KR20070101859A - 진핵 세포의 트랜스펙션을 위한 고정화된 분해가능한양이온성 중합체 - Google Patents

진핵 세포의 트랜스펙션을 위한 고정화된 분해가능한양이온성 중합체 Download PDF

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KR20070101859A
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Abstract

트랜스펙션 시약인 분해가능한 중합체 양이온으로 코팅된 고체 지지체를 포함하는 세포 트랜스펙션/배양기가 개시되었다. 트랜스펙션/배양기는 사용하기 전까지 실온에서 편리하게 보관된다. 세포 트랜스펙션은 트랜스펙션되는 대상 핵산과 세포를 트랜스펙션/배양기에 첨가함으로써 쉽게 달성될 수 있다. 세포 트랜스펙션은 여기에 개시된 트랜스펙션/배양기를 사용하여 1시간 미만에 완결된다.

Description

진핵 세포의 트랜스펙션을 위한 고정화된 분해가능한 양이온성 중합체{IMMOBILIZED DEGRADABLE CATIONIC POLYMER FOR TRANSFECTING EUKARYOTIC CELLS}
관련 출원
본 출원은 2004년 12월 17일에 출원된 미국 임시 특허출원 제 60/637,344 호를 우선권 주장하며, 참고로 그 내용이 여기에 포함된다.
본 발명의 배경
본 발명의 분야
본 발명의 구현예는 세포 트랜스펙션(transfection) 장치 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 구현예는 세포 트랜스펙션 제제와 이 트랜스펙션 제제로 처리된 세포 배양기에 관한 것이다. 처리된 세포 배양기는 실온에서 보관될 수 있으며 간단하고 빠른 트랜스펙션 방법을 제공한다.
관련 분야의 기재 내용
유전자 트랜스펙션(gene transfection) 방법은 핵산을 세포로 도입하는데 사용될 수 있으며, 유전자 조절 및 기능을 연구하는데 유용하다. 많은 쌍의 DNA를 스크리닝하여 이들 인코딩 물질을 관심이 있는 특성에 의해 확인되는데 사용될 수 있는 고출력 검정방법이 특히 유용하다. 유전자 트랜스펙션은 핵산이 세포내 그의 기능을 보유하는 방식으로 세포, 특히 진핵세포 내로 생물학적 기능을 가진 핵산의 운반 및 도입이다. 유전자 트랜스펙션은 유전자 조절, 유전자 기능, 분자 치료법, 신호 전달, 약물 스크리닝과 관련된 연구 및 유전자 치료법 연구에 널리 적용되고 있다. 고등 동물의 유전자 복제와 분류가 계속됨에 따라 연구자들은 유전자의 기능을 발견하고 목적하는 기능을 가진 유전자 물질을 확인하려고 시도하고 있다. 이러한 늘어나는 유전자 서열로 인해 세포와 분자 생물학의 다른 연구 분야와 마찬가지로 유전자 물질을 특성화하고 유전자 기능을 분석하기 위한 계통적이고 고출력의 접근법의 개발이 요구되고 있다.
바이러스성 및 비바이러스성 유전자 운반체(carrier) 모두가 유전자 운반에 사용되어 오고 있다. 바이러스성 벡터는 비바이러스성 운반체보다도 높은 트랜스펙션 효율을 보여 왔으나 바이러스성 벡터의 안전성은 응용가능성을 곤란하게 만들고 있다(Verma I.M and Somia N. Nature 389 (1997), pp. 239-242; Marhsall E. Science 286(2000), pp. 2244-2245). 비바이러스성 트랜스펙션 시스템은 바이러스성 벡터의 효율을 보여주고 있지 않지만, 바이러스성 벡터와 비교할 때 그의 이론적인 안정성 때문에 상당한 주목을 받고 있다. 덧붙여, 바이러스성 벡터 제조는 복잡하고 값비싼 공정이므로, 시험관내로 바이러스성 벡터의 응용을 제한하고 있다. 비바이러스성 운반체의 제조는 바이러스성 운반체의 제조와 비교하여 더욱 간단하고 보다 비용 효율적이어서, 특히 시험관 연구에서, 트랜스펙션 시약으로서 합성 유전자 운반체를 바람직하게 만든다.
대부분의 비바이러스성 벡터는 외부 유전자 물질의 침투를 방지하는 세포 장 벽을 극복하기 위해 바이러스성 세포 진입의 중요한 기능을 모방한다. 유전자 운반체 골격에 기초한 비바이러스성 유전자 벡터는 a)리포플렉스(lipoplexes), b)폴리플렉스(polyplexes), 및 c)리포폴리플렉스로 분류될 수 있다. 리포플렉스는 핵산과 지질 성분의 회합체(assemblies)로서 통상 양이온성이다. 리포플렉스에 의한 유전자 전달은 리포펙션이라고 부른다. 폴리플렉스는 핵산과 양이온성 중합체의 복합체(complexes)이다. 리포폴리플렉스는 지질과 중합체 성분 모두를 함유하고 있다. 종종 그러한 DNA 복합체는 추가로 개질되어 세포 표적화 혹은 세포내 표적화 부분 및/또는 막-탈안정화 성분, 예컨대 바이러스성 단백질 또는 펩티드 혹은 막-분열 합성 펩티드를 함유한다. 최근 박테리아와 파지가 또한 핵산을 세포로 전달하기 위한 운반체(shuttles)으로 기술되어 오고 있다.
대부분의 비바이러스성 트랜스펙션 시약은 합성 양이온성 분자이며, 양이온상의 양이온 부위와 핵산상의 음이온 부위를 상호작용시킴으로써 핵산을 "코트(coat)"하는 것으로 보고되어 오고 있다. 양전하를 띤 DNA-양이온성 분자 복합체는 음전하를 띤 세포막과 상호작용하여 비특이적 엔도시토시스(non-specific endocytosis)에 의해 세포막을 통한 DNA의 통과를 촉진시킨다(Schofield, Brit. Microencapsulated. Bull, 51(1):56-71(1995)). 대부분의 종래 유전자 트랜스펙션 프로토콜에서, 세포는 트랜스펙션 16 내지 24시간 전에 세포 배양기에 접종된다. (양이온성 중합체 운반체와 같은) 트랜스펙션 시약과 DNA는 통상 별도 시험관에서 제조되어 각각의 용액은 (소태아혈청 또는 항생물질 미함유) 배지에 희석된다. 이후 한 용액에 다른 용액을 조심스럽게 서서히 첨가하여 혼합하면서 연 속적으로 혼합물을 보텍스 시킨다. 이 혼합물을 실온에서 15-45분간 배양하여 트랜스펙션 시약과 DNA간에 복합체를 형성하고 잔류 혈청과 항생물질을 제거한다. 트랜스펙션전에, 세포 배양배지를 제거하고 세포를 완충액으로 세정한다. DNA 트랜스펙션 복합체를 함유한 용액을 세포에 첨가하고, 세포를 약 3-4시간동안 배양시킨다. 트랜스펙션 시약을 함유한 배지를 이후에 새로운 배지로 교체한다. 하나 이상의 특정 시간에 세포를 최종적으로 분석한다. 이것은 특히 트랜스펙션되는 샘플의 수가 아주 많을 때 명백히 시간을 소비하는 절차이다.
몇몇 주요 문제점은 종래의 트랜스펙션 절차에 있다. 첫째로, 종래 절차는 시간을 소모하며, 특히 트랜스펙션 시험에 많은 세포 또는 유전자 샘플이 사용될 때 그러하다. 또한, 통상 트랜스펙션 절차에서 유래된 결과는 요구되는 단계의 수로 인해 재현하기 어렵다. 예컨대, DNA-트랜스펙션 시약 복합체 형성은 핵산과 시약의 농도와 부피, pH, 온도, 사용된 완충액의 유형, 보텍싱(vortexing)의 길이와 속도, 배양시간 및 다른 인자에 영향을 받는다. 동일한 시약과 절차가 진행되었지만, 상이한 결과가 수득 될 수 있다. 다단계 절차로부터 유래된 결과는 사람 또는 기계에 의한 실수 혹은 각 단계에서 다른 변수에 의해 종종 영향을 받는다. 덧붙여, 세포 배양배지의 세정후 트랜스펙션은 세포를 교란시켜 이들이 배양되는 표면으로부터 탈착되어 최종 결과에서 변형과 비예측성을 나타낸다. 고려되는 모든 인자로 인해, 종래 트랜스펙션 방법은 트랜스펙션 실험 또는 검정을 수행하기 위해 고도로 숙련된 사람을 요구한다.
연구자들은 보다 쉽고 보다 비용 효과적인 세포의 트랜스펙션방법을 요구하 며, 큰 샘플 수를 효과적으로 트랜스펙션하기 위해 고출력의 세포트랜스펙션 방법이 필요하다.
사바티니(U.S.2002/0006664A1)은 유리 슬라이드에 부착된 DNA를 함유한 조성물을 기술하고 있다. 그러나, 이 시스템은 단지 이전에 부착된 DNA에 의한 트랜스펙션을 허용하고 있다. 이것은 상기 시스템의 주요한 단점이다. 단지 이전에 부착된 DNA와 트랜스펙션을 제공함으로써, 각 연구자들은 바라는 핵산을 사용할 수 없다.
여기에 참고로 인용하는 미국 특허공보 제 2004/0138154A1 호는 트랜스펙션이 지질 중합체에 의해 매개되는 세포 배양/트랜스펙션 장치를 기술하고 있다. 여기에 참고로 인용하는 미국특허공보 제 2005/0176132A1은 칼슘염 매개된 트랜스펙션성 세포 배양기를 기술하고 있다.
여기에 참고로 인용된 미국 특허공보 제 2003/0215395A1 호는 유전자 운반에 사용될 수 있는 분해가능한 중합체를 기술하고 있다.
상기에서 소개한 바와 같이, 종래의 트랜스펙션은 길고 기술적으로 어려운 절차이다. 일반적으로, 세단계가 요구된다. 1) 충분한 컨플루언스(confluence)가 달성될 때까지 세포 배양 플레이트 혹은 접시에서 세포를 접종하고 배양시킨다. 2) 트랜스펙션 시약/핵산 복합체를 제조한다. 그리고 3) 대상 핵산을 트랜스펙션 시약과 함께 첨가하고 추가 배양을 수행한다. 두번의 배양기간이 요구되며 전형적으로 모든 단계를 완결하기 위해 2일 이상이 걸린다. 반대로, 본 발명의 구현예는 한번의 단일 배양 단계만을 수반하는 간단한 절차를 제공 한다. 사전에 트랜스펙션 시약으로 코팅한 세포 배양기는 대상 핵산과 세포 배양물을 연달아 첨가함으로써 트랜스펙션을 허용한다. 이후 트랜스펙션된 세포는 동일한 장치에서 배양할 수 있다. 따라서, 세포는 트랜스펙션될 수 있으며, 트랜스펙션 단계이후 즉시 세포를 추가로 조작할 필요없이 세포는 세포 배양기에서 배양될 수 있다. 트랜스펙션 효율은 정상적인 트랜스펙션과 비교가능하며, 그러나 조작에 요구되는 시간은 하루 이상 감소된다. 본 발명의 구현예는 트랜스펙션 검정의 노동을 크게 감소시키는 트랜스펙션가능한 세포 배양기를 포함하며, 낮은 세포독성에 의해 쉬운 방법으로 임의의 대상 핵산으로 트랜스펙션을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 트랜스펙션가능한 세포 배양기는 실온에서 장기간 보존시에 안정하다.
본 발명의 요약
본 발명의 구현예는 트랜스펙션 시약 혼합물로 코팅된 고체 지지체를 포함하는 장치에 관한 것이다. 바람직하게는, 코팅물내 트랜스펙션 시약은 핵산과 같은 생체 분자와 결합되지(complexed) 않는다. 바람직하게는, 고체 지지체는 폴리스티렌 수지, 에폭시 수지 혹은 유리이다. 바람직하게는, 코팅물은 고체 지지체의 표면에 존재한다. 바람직하게는, 트랜스펙션 시약의 코팅량은 약 0.1 내지 약 100 μg/cm2이다. 바람직하게는 트랜스펙션 시약은 중합체이다. 더욱 바람직하게는, 중합체는 양이온성 중합체이다. 바람직하게는 트랜스펙션 시약은 분해가능한 양이온성 중합체를 함유하고 있다. 더욱 바람직하게는, 분해가능한 양이온성 중합체는 양이온성 화합물 혹은 올리고머를 분해가능한 링커와 연결시킴으로써 만들어진다. 트랜스펙션 시약은 분해가능한 양이온성 중합체와 비분해가능한 양이온성 중합체 모두를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 비분해가능한 양이온성 중합체 대 분해가능한 양이온성 중합체의 비는 중량으로 1:0.5 내지 1:20(비분해가능:분해가능)이다.
바람직한 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 복수의 양이온성 분자와 분지 배열로 상기 양이온성 분자를 연결하는 하나 이상의 분해가능한 링커 분자를 함유하고 있으며, 상기 양이온성 분자는 하기로부터 선택된다:
(i) 하기식 (A) 또는 (B)의 양이온성 화합물 또는 그의 조합:
Figure 112007050291873-PCT00001
(식에서, R1은 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 또 다른 식 A, 혹은 식 B이며,
R2는 식 -(CH2)a-(a는 2 내지 10의 정수임)의 직쇄 알킬렌기이고,
R3는 식 -(CbH2b)-(b는 2 내지 10의 정수임)의 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기이며,
R4는 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 또 다른 식(another Formula) A, 또는 식(Formula) B이고,
R5는 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 또 다른 식 A, 또는 식 B이고,
R6는 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 식 A, 또는 또 다른 식 B이고,
R7은 식 -(CcH2c)-(c는 2 내지 10의 정수임)의 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기이며,
R8은 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 식 A, 또는 또 다른 식 B이다);
(ii) 종결된 일차 또는 이차 아미노기를 갖는 양이온성 수지상 혹은 분지 폴리아미도아민(PAMAM);
(iii) 양이온성 폴리아미노산; 혹은
(iv) 양이온성 폴리카르보하이드레이트;
그리고 상기 분해가능한 링커 분자는 하기식으로 표시된다:
A(Z)d
(식에서 A는 하나 이상의 분해가능한 결합을 가지고 있는 스페이서 분자이고, Z는 아미노기와 반응하는 반응성 잔기이며, d는 2이상의 정수이고, A와 Z는 공유결합된다).
바람직한 구현예에서, 양이온성 중합체 혹은 올리고머는 폴리(L-라이신)(PLL), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리프로필렌이민(PPI), 펜타에틸렌아민, N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민, N,N'-비스(2-아미노프로필)-에틸렌디아민, 스페르민, 스페르미딘, N-(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민, N-(3-아미노프로필)-1,3-프로판디아민, 트리(2-아미노에틸)아민, 1,4-비스(3-아미노프로필)피페라진, N-(2-아미노에틸)피페라진, 수지상 폴리아미도아민(PAMAM), 키토산, 혹은 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트(PDMAEMA)이다.
바람직한 구현예에서, 링커 분자는 디- 및 다중-아크릴레이트, 디- 및 다중-아크릴아미드, 디- 및 다중-이소티오시아네이트, 디- 및 다중-이소시아네이트, 디- 및 다중-에폭시드, 디- 및 다중-알데히드, 디- 및 다중-아실 클로라이드, 디- 및 다중-술포닐 클로라이드, 디- 및 다중-할라이드, 디- 및 다중-무수물, 디- 및 다중-말레이미드, 디- 및 다중-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 디- 및 다중-카르복실산, 혹은 디- 및 다중-할로아세틸기이다.
바람직한 구현예에서, 링커 분자는 1,3-부탄디올 디아크릴레이트, 1,4-부탄디올 디아크릴레이트, 1,6-헥산디올 디아크릴레이트, 2,4-펜탄디올 디아크릴레이트, 2-메틸-2,4-펜탄디올 디아크릴레이트, 2,5-디메틸-2,5-헥산디올 디아크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트, 트리메틸롤프로판 트리아크릴레이트, 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트, 디(트리메틸롤프로판)테트라아크릴레이트, 디펜타에리트리톨 펜타아크릴레이트, 혹은 적어도 세 개의 아크릴레이트 혹은 아크릴아미드 측쇄기를 갖는 폴리에스테르이다.
바람직한 구현예에서, 중합체의 분자량은 500 da 내지 1,000,000 da이다. 더욱 바람직하게는 중합체의 분자량은 2000 da 내지 200,000 da이다.
바람직한 구현예에서, 양이온성 화합물 혹은 올리고머의 분자량은 50 da 내 지 10,000 da이다. 바람직한 구현예에서, 링커 분자의 분자량은 100 da 내지 40,000 da이다.
바람직하게는, 고체 지지체는 접시 바닥, 다중-웰 플레이트 혹은 연속 표면이다.
일부 바람직한 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 핵산과 공유결합적으로 회합된다. 다른 바람직한 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 핵산과 비공유결합적으로 회합된다.
바람직한 구현예에서, 장치는 상당한 트랜스펙션 활성의 감소없이 적어도 5개월동안 실온에서 보관될 수 있다.
본 발명의 구현예는 트랜스펙션될 핵산을 함유하는 용액을 트랜스펙션 시약 혼합물로 코팅된 고체 지지체를 포함하는 장치에 첨가하는 단계, 진핵 세포를 용액에 첨가하는 단계, 세포와 핵산 용액을 배양하여 세포 트랜스펙션을 허용하는 단계를 포함하는 세포 트랜스펙션 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 배양시간은 5분 내지 3시간이다. 더욱 바람직하게는 배양시간은 10분 내지 90분이다.
바람직하게는, 핵산은 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드 혹은 화학적으로 개질된 핵산이다. 더욱 바람직하게는, DNA는 원형(플라스미드), 선형, 단편, 혹은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(ODN)이다. 더욱 바람직하게는 RNA는 단일 가닥(리보자임) 또는 이중가닥 (siRNA)이다.
일부 바람직한 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 일부 바람직한 구현예에서, 세포의 적어도 일부는 세포 분열을 겪는다. 일부 바람직한 구현예에서, 세포는 형질전환 세포 혹은 일차 세포이다. 일부 바람직한 구현예에서, 세포는 체세포 또는 줄기세포이다. 일부 바람직한 구현예에서, 세포는 식물세포이다.
본 발명의 다른 측면, 특징 및 장점은 하기 바람직한 구현예의 상세한 설명으로부터 명백하게 드러날 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 특징은 예시를 위한 목적으로 주어졌지만 본 발명을 제한하지는 않는 바람직한 구현 도면을 참고로 이제 기술될 것이다.
도 1은 트랜스펙션된 293 세포의 세포 형태를 보여준다. 트랜스펙션 시약 처리는 선형 폴리에틸렌이민(L-PEI) 기재 중합체, 지질 기재 중합체, 분해가능한 양이온성 중합체, 및 미처리(본래의 293 세포)이다.
도 2는 EGFP-양성 세포의 비율이다.
도 3은 트랜스펙션후 세포 상태를 보여준다.
도 4는 O2 흡수제를 가진 마일라 백(mylar bag)내 트랜스펙션가능한 세포 배양기의 안정성을 보여준다.
도 5는 CO2 흡수제를 가진 마일라 백내 트랜스펙션가능한 세포 배양기의 안정성을 보여준다.
도 6는 O2와 CO2 흡수제를 가진 마일라 백내 트랜스펙션가능한 세포 배양기의 안정성을 보여준다.
도 7은 마일라 백내 트랜스펙션가능한 세포 배양기의 안정성을 보여준다.
기술된 구현예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내고 있지만, 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 본 기술 분야의 숙련자들이 변형을 할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 결정된다.
본 발명의 구현예는 종래의 트랜스펙션 검정과 비교하여 간단하며, 편리하고 효율적인 트랜스펙션 장치와 방법에 관한 것이다. 트랜스펙션 장치는 세포 배양기의 고체 표면에 트랜스펙션 시약을 부착함으로써 여기에 기술된 방법에 따라 제작된다. 이 장치를 사용함으로써 연구자들은 트랜스펙션시킬 핵산 또는 다른 생체분자와 세포를 단지 세포 배양기의 표면에 부착시키기만 하면 된다. DNA 또는 생체 분자를 트랜스펙션 시약과 사전에 혼합할 필요가 없다. 이것은 종래 트랜스펙션 과정에서 요구하고 있는 핵심인 시간 소모 단계를 제거한다. 현재 방법에서 요구된 2 내지 5시간 혹은 그 이상과 비교하여 단지 약 40분이면 10개의 샘플에 대한 전체 트랜스펙션 과정을 완결할 수 있다. 이것은 특히 수백 개의 샘플이 동시에 시험되는 고출력 트랜스펙션 검정에 유리하다.
종래 트랜스펙션과 비교하여, 여기에 기술된 방법은 여러 장점이 있다. 본 방법은 보관하기 아주 쉬운 트랜스펙션 장치를 제공하며 어떠한 생체 재료/트랜스펙션 시약 혼합 단계를 요구하지 않는 생체분자 운반 혹은 유전자 트랜스펙션을 위한 단순한 방법을 제공한다. 여기에 기술된 트랜스펙션 과정은 아주 단시간, 예컨대 약 5분 내지 3시간에 완결될 수 있으며, 많은 수의 샘플이 동시에 트랜스펙션될 수 있는 트랜스펙션 혹은 약물 운반을 위한 고출력 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 아주 쉽게 상업화될 수 있고 대량 생산 가능한 트랜스펙션 시약은 세포 배양기의 표면에 쉽게 코팅된다. 고객, 예컨대 연구자들은 세포의 첨가 전에 세포 배양기를 제조하기 위해 대상 핵산과 같은 생체분자를 직접 세포 배양기에 첨가하기만 하면 된다. 소정 시간동안의 배양 기간은 생체 분자와 트랜스펙션 시약이 다음 단계에서 세포에 의해 흡수되는 복합체를 형성하도록 한다. 세포는 이후 세포 배양기의 표면에 접종되며 배지를 바꿀 필요없이 배양되고 그리고 세포는 분석된다. 트랜스펙션 과정에서 배지의 교환은 불필요하다. 여기에 기술된 방법은 극적으로 관련된 단계의 수를 감소시키고 그에 따라 시스템의 일관성과 정확성을 증가시킴으로 에러의 위험을 감소시킨다.
트랜스펙션 시약을 함유하고 있는 조성물은 적절한 임의의 표면에 부착시킬 수 있다. 예컨대, 표면은 유리, (폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐리덴디플루오라이드, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌과 같은) 플라스틱, 실리콘, (금과 같은) 금속, (니트로셀룰로스, 메틸셀룰로스, PTFE 또는 셀룰로스와 같은) 막, 종이, (단백질, 겔라틴, 아가와 같은) 생체 재료, (피부, 내피 조직, 골, 연골과 같은) 조직, 혹은 (히드록시아파타이트, 그래파이트와 같은) 미네랄이 될 수 있다. 바람직한 구현예에 따라, 표면은 슬라이드(유리 혹은 폴리-L-라이신 코팅된 슬라이드) 또는 다중-웰 플레이트의 웰이 될 수 있다.
폴리-L-라이신으로 코팅된 유리 슬라이드(예컨대 시그마사 제품)과 같은 슬라이드에 대해, 트랜스펙션 시약은 표면에 고정되어 건조된 후, 세포로 도입되는 대상 핵산 또는 임의의 핵산이 도입된다. 일반적으로, 핵산은 마이크로어레이내 유리 슬라이드상에 떨어뜨린다. 이 슬라이드는 실온에서 30분간 배양되어 트랜스펙션 장치의 표면에 핵산/트랜스펙션 시약 복합체를 형성한다. 핵산/트랜스펙션 시약 복합체는 고출력 마이크로어레이에 사용되는 배지를 만들며, 동시에 수백 내지 수천의 핵산 또는 다른 생체 분자를 연구하는데 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 별개의 정의된 영역에 트랜스펙션 장치의 표면에 부착되어 트랜스펙션 시약의 마이크로어레이를 형성할수 있다. 이 구현예에서, 세포로 도입되는 핵산과 같은 생체 분자는 트랜스펙션 장치의 표면에 펼쳐져 트랜스펙션 시약 마이크로어레이로 배양된다. 이 방법은 수천의 화합물로부터 트랜스펙션 시약 또는 다른 운반 시약을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 그러한 스크리닝 방법의 결과는 컴퓨터 분석을 통해 시험될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 다중-웰 플레이트의 하나 이상의 웰은 하나 이상의 트랜스펙션 시약으로 코팅될 수 있다. 트랜스펙션에 통상 사용되는 플레이트는 96-웰 및 384-웰 플레이트이다. 트랜스펙션 시약은 다중-웰 플레이트의 각 웰 바닥에 균등하게 적용될 수 있다. 일반적으로, 트랜스펙션 시약은 약 0.1 내지 100 μg/cm2의 범위로 플레이트 바닥에 가해진다. 더욱이, 트랜스펙션 시약의 코팅량은 사용되는 웰 플레이트의 종류에 따라 다양할 수 있다. 예컨대, 6-웰 플레이트, 12-웰 플레이트 혹은 96-웰 플레이트에 대해, 트랜스펙션 시약의 코팅 농도는 바람직하게는 약 0.5 내지 50 μg/cm2, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 20 μg/cm2이다. 384-웰 플레이트에 대해서는, 트랜스펙션 시약의 코팅 농도는 바람직하게는 약 0.5 내지 약 50 μg/cm2, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 30 μg/cm2이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 10-cm 세포 배양접시는 트랜스펙션 시약으로 코팅된다. 트랜스펙션 시약은 접시의 바닥에 균등하게 적용될 수 있다. 트랜스펙션 시약은 약 0.1 내지 약 100 μg/cm2, 더욱 바람직하게는 약 0.2 내지 약 20 μg/cm2의 범위로 접시의 바닥에 가해질 수 있다.
이후에 수백의 핵산 또는 다른 생체분자가 예컨대 다중채널 피펫 혹은 자동화 기계에 의해 웰에 첨가될 수 있다. 트랜스펙션의 결과는 이후 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정된다. 마이크로플레이트 판독기는 통상 대부분의 생체재료 실험실에 사용되고 있기 때문에 상기 방법은 트랜스펙션된 세포를 분석하는 데 아주 편리하다. 트랜스펙션 시약으로 코팅된 다중-웰 플레이트는 유전자 조절, 유전자 기능, 분자 치료 및 신호 전달을 연구하는 대부분의 실험실에 널리 사용될 수 있다. 또한, 만약 상이한 종류의 트랜스펙션 시약이 다중-웰 플레이트의 상이한 웰에 코팅된다면, 플레이트는 많은 트랜스펙션 혹은 운반 시약을 효율적으로 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 최근 1,536 및 3,456 웰 플레이트가 개발되어 오고 있는데, 이들 또한 여기에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 트랜스펙션 장치는 플라스틱(예컨대, 셀로판), 탄성 재료, 얇은 재료, Mylar®, 또는 다른 폴리에스테르 필름 재료인 패키징에 적합한 재료에 보관될 수 있다. 보관은 산소 및/또는 이산화탄소 흡수제의 유무하에 이루어질 수 있다. 여기에 기술된 대로 제조된 트랜스펙션 플레이트는 상당한 세포 트랜스펙션 활성을 보유하면서 실온에서 적어도 5달동안 보관될 수 있다.
트랜스펙션 시약은 바람직하게는 핵산과 같은 생체분자를 세포로 도입할 수 있는 양이온성 화합물이다. 바람직한 구현예는 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI)와 같은 양이온성 올리고머이다. 더욱 바람직하게는, 트랜스펙션 시약은 분해가능한 양이온성 중합체이다. 선택적으로, 트랜스펙션 시약은 운반 증진제 뿐만 아니라 세포-표적화 혹은 세포내-표적화 부분 및/또는 막-탈안정화 성분을 포함한다.
일반적으로, 운반 증진제는 두개의 카테고리로 나누어 진다. 이들은 바이러스성 운반 시스템과 비바이러스성 운반 시스템이다. 인간 바이러스가 상기에 소개한 핵산으로 수송하기 위해 장벽을 극복하는 방법을 진화시켜옴에 따라, 바이러스 또는 바이러스성 성분이 핵산을 세포로 전달하는 데 유용하다. 아울러, 분해가능한 중합체는 바이러스성 또는 비바이러스성 단백질과 결합하거나 회합하여 트랜스펙션 효율을 증진시킬 수 있다. 예컨대, 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 소포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus) G 단백질(VSVG)와 다른 펩티드 또는 단백질은 트랜스펙션 효율을 개선하기위해 중합체에 첨가될 수 있다.
운반 증진제로 유용한 바이러스성 성분의 다른 예는 적혈구 응집성 펩티드(HA-펩티드)이다. 이 바이러스성 펩티드는 엔도좀 파괴(endosome disruption)에 의해 생체분자의 세포내 전달을 촉진한다. 엔도좀의 산성 pH에서, 이 단백질은 세포질액로의 생체분자와 운반체의 방출을 일으킨다.
비바이러스성 운반 증진제는 중합체 기재 혹은 지질 기재일 수 있다. 이들은 통상 핵산의 음전하와 균형을 맞추는 다중양이온이다. 다중양이온성 중합체는 비제한된 크기의 DNA 플라스미드를 농축하는 능력과 바이러스성 벡터와 관련된 안정성으로 부분적으로 인해 비바이러스성 유전자 운반 증진제로서 중요한 기대를 보여주고 있다. 예로는 올리고-라이신, 올리고-아르기닌 또는 그의 조합 및 폴리에틸렌이민(PEI)와 같은 염기성 아민산이 풍부한 부분을 가진 펩티드를 포함한다. 이들 다중양이온성 중합체는 DNA의 축합에 의한 수송을 촉진한다. PEI와 별모양 덴드라이머와 같은 분지쇄형 다중양이온은 DNA 축합과 엔도좀 방출 모두를 매개할 수 있다(Boussif, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA vol. 92:7297-7301). PEI는 pH 6.9에서 이온화가능한 말단 아민과 pH 3.9에서 이온화가능한 내부아민을 가진 고도로 분지화된 중합체이며, 이러한 구성 때문에, 소포(vesicle) pH에서 변화를 발생시킬 수 있어, 소포가 팽윤되고, 필연적으로는 엔도좀 포착으로부터 방출로 이끈다.
운반을 증진시키는 다른 수단은 트랜스펙션 시약에 리간드를 고안하는 것이다. 이러한 리간드는 표적화되는 세포상에 수용체를 가져야한다. 세포내로 생체분자의 운반은 이후 수용체 인지에 의해 개시된다. 리간드가 그의 특정 세포 수용체와 결합할 때, 엔도시토시스(endocytosis)가 자극된다. 생체분자 수송을 증진하기위해 각종 세포 유형과 사용되어오고 있는 리간드의 예로는 갈락토스, 트란스페린, 글리코단백질 아시알로오로소무코드(asialoorosomucoid), 아데노바이러스 섬유, 말라리아 써컴스포로자이트(circumsporozite) 단백질, 상피 성장인자, 유두 바이러스 캡시드, 섬유아세포 성장인자 및 폴산이다. 폴산염(folate) 수용체의 경우에, 결합된 리간드는 포토사이토시스(potocytosis)라고 부르는 과정을 통해 내부화되며, 여기에서 수용체는 리간드와 결합하며, 주위 막은 세포 표면으로부터 차단되고, 이후 내부화된 물질은 소포막을 통해 세포질로 통과한다(Gottschalk, et al. (1994) Gene Ther 1:185-191).
각종 시약이 엔도좀 파괴에 사용되어 오고 있다. 상기 기술된 HA-단백질 이외, 불완전한 바이러스 입자가 엔도좀 용해(endosomolystic) 시약으로 사용되어오고 있다(Cotten, et al. (July 1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 89: pages 6094-6098). 비바이러스성 시약은 양쪽성 혹은 지질 기재이다.
세포의 세포질로 DNA와 같은 생체분자의 방출은 엔도좀 파괴을 매개하거나 분해를 감소시키거나 혹은 이러한 과정 모두를 함께 우회하는 시약에 의해 증진될 수 있다. 엔도좀 pH를 상승시키는 클로로퀴닌(Chloroquine)는 리소솜 가수분해 효소를 억제함으로써 흡수(endocytosed)된 물질의 분해를 감소시키는데 사용되어 오고 있다(Wagner, et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA vol. 87:3410-3414). PEI 및 별모양 덴드라이머와 같은 분지된 사슬 폴리양이온은 또한 상기에 소개한 바와 같이 엔도좀 방출을 촉진한다.
엔도좀 분해를 완전히 우회하기위해, 유전자/유전자 운반체 복합체에 삽입시킬 수 있는 키메라 단백질의 성분으로서 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소와 같은 독소의 서브유닛이 이용되어 오고 있다(Uherex, et al(1998) J Biol. Chem. vol. 273:8835-8841). 이들 성분은 엔도좀 막을 통한 핵산의 운반을 촉진하며 세포질 그물을 통해 후퇴한다.
세포질에서 일단 핵산이 핵에 대한 그의 경로를 발견해야만 한다. 핵에 대한 국소화는 핵산-운반체상에 핵 국소화 신호의 삽입에 의해 증진될 수 있다. 핵 국소화 신호(NLS)로서 기능을 하는 특정 아미노산 서열이 사용되었다. 카고-운반체 복합물상의 NLS는 시토졸에 위치한 특정 핵 수송 수용체 단백질과 상호작용하게 된다. 일단 카고-운반체 복합물이 회합되면, 복합물의 수용체 단백질은 뉴클레오포린(nucleoporins)와 다중 접촉하고, 그에 의해 핵 기공을 통해 복합물을 수송하는 것으로 생각된다. 카고-운반체 복합물이 그의 목적지에 도착한후, 해리하여 카고와 다른 성분을 방출한다.
SV40 거대 T-항원으로부터 하부서열이 핵으로 수송하는데 사용되어오고 있다. SV40 거대 T-항원로부터 이러한 짧은 서열은 핵으로 해리된 거대분자의 수송을 야기하는 신호로서 작용한다.
생분해가능한 양이온성 중합체는 전형적으로 낮은 세포독성을 보여주지만 또한 급속한 분해로 인해 낮은 트랜스펙션 효율을 보여주어, 유전자 트랜스펙션 및 다른 분야에 대한 다른 운반체에 대해 다소 덜 경쟁적으로 만든다. 이들 분해가능한 양이온성 중합체는 저분자량 양이온성 화합물 또는 올리고머를 분해가능한 링커와 함께 결합시킴으로써 트랜스펙션 효율을 개선시킨다. 이 링커 분자는 생물적으로, 물리적으로 혹은 화학적으로 절단가능한 결합, 예컨대 가수분해 결합, 환원가능한 결합, 절단 부위에 특이적인 효소를 가진 펩티드 서열, pH 민감성 또는 초음파 민감성 결합을 함유할 수 있다. 이들 중합체의 분해는 가수분해, 효소 소화 및 광 분해(photolysis)와 같은 물리적 분해 방법을 포함하지만 이들로만 제한되지는 않는다.
여기에 기재된 분해가능한 양이온성 중합체의 장점중의 하나는 링커의 유형과 구조를 기초하여 중합체 분해의 속도와 부위의 측면에서, 중합체의 분해가 조절가능하다는 것이다.
바람직한 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 복수의 양이온 분자와 분지 배열로 상기 양이온성 분자를 연결하는 적어도 하나의 분해가능한 링커 분자를 함유한다.
양이온성 올리고머, 예컨대 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI), 저분자량 폴리(L-라이신)(PLL), 저분자량 키토산, 및 저분자량 PAMAM 덴드라이머는 여기에 기재된 중합체를 만드는데 사용될 수 있다. 더욱이, 3개 이상의 반응성 부위를 가진 아민을 함유한 분자가 사용될 수 있다.
양이온성 올리고머는 하기로부터 선택될 수 있지만, 이들로만으로 제한되지는 않는다:
(i) 하기식 (A) 또는 (B)의 양이온성 화합물 또는 그의 조합:
Figure 112007050291873-PCT00002
(식에서, R1은 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 또 다른 식 A, 혹은 식 B이며,
R2는 식 -(CH2)a-(a는 2 내지 10의 정수임)의 직쇄 알킬렌기이고,
R3는 식 -(CbH2b)-(b는 2 내지 10의 정수임)의 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기이며,
R4는 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 또 다른 식 A, 또는 식 B이고,
R5는 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 또 다른 식 A, 또는 식 B이고,
R6는 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 식 A, 또는 또 다른 식 B이고,
R7은 식 -(CcH2c)-(c는 2 내지 10의 정수임)의 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기이며,
R8은 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 식 A, 또는 또 다른 식 B이다);
(ii) 종결된 일차 또는 이차 아미노기를 갖는 양이온성 수지상 혹은 분지 폴리아미도아민(PAMAM);
(iii) 양이온성 폴리아미노산; 혹은
(iv) 양이온성 폴리카르보하이드레이트.
그러한 양이온성 분자의 예로는 표 1에 나타난 양이온성 분자를 포함하지만 이들로만으로 제한되지는 않는다.
Figure 112007050291873-PCT00003
Figure 112007050291873-PCT00004
여기에 사용된 양이온성 중합체는 당, 펩티드, 단백질 및 다른 분자와 같은 활성 리간드와 결합될 수 있는 일차 또는 이차 아미노기를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 락토비오닉 산(lactobionic acid)이 양이온 중합체와 결합된다. 갈락토실 단위는 세포의 표면 갈락토스 수용체의 존재로 인해 간세포 쪽으로 유용한 표적화 분자를 제공한다. 다른 구현예에서, 중합체상에 갈락토실 단위를 도입하기 위해 락토스는 분해가능한 양이온성 중합체와 결합된다.
분해가능한 링커 분자는 적어도 하나의 생분해가능한 스페이서를 함유하는 디- 및 다중-아크릴레이트, 디- 및 다중-메타크릴레이트, 디- 및 다중-아크릴아미드, 디- 및 다중-이소티오시아네이트, 디- 및 다중-이소시아네이트, 디- 및 다중-에폭시드, 디- 및 다중-알데히드, 디- 및 다중-아실 클로라이드, 디- 및 다중-술포닐 클로라이드, 디- 및 다중-할라이드, 디- 및 다중-무수물, 디- 및 다중-말레이미드, 디- 및 다중-카르복실산, 디- 및 다중-α-할로아세틸산, 디- 및 다중-N-히드록시숙신이미드 에스테르를 들 수 있지만, 이들로만으로 제한되지는 않는다. 하기 식은 바람직한 구현예에 따라 사용될 수 있는 링커를 기술하고 있다:
A(Z)d
(식에서 A는 적어도 하나의 분해가능한 결합을 갖는 스페이서 분자이고, Z는 아미노기와 반응하는 반응성 잔기이며, d는 2 이상의 정수이고, A와 Z는 공유결합된다).
링커 분자의 반응성 잔기의 몇몇 구현예가 표 2에 예시되었지만, 이들 예로 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다. 반응성 잔기는 아크릴로일, 말레이미드, 할라이드, 카르복실 아실할라이드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 에폭시드, 알데히드, 술포닐 클로라이드, 및 N-히드록시숙신이미드 에스테르 기 또는 그의 조합으로부터 선택되지만 이들로만 제한되지는 않는다.
Figure 112007050291873-PCT00005
중합체의 분해속도는 중합체 조성, 공급 비 및 중합체의 분자량을 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 예컨대, 벌크 알킬기와 링커가 사용될 경우, 중합체는 서서히 분해할 것이다. 또한 분자량을 증가시키면 일부 경우에 분해 속도의 감소가 일어날 것이다. 중합체의 분해속도는 링커에 대한 양이온성 중합체의 비를 조정함으로써 혹은 각종 분해가능한 링커 분자를 변화시킴으로써 제어할 수 있다.
아크릴레이트 링커는 디술피드-함유 링커의 합성이 더욱 어렵기 때문에, 디술피드-함유 링커보다도 더욱 값싸다. 아크릴레이트 링커는 수용액에서 가수분해가능하다. 따라서 아크릴레이트 링커를 함유하는 중합체는 물을 함유하는 한 다양한 환경에서 분해될 수 있다. 따라서, 아크릴레이트 링커를 함유하는 중합체는 디술피드-링커 함유 중합체와 비교하여 넓은 적용분야를 가지고 있다. 덧붙여, 디술피드-링커를 가진 중합체의 분해속도는 통상 같지만, 아크릴레이트 링커에 의해 합성된 중합체의 분해속도는 사용된 상이한 아크릴레이트 링커에 따라 다양할 수 있다.
일부 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 단백질, 펩티드, 다당류 혹은 다른 중합체와 같은 매트릭스와 혼합될 수 있다. 단백질은 표면에 단백질을 부착시키는데 사용될 수 있는 겔라틴, 콜라겐, 소혈청 알부민 또는 다른 단백질이다. 중합체는 하이드로겔, 공중합체, 비분해가능 또는 생분해가능 중합체 및 생체적합 재료이다. 다당류는 막을 형성할 수 있으며 키토산과 같은 운반 시약을 코팅할 수 있는 화합물일 수 있다. 다른 시약, 예컨대 세포독성 감소 시약, 세포 결합 시약, 세포 성장 시약, 세포 자극 시약 또는 세포 억제 시약 및 특이 세포 배양 화합물은 또한 트랜스펙션 또는 운반 시약과 함께 트랜스펙션 장치에 부착될 수 있다. 트랜스펙션 시약은 분해가능한 양이온성 중합체와 비분해가능한 양이온성 중합체 모두를 함유할 수있다. 비분해가능한 양이온성 중합체 대 분해가능한 양이온성 중합체의 비는 바람직하게는 중량으로 1:0.5 내지 1:20(비분해가능:분해가능), 더욱 바람직하게는 중량으로 1:2 내지 1:10이다.
다른 구현예에 따라, 적절한 용매, 예컨대 물 혹은 두 번 탈이온화된 물에서 존재하는 겔라틴과 트랜스펙션 시약(예, 지질, 중합체, 지질-중합체 혹은 막 탈안정화 펩티드)를 함유하는 겔라틴-트랜스펙션 시약 혼합물이 트랜스펙션 장치에 부착될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 배양 시약(예, 파이브로넥틴, 콜라겐, 염, 당, 단백질 또는 펩티드)는 또한 겔라틴-트랜스펙션 시약 혼합물에 존재할 수 있다. 이 혼합물은 표면, 예컨대 슬라이드 혹은 다중-웰 플레이트에 균일하게 퍼져 겔라틴-트랜스펙션 시약 혼합물을 함유하고 있는 트랜스펙션 장치를 제조한다. 또 다른 구현예에서, 상이한 트랜스펙션 시약-겔라틴 혼합물이 또한 트랜스펙션 장치의 표면의 별개 영역내에 떨어뜨릴 수 있다. 수득한 생성물은 겔라틴-트랜스펙션 시약 혼합물이 혼합물의 적용 부위에 부착되도록 적절한 조건하에서 완전히 건조시킨다. 예컨대, 수득한 생성물은 특정 온도 혹은 습도 혹은 진공-건조기에서 건조될 수 있다.
상기 혼합물에 존재하는 트랜스펙션 시약의 농도는 트랜스펙션 효율과 시약의 세포독성에 의존한다. 전형적으로 트랜스펙션 효율과 세포독성간에 균형점이 있다. 트랜스펙션 시약이 가장 효과적인 농도에서, 세포독성은 허용가능한 수준으로 유지하면서, 트랜스펙션 시약의 농도는 최적 수준으로 한다. 트랜스펙션 시약의 농도는 통상 약 1.0 μg/ml 내지 약 1000 μg/ml의 범위이다. 바람직한 구현예에서, 농도는 약 10 μg/ml 내지 약 600 μg/ml이다. 유사하게, 겔라틴 또는 다른 매트릭스의 농도는 수행되는 실험 또는 검정에 의존하지만, 농도는 통상 트랜스펙션 시약 용액의 0.01% 내지 0.5%(w/v)의 범위이다.
바람직한 구현예에서, 세포로 도입되는 분자는 핵산이다. 핵산은 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 펩티드 핵산(PNA) 등이다. 만약 사용된 DNA가 벡터내 존재한다면, 벡터는 플라스미드(예, 플라스미드 운반 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자 및/또는 루시페라제(luc) 유전자) 또는 바이러스성 기재 벡터(예, pLXSN)와 같은 임의의 유형일 수 있다. DNA는 발현되는 cDNA의 5' 말단에서 (CMV 프로모터와 같은) 프로모터 서열과 3'말단에서 폴리 A 부위을 가진 선형 단편일 수 있다. 이들 유전자 발현 요소는 대상 cDNA가 포유류 세포에 임시적으로 발현되도록 한다. 만약 DNA가 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), 예컨대 안티센스 ODN이라면, 세포로 도입되어 표적 유전자 발현을 제어할 수 있다. RNA를 사용한 구현예에서, 핵산은 단일 가닥(안티센스 RAN와 리보자임) 혹은 이중 가닥 (RNA 인터페렌스, SiRNA)일 수 있다. 대부분의 경우에, RNA는 그의 안정성을 증가시키고 유전자 발현의 하향 조절에서 기능을 개선하기위해 개질된다. 펩티드 핵산(PNA)에서, 핵산 골격은 펩티드로 교체되어 분자를 더욱 안정하게 만든다. 여기에 기술된 방법은 여러 목적으로 예컨대 분자 치료법, 단백질 기능 연구, 혹은 분자 메카니즘 연구를 위해 세포로 핵산을 도입하는데 사용될 수 있다.
적절한 조건하에, 핵산 용액을 트랜스펙션 시약으로 코팅된 트랜스펙션 장치에 첨가하여 핵산 트랜스펙션 시약 복합체를 형성한다. 핵산은 바람직하게는 소태아 혈청 및 항생물질이 없는 세포 배양배지, 예컨대 둘베코 개질 이글 배지(DMEM)에 용해된다. 그러나 최소 필수 이글, F-12 카이간 개질 배지, 또는 RPMI 1640 배지를 포함하는 적절한 세포 배양 배지가 사용될 수 있으며 이들로 제한되지는 않는다. 만약 트랜스펙션 시약이 균등하게 슬라이드에 부착되면, 핵산 용액을 슬라이드상에 별개 위치에 떨어뜨릴 수 있다. 또 다르게는, 트랜스펙션 시약은 슬라이드상에 별개의 위치에 떨어뜨릴 수 있고, 핵산 용액은 간단히 트랜스펙션 장치의 전체 표면을 덮도록 첨가할 수 있다. 만약 트랜스펙션 시약이 다중-웰 플레이트의 바닥에 부착된 다면, 핵산용액은 다중-채널 피펫, 자동화 장치 혹은 본 기술분야에 공지된 운반 방법에 의해 상이한 웰에 간단히 첨가된다. 수득한 생성물(트랜스펙션 시약과 원하는 핵산으로 코팅된 트랜스펙션 장치)를 대략 5분 내지 60분, 더욱 바람직하게는 25-30분동안 실온에서 배양하여 핵산/트랜스펙션 시약 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, 예컨대 만약 상이한 핵산 샘플을 슬라이드의 별개 위치에 떨어뜨린다면, 트랜스펙션 시약으로 결합된 핵산샘플을 갖는 표면을 제조하도록 DNA 용액은 제거될 것이다. 또 다른 구현예에서, 핵산 용액은 표면에 유지될 수 있다. 두 번째, DMEM와 같은 적절한 배지내 세포가 적절한 밀도로 표면상에 플레이트된다. 수득한 생성물(생체분자와 플레이트된 세포를 함유하는 표면)은 적절한 조건하에서 유지되어 대상 핵산을 플레이트된 세포로 유입되게 한다. 또 다른 구현예에서, 세포는 생체분자 혹은 핵산과 혼합된다. 세포/생체 분자혼합물은 이후에 트랜스펙션 장치에 첨가되어 실온에서 배양된다.
여기에 기술된 방법에 따른 용도를 위한 적절한 세포는 원핵생물, 이스트균, 또는 식물 및 동물 세포, 특히 포유류 세포를 포함하는 고등 진핵 세포를 포함하지만 이들로만으로 제한되지는 않는다. 바람직한 구현예에서, 대상 핵산의 진핵 세포로의 도입/유입과 DNA의 발현 혹은 생체분자와 세포 성분과의 상호작용을 위한 적절한 조건과 충분한 밀도에서, 진핵세포, 예컨대 포유류 세포(예, 인간, 원숭이, 개, 고양이, 소 또는 쥐 세포), 박테리아, 곤충 또는 식물 세포는 트랜스펙션 시약과 대상 핵산이 코팅된 트랜스펙션 장치에 플레이트된다. 특정 구현예에서, 세포는 조혈세포, 신경세포, 췌장세포, 간세포, 연골세포, 골세포, 또는 근세포로부터 선택될 수 있다. 이 세포는 완전히 분화된 세포 또는 전구/줄기 세포일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 진핵 세포는 L-글루타민과 페닐실렌/스트렙토마이신(pen/strep)을 가진 10% 가열-불활성화된 소태아 혈청(FBS)을 함유한 둘베코 개질 이글 배지(DMEM)에서 성장하였다. 당 기술분야의 숙련자들에게 일부 세포가 성장인자와 아미노산과 같은 특정 영양분을 필요로 하기 때문에 특정 세포는 특수 배지에서 배양시켜야한다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 특정 세포 유형의 배양을 위한 적절한 배지는 당 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있다. 세포의 최적 밀도는 세포 유형과 실험의 목적에 의존한다. 예컨대, 70 내지 80% 컨플루언트(confluent) 세포가 유전자 트랜스펙션에 바람직하지만, 올리고뉴클레오티드 운반을 위한 최적 조건은 30-50% 컨플루언트 세포이다. 예컨대, 5 X 104 293 세포/웰이 96 웰 플레이트에 접종될 경우, 세포는 세포 접종후 18-24 시간에 90% 컨플루언스에 도달할 것이다. HeLa 705세포의 경우 다만 1 X 104 세포/웰이 96 웰 플레이트에서 유사한 컨플루언스비율을 달성하는데 필요하다.
세포가 핵산 샘플/트랜스펙션 시약을 함유한 표면에 접종된 후, 세포는 세포 유형을 위한 최적 조건(예, 37℃, 5-10% CO2)하에 배양된다. 배양시간은 실험 목적에 의존적이다. 전형적으로 세포는 유전자 트랜스펙션 실험의 경우에 표적 유전자를 발현하도록 하기 위해 24 내지 48시간 동안 배양된다. 세포내 생체분자의 세포내 트래피킹(trafficking)의 분석시 수분 내지 수시간의 배양시간이 요구될 수 있으며, 세포는 정의된 시간에 관측될 수 있다.
생체분자 운반의 결과는 상이한 방법에 의해 분석될 수 있다. 유전자 트랜스펙션과 안티센스 핵산 운반의 경우에, 표적 유전자 발현 수준은 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자, 루시페라제 유전자, 또는 베타-갈락토시다제 유전자 발현과 같은 리포터 유전자에 의해 검출될 수 있다. GFP의 신호는 현미경하에 직접 관측될 수 있으며, 루시페라제의 활성은 발광기(luminometer)로 검출될 수 있고, β-갈락토시다제에 의해 촉매화된 청색물이 현미경하에 관측되거나 마이크로플레이트 판독기에 의해 측정될 수 있다. 본 기술분야에 숙련자들은 이들 리포터가 어떻게 기능하며 이들이 유전자 운반 시스템에 도입될 수 있는지 친숙하다. 핵산과 그의 생성물, 혹은 여기에 기술된 방법에 따라 운반된 다른 생체분자와 이들 생체분자에 의해 매개된 표적은 면역형광 검출 또는 효소 면역세포화학, 자기방사기록법, 혹은 인사이투(in situ) 하이브리드화와 같은 각종 방법에 의해 측정될 수 있다. 만약 면역형광법이 부호화된 단백질의 발현을 검출하는데 사용될 경우, 표적 단백질과 결합하는 형광 라벨 항체가 사용된다(예컨대, 항체의 단백질의 대한 결합을 위한 적절한 조건하에 슬라이드에 첨가). 단백질을 함유한 세포는 이후 형광 신호를 검출함으로써 확인된다. 만약 운반된 세포가 유전자 발현을 매개할 수있다면, 표적 유전자 발현 수준은 또한 자기방사기록법, 인사이투 하이브리드화 및 인사이투 PCR과 같은 방법에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 확인 방법은 운반된 생체분자, 그의 발현물, 그에 의해 매개된 표적, 및/또는 생체분자의 운반으로부터 수득된 최종 생성물의 특성에 의존한다.
실시예 1
분해가능한 양이온성 중합체의 제조
분해가능한 양이온성 중합체의 제조를 위한 통상 과정으로 분자량 600의 폴리에틸렌이민 올리고머(PEI-600)과 2,4-펜탄디올 디아크릴레이트(PDODA)로부터 유도된 중합체의 합성이 제공되었다. 바이얼에 염화메틸렌 25 ml중의 PEI-600 4.32 g을 피펫 또는 주사기를 사용하여 첨가하였다. PDODA 2.09 g을 상기 PEI-600 용액에 교반하면서 신속히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온(20℃)에서 4시간동안 교반시켰다. 이후 2M HCl 50 ml를 첨가함으로써 이 반응 혼합물을 중화시켰다. 백색 침전물을 원심분리하고, 염화메틸렌으로 세정하고, 감압하에 실온에서 건조시켰다.
실시예 2
분해가능한 양이온성 중합체를 가진 트랜스펙션가능한 세포 배양기의 제조
분해가능한 양이온성 중합체는 실시예 1에 지적한 바와 같이 제조되었다. 선형 폴리에틸렌이민(L-PEI) 기재 중합체와 기질 기재 중합체가 실험관내 포유류 세포내로 플라스미드 DNA의 트랜스펙션을 위해 사용되어 트랜스펙션 효율을 평가하였다. L-PEI 기재 중합체에 대해서는, 제트 PEI(Qbiogene) 트랜스펙션 시약이 사용되었다. 리포펙타민 2000 (인비트로겐)과 N-〔1-(2,3-디올레오일옥시)프로필〕-N,N,N-트리메틸암모늄 염(DOTAP; 시그마-알드리치)를 지질 기재 중합체로 사용하였다. 분해가능한 양이온성 중합체와 DOTAP를 메탄올에 용해시키고, 제트 PEI와 리포펙타민 2000을 탈이온수로 희석시켰다. 평평한 바닥 96-웰 세포 배양 플레이트(바닥면: 각 웰당 0.23 cm2, BD Biosciences)를 이들 중합체 용액으로 처리하였다. 바닥에 부착된 실제 양은 다음과 같다: (a) 분해가능한 양이온성 중합체; 웰당 3 μg, 따라서 9.4 μg/cm2, (b) 제트 PEI; 웰당 1 μl, (c) 리포펙타민 2000; 웰당 0.375 μg, (d) DOTAP; 웰당 2 및 4 pmole. 이들 플레이트는 감압하에 실온에서 건조시킨후 사용할 때까지 진공 팩에 밀봉시켰다.
실시예 3
트랜스펙션 가능한 세포 배양기에 의한 293 세포의 트랜스펙션
옵티-MEM I (인비트로겐) 25 μl에 pEGFP-Nl 플라스미드(Clontech사에서 구 매) 25 또는 50 ng을 각 웰에 첨가하고 실온에서 25분동안 유지시켰다. 이후, 10% 송아지 혈청(인비트로겐)을 가진 둘베코 개질 이글 배지(DMEM)(인비트로겐) 100 μl에 293 세포 5 X 104을 첨가하고 7.5% CO2 및 37℃에서 배양시켰다. 24 내지 36시간 배양후, 트랜스펙션 효율을 에피형광 현미경(epifluorescent microscope)(1 X 70, Olympus)을 사용하여 EGFP 형광을 관측함으로써 평가하였다.
트랜스펙션 효율은 표 3에 나타나 있다. 분해가능한 양이온성 중합체와 제트 PEI, 즉 L-PEI 기재 중합체가 높은 트랜스펙션 효율을 보여주었다.
Figure 112007050291873-PCT00006
실시예 4
세포독성 평가
기술된 방법의 세포독성을 평가하였다. 실시예 3에 지적된 대로 트랜스펙션된 293 세포의 세포 형태를 현미경 관측으로 비교하였다(도 1). 분해가능한 중합체를 사용하여 트랜스펙션된 세포는 정상적인 형태를 보여주었으며, 이는 본래 293 세포와 유사하였다. 그러나, L-PEI 기재 중합체 (제트 PEI)와 지질 기재 중합체(리포펙타민 2000)을 사용하여 트랜스펙션된 세포는 원형이였다. 우리는 분해가능한 양이온성 중합체가 세포를 손상하지 않고 유전자를 운반할 수 있다는 결론을 내렸다.
실시예 5
분해가능한 양이온성 중합체 양의 최적화
분해가능한 양이온성 중합체의 각종 양을 세포 배양기에 부착하고, 트랜스펙션 효율을 평가하였다. 실시예 2에 나타난 것과 동일한 프로토콜로 96-웰 세포 배양 플레이트에 분해가능한 양이온성 중합체를 코팅하였다. 중합체의 실제량은 다음과 같다: 웰당 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 10 및 20 μg. 이후, 트랜스펙션을 실시예 3에 기술된 대로 수행하고, 트랜스펙션된 세포를 7.5%의 CO2 및 37℃에 배양하였다. 세포 접종전에 첨가된 플라스미드 DNA의 양은 웰당 0.13, 0.25, 0.50 또는 1.0 μg이였다. 40시간 배양후, 형광세포의 비율과 세포 상태를 에피형광 현미경으로 평가하였다. 도 2는 트랜스펙션후 EGFP-양성 세포의 비율을 보여준다. 플라스미드 DNA의 웰당 0.25 및 0.5 μg(따라서, 0.78 내지 1.6 μg/cm2)와 분해가능한 양이온성 중합체의 웰당 2.5 내지 5.0 μg(따라서, 7.8 내지 16 μg/cm2)에서 높은 트랜스펙션 효율을 나타냈다.
이들 실험에서 세포 상태는 도 3에 나타나 있다. L-PEI와 지질 기재 중합체에 의해 플레이트에 트랜스펙션된 세포는 원형이며 응집화되었다. 모폴로지는 세포독성으로 인한 것이다. 플레이트의 바닥에 부착된 분해가능한 양이온성 중합체의 양이 웰당 2.5 내지 5.0 μg일 경우 세포 상태가 허용가능하였다. 또한, 우리가 실험한 모든 플라스미드 DNA는 그 양이 웰당 2.5 내지 5.0 μg일 경우 분해가능한 양이온성 중합체와 우수한 세포 상태를 제공하였다.
실시예 6
안정성 연구
특정 목적, 예컨대 세포 성장을 돕기 위해 세포 배양기의 표면에 코팅이 있는 시판 제품이 있다. 정상적으로, 코팅 물질은 콜라겐 또는 피브로넥틴과 같은 일종의 단백질이다. 이들은 온도민감성이므로 이들 세포 배양기는 특히 부피가 큰 경우 단점인 냉장 보관을 요한다. 이러한 이유로, 실온에서 안정성이 중요한 기능이다.
장기간 보관후에 그의 안정성을 연구하기 위해 본 발명의 세포 배양/트랜스펙션 장치를 시험하였다. 세포 트랜스펙션 장치를 실시예 2에 기술된 대로 제조하고, 산소 및 이산화탄소 흡수제의 유무하에 산소 차단 물질과 알루미늄 호일이 있는 필름인 마일라 백(듀폰사)에 진공밀봉하였다. 25℃에 보관하였다. 이후, 루시페라제 유전자(pCMV-LUC)을 수반하는 플라스미드 DNA에 의해 트랜스펙션 효율을 주기적으로 측정하였다. 트랜스펙션가능한 세포 배양기에 대한 절차는 플라스미드 DNA가 다른 것은 제외하고는 실시예 3에 기술된 것과 같다. 세포의 루시페라제 활성은 Dynex MLX 마이크로티터® 플레이트 발광기와 루시페라제 검정 시스템(Promega Corp. Madison, WI USA)을 사용하여 측정함으로써 트랜스펙션 효율을 측정하였다.
도 4, 5 및 6은 마일라 백에 O2 및/또는 CO2 흡수제에 의해 25℃ 보관후 트랜스펙션 효율의 변화를 보여주고 있다. 5달 보관후 어떠한 명백한 트랜스펙션 효율의 감소도 나타나지 않았다. 더욱이, 세포 배양기가 O2 및/또는 CO2 흡수제가 없는 마일라 백에 25℃에 보관될 경우에도 5달후 트랜스펙션 효율은 안정하였으며, 상당히 높았다(도 7). 본 발명의 세포 배양기는 실온에서 상당히 안정하였다. 이 장치는 특별한 보관 조건을 사용하지 않고 보관될 수 있다.
실시예 7
비분해가능한 양이온성 중합체의 제조
비분해가능한 중합체는 다음과 같이 제조하였다. 폴리에틸렌이민 약 5 g(알드리치, 제품번호: 408727)를 디클로로메탄 50 ml에 용해시킨후, 디에틸 에테르 (알드리치, 제품번호: 455180)중의 2.0 M 염화수소 100 ml에 용해시키고 잘 혼합하여 중합체 히드로클로라이드를 형성하였다. 이후, 중합체 히드로클로라이드를 원심분리에 의해 수집하고, 디에틸 에테르 150 ml로 세정시켰다. 디에틸 에테르에 의한 이러한 세정은 두 번 수행하였다. 세정후 수득한 침전물을 실온에서 3시간동안 진공하에 건조시켰다. 이후, 건조 분말은 사용하기전까지 건조제와 4℃에 보관하였다.
실시예 8
분해가능한 양이온성 중합체와 비분해가능한 양이온성 중합체를 가진
96-웰 트랜스펙션 가능한 세포 배양기의 제조
분해가능한 양이온성 중합체를 실시예 1에서 지적한 대로 제조하였다. 비분해가능한 양이온성 중합체는 실시예 7에서 지적한 대로 제조하였다. 양 중합체를 메탄올에 용해시키고 함께 혼합하여 코팅액을 만들었다. 각 중합체의 최종 농도는 다음과 같다. 분해가능한 양이온성 중합체 40 μg/ml, 비분해가능한 양이온성 중합체 10 μg/ml. 이후, 평평한 바닥 96-웰 세포 배양 플레이트(바닥면 각 웰당 0.32 cm2; BD Bioscience)를 코팅액으로 처리하였다. 실제로, 코팅액 25 μl를 각 웰에 분배하고 진공 조건하에서 건조하여 메탄올을 제거하였다. 이들 코팅 조건하에서, 분해가능한 양이온성 중합체 1 μg을 96-웰 플레이트의 각 웰에 부착한 결과 분해가능한 양이온성 중합체의 밀도는 3.1 μg/cm2였다. 또한, 비분해가능한 양이온성 중합체 0.25 μg을 96-웰 플레이트의 각 웰에 부착한 결과 비분해가능한 양이온성 중합체의 밀도는 0.78 μg/cm2였다. 전체로, 중합체 1.25 μg을 96-웰 플레이트의 각 웰에 부착하였으며, 따라서 중합체의 밀도는 3.9 μg/cm2였다. 이 실시예에서 제조한 세포 배양기는 건조제가 있는 마일라 백에서 진공밀봉하고 추후 사용시까지 실온에서 보관하였다.
실시예 9
분해가능한 양이온성 중합체와 비분해가능한 양이온성 중합체를 가진
12-웰 트랜스펙션가능한 세포 배양기의 제조
분해가능한 양이온성 중합체를 실시예 1에서 지적한 대로 제조하였다. 비분해가능한 양이온성 중합체는 실시예 7에서 지적한 대로 제조하였다. 양 중합체를 메탄올에 용해시키고 함께 혼합하여 코팅액을 만들었다. 각 중합체의 최종 농도는 다음과 같다. 분해가능한 양이온성 중합체 80 μg/ml, 비분해가능한 양이온성 중합체 10 μg/ml. 이후, 평평한 바닥 12-웰 세포 배양 플레이트(바닥면 각 웰당 3.8 cm2; BD Bioscience)를 이들 중합체 액으로 처리하였다. 코팅액 100 μl를 각 웰에 분배하고 진공 조건하에서 건조하여 메탄올을 제거하였다. 이들 코팅 조건하에서, 분해가능한 양이온성 중합체 8.0 μg을 12-웰 플레이트의 각 웰에 부착한 결과 분해가능한 양이온성 중합체의 밀도는 2.1 μg/cm2이며, 비분해가능한 양이온성 중합체 1.0 μg을 12-웰 플레이트의 각 웰에 부착한 결과 비분해가능한 양이온성 중합체의 밀도는 0.26 μg/cm2였다. 전체로, 중합체 9.0 μg을 12-웰 플레이트의 각 웰에 부착하였으며, 따라서 중합체의 밀도는 2.4 μg/cm2였다. 이 실시예에서 제조한 세포 배양기는 건조제가 있는 마일라 백에서 진공밀봉하고 추후 사용시까지 실온에서 보관하였다.
실시예 10
분해가능한 양이온성 중합체와 비분해가능한 양이온성 중합체를 가진
6-웰 트랜스펙션가능한 세포 배양기의 제조
분해가능한 양이온성 중합체를 실시예 1에서 지적한 대로 제조하였다. 비 분해가능한 양이온성 중합체는 실시예 7에서 지적한 대로 제조하였다. 양 중합체를 메탄올에 용해시키고 함께 혼합하여 코팅액을 만들었다. 각 중합체의 최종 농도는 다음과 같다. 분해가능한 양이온성 중합체 80 μg/ml, 비분해가능한 양이온성 중합체 10 μg/ml. 이후, 평평한 바닥 6-웰 세포 배양 플레이트(바닥면 각 웰당 9.6 cm2; BD Bioscience)를 이들 코팅액으로 처리하였다. 코팅액 200 μl를 각 웰에 분배하고 진공 조건하에서 건조하여 메탄올을 제거하였다. 이들 코팅 조건하에서, 분해가능한 양이온성 중합체 16 μg을 6-웰 플레이트의 각 웰에 부착한 결과 분해가능한 양이온성 중합체의 밀도는 1.7 μg/cm2이며, 비분해가능한 양이온성 중합체 2.0 μg을 6-웰 플레이트의 각 웰에 부착한 결과 비분해가능한 양이온성 중합체의 밀도는 0.21 μg/cm2였다. 전체로, 중합체 18 μg을 6-웰 플레이트의 각 웰에 부착하였으며, 따라서 중합체의 밀도는 1.9 μg/cm2였다. 이 실시예에서 제조한 세포 배양기는 건조제가 있는 마일라 백에서 진공밀봉하고 추후 사용시까지 실온에서 보관하였다.
실시예 11
분해가능한 양이온성 중합체와 비분해가능한 양이온성 중합체로 제조된
96-웰 트랜스펙션 가능한 세포 배양기에 의한 트랜스펙션
포유류 세포를 10 cm 세포 배양 접시에 배양하고, 포스페이트-완충 염수로 세정하고 트립신 용액으로 처리하였다. 이후, 트립신화된 세포를 혈청을 가진 적 절한 세포 배양배지에 희석하여 세포 현탁액을 제조였다. 본 실시예에 사용된 세포 밀도는 표 4에 나타나 있다.
pEGFP-Nl 플라스미드를 옵티-MEM에 희석시키고 최종 농도를 10 μg/ml로 조정하였다. 이후, 플라스미드 용액 25 μl를 실시예 8에서 지적한 바와 같이 제조된 96-웰 트랜스펙션 가능한 세포 배양기의 각 웰에 첨가하고 실온에서 25분간 유지시켰다. 이후, 세포 현탁액 100 μl를 웰에 첨가하고 7.5%의 CO2와 37℃에서 배양시켰다. 36 내지 48 시간 배양후, 트랜스펙션 효율을 에피형광 현미경(1 X 70, Olympus)을 사용하여 EGFP 형광을 관측함으로써 평가하였다.
표 4는 각종 포유류 세포주에서 EGFP 형광을 가진 세포의 비율을 나타낸다. 본 발명의 96-웰 트랜스펙션 가능한 세포 배양기는 높은 효율로 각종 포유류 세포주를 트랜스펙션시켰다.
실시예 12
분해가능한 양이온성 중합체와 비분해가능한 양이온성 중합체로 제조된
12-웰 트랜스펙션 가능한 세포 배양기에 의한 트랜스펙션
포유류 세포를 10 cm 세포 배양 접시에 배양하고, 포스페이트-완충 염수로 세정하고 트립신 용액으로 처리하였다. 이후, 트립신화된 세포를 혈청을 가진 적절한 세포 배양배지에 희석하여 세포 현탁액을 제조였다. 본 실시예에 사용된 세포 밀도는 표 4에 나타나 있다.
pEGFP-Nl 플라스미드를 옵티-MEM에 희석시키고 최종 농도를 5 μg/ml로 조정 하였다. 이후, 플라스미드 용액 200 μl를 실시예 9에서 지적한 바와 같이 제조된 12-웰 트랜스펙션 가능한 세포 배양기의 각 웰에 첨가하고 실온에서 25분간 유지시켰다. 이후, 세포 현탁액 1 ml를 웰에 첨가하고 7.5%의 CO2와 37℃에서 배양시켰다. 36 내지 48 시간 배양후, 트랜스펙션 효율을 에피형광 현미경(1 X 70, Olympus)을 사용하여 EGFP 형광을 관측함으로써 평가하였다.
표 4는 각종 포유류 세포주에서 EGFP 형광을 가진 세포의 비율을 나타낸다. 본 발명의 12-웰 트랜스펙션 가능한 세포 배양기는 높은 효율로 각종 포유류 세포주를 트랜스펙션시켰다.
실시예 13
분해가능한 양이온성 중합체와 비분해가능한 양이온성 중합체로 제조된
6-웰 트랜스펙션 가능한 세포 배양기에 의한 트랜스펙션
포유류 세포를 10 cm 세포 배양 접시에 배양하고, 포스페이트-완충 염수로 세정하고 트립신 용액으로 처리하였다. 이후, 트립신화된 세포를 혈청을 가진 적절한 세포 배양배지에 희석하여 세포 현탁액을 제조였다. 본 실시예에 사용된 세포 밀도는 표 4에 나타나 있다.
pEGFP-Nl 플라스미드를 옵티-MEM에 희석시키고 최종 농도를 5 μg/ml로 조정하였다. 이후, 플라스미드 용액 400 μl를 실시예 10에서 지적한 바와 같이 제조된 6-웰 트랜스펙션 가능한 세포 배양기의 각 웰에 첨가하고 실온에서 25분간 유지시켰다. 이후, 세포 현탁액 2 ml를 웰에 첨가하고 7.5%의 CO2와 37℃에서 배양시 켰다. 36 내지 48 시간 배양후, 트랜스펙션 효율을 에피형광 현미경(1 X 70, Olympus)을 사용하여 EGFP 형광을 관측함으로써 평가하였다.
표 4는 각종 포유류 세포주에서 EGFP 형광을 가진 세포의 비율을 나타낸다. 본 발명의 6-웰 트랜스펙션 가능한 세포 배양기는 높은 효율로 각종 포유류 세포주를 트랜스펙션시켰다.
Figure 112007050291873-PCT00007
본 기술 분야의 숙련자라면 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다수의 각종 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 형태는 예시를 위해 주어진 것으로 본 발명의 범위를 제한할 의도로 주어진 것은 아니라는 것을 명확히 이해되어야 한다.

Claims (31)

  1. 생체 분자에 결합되지 않는 트랜스펙션 시약을 함유하고 있는 조성물로 코팅된 고체 지지체를 함유한 장치.
  2. 제 1 항에 있어서, 고체 지지체가 폴리스티렌 수지, 에폭시 수지 및 유리로 구성된 군에서 선택되는 장치.
  3. 제 1 항에 있어서, 코팅물이 고체 지지체의 표면에 존재하는 장치.
  4. 제 3 항에 있어서, 트랜스펙션 시약의 코팅량이 약 0.1 내지 약 100 μg/cm2인 장치.
  5. 제 1 항에 있어서, 트랜스펙션 시약이 중합체인 장치.
  6. 제 5 항에 있어서, 중합체가 양이온성 중합체인 장치.
  7. 제 1 항에 있어서, 트랜스펙션 시약이 분해가능한 양이온성 중합체를 함유하고 있는 장치.
  8. 제 7 항에 있어서, 분해가능한 양이온성 중합체가 하나 이상의 분해가능한 링커에 의해 함께 결합된 양이온성 화합물 또는 올리고머를 함유하고 있는 장치.
  9. 제 7 항에 있어서, 트랜스펙션 시약이 추가로 비분해가능한 양이온성 중합체를 함유하고 있는 장치.
  10. 제 9 항에 있어서, 비분해가능한 양이온성 중합체 대 분해가능한 양이온성 중합체의 비가 중량으로 1:0.5 내지 1:20인 장치.
  11. 제 1 항에 있어서, 트랜스펙션 시약이 복수의 양이온성 분자와, 상기 양이온성 분자를 분지 배열로 연결하는 적어도 하나의 분해가능한 링커 분자를 함유하고 있으며, 상기 양이온성 분자가 하기로 구성된 군에서 선택되는 장치:
    (i) 하기식 A 또는 B의 양이온성 화합물 또는 그의 조합:
    Figure 112007050291873-PCT00008
    (식에서, R1은 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 또 다른 식 A, 혹은 식 B이며,
    R2는 식 -(CH2)a-(a는 2 내지 10의 정수임)의 직쇄 알킬렌기이고,
    R3는 식 -(CbH2b)-(b는 2 내지 10의 정수임)의 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기이며,
    R4는 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 또 다른 식 A, 또는 식 B이고,
    R5는 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 또 다른 식 A, 또는 식 B이고,
    R6는 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 식 A, 또는 또 다른 식 B이고,
    R7은 식 -(CcH2c)-(c는 2 내지 10의 정수임)의 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기이며,
    R8은 수소원자, 탄소수 2 내지 10의 알킬, 식 A, 또는 또 다른 식 B이다);
    (ii) 종결된 일차 또는 이차 아미노기를 갖는 양이온성 수지상 혹은 분지 폴리아미도아민(PAMAM);
    (iii) 양이온성 폴리아미노산; 혹은
    (iv) 양이온성 폴리카르보하이드레이트;
    그리고 상기 분해가능한 링커 분자는 하기식으로 표시된다:
    A(Z)d
    (식에서 A는 하나 이상의 분해가능한 결합을 가지고 있는 스페이서 분자이고, Z는 아미노기와 반응하는 반응성 잔기이며, d는 2이상의 정수이고, A와 Z는 공유결합된다).
  12. 제 8 항에 있어서, 양이온성 화합물 또는 올리고머가 폴리(L-라이신)(PLL), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리프로필렌이민(PPI), 펜타에틸렌아민, N,N'-비스(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민, N,N'-비스(2-아미노프로필)-에틸렌디아민, 스페르민, 스페르미딘, N-(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민, N-(3-아미노프로필)-1,3-프로판디아민, 트리(2-아미노에틸)아민, 1,4-비스(3-아미노프로필)피페라진, N-(2-아미노에틸)피페라진, 수지상 폴리아미도아민(PAMAM), 키토산, 및 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트(PDMAEMA)로 구성된 군에서 선택되는 장치.
  13. 제 8 항에 있어서, 링커 분자가 디- 및 다중-아크릴레이트, 디- 및 다중-아크릴아미드, 디- 및 다중-이소티오시아네이트, 디- 및 다중-이소시아네이트, 디- 및 다중-에폭시드, 디- 및 다중-알데히드, 디- 및 다중-아실 클로라이드, 디- 및 다중-술포닐 클로라이드, 디- 및 다중-할라이드, 디- 및 다중-무수물, 디- 및 다중-말레이미드, 디- 및 다중-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 디- 및 다중-카르복실산, 혹은 디- 및 다중-할로아세틸기로 구성된 군에서 선택되는 장치.
  14. 제 8 항에 있어서, 링커 분자가 1,3-부탄디올 디아크릴레이트, 1,4-부탄디올 디아크릴레이트, 1,6-헥산디올 디아크릴레이트, 2,4-펜탄디올 디아크릴레이트, 2-메틸-2,4-펜탄디올 디아크릴레이트, 2,5-디메틸-2,5-헥산디올 디아크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트, 트리메틸롤프로판 트리아크릴레이트, 펜타에리 트리톨 테트라아크릴레이트, 디(트리메틸롤프로판)테트라아크릴레이트, 디펜타에리트리톨 펜타아크릴레이트, 및 적어도 세 개의 아크릴레이트 혹은 아크릴아미드 측쇄기를 갖는 폴리에스테르로 구성된 군에서 선택되는 장치.
  15. 제 8 항에 있어서, 중합체의 분자량이 500 da 내지 1,000,000 da인 장치.
  16. 제 8 항에 있어서, 중합체의 분자량이 2000 da 내지 200,000 da인 장치.
  17. 제 8 항에 있어서, 양이온성 화합물 또는 올리고머의 분자량이 50 da 내지 10,000 da인 장치.
  18. 제 8 항에 있어서, 링커 분자의 분자량이 100 da 내지 40,000 da인 장치.
  19. 제 1 항에 있어서, 고체 지지체가 접시 바닥, 다중-웰 플레이트 혹은 연속 표면인 장치.
  20. 제 1 항에 있어서, 상당한 트랜스펙션 효율의 감소없이 적어도 5달동안 실온에서 보관될수 있는 장치.
  21. 제 1 항의 장치에 트랜스펙션되는 핵산을 함유한 용액을 첨가하는 단계;
    진핵 세포를 상기 장치에 첨가하는 단계; 및
    세포 트랜스펙션이 이루어지도록 세포와 핵산 용액을 배양하는 단계를 포함하는 세포 트랜스펙션의 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 배양 시간이 5분 내지 3시간인 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 배양 시간이 10분 내지 90분인 방법.
  24. 제 21 항에 있어서, 핵산이 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드 및 화학적으로 개질된 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, DNA가 원형(플라스미드), 선형, 단편 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(ODN)인 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, RNA가 단일 가닥(리보자임) 또는 이중가닥 (siRNA)인 방법.
  27. 제 21 항에 있어서, 세포가 포유류 세포인 방법.
  28. 제 21 항에 있어서, 세포의 적어도 일부가 세포 분열을 겪는 방법.
  29. 제 21 항에 있어서, 세포가 형질전환 혹은 일차 세포인 방법.
  30. 제 21 항에 있어서, 세포가 체세포 또는 줄기세포인 방법.
  31. 제 21 항에 있어서, 세포가 식물 세포인 방법.
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