KR20210069036A - 3d 프린팅용 바이오 잉크 - Google Patents

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KR20210069036A
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maleimide
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thiol
bis
cell
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KR1020217005318A
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로버트 하디노토 우타마
빈센트 티트 구안 탄
존 저스틴 구딩
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뉴사우스 이노베이션즈 피티와이 리미티드
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Abstract

본 기술은 적어도 2개의 티올 관능기를 갖는 비스-티올 함유 가교제를 사용하여 가교된 말레이미드 함유 중합체로부터 형성된 3D 프린팅된 히드로겔, 3D 프린팅된 히드로겔을 제조하는 방법, 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

3D 프린팅용 바이오 잉크
관련 출원
본 출원은 2018년 7월 24일 출원된 호주 특허 가출원 번호 2018902674 (발명의 명칭: "Bio-ink for 3D printing")로부터 우선권을 주장하며, 상기 특허의 전체 내용은 본원에서 상호 참조로 포함된다.
기술 분야
본 기술은 광범위하게 3D 바이오프린팅용 바이오 잉크에 관한 것이다. 특히, 본 기술은 가교제를 사용하여 가교된 중합체로부터 형성된 3D 프린팅된 히드로겔, 상기 히드로겔을 제조하는 방법, 및 그의 용도에 관한 것이다.
세포는 생체내 세포외 매트릭스 (ECM) 내에서 3차원적으로 존재한다. 세포와 ECM 사이의 상호작용은 세포의 생물학적 특징 및 거동을 제어하는 데 있어 중요한 역할을 한다. 암 생물학에서, 3차원 (3D) 시험관내 세포 배양 어세이는 세포의 천연 환경을 매우 가깝게 모방하는 환경에서 세포를 배양하는 데 사용된다. 상기 어세이는 2차원 단층 배양물에는 존재하지 않는 생리적 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 유지시킨다.
3D 바이오프린팅은 세포와 다른 생체물질을 조합하여 ECM을 모방하는 합성 구조체를 제조하는 3D 프린팅 기술을 이용한다. 보편적으로, 3D 바이오프린터는 드롭-온-디맨드(drop-on-demand) 또는 압출 프린팅 기술을 이용하여 3D 시험관내 어세이를 프린팅한다. 드롭-온-디맨드 바이오프린팅은 프린팅시 높은 세포 생존율을 유지하는 것으로 보고되었지만, 현 3D 바이오 잉크의 점도는 낮고, 세포 밀도가 낮기 때문에, 상기 기술은 그의 압출 카운터파트와 비교하여 여전히 덜 흔하게 사용되고 있다.
합성 히드로겔 및 천연 히드로겔 둘 모두가 ECM 모방체로서 광범위하게 사용되고 있다. 특히, 합성 히드로겔은 고도로 재현가능하고, 물리적 및 세포 반응 특성을 탁월하게 제어하며, 이는 시험관내 연구를 위해 고도로 바람직한 ECM 모방체의 특징이 된다. 3D 시험관내 어세이를 수동으로 생성하는 현행 접근법은 대개 ECM 모방체로서 매트리겔(Matrigel)® 또는 콜라겐을 이용한다. 광범위하게 사용되어 온 다른 물질은 히알루론산, 키토산 및 알기네이트이다. 이들은 천연물로부터 공급되기 때문에, 천연 히드로겔은 전형적으로 생체적합성이고, 일부 경우에, 세포-매트릭스 상호작용을 위해 필요한 생체분자를 보유한다. 그러나, 천연 히드로겔은 배치별 가변성에 취약하고/거나, 물리적 및 생화학적 모듈성이 없고/거나, 취급이 어려울 수 있기 때문에, ECM 모방체로서 한계를 갖고 있다.
천연 히드로겔이 갖고 있는 다양한 한계를 극복하기 위한 시도로 다양한 합성 히드로겔이 제조되어 왔다. 특히, 공유적으로 가교된 합성 히드로겔은 천연 히드로겔보다 더욱 강건하고, 기계적으로 정확한 시스템을 제공한다. 그러나, 이들 합성 히드로겔 중 다수는 세포-매트릭스 상호작용을 촉진시키는 생화학적 특징이 없다. 추가로, 공유적으로 가교된 합성 히드로겔을 세포의 3D 바이오프린팅에 적용시키기 위해서는 물질은 세포가 히드로겔 내에서 계내 프린팅될 수 있도록 하기 위해서는 생체적합성이어야 한다. 예를 들어, 폴리(아크릴아미드)가 세포 생물학에서 사용되는 생체적합성 합성 히드로겔이지만 (Caliari and Burdick, 2016), 상응하는 히드로겔 전구체는 생체적합성이 아니며, 이러한 이유에서 세포의 3D 바이오프린팅에는 적합하지 않은 것이 된다.
3D 바이오프린팅을 위한 현행 접근법은 히드로겔이 빠르게 형성될 수 있도록 하는 UV-개시된 라디칼 가교 반응을 포함한다 (문헌 [Murphy and Atala, 2014]; [Donderwinkel et al., 2017]: [Jungst et al., 2016 Lowe et al., 2014]). 예를 들어, 광가교가능한 아크릴화된 PEG 및 펩티드의 잉크젯 프린팅은 중간엽 줄기 세포의 캡슐화를 위해 3D 히드로겔 구성체를 생성하는 데 적합한 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Gao et al., 2017]; [Gao et al., 2015]). 그러나, 살아있는 세포의 3D 바이오프린팅을 위한 상기 접근법의 잠재적 사용은 밝혀졌지만, 광가교를 개시하기 위해 UV 조사를 사용하는 것은 살아있는 유기체에서 DNA에 손상을 일으킬 수 있으며, 동시에, 생성된 유리 라디칼 또한 감수성 세포를 손상시킬 수 있다.
최근 3D 바이오프린팅은 상당한 발전을 나타내었고, 3D 시험관내 세포 배양 어세이를 위한 현행 접근법의 한계를 완화시킬 수 있는 잠재성을 갖고 있다. 그러나, 비록 3D 프린팅된 세포 배양의 이익이 잘 확립되어 있기는 하지만, 세포 생물학에서 3D 프린팅된 시험관내 어세이의 사용은 그의 복잡성, 노동 집약적이고, 처리량이 낮은 성질로 인해 여전히 제약을 받고 있다. 따라서, 3D 바이오프린팅에서 사용하기 위한 대안적인 ECM 모방체가 요구되고 있다.
본 발명자들은 생체적합성이고, 실질적으로 비독성인 화학 경로를 통해 신속하게 히드로겔을 형성할 수 있는, 3D 프린팅에 적합한 바이오 잉크를 개발하였다.
제1 측면에서, 본 기술은 적어도 2개의 티올 관능기를 갖는 비스-티올 함유 가교제를 사용하여 가교된 말레이미드 함유 중합체로부터 형성된 3D 프린팅된 히드로겔을 제공한다.
비스-티올 함유 가교제는 2개 초과의 티올 관능기를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 3D 프린터를 이용하여 말레이미드 함유 중합체를 포함하는 용액 (중합체 바이오 잉크)과 비스-티올 함유 가교제를 포함하는 용액 (활성화제)을 조합할 때, 히드로겔이 형성된다.
한 실시양태에서, 3D 프린팅된 히드로겔은 중합체 바이오 잉크 및 활성화제의 프린팅으로부터 약 30분 이하, 또는 10분 이하, 또는 1분 이하, 또는 30초 이하, 또는 10초 이하, 또는 1초 이하 이내에 형성된다.
한 실시양태에서, 중합체 바이오 잉크는 세포와 생체적합성을 나타낸다.
한 실시양태에서, 활성화제는 세포와 생체적합성을 나타낸다.
한 실시양태에서, 중합체 바이오 잉크 및 활성화제는 3D 프린팅 동안 조합되었을 때, 세포와 생체적합성을 나타내는 히드로겔을 형성한다.
한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체는 말레이미드 함유 다당류, 예컨대, 프럭토스, 수크로스 또는 글루코스 단량체를 함유하는 중합체; 합성 중합체, 예컨대, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 말레이미드, 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트 (PHEMA) 말레이미드, 폴리(ε-카프로락톤) (PCL) 말레이미드, 폴리(비닐 알콜) (PVA) 말레이미드, 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 말레이미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (NIPAAM) 말레이미드, 폴리(프로필렌 푸마레이트) (PPF) 말레이미드, 폴리(에틸렌 이민) (PEI) 말레이미드, 폴리(3-메타크릴아미도프로필) 트리메틸암모늄 (PMAETMA) 말레이미드, 및 폴리(L-리신) (PLL) 말레이미드, 폴리(아크릴산) (PAA) 말레이미드, 폴리(스티렌 술포네이트) (PSS) 말레이미드, 폴리(아크릴산-stat-디메틸아미노에틸 메타크릴아미드) (P(AA-stat-DMAEMA)) 말레이미드), 및 폴리(아르기닌 메타크릴레이트) 말레이미드), 또는 그의 유도체; 말레이미드 함유 생체중합체, 예컨대, 젤라틴 말레이미드, 셀룰로스 말레이미드, 히알루론산 말레이미드 및 알기네이트 말레이미드; 및 말레이미드 함유 핵염기 중합체 (즉, 아데닌, 티민, 구아닌 및/또는 시토신 반복 단위의 말레이미드 함유 중합체); 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 말레이미드를 포함한다.
한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체는 젤라틴 말레이미드를 포함한다.
한 실시양태에서, 비스-티올 함유 가교제는 합성 중합체, 생체중합체, 소분자, 생체활성 분자, 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 합성 중합체는 PEG-비스-티올, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)-비스-티올 (NIPAAM-비스-티올), 폴리(아크릴산)-비스-티올, 폴리(메타크릴산)-비스-티올, 폴리(스티렌 술포네이트)-비스-티올, 폴리(아미드)-비스-티올, 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 비스-티올 함유 가교제는 PEG-비스-티올이다.
한 실시양태에서, 생체중합체는 티올-젤라틴, 티올-셀룰로스, 티올-키토산, 티올-히알루론산, 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 소분자는 디티오트레이톨 (DTT)이다.
한 실시양태에서, 생체활성 분자는 적어도 2개의 시스테인 아미노산 기를 갖는 단쇄 펩티드, 불활성 단쇄 펩티드, 효소 반응성 단쇄 펩티드, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 반응성 펩티드, 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 비스-티올 함유 생체활성 분자는 MMP-반응성 비스-시스테인 펩티드로부터 선택된다.
한 실시양태에서, MMP-반응성 펩티드는 GCIPVSLRSGCG, GCRDGPQGIWGQDRCG, GCRDPLGLDRCG, GCRDEAPLKQDRCG, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체는 PEG-말레이미드이고, 비스-티올 함유 가교제는 PEG-비스-티올, MMP-반응성 펩티드, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체는 RGD, YIGSR 및 IKVAV로부터 선택되는 적어도 하나의 생체활성 분자로 치환된 PEG-말레이미드이고, 비스-티올 함유 가교제는 PEG-비스-티올, MMP-반응성 펩티드, 또는 그의 조합으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, MMP-반응성 펩티드는 GCIPVSLRSGCG, GCRDPLGLDRCG, 또는 그의 조합이다.
한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체는 젤라틴 말레이미드이고, 비스-티올 함유 가교제는 PEG-비스-티올이다.
한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체는 젤라틴 말레이미드이고, 비스-티올 함유 가교제는 PEG-비스-티올이다.
한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체 대 비스-티올 함유 중합체의 몰비는 약 10:1 내지 약 1:10 범위이다. 말레이미드 함유 중합체(들) 중 말레이미드 기 대비 비스-티올 함유 가교제(들) 중 티올 기의 비는 약 60%를 초과할 수 있다.
히드로겔은 중합체 바이오 잉크 한 방울을 기판 상에 프린팅한 후에 활성화제 한 방울을 프린팅하여 히드로겔 액적을 형성하거나, 또는 활성화제 한 방울을 기판에 적용한 후에 중합체 바이오 잉크 한 방울을 적용하여 히드로겔을 형성함으로써 형성될 수 있다. 프린팅 단계를 반복하여 히드로겔을 형성한다. 프린팅 프로세스 동안, 세포는 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 둘 모두와 함께 포함될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 세포는 세포 배양 배지와 함께 포함될 수 있다. 세포 배양 배지는 중합체 바이오 잉크, 활성화제와 함께 포함될 수 있거나, 또는 중합체 바이오 잉크 및 활성화제로부터 분리되어 있을 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 중합체 바이오 잉크 및 활성화제로부터 형성되는 3D 프린팅된 히드로겔의 층 사이에 현탁될 수 있거나, 또는 히드로겔 표면 상에 증착될 수 있다.
한 실시양태에서, 기판은 임의의 적합한 베쓸로부터 선택된다. 예로는 상이한 웰 구성 (6, 24, 48 및 96-웰)의 마이크로타이터 플레이트, 상이한 웰 구성 (6, 24, 48 및 96-웰)의 커버슬립 바닥을 갖는 마이크로타이터 플레이트, 다양한 크기의 플루오로디쉬, 상이한 챔버 구성 (1, 2, 4, 8 및 16)의 챔버 슬라이드, 커버 슬립 또는 현미경 슬라이드를 포함한다. 베쓸은 세포를 함유, 수용 또는 성장시키는 데 적합할 수 있다.
한 실시양태에서, 3D 프린팅된 히드로겔은 생체활성 분자를 추가로 포함한다. 생체활성 분자는 말레이미드 함유 중합체, 비스-티올 함유 가교제, 또는 말레이미드 함유 중합체 및 비스-티올 함유 가교제 둘 모두에 결합될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 유리 생체활성 분자는 3D 프린팅된 히드로겔에 존재할 수 있다. 유리 생체활성 분자는 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 또는 둘 모두에 존재할 수 있다. 생체활성 분자는 펩티드, MMP-반응성 펩티드, 단백질, 다당류, 약물, 치료제, 항체, 소분자 억제제, 키나제 억제제, 포스파타제 억제제, 항원, 병원체, 혈소판, 성장 인자, 시토카인, 아미노산, 영양소, 조건화된 배지, 항생제, 항바이러스제, RNA, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 나노입자는 또한 3D 프린팅된 히드로겔 내로 혼입될 수 있다.
한 실시양태에서, 생체활성 분자는 CRGDS, CIKVAV, CYIGSR, C-말단 쌍을 이루지 않는 시스테인을 포함하는 VEGF, 단백질 (예컨대, 라미닌, 콜라겐), 및 MMP-반응성 펩티드 (예컨대, GCIPVSLRSGCG, GCRDGPQGIWGQDRCG, GCRDPLGLDRCG, GCRDEAPLKQDRCG); 및 그의 임의의 조합으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 3D 프린팅된 히드로겔은 세포 배양 배지를 추가로 포함한다. 적합한 배양 배지의 예로는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium: IMDM), 배지 199, 햄(Ham's) F10, 햄 F12, 맥코이(McCoy's) 5A 및 로스웰 메모리얼 파크 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute: RPMI) 배지를 포함한다. 세포 배양 배지는 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 또는 둘 모두에 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, 히드로겔은 세포를 함유한다.
한 실시양태에서, 세포는 세포를 함유하는 히드로겔의 프린팅을 허용하기 위해 3D 프린팅 이전에 중합체 바이오 잉크에, 활성화제에, 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 둘 모두에, 또는 별개의 배지에 존재한다.
한 실시양태에서, 세포는 히드로겔의 일부분 내에 현탁된다.
한 실시양태에서, 세포는 히드로겔 전반에 걸쳐 실질적으로 균일하게 현탁된다.
프린팅된 세포의 농도는 약 1 x 105 내지 약 5 x 108개 세포/mL 범위일 수 있다. 세포를 함유하는 프린팅된 히드로겔을 형성하기 위해 더 높거나, 또는 더 낮은 농도의 세포가 프린팅될 수 있음을 이해할 것이다.
한 실시양태에서, 세포는 간 세포, 위장 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 폐 세포, 기관 세포, 혈관 세포, 골격근 세포, 심장 세포, 피부 세포, 평활근 세포, 결합 조직 세포, 각막 세포, 비뇨생식기 세포, 유방 세포, 생식 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포, 신경 세포, 슈반(Schwann) 세포, 지방 세포, 골 세포, 골수 세포, 연골 세포, 혈관주위세포, 중피 세포, 내분비 조직 유래 세포, 기질 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 림프 세포, 혈액 세포, 내배엽 유래 세포, 외배엽 유래 세포, 및 중배엽 유래 세포, 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 세포는 암성 세포를 포함할 수 있다.
제2 측면에서, 본 기술은
말레이미드 함유 중합체를 포함하는 중합체 바이오 잉크를 제공하는 단계;
적어도 2개의 티올 관능기를 갖는 비스-티올 함유 가교제를 포함하는 활성화제를 제공하는 단계; 및
중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 프린팅하여 3D 프린팅된 히드로겔을 형성하는 단계를 포함하는, 3D 프린팅된 히드로겔을 제조하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 방법은 세포를 제공하여 세포를 함유하는 3D 프린팅된 히드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 세포는 3D 프린팅 전에 중합체 바이오 잉크에, 활성화제에, 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 둘 모두에, 또는 별개의 배지에 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, 3D 프린팅된 히드로겔은 중합체 바이오 잉크 및 활성화제의 프린팅으로부터 30분 이하, 또는 10분 이하, 또는 1분 이하, 또는 30초 이하, 또는 10초 이하, 또는 1초 이하 이내에 형성된다.
한 실시양태에서, 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 또는 둘 모두는 프린팅 전에 약 pH 7.4로 조정된다.
한 실시양태에서, pH는 NaOH를 사용하여 조정된다.
본 방법은 제1 측면에 따른 3D 프린팅된 히드로겔을 제조하는 데 사용될 수 있다.
제3 측면에서, 본 기술은
말레이미드 함유 중합체를 포함하는 중합체 바이오 잉크; 및
적어도 2개의 티올 관능기를 갖는 비스-티올 함유 가교제를 포함하는 활성화제를 포함하는 3D 프린팅용 키트를 제공한다.
한 실시양태에서, 키트는 세포를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 키트는 프린팅 기판을 추가로 포함한다.
제4 측면에서, 본 기술은 제1 측면에 따른 세포를 함유하는 3D 프린팅된 히드로겔을 포함하는 세포 어세이를 제공한다.
제5 측면에서, 본 기술은 세포 어세이를 위한 제1 측면에 따른 세포를 함유하는 3D 프린팅된 히드로겔의 용도를 제공한다.
정의
하기는 본 기술내용을 이해하는 데 도움이 될 수 있는, 관련 기술분야에 사용되는 용어에 관한 일부 정의이다. 이는 일반 정의로 의도되며, 본 발명의 범주는 어느 방식으로든 상기 용어 단독으로만 제한되지 않아야 하며, 하기 기술내용을 더욱 잘 이해할 수 있도록 제시된다.
문맥상 달리 요구되지 않거나, 또는 구체적으로 반대로 언급되지 않는다면, 본원에서 단수의 정수, 단계, 또는 요소로서 언급된 본 발명의 정수, 단계, 요소는 단수 및 복수 형태의 언급된 정수, 단계 또는 요소 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "약"이라는 용어는 언급된 값의 ±10%를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "가교제" 및 "가교제"라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 말레이미드 함유 중합체를 공유적으로 가교시킬 수 있는 화학적 화합물을 의미한다. 본원에서 "비스-티올 함유 가교제" 또는 "비스-티올 함유 가교제"로서 지칭되는 본 기술의 가교제는 적어도 2개의 티올 관능기를 포함한다. 비스-티올 함유 가교제는 2개 초과의 티올 관능기, 예컨대, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 티올 관능기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "중합체 바이오 잉크"라는 용어는 말레이미드 함유 중합체, 또는 2개 이상의 말레이미드 함유 중합체의 조합을 포함하는 용액, 바람직하게, 수용액을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "활성화제"라는 용어는 적어도 하나의 비스-티올 함유 가교제를 포함하는 용액, 바람직하게, 수용액을 지칭한다. 본 기술의 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 혼합시, 즉, 3D 프린팅 동안, 티올-말레이미드 가교 반응이 발생하고, 이에 의해 히드로겔이 형성된다.
본원에서 사용되는 바, 물질과 관련하여 "생체적합성"이라는 용어는 물질이 살아있는 세포 또는 조직에 대해 실질적으로 비독성이라는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "생체활성 분자"라는 용어는 배양된 세포와 함께 사용될 수 있는, 생물학적 활성을 갖는 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "세포 중합체 바이오 잉크"라는 용어는 적어도 하나의 말레이미드 함유 중합체를 포함하는 중합체 바이오 잉크와 혼합된 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "세포 활성화제"라는 용어는 적어도 하나의 비스-티올 함유 가교제를 포함하는 활성화제와 혼합된 세포를 지칭한다. 본 기술의 세포 중합체 바이오 잉크 및 세포 활성화제는 세포가 3D 바이오프린팅 프로세스 전 기간 동안 현탁되고, 현탁된 상태 그대로 유지될 수 있는, 하나 이상의 생체활성 분자 유형으로 이루어진 수용액일 수 있다.
"세포 배양 배지"라는 용어는 세포를 보관, 유지, 성장 또는 배양하는 데 사용될 수 있는 액체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 3D 바이오프린팅과 관련하여 "드롭-온-디맨드"라는 용어는 바이오 잉크의 전달이 이산 액적 생성에 기초하는 것인 프린팅 프로세스를 지칭한다. 드롭-온-디맨드 바이오프린팅은 열 잉크젯, 피에조 잉크젯 및 마이크로밸브 기반 바이오프린팅을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서의 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐 값의 범위로 제공되는 경우, 언급된 범위는 상기 범위 내의 임의의 값을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 포함된 문헌, 조치, 물질, 장치, 논문 등에 관한 임의의 논의는 단지 본 발명에 대한 맥락을 제공하고자 하는 것이다. 이러한 사안들 중 임의의 것 또는 그들 모두, 그가 본 명세서의 각 청구항의 우선일 이전에 존재하였기 때문에 선행 기술 기반의 일부를 형성하거나, 또는 본 발명의 관련 기술분야에서 일반적인 일반 지식인 것으로 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다"라는 단어, 또는 예컨대, "포함한다" 또는 "포함하는"이라는 파생어는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제하지는 않는 것으로 이해된다.
"~으로 이루어진"이라는 용어는 "오직 ~으로만 이루어진"이라는 것, 즉, 언급된 요소(들), 정수(들) 또는 단계(들)를 포함하고, 이에 제한되고, 임의의 다른 요소(들), 정수(들) 또는 단계(들)를 배제한다는 것을 의미한다. "본질적으로 "~으로 이루어진"이라는 용어는 언급된 요소(들), 정수(들) 또는 단계(들)를 포함하고, 본 발명의 작동은 크게 변경시키지 않거나, 또는 그에 기여하지 않는 다른 요소(들), 정수(들) 또는 단계(들) 또한 포함될 수 있음을 의미한다.
본 기술을 더욱 명확하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 바람직한 실시양태는 하기 도면 및 실시예를 참조로 하여 기술될 것이다.
도 1은 3D 바이오프린팅 프로세스의 대표적인 개략도이다.
도 2는 CRGDS에 의한 4-아암 PEG-Mal의 변형의 (a) UV 분석; 및 (b) 1H NMR에 의한 CRGDS 접합 분석의 정량화를 보여주는 것이다.
도 3은 2.5 mM RGD를 갖는 4-아암 PEG-Mal 히드로겔 (10 wt%)로부터 제조되고, PEG-비스-티올 및 MMP-2 반응성 비스-시스테인 펩티드 (50:50 티올 몰 농도로 혼합)와 가교된 히드로겔에 대한 (a) 주파수; (b) 변형률; (c) 강성; 및 (d) 점도 레올로지 연구 결과를 보여주는 것이다.
도 4는 (a) PEG-비스-티올과 가교된 7.5 wt% 블랭크 4-아암 PEG-Mal 히드로겔 및 (b) MMP-반응성, 비스-시스테인 펩티드 활성화제와 가교된 PEG-트리펩티드 히드로겔의 강성 레올로지 연구 결과를 보여주는 것이다.
본 기술은 3D 프린팅된 히드로겔에 관한 것이다. 3D 프린팅된 히드로겔은 장기간 동안 세포 생존율을 지원할 수 있다. 본 기술의 히드로겔은, 생체적합성이고, 프린팅시 히드로겔을 신속하게 형성하여 3D 세포 구조체 및 어세이의 고처리량 생산을 허용하는 중합체 바이오 잉크 및 활성화제의 3D 프린팅에 의해 제조된다.
특히, 본 발명자들은 비스-티올 함유 가교제를 이용하여 공유적으로 가교된 말레이미드 함유 중합체는, 어떠한 공반응물의 도움 없이 생리적 조건하에서 생체적합성 가교 경로를 통해 균일한 히드로겔의 신속한 형성을 허용하고, 어떠한 독성 부산물도 생성하지 않는다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 본 기술의 3D 프린팅된 히드로겔은 말레이미드 함유 중합체를 포함하는 중합체 바이오 잉크와 적어도 2개의 티올 관능기를 갖는 비스-티올 함유 가교제를 포함하는 활성화제의 조합에 의해 형성된다.
중합체 바이오 잉크
본 기술의 중합체 바이오 잉크는 말레이미드 함유 중합체, 또는 2개 이상의 말레이미드 함유 중합체의 조합을 포함한다. 말레이미드 함유 중합체(들)는 히드로겔을 형성하는 말레이미드 반응성 기를 함유하는 임의의 중합체(들)일 수 있다. 유리 말레이미드 기를 함유하는 중합체(들) 또한 히드로겔에 존재할 수 있다.
다양한 분자 질량, 분자 구조, 분자 분포 및 관능기를 갖는 말레이미드 함유 중합체가 중합체 바이오 잉크에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 말레이미드 함유 중합체(들)의 분자 질량은 약 1 kDa 내지 약 10,000 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 10,000 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 5,000 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 1,000 kDa, 또는 약 10 kDa 내지 약 1,000 kDa, 또는 약 20 kDa 내지 약 1,000 kDa, 또는 약 10 kDa 내지 약 500 kDa 범위일 수 있다. 말레이미드 함유 중합체(들)는 예를 들어, 그 중에서도 특히 선형, 블록형, 분지형, 별모양, 고리형, 빗형(comb), 또는 브러쉬형(brush) 중합체(들), 또는 그의 임의의 조합과 같이, 임의의 적합한 분자 구조를 가질 수 있다. 중합체 백본을 따라 진행되는 단량체 단위의 분포를 지칭하는 분자 분포는 그 중에서도 특히 호모, 블록, 통계적, 랜덤, 또는 멀티-블록 분포, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 관능기 (즉, 단량체 유형)는 그 중에서도 특히 히드록실, 아민, 티올 카르복실산, 알켄, 알킨 및 다중-원 탄소 고리를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 중합체는 1개의 관능기, 또는 2개 이상의 관능기 (즉, 공중합체)를 함유할 수 있다.
한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체는 생체적합성이다.
말레이미드 함유 중합체(들)는 2개 이상의 말레이미드 반응성 기를 중합체 내로 혼입시킴으로써 합성에 의해 제조된다. 2개 이상의 말레이미드 기는 예를 들어, 카르보디이미드 커플링, 스테글리치(Steglich) 에스테르화 및 과량의 비스-말레이미드 분자와의 티올-말레이미드 커플링과 같은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 중합체(들) 내로 혼입될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 상업적으로 이용가능한 말레이미드 함유 중합체(들)가 사용될 수 있다.
본 기술의 중합체 바이오 잉크에서 사용하는 데 적합한 말레이미드 함유 중합체의 비제한적인 예로는 말레이미드 함유 다당류, 예컨대, 프럭토스, 수크로스 또는 글루코스 단량체를 함유하는 중합체; 합성 중합체, 예컨대, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 말레이미드, 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트 (PHEMA) 말레이미드, 폴리(ε-카프로락톤) (PCL) 말레이미드, 폴리(비닐 알콜) (PVA) 말레이미드, 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 말레이미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (NIPAAM) 말레이미드, 폴리(프로필렌 푸마레이트) (PPF) 말레이미드, 폴리(에틸렌이민) (PEI) 말레이미드, 폴리(3-메타크릴아미도프로필) 트리메틸암모늄 (PMAETMA) 말레이미드, 폴리(L-리신) (PLL) 말레이미드), 폴리(아크릴산) (PAA) 말레이미드, 폴리(스티렌 술포네이트) (PSS) 말레이미드), 폴리(아크릴산-stat-디메틸아미노에틸 메타크릴아미드) (P(AA-stat-DMAEMA)) 말레이미드, 및 폴리(아르기닌 메타크릴레이트) 말레이미드, 또는 그의 유도체; 말레이미드 함유 생체중합체, 예컨대, 젤라틴 말레이미드, 셀룰로스 말레이미드, 히알루론산 말레이미드 및 알기네이트 말레이미드; 및 말레이미드 함유 핵염기 중합체 (즉, 아데닌, 티민, 구아닌 및/또는 시토신 반복 단위의 말레이미드 함유 중합체); 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
PEG는 상업적으로 이용가능하고, 불활성이며, 생물학적 적용에서 비독성이고, 다양한 화학적 변형에 대하여 다용도로 이용될 수 있기 때문에, ECM 모방체로서 합성 히드로겔을 제조하는 데 있어 특히 관심을 끄는 물질이다. 추가로, PEG-기반 중합체 바이오 잉크는 PEG 중합체 전구체의 분자량이 낮기 때문에, 낮은 상대 점도를 가질 수 있고, 이러한 이유에서 드롭-온-디맨드 바이오프린팅에 특히 적합하다. 따라서, 한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체는 적어도 2개의 말레이미드 반응성 기를 함유하는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 중합체 (PEG-말레이미드)이다. PEG-말레이미드는 3-아암 PEG-말레이미드, 4-아암 PEG-말레이미드, PEG와 적어도 2개의 말레이미드 기의 블록-공중합체, 또는 그의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 적합한 분자 구조를 가질 수 있다. PEG 기는 임의의 적합한 분자량을 가질 수 있다. 예를 들어, PEG 기의 분자 질량은 약 1 kDa 내지 약 50 kDa, 또는 약 1 kDa 내지 약 40 kDa, 또는 약 1 kDa 내지 약 30 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 30 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 20 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa, 또는 약 10 kDa 내지 약 20 kDa 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, PEG 기의 분자 질량은 약 5 kDa, 또는 약 10 kDa, 또는 약 20 kDa이다.
"3-아암 PEG-말레이미드"라는 용어는 하기 구조를 갖는 중합체 화합물을 지칭한다 (n = 38-3,788):
Figure pct00001
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"4-아암 PEG-말레이미드"라는 용어는 하기 구조를 갖는 중합체 화합물을 지칭한다 (n = 28-2,841):
Figure pct00002
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말레이미드 함유 중합체의 특성은 말레이미드 기(들)를 하나 이상의 관능기 또는 다른 모이어티로 부분적으로 변형시킴으로써 특정 적용을 위해 적합화될 수 있다. 부분적인 변형이란, 비스-티올 함유 가교제와의 가교를 위해 적어도 하나, 바람직하게, 적어도 2개의 말레이미드 기가 무손상인 상태 그대로 유지되는 것을 의미한다. 따라서, 생체활성 분자를 말레이미드 함유 중합체 내로 혼입시키고자 하는 경우, 말레이미드 함유 중합체는 적어도 2개, 전형적으로, 적어도 3개의 말레이미드 기를 함유한다. 이러한 접근법을 통해 중합체의 재현성 및 모듈성은 유지될 수 있고, 동시에, 관련된 생물학적 특징은 3D 프린팅된 히드로겔 내로 도입될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체의 말레이미드 기는 하나 이상의 생체활성 분자로 부분적으로 변형될 수 있다.
본 기술의 중합체 바이오 잉크는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 제제 중 말레이미드 함유 중합체를 포함하는 수용액으로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 중합체 바이오 잉크는 적어도 하나의 말레이미드 함유 중합체 및 임의적으로, 하나 이상의 생체활성 분자를 포함하는 수성 제제로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 수성 제제는 pH 완충처리된 용액 또는 세포 배양 배지 중 말레이미드 함유 중합체를 포함하는 용액일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체 바이오 잉크는 임의의 비로, 예를 들어, 약 10:1 내지 약 1:10, 예컨대, 약 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10의 비로 2개의 말레이미드 함유 중합체를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 중합체 바이오 잉크는 말레이미드 함유 중합체를 포함하는 수용액 형태로 제공된다. 전형적으로, 중합체 바이오 잉크는 용액 중에, 바람직하게, 세포 배양 배지 중에 말레이미드 함유 중합체를 용해시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 중합체 바이오 잉크는 2개 이상의 말레이미드 함유 중합체의 혼합물을 포함할 수 있다. 중합체 바이오 잉크는 용액 중 임의의 적합한 농도의 말레이미드 함유 중합체(들)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 중합체 바이오 잉크 용액 중 말레이미드 함유 중합체(들)의 농도는 약 1 wt% 내지 50 wt%, 또는 약 1% to 40 wt%, 또는 약 1 wt% 내지 30 wt%, 약 5 wt% 내지 20 wt%, 약 5 wt% 내지 15 wt%, 또는 약 10 wt% 내지 20 wt% 범위일 수 있다. 중합체 바이오 잉크는 말레이미드 함유 중합체에 공유적으로 결합된 하나 이상의 생체활성 분자를 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 중합체 바이오 잉크는 용액 중 하나 이상의 유리 생체활성 분자를 포함할 수 있다. 중합체 바이오 잉크 중 생체활성 분자(들)의 농도는 약 0.1 mM 내지 10 mM, 약 0.5 mM 내지 10 mM, 약 1 mM 내지 10 mM, 약 1 mM 내지 5 mM, 약 2 mM 내지 5 mM 또는 약 2 mM 내지 3 mM 범위일 수 있다.
한 실시양태에서, 중합체 바이오 잉크는 멸균 용액으로서 제조된다. 멸균 용액을 제조하는 데 적합한 방법, 또는 중합체 바이오 잉크 용액을 멸균시키는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
한 실시양태에서, 중합체 바이오 잉크는 생체적합성이다.
활성화제
본 기술의 활성화제는 비스-티올 함유 가교제를 포함한다. 비스-티올 함유 가교제는 본원에서 비스-티올로서 지칭되는 적어도 2개의 티올 기를 함유하는 임의의 화합물일 수 있다. 바람직하게, 티올 기는 말단 티올 기이다.
한 실시양태에서, 비스-티올 함유 가교제는 생체적합성이다.
한 실시양태에서, 비스-티올 함유 가교제는 비스-티올 함유 중합체, 바람직하게, 말단 비스-티올 함유 합성 중합체일 수 있다. 적합한 비스-티올 함유 합성 중합체는 PEG-비스-티올, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)-비스-티올 (NIPAAM-비스-티올), 폴리(아크릴산)-비스-티올, 폴리(메타크릴산)-비스-티올, 폴리(스티렌 술포네이트)-비스-티올, 폴리(아미드)-비스-티올, 또는 그의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 비스-티올 함유 가교제는 비스-티올 함유 생체중합체, 바람직하게, 말단 비스-티올 함유 생체중합체일 수 있다. 적합한 비스-티올 함유 생체중합체는 (예컨대, 소, 돼지, 및 냉온 어류 기원의) 티올-젤라틴, (예컨대, 스트렙토코쿠스 에쿠이(streptococcus equi), 소 및 인간 제대로부터의) 티올-히알루론산, 또는 그의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 비스-티올 함유 가교제는 PEG-비스-티올이다. PEG-비스-티올은 그 중에서도 특히 선형, 분지형, 및 별모양 PEG 구조를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 분자 구조를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, PEG-비스-티올은 선형 PEG-비스-티올이다. PEG 기의 분자 질량은 달라질 수 있고, 예를 들어, PEG 기의 분자 질량은 약 1 kDa 내지 약 50 kDa, 또는 약 1 kDa 내지 약 40 kDa, 또는 약 1 kDa 내지 약 30 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 30 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 20 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa, 또는 약 10 kDa 내지 약 20 kDa 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, PEG 기의 분자 질량은 약 5 kDa, 또는 10 약 kDa, 또는 약 20 kDa이다.
선형 PEG-비스-티올의 한 예는 하기 구조를 갖는다 (n = 11-1,136):
Figure pct00003
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일부 실시양태에서, 비스-티올 함유 가교제는 비스-티올 함유 소분자일 수 있다. 적합한 비스-티올 함유 분자는 (붕산나트륨 또는 붕사와 함께 사용되거나, 또는 그를 사용하지 않고 사용되는) 디티오트레이톨 (DTT), 또는 그의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 비스-티올 함유 가교제는 적어도 2개의 시스테인 아미노산 기, 바람직하게, 말단 시스테인 기 (즉, 티올 플랭킹된 아미노산 서열)를 포함하는 비스-티올 함유 단쇄 펩티드일 수 있다. 2개의 시스테인 아미노산 기와 플랭킹된 적합한 비스-티올 함유 단쇄 펩티드는 불활성 단쇄 펩티드 서열, 효소 반응성 단쇄 펩티드 (예컨대, MMP-반응성, 세린 반응성, 시스테인 반응성, 아스파르틱 반응성, 글루타믹 반응성, 카스파제 반응성 또는 트립신 반응성 펩티드 서열), 또는 그의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 비스-티올 함유 가교제는 비스-티올 함유 생체활성 분자이다. 예를 들어, 비스-티올 함유 단쇄 펩티드는 MMP-반응성 비스-시스테인 펩티드일 수 있다. 예를 들어, MMP-반응성 펩티드는 MMP-2 반응성 비스-시스테인 펩티드 (예컨대, GCIPVSLRSGCG), MMP-1, -2, -3, -7, -8 및 -9 반응성 비스-시스테인 펩티드 (예컨대, GCRDGPQGIWGQDRCG), MMP-15 반응성 티올화된 펩티드 (예컨대 GCRDEAPLKQDRCG) 또는 MMP-1, -2, -3, -7, -8, -9, -12, -13 및 -14 반응성 비스-시스테인 펩티드 (예컨대, GCRDPLGLDRCG)일 수 있다.
활성화제는 임의의 비로 2개 이상의 비스-티올 함유 가교제 유형으로 이루어진 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성화제는 약 10:1 내지 약 1:10, 예컨대, 약 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10의 비로 2개의 비스-티올 함유 가교제 유형의 조합을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 활성화제는 비스-티올 함유 가교제를 포함하는 수용액 형태일 수 있다. 수용액은 세포 배양 배지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화제는 2개 이상의 비스-티올 함유 가교제의 혼합물을 포함할 수 있다. 활성화제는 용액 중 임의의 적합한 농도의 비스-티올 함유 가교제(들)를 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 활성화제 중 비스-티올 함유 가교제(들)의 농도는 보완 중합체 바이오 잉크 중 말레이미드 함유 중합체(들) 농도 이하이다. 말레이미드 함유 중합체(들) 대 비스-티올 함유 가교제(들)의 몰비는 약 10:1 내지 1:1, 약 9:1 내지 1:1, 약 8:1 내지 1:1, 약 7:1 내지 1:1, 약 6:1 내지 1:1, 약 5:1 내지 1:1, 약 4:1 내지 1:1, 약 3:1 내지 1:1, 또는 약 2:1 내지 1:1 범위일 수 있다. 비스-티올 함유 가교제는 생체활성 분자를 포함할 수 있거나, 또는 그에 공유적으로 결합된 하나 이상의 생체활성 분자를 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 활성화제는 용액 중 하나 이상의 유리 생체활성 분자를 포함할 수 있다. 활성화제 중 생체활성 분자(들)의 농도는 약 0.1 mM 내지 10 mM, 약 0.5 mM 내지 10 mM, 약 1 mM 내지 10 mM, 약 1 mM 내지 5 mM, 약 2 mM 내지 5 mM 또는 약 2 mM 내지 3 mM 범위일 수 있다.
한 실시양태에서, 활성화제는 멸균 용액이다. 멸균 용액을 제조하는 데 적합한 방법, 또는 활성화제 용액을 멸균시키는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
활성화제의 제제는 중합체 바이오 잉크의 제제와 동일한 것일 수 있거나, 또는 상이할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 위해 사용되는 제제는 동일한 것이다.
한 실시양태에서, 활성화제는 생체적합성이다.
3D 프린팅된 히드로겔
본 기술의 3D 프린팅된 히드로겔은 비스-티올 함유 가교제를 이용하여 가교된 말레이미드 함유 중합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 3D 프린팅된 히드로겔은 세포를 함유한다.
한 실시양태에서, 3D 프린팅된 히드로겔은 말레이미드 함유 중합체를 포함하는 중합체 바이오 잉크 및 비스-티올 함유 가교제를 포함하는 활성화제의 3D 프린팅에 의해 제조된다.
3D 바이오프린팅에 사용하기에 적합하도록 만들기 위해서는 히드로겔 형성은 신속하게 진행되어야 한다. 그러나, 선행 기술에서 사용된 히드로겔의 신속한 형성은 전형적으로 불규칙적인 히드로겔의 형성을 초래한다. 3D 바이오프린팅에서 균일한 겔을 가교시키고, 생성하는 속도를 제어하는 현행 접근법은 외부 구동력, 예컨대, UV 조사 및 공반응물 또는 촉매 사용을 포함한다. 상기 외부 구동인자는 히드로겔 형성에는 참여하는 것이 아니라, 오히려 히드로겔 형성을 지원하며, 히드로겔에 캡슐화된 세포의 세포 및 생물학적 특징에 영향을 줄 수 있다. 특히, UV 조사 사용을 포함하는 광화학적 가교 반응은, 히드로겔 중 세포와 상호작용하지 않도록 하기 위해서는 생성물로부터 제거되어야 하는 유리 라디칼 공급원 사용을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 세포를 지지할 수 있는 균일한 히드로겔을 높은 밀도 및 생존율로 신속하게 형성하는 것은 말레이미드 함유 중합체를 비스-티올 함유 가교제와 반응시킴으로써 달성될 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 말레이미드 기는 생리적 조건하에서 티올과 신속하게 및 자발적으로 반응한다. 본 반응은 어떠한 외부 구동력도 요구하지 않는 바, 잠재적으로 세포독성인 공반응물, 라디칼 개시인자 또는 UV 조사가 필요 없기 때문에, 시험관내 어세이의 3D 바이오프린팅에서의 사용에 특히 관심의 대상이 된다. 추가로, 원치않거나, 또는 세포독성인 부산물이 생산되지 않고, 이에 의해 원치않는 부산물의 생산 없이 세포의 계내 프린팅이 이루어질 수 있다.
비스-티올 함유 가교제를 이용한 말레이미드 함유 중합체 사이의 가교 반응은 활성화제와 중합체 바이오 잉크의 접촉시에 신속하게 일어나며, 이에 의해 3D 프린팅된 히드로겔이 신속하게 형성된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 히드로겔은 중합체 바이오 잉크 및 활성화제의 프린팅으로부터 30분 이하 이내에 형성된다. 예를 들어, 히드로겔은 중합체 바이오 잉크 및 활성화제의 프린팅으로부터 30분 이하, 또는 20분 이하, 또는 10분 이하, 또는 1분 이하, 또는 30초 이하, 또는 10초 이하, 또는 1초 이하 이내에 형성될 수 있다. 다양한 인자, 예컨대, 그 중에서도 특히, 크기, 형상, 조성이 3D 프린팅된 히드로겔 형성 속도에 영향을 줄 수 있다.
말레이미드 함유 중합체와 비스-티올 함유 가교제 사이의 예시적인 반응은 하기 반응식 1에 도시되어 있다. 본 반응은 비스-티올 함유 가교제 (1) 상의 티올 기의 말레이미드 함유 중합체 (2) 상의 말레이미드 모이어티의 알켄 관능기와의 친핵성 (마이클(Michael)) 부가를 통해 수성 조건하에서 (예컨대, 세포 배양 배지 중에서) 3-치환된 숙신이미드 기를 생성하는 것을 포함한다. 본 반응은 잠재적으로 세포독성인 공반응물, 라디칼 개시인자 또는 UV 조사가 필요 없기 때문에, 시험관내 어세이의 3D 바이오프린팅에서에 특히 유용하다. 추가로, 공유적 가교는 생리적 조건하에서 (예컨대, pH 약 6.5-7.5, 바람직하게 pH 7.4에서) 말레이미드 함유 중합체 및 비스-티올 가교제 혼합시 신속하게 및 자발적으로 일어남으로써 가교된 중합체 (3)가 생성된다.
Figure pct00004
반응식 1
한 실시양태에서, 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 또는 둘 모두의 pH는 3D 프린팅 이전에 적합한 염기의 사용으로 생리적 pH (예컨대, 약 6.5-7.5, 바람직하게 약 pH 7.4)로 조정될 수 있다. 적합한 염기는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
한 실시양태에서, 염기는 NaOH이다.
본 발명자들은 중합체 바이오 잉크, 활성화제의 pH를 조정하기 위해 NaOH를 사용하는 것이 3D 프린팅 동안의 겔화를 가속화시킬 수 있고, 이에 의해 3D 프린팅된 히드로겔이 신속하게 (예컨대, 약 1초 미만의 기간 이내에) 형성될 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 추가로, 본 발명자들은 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 또는 둘 모두 그 중의 NaOH 존재가 세포 응집을 감소시킬 수 있고, 작은 노즐 오리피스를 통한 3D 프린팅을 위해 고농도의 세포가 용액 중에 분산되어 있을 수 있다는 것도 발견하게 되었다.
한 실시양태에서, 말레이미드 함유 중합체의 몰비는 비스-티올 함유 가교제보다 크고, 이에 의해 비스-티올 함유 가교제가 소비된다. 생성된 히드로겔은 임의의 추가의 원치않는 부산물 없이, 가교된 생성물 및 과량의 말레이미드 함유 중합체 (존재할 경우)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 말레이미드 함유 중합체(들) 대 비스-티올 함유 가교제(들)의 몰비는 약 10:1 내지 2:1, 약 9:1 내지 2:1, 약 8:1 내지 2:1, 약 7:1 내지 2:1, 약 6:1 내지 2:1, 약 5:1 내지 2:1, 약 4:1 내지 2:1, 약 3:1 내지 2:1 범위일 수 있다.
바람직하게, 히드로겔 형성을 위해, 비스-티올 함유 가교제(들) 중 티올 기의 개수는 말레이미드 함유 중합체(들) 중 말레이미드 기 개수 대비 약 60% 초과이다. 예를 들어, 말레이미드 함유 중합체(들) 중 말레이미드 기 대비 비스-티올 함유 가교제(들) 중 티올 기의 개수는 약 60%, 또는 70%, 또는 80%, 또는 90%, 또는 100%, 또는 200% 또는 그 초과일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비스-티올 함유 가교제(들) 중 티올 기의 개수는 말레이미드 함유 중합체(들) 중 말레이미드 기의 개수는 동일하다 (즉, 그 대비 100%이다).
본원에 개시된 중합체 바이오 잉크 및 활성화제가 다량의 어세이를 생성하는 데 사용될 수 있는 바, 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 제조에 사용되는 물질은 바람직하게 쉽게 벌크로 상업적으로 이용가능하거나, 또는 상기 상업적으로 이용가능한 물질로부터 쉽게 제조된다.
본 기술의 3D 프린팅된 히드로겔을 제조하는 전형적인 방법은
말레이미드 함유 중합체를 포함하는 중합체 바이오 잉크를 제공하는 단계;
비스-티올 함유 가교제를 포함하는 활성화제를 제공하는 단계; 및
3D 중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 프린팅하여 3D 프린팅된 히드로겔을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 방법은 세포를 제공하는 단계를 추가로 포함하고, 이에 의해 중합체 바이오 잉크, 활성화제 및 세포의 3D 프린팅은 세포를 함유하는, 3D 프린팅된 히드로겔을 형성한다.
한 실시양태에서, 세포는 히드로겔 중에 현탁된다. 세포는 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 또는 둘 모두에, 또는 또 다른 배지 중에 제공될 수 있다. 세포는 히드로겔의 일부에 (또는 다중의 일부에) 현탁될 수 있거나, 또는 히드로겔 전반에 걸쳐 실질적으로 균일하게 현탁될 수 있다.
한 실시양태에서, 세포는 세포 배양 배지 중에 제공된다. 세포 배양 배지는 중합체 바이오 잉크, 활성화제 내에 포함될 수 있거나, 또는 중합체 바이오 잉크 및 활성화제로부터 별개로 제공될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 중합체 바이오 잉크 및 활성화제로부터 형성된 3D 프린팅된 히드로겔 층 사이에 현탁될 수 있거나, 또는 히드로겔 표면 상에 증착될 수 있다.
한 실시양태에서, 3D 프린팅된 히드로겔은 생체활성 분자를 추가로 함유한다. 생체활성 분자는 중합체 바이오 잉크 또는 활성화제, 또는 둘 모두 중에 제공될 수 있다. 생체활성 분자는 중합체 바이오 잉크 또는 활성화제, 또는 둘 모두에 자유롭게 현탁될 수 있거나, 또는 말레이미드 함유 중합체 및/또는 비스-티올 함유 가교제에 결합되어 있을 수 있다.
한 실시양태에서, 3D 프린팅 프로세스는 실질적으로 멸균 환경에서 수행된다.
생체활성 분자
본 기술의 3D 프린팅된 히드로겔은 특정의 생물학적 특징을 도입하기 위해 하나 이상의 생체활성 분자에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 3D 프린팅된 히드로겔의 생물학적 특징은 그 중에서도 특히 단백질, 펩티드 (예컨대, MMP-반응성 펩티드), 화학유인물질, 성장 인자, 유기 염료, 형광성 염료, 약물, 치료제, 항체, 소분자 억제제, 키나제 억제제, 포스파타제 억제제, 항원, 병원체, 혈소판, 시토카인, 영양소 (예컨대, 단당류 및 다당류), 조건화된 배지, 항생제, 항바이러스제, RNA 및 관련 변이체 (예컨대, siRNA, mRNA)를 혼입시킴으로써 변형될 수 있다. 하나 이상의 생체활성 분자는 말레이미드 함유 중합체, 비스-티올 함유 가교제, 또는 그의 임의의 조합에의 공유 결합에 의해 3D 프린팅된 히드로겔 내로 혼입될 수 있다. 나노입자 또한 3D 프린팅된 히드로겔 내로 혼입될 수 있다.
한 실시양태에서 생체활성 분자는 단쇄 펩티드 (예컨대, N 또는 C 말단 상에 시스테인 (C) 아미노산을 함유하는 Arg-Gly-Asp (RGD)), 성장 인자 (예컨대, VEGF), 단백질 (예컨대, 라미닌, 콜라겐), 또는 화학유인물질 (예컨대, 기질 세포-유래 인자-1 (CXCL12)), 또는 그의 임의의 조합이다. 다른 적합한 생체활성 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 생체활성 분자는 유리 생체활성 분자(들)를 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 또는 둘 모두 내로 혼입시킴으로써 3D 프린팅된 히드로겔 내로 혼입될 수 있다. 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 또는 둘 모두 세포 배양 배지를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 생체활성 분자는 말레이미드 함유 중합체에 결합될 수 있다. 생체활성 분자는 말레이미드 기와 생체활성 분자와 반응하여 공유 결합을 형성함으로써 말레이미드 함유 중합체 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 공유 결합은 (예컨대, 수성 매질 중) 티올 및 비닐-함유 생체활성 분자 사이의 마이클 유형 부가 반응, 아미노 및 알데히드 기 사이의 쉬프(Schiff) 염기 반응, 딜스-알더(Diels-Alder) 반응, 클릭 화학법, 활성 에스테르 기로의 아미노 분해 반응, 또는 효소 가교에 의해 형성될 수 있다. 티올 모이어티는 다수의 생체활성 분자에 풍부하고, 따라서, 생체활성 분자의 말레이미드 함유 중합체 내로의 혼입은 티올 기의 말레이미드 기의 알켄 모이어티로의 친핵성 (마이클) 부가를 통해 3-치환된 숙신이미드 모이어티 생성에 의해 발생할 수 있다. 사용되는 조건 및 반응물의 몰비에 따라, 생성된 화합물에서 적어도 하나의 말레이미드 기는 3-치환된 숙신이미드 기를 보유하는 생체활성 분자로 전환되고, 이에 의해 적어도 하나의, 바람직하게 적어도 2개의, 말레이미드 기는 무손상인 상태 그대로 유지될 것이다. 통상의 기술자는 적어도 하나, 또는 적어도 2개 또는 그 초과의 말레이미드 기가 무손상인 상태 그대로 유지될 수 있도록 반응을 제어하는 데 적절한 조건 (예컨대, 반응물의 몰비)을 결정할 수 있을 것이다.
티올 함유 생체활성 분자를 말레이미드 함유 중합체 내로 혼입시키기 위한 전형적인 프로세스에서, 생체활성 분자 및 말레이미드 함유 중합체는 말레이미드 함유 중합체가 생체활성 분자의 것을 초과하는 몰비로 (예컨대, 3:1, 또는 4:1, 또는 5:1) 수용액 (예컨대, 완충제 또는 세포 배양 배지) 중에서 실온에서 혼합된다. 예를 들어, 엘만(Ellman) 어세이를 통해 반응 완료를 모니터링할 수 있고, 이에 의해 유리 티올 기가 계속 남아있지 않음을 확인할 수 있다. 전형적인 반응 시간은 약 30분이다. 반응 완료 후, 필요할 경우, 적합한 염기 (예컨대, NaOH)를 첨가하여 용액의 pH를 생리적 pH (약 7.4)로 조정할 수 있다. pH를 생리적 pH로 조정하는 데 적합한 염기는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 생성된 변형된 말레이미드 함유 중합체 용액은 단리 또는 정제할 필요 없이 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 생체분자-함유 중합체 바이오 잉크 또는 활성화제 용액의 pH는 NaOH 사용으로 생리적 pH (예컨대, 약 6.5-7.5, 바람직하게, pH 7.4)로 조정된다. 중합체 바이오 잉크 또는 활성화제의 pH를 조정하기 위해 NaOH를 사용함에 따라 후속 3D 프린팅 동안 중합화는 신속하게 진행될 수 있고, 이에 의해 (예컨대, 1초 미만으로) 히드로겔 형성이 가속화될 수 있다. 추가로, NaOH 사용이 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 또는 둘 모두 중의 세포 응집을 감소시킬 수 있고, 이에 의해 작은 노즐 오리피스를 통한 3D 프린팅을 위해 고농도의 세포가 용액 중에 분산되어 있을 수 있다.
RGD로 부분적으로 변형된 4-아암 PEG-말레이미드의 한 예 (4-아암 PEG-말레이미드-RGD)는 4-아암 PEG-말레이미드와 CRGDS를 4:1 몰비로 반응시킴으로써 제조된, 하기 구조를 갖는다 (n = 28-2,841):
Figure pct00005
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VEGF로 부분적으로 변형된 4-아암 PEG-말레이미드의 한 예 (4-아암 PEG-말레이미드-VEGF)는 4-아암 PEG-말레이미드와 VEGF를 4:1 몰비로 반응시킴으로써 제조된, 하기 구조를 갖는다 (n = 28-2,841):
Figure pct00006
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일부 실시양태에서, 생체활성 분자, 예컨대, CRGDS, CIKVAV, C-말단 쌍을 이루지 않는 시스테인을 포함하는 VEGF 및/또는 MMP-반응성 펩티드 (예컨대, GCIPVSLRSGCG, GCRDGPQGIWGQDRCG, GCRDPLGLDRCG 또는 GCRDEAPLKQDRCG)가 3D 프린팅된 히드로겔 내로 혼입되어 생물학적 기능이 도입된다. 예를 들어, 세포 부착은 CRGDS 또는 CIKVAV 세포 부착 모티프의 혼입을 통해 도입될 수 있고, 혈관신생은 VEGF 도입에 의해 촉진될 수 있고, MMP-반응성 펩티드 가교제의 혼입에 의해 세포 운동성이 촉진될 수 있다. GCIPVSLRSGCG는 가교제에서 비스-티올 함유 가교제로서 사용하는 데 특히 적합하지만, 추가로 또는 대안적으로, 말레이미드 함유 중합체, 비스-티올 함유 가교제, 또는 둘 모두에 공유적으로 연결될 수 있거나, 또는 유리 생체활성 분자로서 중합체 바이오 잉크, 활성화제 둘 모두에 부가될 수 있다.
생체활성 분자는 3D 프린팅된 히드로겔 중에 임의의 적합한 농도로 존재할 수 있고, 이에 의해 원하는 생물학적 특징을 달성할 수 있다. 예를 들어, 생체활성 분자는 3D 프린팅된 히드로겔 중에 약 1 nM 내지 100 μM, 약 1 nM 내지 50 μM, 약 5 nM 내지 50 μM, 약 10 nM 내지 50 μM, 약 50 nM 내지 50 μM, 약 100 nM 내지 50 μM, 약 100 nM 내지 1 μM, 또는 약 500 nM 내지 1 μM 범위의 농도로 존재할 수 있다.
세포
세포는 본 기술의 3D 프린팅된 히드로겔 내로 혼입될 수 있다. 세포 생존율을 유지시키기 위해 또는 성장 및 세포 분열을 촉진시키기 위해 세포 배양 배지 또한 히드로겔 내로 혼입될 수 있다. 세포 및/또는 세포 배양 배지는 그의 중합체 바이오 잉크 또는 활성화제, 또는 둘 모두 내로의 혼입에 의해 히드로겔 내로 혼입될 수 있다.
한 실시양태에서, 세포는 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 둘 모두에, 또는 별개의 배지 중에 제공된다.
중합체 바이오 잉크 및/또는 활성화제는 세포 배양 배지를 포함할 수 있다. 세포 배양 배지는 세포와 적합성을 나타내고, 3D 프린팅 프로세스 동안 세포의 생존율을 유지시켜 주는 임의의 적합한 배지로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 물 (예컨대, 멸균된 밀리Q 워터(MilliQ water)), 완충제 및 세포 배양 배지를 포함하는 용액일 수 있다. 적합한 완충제로는 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS), 2-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES) 및 2-(시클로헥실아미노)에탄술폰산 (CHES), 또는 그의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 세포 배양 배지의 비제한적인 예로는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM), 배지 199, 햄 F10, 햄 F12, 맥코이 5A 및 로스웰 메모리얼 파크 인스티튜트 (RPMI) 배지를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 환원제 (예컨대, 2-메르캅토에탄올 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)), 안정화제 (예컨대, 피콜(Ficoll)® 또는 PVP) 및/또는 성장 보충제 (예컨대, L-글루타민 또는 히드로코르티손)를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 성장 보충제의 비제한적인 예로는 우태아 혈청 (FCS), 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFBF), 섬유모세포 성장 인자 (FBF), 내피 세포 성장 인자 (ECGF), 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1) 및 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF)를 포함한다. 환원제는 예를 들어, 가교제 중 유리 티올 기 사이의 이황화 브릿지 형성을 막을 수 있다. 안정화제는 예를 들어, 세포가 세포 배양 배지로부터 침전되지 못하게 하는 데 사용될 수 있다. 필요할 경우, 세포 배양 배지의 pH는 적절한 염기를 사용하여 생리적 pH 약 7.4로 조정될 수 있다. 한 실시양태에서, 수산화나트륨 (NaOH)은 세포 응집을 촉진시키지 않기 때문에, 세포 배양 배지의 pH를 중화시키거나, 또는 그를 제어하는 염기로서 사용된다.
수거된 세포는 선택된 세포 농도로 중합체 바이오 잉크 또는 활성화제, 또는 둘 모두 중에 재현탁될 수 있다. 중합체 바이오 잉크 및/또는 활성화제 중 세포의 농도는 약 1 x 105 내지 약 5 x 108개 세포/mL, 또는 약 1 x 105 내지 약 1 x 108개 세포/mL, 또는 약 1 x 105 내지 약 1 x 107개 세포/mL, 5 x 105 내지 약 1 x 107개 세포/mL, 또는 약 5 x 105 내지 약 5 x 106개 세포/mL, 또는 약 1 x 106 내지 약 5 x 106개 세포/mL 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는 약 4 x 106개 세포/mL 또는 5 x 106개 세포/mL 중합체 바이오 잉크 또는 활성화제인 농도로 중합체 바이오 잉크 및/또는 활성화제 또는 세포 배양 배지 중에 현탁된다.
임의의 적합한 세포는 본 기술의 중합체 바이오 잉크 및 활성화제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 세포는 부착성 세포 예컨대, 포유동물 간 세포, 위장 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 폐 세포, 기관 세포, 혈관 세포, 골격근 세포, 심장 세포, 피부 세포, 평활근 세포, 결합 조직 세포, 각막 세포, 비뇨생식기 세포, 유방 세포, 생식 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포, 신경 세포, 슈반 세포, 지방 세포, 골 세포, 골수 세포, 연골 세포, 혈관주위세포, 중피 세포, 내분비 조직 유래 세포, 기질 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 림프 세포, 혈액 세포, 내배엽 유래 세포, 외배엽 유래 세포, 중배엽 유래 세포, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 적합한 세포 유형으로는 다른 진핵 세포 (예컨대, 차이니즈 햄스터 난소), 박테리아 (예컨대, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)), 진균 (예컨대, 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum)) 및 효소 (예컨대, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae))를 포함할 수 있다.
3D 프린팅된 히드로겔은 적어도 약 100, 또는 약 1,000, 또는 약 5,000, 또는 약 10,000, 또는 약 50,000, 또는 약 100,000, 또는 약 150,000, 또는 약 200,000, 또는 약 250,000, 또는 약 300,000, 또는 약 350,000, 또는 약 400,000, 또는 약 450,000, 또는 약 500,000개 또는 그 초과의 세포를 함유할 수 있다. 다른 개수의 세포도 사용될 수 있다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 세포 성장 또는 유지를 허용하는 조건하에서 히드로겔 중에 현탁된 세포를 인큐베이션시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포의 분화를 허용하는 조건하에서 히드로겔 중에 현탁될 수 있다. 인큐베이션은 임의의 적합한 온도 및 조건에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 세포 성장, 유지 또는 분화에 적합한 인큐베이션은 약 5% CO2하에 약 37℃에서 적어도 24시간 동안 수행될 수 있다. 인큐베이션은 히드로겔 중 세포 유형의 세포 성장, 유지 또는 분화를 허용하는 임의의 온도 및 지속 시간 동안 수행될 수 있음을 이해할 것이다.
다른 실시양태에서, 본 방법은 세포 성장에 적합하지 않을 수도 있는 조건하에서 히드로겔 중에 현탁된 세포를 인큐베이션시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 인큐베이션은 산소가 부족한 조건하에서, 세포를 고갈시키는 무혈청 환경에서, 산성 또는 염기성 환경에서, 가해진 외부 압력하에, 전기장 존재하에, 일정한 진탕하에, 또는 그의 임의의 조합으로 수행될 수 있다. 특정 생물학적 조건을 모방하는 데 적합한 다른 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
3D 바이오프린팅
본 기술의 중합체 바이오 잉크 및 활성화제는, 바이오프린팅이 중합체 바이오 잉크 및 활성화제의 이산 액적의 생성에 기초하여 이루어지고, 그 중에서도 특히, 열 잉크젯, 피에조 잉크젯 및 마이크로밸브 기반 바이오프린팅을 포함할 수 있는 것인 드롭-온-디맨드 (DOD) 바이오프린팅에 적합하다. 임의의 다른 드롭-온-디맨드 프린팅 기술에서와 같이, 중합체 바이오 잉크 및 활성화제는 바이오프린터 카트리지 내부에서는 액체여야 한다. 추가로, 중합체 바이오 잉크 및 활성화제는 바이오프린팅 카트리지에 보관될 때 높은 세포 생존율을 유지시키기 위해서는 생체적합성 물질로부터 제조되어야 한다.
3D 어세이의 DOD 바이오프린팅은 바이오프린터 소프트웨어를 통해 결정된 기판 상의 위치에 이러한 크기의 중합체 바이오 잉크 및 활성화제의 액적을 반복적으로 증착시키는 것을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 3D 바이오프린팅은 액적을 형성하고, 증착시킬 수 있는 3D 바이오프린터를 사용하여 수행된다. 바이오프린터는 적어도 중합체 바이오 잉크, 활성화제 및 세정액을 위한 유체 저장소, 3축 모션 제어 스테이지, 드롭-온-디맨드 액적 디스펜싱 시스템, 및 유체 저장소 내의 압력을 제어하기 위한 압력 조절기를 가질 수 있다. 액적 디스펜싱 시스템 및 3축 스테이지는 멸균 챔버, 예컨대, 층류 캐비넷 내부에 하우징될 수 있다. 프린팅 플랫폼은 많은 종류의 기판, 예컨대, 마이크로-웰 플레이트 및 페트리 디쉬 상에 프린팅하는 어댑터를 포함할 수 있다. 프린팅 플랫폼은 세포 증식을 지원하기 위해 약 37℃로 가열될 수 있다.
3D 바이오프린터는 프린팅 포맷을 정의하는 소프트웨어를 갖는 컴퓨터에 의해 제어될 수 있다.
3D 바이오프린터는 세포 무결성, 생존율 또는 기능을 허용하는 방식으로 한 방울의 중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 프린팅 (증착)하도록 설정될 수 있다. 중합체 바이오 잉크 및 활성화제의 증착은 임의의 순서로 수행될 수 있음을 이해할 것이다. 중합체 바이오 잉크 한 방울을 기판에 적용한 후에 활성화제 한 방울을 적용하여 히드로겔 액적을 형성할 수 있거나, 또는 활성화제 한 방울을 기판에 적용한 후에 중합체 바이오 잉크 한 방울을 적용하여 히드로겔 액적을 형성할 수 있다.
본 기술의 방법에 의해 형성된 히드로겔은 실질적으로 균일한 3D 구조체를 포함한다. 히드로겔이 세포를 함유할 때, 세포는 히드로겔 전반에 걸쳐 실질적으로 균일하게 분포될 수 있거나, 또는 히드로겔의 히드로겔의 일부분 내에 현탁될 수 있다. 세포는 히드로겔 중 하나 이상의 선택된 위치에 증착될 수 있다.
프린팅 기판은 프린팅된 히드로겔 구조체를 인클로징하고, 배양하는 데 사용되는 생체적합성 소모품이다. 기판은 세포를 함유, 수용, 또는 성장시키는 데 적합한 임의의 베쓸로부터 선택될 수 있다. 예로는 상이한 웰 구성 (6, 24, 48 및 96-웰)의 마이크로타이터 플레이트, 상이한 웰 구성 (6, 24, 48 및 96-웰)의 커버슬립 바닥을 갖는 마이크로타이터 플레이트, 다양한 크기의 플루오로디쉬, 상이한 챔버 구성 (1, 2, 4, 8 및 16)의 챔버 슬라이드, 커버 슬립 또는 현미경 슬라이드, 또는 페트리 디쉬를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3D 바이오프린팅 프로세스는 기판 상에 복수의 3D 조직 배양물 모델을 형성하기 위해 수행된다. 예를 들어, 96-웰 마이크로타이터 플레이트는 적합한 기판이고, 다중 세포 어세이를 위해 사용될 수 있다. 다른 적합한 베쓸은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
어세이의 3D 구조체는 바이오프린터 소프트웨어를 이용하여 디자인될 수 있다. 적합한 바이오프린터 및 바이오프린터 소프트웨어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 96-웰 플레이트에서의 바이오프린팅을 위해, 바이오프린터 소프트웨어는 선택된 직경을 갖는 층 중의 웰에 액적을 반복적으로 증착시키도록 설정될 수 있다.
중합체 바이오 잉크 및 활성화제는 프린팅시 신속하게 반응하여 히드로겔을 형성하고, 이에 의해 신속한 고처리량의 3D 구조체 및 어세이 생산이 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 본 기술의 중합체 바이오 잉크 및 활성화제는 혼합 (즉, 프린팅시) 수초 이내에 히드로겔을 형성한다. 예를 들어, 히드로겔은 혼합 5초 이내에, 바람직하게, 혼합 4, 3, 2, 또는 1초 이내에 형성될 수 있다.
본 기술의 중합체 바이오 잉크 및 활성화제는 임의의 적합한 DOD 바이오프린팅 시스템과 함께 사용될 수 있다. 본 발명자들은 최근 3D 시험관내 어세이의 바이오프린팅용으로 특수 디자인된 DOD 바이오프린팅 시스템을 개발하였다. 더욱 구체적으로, 바이오프린터는 95% 초과의 세포 생존율로 최대 500 x 106개 세포/mL로 세포와 함께 중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 최대 200 cP로 프린팅할 수 있다. 개발된 시스템은 고처리량 방식으로 3D 스페로이드 어세이를 바이오프린팅하는 데 성공적으로 사용되었다. 따라서, 본 기술의 바이오 잉크는 본 발명자들에 의해 개발된 3D 바이오프린팅 시스템을 이용하는 3D 세포 프린팅에 특히 유용하다.
개발된 바이오프린터의 신규한 프린팅 로직과 조합된, 본 기술의 히드로겔의 빠른 겔화 특징을 통해 바이오프린터는 96-웰 포맷으로 복합 3D 어세이를 신속하게 프린팅할 수 있게 되었다. 예를 들어, 96-웰 플레이트에서의 3D 어세이의 바이오프린팅은 약 1시간 미만, 바람직하게, 약 30분 미만, 예컨대, 약 25분, 또는 약 20분, 또는 약 15분, 또는 그 미만인 기간 내에 달성될 수 있다.
중합체 바이오 잉크 및 활성화제는 프린팅 직전에 별개의 멸균된 카트리지 내로 로딩될 수 있거나, 또는 카트리지에 보관될 수 있다. 세포 바이오 잉크가 카트리지에 보관되는 경우, 카트리지는 추가 사용을 위해 요구될 때까지 바람직하게 4℃에서 보관되어야 한다. 본 기술의 중합체 바이오 잉크 및 활성화제는 프린팅 전 장기간 동안 세포 생존율을 지원할 수 있다. 예를 들어, 세포는 적어도 약 2시간 동안 프린팅 전에 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 중에서 생존가능한 상태 그대로 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 중합체 바이오 잉크 및 활성화제는 실질적으로는 세포 생존율에는 영향을 주지 않으면서, -20℃에서 적어도 6개월 동안 보관될 수 있다. 유사하게, 본 기술의 3D 프린팅된 히드로겔은 프린팅 후에 장기간 동안 세포 생존율을 지원할 수 있다. 예를 들어, 세포는 적어도 약 21일 동안 3D 프린팅된 히드로겔 중에서 생존가능한 상태 그대로 유지될 수 있다.
사용할 준비가 되었을 때, 카트리지를 클린 바이오프린터에 연결할 수 있다. 카트리지 및/또는 바이오프린터 (유체 라인, 밸브 및 노즐 포함) 세정은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어, 에탄올 (물 중 70 v/v%) 와이핑, 대기 건조, 및 생물안전 캐비넷 내의 배치에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게, 세정 후 및 프린팅 이전에 사용되는 조직 배양 배지로 바이오프린터를 퍼징한다.
적용
본 기술의 3D 프린팅된 히드로겔은 다양한 시험관내 적용을 가질 수 있다. 한 예에서, 본 기술의 3D 프린팅된 히드로겔은 세포 운동성, 세포 이동, 세포 침입, 경내피 이동, 상피-중간엽 이행, 중간엽-상피 이행, 스페로이드 형성 및 성장, 세포 분화 (예컨대, 줄기 세포 분화, 세포 분화 마커의 모니터링), 세포 사멸 (예컨대, 세포 아폽토시스; 세포 괴사), 세포 자가 포식, 세포 증식, 세포 대사, 단백질 전환, 단백질 분포 및 국재화, 세포 신호전달 및 하류 이벤트, 약물 효능, 약물 약력학적 성질, 약물 작용 기전, 약물 수용체 매개 수송, 약물 내재화 기전, 바이오마커 평가, 세포-세포 연접, 세포-세포 신호전달 및 하류 이벤트, 세포 형태, 세포 부착, 유전자 발현, 단백질 발현, 세포 귀소, 세포 주기 조절 및 제어, 시토카인 방출, 인슐린 생산, 단백질 분비 및 세포내 이동 및 수송, 수용체-리간드 결합, 항체 결합, 항체 특이성, 단백질 인산화, 프로테아솜 기능, 효소 기능 (예컨대, 효소 억제), 면역조정, 클론원성, 산화 스트레스, 단백질 폴딩, 세포 세포골격, 세포기관 형태 및 기능 (예컨대, 미토콘드리아, 엽록체, 퍼옥시좀, 분비 소포체, 액포, 리보솜, 핵, 리소좀, 섬모, 소포체, 골지체), 막 수송, 저산소, 혈관신생, 상처 치유, 신경돌기 (성장 또는 형성), 키나제 기능, 포스파타제 기능, 라멜리포듐 형성 및 동적 성질, 병소 접촉/부착 형성, 동적 성질 및 신호전달, 세포 감지, 및 기계적에너지변환을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 생물학적 표현형 검사를 위한 어세이를 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 기술의 3D 프린팅된 히드로겔은 또한 생체내 적용 (예컨대, 동물 연구)에도 적합할 수 있다. 예를 들어, 본 기술의 3D 프린팅된 히드로겔은 세포의 존재 또는 부재하의 동소 및 피하 모델에서 사용될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 기술, 및 본 기술의 3D 프린팅된 히드로겔로 달성될 수 있는 유익한 효과를 예시하는 것이며, 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
물질
4-아암 PEG-말레이미드 (PEG-Mal, MW 5, 10 및 20 kDa, 젠켐(JenKem)), PEG-비스-티올 (MW 1 kDa, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)), 젤라틴 (소, 어류 또는 돼지 유래의 것, 시그마 알드리치), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC, 시그마 알드리치), N-히드록시술포숙신이미드 (술포-NHS, 시그마 알드리치), 수산화나트륨 (NaOH), CRGDS, CIKVAV, CYIGSR, GCRDGPQGIWGQDRCG, GCRDPLGLDRCG 및 GCIPVSLRSGCG (> 90%, 겐스크립트(Genscript)), 염화칼슘 무함유 포스페이트 완충처리된 용액 (PBS, 기브코(Gibco)), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, 기브코), 칼슘 무함유 DMEM (기브코), 피루브산 나트륨 (기브코), L-글루타민 (기브코), 트립신 (시그마 알드리치), 0.22 ㎛ 시린지 필터 (폴리에테르술폰 막, 머크 밀리포어(Merck Millipore)), T75 및 T150 플라스크 (코닝(Corning)), 15 mL 원심분리관 (코닝), 에탄올 (시그마 알드리치)을 받은 그대로 사용하였다.
실시예 1 - PEG- Mal 중합체 바이오 잉크 제조
실시예 1a - PBS 중에서의 중합체 바이오 잉크 제조
PBS 완충제 중에서 3가지 유형의 PEG-Mal 중합체 바이오 잉크를 제조하였다.
PEG- Mal 중합체 바이오 잉크
실온에서 PBS 완충 용액 중에서 PEG-Mal (7.5 wt%)을 혼합하여 PEG-Mal 중합체 바이오 잉크를 제조하였다. 용해 완료 후, 용액을 무균 방식으로 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다.
PEG- RGD 중합체 바이오 잉크
실온에서 30분 동안 PBS 완충 용액 중에서 CRGDS를 PEG-Mal (10 wt%)과 혼합하여 총 5 mM RGD 농축물을 수득함으로써 RGD-함유 PEG-Mal (PEG-RGD) 중합체 바이오 잉크를 제조하였다. 유리 티올이 기록되지 않았을 때, 엘만 어세이를 통해 반응이 완료되었음을 확인하였다. 반응 생성물은 PBS 중에 용해된 10 wt% PEG-RGD 및 5 mM RGD 농축물을 함유하였다. 용해 완료 후, 등몰 농도의 NaOH를 RGD 농축물로 용액에 첨가하여 용액의 pH가 최대 7.4가 되도록 만들었다. 용액을 무균 방식으로 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과 멸균하였다.
PEG- 트리펩티드 중합체 바이오 잉크
실온에서 30분 동안 PBS 완충 용액 중에서 CRGDS, CIKVAV 및 CYIGSR (원하는 몰 농도)을 PEG-Mal (15 wt%)과 혼합하여 15 wt% PEG-트리펩티드 및 0.67 mM의 RGD, YIGSR 및 IKVAV를 수득함으로써 RGD, IKVAV 및 YIGSR을 함유하는 PEG-Mal (PEG-트리펩티드) 중합체 바이오 잉크를 제조하였다. 용해 완료 후, 1 M NaOH를 적가하여 용액의 pH를 7.4로 상승시켰다. 이어서, 생성된 용액을 무균 방식으로 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과 멸균하였다.
도 2는 CRGDS에 의한 4-아암 PEG-Mal의 변형의 분석을 보여주는 것이다. UV 분석 결과, 반응 시작시 412 nm에서 뚜렷한 피크를 보였다 (도 2(a)). 이는 엘만 시약의 이황화 결합이 티올 모이어티 (이 경우, CRGDS)에 의해 절단되고, 이온화되었을 때에 생성되는 TNB2 - (2-니트로-5-티오벤조에이트) 이온의 존재를 나타낸다. 그에 반해, 상기 피크는 CRGDS 부재하에서 및 반응을 30분 동안 계속해서 진행시킨 후 4-아암 PEG-Mal 용액에서는 존재하지 않았고, 이는 각각 4-아암 PEG-Mal이 엘만 시약과 반응하지 않고, CRGDS가 30 min 후에 완전히 반응했다는 것을 시사하는 것이다. 1H NMR을 사용하여 아미드 및 말레이미드 양성자 피크를 비교함으로써 CRGDS 접합의 정량화를 확인하였다 (도 2(b)).
실시예 1b - 세포 배양 배지 중에서의 중합체 바이오 잉크 제조
PBS 용액 대신, 프린팅하고자 하는 세포에 적절한 세포 배양 용액을 이용하여 실시예 1a의 방법에 따라 세포 배양 배지 중 RGD 함유 PEG-Mal 중합체 바이오 잉크를 제조하였다. 생성된 중합체 바이오 잉크를 무균 방식으로 여과 멸균 (0.22 ㎛ 필터)하였다.
실시예 1에 따라 제조된 중합체 바이오 잉크를 추가 사용을 위해 요구될 때까지 -20℃에서 보관하였다. 중합체 바이오 잉크는 기능에는 영향을 주지 않으면서 적어도 6개월 동안 -20℃에서 보관될 수 있다.
실시예 2 - PEG- 비스 - 티올 및 GCIPVSLRSGCG 활성화제의 제조
실시예 2a - PBS 중에서의 활성화제 제조
전체 티올 농도가 보완 중합체 바이오 잉크의 말레이미드 농도와 등몰 농도인 농도로 PBS 중에서 디티오트레이톨 (DTT), PEG-비스-티올, GCIPVSLRSGCG 및 GCRDPLGLDRCG, 또는 그의 다양한 조합을 혼합함으로써 활성화제를 제조하였다. 생성된 용액을 무균 방식으로 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과 멸균하였다.
실시예 2b - 세포 배양 배지 중에서의 활성화제 제조
전체 티올 농도가 보완 바이오 잉크의 말레이미드 농도와 등몰 농도인 농도로, 프린팅하고자 하는 세포에 적절한 세포 배양 용액중에서 디티오트레이톨 (DTT), PEG-비스-티올, GCIPVSLRSGCG 및 GCRDPLGLDRCG를 혼합함으로써 활성화제를 제조하였다. 생성된 용액을 무균 방식으로 여과 멸균 (0.22 ㎛ 필터)하였다.
실시예 2에 따라 제조된 활성화제를 추가 사용을 위해 요구될 때까지 -20℃에서 보관하였다. 활성화제는 기능에는 영향을 주지 않으면서 적어도 6개월 동안 -20℃에서 보관될 수 있다.
실시예 3 - 세포 배양
SK-N-BE(2) (인간 신경모세포종), KrasG12D 및 p53R172H (췌장 도관 선암종), MCF7 (인간 유방암) 및 U87vIII (인간 교모세포종) 세포를 개별적으로 37℃/5% CO2에서 10% 우태아 혈청 (FCS)/DMEM 중에서 유지시켰다. 인간 비소세포 폐암 H460 세포는 37℃/5% CO2에서 로스웰 메모리얼 파크 인스티튜트 (RPMI) 1640 배지 및 10% FCS 중에서 배양하였다. 세포주를 통상적으로 스크리닝하였고, 마이코플라즈마 오염은 없었다.
실시예 4 - 트립판 블루 배제
실시예 3에 따라 배양된 SK-N-BE(2), KrasG12D 및 p53R172H, H460 및 U87vIII 세포를 트립신/PBS를 이용하여 T75 플라스크로부터 수거하고, 원심분리를 사용하여 펠릿화하였다. 세포를 10 wt% PEG-Mal 및 PEG-RGD 및 5 mM RGD 농축물을 함유하는 중합체 바이오 잉크 중에 2 x 106개 세포/mL인 세포 농도로 재현탁시켰다. 샘플을 2개 군: 프린팅된 군 및 비-프린팅된 대조군으로 나누었다. 프린팅된 샘플을 3D 바이오프린터를 통해 통과시키고, 실온에서 30분 동안 멸균 조건에서 보관하였다. 죽은 세포는 0.4% 트립판 블루 염료 (인비트로겐(Invitrogen))를 이용하여 확인하였다. 각 샘플 중 살아있는 세포 및 죽은 세포의 개수를 계수하여 세포 계수를 수득하였다. 세포 생존율 백분율은 살아있는 세포의 총 개수를 세포 총 개수 (살아있는 것 + 죽은 것)로 나눔으로써 결정되었다.
실시예 5 - 세포 중합체 바이오 잉크의 제조
실시예 4의 방법에 따라 수행하여 특정 전면생장률의 배양된 관심 세포를 수거하였다. 세포 중합체 바이오 잉크를 구성하기 위해, 수거된 세포를 실시예 1(a) 또는 1(b)에 따라 제조된 멸균된 중합체 바이오 잉크 중에 적절한 세포 농도로 1 mL의 멸균된 중합체 바이오 잉크 중 2 x 106개 세포/mL가 되도록 재현탁시켰다.
실시예 6 - 세포 활성화제의 제조
실시예 4의 방법에 따라 수행하여 특정 전면생장률의 배양된 관심 세포를 수거하였다. 세포 활성화제를 구성하기 위해, 수거된 세포를 실시예 2(a) 또는 2(b)에 따라 제조된 멸균된 활성화제 중에 적절한 세포 농도로 재현탁시켰다.
실시예 7 - 3D 세포 생존율 어세이
라이브/데드 염료를 이용하여 히드로겔 캡슐화된 세포의 생존율을 모니터링하였다. DMEM 중 칼세인 AM (1 ㎕ mL-1) 및 에티디움 동종이량체-I (4 ㎕ mL-1)를 사용하여 각각 살아있는 세포 및 죽은 세포를 염색하였다. 실시예 5에 따라 제조된 세포 중합체 바이오 잉크를 이용하여 히드로겔을 캡슐화된 세포로 3D 바이오프린팅하였다. 필요한 인큐베이션 기간 경과 후, 바이오프린팅된 히드로겔을 공초점 형광 현미경법 분석 이전에 37℃/5% CO2에서 적어도 2 h 동안 라이브/데드 염료와 함께 인큐베이션시켰다.
실시예 8 - 레올로지 특징화
(실시예 1(a)에 따라 제조된) 5 mM RGD (10 wt%)를 갖는 4-아암 PEG-Mal 히드로겔로부터 제조되고, (실시예 2(a)에 따라 제조된) (50:50 티올 몰 농도로 혼합된) PEG-비스-티올 및 MMP-2 반응성 비스-시스테인 펩티드 GCIPVSLRSGCG와 가교된 히드로겔에 대한 기계적 특성을 연구하였다.
동심 원통 스핀들 및 컵 시스템이 장착된 안톤-파(Anton-Paar) 모듈식 소형 레오미터 (MCR) 302를 사용하여 히드로겔 레올로지를 측정하였다. 점도 측정은 1-1000 s-1 사이의 전단율 값에서 수행하였다. 병렬-플레이트 기하학적 구조 (직경 25 mm) 시스템 및 액체 증발을 최소화하기 위한 용매 트립이 장착된, 상기와 동일한 기계를 이용하여 히드로겔의 레올로지 특징을 측정하였다. 미리 가열된 플레이트 상에서 레올로지 측정을 수행하였고, 37℃의 일정한 온도로 유지시켰다. 진폭 변형률 스윕 실험 (γ: 1-100%)을 수행하여 10 Hz의 고정 주파수에서 선형 점탄성 영역 (LVR)을 결정하였다. 일단 각 샘플의 LVR을 확립하고 나면, 히드로겔의 선형 점탄성 영역에서 고정 변형률에서 동적 주파수 스윕을 수행하였다 (ω: 0.1-10 Hz). 전형적으로 고정 주파수 (10 Hz) 및 (LVR 내의) 변형률 진폭에서 시간 스윕 측정을 수행하였다.
도 3에 제시된 바와 같이, 주파수 (도 3(a)) 및 변형률 (도 3(b)) 스윕 연구를 통해 겔의 기계적 특성은 상기 두 파라미터와는 관계가 없다는 것인 확인되었다.
이어서, 히드로겔의 점탄성 영역 내에서 일정한 주파수 및 변형률 값에서 강성 측정을 수행하였다 (도 3(c)). 히드로겔 캐스팅 후 1분 이내에 측정을 수행하였다. 도 3(c)는 저장 탄성률 (G') 값이 전 측정 기간 동안 손실 탄성률 (G") 값보다 항상 높았다는 것을 보여준다. 약 1.1 kPa의 일정한 저장 탄성률 값은 겔화 프로세스가 1분 기간 이내에 완료되었다는 것을 시사하는 것이었다. 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 둘 모두에 대한 점도 연구 결과, 점도 값은 10 cP 미만인 것으로 나타났고, 이러한 이유에서 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 둘 모두 드롭-온-디맨드 바이오프린팅 프로세스에 매우 적합한 것이 되었다 (도 3(d)).
(실시예 2(a)에 따라 제조된) PEG-비스-티올과 가교된 (실시예 1(a)에 따라 제조된) 4-아암 PEG-Mal 블랭크 중합체 바이오 잉크로부터 제조된 히드로겔, 및 (실시예 2(a)에 따라 제조된 MMP-감수성 활성화제 (GCIPVSLRSGCG)와 가교된 (실시예 1(a)에 따라 제조된) PEG-트리펩티드로부터 제조된 히드로겔에 대한 기계적 특성 또한 연구하였다. PEG-Mal 히드로겔 (도 4(a)) 및 PEG-트리펩티드 히드로겔 (도 4(b))의 점탄성 영역 내에서 일정한 주파수 및 변형률 값에서 강성 측정을 수행하였다. 히드로겔 캐스팅 후 1분 이내에 측정을 수행하였다. 도 4(a) 및 4(b)는 저장 탄성률 (G') 값이 전 측정 기간 동안 손실 탄성률 (G") 값보다 항상 높았다는 것을 보여준다. 이러한 관찰 결과를 통해 바이오 잉크 및 활성화제가 혼합되었을 때, 히드로겔이 존재하였다는 것을 확인할 수 있었다. 정량적으로, PEG-Mal 블랭크 중합체 바이오 잉크 및 PEG-비스-티올 활성화제로부터 형성된 히드로겔의 강성 값는 약 0.2 kPa이었고, PEG-트리펩티드/MMP-감수성 히드로겔의 강성 값은 약 1.6 kPa였다.
실시예 9 - 3D 바이오프린팅 플랫폼
본 실시예에서 사용된 3D 바이오프린터의 컴포넌트는 3축 모션 제어 스테이지, 드롭-온-디맨드 액적 디스펜싱 시스템 및 유체 저장소 내의 압력을 제어하기 위한 압력 조절기를 포함한다. 액적 디스펜싱 시스템 및 3축 스테이지는 멸균 챔버, 예컨대, 층류 캐비넷 내부에 하우징될 수 있다. 프린팅 플랫폼은 많은 종류의 기판, 예컨대, 마이크로-웰 플레이트 및 페트리 디쉬 상에 프린팅하는 어댑터를 포함한다. 프린팅 플랫폼은 세포 증식을 지원하기 위해 37℃로 가열될 수 있다.
3축 모션 제어 스테이지 (MX80S, 파커(Parker))는 3차원 모두에서 (X, Y 및 Z) 10 ㎛ 해상도로 액적 디스펜싱 시스템을 정확하게 포지셔닝할 수 있다. 10개의 액적 디스펜싱 시스템은 마이크로컨트롤러 (아두이노 메가(Arduino Mega) 2560, 아두이노(Arduino))에 의해 제어되는 쥬얼(jewelled) 오리피스 디스펜싱 노즐 (MINSTAC 노즐, 더 리 컴퍼니(The Lee Company))이 있는 솔레노이드 밸브 (VHS 시리즈 솔레노이드 밸브(VHS Series Solenoid Valve), 더 리 컴퍼니)로 구성된다. 쥬얼 오리피스 노즐의 내부 직경은 유체 점도 및 원하는 액적 부피에 따라 127 내지 254 ㎛일 수 있다. 각 액적 디스펜싱 시스템은 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 용액이 가요성 배관을 통해 분배되도록 하기 위해 정압 저장소에 부착된다. 원하는 액적 부피 또한 유체 저장소내 배압 및 솔레노이드 밸브 개방 시간을 이용하여 조정될 수 있다. 전형적으로, 배압은 1 내지 300 kPa 압력으로 세팅되고, 솔레노이드 밸브 개방 시간 0.3 ms 이상이고, 액적 부피는 1 내지 500 nL이다. 시스템을 프라이밍하고, 프린팅 루틴 종료시 그를 퍼징하는 데 소요되는 시간량을 최소화시키기 위해, 중합체 바이오 잉크 저장소 및 활성화제 저장소를 연결하는 가요성 배관은 가능한 짧게 유지시켰다.
실시예 10 - 제어 소프트웨어
생물학적 어세이를 프린팅하기 위해 개발된 사용자 정의 소프트웨어를 통해 3D 바이오프린터를 제어하였다. 소프트웨어는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 포함하고, 파이썬(Python) 프로그래밍 언어로 작성되었다. GUI를 통해 최종 사용자는 상이한 어세이 프린팅 루틴을 선택할 수 있고, 어세이 파라미터, 예컨대, 액적 간격 및 액적 부피를 바꿀 수 있다. 사용자는 또한 액적 디스펜싱 시스템의 공간 위치를 수동으로 제어할 수 있고, 액적의 사용자 정의 패턴을 생성할 수 있다. 소프트웨어의 추가 특징으로 액적 디스펜싱 시스템의 프라이밍 및 퍼징을 위한 루틴을 포함한다.
실시예 11 - 3D 바이오프린팅
프린팅 전에 멸균 중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 실온으로 가열하였다. 관심 세포를 원하는 세포 농도로 중합체 바이오 잉크 및/또는 활성화제와 혼합하였다. 이어서, 모든 용액을 바이오프린터 샘플 트레이에 로딩하였다. 라스트럼(Rastrum)™ 모듈식 3D 바이오프린터 (인벤티아 라이프 사이언스(Inventia Life Science: ILS))를 이용하여 바이오프린팅을 수행하였다. 라스트럼™ 소프트웨어 (ILS)를 이용하여 구조체를 디자인하였다. 2개의 상이한 바이오프린팅된 샘플을 프린팅하였다; 직경이 약 6.35 cm이고, 두께가 400 ㎛인 원통형 구조체, 및 직경이 6.35 cm이고, 두께가 100 ㎛인 불활성 겔 층 위에 안치된, 직경이 100 ㎛인 반구형 구조체. 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 용액 둘 모두를 20 내지 100 kPa의 프린팅 압력으로 프린팅하였다. 바이오프린팅 프로세스 전, 라스트럼™ 바이오프린터는 자동 멸균화 및 프라이밍 단계를 수행하였다.
소프트웨어에 의해 결정된 위치에의 중합체 바이오 잉크 액적 증착 후, 이어서, 바로 그 위에 활성화제 액적의 증착으로 3D 객체가 생성되었다. 모든 프린팅은 96-웰 플레이트 (코닝)에서 수행되었다. 완료시, 세포를 위해 관련된 세포 배양 배지 (150 ㎕)를 첨가하고, 플레이트를 인큐베이터로 옮겼다.
도 1은 3D 바이오프린팅 프로세스의 대표적인 개략도이다. 사용된 중합체 바이오 잉크는 4-아암 PEG-말레이미드 (PEG-Mal), CRGDS 및 원하는 암 세포 (실시예 1(a) 및 5에 따라 제조)를 포함하였다. 활성화제는 PEG-비스-티올 및 비스-티올 MMP 반응성 펩티드 GCIPVSLRSGCG (실시예 2(a)에 따라 제조)의 혼합물을 포함하였다. 상기 두 용액 모두 실시예 9에 따른 ILS 3D 바이오프린터 시스템에 로딩하였고, 이는 공간 제어 방식으로 중합체 바이오 잉크 및 활성화제의 조합을 증착시켰다. 96-웰 플레이트 내에서 상기 두 용액 혼합 즉시 겔화가 일어났고, 이에 의해 히드로겔 내에 3차원으로 캡슐화된 세포가 생성되었다.
실시예 12 - 췌장 도관 선암종 세포 ( Kras G12D 및 p53 R172H )의 3D 바이오프린팅
티올-말레이미드 가교된 PEG 히드로겔 내부에 3차원으로 캡슐화된 암 세포로 이루어진 다중 샘플을 ILS 3D 바이오프린터를 이용하여 바이오프린팅하였다. 구체적으로, 바이오프린터를 이용하여 암 세포, 중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 동시에 전달하여 바이오프린팅된 히드로겔 내부에서 계내 세포 캡슐화가 신속하게 발생하도록 하였다.
세포 배양
T150 플라스크 중 80% 전면생장률의 췌장 도관 선암종 세포 KrasG12D 및 p53R172H를 3 mL PBS로 세척하였다. 과량의 PBS 흡인 후, 3 mL의 트립신을 첨가하고, 플라스크를 37℃에서 인큐베이션시켜 5분 동안 플라스크 표면으로부터 세포를 해리시켰다. 이어서, 10 v/v% FCS와 DMEM을 혼합하여 제조된 7 mL 조직 배양 배지를 첨가하고, 해리된 세포를 15 mL 튜브로 옮겼다. 세포 분산액을 400 g로 3분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 세포 펠릿을 5 mL 배지 중에 재현탁시켰다. 이어서, 동일한 부피의 세포 현탁액 및 트립판 블루 염료를 혼합하여 세포 농도를 결정함으로써 세포 계수를 수행하였다.
기판
코닝 인코포레이티드(Corning incorporated)로부터 공급받은 96-웰 플레이트를 받은 그대로 사용하였다. 멸균 패키징을 멸균 환경에서 개봉하여 내용물의 멸균성을 그대로 유지시켰다.
중합체 바이오 잉크
중합체 바이오 잉크를 제조하기 위해, PEG-Mal (0.150 g)을 1.5 mL PBS 중에 용해시켜 10 wt% 중합체 바이오 잉크를 수득하였다. PEG-RGD를 혼입시키고자 할 경우, CRGDS (1.34 mg)를 용액에 첨가하고, 30분 동안 교반시켜 10 wt% PEG-Mal/5 mM RGD를 갖는 PEG-RGD 중합체 바이오 잉크를 수득하였다. 용액에 2.5 ㎕ 1 M NaOH를 첨가하여 용액의 pH를 7.4로 상승시켰다. 이어서, 용액을 멸균 환경하에서 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켰다.
1 mL DMEM 중에 2 x 106개 세포/mL로 분산된, 수거된 KrasG12D 및 p53R172H를 원심분리하여 500,000개의 세포로 이루어진 세포 펠릿을 수득하였다. 이어서, 생성된 펠릿을 중합체 바이오 잉크 (1 mL) 중에 재분산시켜 KrasG12D 및 p53R172H 세포가 2 x 106개 세포/mL로 분산된 세포 중합체 바이오 잉크 용액을 수득하였다.
활성화제
비-MMP 및 MMP 반응성 히드로겔 둘 모두를 생산하기 위해 2개의 상이한 활성화제를 제조하였다. 각각이 1 mL PBS 중에 용해되어 있는, PEG-비스-티올 (0.01975 g) 단독, 또는 PEG-비스-티올 (0.0096 g) 및 GCIPVSLRSGCG (0.0111 g)의 조합으로부터 2개의 활성화제를 제조하여 바이오 잉크 중 말레이미드와 등몰 농도인 티올 농도를 갖는 활성화제를 수득하였다. 이어서, 각 용액을 멸균 환경하에서 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켰다.
세포 프린팅 조건
세포 중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 바이오프린터에 연결된, 관련된 카트리지에 로딩하였다. 세포 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 둘 모두 10 Psi으로 작동하는 0.007" 노즐에 연결시켰다.
프린터를 처음에 에탄올 (물 중 70 v/v%) 와이핑을 통해 세정하고, 대기 건조시켰다. 유체 라인, 밸브, 및 노즐 또한 에탄올, 물 및 조직 배양 배지 퍼징을 통해 상기 순서로 멸균화하였다. 이어서, 세포 중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 그의 각 바이알에 로딩하였다. 이어서, 프린팅 루틴 시작 전에 프린트헤드를 프라이밍하였다.
ILS 사용자 맞춤형 소프트웨어를 이용하여 어세이의 3D 구조체를 디자인하였다. 3D 어세이는 고리 형상의 겔로 이루어진 3층으로 구성되었고, 총 직경은 6.35 mm였다. 소프트웨어를 통해 결정된 위치에 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 쌍의 액적을 반복적으로 증착시킴으로써 3D 어세이의 바이오프린팅을 수행하였다.
세포 농도
본 실험에서는 2 x 106개 세포/mL 농도의 세포 중합체 바이오 잉크를 사용하였다.
세포 생존율
95% 이상의 세포 생존율을 얻었다.
실시예 13 - 인간 유방암 세포 ( MCF7 )의 3D 바이오프린팅
세포 배양
T75 플라스크 중 80% 전면생장률의 MCF7 세포를 3 mL PBS로 세척하였다. 과량의 PBS 흡인 후, 1 mL의 트립신을 첨가하고, 플라스크를 37℃에서 인큐베이션시켜 3분 동안 플라스크 표면으로부터 세포를 해리시켰다. 이어서, 10 v/v% FCS와 DMEM을 혼합하여 제조된 7 mL 조직 배양 배지를 첨가하고, 해리된 세포를 15 mL 튜브로 옮겼다. 세포 분산액을 400 g로 3분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 세포 펠릿을 5 mL 배지 중에 재현탁시켰다. 이어서, 동일한 부피의 세포 현탁액 및 트립판 블루 염료를 혼합하여 세포 농도를 결정함으로써 세포 계수를 수행하였다.
기판
코닝 인코포레이티드로부터 공급받은 96-웰 플레이트를 받은 그대로 사용하였다. 멸균 패키징을 멸균 환경에서 개봉하여 내용물의 멸균성을 그대로 유지시켰다.
중합체 바이오 잉크
블랭크 중합체 바이오 잉크를 제조하기 위해, PEG-Mal (0.1125 g)을 1.5 mL PBS 중에 용해시켜 7.5 wt% 중합체 바이오 잉크를 수득하였다. 1.5 mL PBS 중에서 CRGDS (0.54 mg), CIKVAV (0.64 mg), CYIGSR (0.70 mg) 및 PEG-Mal (0.225 g)을 30분 동안 혼합하여 각각 0.67 mM RGD, IKVAV 및 YIGSR을 갖는 15 wt% PEG-트리펩티드를 수득함으로써 PEG-트리펩티드를 제조하였다. 1 M NaOH를 적가하여 용액의 pH를 7.4로 상승시켰다. 두 용액 모두 무균 방식으로 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켰다.
활성화제
비-MMP 및 MMP 반응성 히드로겔 둘 모두를 생산하기 위해 2개의 상이한 활성화제를 제조하였다. 각각이 1 mL PBS 중에 용해되어 있는, PEG-비스-티올 (0.015 g) 또는 GCRDPLGLDRCG (0.019 g)로부터 2개의 활성화제를 제조하여 각각 블랭크 바이오 잉크 및 PEG-트리펩티드 중 말레이미드와 등몰 농도인 티올 농도를 갖는 활성화제를 수득하였다. 이어서, 1 M NaOH를 적가하여 MMP-반응성 활성화제 용액을 pH 7.4로 조정하였다. 이어서, 각 용액을 무균 방식으로 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켰다.
1 mL DMEM 중에 분산된, 수거된 MCF7을 원심분리하여 10,000,000개의 세포로 이루어진 세포 펠릿을 수득하였다. 이어서, 생성된 펠릿을 활성화제 (1 mL) 중에 재분산시켜 MCF7 세포가 1 x 107개 세포/mL로 분산된 세포 MMP-활성화제 용액을 수득하였다.
세포 프린팅 조건
중합체 바이오 잉크, PEG-비스-티올 활성화제 및 MMP-반응성 세포 활성화제를 바이오프린터에 연결된, 관련된 카트리지에 로딩하였다. 중합체 바이오 잉크, PEG-비스-티올 활성화제 및 MMP-반응성 세포 활성화제를 각각 25 내지 30 kPa로 작동하는 0.007" 노즐에 연결시켰다.
프린터를 처음에 에탄올 (물 중 70 v/v%) 와이핑을 통해 세정하고, 대기 건조시켰다. 유체 라인, 밸브, 및 노즐 또한 에탄올 및 멸균수 퍼징을 통해 상기 순서로 멸균화하였다. 이어서, 중합체 바이오 잉크, PEG-비스-티올 활성화제 및 MMP-반응성 세포 활성화제를 그의 각 바이알에 로딩하였다. 이어서, 프린팅 루틴 시작 전에 프린트헤드를 프라이밍하였다.
ILS 사용자 맞춤형 소프트웨어를 이용하여 어세이의 3D 구조체를 디자인하였다. 3D 어세이는 직경이 6.35 cm이고, 두께가 100 ㎛인 바닥 겔 층 및 직경이 1 mm이고, 두께가 200 ㎛인, 세포가 내재된 돔 형상의 겔로 구성되었다.
세포 농도
본 실험에서는 1 x 107개 세포/mL 농도의 세포 활성화제를 사용하였다.
세포 생존율
95% 이상의 세포 생존율을 얻었다.
실시예 14 - 세포 배열 비교
본 기술의 중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 이용하여 히드로겔 마이크로 환경이 췌장암의 세포 배열에 미치는 효과를 시험하였다. 췌장암 세포의 생물학적 특징은 세포 배양 환경에 고도로 의존하기 때문에 그를 선택하였다. 96-웰 플레이트 상에 직경 6 mm 및 높이 0.4 mm의 히드로겔 샘플을 바이오프린팅하여 2개의 상이한 세포 배열을 시험하였다. 맨 먼저, 세포를 히드로겔 상에 3D 바이오프린팅하고, 두 번째로, 세포를 히드로겔 내부에 프린팅하였다 (즉, 그 안에 캡슐화하였다). 시험된 두 세포 배열 모두에서, 생존가능한 세포가 관찰되었다. 또한, 히드로겔 내로 돌출부를 형성할 수 있는 세포의 능력으로 나타난 바와 같이, 세포-겔 상호작용도 육안으로 볼 수 있었다. 종합적으로, 생체적합성 및 생체관련 3D 어세이는 성공적으로 PEG-기반 중합체 바이오 잉크로 바이오프린팅되었다.
히드로겔 상에 시딩된 췌장암 세포
3D 바이오프린팅을 위해 5 mM RGD 중합체 바이오 잉크와 함께, 수거된 췌장 도관 선암종 세포 (KrasG12D 및 p53R172H) 및 4-아암 PEG-Mal (10 kDa)로부터 세포 중합체 바이오 잉크를 제조하였다. 췌장암 세포를 추정컨대, 5,000개 세포/웰로 시딩하는 데 적절한 농도로 세포 중합체 바이오 잉크 중에 분산시켰다.
세포 무함유 히드로겔을 먼저 96-웰 플레이트 상에 5 mM RGD 중합체 바이오 잉크 및 PEG-비스-티올 및 MMP-2 (GCIPVSLRSGCG) 활성화제 (50:50 티올 농도 비로)와 함께 4-아암 PEG-Mal (10 kDa)로부터 3D 바이오프린팅하였다. 이어서, 세포 중합체 바이오 잉크를 PEG-비스-티올 및 MMP-2 활성화제 (50:50 티올 농도 비로)와 함께 히드로겔 상에 프린팅하여 추정컨대, 5,000개 세포/웰로 시딩하였다.
히드로겔 상에 시딩된 췌장암 세포의 현미경 영상을 촬영하였다. 3일 인큐베이션 후, 조직 배양 플라스틱 위에 시딩되었을 때, 동일한 세포의 형태학적 차이가 관찰되었다. 히드로겔 상에 시딩되었을 때, 세포-겔 및 세포-세포 상호작용 둘 모두 촉진되었고, 이는 3차원 모두에서 광범위한 세포 돌출부를 갖는 확장된 세포 네트워크 형성으로 이어졌다. 3일 인큐베이션 후, 배양된 세포는 라이브/데드 염색 어세이를 통해 생존가능한 것으로 확인되었다. 세포 생존율은 > 98%인 것으로 확인되었고, 더욱 큰 살아있는 세포 클러스터 내에서 소수의 개별 죽은 세포가 뚜렷하게 육안으로 관찰되었다.
비교를 위해 췌장암 세포를 또한 다양한 기판 상에 시딩하였다. 현미경 영상에서는 조직 배양 웰-플레이트 상에 시딩된 췌장암 세포가 매우 개별적인 것으로 나타났다. 그에 반해, 히드로겔 상에 시딩되었을 때, 췌장암 세포는 다중 세포 사이에 확장된 네트워크를 형성하였다. 히드로겔 상에 시딩되었을 때, 세포는 히드로겔 내로 침입할 수 있었고, 3D 세포 네트워크를 형성하였다. z축에서 겔로의 현미경 스캐닝 결과, 히드로겔 내의 3D 세포 네트워크의 존재를 확인할 수 있었다.
생물학적으로 불활성인 히드로겔 내에 캡슐화된 췌장암 세포
PEG-RGD 부재하에 중합체 바이오 잉크 중에 췌장 도관 선암종 세포 (KrasG12D 및 p53R172H)를 2 x 106개 세포/mL로 분산시켜 세포 중합체 바이오 잉크를 수득하고, 세포 중합체 바이오 잉크를 MMP-2 반응성 펩티드 부재하에 활성화제와 함께 프린팅하였다. 96-웰 플레이트 상에 PEG-비스-티올 활성화제와 함께 세포-바이오 잉크를 직접 3D 바이오프린팅하여 계내 캡슐화를 달성하였다.
공초점 영상에서는 히드로겔 내부에 캡슐화된 췌장암 세포를 볼 수 있었다. 인큐베이션 기간 동안 세포의 형태를 확인하였다. RGD 및 MMP-2 가교제 부재로 인해, 겔 내부에서 세포 형태는 둥근 모양이었다. 이러한 형태는 세포가 히드로겔과 상호작용하여 병소 부착을 생성할 수 없고, 겔 내부로 이동할 수 없다는 것을 나타내었다. 3일 인큐베이션 기간 후, 캡슐화된 세포에 대해 라이브/데드 어세이를 수행하였다. 3일 인큐베이션 후, 형광 영상에서는 생존가능한 세포 (> 95% 생존율)가 관찰되었다.
생물학적으로 활성인 히드로겔 내에 캡슐화된 췌장암 세포
세포 중합체 바이오 잉크 중에 췌장 도관 선암종 세포 (KrasG12D 및 p53R172H)를 2 x 106개 세포/mL로 분산시키고, MMP-2 반응성 펩티드 활성화제 (50:50 티올 농도 비로)와 함께 프린팅하였다. 96-웰 플레이트 상에 PEG-비스-티올 및 MMP-2 활성화제와 함께 세포 중합체 바이오 잉크를 직접 3D 바이오프린팅하여 계내 캡슐화를 달성하였다. 세포 침입을 허용하기 위해 MMP-2 활성화제를 사용하였다.
공초점 영상에서는 히드로겔 내부에 캡슐화된 췌장암 세포를 볼 수 있었다. 인큐베이션 기간 동안 세포의 형태 변화가 확인되었다. 겔 내부에서, 세포 클러스터의 형성에 의해 세포-세포 상호작용이 나타난 반면, 세포-겔 상호작용 및 세포 침입은 세포막 돌출부의 존재로 확인되었다. 3 및 6일 인큐베이션 기간 후, 캡슐화된 세포에 대해 라이브/데드 어세이를 수행하였다. 3일 인큐베이션 후, 명시야 및 형광 영상에서는 생존가능한 세포 (> 98% 생존율)가 관찰되었고, 세포-세포 및 세포-겔 상호작용의 존재가 확인되었다. 6일 인큐베이션에서 세포 침입이 더욱 뚜렷하게 나타났고, 이는 세포-겔 상호작용이 강하다는 것을 시사한다. 동시에, 6일 인큐베이션 후, 겔 내부에서 > 98%의 세포 생존율 또한 유지되었다.
히드로겔에 시딩된 MCF7 유방암 세포
3일 인큐베이션 후, 명시야 현미경하에서의 세포 형태 관찰을 통해 세포 활성을 확인하였다. 인큐베이션 기간 후, 미리 정의된 겔 영역에서 다중의 스페로이드를 형성하는, 단일 MCF7 세포의 응집이 육안으로 관찰되었고, 이는 히드로겔 내부에서 서로 이동할 수 있는 개별 MCF7 세포의 능력을 시사하는 것이다.
실시예 15 - 냉온 어류의 어피로부터의 젤라틴의 말레이미드 기에 의한 변형
어피로부터의 젤라틴 (1 g)을 40℃에서 20 mL의 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 완충제 중에 용해시켰다. 별개의 용기에서, 6-말레이미도헥산산 (MHA; 0.211 g), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC, 1:20 EDC:MHA 몰비로) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS, 1:2 NHS:EDC 몰비로)를 1 mL MES 완충제 중에 용해시키고, 20분 동안 교반시켜 카르복실산 (COOH) 기를 활성화시켰다. 이어서, 활성화된 COOH 기의 용액을 젤라틴 용액으로 옮기고, 반응이 계속 진행되도록 24 h 동안 방치하였다. 생성된 용액을 2일 동안 10 mM 염산 (HCl) 및 1 wt% 염화나트륨 (NaCl)에 대해 투석한 후, 이어서, 1일 동안 10 mM HCl에 대해 투석하여 정제하였다. 이어서, 정제된 젤라틴 용액을 냉동 건조시켜 말레이미드 변형된 어류 젤라틴을 수득하였다.
실시예 16 - 돼지 피부로부터의 젤라틴의 말레이미드 기에 의한 변형
돼지 피부로부터의 젤라틴 (겔 강도 300, 유형 A, 1 g)을 40℃에서 20 mL의 MES 완충제 중에 용해시켰다. 별개의 용기에서, MHA (0.139 g), EDC (1:20 EDC:MHA 몰비로) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS, 1:2 NHS:EDC 몰비로)를 1 mL MES 완충제 중에 용해시키고, 20분 동안 교반시켜 COOH 기를 활성화시켰다. 이어서, 활성화된 COOH 기의 용액을 젤라틴 용액으로 옮기고, 반응이 계속 진행되도록 24 h 동안 방치하였다. 생성된 용액을 2일 동안 10 mM HCl 및 1 wt% NaCl에 대해 투석한 후, 이어서, 1일 동안 10 mM HCl에 대해 투석하여 정제하였다. 이어서, 정제된 젤라틴 용액을 냉동 건조시켜 말레이미드 변형된 돼지 젤라틴을 수득하였다.
실시예 17 - 말레이미드 변형된 젤라틴의 겔화
실시예 15 및 16에서 합성된, 돼지 피부 및 냉온 어류의 어피 둘 모두로부터의 말레이미드 변형된 젤라틴을 각각 20 wt%로 PBS 중에 용해시켜 중합체 바이오 잉크를 수득하였다. 1 M NaOH를 이용하여 각 용액의 pH를 pH 7.4로 중화시켰다. 활성화제를 제조하기 위해, 말레이미드 몰 농도와 동일한 SH 몰 농도로 PEG-비스-티올을 PBS 중에 용해시켰다. 동일한 부피의 각 중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 혼합하여 겔화를 달성하였다.
실시예 18 - 콜라겐 함유 PEG 히드로겔의 3D 바이오프린팅
기판
96-웰 플레이트의 차원을 모방하는 표적 그리드를 이용하여, 써모피셔(Thermofisher)로부터 공급받은 세포 배양 디쉬를 에칭하였다.
중합체 바이오 잉크
중합체 바이오 잉크를 제조하기 위해, PEG-Mal (0.15 g)을 1.5 mL PBS 중에 용해시켜 10 wt% 중합체 바이오 잉크를 수득하였다. 용액을 무균 방식으로 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켰다.
활성화제
0.5 mL PBS 중에서 GCRDPLGLDRCG (0.01 g)를 혼합하여 콜라겐 함유 활성화제를 제조하였다. 이어서, 0.5 mL의 유형 I 소 콜라겐 (3.1 mg)을 활성화제 용액에 혼합하여 콜라겐 함유 MMP-활성화제를 수득하였다. 이어서, 1 M NaOH를 적가하여 용액의 pH를 pH 7.4로 조정하였다. 이어서, 용액을 무균 방식으로 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켰다.
프린팅 조건
중합체 바이오 잉크 및 콜라겐 함유 MMP-활성화제를 바이오프린터에 연결된, 관련된 카트리지에 로딩하였다. 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 둘 모두를 25 내지 30 kPa로 작동하는 0.007" 노즐에 연결시켰다.
ILS 사용자 맞춤형 소프트웨어를 이용하여 어세이의 3D 구조체를 디자인하였다. 3D 직사각형 프리즘 구조체는 길이 및 너비가 대략 4.5 cm이고, 두께가 150 ㎛인 바닥 겔 층으로 구성되었다.
구조 검증
생성된 히드로겔 구조를 USB 디지털 현미경을 이용하여 영상화하였다.
실시예 19 - 콜라겐 함유 PEG 히드로겔 내의 섬유모세포 배양
PBS 중에서 유형 I 소 콜라겐을 10 wt% PEG-Mal과 함께 1:1 v/v 비로 혼합하여 콜라겐을 포함하는 중합체 바이오 잉크를 제조하였다. 1 M NaOH 용액을 적가하여 용액의 pH를 7.4로 상승시켰다. 말레이미드 농도와 등몰 농도의 티올을 함유하는 PEG-비스-티올 활성화제를 PBS 중에서 제조하였다. 수거된 인간 폐 섬유모세포 (MRC-5) 세포를 펠릿화하고, 콜라겐 함유 중합체 바이오 잉크 중에 재현탁시켰다. 먼저, 중합체 바이오 잉크를 웰 플레이트로 옮긴 후, 이어서, 동일한 부피의 세포 함유 활성화제를 동일한 웰로 옮김으로써 PEG 히드로겔을 제조하였다. 이어서, 100 ㎕의 DMEM + 10 v/v% FBS를 각 웰 내로 첨가하고, 샘플을 6일 동안 인큐베이션시키고, 0, 3, 및 6일째 명시야 영상을 촬영하여 세포 활성을 모니터링하였다.
섬유모세포의 형태가 둥근 형태에서 스핀들 유사 형태로 변화하는 것을 관찰함으로써 섬유모세포 배양을 위한 겔의 생물학적 적합성을 평가하였다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용은 구체적으로 기술된 것 이외의 다른 것으로 쉽게 변형 및 수정된다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 광범위하게 기술된 바와 같이 본 발명의 정신 또는 범주로부터 벗어남 없이 상기의 모든 변형 및 수정을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 그러므로, 본 실시양태는 모든 측면에서 한정적인 것이 아니라, 예시적인 것으로 간주된다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에서 개별적으로 또는 일괄적으로 언급되거나, 또는 명시된 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계, 특징, 조성물 및 화합물 중 임의의 2개 이상의 것으로 이루어진 임의의 모든 조합을 모두 포함한다.
참조문헌
Figure pct00007

Claims (34)

  1. 적어도 2개의 티올 관능기를 갖는 비스-티올 함유 가교제를 사용하여 가교된 말레이미드 함유 중합체로부터 형성된 3D 프린팅된 히드로겔.
  2. 제1항에 있어서, 말레이미드 함유 중합체가 프럭토스, 수크로스 또는 글루코스 단량체를 함유하는 중합체를 비롯한, 말레이미드 함유 다당류; 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 말레이미드, 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트 (PHEMA) 말레이미드, 폴리(ε-카프로락톤) (PCL) 말레이미드, 폴리(비닐 알콜) (PVA) 말레이미드, 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 말레이미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (NIPAAM) 말레이미드, 폴리(프로필렌 푸마레이트) (PPF) 말레이미드, 폴리(에틸렌이민) (PEI) 말레이미드, 폴리(3-메타크릴아미도프로필) 트리메틸암모늄 (PMAETMA) 말레이미드, 폴리(L-리신) (PLL) 말레이미드), 폴리(아크릴산) (PAA) 말레이미드, 폴리(스티렌 술포네이트) (PSS) 말레이미드), 폴리(아크릴산-stat-디메틸아미노에틸 메타크릴아미드) (P(AA-stat-DMAEMA)) 말레이미드, 및 폴리(아르기닌 메타크릴레이트) 말레이미드, 또는 그의 유도체를 비롯한, 합성 중합체; 젤라틴 말레이미드, 셀룰로스 말레이미드, 히알루론산 말레이미드 및 알기네이트 말레이미드를 비롯한, 말레이미드 함유 생체중합체; 아데닌, 티민, 구아닌 및/또는 시토신 반복 단위의 말레이미드 함유 중합체를 비롯한, 말레이미드 함유 핵염기 중합체; 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  3. 제2항에 있어서, 말레이미드 함유 중합체가 PEG 말레이미드를 포함하는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  4. 제2항에 있어서, 말레이미드 함유 중합체가 젤라틴 말레이미드를 포함하는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 비스-티올 함유 가교제가 합성 중합체, 생체중합체, 소분자, 생체활성 분자, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  6. 제5항에 있어서, 합성 중합체가 PEG-비스-티올, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)-비스-티올 (NIPAAM-비스-티올), 폴리(아크릴산)-비스-티올, 폴리(메타크릴산)-비스-티올, 폴리(스티렌 술포네이트)-비스-티올, 폴리(아미드)-비스-티올, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  7. 제6항에 있어서, 비스-티올 함유 가교제가 PEG-비스-티올인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  8. 제5항에 있어서, 생체중합체가 티올-젤라틴, 티올-셀룰로스, 티올-키토산, 티올-히알루론산, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  9. 제5항에 있어서, 소분자가 디티오트레이톨 (DTT)인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  10. 제5항에 있어서, 생체활성 분자가 적어도 2개의 시스테인 아미노산 기를 갖는 단쇄 펩티드, 불활성 단쇄 펩티드, 효소 반응성 단쇄 펩티드, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 반응성 펩티드, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  11. 제10항에 있어서, 생체활성 분자가 MMP-반응성 비스-시스테인 펩티드인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  12. 제11항에 있어서, MMP-반응성 펩티드가 GCIPVSLRSGCG, GCRDGPQGIWGQDRCG, GCRDPLGLDRCG, GCRDEAPLKQDRCG, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  13. 제1항에 있어서, 말레이미드 함유 중합체가 PEG-말레이미드이고, 비스-티올 함유 가교제가 PEG-비스-티올, MMP-반응성 펩티드, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  14. 제1항에 있어서, 말레이미드 함유 중합체가 RGD, YIGSR 및 IKVAV로부터 선택되는 적어도 하나의 생체활성 분자로 치환된 PEG-말레이미드이고, 비스-티올 함유 가교제가 PEG-비스-티올, MMP-반응성 펩티드, 또는 그의 조합으로부터 선택되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, MMP-반응성 펩티드가 GCIPVSLRSGCG, GCRDPLGLDRCG, 또는 그의 조합인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  16. 제1항에 있어서, 말레이미드 함유 중합체가 젤라틴 말레이미드이고, 비스-티올 함유 가교제가 PEG-비스-티올인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 말레이미드 함유 중합체 대 비스-티올 함유 가교제의 몰비가 10:1 내지 1:10 범위인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 함유하는 3D 프린팅된 히드로겔.
  19. 제18항에 있어서, 세포가 히드로겔의 일부분 내에 현탁되거나, 또는 세포가 히드로겔 전반에 걸쳐 실질적으로 균일하게 현탁되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 프린팅된 세포의 농도가 1 x 105 내지 5 x 108개 세포/mL 범위인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 간 세포, 위장 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 폐 세포, 기관 세포, 혈관 세포, 골격근 세포, 심장 세포, 피부 세포, 평활근 세포, 결합 조직 세포, 각막 세포, 비뇨생식기 세포, 유방 세포, 생식 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포, 신경 세포, 슈반(Schwann) 세포, 지방 세포, 골 세포, 골수 세포, 연골 세포, 혈관주위세포, 중피 세포, 내분비 조직 유래 세포, 기질 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 림프 세포, 혈액 세포, 내배엽 유래 세포, 외배엽 유래 세포, 및 중배엽 유래 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 생체활성 분자를 추가로 포함하는 3D 프린팅된 히드로겔.
  23. 제22항에 있어서, 생체활성 분자가 유리 생체활성 분자이거나, 또는 말레이미드 함유 중합체, 비스-티올 함유 가교제, 또는 말레이미드 함유 중합체 및 비스-티올 함유 가교제 둘 모두에 결합되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 생체활성 분자가 펩티드, MMP-반응성 펩티드, 단백질, 다당류, 약물, 치료제, 항체, 소분자 억제제, 키나제 억제제, 포스파타제 억제제, 항원, 병원체, 혈소판, 성장 인자, 시토카인, 아미노산, 영양소, 조건화된 배지, 항생제, 항바이러스제, RNA, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  25. 제24항에 있어서, 생체활성 분자가 콜라겐인, 3D 프린팅된 히드로겔.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지를 추가로 포함하는 3D 프린팅된 히드로겔.
  27. 말레이미드 함유 중합체를 포함하는 중합체 바이오 잉크를 제공하는 단계;
    적어도 2개의 티올 관능기를 갖는 비스-티올 함유 가교제를 포함하는 활성화제를 제공하는 단계; 및
    중합체 바이오 잉크 및 활성화제를 프린팅하여 3D 프린팅된 히드로겔을 형성하는 단계를 포함하는, 3D 프린팅된 히드로겔을 제조하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 세포를 제공하여 세포를 함유하는 3D 프린팅된 히드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 세포가 3D 프린팅 전에 중합체 바이오 잉크에, 활성화제에, 중합체 바이오 잉크 및 활성화제 둘 모두에, 또는 별개의 배지에 존재하는 것인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 3D 프린팅된 히드로겔이 중합체 바이오 잉크 및 활성화제의 프린팅으로부터 30분 이하, 또는 10분 이하, 또는 1분 이하, 또는 30초 이하, 또는 10초 이하, 또는 1초 이하 이내에 형성되는 것인 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 바이오 잉크, 활성화제, 또는 둘 모두가 프린팅 전에 약 pH 7.4로 조정되는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, pH가 NaOH를 사용하여 조정되는 것인 방법.
  33. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 세포를 함유하는 3D 프린팅된 히드로겔을 포함하는 세포 어세이.
  34. 세포 어세이를 위한, 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 세포를 함유하는 3D 프린팅된 히드로겔의 용도.
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