 배수 유도로서 보고된다. 모든 값을 베타-튜불린에 대해 정규화하였다. (*)는 ALP 및 Coll I 발현에 대해 형질감염 후 3일째와 7일째 사이의 유의미한 차이를 나타낸다.
도 8. DF-Gold/cmRNA 리포플렉스 및 DF-Gold/SO-Mag6-115/cmRNA 자성 트리플렉스로의 형질감염 후 상이한 시점에서 AMSC에서 생산된 hBMP-7. 생산된 hBMP-7을 적용된 hBMP-7 cmRNA 용량 (20 및 32 pg/세포)에 대해 정규화하였다.
도 9. DF-Gold/hBMP-7 cmrna 리포플렉스로의 리포펙션 및 SO-Mag6-115/DF-Gold/hBMP-7 cmRNA 트리플렉스로의 마그네토펙션 후 AMSC의 무기질화. 사용된 cmRNA의 용량은 20 및 32 pg/세포였다. 형질감염 21일 후 알리자린 레드 염색: (A) 비형질감염된 세포, (B-C) 리포펙션 후 세포 및 (C-D) 마그네토펙션 후 세포.
도 10. DF-Gold/ MetLuc mRNA 리포플렉스로 AMCS의 형질감염 후 상이한 시점에서 MetLuc 발현. 시험된 DF-Gold-대-mRNA v/w 비는 2.5, 5, 10 및 20 pg/세포의 적용된 mRNA 용량에서 μg mRNA당 0.5 내지 5 μl DF-Gold의 범위 내였다.
도 11. DF-Gold/MetLuc mRNA 리포플렉스로 BMSC의 형질감염 후 상이한 시점에서 MetLuc 발현. 시험된 DF-Gold-대-mRNA v/w 비는 2.5, 5, 10 및 20 pg/세포의 적용된 mRNA 용량에서 μg mRNA에 대한 0.5 내지 5 μl DF-Gold의 범위 내였다.
도 12. 4의 DF-Gold-대-mRNA v/w 비에서 DF-Gold/eGFP mRNA 리포플렉스로의 형질감염 (리포펙션) 및 0.5의 Fe-대-mRNA w/w 비에서 DF-Gold/SO-Mag6-115/eGFP mRNA 자성 트리플렉스로의 형질감염 (마그네토펙션) 24시간 후 (A) AMSC 및 (B) BMSC에 대한 유세포 분석 히스토그램.
도 13. 뼈 임플란트 재료 위에 그라프팅된 BMP-2 RNA-μ-CT 결과-전골. 처리 2주 후 모든 그룹에 대해 수득된 μCT 3D 재구성 및 종단면. (A) 피브린, (B) C12-(2-3-2)/FFL cmRNA, 및 (C) C12-(2-3-2)/hBMP-2 cmRNA. 캘러스 (callus) 형성 면적을 모든 샘플에 대해 ImageJ 소프트웨어에서 동일한 역치 (2500-4500)를 설정함으로써 강조하였다. (D) 캘러스 형성의 양을 ImageJ로 정량하였다.
도 14. 콜라겐 스폰지 상에 복합체 로딩 및 세포 접종. (A) Luc SNIM RNA 리포플렉스가 비로딩 및 로딩된 진공-건조된 콜라겐 스폰지의 주사 전자 현미경 (리포플렉스의 평균 유체역학 직경: 65,8 nm). (B) 10% tdTomato mRNA가 FITC 표지되어 있는 tdTomato mRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지 상에 접종 30시간 후 NIH3T3 세포의 형광 현미경. (C) 콜라겐 스폰지 상에 접종 7일 후 NIH3T3 세포의 헤마톡실린 염색. 세포의 핵을 헤마톡실린을 이용해 짙은 청색으로 염색하였다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다. 상부 패널의 좌측 가장자리는 콜라겐 스폰지의 표면을 나타낸다.
도 15. eGFP mRNA-복합체가 로딩된 콜라겐 스폰지 상에 NIH3T3 세포의 접종 48시간 후 형질감염 효율 및 세포 생존력. (A) 4× 배율 (JULY™) 하의 형광 현미경: NIH3T3 세포에서 eGFP mRNA의 발현. (B) FACS 분석: 비형질감염된 세포에 비해, 100 pg/세포 eGFP mRNA로 형질감염된 NIH3T3 세포에서 평균 형광 감도의 명백한 이동. (C) FACS 분석: 형질감염 효율에 대한 mRNA 용량의 상관관계. (D) 및 (E) PI 염색의 FACS 분석 및 WST 어세이는 각각 약 60-70%의 세포 생존력을 나타낸다. 모든 데이터는 3회 반복의 값으로부터의 평균 ± SD이다.
도 16. NIH3T3 세포를 사용한 2D 대 3D 배양에서 메트리디아 루시퍼라제 mRNA의 발현 역학. 상청액을 형질감염 후 매 24시간마다 수집하고, Met luc의 발현을 즉시 측정하였다. 나타난 모든 데이터는 3회 반복의 값으로부터의 평균 ± SD이다. Y 축은 로그자 (logarithmic scale)이다.
도 17. 상이한 세포 밀도로 MSC를 사용한 콜라겐 스폰지 내 메트리디아 루시퍼라제의 발현 역학. 이 실험에 사용된 mRNA 리포플렉스의 양은 50 pg/세포이었다. 상청액을 형질감염 후 24시간 마다 수집하고 -20℃에 보관하였다. 8일 후, 메트리디아 루시퍼라제의 발현을 모든 시점에서 측정하였다. 나타난 데이터는 3회 반복의 값으로부터의 평균 ± SD이다. Y 축은 로그자이다.
도 18. 생체 내 골 재생에 대한 면역조직화학적 분석. (A) 무기질화된 골 조직의 염색. 적색 직사각형은 스폰지가 대퇴골 결함에 배치된 위치를 보여준다. 흑색 영역은 고도로 무기질화된다. (B) 골막 영역 내 캘러스 형성. (C) 섬유 조직 형성의 분절. (D) 유골 (osteoid) 형성의 분절. 값들을 T-검정을 이용하여 비교하였다 (n= 9).
도 19. hBMP2 mRNA-로딩된 콜라겐 스폰지 상에 접종된 MSC에 의한 hBMP2의 발현. 상이한 3종의 용량을 시험하였다. 나타난 데이터는 3회 반복의 값으로부터의 평균 ± SD이다.
도 20. 시험관 내 골 분화. RT-qPCR 결과: hBMP2 cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지 상에 세포의 접종 후 7일 및 14일째에 골아세포 마커의 발현의 배수 증가. 값은 3회 반복의 평균 ± SD이다. (A) MC3T3-E1 세포: 값을 GAPDH의 발현에 대해 정규화하였다. 데이터를 3D에서 비형질감염된 세포에 대한 배수 증가로 표시하였다. (B) MSC: 값을 β-튜불린의 발현에 대해 정규화하였다. 데이터를 2D에서 비형질감염된 세포에 대한 배수 증가로 표시하였고, 다중 t-검정을 이용하여 비교하였다.
도 21. 생체 내 골 재생. (A) 이식 후 2주째에 래트 대퇴골의 μ-CT 영상. 적색 부분은 새로 형성된 뼈를 나타낸다. (B) 이식 후 2주째에 골 형성 면적의 평가를 위한 μ-CT 분석. t-검정을 사용하여 값을 비교하였다 (n= 9).
도 22. 콜라겐 스폰지 상에서 진공-건조된 mRNA 리포플렉스의 안정성. 2시간 동안 진공-건조된 후, 진공 밀봉되고 RT에서 보관된 Metluc mRNA-로딩된 콜라겐 스폰지. 진공-건조 후 상이한 시점에서, 플레이트를 개봉하고 NIH3T3 세포를 스폰지 위에 접종하였다. Met Luc의 발현을 세포 접종 24시간 후 측정하였다. 나타난 모든 데이터는 3회 반복의 값으로부터의 평균 ± SD이다. Y 축은 로그자이다.
도 23. 진공-건조 전 및 후에 콜라겐 스폰지의 SEM 사진. 스케일 바는 200 μm를 나타낸다.
도 24. 콜라겐 스폰지 상의 NIH3T3 세포에서 SNIM Metluc 또는 비변형된 Metluc mRNA 중 하나로의 형질감염 후 Metluc 발현의 역학. 상청액을 형질감염 후 24시간 마다 수집하고, -20℃에서 보관하였다. 10일 후, 메트리디아 루시퍼라제의 발현을 모든 시점에 대해 측정하였다. 나타난 데이터는 3회 반복의 평균 ± SD이다. Y 축은 로그자이다.
도 25. 콜라겐 스폰지 상의 NIH3T3 세포에서 Metluc 발현의 역학에 대한 스폰지의 진공-건조 효과. 상청액을 형질감염 후 24시간 마다 수집하고, -20℃에서 보관하였다. 5일 후, 메트리디아 루시퍼라제의 발현을 모든 시점에 대해 측정하였다. 나타난 데이터는 3회 반복의 평균 ± SD이다. Y 축은 로그자이다.
도 26. FACS 분석: 래트의 지방 조직으로부터의 분리 후 MSC에 대한 양성 (CD90 및 CD29), 및 음성 (CD45, CD106 및 CD31) 마커의 조사. IgM,K-FITC, IgG1,K-FITC 및 IgG1,K-PE를 대조군으로 사용하였다.
도 27. 분화 동안 스폰지의 현미경적 형태 변화이다. 스폰지 상에 MSC 접종 후 7일째에, 96-웰 플레이트로부터 사진을 찍었다.
도 28. 뼈의 상이한 부분에 hBMP2 cmRNA 리포플렉스가 로딩된 콜라겐 스폰지의 생체 내 골형성 효과. T-검정을 이용하여 값을 비교하였다.
도 29. μ-CT: 수술 후 2주째에 생체 내 골재생을 위한 hBMP2 cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지의 효과. 노란색 부분이 새로 형성된 뼈이다.
도 30. (A) 래트 대퇴골의 속질에서 hBMP-2 코딩 cmRNA가 로딩된 임플란트 위에서 조직의 무기질화가 유의미하게 증가한다. (B) 골막 조직 형성이 hBMP-2 코딩 cmRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지의 이식의 결과로서 유의미하게 증가한다. (C) 총 용적 당 섬유상 조직 (Fb.V/TV)이 hBMP-2에 대한 cmRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지로의 처리 시 유의미하게 증가한다. (D) 총 용적당 유골의 형성 (OV/TV)이 hBMP-2를 코딩하는 cmRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지로의 처리 시 증가한다. (E) 더 적은 골 흡수는 hBMP-2를 코딩하는 cmRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지로의 이식에 대한 결과와 상반된다.
도 1. 천연 아가로스 겔 전기영동을 사용한 변형된 mrna의 온전성 및 크기의 결정. cmrna 및 RiboRuler RNA 레더 (ladder) 고범위를 로딩 염료를 함유하는 RiboRuler 포름아미드와 혼합하고 70℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 이어서 샘플을 얼음 중에서 냉각시키고 아가로스 겔에 적용하였다. 에티디움브로마이드 염색 및 Gel 영상 시스템 상에서 가시화하여 검출을 수행하였다.
도 2. (A) 20 pg/세포의 cmRNA 용량에서 인핸서로서 리포펙타민 2000 (LF), Dogtor, DF-Gold 또는 bPEI를 사용하여 형성된 MetLuc cmRNA 복합체로 형질감염된 AMSC에서 메트리디아 (Metridia) 루시퍼라제 발현 역학 및 (B) 형질감염 5 및 24시간 후 세포의 생존력. 비형질감염된 대조군 (100% 세포 생존력) 및 형질감염된 세포 사이의 유의미한 차이를 (*)로 표시한다. (C) 둘 다 MetLuc를 인코딩하는 pDNA 또는 cmRNA의 DF-Gold 리포플렉스로 형질감염 후 AMSC에서 리포터 발현에 대한 시간 프로파일의 비교. "pDNA" 및 "cmRNA" 곡선하 면적, AUC pDNA 및 AUC cmRDNA 를 제로 및 120시간 시점 사이에서 데이터를 적분하여 계산하였다. pDNA와 cmRNA 데이터 사이의 유의미한 차이를 (*)로 표시한다.
도 3. DF-Gold/cmRNA 리포플렉스 및 DF-Gold/SO-Mag6-115/cmRNA 자성 트리플렉스로의 형질감염 후 AMSC 및 BMSC에서 Tomato, eGFP 및 MetLuc 리포터의 발현. 적용된 cmRNA 용량은 20 pg/세포였다. (A) tomato N1 cmRNA 및 (B) eGFP cmRNA의 복합체로의 형질감염 24시간 후 취해진 세포의 형광 현미경 영상. 스케일 바 (scale bar)는 250 μm를 나타낸다. (C) eGFP cmRNA의 복합체로의 형질감염 24시간 후 eGFP를 발현하는 세포의 비율에 대한 FACS 결과. 비형질감염된 세포와 리포펙션된 (*) 또는 마그네토펙션된 세포 (**) 사이뿐만 아니라 리포펙션과 마그네토펙션 사이(‡)의 유의미한 차이를 도면에 나타내었다. (D) 메트리디아 루시퍼라제 발현의 시간의 경과를 MetLuc cmRNA의 복합체로 형질감염된 두 세포 유형 모두에 대해 나타내었다. 마그네토펙션과 리포펙션 사이의 유의미한 차이를 AMSC 및 BMSC 각각에 대해 (*) 및 (**)로 표시한다. MAI를 계산하기 위하여, "마그네토펙션" 곡선하 면적 AUC MF 를 BMSC 및 AMSC 둘 모두의 경우에서 "리포펙션" 곡선하 면적 AUC LF 에 대해 정규화하였다.
도 4. DF-Gold/cmRNA 리포플렉스 및 DF-Gold/SO-Mag6-115/cmRNA 자성 트리플렉스로의 형질감염 후 상이한 시점에서 AMSC 내 생산된 hBMP-2. 생산된 hBMP-2를 적용된 hBMP-2 cmRNA 용량 (20 pg/세포)에 대해 정규화하였다. (A) 상청액에서 측정된 분비된 hBMP-2의 함량에 대한 형질감염 시 사용된 배양 배지 (골형성 배지 vs. Opti-MEM)의 효과; (*)는 비교된 그룹들 사이에 유의미한 차이를 나타낸다. (B) 형질감염 후 1, 2, 및 3일째에 상청액 내 (분비된 hBMP-2) 및 세포 용해물 내 (세포내 hBMP-2)에서 측정된 형질감염된 세포 (cmRNA (+))에 의해 생산된 내인성 hBMP-2 (cmRNA (-)) 및 hBMP-2의 함량. (*)는 비처리된 세포와 형질감염된 세포 사이에서 분비된 hBMP-2에 대한 유의미한 차이를 나타낸다. (**)는 소정의 관찰 시점에서 형질감염된 세포에 대한 분비된 hBMP-2와 세포내 hBMP-2 사이의 유의미한 차이를 나타낸다. (#)는 리포펙션과 마그네토펙션 사이의 분비된 hBMP-2에 대한 유의미한 차이를 나타낸다. (C) 형질감염된 세포에서 총 (분비된 + 세포내) hBMP-2 함량의 시간의 경과. MAI=6.0을 계산하기 위하여, "마그네토펙션" 곡선하 면적, AUC MF 를 내인성 hBMP-2의 수준을 보여주는 "비처리된 세포" 곡선하 면적, AUC ref 의 공제 후, "리포펙션" 곡선하 면적, AUC LF 에 대해 정규화하였다.
도 5. DF-Gold/cmRNA 리포플렉스로 형질감염된 세포의 알칼라인 포스파타제 (ALP) 활성. (A) 형질감염 12일 후 ALP 염색. (B) 형질감염 후 3, 7 및 12일째의 ALP 활성. (*)는 비형질감염된 세포와 형질감염된 세포 사이의 유의미한 차이를 나타내고 (**)는 형질감염 후 3일째와 12일째 사이의 유의미한 차이를 나타낸다. 20 pg/세포의 적용된 cmRNA 용량에서 hBMP-2 cmRNA의 복합체를 이용한 AMSC의 리포펙션 및 마그네토펙션 후 골-관련 유전자의 발현에 있어서의 증가. 형질감염 후 3, 7, 14 및 21일째에 (C) RunX2, (D) Osx, (E) ALP, (F) Coll I, (G) OPN 및 (H) OCN의 발현에 있어서의 배수 증가. 회색 막대는 DF-Gold/cmRNA 복합체를 이용한 리포펙션을 나타내는 반면, 점선 막대는 SO-Mag6-115/DF-Gold/cmRNA 트리플렉스를 이용한 마그네토펙션을 상징한다. (*)는 동일한 관찰 시점에서 리포펙션 그룹과 마그네토펙션 그룹 사이(‡)의 유의미한 차이를 나타낸다. (**)는 리포펙션 그룹과 마그네토펙션 그룹에 대한 형질감염 후 상이한 시점을 비교한 경우의 유의미한 차이를 나타낸다.
도 6. 리포펙션 및 마그네토펙션 후 AMSC의 무기질화. 형질감염 21일 후 알리자린 레드 염색: (A) 비형질감염된 세포, (B) 마그네토펙션 후 세포 및 (C) 리포펙션 후 세포. (D) 형질감염 후 14일 및 21일째 알리자린 레드 염색의 정량. 비형질감염된 세포와 형질감염된 세포 사이의 유의미한 차이를 (*)로 표시하고 상이한 형질감염된 세포들 간의 비교를 (
도 7. 인핸서-대-cmRNA v/w 비 4와 5 μg hBMP-2-또는 tomato N1-cmrna/디스크의 용량으로 DF-Gold/cmrna 리포플렉스를 이용한 3 mm 지방 디스크의 형질감염. (A) tomato N1 cmRNA의 복합체로의 형질감염 후 24시간째에 취해진 지방 디스크의 형광 현미경 영상. 스케일 바는 500 μm를 나타낸다. DF-Gold/hBMP-2 cmRNA 복합체를 이용한 지방 디스크 리포펙션 후 골-관련 유전자 발현의 유도. (B) hBMP-2, (C) RunX2, (D) ALP 및 (E) Coll I의 발현에 있어서 배수 증가. 총 RNA를 추출하고 형질감염 후 3일 및 7일째에 RT-PCR을 수행하였다. 발현은 비형질감염된 대조군 대비 배수 유도로서 보고된다. 모든 값을 베타-튜불린에 대해 정규화하였다. (*)는 ALP 및 Coll I 발현에 대해 형질감염 후 3일째와 7일째 사이의 유의미한 차이를 나타낸다.
도 8. DF-Gold/cmRNA 리포플렉스 및 DF-Gold/SO-Mag6-115/cmRNA 자성 트리플렉스로의 형질감염 후 상이한 시점에서 AMSC에서 생산된 hBMP-7. 생산된 hBMP-7을 적용된 hBMP-7 cmRNA 용량 (20 및 32 pg/세포)에 대해 정규화하였다.
도 9. DF-Gold/hBMP-7 cmrna 리포플렉스로의 리포펙션 및 SO-Mag6-115/DF-Gold/hBMP-7 cmRNA 트리플렉스로의 마그네토펙션 후 AMSC의 무기질화. 사용된 cmRNA의 용량은 20 및 32 pg/세포였다. 형질감염 21일 후 알리자린 레드 염색: (A) 비형질감염된 세포, (B-C) 리포펙션 후 세포 및 (C-D) 마그네토펙션 후 세포.
도 10. DF-Gold/ MetLuc mRNA 리포플렉스로 AMCS의 형질감염 후 상이한 시점에서 MetLuc 발현. 시험된 DF-Gold-대-mRNA v/w 비는 2.5, 5, 10 및 20 pg/세포의 적용된 mRNA 용량에서 μg mRNA당 0.5 내지 5 μl DF-Gold의 범위 내였다.
도 11. DF-Gold/MetLuc mRNA 리포플렉스로 BMSC의 형질감염 후 상이한 시점에서 MetLuc 발현. 시험된 DF-Gold-대-mRNA v/w 비는 2.5, 5, 10 및 20 pg/세포의 적용된 mRNA 용량에서 μg mRNA에 대한 0.5 내지 5 μl DF-Gold의 범위 내였다.
도 12. 4의 DF-Gold-대-mRNA v/w 비에서 DF-Gold/eGFP mRNA 리포플렉스로의 형질감염 (리포펙션) 및 0.5의 Fe-대-mRNA w/w 비에서 DF-Gold/SO-Mag6-115/eGFP mRNA 자성 트리플렉스로의 형질감염 (마그네토펙션) 24시간 후 (A) AMSC 및 (B) BMSC에 대한 유세포 분석 히스토그램.
도 13. 뼈 임플란트 재료 위에 그라프팅된 BMP-2 RNA-μ-CT 결과-전골. 처리 2주 후 모든 그룹에 대해 수득된 μCT 3D 재구성 및 종단면. (A) 피브린, (B) C12-(2-3-2)/FFL cmRNA, 및 (C) C12-(2-3-2)/hBMP-2 cmRNA. 캘러스 (callus) 형성 면적을 모든 샘플에 대해 ImageJ 소프트웨어에서 동일한 역치 (2500-4500)를 설정함으로써 강조하였다. (D) 캘러스 형성의 양을 ImageJ로 정량하였다.
도 14. 콜라겐 스폰지 상에 복합체 로딩 및 세포 접종. (A) Luc SNIM RNA 리포플렉스가 비로딩 및 로딩된 진공-건조된 콜라겐 스폰지의 주사 전자 현미경 (리포플렉스의 평균 유체역학 직경: 65,8 nm). (B) 10% tdTomato mRNA가 FITC 표지되어 있는 tdTomato mRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지 상에 접종 30시간 후 NIH3T3 세포의 형광 현미경. (C) 콜라겐 스폰지 상에 접종 7일 후 NIH3T3 세포의 헤마톡실린 염색. 세포의 핵을 헤마톡실린을 이용해 짙은 청색으로 염색하였다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다. 상부 패널의 좌측 가장자리는 콜라겐 스폰지의 표면을 나타낸다.
도 15. eGFP mRNA-복합체가 로딩된 콜라겐 스폰지 상에 NIH3T3 세포의 접종 48시간 후 형질감염 효율 및 세포 생존력. (A) 4× 배율 (JULY™) 하의 형광 현미경: NIH3T3 세포에서 eGFP mRNA의 발현. (B) FACS 분석: 비형질감염된 세포에 비해, 100 pg/세포 eGFP mRNA로 형질감염된 NIH3T3 세포에서 평균 형광 감도의 명백한 이동. (C) FACS 분석: 형질감염 효율에 대한 mRNA 용량의 상관관계. (D) 및 (E) PI 염색의 FACS 분석 및 WST 어세이는 각각 약 60-70%의 세포 생존력을 나타낸다. 모든 데이터는 3회 반복의 값으로부터의 평균 ± SD이다.
도 16. NIH3T3 세포를 사용한 2D 대 3D 배양에서 메트리디아 루시퍼라제 mRNA의 발현 역학. 상청액을 형질감염 후 매 24시간마다 수집하고, Met luc의 발현을 즉시 측정하였다. 나타난 모든 데이터는 3회 반복의 값으로부터의 평균 ± SD이다. Y 축은 로그자 (logarithmic scale)이다.
도 17. 상이한 세포 밀도로 MSC를 사용한 콜라겐 스폰지 내 메트리디아 루시퍼라제의 발현 역학. 이 실험에 사용된 mRNA 리포플렉스의 양은 50 pg/세포이었다. 상청액을 형질감염 후 24시간 마다 수집하고 -20℃에 보관하였다. 8일 후, 메트리디아 루시퍼라제의 발현을 모든 시점에서 측정하였다. 나타난 데이터는 3회 반복의 값으로부터의 평균 ± SD이다. Y 축은 로그자이다.
도 18. 생체 내 골 재생에 대한 면역조직화학적 분석. (A) 무기질화된 골 조직의 염색. 적색 직사각형은 스폰지가 대퇴골 결함에 배치된 위치를 보여준다. 흑색 영역은 고도로 무기질화된다. (B) 골막 영역 내 캘러스 형성. (C) 섬유 조직 형성의 분절. (D) 유골 (osteoid) 형성의 분절. 값들을 T-검정을 이용하여 비교하였다 (n= 9).
도 19. hBMP2 mRNA-로딩된 콜라겐 스폰지 상에 접종된 MSC에 의한 hBMP2의 발현. 상이한 3종의 용량을 시험하였다. 나타난 데이터는 3회 반복의 값으로부터의 평균 ± SD이다.
도 20. 시험관 내 골 분화. RT-qPCR 결과: hBMP2 cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지 상에 세포의 접종 후 7일 및 14일째에 골아세포 마커의 발현의 배수 증가. 값은 3회 반복의 평균 ± SD이다. (A) MC3T3-E1 세포: 값을 GAPDH의 발현에 대해 정규화하였다. 데이터를 3D에서 비형질감염된 세포에 대한 배수 증가로 표시하였다. (B) MSC: 값을 β-튜불린의 발현에 대해 정규화하였다. 데이터를 2D에서 비형질감염된 세포에 대한 배수 증가로 표시하였고, 다중 t-검정을 이용하여 비교하였다.
도 21. 생체 내 골 재생. (A) 이식 후 2주째에 래트 대퇴골의 μ-CT 영상. 적색 부분은 새로 형성된 뼈를 나타낸다. (B) 이식 후 2주째에 골 형성 면적의 평가를 위한 μ-CT 분석. t-검정을 사용하여 값을 비교하였다 (n= 9).
도 22. 콜라겐 스폰지 상에서 진공-건조된 mRNA 리포플렉스의 안정성. 2시간 동안 진공-건조된 후, 진공 밀봉되고 RT에서 보관된 Metluc mRNA-로딩된 콜라겐 스폰지. 진공-건조 후 상이한 시점에서, 플레이트를 개봉하고 NIH3T3 세포를 스폰지 위에 접종하였다. Met Luc의 발현을 세포 접종 24시간 후 측정하였다. 나타난 모든 데이터는 3회 반복의 값으로부터의 평균 ± SD이다. Y 축은 로그자이다.
도 23. 진공-건조 전 및 후에 콜라겐 스폰지의 SEM 사진. 스케일 바는 200 μm를 나타낸다.
도 24. 콜라겐 스폰지 상의 NIH3T3 세포에서 SNIM Metluc 또는 비변형된 Metluc mRNA 중 하나로의 형질감염 후 Metluc 발현의 역학. 상청액을 형질감염 후 24시간 마다 수집하고, -20℃에서 보관하였다. 10일 후, 메트리디아 루시퍼라제의 발현을 모든 시점에 대해 측정하였다. 나타난 데이터는 3회 반복의 평균 ± SD이다. Y 축은 로그자이다.
도 25. 콜라겐 스폰지 상의 NIH3T3 세포에서 Metluc 발현의 역학에 대한 스폰지의 진공-건조 효과. 상청액을 형질감염 후 24시간 마다 수집하고, -20℃에서 보관하였다. 5일 후, 메트리디아 루시퍼라제의 발현을 모든 시점에 대해 측정하였다. 나타난 데이터는 3회 반복의 평균 ± SD이다. Y 축은 로그자이다.
도 26. FACS 분석: 래트의 지방 조직으로부터의 분리 후 MSC에 대한 양성 (CD90 및 CD29), 및 음성 (CD45, CD106 및 CD31) 마커의 조사. IgM,K-FITC, IgG1,K-FITC 및 IgG1,K-PE를 대조군으로 사용하였다.
도 27. 분화 동안 스폰지의 현미경적 형태 변화이다. 스폰지 상에 MSC 접종 후 7일째에, 96-웰 플레이트로부터 사진을 찍었다.
도 28. 뼈의 상이한 부분에 hBMP2 cmRNA 리포플렉스가 로딩된 콜라겐 스폰지의 생체 내 골형성 효과. T-검정을 이용하여 값을 비교하였다.
도 29. μ-CT: 수술 후 2주째에 생체 내 골재생을 위한 hBMP2 cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지의 효과. 노란색 부분이 새로 형성된 뼈이다.
도 30. (A) 래트 대퇴골의 속질에서 hBMP-2 코딩 cmRNA가 로딩된 임플란트 위에서 조직의 무기질화가 유의미하게 증가한다. (B) 골막 조직 형성이 hBMP-2 코딩 cmRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지의 이식의 결과로서 유의미하게 증가한다. (C) 총 용적 당 섬유상 조직 (Fb.V/TV)이 hBMP-2에 대한 cmRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지로의 처리 시 유의미하게 증가한다. (D) 총 용적당 유골의 형성 (OV/TV)이 hBMP-2를 코딩하는 cmRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지로의 처리 시 증가한다. (E) 더 적은 골 흡수는 hBMP-2를 코딩하는 cmRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지로의 이식에 대한 결과와 상반된다.
본 명세서에서, 특허 출원을 비롯한 다수의 문헌이 인용된다. 이들 문헌의 개시는, 본 발명의 특허성과 관련이 있는 것으로 고려되지는 않지만, 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 더욱 구체적으로, 모든 참조된 문헌은 각각의 개별적인 문헌이 참조로서 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시되었던 것과 동일한 수준으로 참조로서 포함된다.
본 발명은 단지 예시적이고 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 고려되지 않는 하기 실시예를 참조하여 이제 기술될 것이다.
실시예
1.
재료 및 방법 (특히
실시예
1 내지 7과 관련됨)
재료. 둘베코의 변형된 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM), 칼슘 및 마그네슘 무함유 둘베코의 인산염-완충된 식염수 (DPBS), 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린/스트렙토마이신 (P/S) 및 아큐타제 (Accutase) 용액을 PAA Laboratories GmbH (Pasching, Austria)로부터 구입하였다. Opti-MEM 배지 및 콜라게나제 타입 II를 GibcoTM (Invitrogen, CA, USA)로부터 입수하였다. Ficoll-PaqueTM를 GE Healthcare Ltd. (CT, USA)로부터 구입하였다. 테트라에틸 오르쏘실리케이트 (TEOS), 3-(트리히드록시실릴) 프로필메틸포스포네이트 (THPMP) 및 분지된 폴리에틸렌이민 (bPEI)을 Sigma-Aldrich (MO, USA)로부터 입수하였다. 다른 시약 및 재료는 달리 특정되지 않는 한 Sigma-Aldrich로부터 입수하였다. 24-웰 자성 플레이트 (OzBiosciences, Marseille, France)를 마그네토펙션 실험에 사용하였다.
동물. 암컷 스프라그 다우리 (Sprague Dawley) 래트 (250-300 g)를 Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germany)로부터 구입하고 지방 및 골수 중간엽 줄기세포 분리 둘 모두에 사용하였다. 동물을 조직 수집 직전에 이산화탄소 질식에 의해 안락사시켰다. 사용된 절차는 지역윤리위원희에 의해 허가되었고 동물 보호를 위한 독일법에 따라 수행되었다.
래트 -유도된 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양. 골수 중간엽 줄기세포 (BMSC)를 이전에 기술된 프로토콜을 이용해 분리하였다 (Balmayor, Biores Open Access 2(5), 2013, 346-355). 간략히는, 대퇴골 및 경골을 모든 주변 조직으로부터 씻어내고, 양 골단 (epiphyses)에서 절단하고 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 2.5 mg/ml 콜라게나제 타입 II를 함유하는 살균 DMEM 중에서 인큐베이션하였다. 일단 골수를 완전 DMEM (즉, 10% FBS 및 1% P/S가 보충됨)으로 세척하였으면, 세포를 침강시키고 신선한 완전 DMEM에 재현탁하였다. 이어서, 단핵 세포 분획을 Ficoll-PaqueTM (500 g, 30분)를 사용한 밀도 구배 원심분리에 의해 수집하고, 세척하고 완전 DMEM 중에 재현탁하였다. 3000개 세포/cm2으로 세포를 도말하였다. 24시간 배양 후, 배양 배지를 교체하여 비-부착성 세포를 제거하였다.
지방 중간엽 줄기세포 (AMSC)를 분리하기 위해, 복부 영역으로부터 수집된 지방 조직을 작은 mm 크기 조각으로 절단하고 살균 DPBS를 함유하는 팔콘 튜브로 옮겼다. DPBS로 수회 세척 단계 후, 지방 조각을 37℃에서 30분간 0.5 mg/ml 콜라게나제 타입 II 용액 중에서 인큐베이션하였다. 이어서, 완전 DMEM 배양 배지를 첨가하여 콜라게나제 작용을 중지시키고 혼합물을 600 g에서 10분간 원심분리하였다. 수득된 세포 펠렛을 완전 DMEM 배양 배지 중에 재-현탁하고 세포 현탁액을 40 μm 세포 스트레이너 (strainer) (BD Falcon, NJ, USA)를 통해 여과하고 3000개 세포/cm2로 도말하였다.
BMSC 및 AMSC 두 세포 유형 모두 완전 DMEM을 사용하여 37℃ 및 5% CO2에서 증폭하고 배양하였다. 형질감염 및 분화 실험을 위해, 세포를 최대 계대 6에서 사용하였다. 배양 동안, 배지를 매 3일 마다 교체하고 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다. 분리된 두 MSC의 특성화를 Balmayor (2013, 상기 인용문 중)에 의해 공개된 바와 같은 하기에 기술된 프로토콜에 따라서 수행하였다.
생체 외 인간 지방 조직 배양. 신선한 인간 피하 지방 조직을 독일의 뮌헨공과대학교 (Technical University of Munich, Germany)에서 의과대학 "Klinikum rechts der Isar"의 지역윤리위원회에 의해 승인된 환자의 서면 동의서 하에서 재건 수술을 받은 건강한 환자로부터 수득하였다.
인간 지방 조직을 살균 조건하에서 피부 및 혈관으로부터 해부하였다. 이어서, 조직을 대략 1 mm 두께 슬라이스로 조심스럽게 절단하였다. 다음에, 피부 생검 펀치 (3 mm)를 사용하여 Evans (2009, 상기 인용문 중)에 의해 기술된 프로토콜에 따라서 균일한 3 mm × 1 mm 원형 외식편을 펀칭-아웃하였다. 수득된 조직 외식편을 살균 DPBS로 3회 세척하고 35 mm 직경의 페트리 디쉬에 두었다. 이어서, 이들을 37℃ 및 5% CO2에서 최대 7일간 완전 DMEM 중에서 배양하였다. 배양 배지 교환을 2시간 후에 최초로, 그 후에는 배양 매 24시간 마다 수행하여, 충분히 산소화된 상태를 확보하였다 (Puri, J Lipid Res 48(2), 2007, 465-471).
산화철 실리카 자성 나노입자의 합성. 산화철 실리카 코어-쉘 자성 나노입자를 이전에 기술된 바와 같이 합성하였다 (Mykhaylyk, Liposomal magnetofection. In: Weissig V (ed) Liposomes, Methods in Molecular Biology, vol. 605. Humana Press-Springer, New York 2010, 487-525; Mykhaylyk, Pharm Res 29(5), 2012, 1344-1365). 먼저, 철 염의 수용액으로부터 Fe(II)/Fe(III) 수산화물의 침전 및 자철광 (magnetite) "코어" 나노입자의 전환을 수행하였다. 이어서, 나노입자의 표면을 테트라에틸 오르쏘실리케이트 (TEOS) 및 3-(트리히드록시실릴) 프로필메틸포스포네이트 (THPMP)의 공-응축에 의해 안정화시켜 표면 포스포네이트기를 갖는 실리콘 산화물 코팅을 초래한다. 마지막으로, 25-kD 분지된 폴리에틸렌이민 수용액 (pH 7.0)을 11.5%의 PEI-대-철 w/w 비로 적용하여 입자의 표면을 가식하였다 (decorate). SiOx/포스포네이트-PEI 코팅을 갖는 결과의 자성 나노입자는 또한 SO-Mag6-115 mnp 또는 mnp로 언급될 것이다. 이들 나노입자의 상세한 물리-화학적 특성화는 Mykhaylyk (상기 인용문 중)에 의해 보고된 바 있다. 간략히, 입자는 Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS (Herrenberg, Germany)를 사용한 동적 광산란 (DLS)에 의해 결정되는 바와 같이 물 중에서 현탁될 때 평균 수화된 직경 Dh=97±14 (PDI=0.32±0.03) 및 동전기적 전위 =+34.1±2.7을 갖는다.
MetLuc , eGFP , tomato 및 인간 BMP-2를 인코딩하는 화학적으로 변형된 메신저 RNA의 생성. 메트리디아 루시퍼라제 (Metridia longa)의 코돈-최적화된 개방형 해독틀 및 인간 BMP-2 mRNA를 함유하는 플라스미드 벡터를 합성하고 GeneArt (Life Technologies, CA, USA)에 의해 pVAXA120의 BamHI-EcoRI 부위 내로 클로닝하였다. eGFP를 NotI-HindIII를 사용하여 peGFP-N1 (Clontech, CA, USA)로부터 잘라내고 세미-블런트 라이게이션 (semi-blunt ligation)을 통해 pVAXA120의 EcoRI-HindIII 내로 클로닝하였다. Tomato의 코딩 서열을 ptd Tomato-N1 (Clonetech, CA, USA)로부터 NotI-KpnI을 이용해 잘라내고 세미-블런트 라이게이션을 통해 pVAXA120의 EcoRI-KpnI 부위 내로 라이게이션하였다. 벡터 pVAXA120은 이전에 기술된 바 있고 (Kormann, Nat Biotechnol 29(2), 2011, 154-157) pVAX1 (Invitrogen, CA, USA)의 PstI-NotI 부위들 사이에 120 As의 스트레치 (stretch)를 클로닝함으로써 작제하였다.
시험관 내 전사 (IVT)를 위한 주형을 생성하기 위하여, 상기에 언급된 플라스미드 DNA (pDNA) (즉, pVAXA120-MetLuc, pVAXA120-eGFP, pVAXA120-Tomato 또는 pVAXA120-hBMP-2)를 NotI을 이용한 제한효소 분해에 의해 선형화하였다. 주형 pDNA를 클로로포름 에탄올 침전에 의해 더욱 정제하였다. IVT를 RiboMAX™ 대규모 RNA 생산 시스템-T7 (Promega, WI, USA)을 사용해 수행하였다. 캡핑된 mRNA의 합성을 위해서, 안티-리버스 (anti-reverse) 캡 유사체 (ARCA, m7,3'- OGpppG, Jena Biosciences, Jena, Germany)를 사용하여 오로지 목적하는 방향으로만 캡의 도입을 보장하였다. 변형된 mrna를 생성하기 위해, 시티딘-5'-트리포스페이트 및 유리딘-5'-트리포스페이트의 25%를 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트 및 2-티오유리딘-5'-트리포스페이트 (Jena Biosciences, Jena, Germany)로 대체하였다. 결과의 변형된 mrna의 정제를 암모늄 아세테이트 침전에 의해 수행하였다. 생산된 변형된 mrna의 온전성 (Integrity) 및 크기를 천연 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하였다.
형질감염 복합체의 형성 및 특성화. 리포플렉스 및 폴리플렉스를 선택된 지질 형질감염 시약, 예컨대, 리포펙타민 2000 (Invitrogene, CA, USA), DreamFect Gold (DF-Gold) 및 Dogtor (OzBiosciences, Marseille, France) 또는 bPEI와 각각의 cmrna를 혼합하여 항상 신선하게 제조하였다. cmRNA에 대한 리포좀 형질감염 시약의 사용된 부피-대-중량 비는 제조사의 지침 (즉, 각각 μg mRNA당 2 μl 리포펙타민 2000 또는 4 μl DF-Gold 또는 4 μl Dogtor)에 따라서 선택하였다. bPEI의 경우에, 물 중의 10 mg/ml 용액을 제조하고 사용 전에 pH를 7.0으로 조절하였다. bPEI와 cmRNA 용액을 N/P=8로 혼합한 후 이어서 실온에서 20분간 인큐베이션하여 복합체 어셈블링을 허용함으로써 복합체를 제조하였다. 자성 리포플렉스를 제조하기 위하여 동일한 부피의 SO-Mag6-115 mnp 수성 현탁액 (0.1 μg Fe/μl) 및 DF-Gold 희석액 (물로 80 μl DF-Gold를 100 μl로 희석함)을 혼합하였다. 이어서, 동일한 부피의 cmrna 희석액 (0.2 μg/μl 물 또는 150 mM NaCl 또는 비-보충된 Opti-MEM)을 첨가하고, 조심스럽게 혼합하고, 혼합물을 실온에서 20분간 보관하였다. SO-Mag6-115/DF-Gold/cmrna 복합체 내 성분들의 결과 비는 0.5:4:1 (철 중량/부피/중량)이었다. 복합체의 특성을 DLS 방법을 이용하여 이들의 평균 유체역학 직경 (Dh), 다분산도 (PDI) 및 제타 전위 ()에 대해 분석하였다 (표 1).
AMSC 및 BMSC에서 형질감염 프로토콜. 형질감염을 위해, AMSC 및 BMSC를 24-웰 플레이트에 1.25×104 세포/cm2 로 접종하였다. 24시간 인큐베이션 후, 세포 배양 배지를 신선한 비-보충된 Opti-MEM으로 교체하였다. 20 pg/세포 cmrna (즉, MetLuc, eGFP 또는 tomato cmrna)를 함유하는 100 μl의 리포플렉스 또는 bPEI-복합체를 상기에 기술된 바와 같이 제조하고 세포에 첨가하였다. 형질감염 5시간 후, 배지를 완전 DMEM으로 교체하였다. 세포를 결과 평가전까지 최대 10일간 표준 조건하에서 추가로 배양하였다. 형질감염 효율을 더욱 증가시키기 위하여, SO-Mag6-115 mnp를 상기에 기술된 바와 같은 0.5:4:1의 철 중량/부피/중량 비로 자성 SO-Mag6-115 입자/DF-Gold/cmrna 리포플렉스 내로 지질 형질감염 시약 및 cmRNA와 연합시켰다 (associated). 형질감염을 위해, 20 pg cmrna/세포를 함유하는 100 μl의 자성 리포플렉스 (즉, MetLuc, eGFP 또는 tomato cmrna)를 배양 중인 AMSC 또는 BMSC에 첨가하고 24-웰 자성 플레이트 위에 세포 배양 플레이트를 30분간 놓아 둠으로써 자기장을 인가하였다. 이어서, 자성 플레이트를 제거하고 계속 형질감염이 되게 하였다. 전체 연구에 걸쳐서 모든 형질감염은 3회 반복으로 수행하였다. 형질감염 효율에 대한 마그네토펙션의 효과를 정량적으로 특성화하기 위하여, MAI를 하기와 같이 계산하였다:
여기서 AUC는 각각 마그네토펙션 (MF) 및 리포펙션 (LF) 후 표적 단백질 (MetLuc 및 hBMP-2) 발현의 역학에 대한 면적하 곡선 값을 나타낸다.
본 연구의 목적 중 하나는 형질감염 효율의 측면에서 AMSC 및 BMSC를 비교하는 것이었다. 따라서, mRNA에 대한 리포좀 형질감염 시약의 사용된 부피-대-중량 비는 두 세포 유형 모두에 대해 동일하도록 제조사의 지침에 따라서 선택하였다. 그러나, 형질감염 프로토콜의 최적화는 2.5, 5, 10 및 20 pg/세포의 용량에서 핵산 μg당 0.5 내지 5 μl의 형질감염 시약의 DF-Gold-대-cmRNA 비를 이용하여 두 세포 모두에 대해 추가로 수행하였다. 도 10 내지 12에 대한 설명 및 각각의 실시예 부분을 참조한다.
형질감염된 세포에서 메트리디아 루시퍼라제 활성의 평가. 메트리디아 루시퍼라제는 코엘렌테라진 (coelenterazine)의 산화를 촉진하여 코엘렌테라미드 (coelenteramide), CO2 및 빛 (μmax 480 nm)을 생산한다. 이 반응을 토대로, 코엘렌테라진은 다수의 분비된 루시퍼라제의 검출을 위한 기질로 사용될 수 있다 (Inouye, Protein Expr Purif 88(1), 2013, 150-156). 본 연구에서, 천연 코엘렌테라진 (Synchem OHG, Felsberg, Germany)을 사용하여 MetLuc 활성을 분석하였다. 간략히는, 50 μl의 상청액당 동일 부피 (형질감염 5시간, 1일, 2일, 3일, 5일 및 7일 후에 형질감염된 세포로부터 수집됨) 및 코엘렌테라진 용액 (pH 7.0에서 탈기된 인산나트륨 완충제 중의 50 μm)을 백색 투명한 96-웰 플레이트에서 혼합하였다. 발광 강도를 PerkinElmer Wallac Victor 1420 멀티라벨 계수기 (MA, USA)를 사용하여 실온에서 단위 시간당 광 단위 또는 상대적 광 단위 (relative light units, RLU)로 측정하였다. 모든 샘플을 3회 반복으로 측정하였다. MetLuc 활성을 하기 식을 이용하여 계산된 정규화된 상대적 광 단위 (Normalized Relative Light Units)로 표현하였다:
여기서 RLU은 장비로부터 수득된 값이고, V 1 은 측정 수행을 위해 수집된 상청액의 부피에 상응하고, V 2 는 총 상청액 부피 (ml)이다.
증강된 녹색 형광 단백질 ( eGFP ) 양성 세포. eGFP-양성 세포의 비율 측면에서 형질감염 효율을 평가하기 위하여, eGFP cmRNA로 형질감염된 세포를 유세포 분석으로 분석하였다. 이를 위해, 형질감염 24시간 후 세포를 DPBS로 2회 세척하고 24-웰 플레이트의 웰당 100 μl 아큐타제를 사용하여 탈착시켰다. 이어서, 세포 배양 플레이트를 500 g에서 10분간 원심분리하고 세포를 DPBS (2% FBS)에 재현탁하였다. 유세포 분석을 샘플당 적어도 5,000 사례 (event)를 수집하는 MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany) 상에서 수행하였다.
증강된 녹색 형광 단백질 ( eGFP ) 및 tomato 발현 세포. eGFP 및 tomato cmrna로 형질감염된 AMSC 및 BMSC를 형광 현미경 (Biorevo BZ9000, Keyence, Osaka, Japan) 하에서 형질감염 후 24시간째에 영상화하였다.
화학적으로 변형된 mRNA의 복합체의 세포독성 스크리닝. 세포독성 스크리닝을 상이한 MetLuc cmRNA 복합체로 AMSC를 형질감염시킨 후 이어서 제조사의 지침에 따라서 3회 반복으로 수행되는 표준 MTS 어세이 (CellTiter 96, Promega, WI, USA)를 이용하여 형질감염 5 및 24시간 후 세포 호흡 활성 (생존력)의 분석에 의해 수행하였다. 실험적 세부사항은 본원의 다른 곳에서 확인된다.
형질감염된 세포에 의한 BMP-2 생산. 상기에 기술된 리포펙션 및 마그네토펙션 프로토콜을 사용하여 hBMP-2 cmRNA를 AMSC 내로 전달하였다. 20 또는 32 pg hBMP-2 cmRNA/세포를 사용하여 형질감염을 수행하였다. 정의된 시점에서, 분비되고 세포 연합된 인간 BMP-2의 수준을 각각 상청액 및 세포 용해물에서 제조사의 지침에 따라 효소-연계 면역흡착 어세이 (ELISA, Quantikine, R&D Systems, MN, USA)로 결정하였다. 450 nm에서의 흡광도를 PerkinElmer Wallac Victor 1420 멀티라벨 계수기 (MA, USA)에서 측정하였다. 파장 수집을 570 nm에서 설정하였다. 실험을 3회 반복으로 수행하고, 단백질 함량을 표준 곡선 (범위: 0-4000 pg/ml hBMP-2)을 사용하여 결정하였다.
나아가, 세포를 또한 골형성 배지 (즉, 2% FBS, 10 mM β-글리세로포스페이트, 200 μm 아스코르브산)의 존재하에서 형질감염시켰다. 골형성 배지를 덱사메타손 부재하에서 제조하였다. 따라서, 관련 정보가 이후의 실험에서 세포-방출된 hBMP-2의 골형성능에 대해 수득될 수 있다.
일차 인간 조직 내로 hBMP -2 cmRNA의 형질감염. 외식편 형질감염을 약간의 변형을 가하여 Evans (2009, 상기 인용문 중)에 의해 이전에 기술된 프로토콜에 따라서 수행하였다. 간략히는, 세척된 인간 지방 조직 디스크를 48-웰 플레이트 내에 배치하고 DF-Gold 리포플렉스 (4 μl DF-Gold/1 μg cmRNA)를 사용하여 5 μg hBMP-2 cmRNA 또는 tomato cmrna로 형질감염시켰다. 복합체를 함유하는 80 μl 현탁액을 조직 디스크 내로 직접 주입하였다. 플레이트를 인큐베이터에 1시간 동안 다시 놓아 두었다. 그 후에, 500 μl의 신선한, 비-보충된 Opti-MEM을 형질감염된 외식편을 함유하는 각 웰에 첨가하고 추가 5시간 동안 계속 인큐베이션하였다. 그 후에 배양 배지를 골형성 배지로 교환하고 외식편을 3일 및 7일간 이전에 기술된 바와 같이 추가 배양하였다. 조직 외식편의 모든 형질감염은 신선하게 수집된 조직에 대해 살균 조건하에서 실시하였다.
tomato cmrna로 형질감염된 지방 조직 디스크를 형광 현미경 (Biorevo BZ9000, Keyence, Osaka, Japan) 하에서 형질감염 후 24시간째에 영상화하였다.
시험관 내 골형성. hBMP-2 cmRNA-형질감염된 AMSC를 골형성 자극 하에서 배양하여 시험관 내 골형성을 유도하는 hBMP-2 cmRNA의 능력을 평가하였다. 리포펙션 및 마그네토펙션 방법 둘 다를 이전에 기술된 바와 같이 hBMP-2 cmRNA를 세포 내로 전달하는데 사용하였다. 형질감염 5시간 후, 배지를 덱사메타손 부재의 골형성 배지로 교환하였다. 형질감염된 세포를 최대 21일간 골형성 배지 하에서 유지하고 배지를 매 3일마다 부분적으로 교환하였다 (즉, 절반 부피를 신선한 골형성 배지로 교체하였다). 동일한 조건하에서 배양된, 비형질감염된 세포를 대조군으로 사용하였다. 시험관 내 골형성에 이어서 골-관련 유전자의 발현 및 무기질화의 발생을 평가하였다.
알칼라인 포스파타제 (ALP) 활성. 알칼라인 포스파타제 활성을 형질감염 후 3, 7, 및 12일째에 평가하였다. 이 목적을 위하여, 알칼라인 포스파타제 비색 어세이 (Abcam, Cambridge, UK)를 제조사의 지침에 따라 사용하였다.
본 어세이는 포스파타제 기질로서 p-니트로페닐 포스페이트 (pNPP)의 사용을 토대로 한다. pNPP는 ALP의 존재 시에 탈인산화된다. 그 결과, 노란색 p-니트로페놀 (pNP) 화합물이 형성되고, 이는 405 nm의 최대 흡광도에 의해 특성화된다. ALP 어세이를 제조사의 지침에 따라서 수행하였다. 간략히는, 형질감염된 세포를 DPBS로 2회 세척하고 이어서 실온에서 20분간 어세이 완충제와 함께 인큐베이션하였다. 세포 단층의 우수한 균질화 후, 샘플을 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. pNPP 용액을 샘플 및 대조군 샘플에 첨가하고 실온에서 60분간 인큐베이션하고 빛으로부터 보호하였다. pNP 생산을 상기에 이미 기술된 바와 같이, 멀티라벨 계수기를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. pNP 함량 값을 표준 곡선을 근거로 계산하였다. 3회 반복을 모든 경우에서 평가하였다.
나아가, ALP를 37℃에서 30분간 패스트 블루 (Fast blue) B 염 및 나프톨 AS-MX 포스페이트의 염색 혼합물 (Cox, J Histochem Cytochem 47(11), 1999, 1443-1456)과의 인큐베이션에 의해 고정된 세포에서 염색하였다. 염색 용액을 DPBS로 세척하여 제거하고 세포를 현미경 하에서 분석하였다. 보라색으로 염색된 면적을 양성으로 간주하였다.
정량적 실시간 PCR. hBMP-2 cmRNA 형질감염 후 3, 7, 14 및 21일째에, 세포를 DPBS로 2회 세척하고 이어서 TRIzol (Life technology, CA, USA)로 용해시켰다. 총 RNA를 페놀/클로로포름 방법을 토대로 분리하였다. RNA 농도 및 순도를 BioPhotometer 플러스 UV 분광광도계 (Eppendorf AG, Hamburg, Germany)를 사용하여 분광광도적으로 결정하였다. 제1-가닥 cDNA를 제조사의 지침에 따라서 First Strand cDNA 합성 키트 (Thermo Scientific, MA, USA)의 사용에 의해 총 RNA로부터 역-전사하였다. 골-관련 유전자의 발현을 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)에 의해 결정하였다. 증폭 프라이머를 표 2에 열거하였다. SsoFast Eva Green Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc., CA, USA)를 사용하여 실시간 PCR을 Bio-Rad CFX96 열 순환기 (Bio-Rad Laboratories Inc., CA, USA)에서 실시하였다.
형질감염된 지방 조직의 경우에, 총 RNA를 형질감염 후 3일 및 7일째에 추출하였다. 세척된 조직을 제조사의 지침에 따라서 RNAlater 시약 (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)으로 수집하였다. RNA 추출 전에, 조직을 휴대용 균질기 (PT1200E Polytron, Kinematica GmbH, Eschbach, Germany)의 사용에 의해 TRIzol 내에서 균질화하였다. RNA 추출, cDNA 합성 및 RT-PCR을 세포에 대해 상기에 언급된 동일한 프로토콜을 사용하여 수행하였다. hBMP-2, RunX2, ALP 및 Coll I의 발현 수준을 분석하였다. 증폭 프라이머를 표 3에 열거하였다.
전체적으로, 베타-튜불린이 참조 유전자로 선택되었다. 데이터를 각각 대조군, 즉 비형질감염된 세포 및 조직에 대한 배수 유도로 표현하였다.
알리자린 레드 염색 및 정량. 형질감염 후 14일 및 21일째에, 알리자린 레드 (Alizarin red) 염색을 수행하여 hBMP-2 cmRNA 복합체로 형질감염된 세포에서 칼슘 침착을 평가하였다. 이들 칼슘 침착은 AMSC의 골형성 분화에 대한 지시자일 것이다. 간략히는, 에탄올-고정된 세포를 실온에서 15분간 알리자린 레드 용액 (DPBS 중의 5 mg/mL)과 함께 인큐베이션하였다. 염색된 세포를 광범위하게 세척하여 비특이적 염색 및/또는 가능한 침전물을 제거하였다. 무기질화된 결절 및 칼슘 침착이 골형성을 나타내는 적색 반점으로 염색된다. 알리자린 레드 염료를 이어서 3시간 동안 실온에서 100 mM 세틸피리디늄 클로라이드로 추출하였다. 그 후에 흡광도를 570 nm에서 측정하였다. 실험을 3회 반복 수행하였고 결과를 비형질감염된 대조군 세포와 비교하여 기록하였다.
통계적 분석. 수득된 모든 값은 평균 ± 표준 편차로 기록된다. GraphPad Prism 버전 6.00 (GraphPad Software, CA, USA)을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 데이터의 정규 분포를 Shapiro-Wilk 검정을 적용하여 분석하였다. 일원분산 분석 (one-way ANOVA)에 이어 Tukey의 다중 비교 검정을 수행하여 상이한 형질감염 시약을 통해 형질감염된 세포의 MetLuc 발현 (도 2A) 및 유세포 분석 결과 (도 3C)를 분석하였다. 또한, 2개의 독립적인 샘플이 분석되었던 경우에는 Student's t 검정을 사용하였다. 모든 통계적 분석은 사용된 소프트웨어의 권고사항에 따라서 수행하였다. p<0.05의 확률을 유의미한 것으로 간주하였다. 면적 하 곡선 (AUC) 값을 Origin Pro 9G 소프트웨어 (Microcal1 software; OriginLab Corp, MA, USA)를 사용하여 계산하였다.
화학적으로 변형된 mrna의 생산. eGFP, Tomato, MetLuc 및 인간 BMP-2를 인코딩하는 cmrna를 공개된 프로토콜 (Kormann, 상기 인용문 중)을 이용하여 생산하였다. 생산된 cmrna의 분자 크기 및 품질을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다 (도 1). 모든 cmrna는 예상된 크기이고 어떠한 분해 (스미어링 (mearing)의 결여) 또는 추가의 부산물 (예측되지 않은 크기의 여분의 밴드)도 검출되지 않았다.
MTS 어세이. 세포 단층을 MTS 시약 용액의 200 μl/웰 (페놀 레드 부재인 무혈청 MEM 중에서 5:1 비)로 처리하고 빛-차단된, 표준 배양 조건하에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰로부터 100 μl의 배지를 96-웰 플레이트로 옮기고 흡광도를 PerkinElmer Wallac Victor 1420 멀티라벨 계수기 (MA, USA)에서 490 nm에서 결정하였다. 라텍스 고무를 세포 사멸 (양성 대조군)의 유도에 사용하였다 (Balmayor, 2013, 상기 인용문 중). 비처리된 세포를 음성 대조군 (즉, 100% 세포 생존력)으로 사용하였다.
생체 내 검정을 위한
cmRNA
제제.
C12-(2-3-2)/ cmrna 리포이드 (lipoid) 제제. 양이온성 지질 ("C12-(2-3-2)"로 언급됨)을 100 mg의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 (0.623 mmol)을 575.07 mg의 1,2-에폭시도데칸 (3.12 mmol, (N-1) 당량. 여기서 N은 올리고(알킬렌 아민)당 2× 양의 일차 아민 + 1× 양의 이차 아민임)와 혼합하여 제조하고 일정한 교반 중의 80℃에서 96시간 동안 혼합하였다. 리포이드 입자를 8:5.29:4.41:0.88의 몰비로 양이온성 지질 C12-(2-3-2), 헬퍼 지질 DOPE 및 콜레스테롤 및 PEG-지질 DMPE-PEG 2k를 사용하여 제제화하였다. 간략히는, 각 지질 스톡 용액의 적당한 부피를 각각 50, 20, 20 및 20 mg/ml의 농도를 달성하도록 100% 에탄올 중에 조합하였다. 최종 부피를 200 μl로 조정하였다. 신속한 용매 교환에 의해 리포좀 형성을 달성하였다. 이어서, 200 μl의 리포좀 혼합물을 시트레이트 완충제 중에서 800 μl의 cmrna (즉, hBMP-2 cmRNA 또는 FFL cmRNA)와 혼합하였다. 최종 cmrna 농도를 17의 N/P 비에서 200 μg/ml로 고정하였다. RT에서 30분간 인큐베이션 후, 리포플렉스를 밤새 물로 투석하였다.
생체 내 검정을 위한 C12-(2-3-2)/ cmrna 리포이드를 함유하는 피브린 클롯. C12-(2-3-2)/cmRNA 복합체를 함유하는 피브린 클롯을 이식 직전에 제조하였다. 따라서, 둘 다 2.5 μg cmRNA를 함유하는, C12-(2-3-2)/hBMP-2 cmRNA 및 C12-(2-3-2)/FFL cmRNA 복합체를 50 μl 피브리노겐 (3000 KIU/mL, Tissucol, Baxter, Unterschleißheim, Germany)과 독립적으로 혼합하고 동결건조하였다. 피브리노겐-cmRNA 분말을 수술 절차를 개시하기 30분 전에 살균수로 재수화하였다. 완전한 균질화 후, 피브리노겐-C12-(2-3-2)/cmrna를 50 μl의 트롬빈 (4 U/mL, Tissucol, Baxter, Unterschlei
heim, Germany)과 혼합하고 2분간 클롯팅을 허용하였다. 대조군으로서, 피브린 클롯을 cmrna의 완전한 부재하에서 상기에 언급된 동일한 절차에 따라서 수득하였다.
비-치명적 크기 결손: hBMP -2 cmRNA 적용 - 생체 내 검정용. 초피질성 (transcortical) 3 mm 비-치명적 크기 골 결손을 살균 조건하에서 생성시켰다. 골 결손을 18마리 수컷 스푸라그-다우리 래트 (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany)의 대퇴골 골간의 중앙에 쌍방으로 생성시켰다. 650과 750 g 사이의 체중을 갖는 래트를 무작위하고 3개 그룹 (각각 n = 6)으로 나누었다: 피브린 (즉, 대조군); 피브린 + 2.5 μg FFL cmRNA 및 피브린 + 2.5 μg hBMP-2 cmRNA.
110 mg/kg 케타민 (Ketanest S, 25 mg/ml, Pfizer, Karlsruhe, Germany) 및 12 mg/kg 자일라진 (Rompun, 20 mg/ml, Bayer, Leverkusen, Germany)의 혼합물의 근육내 주입으로 마취를 유도하였다. 3 mm 드릴 구멍을 대퇴골간 (femur shaft)의 중앙에 만들고 0.9% 염화나트륨 용액 (B-Braun, Melsungen, Germany)으로 씻어 내었다. 그룹에 따라서, 결손을 이식 직전에 생산된 100 μl의 피브린 클롯으로 채웠다. 따라서, 클롯을 겸자를 이용해 에펜도르프 튜브로부터 옮기고 골 결손 내로 배치시켜 완전한 봉합을 보장하였다.
래트는 진통제 처리로서 4일간 1일 1회 피하로 (s.c) 카프로펜 (리마딜, Pfizer, Karlsruhe, Germany) (4 mg/kg)을 투여 받았다.
수술 2주 후 래트를 심장 내 주입에 의한 펜토바르비탈 (120 mg/kg, Eutha77, Essex Pharma, Hamburg, Germany)의 과투여에 의해 일반적인 마취하에서 희생시켰다. 대퇴골을 수거하고 24시간 동안 포르말린 용액 (중성 완충됨, 10%, Sigma-Aldrich, MO, USA) 중에서 보관하였다. 이어서, 샘플을 추가의 처리 전까지 80% 에탄올로 옮겼다.
마이크로 컴퓨터 단층촬영 ( μCT ) 분석 - 생체 내 검정용. 모든 체외 이식된 대퇴골을 마이크로 컴퓨터 단층촬영 분석 (μCT) (μCT 40; Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland)에 적용하였다. 측정을 위해 사용된 설정은 하기와 같이 기술된다. 증가분 (increment)을 0°의 각도로 157 μm로 설정하였다. 영상의 복셀 (voxel) 크기를 665개의 조각 총 개수로 8000 μm로 설정하였다. 따라서, 각 샘플을 축 방향으로 5.32 mm의 총 간격에서 조사하였다. 광선의 통합 시간 (integration time)을 300 ms의 최대값으로 설정하였고 각 측정 시점에 대한 3개의 데이터 세트를 검출하였다 (이들의 평균 값은 후속 계산을 위해 사용됨). μCT 장비를 히드록시아파타이트 환영 (phantom)으로 주 1회 조정하였다.
무기질화된 뼈 및 해면 (trabecular) 캘러스 구조를 소프트웨어 ImageJ (National Institutes of Health, MD, USA)를 이용한 3D 분할 알고리즘으로 분석하였다. μCT 데이터 세트를 Karl Heinz Kunzelmann 박사 (Department of Operative/Restorative Dentistry, Ludwig-Maximilians-University of Munich, Germany)에 의해 호의적으로 제공된 KHK_microCT로 불리는 Plugin에 의해 3D 층 세트 내로 이동시켰다. 무기질화된 뼈 및 캘러스의 밀도 수준을 분리하기 위하여, 회색-스케일 역치를 도입하고 조사되었던 2개의 밀도 간격에 대해 2500-4500의 값들 사이를 설정하였다. BoneJ®로 불리는 또 다른 Plugin을 캘러스 구조의 3D 영상화 및 정량에 이어서 사용하였다. 고려되었던 유일한 수적 가치는 각 표본의 새로이 형성된 캘러스의 양을 비교하기 위한 골 용적 (BV)이었다. 이 양은 상기에 언급된, KHK_microCT plugin에 의해 자동적으로 미터 (metric) 값으로 전환되었다. 캘러스 구조의 상세한 3D 영상을 "3D 뷰어 (viewer)"로 불리는 내장된 Plugin에 의해 입수하였다.
실시예
2.
AMSC
및
BMSC에서의
형질감염을 위한 DF-Gold-대-
mRNA
비의 최적화.
DF-Gold와 mRNA 리포플렉스를 사용한 AMSC 및 BMSC를 위한 형질감염 프로토콜을 더욱 최적화하기 위하여, 다양한 파라미터를 고려하였다. 2.5, 5, 10 및 20 pg/세포의 용량에서 핵산 μg당 0.5 내지 5 μl의 인핸서인 DF-Gold-대-mRNA v/w 비를 조사하였다. 그 결과를 도 10 및 11에 나타내었다. 두 세포 유형 모두의 경우, 20 pg mRNA/세포의 용량이 최적인 것으로 확인되었다. 또한, AMSC에서 5 μl의 DF-Gold /μg mRNA 및 BMSC에서 2 μl의 DF-Gold /μg mRNA가 사용되는 인핸서의 최적량으로 확인되었다.
실시예
3.
리포
- &
마그네토펙션에
의한 줄기세포로의 효율적인
cmRNA
전달.
먼저, 지방-유래 줄기세포 (AMSC)를 cmrna로 형질감염시키는 다양한 시약의 효능을 조사하였다. 도 2A는 형질감염 후 최대 120시간 동안 메트리디아 루시퍼라제의 발현 역학을 나타낸다. 모든 시험된 시약의 경우에, 형질감염 24시간 후 최대 발현이 달성되었다. bPEI가 모든 시약들 중에서 가장 덜 효율적인 시약이고 임의의 측정된 시점에서 bPEI를 이용해 어떠한 유의미한 발현도 관찰되지 않았다 (p>0.05). 다른 지질 기반 시약들은 결과의 MetLuc 발현 역학에서 달랐다. 가장 높은 발현이 24시간 후에 리포펙타민 2000을 이용해 관찰된 반면 (p<0.0001), 48시간째 또는 그 이후의 시점에서 낮은 MetLuc 활성을 갖는 가장 짧은 생존을 나타내었다. 반면, DreamFect Gold (DF-Gold) 및 Dogtor은, 리포펙타민 2000에 비해 24시간째에 다소 덜 효율적이지만, 최대 120시간까지 MetLuc 발현을 유지하였다. 형질감염 효율 이외에, AMSC에서 다른 형질감염 시약들의 세포독성이 또한 시험되었다. 리포펙타민 2000을 이용한 MetLuc cmRNA 복합체는 5시간 이내에 75% 미만으로 감소된 세포 생존력을 가져 가장 독성이었다 (도 2B). DF-Gold 및 bPEI 복합체는 측정된 시점 둘 다에서 80% 초과의 세포 생존력을 가져 중등의 세포독성을 초래하였다. 형질감염 24시간 후에 DF-Gold-형질감염된 세포와 비형질감염된 대조군에 대한 세포 생존력 사이에 어떠한 통계적으로 유의미한 차이도 관찰되지 않았다 (p=0.06).
더 긴 전이유전자 발현 (형질감염 후 최대 120시간) 및 낮은 세포독성의 바람직한 특성에 근거하여, 중간엽 줄기세포 (AMSC 및 BMSC)를 cmrna로 형질감염시키는데 DF-Gold를 선택하였다. 세포당 cmrna의 용량을 두 세포 유형 모두에 대해 최적화하였다. 결과는 형질감염을 위한 최적 용량으로서 20 pg/세포를 나타내었다. 데이터를 도 10 및 도 11에 나타내었다. DF-Gold-대-cmRNA v/w 비는 AMSC와 BMSC 사이의 더욱 정확한 비교를 위해 4 (제조사의 지침)로 고정하였다. 그럼에도 불구하고, 이 비는 또한 두 세포 유형 모두에 대해 개선되었다. 결과는 AMSC의 경우 5, BMSC의 경우 2의 v/w 비를 나타내었다 (도 10 및 도 11).
플라스미드 DNA (pDNA)는 유전자 전달용으로 통상적으로 사용된 비-바이러스 벡터이기 때문에, MetLuc 발현을 MetLuc cmRNA 또는 그의 플라스미드 대응물 (pVAXA120-MetLuc) 중 하나로의 형질감염 후 비교하였다. 표적 단백질이 세포의 pDNA 리포펙션 24시간 후, 48시간째부터 시작하여 120시간째의 관찰 시간의 종료 시까지, 더 많이 발현된 것으로 보일 수 있지만, cmRNA 발현은 현격히 감소된 pDNA에 비해 이 맥락에서 높게 유지되었다. 이론에 결부됨 없이, 지속적인 발현은, 예를 들어 본 발명에 따라 사용된 각각의 리포플렉스 (예컨대, DF-GoldTM/cmRNA)로 인해, 분해에 대해 더 우수한 mRNA 보호에 대한 증거 및 cmRNA의 안정화에 대한 표시일 수 있다.
둘 다 MetLuc를 코딩하는, pDNA 및 cmRNA의 리포펙션 후 표적 단백질 발현의 효율을 비교하였다 (도 2C). 형질감염 24시간 후, 형질감염 효율은 pDNA-형질감염된 AMSC에서 거의 2배 더 높았다 (p=0.005). 그러나, 형질감염 후 48시간과 120시간 사이에, MetLuc 발현 수준은 cmRNA로 형질감염된 세포의 경우에 유의미하게 더 높았고 (p=0.0002) 형질감염 후 최대 120시간까지 유의미하게 더 높은 상태를 유지하였다 (p=0.007). 제로와 120시간 사이의 데이터를 적분함으로써 계산된, "pDNA" 및 "cmRNA" 곡선하 면적, AUC pDNA =1.71·10 8 (정규화된 RLU·h) 및 AUC cmRDNA =1.68·10 8 (정규화된 RLU·h)은 pDNA 전달 후 달성된 것과 유사한 표적 단백질의 "생체이용률"을 초래할 수 있음을 보여주었다.
cmRNA 형질감염의 효율을 더욱 증가시키기 위하여, 마그네토펙션을 이용하였다. 이 목적을 위하여, PEI-가식된 철 산화물 코어-실리카 쉘 자성 나노입자 (즉, SO-Mag6-115)를 사용하였다. SO-Mag6-115 나노입자는 대략 96±14 nm의 유체역학 직경 및 34±3 mV의 고도의 양성 제타 전위를 특징으로 한다. 자성 나노입자는 수성 현탁액 중에서 시각적으로 안정한 것으로 보였다. 물, 150 mM NaCl 또는 세포 배양 배지 중에서 어떠한 침강도 관찰되지 않았다. 또한, 나노입자는 외부적으로 적용된 자기장에 대해 명확한 반응을 나타내었다.
마그네토펙션 실험에서, BMSC를 AMSC와 나란히 비교하기 위해 형질감염시켰다. 마그네토펙션은 리포펙션에 비해 두 세포 유형 모두에 대해 형질감염 효율의 유의미한 증가를 초래하였다 (도 3). 형질감염 후 24시간째에 eGFP-형질감염된 세포의 유세포 분석은 59.7% (AMSC) 및 73.2% (BMSC) 양성 세포를 나타내었다 (도 3C). 반대로, 리포펙션이 수행된 경우에는 (즉, 형질감염 시약으로서 DF-Gold) 단지 37.5% (AMSC) 및 38.9% (BMSC) 세포만이 eGFP에 대해 양성을 나타내었다. 대표적인 히스토그램을 도 12에 나타내었다. 이 유세포 분석 데이터는 형광 현미경 및 MetLuc 어세이의 데이터와 일치하였다 (도 3A, B 및 D). 도 3A는 마그네토펙션이 세포 내로 tomato cmRNA를 전달하기 위해 사용된 경우, tomato 단백질을 발현하는 더 높은 퍼센트의 형질감염된 BMSC를 보여준다. 유사한 양상이 eGFP를 코딩하는 cmRNA의 전달 후 관찰되었고, eGFP를 발현하는 AMSC 및 BMSC의 형광 현미경 사진을 도 3B에 나타내었다. 유사하게, 도 3D는 마그네토펙션을 통해 MetLuc cmRNA으로 형질감염된 AMSC 및 BMSC 둘 다에 의한 형질감염 후 24시간째에 유의미하게 더 높은 MetLuc 발현을 보여준다 (p<0.0001).
BMSC에 대해 마그네토펙션의 명백히 더욱 뚜렷한 효과가 수득되었다. 두 세포 유형 모두에 대한 MAI가 도 3D에 제공된다. MetLuc 활성에서의 4.4-배 및 2.4-배 증가 (MAI)가 각각 BMSC 및 AMSC에 대해 결정되었다. 이들 데이터는 마그네토펙션이 사용된 경우에 두 MSC 유형 모두에서 단백질 발현의 유의미한 증가의 증거를 제공한다.
실시예
4. 형질감염된 줄기세포에 의한
hBMP
-2의
증가된
분비.
후속 실험에서 골형성 조건의 중요성으로 인해 골형성 배지의 존재뿐만 아니라 Opti-MEM 배지 중에서 hBMP-2 cmRNA의 형질감염을 수행하였다. 흥미롭게도, 5시간 후 골형성 배지로 배지를 추가 교환하면서 Opti-MEM에서 수행된 형질감염은 형질감염 효율을 손상시키지 않는 것으로 나타났다 (도 4A). 형질감염이 골형성 배지의 존재하에서 수행된 경우에 유의미하게 더 낮은 hBMP-2 발현이 관찰되었다 (p<0.05). 도 4B는 형질감염 후 상이한 시점에서 형질감염된 세포의 세포 용해물 및 상청액에서 정량된, 분비되고 세포 연합된 hBMP-2의 함량을 나타낸다. 유의미하게 더 높은 hBMP-2 수준이 비형질감염된 대조군에 비해 형질감염된 세포로부터의 샘플로부터 검출되었다 (p<0.001). 최대 hBMP-2 발현이 형질감염 후 48시간째에 관찰되었다. hBMP-2의 세포 내 수준은 48시간 후에 유의미하게 감소하였다 (p=0.007). hBMP-2의 높은 세포 내 수준에도 불구하고, 형질감염된 AMSC는 형질감염 후 최대 7일간 유의미하게 더 높은 hBMP-2 수준을 분비하였다 (도 4B 및 C) (p=0.0008). 도 4B 및 C는 마그네토펙션된 세포로부터의 샘플에서 hBMP-2 수준을 나타낸다. 총 세포-생산된 hBMP-2는 대략 700 pg/μg cmRNA였다 (도 4C). 이는 리포펙션 후 달성된 hBMP-2 수준에 비해 6배 증가 (MAI)를 나타낸다 (도 4C). 마그네토펙션을 이용해 관찰된 hBMP-2의 더 높은 수준은 eGFP 리포터 (도 3B, 도 12), MetLuc (도 3D) 및 Tomato (도 3A)를 코딩하는 cmrna에 대해 관찰된 더 높은 형질감염 효율 및 발현과 일치한다. 또한 형질감염된 세포에서 hBMP-2의 세포 내 수준이 마그네토펙션을 이용해 상당히 증가되었다는 사실은 언급할 가치가 있다 (p<0.0003). 도 4B에서, hBMP-2의 세포 내 양은 형질감염 24시간 후에 분비된 hBMP-2와 거의 동일하였다 (p=0.8)고 관찰될 수 있다. 이 시점 이후에, 형질감염된 세포는 세포 용해물에서 정량된 수준에 비해 유의미하게 더 많은 양의 hBMP-2를 분비할 수 있었다 (p<0.001).
실시예
5.
hBMP
-2
cmRNA
전달은
AMSC에서
시험관 내
골형성을
유도하였음.
시험관 내 골형성의 첫 번째 표시로서, 알칼라인 포스파타제 (ALP) 활성에 대해 hBMP-2 형질감염된 AMSC를 평가하였다. hBMP-2 cmRNA 전달 12일 후, 증가된 ALP 발현이 형질감염된 세포에서 확인될 수 있었다 (도 5A 및 B). ALP 활성의 정량화는 유의미한 증가가 빠르면 7일째에 관찰되었고 대조군에 비해 형질감염된 세포의 경우 12일까지 지속되었음을 입증하였다 (도 5B, p<0.01).
결과적으로, 골형성 관련 유전자의 발현을 실시간 PCR로 상이한 시점에서 정량하였다 (도 5C-H). 리포펙션 및 마그네토펙션 그룹 둘 다의 경우, RunX2, 오스테릭스 (Osterix), ALP, Coll I, 오스테오폰틴 (Ospeopontin) 및 오스테오칼신 (Osteocalcin)의 발현이 비형질감염에 비해 시간의 경과에 따라서 증가하였다. 흥미롭게도, RunX2, ALP 및 OPN은 형질감염 후 14일째에 리포펙션과 비교할 때 마그네토펙션 그룹에서 유의미하게 더 높은 발현을 나타내었다. 특히 OPN의 경우에, 마그네토펙션은 14일 후 지속적으로 높은 발현을 초래하였다. 반면, RunX2 발현의 감소가 마그네토펙션 그룹에서 14일 후에 유일하게 관찰되었다.
알리자린 레드 염색은 형질전환된 그룹 (도 6B 및 C)에서 석회화 결절의 수가 비형질전환된 세포 (도 6A)에서 보다 현저히 더 높았음을 보여주었다. 또한, 리포펙션 후, 염색은 더 낮은 hBMP-2 cmRNA 용량 (즉, 20 pg/세포, 도 6C)에서 명백히 더 강렬하였다. 이는 MetLuc cmRNA를 이용한 적정 실험에 의해 수득된 최적화 용량에 상응하였다 (도 10). 32 pg/세포의 더 높은 용량에서, 무기질화는 시각적으로 더 빈약하였다 (도 C에서 우측). 그러나, 마그네토펙션이 cmRNA 전달에 사용되었던 경우에 이는 더 강해졌다 (도 6B). 알리자린 레드 염색의 정량적 분석은 이러한 결과를 확인하였다. 도 6D는 리포플렉스가 사용되었던 경우에 더 높은 용량 (32 pg/세포)에 비해 더 낮은 용량 (20 pg/세포)에 대해서 유의미하게 더 높은 무기질화를 보여준다 (p<0.0001). 무기질화는 20 pg hBMP-2 cmRNA로 형질감염된 세포에서 배양 시간의 경과에 따라서 증가하였다. 더 높은 용량 그룹에 대한 마그네토펙션의 사용에 의해, 유의미하게 더 높은 무기질화가 검출되었다 (14일의 경우 p=0.04 및 21일의 경우 p=0.007, 도 6D). 더욱이, 이는 빠르면 형질감염 14일 후에 명백히 나타났다.
실시예
6. 인간 지방 조직의 형질감염은 시험관 내 유전자 발현을 유도하였음.
인간 지방 조직을 DF-Gold /tomato N1 cmRNA 또는 DF-Gold /hBMP-2 cmRNA 복합체로 형질감염시켰다. 도 7A에 나타난 바와 같이, 지방 디스크 내부의 다수의 세포가 형질감염 후 tomato N1 양성이 되었다. hBMP-2 형질감염된 디스크의 경우, RT-PCR은 비처리된 외식편에 비해 형질감염된 조직에 대한 hBMP-2 발현에서 4-배 초과의 증가를 나타내었다 (도 7B). 또한, RunX2, 오스테릭스 및 Coll I과 같은 골 관련 유전자의 발현에 있어서의 증가가 대조군에 비해 골형성 조건하에서 배양된 형질감염된 조직에서 명백히 관찰되었다. ALP 및 Coll I의 경우에, 이들의 발현은 형질감염 후 3일째부터 7일째까지 유의미하게 증가하였다 (p<0.001).
실시예
7. BMP-2
cmRNA는
생체 내에서 2주 이내에 골 형성을 대략 배가시켰음.
도 13A-C는 처리 2주 후 모든 연구된 그룹에 대한 μCT 3D 재구성 및 종단면을 나타낸다. 신생-골 형성의 징후를 C12-(2-3-2)/hBMP-2 cmRNA 그룹의 μCT 절편에서 관찰할 수 있다. 반면, 새로운 골 형성의 징후가 피브린 또는 C12-(2-3-2)/FFL cmRNA 그룹에서는 관찰되지 않았다. 이 모델을 자발적인 골 치유 과정에서 hBMP-2 cmRNA의 영향을 결정하는데 사용하였다. 도 13D는 모든 그룹에 대한 캘러스 형성의 양에 대한 정량적 분석을 보여준다. 이 μCT 데이터는 대조군에 비해 C12-(2-3-2)/hBMP-2 cmRNA를 함유하는 피브린으로 처리된 동물에서 2주 후 캘러스 형성에서 유의미한 증가를 나타내었다 (p < 0.05). 피브린과 C12-(2-3-2)/FFL cmRNA를 함유하는 피브린 그룹 사이에서는 어떠한 유의미한 차이도 발견되지 않았다. 이들 그룹에서, 어떠한 유의미한 캘러스 형성도 관찰되지 않았다.
수득된 μCT 결과는 골 치유에 대한 hBMP-2 cmRNA의 치료 효과를 입증한다. hBMP-2 cmRNA로 처리된 이들 동물에서, 생체 내 골형성의 자극이 명백히 관찰되었다. 반대로, 비특이적 cmRNA (즉, FFL cmRNA)로 처리된 동물의 경우에는 어떠한 골형성도 관찰되지 않았다. 이는 hBMP-2 cmRNA가 골형성이 일어나도록 야기하는 골 결손 부위에서 hBMP-2의 치료적 발현을 매개함을 입증한다.
추가의 재료 및 방법 (특히
실시예
8 내지 14에 관련됨).
재료. 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), 알파 최소 필수 배지 (α-MEM), 칼슘 및 마그네슘 부재의 둘베코의 포스페이트-완충된 식염수 (DPBS), 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린/스트렙토마이신 (P/S), 0.05% 트립신-EDTA 및 콜라게나제 타입 I 및 II를 Life Technologies GmbH의 Gibco (Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다.
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC) 및 콜레스테롤을 포함하는 헬퍼 지질을 Avanti Polar Lipids INC (AL, USA)에 의해 공급 받았다. 복합체 제조를 위한 다른 필요한 재료, 예컨대 에탄올 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DMG-PEG) 2 kD를 각각 CarlRoth (Karlsruhe, Germany) 및 Nof America Corporation (NY, USA)으로부터 구입하였다. 상품명 "KOLLAGEN resorb TM"인 콜라겐 스폰지를 Resorba (Nurenburg, Germany)에 의해 공급 받았다. 다른 시약 및 재료는, 달리 지시되지 않는 한, Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
복합체 제조. 양이온성 지질, C12-(2-3-2) (ethris GmbH에 의해 공급 받고 "C12 EPE"로도 알려짐)를, 헬퍼 지질로서 DPPC 및 콜레스테롤과 페길화된 지질로서 DMG-PEG2k와 함께 비-바이러스성 형질감염제로 사용하였다.
200 μg/ml의 RNA 농도, 및 RNA의 포스페이트기에 대한 지질의 아미노기의 몰비를 나타내는, 8의 N/P 비에서 RNA 복합체를 형성하였다. 인슐린 주사기를 사용하여, cmRNA를 함유하는 수성상 내부로 지질상의 에타노 용액 (ethanoic solution)의 신속한 주입에 의한 자가-조립에 이어서, 고속으로 15초간의 볼텍싱, 및 RT에서 30분의 인큐베이션에 의해 복합체를 유도하였다. 합성된 리포플렉스를 7 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 투석 카세트 (Pierce, USA)를 사용하여 재증류수에 대해 투석하고, 30분 후 1회의 물 교환에 이어서 밤새 투석하였다.
입자 크기 및 제타 전위의 측정. 리포플렉스의 입자 크기를 Zetasizer (Malvern Instruments, Worcester, UK)를 사용한 레이저 광산란으로 측정하였다. 750 μl의 복합체를 깨끗한 일회용 큐벳 셀 (cuvette cell) 내에 채우고 입자 크기분석 및 표면 전하의 측정을 위해 각각 총 30회 및 300회 실행을 수행하였다.
메트리디아 루시퍼라제 어세이 . 리포터 mRNA, 메트리디아 루시퍼라제 (Metridia luciferase)의 발현 역학을 이용하여 연장된 mRNA 전달을 위해 콜라겐 스폰지의 특성을 시험하였다. 이를 위해, 세포 배양 상청액을 형질감염 후 매 24시간 마다 수집하고, 새로운 배지로 교체하였다. 수집된 배지를 측정을 위해 바로 진행하거나, 또는 샘플을 종합적으로 측정하기 위해 실험 마지막 날까지 -20℃에서 냉동시켰다. Met luc 발현을 정량하기 위해, 80 μl의 상청액을 흑색 96-웰 플레이트 (Costar, NY, USA)에서 30 μl의 0.05 mM 코엘렌테라진 (Synchem, Felsberg, Germany)과 가볍게 혼합하고 발광 판독기 (Wallac Victor, Perkin-Elmer Life Sciences)를 사용해 3회 반복으로 측정하였다.
래트 중간엽 줄기세포 (MSC)의 분리 및 증폭. 래트 골수 중간엽 줄기세포 (BMSC)를 ethris GmbH에 의해 공급 받았다. 지방 중간엽 줄기세포 (AMSC)를 수컷 래트의 지방 조직으로부터 분리하였다. 이 과정에서, 지방 조직을 밀리미터 크기 조각으로 절단하고 살균 DPBS를 함유하는 팔콘 튜브 (Corning Inc., NY, USA)로 옮긴 후 DPBS로 수 차례 세척하였다. 이어서, 지방 조직을 가습된 37℃에서 콜라게나제 타입 II 용액 (0.4 mg/ml) 중에 30분간 인큐베이션하였다. 그 후에, 콜라게나제 활성을 완전 DMEM 배양 배지 (10% v/v FBS 및 1% v/v 페니실린/스트렙토마이신 함유 DMEM)를 첨가하여 중지시키고, 혼합물을 10분간 600 g에서 원심분리하였다. 상부 지방층을 수집하고 완전 DMEM 배양 배지 중에 재-현탁하였다. 다음 단계에서, 세포 현탁액을 40 μm 세포 스트레이너 (Corning Inc., NY, USA)를 통해 여과시키고, T75 cm 플라스크 (Corning Inc., NY, USA)에 배치하고 완전 DMEM 중의 가습된 37℃ 및 5% CO2에 놓아 두었다 [20]. 비-부착성 세포를 제거하기 위해, 그 다음날 배지를 교체하였다. 1500-3000개 세포/cm2의 세포 밀도로 세포를 증폭시키고 배지를 3일마다 교체하였다. 이 연구에서, MSC를 계대 6까지 사용하였다.
실험적 셋업. 콜라겐 스폰지를 펀처 (puncher) (VBS Lochzange, Nr. 19970181)를 사용하여 작은 조각 (직경 6 mm)으로 절단하였다. 조각을 살균된 평평한 바닥의, 폴리프로필렌 비코팅된 96-웰-플레이트 (Eppendorf, Humburg, Germany)의 웰에 배치하였다. 동결건조제로서 수크로스 (2%) 중의 50 μl의 리포플렉스를 각각의 조각에 한 방울씩 첨가하고 스폰지에 완전히 스며들도록 RT에서 90분간 인큐베이션하였다. 그 후에 로딩된 스폰지를 고 진공 (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Germany)으로 옮기고 0.05 mbar에서 적어도 2시간 동안 거기서 건조시켰다. 그 후에, 스폰지를 세포 접종을 위해 사용하거나 진공-밀봉하였고 사용 전까지 RT에 보관하였다. 세포 접종의 경우에, 50 μl의 완전 배지 (NIH3T3 및 MSC 세포의 경우 완전 DMEM) 중의 바람직한 세포 밀도를 모든 스폰지에 첨가하고 이어서 가습된 37℃ 및 5% CO2에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 동안에, 세포가 폴리프로필렌 비코팅된 플레이트 상에 부착하여 성장할 수 없기 때문에, 이들은 콜라겐 스폰지 위에 접종되어야 한다. 그 후에, 200 μl 완전 배지를 웰에 첨가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터 중에서 인큐베이션하였다.
전체 과정을 층류형 후드 (BDK Luft und reinraumtechnik GmbH, Sonnenbuhl-Genkingen, Germany)를 사용해 살균 조건하에서 수행하였다. 또한, 플라스틱 재료는 콜라겐 스폰지의 높은 정전기 전하로 인해 회피되었다.
cmRNA 전달의 효능. FACS 분석을 수행하여 3D 시스템에서 cmRNA 형질감염의 효능을 특성화하였다. 이를 위해, 각각의 스폰지를 칼슘 및 마그네슘 함유 행크 평형 염용액 (HBSS) 중의 300 U/ml 콜라게나제 타입 I과 함께 4 내지 7시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 동안에, 스폰지를 수차례 시각적으로 조사하여 완전한 콜라겐 분해를 확인하였다. 세포를 500 g에서 5분간 원심분리하고, 이어서 DPBS로 세척하였다. 다음 단계에서, 세포를 10 μl의 0.05% 트립신-EDTA와 37℃에서 5분간 인큐베이션하여 세포의 탈착을 촉진시켰다. 각 웰에 2% FBS를 함유하는 90 μl의 DPBS를 첨가하여 탈착을 중단시켰다.
Attune NxT 유세포 분석기 (Life technologies, NY, USA)를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. 각 실험 전에, 기계를 교정 (calibration) 비드 (Molecular probes, Life technologies, NY, USA)를 사용하여 교정하였다. 세포 잔여물을 정방향- 및 측면-산란 게이팅 (side-scatter gating)을 이용하여 분석으로부터 배제하였다. 2D 및 3D 조건하에서 배양된 비형질전환된 세포를 음성 대조군으로 사용하여 eGFP 형광을 검출하기 위해 형광 채널을 조정하였다. 3회 반복으로 수득된 데이터를 FlowJo_V10 소프트웨어를 이용해 분석하였다.
세포 사멸/생존의 결정. 세포 생존력을 프로피디움 요오드화물 염색, 및 WST 어세이를 사용하여 평가하였다. 두 어세이 모두의 경우, 상이한 용량의 eGFP cmRNA 복합체가 로딩된 진공-건조된 콜라겐 스폰지를 사용하였다. 스폰지당 10,000개 NIH3T3 세포를 완전 DMEM 배지에 접종하고 48시간 동안 가습된 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
생사 (live-dead) 염색의 경우, 이전에 기술된 바와 같은 FACS 분석을 위해 세포를 준비하였다. 그 후에, 프로피디움 요오드화물 용액의 1 mg/ml 스톡의 1:1000 희석액을 측정 바로 직전에 각 웰에 첨가하였다.
세포 생존을 또한 제조사의 지침에 따라서 WST 반응 어세이 (비색 세포 생존력 키트 II (WST-1), Promokine, Heidelberg, Germany)로 평가하였다. WST 시약을 첨가하기 전에, 상청액을 위 아래로 3회 피펫팅하여 각 웰에서 스폰지로부터 균질화된 용액을 수득하였다. 그 후에 100 μl의 상청액을 측정을 위해 새로운 세포 배양 96-웰-플레이트 (Corning Inc., NY, USA)로 옮겼다. 비형질전환된 웰로부터의 상청액을 블랭크로 사용하였다. 흡광도를 다중 분광광도 판독기 (Wallac Victor, Perkin-Elmer Life Sciences, MA, USA)를 사용하여 3회 반복으로 450 nm에서 측정하였다.
hBMP2 - cmRNA -로딩 된 콜라겐 매트릭스 상에서 배양된 MSC 에 의한 hBMP -2의 분비. 상이한 용량의 hBMP2 cmRNA 리포플렉스로 형질전환된 MSC로부터의 배지 샘플을 형질감염 후 24시간째에 수집하고, hBMP-2의 농도를 제조사의 지침에 따라서 인간 BMP-2 ELISA 키트 (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용해 측정하였다. 실험을 3회 반복 수행하였고, 단백질 함량을 표준 곡선을 사용해 결정하였다 (r2=0.99).
주사전자 현미경. 주사전자 현미경 (SEM)을 사용하여 콜라겐 스폰지의 형상을 특성화하고 그 위에서 로딩 mRNA 복합체를 평가하였다. 모든 샘플을 스퍼터 코터 (sputter coater) (Edwards sputter coater S150B, HHV Ltd, West Sussex, UK)를 사용해 60/40의 비로 금 및 팔라듐으로 코팅하였다. 그 후에, SEM을 1.2 kV에서 Zeiss-Leo DSM 982 Gemini (FELMI-ZFE, Graz, Austria)를 사용하여 수행하였다.
콜라겐 스폰지 상에 접종된 세포의 헤마톡실린 염색. 콜라겐 스폰지 상에 NIH3T3 세포를 접종하고 24시간 후, 세포를 pH 7.4인 포스페이트-완충된 식염수 (PBS) 중의 4% 포름알데히드로 RT에서 밤새 고정하였다. 이어서 콜라겐 스폰지를 탈수시키고 파라핀에 포매하였다. 콜라겐 절편 (7 μmm)에서 파라핀을 제거하고, 표준 프로토콜에 따라서 헤마톡실린으로 염색하였다.
RNA 분리, 및 역전사 실시간 중합연쇄반응 (RT- PCR). hBMP-2 로딩된 콜라겐 스폰지 상에 세포를 접종하고 7일 및 14일 후, 행크 평형 염용액 (HBSS) 중의 콜라게나제 I의 적합한 부피를 각 웰에 첨가하여 300 U/ml의 콜라게나제 타입 I의 최종 농도에 도달하였다. 그 후에, 플레이트를 가습된 37℃ 및 5% CO2에서 4 내지 7시간 동안 인큐베이션하였다. 콜라겐 스폰지가 완전히 용해된 경우에, 세포를 500 g에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 이어서 세포를 RNA 분리를 위해 TRIzol 시약 (Ambion by life technologies, Darmstadt, Germany)으로 제조사의 지침에 따라서 용해시켰다.
RNA 농도 및 순도를 NanoDrop 2000C 분광광도계 (Thermo Scientific, DE, USA)로 결정하였다. 제1 가닥 cDNA를 제조사의 지침에 따라서 First Strand cDNA 합성 키트 (Thermo Scientific, Darmstadt, Germany)의 사용에 의해 450 ng의 총 RNA로부터 역-전사하였다. hBMP2 형질감염된 그룹과 비형질감염된 그룹의 각 경우에, 15개 스폰지를 사용하였고, 용해된 세포를 RNA 분리를 위해 함께 풀링하였다.
골-관련 유전자의 발현을 평가하기 위하여, soAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Munich Germany)를 사용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였다 (n = 3). Light Cycler 96 열 순환기 (Roche, Mannheim, Germany) 상에서 PCR을 수행하였다. 표적 유전자의 발현 수준을 GAPDH (MC3T3-E1 세포의 경우), 및 베타-튜불린 (MSC의 경우)의 발현 수준에 대해 정규화하였다. 데이터를 대조군, 즉 3D 배양에서 비형질감염된 MC3T3-E1 세포 및 2D 배양에서 비형질감염된 MSC에 대한 배수 유도로 표현하였다. 5' 내지 3'의 프라이머 서열을 하기에 열거하였다:
MC3T3-E1 세포에 대한 골 재생 실험용 마우스 프라이머:
MSC에 대한 골 재생 실험용 래트 프라이머:
시험관 내 골 분화. 앞서 기술된 바와 같이 2% 수크로스 중의 3 μg hBMP2 mRNA 리포플렉스를 콜라겐 스폰지에 로딩하고 진공-건조시켰다. 다음 단계에서, 50 μl DMEM 중의 신선하게 분리된 래트 AMSC 30,000개를 각각의 콜라겐 스폰지에 접종하고 5% CO2의 가습된 대기 중의 37℃에서 30분간 인큐베이션하여, 콜라겐 스폰지에 대한 세포 부착을 보장하였다. 그 후에, 250 μl 골형성 배지 (DMEM + 2% FBS + 10 mM β-글리세로포스페이트 + 200 μM L-아스코르브산 + 1% Pen-Strp)를 각 웰에 첨가하였다. 배지의 절반을 매 2 내지 3일마다 재생시켰다. 3D (콜라겐 스폰지 상에 접종됨) 및 2D (정상적 세포 배양 플라스크에 접종됨)에서 비형질감염된 세포를 포함하는 음성 대조군을 3D에서 형질감염된 세포와 정확히 동일하게 처리하였다. 접종 후 7일 및 14일째에, 세포를 RT-PCR로 골형성 마커의 발현에 대해 조사하였다.
생체 내 골 분화. 실험 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드라인 (Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals) (National Research Council (US) Committee, National Academies Press (US), 2011)에 따라서 생체 내 이식 실험을 설계하였다. 총 9마리 스프라그-다우리 래트 (6개월령 수컷, 평균 체중 600 내지 700 g; Janvier, Le Genest-St-Isles, France)를 사용하였다. 각 래트에서, 좌측 다리의 대퇴골 결손을 공 (empty) 콜라겐 스폰지 (음성 대조군)로 처리하고, 우측 대퇴골 결손을 2.5 μg hBMP2 cmRNA-로딩된 스폰지로 치료하였다. 수술 동안 및 그 후에 감염을 회피하고 통증을 완화하기 위하여, 일상적인 항생제 및 진통제를 처방하였고, 동물을 메데토미딘 (Medetomidin) (Domitor®, Orion pharma, Espoo, Finland; 135 μg/kg), 미다졸람 (Midazolam) (Dormicum®, Unterhaching, Germany; 2.5 mg/kg) 및 펜타닐 (Duragesic®, Beerse, Belgium; 5 μg/kg)의 조합을 사용하여 마취시켰다.
면도 및 소독 후, 측면 외부 영역에 작은 피부 절개를 만들었다. 2-mm 외경을 갖는 뼈 드릴을 사용하여 대퇴골의 중앙부에 전층 (full-thickness) 골 결손을 생성하였다.
스캐폴드를 결손 내로 적용한 후, 폴리비닐 막을 사용하여 이식 부위를 덮어주어 임의의 두개골막 자가-재생능의 효과를 최소화하였다. 마지막으로, 4-0 바이크릴 (vicryl) 봉합사를 사용하여 두개골막 및 오버라잉 (overlying) 피부를 봉합하였다. 래트를 나트륨 펜토바르비탈 (natrium pentobarbital) (Narcoren®, Merial GmbH, Hallbergmoos, Germany; 400 mg/kg)을 사용하여 2주째에 희생시키고, 샘플을 μCT 및 병리학적 분석을 위해 수집하였다.
μ-컴퓨터 단층촬영 (μ-CT) 분석. μCT 40 (Scanco Medical, Bassersdorf, Switzerland)을 사용한 3차원 x-선 마이크로-컴퓨터 단층촬영 (μ-CT) 영상화를 수행하여 골 형성을 정량하였다. 골 부피를 측정하여 각 표본 (공 콜라겐 스폰지로 처리된 결손 및 hBMP2 cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지로 처리된 결손)에서 새롭게 형성된 캘러스의 양을 비교하였다.
래트 대퇴골 결손의 병리학적 관찰. 골 재생의 정량적 및 형태학적 측면을 병리학적 조직표본을 이용하여 분석한 바 있다. 대퇴골을 40% 내지 100% 등급의 일련의 에탄올로 탈수시키고 메타크릴레이트 수지 (Technovit 7200, Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim, Germany) 중에 포매하였다. 얇은 기저 절편 (ca. 30 μm)을 제조하고 Levai Laczko 염색으로 염색하고 광학 현미경 하에서 평가하였다 [Donath K. and Breuner G., J. Oral Pathology (11), 1982, 318-326; Laczko J. and Levai G. (31), Mikroskopie, 1975, 1-4].
통계적 분석. 모든 통계적 분석은 윈도우용 GraphPad Prism 버전 6.05 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA)를 이용하여 수행하였다. t-검정 및 다중 t-검정을 이용하여 통계적 유의성을 결정하였다. P< 0.05를 유의미한 것으로 간주하였다.
실시예
8. C12-(2-3-
2)를
이용한 추가의, 대안적인,
cmRNA
복합체 형성.
Ethris GmbH에 의해 제공된, 양이온성 지질을 비-바이러스 벡터로 사용하여 지질의 양성 아미노기와 cmRNA의 음성 포스페이트기 사이의 정전기적 상호작용에 근거하여, cmRNA를 이용해 안정한 리포플렉스를 제조하였다 (Anderson, Human Gene Therapy 14, 2003, 191-202). 리포플렉스 구조를 안정화시키고 유출을 감소시키기 위하여, Ethris 지질을 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC) 및 콜레스테롤로 불리는 2종의 헬퍼 지질로 공급하였다 (Anderson, Drug Delivery 11, 2004, 33-39; Liang, Journal of Colliod and Interface Science 278, 2004, 53-62). 마지막에, 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DMG-PEG) 2 kD를 지질 혼합물에 첨가하여 페길화된 (PEGylated) 리포좀을 제공하였다. 페길화가 수용해도를 증가시키고, 효소적 분해로부터 보호하고, 면역원성 및 알러지 반응을 제한함으로써 리포좀 제제의 물리-화학적 특성을 개선함은 이미 잘 알려져 있다 (Milla, Current Drug Metabolism 13, 2012, 105-119). 전체 에타노 (ethanoic) 지질 혼합물에 대한 최종 N/P 비는 cmRNA 분자의 하나의 포스페이트기에 대해, 각각, C12-(2-3-2)/DPPC/콜레스테롤/DMG-PEG의 아미노기의 몰비를 나타내는 8/5.29/4.41/0.88이었다. cmRNA 리포플렉스의 생물물리학적 특성을 표 6에 열거하였다. 모든 생성물의 유체역학 직경은 0.1에 근접한 다분산 지수를 갖는 대략 50 nm이고, 이는 균질한 생성물을 나타낸다. 그 외에, 모든 복합체의 총 표면 전하는 중성에 가까운, 약간 양성이었다.
실시예
9. 콜라겐
스폰지
상에의
cmRNA
복합체 로딩 및 세포 접종.
콜라겐 스폰지 상에 로딩하기 전에, 2% 수크로스를 동결보호제로서 cmRNA 리포플렉스 용액에 첨가하였다. 동결보호제는 진공-건조 과정에서 탈수 동안에 생물학적 시스템의 온전성을 유지한다 (Kannan, Journal of Liposome Research, 2014, 1-9). 주사전자 현미경 (SEM)에 의한 스폰지의 시각화는 2% 수크로스를 함유하는, 진공-건조된 콜라겐 스폰지가 진공-건조 전의 것에 비해 더 작은 기공을 갖는 폐쇄된 케이지와 유사하였음을 보여주었다 (도 23).
스폰지 상에 cmRNA 리포플렉스의 로딩 가능성을 보장하기 위해, cmRNA-로딩된 스폰지를 SEM으로 조사하였고, cmRNA를 함유하는 리포플렉스를 콜라겐 스폰지 상에서 검출하였다 (도 14A).
콜라겐 스폰지 상에의 cmRNA 로딩뿐만 아니라 세포 형질감염을 조사하기 위하여, 2 μg의 tdTomato cmRNA 리포플렉스를 스폰지에 로딩하였고, 이때 10%의 tdTomato cmrna는 공유적으로 FITC-접합되었다. 스폰지 상에서 세포 및 cmRNA 리포플렉스의 분산도뿐만 아니라 형질감염 효율을 NIH3T3 세포 접종 30시간 후 Leica DMi8 형광 현미경 (Leica microsystems, Heerbrugg, Switzerland)을 사용해 시각화하였다. 도 14B에 나타난 바와 같이, 세포는 형질감염되었고, 대부분 높은 cmRNA 축적을 갖는 위치 (녹색 반점)에서, tdTomato 단백질을 발현하였다 (적색 반점).
3D 매트릭스 상에서 세포 거동의 조사를 위해, 콜라겐 스폰지 내로 NIH3T3 세포의 이동을 NIH3T3 세포의 접종 7일 후 스폰지의 수직 절단의 헤마톡실린 염색에 의해 확인하였다. 도 14C로부터, 세포가 스폰지 내로 이동하여 성장과 시그널링을 위해 전체 매트릭스를 사용할 수 있으며, 이는 생체 내-유사 상황을 모사할 가능성이 더 많음이 분명해졌다.
먼저, 세포가 콜라겐 스폰지 3D 매트릭스 내부에서 성장할 수 있는 것으로 나타났다. 다른 연구는 또한 세포 배양에 적합한 3D 스캐폴드로서 콜라겐 스폰지를 입증하였고, 이는 결과적으로 세포 시그널링 및 세포 거동을 향상시키고, 세포 내에서 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다 (Chevallay, Medical and Biological Engineering and Computing 38, 2000, 211-218). 그 후에, cmRNA 리포플렉스 및 세포의 균일한 분포를 SEM 및 형광-표지된 cmrna를 이용한 형광 현미경으로 시각화하였다 (도 14).
실시예
10. 콜라겐
스폰지
상에서의 형질감염 효율 및 세포 생존력.
콜라겐 스폰지 상에서의 세포 형질감염의 효능 및 안정성을 검증하기 위하여, NIH3T3 세포주에서 eGFP cmRNA의 발현을 형질감염 후 48시간째에 평가하였다. 먼저, 양성 eGFP 발현 세포를 JULY™ 형광 현미경 (Baker and Baker Ruskinn, USA)을 사용하여 시각화하였다 (도 15A). 이들 결과를 정량하기 위해, FACS 분석을 수행하였고 형질감염된 세포에서 평균 형광 강도에 있어 유의미한 증가를 관찰하였다 (도 15B). 용량-반응 실험에서, 최대 100% 형질감염 효율이 세포당 더 많은 양의 cmRNA를 이용해 관찰되었다 (도 15C).
임상적 셋팅에서, 형질감염 효율뿐만 아니라 세포 독성이 또한 결정적인 요인이 된다. 결과적으로, GFP 발현에 덧붙여, 세포 생존력을 또한 2종의 상이한 방법, 즉 PI 염색에 이은 FACS 분석, 및 WST 어세이를 이용한, 2개의 독립된 실험에서 형질감염 후 48시간째에 정량하였다. 60-70% 범위의 세포 생존력을 갖는 비슷한 결과가 두 방법을 이용해 수득되었다 (도 15D 및 E). 효능에 있어 용량 의존성 증가가 관찰되었던 형질감염 효율과는 달리, 세포 생존력은 용량에 비의존적인 것으로 나타났다.
FACS 분석에 의한 콜라겐 스폰지 상에서의 eGFP cmRNA 형질감염 효능의 정량은, 100% 형질감염된 세포에 이르는, 본 발명의 기법의 상당히 높은 효능을 입증하였다 (도 15B 및 C). 임상적 접근을 위한 본 발명의 기법을 평가하기 위하여, 세포 생존력을 또한 평가하였고, 대략 60-70%의 용량-비의존성 세포 생존력이 관찰되었으며 이는 시험관 내 및 생체 내 접근법 둘 다에서 본 발명에 허용될 수 있었다 (도 15D 및 E). 세포-생존력 어세이에서 용량 비의존성은 3D 매트릭스 내부에서 균질한 세포 분포의 결과일 수 있으며, 이는 생체 내 상황을 근접하게 모사하고 세포 시그널링 및 증식을 개선할 수 있고, 이 과정에서 세포는 고용량의 cmRNA 복합체조차도 용인할 수 있다 (Mueller-Klieser, American Journal of Physiology-Cell Physiology 273, 1997, C1109-C1123). 세포 생존력에 있어서 이 용량-비의존적 경향은 일반적 효능이 낮고 더 고용량의 cmrna가 요구되는 경우에 특이 유리할 것이다.
실시예
11. 콜라겐
스폰지는
연장된
cmRNA
전달을 위한
데포로서
기능함
.
콜라겐 스폰지가 연장된 cmRNA 전달 시스템을 제공할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, NIH3T3 세포에서 메트리디아 루시퍼라제 (Met luc) cmrna의 발현 역학을 매 24시간마다 평가하였고, 2D 및 3D 배양을 비교하였다 (도 16).
결과를 토대로 하면, 콜라겐 스폰지는 후속 6일간 단백질 발현의 정체기 (plateau)를 갖는 연장된 cmRNA 전달 시스템의 특성을 나타내었다. 또한, 8일 후 거의 발현을 나타내지 않았던 2D 세포 배양과는 달리, cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지는 더 높은 cmRNA 용량으로, 11일 이후에서도 상대적으로 높은 단백질 발현을 나타내었다.
콜라겐 스폰지 상에 비변형된 mRNA-함유 리포플렉스를 로딩함으로써 유사한 결과가 수득되었다 (도 24). 그러나, 시스템은 비 진공-건조된 콜라겐 스폰지를 사용한 경우에는 그의 지연된 전달 효율을 상실하였다 (도 25). 이는 진공-건조가 본 발명의 셋팅에서 연장된 cmRNA 전달 시스템을 제공하기 위한 필수적 및 결정적 단계라는 증거를 제공하는 것이다.
다음 단계에서, 골수 (BMSC) 및 지방 조직 (AMSC)으로부터 분리된 래트 중간엽 줄기세포 (MSC)를 사용하여 일차 세포에 대해 본 시스템을 시험하였다. 두 세포 유형 모두를 사용하여, Met luc 발현의 역학을 리포플렉스-로딩된 콜라겐 스폰지 상에 세포의 수를 증가시켜 접종함으로써 결정하였다. 도 17에 나타난 바와 같이, 세포 밀도와는 무관하게, 복합체-로딩된 콜라겐 스폰지 상에 접종된 MSC는 적어도 후속 4일간 연장된 단백질 발현을 나타내었다. Met luc 발현에서 어떠한 유의미한 증가도 더 높은 밀도 (>10000개 세포/스폰지)에 대해서 관찰되지 않았기 때문에, 이후의 실험은 10-20,000개 세포/스폰지 사이를 사용하여 수행하였다.
세포주 (도 16) 및 다양한 세포 밀도를 갖는 일차 세포 (도 17), 및 또한 변형 및 비변형된 mrna (도 24)를 사용해 메트리디아 루시퍼라제 cmRNA의 발현 역학을 측정하여 연장된 cmRNA 전달을 위한 콜라겐 스폰지의 능력을 평가하였다. 역학 결과에 근거하면, 진공-건조된 cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지는 cmrna를 위한 강력한 연장된 전달 시스템을 제공하고, 이는 RNA 변형, 세포 유형 및 세포 밀도와 독립적이며; 접촉 억제 및 세포 밀도에 더욱 민감한 일차 세포에서조차 그러하다 [21]. 이러한 시스템은, 낮은 세포 밀도에 대한 스위치가 또한 실현 가능할 때, 세포 및 환자 샘플의 공급원 부족의 경우에 매우 유리할 것이다. 이러한 지연 전달 시스템을 갖기 위하여, 진공-건조가 결정적 역할을 하는 것으로 보이는 반면, 비-건조된 스폰지에서 cmrna의 발현은 더욱 신속히 하락한다 (도 25). 진공-건조 후 연장된 cmRNA 전달은, 이론에 결부됨 없이, 안착된 (imprisoned) 리포플렉스가 세포와 접촉하게 되거나 매트릭스로부터 방출되는데 시간을 필요로 하는, 진공-건조된 콜라겐 스폰지의 폐쇄형-케이지 (closed-cage) 구조에 기인한 것일 수 있다 (도 23) [10]. 콜라겐 스폰지 상에 진공-건조된 cmRNA 리포플렉스의 균일한 분포 (도 14A)가 최대의 (peaks) 형질감염 효능 또는 갑작스런 (burst) 방출 없이, 수일간의 정상 상태 (steady state) 발현을 위한 또 다른 이유일 수 있다 (Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752).
진공-건조는 또한, 진공-건조된 콜라겐 스폰지 상의 cmRNA 복합체가 RT에서 적어도 6개월간 적합하였던 경우에 또 다른 실질적인 영향을 미친다 (도 22; 또한 실시예 14 참조). 매우 민감한 mRNA 분자에 대해 이러한 상당한 유효 기간이 본 연구에서 최초로 달성되었다. 이는 그 결과로 잠재적 cmRNA 치료제의 이용률 및 사용 용이성을 증가시키고 cmrna을 임상 적용에 더욱 근접하게 만들 수 있다.
본 발명의 기법이 세포주뿐만 아니라 일차 세포 내로 리포터 cmrna의 전달에 잘 최적화되었을 때, 본 발명의 시스템을 시험하여 생리학적 효과, 즉 hBMP2 cmRNA를 사용한 골 형성을 조사하였다.
실시예
12. 시험관 내 세포 분화.
생리학적 효과를 위한 연장된 cmRNA 전달 시스템의 성능을 평가하기 위하여, hBMP2 cmRNA 리포플렉스를 사용하여 2개의 상이한 세포들, 즉 MC3T3-E1 및 MSC로 2개의 시험관 내 골 분화 실험을 설계하였다 (Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752; Meine, Biomaterials 27, 2006, 4993-5002; Kim, Biomaterials 28, 2007, 1830-1837).
골아세포 유사 세포 (MC3T3-E1)에서의 골 분화를 확인하기 위하여, hBMP2 cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지 상에 세포를 접종하고 7일 및 14일 후, 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-qPCR)을 실시하여 골형성 마커 (OCN, 및 ALP)의 발현을 정량하였다. 비로딩된 콜라겐 스폰지 상에 접종된 비형질전환된 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 20A에 나타난 바와 같이, 마커 둘 다는 두 시점 모두에서 강력히 발현되었고, 발현은 14일까지 증가하였다.
다음 단계에서, 동일한 설정을 사용하여 MSC를 사용한 시험관 내 골 분화를 수행하였다. 먼저, 신선하게 분리된 MSC를 FACS 분석을 이용하여 양성 및 음성 마커에 대해 평가하였다 (도 26). 그 후에, MSC를 hBMP2 cmRNA 리포플렉스가 로딩된 콜라겐 스폰지 상에 접종하였다. 형질감염 후 24시간째에, hBMP2 발현을 ELISA를 이용해 상청액에서 정량하였다 (도 19). 7일 및 14일 후, 골형성 마커 (RUNX2, OSX, OCN, 및 ALP)의 발현을 RT-qPCR을 이용하여 검출하였다. 예상외로, 모든 마커가 3D 콜라겐 스캐폴드 상에 접종된 형질전환된 MSC뿐만 아니라 비형질전환된 MSC에서도 고도로 발현되었다. 따라서, 3D에서의 세포와 정확히 동일하게 처리된 (배지 및 세척 관련하여), 통상적인 2D 환경 (페트리 디쉬에서의 표준 세포 배양)에서의 비형질전환된 MSC 배양액을 음성 대조군으로 선택하여 3D에서의 세포에서 관찰된 분화 마커의 발현을 정규화하였다. 도 20B에 제시된 바와 같이, 3D 콜라겐 매트릭스 단독에서의 배양은 MSC에서 골형성 마커의 발현을 유의미하게 상향 조절한다.
hBMP2 cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지 상에 접종된 골아세포 유사 세포주 (MC3T3-E1) 및 MSC를 사용하여 시험관 내 골 분화를 수행하였다 [10,19] (도 20). MC3T3-E1 세포의 경우, hBMP2 mRNA는, 골형성 마커의 발현이 3D 콜라겐 스캐폴드 상에 접종된 비형질전환된 세포에 비해 형질전환된 세포에서 수배 더 높음에 따라, 골 형성을 유발하는데 유의미한 효과를 나타내었다 (도 20A).
반대로, 콜라겐 스폰지 상의 hBMP2 형질감염된 MSC와 비형질감염된 MSC 사이에서는 골형성 마커의 발현에 유의미한 차이가 거의 없었다 (도 20B). 그러나, hBMP2 cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지 상에 접종된 MSC로부터의 hBMP2의 발현을 ELISA를 이용하여 앞서 검출하였다 (도 19). 이 데이터에 따르면, 콜라겐 스폰지 자신은 MSC에서 시험관 내 골 재생을 유발할 수 있다. 이전에, 콜라겐 스폰지가 연골형성을 개시할 수 있는 것으로 또한 나타난바 있다 (Bosnakovski, Biotechnology and Bioengineering 93, 2006, 1152-1163). 이 현상에 대한 또 다른 설명은 MSC를 함유하는 형질감염 및 비형질감염된 콜라겐 스폰지에서의 급격한 현미경적 변화를 통해 이루어진다 (도 27). 7일차까지, hBMP2가 로딩된 스폰지는 더 솜털같이 (fluffy) 보이고 크기가 확대된 반면, 비로딩된 스폰지는 시간이 경과함에 따라 응축되고 수축되었다. MSC가 비로딩된 수축 스폰지에서 너무 융합성이었기 때문에, 이들은 자신의 다능성을 상실하고 말단 분화된 세포로 재프로그래밍되기 시작할 것이고 (Sekiya, Stem Cells 20, 2002, 530-541; Coulter, PNAS 97, 2000, 3213-3218), 이들이 골형성 배지에서 성장함에 따라서, 골형성 분화가 가장 유망할 것이다.
실시예
13. 시험관 내 세포 분화.
생체 내 골 재생 활성을 래트 대퇴골 결손 모델에 의해 평가하였다. hBMP2 cmRNA-로딩 및 비로딩된 진공-건조된 콜라겐 스폰지를, 실험군 및 대조군과 같은, 두 그룹의 동물의 대퇴골 결손에 각각 적용하였다. 구체적으로, 제조된 스폰지를 래트 대퇴골 뼈의 중앙 부분에 생성된, 2-mm 직경의 골 결손 내에 이식하였다. 골 치유를 시각화하고 정량하기 위해, 마이크로-컴퓨터 단층촬영 (μ-CT) 스캔을 수술 2주 후에 취하였다. 도 21A에 제시된 바와 같이, 더 많이 새롭게 형성된 뼈가 hBMP2 cmRNA 처리군에서 발견되었다. 이 정량 결과는 또한 hBMP2 cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지가 공 (empty) 콜라겐에 비해 골 재생을 유의미하게 증가시킬 수 있음을 입증하였다 (도 21B). 캘러스 형성에 대한 hBMP2의 효과가 또한 μ-CT의 3D 스캐닝 모델에서 육안으로 잘 보인다 (도 29). 더 상세히 살펴보면, 뼈의 상이한 부분 (골막, 피질, 및 속질)에서의 μ-CT를 이용한 추가 분석은 수많은 골수 줄기세포가 존재하는 속질 영역 (medullary area)에서 가장 높은 골 재생을 나타내었다 (도 28).
새롭게 형성된 뼈를 평가하기 위하여, 면역조직화학을 또한 2주째에 수행하였고, 더 높은 무기질화된 골 조직이 hBMP2 cmRNA 처리군에서 발견되었다. μ-CT 결과와 유사하게, 고도로 무기질화된 영역 (면역조직화학 영상에서 짙은 흑색)이 대부분 뼈의 속질 부분에서 관찰되었다 (도 18A). 더욱이, 골막 영역에서의 조직학적 분석은 대조군에 비해 hBMP2 cmRNA 처리군에서 캘러스 형성의 유의미한 증가를 나타내었다 (도 18B). 유의미하게 더 많은 섬유상 조직이 공 스폰지로 처리된 그룹에 비해서 hBMP2 cmRNA-로딩된 스폰지로 처리된 그룹에서 형성되었음이 추가 분석에서 입증되었다 (도 18C). 골 치유 과정에서, 섬유상 조직은 유골 형성으로의 경향, 및 골 재생을 유발할 수 있다 (Luellmann-Rauch, De BoeckSuperrieur, 2008). 따라서, 도 18D는 hBMP2 cmRNA 처리군에서 더 많은 유골 형성을 나타낸다.
전임상 수준에서 본 발명의 cmRNA 전달 시스템을 시험하기 위하여, cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지를 hBMP2 cmRNA를 사용하여 생체 내 골 형성에 적용하였다. PEI로 화학적으로 변형된 BMP2 cmRNA 복합체의 생체 내 골 형성 효과가 최근에 공개된 바 있다 (Elangovan 상기 인용문 중).
그러나, 이 연구에서는, 절반 크기의 PEI 복합체를 갖는 hBMP2 cmRNA 리포플렉스를 사용하였는데 (표 6), 이는 시험관 내 세포 흡수뿐만 아니라 생체 내 약물동태학 및 생체분포를 개선할 수 있다 (Lee, Biomaterials 32, 2011, 744-752; Albanese, Annual Review of Biomedical Engineering 14, 2012, 1-16). 그 후에 hBMP2 cmRNA 리포플렉스를 진공 건조에 의해 콜라겐 스폰지 상에 안정화시키고 바로 사용 가능한 생체물질로 형성하였다. 마지막에, 본 발명의 생체물질의 효능을 동물 모델을 이용해 평가하여, 생체 내 골 재생을 위한 hBMP2 cmRNA 전달에 있어 본 발명의 기법의 기능성을 입증하였다.
다양한 연구는 상이한 담체를 이용한 골 조직 공학에서 BMP2 단백질의 효과를 입증하였다 (Meinel, Biomaterials 27, 2006, 4993-5002; Kempen, Biomaterials 30, 2009, 2816-2825). 그러나, 현재 재조합 hBMP2를 위해 FDA 승인된 담체는 콜라겐뿐이다. 결과적으로, 안정화된 hBMP2 cmrna를 위한 담체로서, 콜라겐의 효율을 본 연구에서 조사하였다.
생체 내 실험을 수행하기 위하여, 로딩 및 비로딩된 콜라겐 스폰지를 래트 대퇴골 결손 내로 이식하였다. 2주 후에, 래트를 희생시키고 골 형성을 μ-CT 및 면역조직화학을 이용하여 평가하였다. 수득된 결과는 MC3T3-E1 세포에서 시험관 내 골 재생의 결과와 유사하였다. μ-CT 결과 및 면역조직화학 둘 다 공 콜라겐에 비해 hBMP2 cmRNA 로딩된 콜라겐으로 처리된 결손에서 유의미하게 더 높은 골 형성을 나타내었다 (도 21, 18A 및 B, 및 도 29). 뼈의 상이한 부분 (골막, 피질 및 속질)에서의 추가 분석은 최대 골 형성이 속질 영역에서 일어났음을 입증하였다 (도 28, 도 21 A, 및 도 18 A). 이상적인 조직 공학의 경우, 새로운 뼈는 피질 영역 (cortical area) 내에 대부분 형성되어야 하지만, 본원에서 이러한 속질 골 형성은 골 결손 내 콜라겐 스폰지의 배치에 기인한다. 본 발명의 연구에서, 로딩 및 비로딩된 콜라겐 스폰지를 (피질 부분에서만 아니라) 전체 골 결손에 배치하였다. 속질 영역은 뼈의 다른 부분에 비해 훨씬 더 많은 BMSC를 함유하기 때문에, 최대 골 형성이 이곳에서 일어났다. 다시 말해, 피질 골 형성을 보기 위해서, hBMP2 cmRNA-로딩된 콜라겐 스폰지는 피질 영역 바로 그 안에 배치되어야 하는데, 이는 래트 뼈의 작은 크기로 인해 래트 모델에서는 실현 가능하지 않다. 재조합 BMP2 단백질로 동일한 동물 모델을 처리하는, 다른 간행물은 또한 2주째에 피질에 비해 속질에서 더 많은 골 형성을 나타낸 바 있다. 그러나, 더 많은 피질 골 형성이 4주째에 관찰되었다 (Keibl, Injury 42, 2011, 814-820). 따라서, 이후 시점에서의 추가 실험은 피질 영역에서 골 재생의 조사에 유용할 수 있다.
유의미하게 더 많은 섬유상 조직이 hBMP2 처리군에서 생성되었음이 추가의 병리학적 분석에서 입증되었다 (도 18C). 이는 또한 골 치유 과정에서와 같이, 골 치유 형성의 신호로서 고려될 수 있고, 섬유상 조직은 기능적 섬유상 조직으로, 그 후에는 유골 형성으로의 경향을 따를 수 있다 (Luellmann-Rauch, De Boeck Suprerieur, 2008). 유사하게, 더 많은 유골 형성이 hBMP2 cmRNA 처리군에서 검출되었다 (도 18D).
이들 결과는, hBMP2 cmRNA-로딩 및 비로딩된 콜라겐 스폰지가 골 형성을 위해 거의 동일하게 작용하였던, MSC를 사용한 시험관 내 골 재생에서 나타났던 결과와 상이하였다 (도 20B). 소분자, 성장인자 및 사이토카인의 존재와 같은, 다량의 인자들이 생체 내 골 재생을 위한 bmp 및 콜라겐 스폰지의 효과에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이 차이는 시험관 내 및 생체 내 환경에서의 차이로부터 기인할 수 있다 (Lynch, Journal of Periodontology 62, 1991, 710-716; Wan, PNASA 105, 2008, 868-691; Mountziaris, Tissue Engineering, Part B: Reviews 14, 2008, 179-186). 이러한 인자들이 시험관 내 상황에서는 결여되고, 따라서 생체 내 결과는 시험관 내 결과를 정확히 따르지 않을 수 있다. 따라서, 콜라겐 스폰지, 및 본원에 기술된 다른 담체는 바람직한 cmRNA 리포플렉스로 뿐만 아니라, 소분자 및 사이토카인으로 사전-로딩될 수 있고, 이는 스폰지 내부로 MSC의 이동을 증강시키며 (Xu, Oncology Reports 23, 2010, 1561-1567; Wu, Stem Cell Reviews and Reports 8, 2012, 243-250), 따라서 형질감염 효능을 개선할 수 있다.
골 조직형태계측법 (
Histomorphometry
)의 추가 결과:
부검 후, 대퇴골을 회수하고, 주변 연조직을 제거한 후 이어서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 고정하였다. 그 다음에, 샘플을 구배된 (graded) 알코올 및 자일렌 중에 침지시켜 탈수시켰고 마지막으로 메틸메타크릴레이트 (MMA) 중에 포매시켰다. 이어서 마이크로 분쇄된 (micromilled) 단편을 준비하고 본 코사 (Von Kossa)의 프로토콜에 따라서 톨루이딘 블루 (Toluidine Blue)로 염색하고 타르트레이트 내성 산 포스파타제 (Tartrate Resistant Acid Phosphatase, TRAcP)를 준비하였다.
드릴 구멍 영역을 조직형태계측법을 위해 이론적으로 4개 영역으로 구분하였다. 즉:
본 코사 염색된 절편을, 새로운 뼈의 형성을 나타내는 무기질화 조직을 나타내는지에 대해 조사하였다. 이 절차를 이용하여 유의미하게 (만-휘트니 U-검정 (Mann-Whitney's U-Test)을 이용해 p = 0.01) 조직 부피당 더 많은 양의 무기질화된 조직 (BV/TV)이 hBMP-2를 코딩하는 cmRNA이 로딩된 콜라겐 스폰지가 이식된 드릴 구멍 내 영역 M4에서 발견되었고, 이는 골수 내부의 임플란트의 외표면에서 증강된 골 형성을 나타낸다. 조혈 줄기세포가 주위 표면에서 임플란트와 가장 집중적으로 접촉할 것 같지만, 이 부위에서 뼈의 형성이 예상되었다 (도 30A).
드릴 구멍 주변의 골막 영역 (M1)은 단지 공 스폰지가 이식된 뼈에서보다 hBMP-2 코딩 cmRNA-로딩된 스폰지가 이식된 뼈에서 전체적으로 더 많은 양의 조직을 나타내었고, 이는 기능적 hBMP-2의 과발현의 결과로서 증가된 골형성 활성을 나타낸다 (도 30B).
톨루올 블루 (toluol blue) 염색된 절편의 조사는 hBMP-2 코딩 cmRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지의 이식 시 치밀부 내부의 드릴 구멍의 영역 (M2)에서 유의미하게 더 많은 섬유상 조직을 나타내었다 (도 30C). 더욱이, 더 많은 섬유상 조직이 관찰되었을 뿐만 아니라 유골로의 섬유상 조직의 형성이 또한 증가되었고 (도 30D), 이는 새로 발생하는 골 조직의 전구체로서 세포외 기질의 더 많은 형성을 나타낸다.
TRAcP 염색은 hBMP-2를 코딩하는 cmRNA가 로딩된 콜라겐 스폰지로의 처리 시 치밀 영역 (M2) 내부에서 골 시야측정계 (perimeter)의 밀리미터당 유의미하게 더 적은 파골세포 (N.Oc/B.Pm)를 나타내었고, 이는 드릴 구멍의 뼈 표면에서 염증 과정에 기인한 골 흡수가 더 적음을 나타낸다 (도 30E).
실시예
14. 콜라겐
스폰지
상에서 진공-건조된
cmRNA
리포플렉스의
안정성 어세이.
장기간 안정성 평가를 수행하여 생체물질로서 콜라겐 스폰지 상에서 진공-건조된 cmRNA 리포플렉스의 유효 기간을 추정하였다. 이 목적을 위해, 콜라겐 스폰지 상에 진공-건조된 Met luc cmRNA 리포플렉스를 함유하는 96-웰 플레이트를 진공-밀봉하고 RT에서 보관하였다. 특정 시점에서, 플레이트 중 하나를 스폰지 상에 NIH3T3 세포를 접종하는데 사용하였다. 세포 접종 24시간 후, 메트리디아 루시퍼라제의 발현을 측정하였다. 그 후에 다양한 시점 동안 보관된 플레이트로부터의 발현을 진공-건조 후 직접 사용되었던 플레이트에서의 발현과 비교하였다 (시점 = 0). 도 22에 나타난 바와 같이, 적용된 cmRNA 용량과는 무관하게, 콜라겐 스폰지 상의 진공-건조된 cmRNA 복합체는 RT에서 적어도 6개월 동안 안정하였다.
본 발명은 하기 표를 참조한다:
[표 1] 0.5:1의 철-대-cmRNA 비 (w/w)로 제제화된 DF-Gold/hBMP-2 cmRNA 리포플렉스 및 SO-Mag6-115/DF-Gold/hBMP-2 cmRNA 자성 리포플렉스의 특징. 각 값은 평균 ± SD (n=30)를 나타낸다.
[표 2] qRT-PCR 어세이에 사용된 고안된 래트 프라이머의 설명
[표 3] qRT-PCR 어세이에 사용된 고안된 인간 프라이머의 설명
[표 4] 이용되는 cmRNA에서 적합한 변형의 예시
[표 5] bmp의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 데이터베이스 엔트리
[표 6] mRNA 복합체의 특징
본 발명은 하기 (추가의) 참조를 인용한다:
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SEQUENCE LISTING
<110> ethris GmbH
<120> Induction of osteogenesis by delivering BMP encoding RNA
<130> IPA170451-DE
<150> EP 14192539.6
<151> 2014-11-10
<160> 47
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 1191
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> 1..1191
<223> /transl_table=1
<400> 1
atg gtg gcc ggg acc cgc tgt ctt cta gcg ttg ctg ctt ccc cag gtc 48
Met Val Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gln Val
1 5 10 15
ctc ctg ggc ggc gcg gct ggc ctc gtt ccg gag ctg ggc cgc agg aag 96
Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys
20 25 30
ttc gcg gcg gcg tcg tcg ggc cgc ccc tca tcc cag ccc tct gac gag 144
Phe Ala Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gln Pro Ser Asp Glu
35 40 45
gtc ctg agc gag ttc gag ttg cgg ctg ctc agc atg ttc ggc ctg aaa 192
Val Leu Ser Glu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser Met Phe Gly Leu Lys
50 55 60
cag aga ccc acc ccc agc agg gac gcc gtg gtg ccc ccc tac atg cta 240
Gln Arg Pro Thr Pro Ser Arg Asp Ala Val Val Pro Pro Tyr Met Leu
65 70 75 80
gac ctg tat cgc agg cac tca ggt cag ccg ggc tca ccc gcc cca gac 288
Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly Gln Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp
85 90 95
cac cgg ttg gag agg gca gcc agc cga gcc aac act gtg cgc agc ttc 336
His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe
100 105 110
cac cat gaa gaa tct ttg gaa gaa cta cca gaa acg agt ggg aaa aca 384
His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr Ser Gly Lys Thr
115 120 125
acc cgg aga ttc ttc ttt aat tta agt tct atc ccc acg gag gag ttt 432
Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu Glu Phe
130 135 140
atc acc tca gca gag ctt cag gtt ttc cga gaa cag atg caa gat gct 480
Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gln Val Phe Arg Glu Gln Met Gln Asp Ala
145 150 155 160
tta gga aac aat agc agt ttc cat cac cga att aat att tat gaa atc 528
Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile
165 170 175
ata aaa cct gca aca gcc aac tcg aaa ttc ccc gtg acc aga ctt ttg 576
Ile Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr Arg Leu Leu
180 185 190
gac acc agg ttg gtg aat cag aat gca agc agg tgg gaa agt ttt gat 624
Asp Thr Arg Leu Val Asn Gln Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser Phe Asp
195 200 205
gtc acc ccc gct gtg atg cgg tgg act gca cag gga cac gcc aac cat 672
Val Thr Pro Ala Val Met Arg Trp Thr Ala Gln Gly His Ala Asn His
210 215 220
gga ttc gtg gtg gaa gtg gcc cac ttg gag gag aaa caa ggt gtc tcc 720
Gly Phe Val Val Glu Val Ala His Leu Glu Glu Lys Gln Gly Val Ser
225 230 235 240
aag aga cat gtt agg ata agc agg tct ttg cac caa gat gaa cac agc 768
Lys Arg His Val Arg Ile Ser Arg Ser Leu His Gln Asp Glu His Ser
245 250 255
tgg tca cag ata agg cca ttg cta gta act ttt ggc cat gat gga aaa 816
Trp Ser Gln Ile Arg Pro Leu Leu Val Thr Phe Gly His Asp Gly Lys
260 265 270
ggg cat cct ctc cac aaa aga gaa aaa cgt caa gcc aaa cac aaa cag 864
Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys His Lys Gln
275 280 285
cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag aga cac cct ttg tac gtg gac 912
Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp
290 295 300
ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg att gtg gct ccc ccg ggg tat 960
Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr
305 310 315 320
cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc cct ttt cct ctg gct gat cat 1008
His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His
325 330 335
ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt cag acg ttg gtc aac tct gtt 1056
Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
340 345 350
aac tct aag att cct aag gca tgc tgt gtc ccg aca gaa ctc agt gct 1104
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
355 360 365
atc tcg atg ctg tac ctt gac gag aat gaa aag gtt gta tta aag aac 1152
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
370 375 380
tat cag gac atg gtt gtg gag ggt tgt ggg tgt cgc tag 1191
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
385 390 395
<210> 2
<211> 1296
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> 1..1296
<223> /transl_table=1
<400> 2
atg cac gtg cgc tca ctg cga gct gcg gcg ccg cac agc ttc gtg gcg 48
Met His Val Arg Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro His Ser Phe Val Ala
1 5 10 15
ctc tgg gca ccc ctg ttc ctg ctg cgc tcc gcc ctg gcc gac ttc agc 96
Leu Trp Ala Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ala Asp Phe Ser
20 25 30
ctg gac aac gag gtg cac tcg agc ttc atc cac cgg cgc ctc cgc agc 144
Leu Asp Asn Glu Val His Ser Ser Phe Ile His Arg Arg Leu Arg Ser
35 40 45
cag gag cgg cgg gag atg cag cgc gag atc ctc tcc att ttg ggc ttg 192
Gln Glu Arg Arg Glu Met Gln Arg Glu Ile Leu Ser Ile Leu Gly Leu
50 55 60
ccc cac cgc ccg cgc ccg cac ctc cag ggc aag cac aac tcg gca ccc 240
Pro His Arg Pro Arg Pro His Leu Gln Gly Lys His Asn Ser Ala Pro
65 70 75 80
atg ttc atg ctg gac ctg tac aac gcc atg gcg gtg gag gag ggc ggc 288
Met Phe Met Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Met Ala Val Glu Glu Gly Gly
85 90 95
ggg ccc ggc ggc cag ggc ttc tcc tac ccc tac aag gcc gtc ttc agt 336
Gly Pro Gly Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser
100 105 110
acc cag ggc ccc cct ctg gcc agc ctg caa gat agc cat ttc ctc acc 384
Thr Gln Gly Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gln Asp Ser His Phe Leu Thr
115 120 125
gac gcc gac atg gtc atg agc ttc gtc aac ctc gtg gaa cat gac aag 432
Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu Val Glu His Asp Lys
130 135 140
gaa ttc ttc cac cca cgc tac cac cat cga gag ttc cgg ttt gat ctt 480
Glu Phe Phe His Pro Arg Tyr His His Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu
145 150 155 160
tcc aag atc cca gaa ggg gaa gct gtc acg gca gcc gaa ttc cgg atc 528
Ser Lys Ile Pro Glu Gly Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu Phe Arg Ile
165 170 175
tac aag gac tac atc cgg gaa cgc ttc gac aat gag acg ttc cgg atc 576
Tyr Lys Asp Tyr Ile Arg Glu Arg Phe Asp Asn Glu Thr Phe Arg Ile
180 185 190
agc gtt tat cag gtg ctc cag gag cac ttg ggc agg gaa tcg gat ctc 624
Ser Val Tyr Gln Val Leu Gln Glu His Leu Gly Arg Glu Ser Asp Leu
195 200 205
ttc ctg ctc gac agc cgt acc ctc tgg gcc tcg gag gag ggc tgg ctg 672
Phe Leu Leu Asp Ser Arg Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu Gly Trp Leu
210 215 220
gtg ttt gac atc aca gcc acc agc aac cac tgg gtg gtc aat ccg cgg 720
Val Phe Asp Ile Thr Ala Thr Ser Asn His Trp Val Val Asn Pro Arg
225 230 235 240
cac aac ctg ggc ctg cag ctc tcg gtg gag acg ctg gat ggg cag agc 768
His Asn Leu Gly Leu Gln Leu Ser Val Glu Thr Leu Asp Gly Gln Ser
245 250 255
atc aac ccc aag ttg gcg ggc ctg att ggg cgg cac ggg ccc cag aac 816
Ile Asn Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ile Gly Arg His Gly Pro Gln Asn
260 265 270
aag cag ccc ttc atg gtg gct ttc ttc aag gcc acg gag gtc cac ttc 864
Lys Gln Pro Phe Met Val Ala Phe Phe Lys Ala Thr Glu Val His Phe
275 280 285
cgc agc atc cgg tcc acg ggg agc aaa cag cgc agc cag aac cgc tcc 912
Arg Ser Ile Arg Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser
290 295 300
aag acg ccc aag aac cag gaa gcc ctg cgg atg gcc aac gtg gca gag 960
Lys Thr Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu
305 310 315 320
aac agc agc agc gac cag agg cag gcc tgt aag aag cac gag ctg tat 1008
Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr
325 330 335
gtc agc ttc cga gac ctg ggc tgg cag gac tgg atc atc gcg cct gaa 1056
Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu
340 345 350
ggc tac gcc gcc tac tac tgt gag ggg gag tgt gcc ttc cct ctg aac 1104
Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn
355 360 365
tcc tac atg aac gcc acc aac cac gcc atc gtg cag acg ctg gtc cac 1152
Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His
370 375 380
ttc atc aac ccg gaa acg gtg ccc aag ccc tgc tgt gcg ccc acg cag 1200
Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln
385 390 395 400
ctc aat gcc atc tcc gtc ctc tac ttc gat gac agc tcc aac gtc atc 1248
Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile
405 410 415
ctg aag aaa tac aga aac atg gtg gtc cgg gcc tgt ggc tgc cac tag 1296
Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His
420 425 430
<210> 3
<211> 396
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> [CDS]:1..1191 from SEQ ID NO 1
<400> 3
Met Val Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gln Val
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys
20 25 30
Phe Ala Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gln Pro Ser Asp Glu
35 40 45
Val Leu Ser Glu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser Met Phe Gly Leu Lys
50 55 60
Gln Arg Pro Thr Pro Ser Arg Asp Ala Val Val Pro Pro Tyr Met Leu
65 70 75 80
Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly Gln Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp
85 90 95
His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe
100 105 110
His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr Ser Gly Lys Thr
115 120 125
Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu Glu Phe
130 135 140
Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gln Val Phe Arg Glu Gln Met Gln Asp Ala
145 150 155 160
Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile
165 170 175
Ile Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr Arg Leu Leu
180 185 190
Asp Thr Arg Leu Val Asn Gln Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser Phe Asp
195 200 205
Val Thr Pro Ala Val Met Arg Trp Thr Ala Gln Gly His Ala Asn His
210 215 220
Gly Phe Val Val Glu Val Ala His Leu Glu Glu Lys Gln Gly Val Ser
225 230 235 240
Lys Arg His Val Arg Ile Ser Arg Ser Leu His Gln Asp Glu His Ser
245 250 255
Trp Ser Gln Ile Arg Pro Leu Leu Val Thr Phe Gly His Asp Gly Lys
260 265 270
Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys His Lys Gln
275 280 285
Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp
290 295 300
Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr
305 310 315 320
His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His
325 330 335
Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
340 345 350
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
355 360 365
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
370 375 380
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
385 390 395
<210> 4
<211> 431
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> [CDS]:1..1296 from SEQ ID NO 2
<400> 4
Met His Val Arg Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro His Ser Phe Val Ala
1 5 10 15
Leu Trp Ala Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ala Asp Phe Ser
20 25 30
Leu Asp Asn Glu Val His Ser Ser Phe Ile His Arg Arg Leu Arg Ser
35 40 45
Gln Glu Arg Arg Glu Met Gln Arg Glu Ile Leu Ser Ile Leu Gly Leu
50 55 60
Pro His Arg Pro Arg Pro His Leu Gln Gly Lys His Asn Ser Ala Pro
65 70 75 80
Met Phe Met Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Met Ala Val Glu Glu Gly Gly
85 90 95
Gly Pro Gly Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser
100 105 110
Thr Gln Gly Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gln Asp Ser His Phe Leu Thr
115 120 125
Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu Val Glu His Asp Lys
130 135 140
Glu Phe Phe His Pro Arg Tyr His His Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu
145 150 155 160
Ser Lys Ile Pro Glu Gly Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu Phe Arg Ile
165 170 175
Tyr Lys Asp Tyr Ile Arg Glu Arg Phe Asp Asn Glu Thr Phe Arg Ile
180 185 190
Ser Val Tyr Gln Val Leu Gln Glu His Leu Gly Arg Glu Ser Asp Leu
195 200 205
Phe Leu Leu Asp Ser Arg Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu Gly Trp Leu
210 215 220
Val Phe Asp Ile Thr Ala Thr Ser Asn His Trp Val Val Asn Pro Arg
225 230 235 240
His Asn Leu Gly Leu Gln Leu Ser Val Glu Thr Leu Asp Gly Gln Ser
245 250 255
Ile Asn Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ile Gly Arg His Gly Pro Gln Asn
260 265 270
Lys Gln Pro Phe Met Val Ala Phe Phe Lys Ala Thr Glu Val His Phe
275 280 285
Arg Ser Ile Arg Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser
290 295 300
Lys Thr Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu
305 310 315 320
Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr
325 330 335
Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu
340 345 350
Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn
355 360 365
Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His
370 375 380
Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln
385 390 395 400
Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile
405 410 415
Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His
420 425 430
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 5
ccgtgtcagc aaaacttctt t 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 6
gctcacgtcg ctcatcttg 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 7
tggaacactg ggtcccata 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 8
gacctggtct tccctccaa 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 9
cccaactgtc aggagctaga g 21
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 10
gatgtggcgg ctgtgaat 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 11
tgcttgaaga cctatgtggg ta 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 12
aaaggcagca tttggggtat 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 13
acggcagctt cagctttg 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 14
gaggcagaga gagggaacag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 15
atcgacagtc aggcgagttc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 16
gctgtgaaac tcgtggctct 20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 17
ctgatgagca gggcgagt 18
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 18
tccgagaagt tcttaagcct ca 22
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 19
ccccctacat gctagacctg t 21
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 20
cactcgtttc tggtagttct tcc 23
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 21
tgcctaggcg catttcaggt gc 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 22
tgaggtgact ggcggggtgt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 23
acgtggctaa gaatgtcatc 20
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 24
ctggtaggcg atgtcctta 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 25
cagccgcttc acctacagc 19
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 26
ttttgtattc aatcactgtc ttgcc 25
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 27
gagggcgagg acgaggctta 20
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 28
tctaacagag gcaaaactga gcacc 25
<210> 29
<211> 1674
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of uncapped hBmp2 mRNA when the vector is linearized
with XbaI
<400> 29
gagaataact tgcgcacccc actttgcgcc ggtgcctttg ccccagcgga gcctgcttcg 60
ccatctccga gccccaccgc ccctccactc ctcggccttg cccgacactg agacgctgtt 120
cccagcgtga aaagagagac tgcgcggccg gcacccggga gaaggaggag gcaaagaaaa 180
ggaacggaca ttcggtcctt gcgccaggtc ctttgaccag agtttttcca tgtggacgct 240
ctttcaatgg acgtgtcccc gcgtgcttct tagacggact gcggtctcct aaaggtcggc 300
caccatggtc gccggcacca gatgtctgct ggctctgctg ctgcctcagg tgctgctggg 360
cggagctgcc ggactggtgc ctgagctggg cagaagaaag ttcgccgctg ccagctctgg 420
cagacccagc agccagcctt ccgacgaggt gctgagcgag ttcgagctgc ggctgctgag 480
catgttcggc ctgaagcaga ggcccacccc cagcagagat gccgtggtgc ccccctacat 540
gctggacctg tacagacggc acagcggaca gcctggaagc cctgcccctg accacagact 600
ggaaagagcc gccagccggg ccaacaccgt gcggagcttt caccacgagg aaagcctgga 660
agaactgccc gagacaagcg gcaagaccac ccggcggttc tttttcaacc tgtcctccat 720
ccccaccgaa gagttcatca ccagcgccga actccaggtg ttccgcgagc agatgcagga 780
cgccctgggc aacaacagct catttcacca ccggatcaac atctacgaga tcatcaagcc 840
cgccaccgcc aacagcaagt tccccgtgac ccggctgctg gacacccggc tggtcaacca 900
gaacgccagc agatgggaga gcttcgacgt gacccctgcc gtgatgagat ggaccgccca 960
gggccacgcc aaccacggct ttgtggtgga agtggcccac ctggaagaga agcagggcgt 1020
gtccaagcgg cacgtgcgga tcagcagaag cctgcaccag gacgagcaca gctggtccca 1080
gatccggccc ctgctggtca ccttcggcca cgatggcaag ggccaccccc tgcacaagag 1140
agagaagcgg caggccaagc acaagcagcg gaagcggctg aagtccagct gcaagcggca 1200
ccccctgtac gtggacttca gcgacgtggg ctggaacgac tggatcgtgg cccctcccgg 1260
ctaccacgcc ttctactgcc acggcgagtg ccccttcccc ctggccgacc acctgaacag 1320
caccaaccac gccatcgtgc agaccctggt caacagcgtg aactccaaga tccccaaggc 1380
ctgctgcgtg cccaccgagc tgagcgccat cagcatgctg tacctggacg agaacgagaa 1440
ggtggtgctg aagaactacc aggacatggt ggtggaaggc tgtggctgta gatgatacag 1500
caaaattaaa tacataaata tatatataga attctgcaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag cggccgctcg agtc 1674
<210> 30
<211> 1661
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of uncapped hBmp2 mRNA when the vector is linearized
with NotI
<400> 30
gagaataact tgcgcacccc actttgcgcc ggtgcctttg ccccagcgga gcctgcttcg 60
ccatctccga gccccaccgc ccctccactc ctcggccttg cccgacactg agacgctgtt 120
cccagcgtga aaagagagac tgcgcggccg gcacccggga gaaggaggag gcaaagaaaa 180
ggaacggaca ttcggtcctt gcgccaggtc ctttgaccag agtttttcca tgtggacgct 240
ctttcaatgg acgtgtcccc gcgtgcttct tagacggact gcggtctcct aaaggtcggc 300
caccatggtc gccggcacca gatgtctgct ggctctgctg ctgcctcagg tgctgctggg 360
cggagctgcc ggactggtgc ctgagctggg cagaagaaag ttcgccgctg ccagctctgg 420
cagacccagc agccagcctt ccgacgaggt gctgagcgag ttcgagctgc ggctgctgag 480
catgttcggc ctgaagcaga ggcccacccc cagcagagat gccgtggtgc ccccctacat 540
gctggacctg tacagacggc acagcggaca gcctggaagc cctgcccctg accacagact 600
ggaaagagcc gccagccggg ccaacaccgt gcggagcttt caccacgagg aaagcctgga 660
agaactgccc gagacaagcg gcaagaccac ccggcggttc tttttcaacc tgtcctccat 720
ccccaccgaa gagttcatca ccagcgccga actccaggtg ttccgcgagc agatgcagga 780
cgccctgggc aacaacagct catttcacca ccggatcaac atctacgaga tcatcaagcc 840
cgccaccgcc aacagcaagt tccccgtgac ccggctgctg gacacccggc tggtcaacca 900
gaacgccagc agatgggaga gcttcgacgt gacccctgcc gtgatgagat ggaccgccca 960
gggccacgcc aaccacggct ttgtggtgga agtggcccac ctggaagaga agcagggcgt 1020
gtccaagcgg cacgtgcgga tcagcagaag cctgcaccag gacgagcaca gctggtccca 1080
gatccggccc ctgctggtca ccttcggcca cgatggcaag ggccaccccc tgcacaagag 1140
agagaagcgg caggccaagc acaagcagcg gaagcggctg aagtccagct gcaagcggca 1200
ccccctgtac gtggacttca gcgacgtggg ctggaacgac tggatcgtgg cccctcccgg 1260
ctaccacgcc ttctactgcc acggcgagtg ccccttcccc ctggccgacc acctgaacag 1320
caccaaccac gccatcgtgc agaccctggt caacagcgtg aactccaaga tccccaaggc 1380
ctgctgcgtg cccaccgagc tgagcgccat cagcatgctg tacctggacg agaacgagaa 1440
ggtggtgctg aagaactacc aggacatggt ggtggaaggc tgtggctgta gatgatacag 1500
caaaattaaa tacataaata tatatataga attctgcaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
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with NotI
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tctttctgct taggtctgct cttgccgact tttcactgga caacgaggtc cattcctcat 180
ttatccaccg tcgactgaga agccaagaga ggcgggaaat gcagcgcgag attttgtcta 240
tcctgggatt gccccataga cctcgtcccc atctccaagg gaaacacaac tctgctccca 300
tgttcatgct ggatctgtac aatgccatgg cagtggagga aggtggtggc ccaggaggac 360
agggcttctc ctatccgtac aaggccgtct tttccaccca aggtccaccg ttggcgagtc 420
tccaggattc ccatttcctg accgatgcgg acatggtgat gtcattcgtg aacctggtgg 480
aacacgacaa agagttcttt caccccaggt atcaccacag agagttccgc ttcgacttga 540
gtaaaatccc tgagggagaa gccgttactg ccgccgagtt tcgcatttac aaggactaca 600
ttcgggagag gttcgataac gaaaccttcc ggatatccgt gtatcaggtg ctgcaagagc 660
atctggggag agagtccgat ctcttcctcc tggacagtag gacactgtgg gcgtctgagg 720
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ataacctggg gcttcagctg tctgtcgaga cactggatgg gcagagcatc aatcccaaac 840
tggctgggtt gatcggacgc catggtccac agaacaaaca gcctttcatg gtagctttct 900
ttaaggccac agaagtgcac tttcggagta ttcggagcac tggcagcaaa cagagaagcc 960
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atctcggatg gcaggactgg attatcgcac cagagggcta tgctgcctac tattgcgaag 1140
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tccgagaagt tcttaagcct ca 22
Claims (33)
- 환자에서
(i) 골 질환, 골 장애 또는 골 손상을 치료 또는 예방하고/하거나,
(ii) 골형성 분화, 골형성 (osteogenesis), 골화 (ossification), 골 재생 및/또는 골 형태형성을 유도 또는 증강시키는 데 사용하기 위한, 약제학적 조성물로서, 하기를 포함하는, 약제학적 조성물:
(i) 골 형태형성 단백질 (BMP)을 코딩하는 서열을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 (RNA); 및
(ii) 하기 화학식 (IV)의 구조를 갖는 리피도이드인 올리고(알킬렌 아민)을 포함하는 성분:
상기 화학식 (IV)에서 변수 a, b, p, m, n 및 R1 내지 R6은 하기와 같이 정의되고:
a는 1이고 b는 2이고;
p는 1이고;
m은 1이고; n은 1이고;
R1 내지 R6은 서로 독립적으로, 수소, -CH2-CH(OH)-R7 기, 또는 -CH(R7)-CH2-OH 기로서, 여기서 R7은 C10 알킬이고, 단 R1 내지 R6 중 적어도 2개의 잔기는 -CH2-CH(OH)-R7 기 또는 -CH(R7)-CH2-OH 기이고, 여기서 R7은 C10 알킬임;
상기 화학식 (IV)에 표시된 질소 원자의 하나 이상은, 화학식 (IV)의 양이온성 리피도이드를 제공하도록 임의로 양성자화되고;
상기 리피도이드는 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민과 1,2-에폭시도데칸을 혼합하여 제조된 양이온성 지질임. - 제1항에 있어서, 상기 BMP가 BMP-2 또는 BMP-7인 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA가 비-화학적으로 변형되거나 화학적으로 변형된 RNA인 것인, 약제학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 리피도이드는 100 mg의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민을 575.07 mg의 1,2-에폭시도데칸과 혼합하여 제조된 양이온성 지질인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 리피도이드는, 100 mg의 N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민, 0.623 mmol을 575.07 mg의 1,2-에폭시도데칸, 3.12 mmol, (N-1) 당량과 혼합하여 제조된 양이온성 지질이고, 여기서 N은, N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 1 분자에서의 일차 아민 수의 2배에 이차 아민 수의 1배를 더한 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 혼합이 일정한 교반 하에 80℃에서 96시간 동안 수행되는, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 콜레스테롤, DPPC, DOPE 및 PEG-지질 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이
(i) DOPE, 콜레스테롤 및 DMPE-PEG; 또는
(ii) DPPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG
를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물. - 제11항에 있어서, 상기 DMG-PEG가 DMG-PEG 2k인, 약제학적 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 리피도이드, 및 (i) 또는 (ii)의 몰비가 8 : 5.3 : 4.4 : 0.9 또는 8 : 5.29 : 4.41 : 0.88이고, 상기 RNA의 포스페이트기에 대한 상기 리피도이드의 아미노기의 몰비가 8인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA가 단일-가닥 RNA인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA가 상기 리피도이드와 복합체를 형성하는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA가 생체내(in vivo) 전달되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA가 상기 환자 내로 도입되는 세포 내로 생체외(ex vivo) 전달되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 RNA가 상기 환자의 세포 내로 생체외(ex vivo) 전달되고 상기 RNA가 전달된 상기 세포가 상기 환자 내로 재도입되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA가, 골 성장의 유도가 요구되는, 상기 환자의 조직 내로 또는 그에 바로 인접하여 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 세포가 골전구세포인 것인, 약제학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 세포가 중간엽 줄기세포 (MSC)인 것인, 약제학적 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 MSC가 지방-유래 중간엽 줄기세포 (AMSC) 또는 골수-유래 MSC (BMSC)인 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA 및 상기 올리고(알킬렌 아민)이 첨가된 것이거나, 또는 상기 RNA 및 상기 올리고(알킬렌 아민)이 로딩된 것인, 매트릭스 또는 스캐폴드를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 매트릭스 또는 스캐폴드가 콜라겐 및/또는 피브린을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 매트릭스 또는 스캐폴드가 콜라겐 스폰지 및/또는 피브린 클롯 (clot) 또는 피브린 글루 (glue)인 것인, 약제학적 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 매트릭스 또는 스캐폴드가 진공-건조된 것인, 약제학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 세포가, 제1항에 정의된 상기 RNA가 첨가된 것이거나, 또는 제1항에 정의된 상기 RNA가 로딩된 것인, 매트릭스 또는 스캐폴드 상에 시딩(seeding)된 것인, 약제학적 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 매트릭스 또는 스캐폴드가 상기 환자의 뼈 또는 골 조직 내로 이식되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 RNA가, 화학적으로 변형된 RNA의 시티딘의 25%가 5-메틸시티딘 (m5C)이고 화학적으로 변형된 RNA의 유리딘의 25%가 2-티오유리딘 (s2U)이도록 화학적으로 변형된 RNA인 것인, 약제학적 조성물.
- 제23항에 정의된 매트릭스 또는 스캐폴드로서, 상기 RNA 및 상기 올리고(알킬렌 아민)이 첨가된 것이거나, 또는 상기 RNA 및 상기 올리고(알킬렌 아민)이 로딩된 것인, 매트릭스 또는 스캐폴드.
- 제1항 내지 제3항 및 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA의 연장 및/또는 지연된 전달을 위해 제제화(formulation)되고/되거나 사용되는, 약제학적 조성물.
- 제30항에 있어서, 상기 RNA의 연장 및/또는 지연된 전달을 위해 제제화되고/되거나 사용되는, 매트릭스 또는 스캐폴드.
- 제23항에 있어서, 상기 RNA의 연장 및/또는 지연된 전달을 위해 제제화되고/되거나 사용되는, 약제학적 조성물.
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