CN101124316A - 用于转染真核细胞的固定的可降解阳离子聚合物 - Google Patents

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CN101124316A CNA2005800434531A CN200580043453A CN101124316A CN 101124316 A CN101124316 A CN 101124316A CN A2005800434531 A CNA2005800434531 A CN A2005800434531A CN 200580043453 A CN200580043453 A CN 200580043453A CN 101124316 A CN101124316 A CN 101124316A
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Abstract

本发明公开了细胞转染/培养装置，其包括包被有作为转染试剂的可降解阳离子聚合物的固体支持物。在室温下方便地贮存该转染/培养装置直至使用。通过将目的核酸和待转染细胞加入所述转染/培养装置容易地完成细胞转染。通过使用本文所述转染/培养装置可在少于1小时的时间内完成细胞转染。

Description

用于转染真核细胞的固定的可降解阳离子聚合物
相关申请
本申请要求于2004年12月17日提交的美国临时申请第60/637,344号的优先权，在此以引用的方式将其并入。
发明背景
发明领域
本发明的实施方案涉及用于细胞转染的装置和方法。特别地，本发明的实施方案涉及细胞转染制剂和用该转染制剂处理的细胞培养装置。经处理的细胞培养装置可在室温下贮存并且提供简单快捷的转染方法。
相关技术的描述
基因转染方法可用于将核酸导入细胞中，还可用于研究基因调节和基因功能。高通量分析尤其有用，它可用于筛选多组DNA以鉴定编码具有所关注性质的产物的DNA。基因转染是将生物学上具有功能的核酸以核酸在细胞中保持其功能的方式递送和导入细胞中，尤其是真核细胞中。基因转染广泛应用于涉及基因调节、基因功能、分子治疗、信号转导、药物筛选、以及基因治疗研究的研究。随着对高等生物基因的克隆和分类的进行，研究人员设法揭示基因的功能并鉴定具有所需要性质的基因产物。不断增长的基因序列收集需要开发系统的和高通量的方法来表征基因产物和分析基因功能，细胞和分子生物学中其它领域的研究也是如此。
病毒基因载体和非病毒基因载体均已被用于基因送递。病毒载体表现出具有比非病毒载体高的转染效率，但是病毒载体的安全性妨碍了其可用性(Verma LM和Somia N.Nature 389(1997)，pp.239-242；MarhsallE.Science 286(2000)，pp.2244-2245)。尽管非病毒转染系统未表现出病毒载体的效率，然而由于非病毒载体与病毒载体相比其理论安全性较高，所以它们还是受到相当的关注。另外，病毒载体的制备是复杂且昂贵的过程，这限制了病毒载体的体外应用。与病毒载体的制备相比，非病毒载体的制备更为简单并且成本效益更高，这使得合成基因载体成为理想的转染试剂，特别是用于体外研究。
大部分非病毒载体模仿病毒进入细胞的重要特征以越过细胞屏障，该细胞屏障旨在防止外源遗传物质的渗入。根据基因载体的主链，非病毒基因载体可分为a)脂质/DNA复合物(lipoplexes)、b)聚合物/DNA复合物(polyplexes)、以及c)脂质/聚合物/DNA复合物(lipopolyplexes)。脂质/DNA复合物是核酸和脂质组分的的装配物，通常是阳离子型的。通过脂质/DNA复合物进行的基因转移称为脂转染。聚合物/DNA复合物是核酸和阳离子聚合物的复合物。脂质/聚合物/DNA复合物包含脂质和聚合物组分。通常这样的DNA复合物被进一步修饰以包含细胞靶向部分或细胞内靶向部分和/或膜失稳组分，例如病毒蛋白或肽或者破坏膜的合成肽。近来，也有将细菌和噬菌体作为穿梭载体用于将核酸转移到细胞中的描述。
大部分非病毒转染试剂是合成的阳离子型分子，并有报道其通过阳离子上的阳离子位点与核酸上的阴离子位点相互作用“包被”该核酸。带正电荷的DNA-阳离子型分子复合物与带负电荷的细胞膜相互作用辅助DNA通过非特异性胞吞作用穿过细胞膜。(Schofield，Brit.Microencapsulated.Bull，51(1)：56-71(1995))。在大部分常规基因转染方案中，细胞在转染前16至24小时被接种到细胞培养装置上。通常在单独的试管中制备转染试剂(例如阳离子聚合物载体)和DNA，并且将每种溶液分别在培养基(不含胎牛血清或抗生素)中稀释。然后在连续涡旋振荡(vortexing)混合物的条件下通过缓慢地将一种溶液加入到另一种溶液中小心地混合溶液。然后将混合物在室温下孵育15-45分钟，使转染试剂和DNA之间形成复合物并且除去残余的血清和抗生素。转染前，移除细胞培养基，并使用缓冲液洗涤该细胞。将含有DNA转染试剂复合物的溶液加入至细胞，孵育约3-4小时。然后用新鲜培养基替换含有转染试剂的培养基。最后在一个或多个特定时间点分析该细胞。这显然是一个耗时的过程，特别是当待转染的样品数目非常大时。
在常规的转染方法中存在几个主要问题。首先，常规方法耗费时间，特别是当在转染实验中要用许多细胞或基因样品时。而且，由于需要多步操作，常规转染方法所得到的结果难以重复。例如，DNA转染试剂复合物的形成受核酸和试剂的浓度和体积、pH、温度、所用缓冲液的类型、涡旋振荡的长短和速率、孵育时间、以及其它因素的影响。尽管可以使用相同的试剂和方法，却可能得到不同的结果。从多步方法得到的结果通常受每一步的人为或机械误差或其它变化的影响。此外，转染后更新细胞培养基会干扰细胞，可能使它们脱离培养它们的表面，因此导致最终结果的变化和不可预知性。由于所提到的全部因素，常规转染方法要求高度熟练的人员来进行转染实验或测定。
研究人员需要更为简单并且成本效益更高的转染细胞的方法，并且需要高通量转染细胞的方法以有效转染大量样品。
Sabatini(U.S.2002/000664A1)描述了固定在载玻片上的含有DNA的组合物。然而该系统仅允许用事先放置的DNA进行转染。这是该系统的主要缺点。由于它仅提供了使用事先放置的DNA进行转染，每个研究人员不能使用他或她需要的核酸。
美国专利公开第2004/0138154A1号描述了使用脂质聚合物介导转染的细胞培养/转染装置，在此以引用的方式将其并入。美国专利公开第2005/0176132A1号描述了钙盐介导的可转染细胞培养装置，在此以引用的方式将其并入。
美国专利公开第2003/0215395A1号描述了可用于基因递送的可降解聚合物，在此以引用的方式将其并入。
如上所述，常规转染是耗时且技术复杂的过程。通常，需要三个步骤：1)将细胞接种在细胞培养板或培养皿上，并且孵育直至获得足够的融合；2)制备转染试剂/核酸复合物；以及3)将目的核酸和转染试剂一起加入并再进行孵育。需要两个孵育过程，一般需要花费两天以上的时间完成所有步骤。相反，本发明的实施方案提供了仅涉及一个孵育步骤的简单方法。事先包被有转染试剂的细胞培养装置使得能够通过连续加入目的核酸和细胞培养物进行转染。然后可以将被转染的细胞在同一装置中培养。因此，可以在该细胞培养装置中转染和培养细胞，无须在转染后立即对细胞进行进一步操作。转染效率与常规转染相当，但是操作需要的时间减少了一天多。本发明的实施方案包括可转染细胞培养装置，该装置大大减少了转染测定的工作量，并且使得能够在低细胞毒性的简单方法中使用任何目的核酸进行转染。而且，本发明的可转染细胞培养装置在室温下长期贮存是稳定的。
发明概述
本发明的实施方案涉及包括包被有转染试剂混合物的固体支持物的装置。优选地，包被层中的转染试剂不与诸如核酸等生物分子复合。固体支持物优选为聚苯乙烯树脂、环氧树脂或玻璃。优选地，该包被层在固体支持物的表面上。转染试剂的涂布量优选为约0.1μg/cm2至约100μg/cm2。优选地，转染试剂为聚合物。更优选地，所述聚合物为阳离子聚合物。优选地，转染试剂包含可降解阳离子聚合物。更优选地，通过阳离子化合物或低聚物与可降解交联剂连接制成所述可降解阳离子聚合物。转染试剂可以同时包含可降解阳离子聚合物和不可降解阳离子聚合物。优选地，不可降解阳离子聚合物与可降解阳离子聚合物的重量比为1∶0.5至1∶20(不可降解∶可降解)。
在优选实施方案中，转染试剂包括多种阳离子分子和至少一种在枝化排列中连接所述阳离子分子的可降解交联剂分子，其中所述阳离子分子选自：
(i)式(A)或式(B)的阳离子化合物或其组合：
Figure A20058004345300101
                R6_NH-R7_R8
式A                                       式B
其中R1为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、另一个式A、或式B；
R2为式：-(CH2)a-的直链亚烷基基团，其中a为2至10的整数；
R3为式：-(CbH2b)-的直链或支链亚烷基基团，其中b为2至10的整数；
R4为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、另一个式A、或式B；
R5为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、另一个式A、或式B；
R6为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、式A、或另一个式B；
R7为式：-(CcH2c)-的直链或支链亚烷基基团，其中c为2至10的整数；
以及
R8为氢原子、2至10个碳原子的烷基、式A、或另一个式B；
(ii)含末端伯氨或仲氨基团的阳离子型树枝状或枝化聚酰胺型胺(PAMAM)；
(iii)阳离子型聚氨基酸；或
(iv)阳离子型聚碳水化合物；
并且其中所述可降解交联剂分子如下式所示：
A(Z)d
其中A为含有至少一个可降解键的间隔分子、Z为可与氨基基团反应的反应性残基、并且d为等于或大于2的整数，并且其中A和Z以共价键结合。
在优选实施方案中，阳离子化合物或低聚物为聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、聚甲基吖丙啶(PPI)、五亚乙基胺、N，N’-双(2-氨乙基)-1，3-丙二胺、N，N’-双(2-氨丙基)-乙二胺、精胺、亚精胺、N-(2-氨乙基)-1，3-丙二胺、N-(3-氨丙基)-1，3-丙二胺、三(2-氨乙基)胺、1，4-双(3-氨丙基)哌嗪、N-(2-氨乙基)哌嗪、树枝状聚酰胺型胺(PAMAM)、壳聚糖、或聚(2-二甲氨基)乙基异丁烯酸(PDMAEMA)。
在优选实施方案中，交联剂分子为二丙烯酸酯和多丙烯酸酯、二丙烯酰胺和多丙烯酰胺、二异硫氰酸酯和多异硫氰酸酯、二异氰酸酯和多异氰酸酯、双环氧化合物和多环氧化合物、二醛和多醛、二酰氯和多酰氯、二磺酰氯和多磺酰氯、二卤化物和多卤化物、双酐和多酐、双马来酰亚胺和多马来酰亚胺、二-N-羟基琥珀酰亚胺基酯和多-N-羟基琥珀酰亚胺基酯、二羧酸和多羧酸、或二卤代乙酰基和多卤代乙酰基基团。
在优选实施方案中，交联剂分子为1，3-丁二醇二丙烯酸酯、1，4-丁二醇二丙烯酸酯、1，6-己二醇二丙烯酸酯、2，4-戊二醇二丙烯酸酯、2-甲基-2，4-戊二醇二丙烯酸酯、2，5-二甲基-2，5-己二醇二丙烯酸酯、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯、二季戊四醇五丙烯酸酯、或含有至少三个丙烯酸酯或丙烯酰胺侧基的聚酯。
在优选实施方案中，聚合物的分子量为500da至1,000,000da。更优选地，该聚合物的分子量为2000da至200,000da。
在优选实施方案中，阳离子化合物或低聚物的分子量为50da至10,000da。在优选实施方案中，交联剂分子的分子量为100da至40,000da。
优选地，固体支持物为培养皿底部(dish bottom)、多孔板、或连续表面。
在某些优选实施方案中，转染试剂与核酸以共价键连接。在其它优选实施方案中，转染试剂与核酸以非共价键连接。
在优选实施方案中，所述装置可以在室温下贮存至少5个月而不显著失去其转染活性。
本发明的实施方案涉及细胞转染方法，该方法包括如下步骤：将含有待转染核酸的溶液加入到包括包被有转染试剂混合物的固体支持物的装置中，将真核细胞加入到该溶液中；以及孵育该细胞和核酸溶液以进行细胞转染。优选地，孵育进行5分钟至3小时。更优选地，孵育进行10分钟至90分钟。
优选地，核酸为DNA、RNA、DNA/RNA杂交体或化学修饰的核酸。更优选地，DNA为环状(质粒)、线性、片段或单链寡核苷酸(ODN)。更优选地，RNA为单链(核酶)或双链(siRNA)。
在某些优选实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。在某些优选实施方案中，至少一些细胞经历细胞分裂。在某些优选实施方案中，所述细胞为转化的细胞或原代细胞。在某些优选实施方案中，所述细胞为体细胞或干细胞。在某些优选实施方案中，所述细胞为植物细胞。
由以下优选实施方案的详细说明可以使本发明的更多方面、特点和优点变得显而易见。
附图的简要说明
现在，参照旨在举例说明而非限定本发明的优选实施方案的附图，对本发明的这些及其它特点进行描述。
图1显示了转染的293细胞的细胞形状。处理所用的转染试剂为基于线性聚氮丙啶(L-PEI)的聚合物、基于脂质的聚合物、可降解阳离子聚合物，以及未处理(完整的293细胞)。
图2显示了EGFP-阳性细胞的百分比。
图3显示了转染后的细胞状态。
图4显示了可转染细胞培养装置在含O2吸收剂的Mylar袋中的稳定性。
图5显示了可转染细胞培养装置在含CO2吸收剂的Mylar袋中的稳定性。
图6显示了可转染细胞培养装置在含O2和CO2吸收剂的Mylar袋中的稳定性。
图7显示了可转染细胞培养装置在Mylar袋中的稳定性。
优选实施方案的详细说明
尽管描述的实施方案代表本发明的优选实施方案，但是应当理解本领域技术人员可对本发明进行修改而不偏离其精神。因此，本发明的范围只受所附权利要求的限定。
本发明的实施方案涉及与常规转染试验相比，更简单、方便、以及有效的转染装置和方法。根据本文描述的方法，通过将转染试剂固定到细胞培养装置的固体表面上来制造转染装置。通过使用本装置，研究人员仅需将待转染的核酸或其它生物分子和细胞加到细胞培养装置表面。无需将DNA或生物分子与转染试剂进行预混合。这除去了常规转染方法所要求的关键耗时步骤。与现有方法需要2至5小时或更长相比，仅需约40分钟就可以完成对10个样品的全部转染过程。这对于一次检测数百个样品的高通量转染分析尤为有利。
与常规转染相比，本文所描述的方法具有若干个优点。它提供了易于贮存的转染装置，并且提供了生物分子递送或基因转染的简单方法，其中无需混合生物材料/转染试剂的步骤。本文描述的转染方法可在短时间内完成，例如约5分钟至3小时，并且提供了转染或药物递送的高通量方法，其中可一次转染大量样品。
在优选实施方案中，转染试剂被简单地涂布在细胞培养装置的表面，该装置易于商品化和大量生产。在加入细胞前准备该装置，消费者，例如研究人员，需仅将诸如目的核酸等生物分子直接加到细胞培养装置的表面。预先确定时间的孵育过程使生物分子和转染试剂形成在下一步中被细胞吸收的复合物。然后将细胞接种到细胞培养装置的表面并孵育，无需更换培养基，以及分析该细胞。在转染操作期间不必更换培养基。本文描述的方法通过减少所涉及的步骤数大大降低了出错几率，因而提高了本系统的一致性和精确性。
可将包含转染试剂的组合物固定到任何合适的表面上。例如，所述表面可以是玻璃、塑料(例如聚四氟乙烯、聚偏1，1-二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯)、硅、金属(例如金)、膜(例如硝基纤维素、甲基纤维素、PTFE或纤维素)、纸、生物物质(例如蛋白、明胶、琼脂)、组织(例如皮肤、内皮组织、骨、软骨)、或矿物(例如羟磷灰石、石墨)。根据优选实施方案，所述表面可以是载玻片(玻璃或聚-L-赖氨酸包被的载玻片)或多孔板的孔。
就载玻片而言，例如包被有聚-L-赖氨酸的载玻片(例如，Sigma，Inc.)，将转染试剂固定在表面上并干燥，然后引入目的核酸或待导入细胞的核酸。通常，以微阵列方式将核酸点样到载玻片上。将载玻片在室温下孵育30分钟以在转染装置表面形成核酸/转染试剂复合物。该核酸/转染试剂复合物形成用于高通量微阵列的基质，该微阵列可用于同时研究成百上千种核酸或其它生物分子。在其它实施方案中，转染试剂可以被固定到转染装置表面离散的、限定的区域，以形成转染试剂的微阵列。在此实施方案中，待导入细胞的生物分子，例如核酸，被分散到转染装置的表面并与转染试剂微阵列一起孵育。本方法可用于从数千种化合物中筛选转染试剂或其它递送试剂。这种筛选方法的结果可通过计算机分析进行检测。
在本发明的另一实施方案中，可用一种或多种转染试剂包被多孔板的一个或多个孔。常用于转染的板为96孔板和384孔板。可将转染试剂均匀地施用在多孔板中每个孔的底部。通常，以约0.1μg/cm2至约100μg/cm2的范围向板底部施用转染试剂。此外，转染试剂的涂布量可以根据所用的孔板类型而变化。例如，对于6孔板、12孔板或96孔板，转染试剂的涂布浓度优选为约0.5μg/cm2至约50μg/cm2，更优选的涂布浓度为约1μg/cm2至20μg/cm2。在384孔板的情况下，转染试剂的涂布浓度优选为约0.5μg/cm2至约50μg/cm2，更优选的涂布浓度为约1μg/m2至30μg/m2。在本发明的另一实施方案中，使用转染试剂包被10-cm的细胞培养皿。可以将转染试剂均匀地施用在培养皿底部。可以以约0.1μg/cm2至约100μg/cm2的范围将转染试剂施用在培养皿底部，更优选约0.2μg/cm2至约20μg/cm2。
然后通过例如多通道微量加样器或自动化机器将数百种核酸或其它生物分子加入孔中。然后通过使用酶标仪测定转染结果。这是非常方便的分析转染细胞的方法，因为大多数的生物医学实验室经常使用酶标仪。包被有转染试剂的多孔板可以广泛用于大多数实验室以研究基因调节、基因功能、分子治疗以及信号传导。并且，如果使用不同的转染试剂包被多孔板的不同孔，该板可用于有效筛选多种转染试剂或递送试剂。近来，开发了1,536和3,456孔板，它们也可用于本文所述的方法。
在优选实施方案中，转染装置贮存在适合用作包装的材料中，该材料可以为塑料(例如玻璃纸)、弹性体材料、薄金属、Mylar_、或其它聚酯薄膜材料。贮存时可以有或没有氧气和/或二氧化碳吸收剂。如本发明所述制备的转染板可在室温下贮存至少5个月且保持显著的细胞转染活性。
转染试剂优选为可将生物分子，例如核酸，导入细胞的阳离子化合物。优选的实施方案使用阳离子低聚物，例如低分子量的聚氮丙啶(PEI)。更优选地，转染试剂为可降解阳离子聚合物。任选地，转染试剂包括细胞靶向部分或细胞内靶向部分和/或膜失稳组分，递送增强剂也是如此。
通常，递送增强剂分成两类：病毒载体系统和非病毒载体系统。如上所述由于人类病毒已进化出克服屏障以进入细胞核的方法，所以病毒或病毒成分可被用于将核酸转运入细胞中。此外，可降解聚合物可与病毒或非病毒蛋白结合或连接以提高转染效率。例如，可将本领域技术人员已知的水泡性口炎病毒G蛋白(VSVG)以及其它肽或蛋白加到聚合物中以改善转染效率。
用作递送增强剂的病毒成分的另一个例子是血凝素肽(HA肽)。该病毒肽通过破坏内体促进生物分子向细胞内的转移。在内体的酸性pH值下，该蛋白造成生物分子和载体向细胞液中的释放。
非病毒递送增强剂可以是基于聚合物的或基于脂质的。通常它们是用于平衡核酸负电荷的聚阳离子。部分由于聚阳离子聚合物具有浓缩不限尺寸的DNA质粒的能力以及对于病毒载体安全性的顾虑，因而聚阳离子聚合物表现出作为非病毒基因递送增强剂的显著前景。例子包括具有富含碱性氨基酸区域的肽和聚氮丙啶(PEI)，所述碱性氨基酸例如寡赖氨酸、寡精氨酸或其组合。这些聚阳离子聚合物通过浓缩DNA辅助转运。诸如PEI等支链形式的聚阳离子和星型树枝状聚合物可以介导DNA浓缩和内体释放(Boussif等人，(1995)Proc.Natl.Acas.Sci.USA vol.92：7297-7301)。PEI是含末端胺和内胺的高枝化聚合物，在pH值为6.9时末端胺可电离，在pH值为3.9时内胺可电离。由于该结构，PEI可以产生小泡pH值的变化，该变化导致小泡膨胀，最终从内体的俘获中释放。
增强递送的另一种方法是在转染试剂上设计配体。该配体必须在所靶向细胞上具有受体。然后通过受体识别引发生物分子向细胞中的递送。当该配体与其特异性细胞受体结合时，激发胞吞作用。用于不同细胞类型以增强生物分子转运的配体的例子是半乳糖、转铁蛋白、糖蛋白脱唾液酸血清类粘蛋白、腺病毒纤维、疟原虫环子孢子蛋白、表皮生长因子、人乳头状瘤病毒衣壳、成纤细胞生长因子以及叶酸。在叶酸盐受体的情况下，通过称为细胞摄液作用的过程内化结合的配体，其中受体与配体结合，周围的膜从细胞表面伸出将其包围，然后该内化的物质穿过液胞膜进入细胞质(Gottschalk等(1994)Gene Ther1：185-191)。
多种试剂可用来破坏内体。除了上述的HA-蛋白外，缺陷病毒颗粒也可用作水解内体的试剂(Cotten等(July 1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.89：6094-6098页)。非病毒试剂是两亲的或基于脂质的。
介导内体破裂、减少降解或同时绕过该过程的试剂可增强诸如DNA等生物分子释放入细胞的细胞质。增高内体pH值的氯喹被用于通过抑制溶酶体的水解酶来减少细胞内吞物质的降解(Wagner等(1990)ProcNatl Acad Sci USA vol.87：3410-3414)。诸如PEI等支链聚阳离子和星型树枝状聚合物也促进上述内体的释放。
为了完全绕过内体降解，使用诸如白喉毒素和假单胞菌外毒素等毒素的亚基作为嵌合蛋白的成分，该嵌合蛋白可被并入基因/基因载体复合物中(Uherek等人(1998)J Biol.Chem.Vol.273：8835-8841)。这些成分促进核酸通过内体膜穿梭并通过内质网返回。
一旦到达细胞质中，核酸必须找到其路径进入细胞核。通过在核酸载体上包括细胞核定位信号可以增强向细胞核的定位。使用起到细胞核定位信号(NLS)作用的特定氨基酸序列。负载物-载体复合物上的NLS与细胞液中的特定细胞核转运受体蛋白相互作用。一旦负载物-载体复合物被装配，复合物中的受体蛋白与核孔蛋白产生多重接触，从而运输复合物通过核孔。在负载物-载体复合物到达其目的位置时，其发生离解，释放出负载物和其它成分。
来自SV40大T-抗原的亚序列可用于向细胞核内的转运。这种来自SV40大T-抗原的短序列作为造成结合的大分子向细胞核内转运的信号。
生物可降解阳离子聚合物通常显示低细胞毒性，但是也由于快速降解显示低转染效率，这使它们相对于其它载体，在基因转移和其它应用中具有较弱的竞争力。这些可降解阳离子聚合物通过连接低分子量的阳离子化合物或低聚物与可降解交联剂来提高转染效率。所述交联剂分子可以含有生物地、物理地或化学地可切割的键，例如可水解的键、可还原的键、含有酶特异切割位点的肽序列、pH敏感的键或声波敏感的键。可以通过以下方法完成这些聚合物的降解，该方法包括但不限于水解、酶消化法、以及物理降解方法，例如光分裂(光解作用)。
本文描述的可降解阳离子聚合物的一个优点为：根据交联剂的类型和结构，聚合物的降解在聚合物降解的速率和位点方面是可控的。
在优选实施方案中，转染试剂包括多种阳离子分子和至少一种在枝化排列中连接所述阳离子分子的可降解交联剂分子。
可以使用阳离子低聚物来制备本文所述的聚合物，所述阳离子低聚物例如低分子量的聚氮丙啶(PEI)、低分子量的聚(L-赖氨酸)(PLL)、低分子量的壳聚糖、以及低分子量的PAMAM树枝状聚合物。此外，可以使用含有具有3个以上反应位点的胺的任何分子。
阳离子低聚物可以选自，但不限于：
(i)式(A)或式(B)的阳离子化合物或其组合：
Figure A20058004345300181
               R6_NH-R7_R8
式A                                   式B
其中R1为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、另一个式A、或式B；
R2为式：-(CH2)a-的直链亚烷基基团，其中a为2至10的整数；
R3为式：-(CbH2b)-的直链亚烷基基团，其中b为2至10的整数；
R4为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、另一个式A、或式B；
R5为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、另一个式A、或式B；
R6为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、式A、或另一个式B；
R7为式：-(CcH2c)-的直链或支链亚烷基基团，其中c为2至10的整数；
以及
R8为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、式A、或另一个式B；
(ii)含末端伯氨或仲氨基团的阳离子型树枝状或枝化聚酰胺型胺(PAMAM)；
(iii)阳离子型聚氨基酸；以及
(iv)阳离子型聚碳水化合物；
这样的阳离子分子的例子包括但不限于表1中所示的阳离子分子。
表1.依照本发明优选实施方案的
阳离子化合物和低聚物的结构
Figure A20058004345300191
Figure A20058004345300201
本文使用的阳离子聚合物可以包括伯氨基基团或仲氨基基团，其可以与诸如糖、肽、蛋白、以及其它分子等活性配体结合。在优选实施方案中，乳糖酸与阳离子聚合物结合。由于半乳糖受体存在于细胞表面，所以半乳糖基单元提供靶向肝细胞的有用靶向分子。在其它实施方案中，乳糖与可降解阳离子聚合物结合，以将半乳糖基单元引入聚合物。
可降解连接分子包括但不限于二丙烯酸酯和多丙烯酸酯、二异丁烯酸酯和多异丁烯酸酯、二丙烯酰胺和多丙烯酰胺、二异硫氰酸酯和多异硫氰酸酯、二异氰酸酯和多异氰酸酯、双环氧化合物和多环氧化合物、二醛和多醛、二酰氯和多酰氯、二磺酰氯和多磺酰氯、二卤化物和多卤化物、双酐和多酐、双马来酰亚胺和多马来酰亚胺、二羧酸和多羧酸、二-α-卤代乙酰基和多-α-卤代乙酰基基团、以及二-N-羟基琥珀酰亚胺基酯和多-N-羟基琥珀酰亚胺基酯，该连接分子含有至少一个生物可降解间隔基。根据优选实施方案，下式描述了可使用的交联剂：
A(Z)d
其中A为含有至少一个可降解键的间隔分子、Z为与氨基基团反应的反应性残基、d为等于或大于2的整数，并且其中A和Z以共价键结合。
表2.中例举了交联剂分子的反应性残基的若干实施方案，然而这些例子不限制本发明的范围。反应性残基可以选自但不限于丙烯酰基、马来酰亚胺、卤化物、羧基酰卤、异氰酸酯、异硫氰酸酯、环氧化物、醛、磺酰氯、以及N-羟基琥珀酰亚胺基酯基团或其组合。
表2：本发明优选实施方案中使用的
生物可降解交联剂分子的结构
Figure A20058004345300211
Figure A20058004345300221
通过改变聚合物组成、进料比、以及聚合物的分子量可以控制聚合物的降解速率。例如，当使用含大量烷基基团的交联剂时，聚合物降解较慢。同样，在一些情况下增加分子量将导致降解速率的降低。通过调整阳离子聚合物与交联剂的比率或通过更换不同的可降解交联剂分子可以控制聚合物的降解速率。
丙烯酸酯交联剂比含二硫化物的交联剂便宜得多，因为含二硫化物的交联剂的合成更加困难。丙烯酸酯交联剂可以在任何水溶液中水解。因此含丙烯酸酯交联剂的聚合物可以在各种环境中降解，只要其含水。因此，含有丙烯酸酯交联剂的聚合物与含有二硫化物交联剂的聚合物相比具有更广泛的应用。此外，含有二硫化物交联剂的聚合物的降解速率通常是相同的，而用丙烯酸酯交联剂合成的聚合物的降解速率可根据所使用的不同丙烯酸酯交联剂而变化。
在某些实施方案中，转染试剂可与诸如蛋白、肽、多糖或其它聚合物等基质混合。蛋白可以是明胶、胶原、牛血清白蛋白或任何其它可用于将蛋白固定到表面上的蛋白。聚合物可以是水凝胶、共聚物、不可降解的或可生物降解的聚合物以及生物相容材料。多糖可以是任何可以形成膜并且包被递送试剂的化合物，例如壳聚糖。还可以将其它试剂与转染或递送试剂一起固定到转染装置上，其它试剂例如细胞毒性减弱试剂、细胞结合试剂、细胞生长试剂、细胞刺激试剂或细胞抑制试剂和培养特定细胞的化合物。转染试剂可以同时包含可降解阳离子聚合物和不可降解阳离子聚合物。不可降解阳离子聚合物与可降解阳离子聚合物的重量比优选为1∶0.5至1∶20(不可降解∶可降解)，更优选的重量比为1∶2至1∶10。
根据另一个实施方案，可以将明胶-转染试剂混合物固定到转染装置上，该混合物包括转染试剂(例如脂质、聚合物、脂质-聚合物或膜失稳的肽)和溶于诸如水或二次去离子水等恰当溶剂的明胶。在其它实施方案中，细胞培养试剂(例如纤连蛋白、胶原、盐、糖、蛋白或肽)也可存在于明胶-转染试剂混合物中。将混合物均匀地涂布到诸如载玻片或多孔板等表面上，由此生产具有明胶-转染试剂混合物的转染表面。在另一个实施方案中，不同的转染试剂-明胶混合物也可被点样到转染装置表面的不连续区域。使得到的产物在合适条件下完全干燥，以使得明胶-转染试剂混合物固定到混合物所应用的位点上。例如，可以在特定温度或湿度下或在真空干燥器中干燥所得产物。
混合物中转染试剂的浓度取决于转染效率和该试剂的细胞毒性。通常在转染效率和细胞毒性之间存在着一个平衡。在转染试剂的浓度使得转染效率最高，同时细胞毒性保持在可接受的水平时，转染试剂的浓度就处于最佳水平。转染试剂的浓度一般为约1.0μg/ml至约1000μg/ml。在优选实施方案中，浓度为约10μg/ml至约600μg/ml。类似地，明胶或另一种基质的浓度取决于所进行的实验或测定，但是，其浓度一般为转染试剂溶液的0.01％至0.5％重量体积比(w/v)。
在优选实施方案中，引入细胞的分子为核酸。核酸可以是DNA、RNA、DNA/RNA杂交体、肽核酸(PNA)等等。如果所用DNA存在于载体中，该载体可以为任何类型，例如质粒(例如带有绿色荧光蛋白(GFP)基因和/或荧光素酶(luc)基因的质粒)或基于病毒的载体(例如pLXSN)。DNA还可以是在要表达的cDNA的5’末端带有启动子序列(例如CMV启动子)并且在3’末端带有多聚A位点的线性片段。这些基因表达元件使得目的cDNA能够在哺乳动物细胞中瞬时表达。如果DNA是单链寡聚脱氧核苷酸(ODN)，例如反义ODN，那么可以将其引入细胞以调节靶基因表达。在使用RNA的实施方案中，核酸可以是单链的(反义RNA和核酶)或双链的(RNA干扰，SiRNA)。在大多数情况下，RNA被修饰以增加RNA的稳定性并且改善其下调基因表达的功能。在肽核酸(PNA)中，核酸主链被肽替换，这使该分子更加稳定。本文所述方法可用于将核酸引入细胞，该引入可以出于各种目的，例如分子治疗、蛋白功能研究或分子机理研究。
在适当的条件下，将核酸溶液加入到包被有转染试剂的转染装置上以形成核酸转染试剂复合物。优选将核酸溶于不含有胎牛血清和抗生素的细胞培养基中，例如Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)。但是可以使用任何合适的细胞培养基，其包括但不限于Minimum Essential Eagle、F-12 Kaighn’s Modification培养基、或RPMI1640培养基。如果转染试剂被均匀地固定到载玻片上，则核酸溶液可以被点样到载玻片的不连续区域。或者，转染试剂可以被点样到载玻片的不连续区域，简单地加入核酸溶液以覆盖转染装置的全部表面。如果转染试剂被固定在多孔板的底部，通过多通道加样器、自动化装置或其它本领域公知的递送方法将核酸溶液简单加入到不同的孔中。将得到的产物(包被有转染试剂和希望核酸的转染装置)在室温下孵育约5分钟至60分钟，更优选地，孵育25-30分钟以形成核酸/转染试剂复合物。在某些实施方案中，例如，如果不同的核酸样品被点样到载玻片的不连续区域，则移除DNA溶液，以产生带有核酸样品的表面，该核酸样品存在于与转染试剂的复合物中。在其它实施方案中，可以将核酸溶液保留在表面上。其次，将在诸如DMEM等适当培养基中的适当密度的细胞接种到表面上。所得产物(带有生物分子和接种的细胞的表面)被维持在导致目的核酸进入接种细胞的条件下。在另一实施方案中，将细胞与生物分子或核酸混合。然后将细胞/生物分子混合物加入转染装置并在室温下孵育。
根据本文所述的方法，适用的细胞包括原核细胞、酵母或高等真核细胞，包括植物和动物细胞，特别是哺乳动物细胞。在优选实施方案中，诸如哺乳动物细胞(例如人、猴、犬、猫、牛、或鼠类细胞)、细菌、昆虫、或植物细胞等真核细胞以充足的密度和在适当条件下被接种到包被有转染试剂和目的核酸的转染装置上，所述条件适合目的核酸向真核细胞中的导入/进入以及DNA表达或生物分子与细胞组分的相互作用。在具体实施方案中，所述细胞可以选自造血细胞、神经元细胞、胰腺细胞、肝细胞、软骨细胞、骨细胞或肌细胞。所述细胞可以是完全分化的细胞或祖细胞/干细胞。
在优选实施方案中，真核细胞在含有10％热灭活的胎牛血清(FBS)和L谷氨酸胺和青霉素/链霉素(pen/strep)的Dulbecco’s Modified EaglesMedium(DMEM)中培养。本领域技术人员应当认识到某些细胞应该在特定培养基中培养，因为某些细胞需要特定营养，例如生长因子和氨基酸。本领域的技术人员已知用于特定细胞培养的适宜培养基。细胞的最佳密度取决于细胞类型和实验目的。例如，70-80％融合的细胞群优选用于基因转染，但是用于寡核苷酸递送的最佳条件是30-50％融合的细胞。例如，如果将5×104个293细胞/孔接种到96孔板上，那么在细胞接种后18-24小时可达到90％的融合。对于HeLa 705细胞，在96孔板上仅需要1×104个细胞/孔就可以达到相似的融合百分比。
将细胞接种到含有核酸样品/转染试剂的表面后，就在该细胞类型的最适条件下孵育该细胞(例如37℃，5-10％CO2)。培养时间取决于实验目的。通常，就细胞转染实验而言，将细胞孵育24至48小时以使细胞表达靶基因。在对细胞内生物分子的胞内运输的分析中，可能需要数分钟至几小时的孵育并且可以在确定的时间点观察细胞。
可以通过不同的方法分析生物分子递送的结果。就基因转染和反义核酸递送而言，可以通过诸如绿色萤光蛋白(GFP)基因、荧光素酶基因或β-半乳糖苷酶基因等报道基因的表达来检测靶基因表达水平。
GFP信号可以在显微镜下直接观察，荧光素酶的活性可以通过照度计来检测，由β-半乳糖苷酶催化的蓝色产物可以在显微镜下观察或通过酶标仪测定。本领域技术人员熟知这些报道基因如何起作用以及如何将它们引入基因递送系统。可以通过不同方法确定根据本文所述方法递送的核酸及其产物或其它生物分子以及由这些生物分子调节的目标，所述方法例如检测免疫荧光或酶免疫细胞化学、放射自显影或原位杂交。如果使用免疫荧光来检测编码蛋白的表达，则使用结合靶蛋白的荧光标记的抗体(例如在适合抗体和蛋白结合的条件下加入到载玻片上)。然后通过荧光信号鉴别含有该蛋白的细胞。如果所递送的分子可以调节基因表达，那么靶基因的表达水平还可以通过诸如放射自显影、原位杂交和原位PCR等方法测定。然而，鉴定方法取决于递送的生物分子的性质、它们的表达产物、由其调节的目标、和/或由生物分子的递送产生的终产物。
实施例1
可降解阳离子聚合物的制备
本发明提供了由分子量为600的聚氮丙啶(PEI-600)和2，4-戊二醇二丙烯酸酯(PDODA)制备聚合物的合成方法作为制备可降解阳离子聚合物的一般方法。使用微量移液器或注射器将溶于25ml二氯甲烷的4.32gPEI-600加入小瓶内。边搅拌边将2.09gPDODA迅速加入上述PEI-600溶液中。在室温下(20℃)搅拌反应混合物4小时。然后，加入50ml的2M HCl中和该反应混合物。白色沉淀被离心分离，用二氯甲烷洗涤，并且在室温下减压干燥。
实施例2
制备含有可降解阳离子聚合物的可转染细胞培养装置
如实施例1中所示制备可降解阳离子聚合物。使用基于线性聚氮丙啶(L-PEI)的聚合物和基于脂质的聚合物在体外将质粒DNA转染到哺乳动物细胞中，以评估转染效率。对于基于L-PEI的聚合物，使用jet PEI(Qbiogene)转染试剂。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)和N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵盐(DOTAP；Sigma-Aldrich)作为基于脂质的聚合物。将可降解的阳离子聚合物和DOTAP溶解在甲醇中，用二次去离子水稀释jet PEI和Lipofectamine2000。用这些聚合物溶液处理96孔细胞培养板的平坦底部(底面积：每孔0.32cm2；BD Biosciences)。固定到底部的实际量如下所示：(a)可降解阳离子聚合物；每孔3μg，即9.4μg/cm2；(b)jet PEI；每孔1μg；(c)Lipofectamine2000；每孔0.375μg；(d)DOTAP；每孔2和4pmole。在室温下减压干燥这些板并将其密封在真空袋中直至使用。
实施例3
用可转染的细胞培养装置转染293细胞
将溶于25μl opti-MEMI(Invitrogen)的25或50ng pEGFP-N1质粒(从Clontech购买)加入到每个孔中，并且在室温下保持25分钟。然后，加入在100μl含10％小牛血清(Invitrogen)的Dulbecco’s modified EagleMedium(DMEM)(Invitrogen)中的5×104个293细胞并在37℃、7.5％CO2中孵育。孵育24至36小时后，使用落射荧光显微镜(IX70，Olympus)观察EGFP荧光，以估算转染效率。
表3显示了转染效率。可降解阳离子聚合物和jet PEI，即基于L-PEI的聚合物显示了高转染效率。
表3
聚合物   EGFP-阳性细胞
可降解的阳离子聚合物Jet PEILipofectamine2000DOTAP 4 pmole/孔DOTAP 2 pmole/孔   60-70％50％少于10％0％0％
实施例4
细胞毒性评估
评估所述方法的细胞毒性。通过显微镜观察比较如实施例3所示转染后的293细胞的细胞形状(图1)。使用可降解聚合物转染的细胞显示为与完整293细胞相似的正常形状。然而，那些使用基于L-PEI的聚合物(jet PEI)和基于脂质的聚合物(Lipofectamine2000)转染的细胞是圆形的。我们推定可降解的阳离子聚合物可在不损伤细胞的条件下递送基因。
实施例5
可降解阳离子聚合物的最佳用量
将不同量的可降解阳离子聚合物固定到细胞培养装置上，并评估转染效率。使用如实施例2所示的相同实验方案将可降解阳离子聚合物涂布在96孔细胞培养板上。聚合物的实际用量如下所示：每孔2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、10以及20μg。然后，如实施例3所述进行转染并且在37℃、7.5％CO2中孵育转染细胞。在接种细胞前，加入的质粒DNA量是每孔0.13、0.25、0.50或1.0μg。在孵育40小时后，通过落射荧光显微镜估算发荧光的细胞百分比和细胞状态。图2显示转染后EGFP阳性细胞的百分比。高转染效率分布在具有每孔0.25μg和0.5μg(即0.78μg/cm2至1.6μg/cm2)质粒DNA的每孔2.5至5.0μg(即7.8μg/cm2至16μg/cm2)的可降解阳离子聚合物之间。
图3显示这些实验中的细胞状态。在含基于L-PEI和脂质的聚合物的板中转染的细胞为圆形且聚集在一起。形态取决于细胞毒性。当附着在板底部的可降解阳离子聚合物的量是每孔2.5μg至5.0μg时，细胞状态是可接受的。同样，如果使用的可降解阳离子聚合物的量是每孔2.5μg至5.0μg时，则所有我们测定的质粒DNA条件都给出良好的细胞状态。
实施例6
稳定性研究
在市场中存在着一些产品，其中出于特定目的，例如帮助细胞生长，在细胞培养装置表面上覆有包被层。通常，包被材料是某种蛋白质，例如胶原或纤连蛋白。由于它们是热敏性的，因此这些细胞培养装置需要冷藏贮存。这是不利的，特别是当它们体积庞大时，更为不利。出于该原因，在室温下的稳定性是重要的特征。
测试本发明的细胞培养/转染装置，以研究长期贮存后它们的稳定性。如实施例2所述制备细胞转染装置，在Mylar Bags(Dupont Corp.)中真空密封，Mylar Bags是含有氧气屏障材料和铝箔、有或没有氧气和二氧化碳吸收剂的膜。在25℃下贮存。然后，使用带有荧光素酶基因的质粒DNA(pCMV-LUC)定期测定转染效率。除了质粒DNA不同之外，可转染细胞培养装置的操作方法如实施例3中所述。通过使用Dynex MLX Microtiter_板发光计和荧光素酶检测系统(PromegaCorp.Madison，WIUSA)测定细胞的荧光素酶活性，以确定转染效率。
图4、5和6显示在25℃、含有O2和/或CO2吸收材料的Mylar Bags中贮存后转染效率的变化。在5个月的贮存后转染效率没有明显下降。而且，即使在25 ℃下将细胞培养装置保存在不合O2和/或CO2吸收材料的Mylar Bags中时，转染效率在5个月后仍是稳定的并且仍然很高(图7)。本发明的细胞培养装置在室温下是十分稳定的。无需特殊贮存条件即可贮存所述装置。
实施例7
制备不可降解阳离子聚合物
按以下步骤制备不可降解聚合物：将约5g的聚氮丙啶(Aldrich，产品号：408727)溶解在50ml二氯甲烷中，然后加入100ml、2.0M溶于乙醚的氯化氢(Aldrich，产品号：455180)，充分混合以形成聚合物的盐酸盐。通过离心收集聚合物的盐酸盐，并且用150ml乙醚洗涤。使用乙醚洗涤两次。洗涤后，将得到的沉淀在室温、真空条件下干燥3小时。随后，在4℃下使用干燥剂贮存干燥的粉末直至使用。
实施例8
使用可降解阳离子聚合物和不可降解阳离子聚合物制备
96孔可转染细胞培养装置
如实施例1所示制备可降解聚合物。如实施例7所述得到不可降解阳离子聚合物。两种聚合物均溶解在甲醇中，混合在一起制成涂布溶液。每种聚合物的终浓度是：可降解阳离子聚合物；40μg/ml，以及不可降解阳离子聚合物；10μg/ml。然后，使用该涂布溶液处理96孔细胞培养板的平坦底部(底面积：每孔0.32cm2；BD Biosciences)。实际上，向每个孔中加入25μl涂布溶液，并在真空状态下干燥以除去甲醇。在这些包被条件下，向96孔板的每个孔中分别固定1μg可降解阳离子聚合物；因此，可降解阳离子聚合物的密度为3.1μg/cm2。同样，向96孔板的每个孔中分别固定0.25μg不可降解阳离子聚合物，使得不可降解阳离子聚合物的密度为0.78μg/cm2。向96孔板的每个孔中固定了总共1.25μg聚合物；因此聚合物的密度为3.9μg/cm2。将本实施例中制备的细胞培养装置真空密封在含有干燥剂的Mylar袋中，贮存在室温下直至进一步使用。
实施例9
使用可降解阳离子聚合物和不可降解阳离子聚合物制备
12孔可转染细胞培养装置
如实施例1所示制备可降解聚合物。如实施例7所述得到不可降解阳离子聚合物。两种聚合物均溶解在甲醇中，并且混合在一起制成涂布溶液。每种聚合物的终浓度是：可降解阳离子聚合物；80μg/ml，以及不可降解阳离子聚合物；10μg/ml。然后，使用这些聚合物溶液处理12孔细胞培养板的平坦底部(底面积：每孔3.8cm2；BD Biosciences)。向每个孔中加入100μl涂布溶液，并在真空状态下干燥以除去甲醇。在这些包被条件下，向12孔板的每个孔中固定8.0μg可降解阳离子聚合物，使得可降解阳离子聚合物的密度为2.1μg/cm2，并且向12孔板的每个孔中固定1.0μg不可降解阳离子聚合物，使得不可降解阳离子聚合物的密度为0.26μg/cm2。向12孔板的每个孔中固定了总共9.0μg聚合物；因此聚合物的密度为2.4μg/cm2。将本实施例中制备的细胞培养装置真空密封在含有干燥剂的Mylar袋中，贮存在室温下直至进一步使用。
实施例10
使用可降解阳离子聚合物和不可降解阳离子聚合物制备
6孔可转染细胞培养装置
如实施例1所示制备可降解聚合物。如实施例7所述得到不可降解阳离子聚合物。将两种聚合物均溶解在甲醇中，并且混合在一起制成涂布溶液。每种聚合物的终浓度是：可降解阳离子聚合物；80μg/ml，以及不可降解阳离子聚合物；10μg/ml。然后，使用该涂布溶液处理6孔细胞培养板的平坦底部(底面积：每孔9.6cm2；BD Biosciences)。向每个孔中加入200μl涂布溶液，并在真空状态下干燥以除去甲醇。在这些包被条件下，向6孔板的每个孔中固定16μg可降解阳离子聚合物，使得可降解阳离子聚合物的密度为1.7μg/cm2以及，向6孔板的每个孔中固定2.0μg不可降解阳离子聚合物，使得不可降解阳离子聚合物的密度为0.21μg/cm2。向6孔板的每个孔中固定了总共18μg聚合物；因此聚合物的密度为1.9μg/cm2。将本实施例中制备的细胞培养装置真空密封在含有干燥剂的Mylar袋中，贮存在室温下直至进一步使用。
实施例11
使用由可降解和不可降解阳离子聚合物制备的
96孔可转染细胞培养装置转染
在10-cm细胞培养皿中孵育哺乳动物细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并用胰蛋白酶处理。然后，在含有血清的适当细胞培养基中稀释经胰蛋白酶处理的细胞，以制备细胞悬液。表4显示本实施例中所用的细胞密度。
在opti-MEM中稀释pEGFP-N1质粒，并将终浓度调整到10μg/ml。然后，将25μl的质粒溶液加入到如实施例8所示制备的96孔可转染细胞培养装置的每个孔中，并在室温下保持25分钟。随后，将100μl细胞悬液加入到孔中，并在37℃、7.5％CO2中孵育。孵育36至48小时后，使用落射荧光显微镜(IX70，Olympus)观察EGFP荧光，以估算转染效率。
表4显示在不同哺乳动物细胞系中带有EGFP荧光的细胞的百分比。本发明中的96孔可转染细胞培养装置高效转染不同的哺乳动物细胞系。
实施例12
使用由可降解和不可降解阳离子聚合物制备的
12孔可转染细胞培养装置转染
在10-cm细胞培养皿中孵育哺乳动物细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并用胰蛋白酶处理。然后，在含有血清的适当细胞培养基中稀释经胰蛋白酶处理的细胞，以制备细胞悬液。表4显示本实施例中所用的细胞密度。
在opti-MEM中稀释pEGFP-N1质粒，并将终浓度调整到5μg/ml。然后，将200μl的质粒溶液加入到如实施例9所示制备的12孔可转染细胞培养装置的每个孔中，并在室温下保持25分钟。随后，将1ml细胞悬液加入到孔中，并在37℃、7.5％CO2中孵育。孵育36至48小时后，使用落射荧光显微镜(IX70，Olympus)观察EGFP荧光，以估算转染效率。
表4显示在不同哺乳动物细胞系中带有EGFP荧光的细胞的百分比。本发明中的12孔可转染细胞培养装置高效转染不同的哺乳动物细胞系。
实施例13
使用由可降解和不可降解阳离子聚合物制备的
6孔可转类细胞培养装置转染
在10-cm细胞培养皿中孵育哺乳动物细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并用胰蛋白酶处理。然后，在含有血清的适当细胞培养基中稀释经胰蛋白酶处理的细胞，以制备细胞悬液。表4显示本实施例中所用的细胞密度。
在opti-MEM中稀释pEGFP-N1质粒，并将终浓度调整到5μg/ml。然后，将400μl的质粒溶液加入到如实施例10所示制备的6孔可转染细胞培养装置的每个孔中，并在室温下保持25分钟。随后，将2ml细胞悬液加入到孔中，并在37℃、7.5％CO2中孵育。孵育36至48小时后，使用落射荧光显微镜(IX70，Olympus)观察EGFP荧光，以估算转染效率。
表4显示在不同哺乳动物细胞系中带有EGFP荧光的细胞的百分比。本发明中的6孔可转染细胞培养装置高效转染不同的哺乳动物细胞系。
表4带有荧光的细胞的百分比，以及初始细胞密度
细胞系   ％EGFP     初始细胞密度(细胞/ml)
  6孔     12孔   96孔     6孔  12孔  96孔
293705COS-7HT-1080HeLaMDCKCHO-K1DU145A549CV-1HepG2   80807070-80705030-4030-4020-3020-3020     808070708060504020-303030   808070-8070705030-4030-4020-3010-20     2.5×1051.5×1051.5-2.0×1050.5-1.0×1051.0-2.0×1051.0×1051.5×1051.5-2.0×1052.0×1051.0×1051.0-2.0×105  2.5×1051.5×1051.5×1050.5×1051.0×1051.5×1052.0×1051.5×1052.0×1051.5×1051.5×105  2.5×1051.5×1051.5×1051.0×1050.5×1052.0×1051.5×1052.0×1051.5×1051.5×105
本领域技术人员应该理解，可以对本发明进行多种修改而不偏离本发明的精神。因此，应清楚地理解，本发明的形式仅仅是示例性的，无意限制本发明的范围。

Claims (31)

1.装置，其包括使用组合物包被的固体支持物，所述组合物包含不与生物分子复合的转染试剂。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述固体支持物选自聚苯乙烯树脂、环氧树脂和玻璃。
3.根据权利要求1所述的装置，其中包被层在所述固体支持物的表面上。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述转染试剂的涂布量为约0.1μg/cm2至约100μg/cm2。
5.根据权利要求1所述的装置，其中所述转染试剂是聚合物。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述聚合物是阳离子聚合物。
7.根据权利要求1所述的装置，其中所述转染试剂包含可降解阳离子聚合物。
8.根据权利要求7所述的装置，其中所述可降解阳离子聚合物包含经由一种或多种可降解交联剂连接在一起的阳离子化合物或低聚物。
9.根据权利要求7所述的装置，其中所述转染试剂还包含不可降解阳离子聚合物。
10.根据权利要求9所述的装置，其中所述不可降解阳离子聚合物与所述可降解阳离子聚合物的重量比为1∶0.5至1∶20。
11.根据权利要求1所述的装置，其中所述转染试剂包含多种阳离子分子和至少一种在枝化排列中连接所述阳离子分子的可降解交联剂分子，其中所述阳离子分子选自：
(i)式(A)或式(B)的阳离子化合物或其组合：
Figure A2005800434530003C1
  R6_NH-R7_R8
式A                式B
其中R1为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、另一个式A、或式B；
R2为式：-(CH2)a-的直链亚烷基基团，其中a为2至10的整数；
R3为式：-(CbH2b)-的直链亚烷基基团，其中b为2至10的整数；
R4为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、另一个式A、或式B；
R5为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、另一个式A、或式B；
R6为氢原子、含2至10个碳原子的烷基、式A、或另一个式B；
R7为式：-(CcH2c)-的直链亚烷基基团，其中c为2至10的整数；并且
R8为氢原子、2至10个碳原子的烷基、式A、或另一个式B；
(ii)含末端伯氨或仲氨基团的阳离子型树枝状或枝化聚酰胺型胺(PAMAM)；
(iii)阳离子型聚氨基酸；以及
(iv)阳离子型聚碳水化合物；
并且其中所述可降解交联剂分子如下式所示：
A(Z)d
其中A为含有至少一个可降解键的间隔分子、Z为与氨基基团反应的反应性残基、并且d为等于或大于2的整数，并且其中A和Z以共价键结合。
12.根据权利要求8所述的装置，其中所述阳离子化合物或低聚物选自聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、聚甲基吖丙啶(PPI)、五亚乙基胺、N，N’-双(2-氨乙基)-1，3-丙二胺、N，N’-双(2-氨丙基)-乙二胺、精胺、亚精胺、N-(2-氨乙基)-1，3-丙二胺、N-(3-氨丙基)-1，3-丙二胺、三(2-氨乙基)胺、1，4-双(3-氨丙基)哌嗪、N-(2-氨乙基)哌嗪、树枝状聚酰胺型胺(PAMAM)、壳聚糖、以及聚(2-二甲氨基)乙基异丁烯酸(PDMAEMA)。
13.根据权利要求8所述的装置，其中所述交联剂分子选自二丙烯酸酯和多丙烯酸酯、二丙烯酰胺和多丙烯酰胺、二异硫氰酸酯和多异硫氰酸酯、二异氰酸酯和多异氰酸酯、双环氧化合物和多环氧化合物、二醛和多醛、二酰氯和多酰氯、二磺酰氯和多磺酰氯、二卤化物和多卤化物、双酐和多酐、双马来酰亚胺和多马来酰亚胺、二-N-羟基琥珀酰亚胺基酯和多-N-羟基琥珀酰亚胺基酯、二羧酸和多羧酸、以及二卤代乙酰基和多卤代乙酰基基团。
14.根据权利要求8所述的装置，其中所述交联剂分子选自1，3-丁二醇二丙烯酸酯、1，4-丁二醇二丙烯酸酯、1，6-己二醇二丙烯酸酯、2，4-戊二醇二丙烯酸酯、2-甲基-2，4-戊二醇二丙烯酸酯、2，5-二甲基-2，5-己二醇二丙烯酸酯、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯、二季戊四醇五丙烯酸酯、以及含有至少三个丙烯酸酯或丙烯酰胺侧基的聚酯。
15.根据权利要求8所述的装置，其中所述聚合物的分子量为500da至1,000,000da。
16.根据权利要求8所述的装置，其中所述聚合物的分子量为2000da至200,000da。
17.根据权利要求8所述的装置，其中所述阳离子化合物或低聚物的分子量为50da至10,000da。
18.根据权利要求8所述的装置，其中所述交联剂分子的分子量为100da至40,000da。
19.根据权利要求1所述的装置，其中所述固体支持物为培养皿底部、多孔板或连续表面。
20.根据权利要求1所述的装置，所述装置可在室温下贮存至少5个月而不显著失去其转染活性。
21.细胞转染方法，包括：
将包含待转染核酸的溶液加入权利要求1所述的装置中；
将真核细胞加入所述装置中；以及
孵育所述细胞和所述核酸溶液以使细胞转染。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述孵育持续5分钟至3小时。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述孵育持续10分钟至90分钟。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述核酸选自DNA、RNA、DNA/RNA杂交体以及化学修饰的核酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述DNA为环状(质粒)、线性、片段或单链寡核苷酸(ODN)。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述RNA为单链(核酶)或双链(siRNA)。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
28.根据权利要求21所述的方法，其中至少一些所述细胞经历细胞分裂。
29.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞为转化细胞或原代细胞。
30.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞为体细胞或干细胞。
31.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞为植物细胞。
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