IT202000005692A1 - Bio-inchiostro per stampa 3D, relativo coniugato e processo di preparazione di un intermedio costituito da un linker fotoreattivo - Google Patents
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Description
?Bio-inchiostro per stampa 3D, relativo coniugato e processo di preparazione di un intermedio costituito da un linker fotoreattivo."
OGGETTO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione descrive un bio-inchiostro per stampa 3D, un relativo intermedio coniugato e il processo di preparazione di un intermedio costituito da un linker fotoreattivo.
E' oggetto della presente invenzione un bio-inchiostro per stampa 3D, cio? un inchiostro da impiegarsi sia nel settore del 3D-printing sia nel settore del 3D-bioprinting, comprendente un coniugato fotocrosslinkabile di acido ialuronico e linker fotoreattivo bifunzionale, o un coniugato fotocrosslinkabile di gelatina e linker fotoreattivo bifunzionale, o miscele dei due coniugati, fotocrosslinkabili. Ulteriore oggetto dell?invenzione ? un coniugato di gelatina e di un linker fotoreattivo bifunzionale, detto linker essendo costituito da umbelliferone e da uno spaziatore trietilenglicolico legati attraverso un legame etereo, detto coniugato essendo fotocrosslinkabile.
Ulteriore oggetto della presente invenzione ? un processo di preparazione di un linker fotoreattivo bifunzionale costituito da umbelliferone legato attraverso un legame etereo:
? a una catena trietilenglicolica,
oppure
? a una catena alchilica lineare C4-C20, preferibilmente ottilica
tale linker essendo in grado di legarsi ad HA o a gelatina attraverso la formazione di un legame ammidico e formare cos? il coniugato di HA o il coniugato di gelatina, fotocrosslinkabili, detto processo comprendendo i seguenti passaggi: i) eterificazione dell?umbelliferone con N-BOC-2-[(2-ptosilossietossi)etossi]etilammina oppure con 8-((terz-butossicarbonil) ammino)(C4-C20 alchil) 4-metilbenzenesolfonato, in presenza di acetone e carbonato di potassio;
ii) reazione di deprotezione del gruppo amminico a temperatura ambiente. STATO DELL'ARTE
Uno dei settori di maggiore interesse per la riparazione dei danni tissutali e d?organo ? indubbiamente il cosiddetto tissue engineering, il cui scopo ? sostanzialmente quello di creare costrutti (scaffold) da applicare in lesioni dei generi pi? vari, con lo scopo di favorire la rigenerazione del tessuto originario o di sostituire interamente un organo danneggiato.
Nel processo rigenerativo i costrutti possono ospitare le cellule presenti nel sito di lesione, che lo colonizzeranno, o possono contenere cellule inserite in fase di preparazione del costrutto, con la funzione di attivare, stimolare e migliorare il processo rigenerativo, determinando la chiusura della lesione o l?integrazione dell?organo. Tali costrutti devono naturalmente possedere alcune caratteristiche fondamentali: devono essere del tutto privi di tossicit?; devono essere biocompatibili; devono avere caratteristiche meccaniche di elasticit? e resistenza adeguate al sito di impianto; devono essere in grado di garantire la vitalit?, la proliferazione e l?organizzazione di cellule, sia quando si tratta di cellule presenti nel sito di impianto, sia quando le cellule vengono incapsulate nel biomateriale in fase di realizzazione, miscelandole all?idrogel.
Il tissue engineering pertanto compendia aspetti prettamente biologici con altri decisamente ingegneristici, anche in considerazione del fatto che i tessuti hanno caratteristiche biologiche, biochimiche, meccaniche profondamente diverse: l?osso ? molto diverso dalla pelle, il fegato da un vaso sanguigno.
Un deciso impulso al settore del tissue engineering ? stato impresso dallo sviluppo tecnologico della stampa tridimensionale (3D-printing): si tratta di un insieme di tecnologie in grado di generare un modello fisico da un?informazione digitale. Molto brevemente, una particolare stampante trasforma un ?inchiostro? polimerico avente bassa viscosit? (ink) in una struttura solida tridimensionale perfettamente identica ad un modello anatomico, secondo le istruzioni fornite da un computer opportunamente programmato.
La solidificazione dell?inchiostro avviene generalmente per suo irraggiamento mano a mano che esso viene erogato (estruso) dalla stampante: attraverso reazioni di polimerizzazione indotte dalla luce, l?inchiostro crosslinka cio? polimerizza, trasformandosi in un solido avente esattamente la forma prestabilita. Se si desidera che il costrutto finale contenga cellule, ? necessario che esse vengano mescolate all?inchiostro (incapsulate) prima della fase di estrusione: l?inchiostro ovviamente deve garantire vitalit? e proliferabilit? del materiale cellulare in esso contenuto. In questo caso di parla pi? correttamente di 3D-bioprinting e l?inchiostro viene definito bioink.
In ambito medico e chirurgico ? sicuramente molto utile poter disporre di modelli anatomici personalizzati su ciascun paziente, siano essi destinati a riparare un tessuto o addirittura a rimpiazzare un intero organo.
Le strutture ottenibili secondo queste tecniche si prestano inoltre particolarmente bene anche al rilascio di principi attivi inclusi nel costrutto e alla creazione di matrici su cui testare nuovi farmaci, contribuendo cos? al loro sviluppo in modo pi? veloce, meno invasivo, meno oneroso ed eticamente corretto.
Un fattore determinante nella preparazione delle strutture descritte ? il tipo di inchiostro, che, proprio per il fatto di dover dare luogo a scaffold con caratteristiche molto peculiari, deve avere requisiti ben precisi sia dal punto di vista tecnico (per esempio, facilit? di lavorazione) sia dal punto vista biologico, quali biocompatibilit? e bassissima o nulla tossicit?.
Ad oggi gli inchiostri pi? comuni noti all?esperto del ramo sono costituiti sostanzialmente da polimeri biocompatibili tra i quali si ricordano, gelatina, acido ialuronico, fibroina, alginato, cellulosa, variamente modificati e/o miscelati tra loro.
Per esempio, WO2011088213 descrive inchiostri formati da acido ialuronico e gelatina, derivatizzati con anidride metacrilica e fotopolimerizzati con luce UV in presenza di un fotoiniziatore; H?lzl K et al. (Biofabrication 2016, 8(3):032002) descrive un inchiostro a base di acido ialuronico esterificato con anidride pentaenoica che polimerizza in presenza di uno specifico fotoiniziatore; Yin J. (ACS Appl. Mater. Interfaces 2018, 10, 6849-6857) descrive le caratteristiche di inchiostri a base di gelatina crosslinkata con metacrilato, ulteriormente miscelata a gelatina per migliorarne la stampabilit?.
In generale, nello stato dell'arte, a prescindere dal polimero impiegato, la polimerizzazione avviene attraverso l?impiego di un fotoiniziatore, che ? potenzialmente tossico, come tossico ? il metacrilato impiegato per la modifica chimica del polimero di partenza.
Scopo della presente invenzione ? quindi quello di individuare inchiostri che superano gli inconvenienti degli inchiostri secondo lo stato dell'arte.
Gli inchiostri, oggetto della presente invenzione, infatti, non prevedono l?uso di fotoiniziatori e non impiegano sostanze tossiche per la derivatizzazione del polimero di partenza, dando quindi origine a materiali con un elevatissimo profilo di sicurezza, sia quando vengono usati in quanto tali sia quando contengono anche materiale cellulare.
Essi sono inoltre dotati di tutte le caratteristiche funzionali, reologiche e meccaniche che li rendono atti all?impiego sia nel 3D-printing sia nel 3D-bioprinting; proprio per questa ragione, e per semplicit?, gli inchiostri descritti nella presente invenzione sono definiti sempre come bio-inchiostro o bioink, anche quando non contenenti cellule.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
E' oggetto della presente invenzione un bio-inchiostro per stampa 3D, cio? un inchiostro da impiegarsi sia nel settore del 3D-printing sia nel settore del 3D-bioprinting, comprendente un coniugato fotocrosslinkabile di acido ialuronico e linker fotoreattivo bifunzionale, o un coniugato fotocrosslinkabile di gelatina e linker fotoreattivo bifunzionale, o miscele dei due coniugati fotocrosslinkabili. Ulteriore oggetto dell?invenzione ? un coniugato di gelatina e di un linker fotoreattivo bifunzionale legati attraverso un legame ammidico, detto linker essendo costituito da umbelliferone e da uno spaziatore trietilenglicolico legati attraverso un legame etereo, detto coniugato essendo fotocrosslinkabile e avente la struttura di formula (III)
.
Ulteriore oggetto della presente invenzione ? un processo di preparazione di un linker fotoreattivo bifunzionale costituito da umbelliferone legato attraverso un legame etereo:
? a una catena trietilenglicolica,
oppure
? a una catena alchilica lineare C4-C20, preferibilmente ottilica
tale linker essendo in grado di legarsi ad HA o a gelatina attraverso la formazione di un legame ammidico e formare cos? il coniugato di HA o il coniugato di gelatina, fotocrosslinkabili, detto processo comprendendo i seguenti passaggi: i) eterificazione dell?umbelliferone con N-BOC-2-[(2-ptosilossietossi)etossi]etilammina oppure con 8-((terzbutossicarbonil)ammino)(C4-C20 alchil) 4-metilbenzenesolfonato, in presenza di acetone e carbonato di potassio;
ii) reazione di deprotezione del gruppo amminico a temperatura ambiente. La presente invenzione riguarda quindi un bio-inchiostro (bioink) da impiegarsi nel settore del 3D-printing e del 3D-bioprinting, comprendente un coniugato di acido ialuronico fotocrosslinkabile o un coniugato di gelatina fotocrosslinkabile o miscele fotocrosslinkabili dei due, aventi le seguenti caratteristiche:
? totale biocompatibilit?;
? capacit? di far aderire cellule presenti nel sito di impianto, e di farle successivamente proliferare;
? capacit? di incapsulare cellule in fase di pre-polimerizzazione, mantenendone intatta la vitalit? post-polimerizzazione;
? bassa viscosit? pre-polimerizzazione a temperature inferiori a quella corporea, cos? da consentire una buona estrusione in fase di stampa, con o senza materiale cellulare al proprio interno;
? una combinazione di viscosit? e yield stress (valore di sforzo tangenziale al di sotto il quale il materiale rimane statico) atti a consentire l'estrusione del materiale e mantenerne la forma dopo estrusione per un tempo sufficiente a far avvenire il crosslinking;
? sterilizzabilit?; i bioink secondo la presente invenzione sono sterilizzabili per filtrazione con filtri 0,45? e/o per trattamento termico in autoclave;
? velocit? di polimerizzazione elevata, in modo da ridurre il tempo di esposizione alla luce UV; tale caratteristica ? fortemente desiderata, soprattutto quando il bioink contiene cellule;
? adeguate caratteristiche reologico-meccaniche post-polimerizzazione, differenti a seconda dello specifico ambito di applicazione.
I bio-inchiostri secondo la presente invenzione sono inoltre preparati mediante un processo che impiega reattivi a bassa tossicit? e pericolosit? (non infiammabili, non esplosivi) e il crosslinking avviene senza l?impiego di alcun fotoiniziatore. Tra i vari polimeri noti allo stato dell?arte, particolarmente indicati per gli scopi della presente invenzione sono la gelatina e l?acido ialuronico (HA), resi fotocrosslinkabili mediante coniugazione con un linker fotoreattivo bifunzionale, che, esposto a luce UV di precisa lunghezza d?onda, induce la polimerizzazione attraverso crosslinking, e quindi la solidificazione del bioink, senza la necessit? di impiegare un fotoiniziatore.
Il linker fotoreattivo bifunzionale (che per brevit? definiamo ?linker?) impiegato secondo la presente invenzione ? un linker cumarinico, costituito cio? da un residuo di umbelliferone, legato a uno spaziatore, dove lo spaziatore pu? essere un polietilenglicole, in particolare trietilenglicole (TEG), o una catena alchilica lineare C4-C20, in particolare una catena ottilica.
Il linker fotoreattivo bifunzionale TEG-Umbelliferone ? rappresentato dalla seguente formula (I):
(I)
dove:
R = -NH2 per la formazione di un legame ammidico;
R = -COOH per la formazione di un legame estereo.
Il linker fotoreattivo bifunzionale catena alchilica-Umbelliferone ? rappresentato dalla seguente formula (II):
Lo spaziatore quindi, qualunque esso sia, a una estremit? si lega sempre all?umbelliferone attraverso un legame etereo e all?altra estremit? si lega al polimero prescelto, cio? HA o gelatina. Lo spaziatore ? opportunamente funzionalizzato in relazione al tipo di legame che deve creare col polimero, estereo o ammidico. Pi? precisamente:
? il legame tra il linker umbelliferone-polietilenglicole e HA pu? essere un legame estereo o ammidico;
? il legame tra il linker umbelliferone-alchile e HA ? esclusivamente ammidico;
? il legame tra il linker, umbelliferone-polietilenglicole o umbelliferonealchile, e gelatina ? sempre ammidico.
La gelatina ? il prodotto della denaturazione del collagene, ? solubile in acqua nella quale crea soluzioni viscose, ed ? riconosciuta come GRAS (Generally Recognized As Safe) dall?ente regolatorio statunitense FDA.
E? ampiamente usata nel settore alimentare, farmaceutico, cosmetico, e nutraceutico, all?interno di integratori alimentari per il benessere di pelle, capelli ed articolazioni. Rispetto al collagene da cui viene prodotta, la gelatina ? molto meno immunogenica, ma conserva invece i domini RGD (sequenza amminoacidica Arginina-Glicina-Acido Aspartico), che le attribuiscono effetti di stimolo su migrazione, proliferazione e differenziamento cellulare, e i siti di attacco per la degradazione da parte delle MMP (Matrix Metallo Proteinase), che la rendono degradabile enzimaticamente.
La gelatina preferibilmente impiegata nell?ambito della presente invenzione ? di origine bovina di tipo B (ottenuta cio? per idrolisi basica del collagene) e ha circa 225 g Bloom (capacit? di gelificazione in seguito a raffreddamento, calcolata secondo USP XX (1990) 1017).
Il coniugato fotocrosslinkabile di gelatina si ottiene per coniugazione dei carbossili della gelatina mediante ammidazione con un linker fotoreattivo bifunzionale, costituito da un residuo di umbelliferone legato a uno spaziatore polietileglicolico, preferibilmente trietilenglicole, o a una catena alchilica lineare C4-C20, preferibilmente una catena ottilica.
Pi? preferibilmente, il coniugato fotocrosslinkabile della gelatina si ottiene per coniugazione dei carbossili della gelatina mediante ammidazione con un linker fotoreattivo bifunzionale, costituito da un residuo di umbelliferone legato a uno spaziatore trietilenglicolico.
Essa viene quindi coniugata col linker fotoreattivo come sopra descritto, preferibilmente col linker TEG-umbelliferone, attraverso la formazione di un legame ammidico che coinvolge i carbossili della gelatina e lo spaziatore opportunamente funzionalizzato, ottenendo il coniugato di formula (III) sotto mostrato
L?acido ialuronico ? un etero-polisaccaride composto da residui alternati di acido D-glucuronico e N-acetil-D-glucosammina, a catena lineare, con peso molecolare che pu? variare tra 400 e 3x10<6 >Da, a seconda della fonte di estrazione o del metodo di preparazione impiegati. HA ? presente in ogni distretto dell?organismo biologico, ed ? coinvolto in moltissimi processi relativi al supporto meccanico delle cellule di molti tessuti come la pelle, i tendini, i muscoli e la cartilagine. HA ? determinante nel processo di riparazione tissutale sia dal punto di vista strutturale sia come sostanza stimolatrice di una vasta serie di processi in cui interviene direttamente ed indirettamente (Weigel P. et al., J Theoretical Biol, 1986:219-234; Abatangelo G. et al., J Surg Res, 1983, 35:410-416; Goa K. et al., Drugs, 1994, 47:536-566). Inoltre HA ? dotato di attivit? antiinfiammatoria, perch? modula il rilascio di citochine, in particolare IL-1, e di attivit? analgesica, in quanto si lega a recettori specifici per gli oppiodi.
Dal punto di vista chimico, la molecola di HA ? dotata di numerosi gruppi funzionali che la rendono variamente modificabile, per esempio per salificazione con basi organiche o inorganiche, per esterificazione con alcoli di varia natura, per ammidazione con ammine non terapeuticamente attive.
L?acido ialuronico di partenza per la preparazione dei bioink o bioinchiostri qui descritti pu? essere prodotto e purificato secondo metodi noti, ad esempio, per estrazione da creste di gallo (EP138572), per fermentazione da Streptococcus (WO2018020458; WO2019016699), per biosintesi da Bacillus (WO2012032154). E? preferito HA prodotto e purificato da Streptococcus o da Bacillus, pi? preferibilmente da Streptococcus, con PM medio ponderale compreso tra 100.000 e 250.000 Da, preferibilmente tra 180.000 e 230.000 Da, definito per brevit? ?PM 200 kDa?, oppure HA con PM medio ponderale compreso tra 500.000 e 730.000 Da.
Per Peso Molecolare (PM) medio si intende il PM medio ponderale calcolato col metodo della ?intrinsic viscosity? (Terbojevich et al., Carbohydr Res, 1986, 363-377).
Nell?ambito della presente invenzione i coniugati di interesse si ottengono per esterificazione o ammidazione del carbossile di HA con un linker fotoreattivo bifunzionale come sopra descritto, preferibilmente costituito da trientileglicole legato a umbelliferone, ottenendo i coniugati di formula (IV) e (V) sotto mostrati: HA-TEG-Umbelliferone Estere (IV)
HA-TEG-Umbelliferone Ammide (V)
Il legame HA-linker fotoreattivo bifunzionale origina, dopo polimerizzazione per crosslinking, materiali a differente grado di degradabilit? a seconda che si tratti di un legame estereo (pi? degradabile) o ammidico (meno degradabile), mantenendo per? intatte le caratteristiche di biocompatibilit? e non tossicit?.
Il coniugato fotocrosslinkabile di acido ialuronico si ottiene per coniugazione del carbossile dell?acido ialuronico mediante esterificazione o ammidazione con un linker fotoreattivo bifunzionale, costituito da un residuo di umbelliferone legato a uno spaziatore polietileglicolico, preferibilmente trietilenglicole, o a una catena alchilica C4-C20, preferibilmente una catena ottilica.
Pi? preferibilmente, detto coniugato fotocrosslinkabile di acido ialuronico si ottiene per coniugazione del carbossile dell?acido ialuronico mediante ammidazione con un linker fotoreattivo bifunzionale, costituito da umbelliferone legato a uno spaziatore trietilenglicolico; ancora pi? preferibilmente l?acido ialuronico di partenza viene preparato e purificato da Streptococcus (WO2018020458; WO2019016699) e ha un PM medio ponderale compreso tra 100.000 e 250.000 Da, preferibilmente tra 180.000 e 230.000 Da.
Tali derivati sono gi? noti all?esperto del ramo: WO2014122580 ne descrive la sintesi e ne rivendica la capacit? di formare idrogel o spugne ?a memoria di forma?, cio? molto resistenti, compatti e in grado di mantenere la loro forma anche dopo taglio, torsione e manipolazione.
Nell?ambito della presente invenzione ? dimostrato che tali derivati, normalmente impiegati nel trattamento di lesioni osteoartrosiche e cartilaginee, nella prevenzione delle adesioni post-chirurgiche, nel riempimento di tessuti molli e di lesioni profonde e cavitate, sono atti all?uso come bioink per la produzione di costrutti attraverso stampa 3D.
Oggetto della presente invenzione ? quindi anche l'uso dei bio-inchiostri qui descritti per la produzione di costrutti attraverso stampa 3D.
La richiedente ha inoltre messo a punto un nuovo processo di preparazione del linker fotoreattivo bifunzionale, atto alla formazione di un successivo legame ammidico, che rispetto a quanto descritto in WO2014122580, impiega reagenti non tossici e non infiammabili, ? pi? veloce, pi? economico, globalmente pi? sicuro e industrialmente pi? conveniente.
La presente invenzione riguarda quindi anche un processo di preparazione di un linker fotoreattivo bifunzionale costituito da umbelliferone legato attraverso un legame etereo:
? a una catena trietilenglicolica (TEG),
oppure
? a una catena alchilica lineare C4-C20, preferibilmente ottilica
tale linker essendo in grado di legarsi ad HA o a gelatina attraverso la formazione di un legame ammidico e formare cos? il coniugato di HA o il coniugato di gelatina, fotocrosslinkabili, detto processo comprendendo i seguenti passaggi: i) eterificazione dell?umbelliferone con N-BOC-2-[(2-ptosilossietossi)etossi]etilammina oppure con 8-((terzbutossicarbonil)ammino)(C4-C20 alchil) 4-metilbenzenesolfonato, in presenza di acetone e carbonato di potassio;
ii) reazione di deprotezione del gruppo amminico a temperatura ambiente. Sinteticamente, il suddetto processo prevede due sole fasi distinte: dapprima la fase di eterificazione in cui l?umbelliferone viene legato a un reattivo N-BOC 2-[(2-p-tosilossietossi)etossi]etilammina oppure 8-((terz-butossicarbonil)ammino) (C4-C20 alchil) 4-metilbenzenesolfonato, preferibilmente 8-((terzbutossicarbonil)ammino)octil 4-metilbenzenesolfonato (commercializzato da Ambeed) attraverso una reazione veloce e pulita che prevede l?impiego di acetone come solvente a riflusso e carbonato di potassio come base.
Successivamente il gruppo amminico viene deprotetto in un tempo compreso tra 1 e 6 ore, a temperatura ambiente, fornendo il prodotto desiderato (Umbelliferone-TEG-NH2 oppure Umbelliferone-C4-C20-alchile-NH2) con resa quantitativa, senza necessit? di ulteriore purificazione.
Rispetto a quanto descritto in WO2014122580, il processo sopra descritto presenta numerosi vantaggi:
la sintesi ? pi? veloce ed economica, richiedendo due soli passaggi invece dei cinque passaggi previsti in WO'580. Inoltre si utilizza un quantitativo notevolmente inferiore di solventi; si evita l?impiego di sodio azide, che comporta un elevato rischio chimico; si evita un?idrogenazione che prevede l?utilizzo di Pd/C (Palladio/Carbone) come catalizzatore; il Palladio, per la sua potenziale tossicit?, deve anche essere smaltito come rifiuto speciale.
Il bioink secondo la presente invenzione, sia quando costituito dal coniugato di HA o dal coniugato di gelatina sia quando costituito da una miscela dei suddetti coniugati, pu? opzionalmente essere ulteriormente miscelato con materiale cellulare, quale a titolo esemplificativo cellule del tessuto connettivo, osseo, cartilagineo muscolare o cellule mesenchimali e/o con ulteriori componenti scelte tra i seguenti derivati dell'acido ialuronico noti allo stato dell?arte quali:
? derivati ammidici come descritti in EP1095064 e EP1853279. Sono preferiti i derivati ammidici della serie alifatica, in particolare l?ammide esadecilica preparata da un HA con peso molecolare medio ponderale compreso tra 500 kDa e 730 kDa, ed avente un grado medio di ammidazione compreso tra 0,1% e 10% molare, preferibilmente compreso tra 1% e 3% molare, rilevato mediante HPLC dopo idrolisi dell?ammide e coniugazione dell?esadecilammina liberatasi con una sostanza fluorofora. L?ammide esadecilica avente le caratteristiche sopra enunciate e grado medio di derivatizzazione compreso tra 1% e 3% molare ? descritta in EP1853279 ed ? disponibile con la denominazione di HYADD?-4;
? esteri interni autocrosslinkati con una percentuale di esterificazione non superiore al 20%, preferibilmente tra lo 0.05 e il 10%, come descritto in EP 0341745 e noti allo stato dell?arte come ACP?;
? derivati crosslinkati, ottenuti mediante l?impiego di agenti crosslinkanti quali BDDE (1,4-Butandiolo diglicil etere), con un grado di derivatizzazione tra 2,5 e 25% molare, preferibilmente tra 5 e 15% molare rispetto all?unit? ripetitiva dell?acido ialuronico, e preparati a partire da HA con PM medio ponderale compreso tra 500 e 730 kDa, come descritto in EP2470230, e noti col nome HBC. La miscelazione con gli ulteriori derivati di HA migliora e rende modulabili le caratteristiche reologiche del bioink e ne aumenta la resistenza all?azione degradativa delle ialuronidasi (Pavan 2016), rendendoli quindi adatti a qualsiasi tipo di applicazione.
Preferibilmente, il bioink pu? comprendere quale ulteriore derivato di HA
? ammidi descritte in EP1095064 e EP1853279, preferibilmente l?ammide esadecilica preparata da un HA con peso molecolare medio ponderale compreso tra 500 kDa e 730 kDa, ed avente un grado medio di ammidazione compreso tra 0,1% e 10% molare, preferibilmente compreso tra 1% e 3% molare (HYADD?-4);
? esteri interni autocrosslinkati con una percentuale di esterificazione non superiore al 20%, preferibilmente tra lo 0.05 e il 10%, come descritto in EP 0341745 (ACP?);
? crosslinkati ottenuti mediante l?impiego di agenti crosslinkanti quali BDDE (1,4-Butandiolo diglicil etere), con un grado di derivatizzazione tra 2,5 e 25% molare, preferibilmente tra 5 e 15% molare rispetto all?unit? ripetitiva dell?acido ialuronico, e preparati a partire da HA con PM medio ponderale compreso tra 500 e 730 kDa, preparati come descritto in EP2470230 (HBC).
Ancora pi? preferibilmente, il bioink pu? comprendere HYADD?-4 o HBC quale ulteriore derivato di HA.
Il bioink viene preparato con concentrazioni variabili dei polimeri precedentemente descritti, in relazione al risultato che si vuole ottenere, alle condizioni di lavorazione, alla presenza o meno di cellule all?interno del bioink stesso.
In particolare, il bioink pu? comprendere
? HA coniugato con il linker fotoreattivo bifunzionale via legame estereo o ammidico come precedentemente descritto, a concentrazioni variabili da 20 a 60 mg/mL, preferibilmente uguale a 40 mg/mL;
? gelatina coniugata con il linker fotoreattivo bifunzionale via legame ammidico, a concentrazioni variabili da 20 a 60 mg/mL, preferibilmente uguale a 40 mg/mL;
? miscele di coniugato di HA e coniugato di gelatina, variamente composte in relazione al materiale da produrre, la concentrazione totale delle due componenti in miscela variando da 30 a 70 mg/mL, e preferibilmente essendo uguale a 60 mg/mL; preferibilmente, rispetto alla suddetta concentrazione totale, la concentrazione del coniugato di gelatina varia da 15 a 30 mg/mL, ed ? preferibilmente uguale a 20 mg/mL;
? miscele con HBC, HYADD?-4, ACP?: in questo caso il polimero aggiuntivo (scelto tra HBC, HYADD?-4, ACP?) ? miscelato in un rapporto che varia da 1:1 a 5:1, preferibilmente da 3:1 a 4:1 con il coniugato di HA o con il coniugato di gelatina. La concentrazione totale complessiva delle componenti che formano la miscela varia da 20 a 60 mg/mL, preferibilmente da 40 a 50 mg/mL. Al fine di meglio illustrare gli scopi e i vantaggi della presente invenzione sono forniti alcuni esempi che, tuttavia, non costituiscono in alcun modo una limitazione della portata delle rivendicazioni.
Esempio 1: Sintesi del coniugato HA-TEG-Umbelliferone via legame estereo da HATBA PM 200 kDa (come da Es. 9 WO2014122580)
Brevemente, in un reattore in vetro dotato di camicia termostatabile a glicole e agitazione magnetica, 2,0 g di HATBA (HA tetrabutilammonio) sono stati sciolti in 240 mL di DMSO anidro e addizionati con 521 mg di 7-(2-(2-(2-iodoetossi)etossi)etossi)-2H-cromen-2-one (preparato come da Esempio 3 WO2014122580). La reazione procede per 48 ore a 40?C; successivamente, viene aggiunta sotto agitazione una soluzione satura di NaBr, quindi si effettua la precipitazione mediante aggiunta di EtOH. Il prodotto viene purificato mediante lavaggi in EtOH/H2O 95:5 e in EtOH assoluto, quindi seccato sotto alto vuoto. Il prodotto cos? ottenuto viene analizzato mediante FT-IR, RP-HPLC e 1H NMR, rivelando una funzionalizzazione pari al 32% ed una resa del 92%.
Esempio 2: Sintesi del linker Umbelliferone-TEG-ammina da legare ad HA o gelatina via legame ammidico (2 steps)
Step 1 di 2: sintesi t-butil (2-(2-(2-((2-osso-2H-cromen-7-il)ossi)etossi) etossi)etil)carbammato
In un pallone a due colli dotato di agitazione magnetica, flusso d?azoto, bagno ad olio e refrigerante s?introduce umbelliferone (221 mg), K2CO3 (0,94 g; 5 eq) e acetone anidro (10 mL), seguiti da 18-crown-6 in quantit? catalitica (0,01 eq), quindi N-BOC 2-[(2-p-tosilossietossi)etossi]etilammina (0,49 g; 0,85 eq). Si lascia procedere la reazione a riflusso sotto agitazione per 48 ore. Si filtra la miscela di reazione raffreddata su imbuto Gooch e si rimuove l?acetone a bassa pressione. Si riprende con DCM (diclorometano), e si estrae con H2O:NaHCO3
(sat) 1:1. La fase organica, passata su MgSO4?12H2O, viene seccata a rotavapor e pompa meccanica. Analisi 1H NMR e HPLC-MS confermano la formazione del prodotto desiderato sotto forma di olio giallino-bruno (0,50 g; resa: 94%).
Step 2 di 2: sintesi 7-(2-(2-(2-amminoetossi)etossi)etossi)-2H-cromen-2-one In un pallone a due colli, contenente t-butil (2-(2-(2-((2-osso-2H-cromen-7-il)ossi)etossi)etossi)etil)carbammato (0,50 g), si crea un?atmosfera anidra. S?introduce quindi DCM (10 mL), acqua Milli-Q? (200 ?L) (acqua distillata o bidistillata), seguita da TFA (acido trifluoroacetico - 20,0 mL), e si lascia procedere la reazione sotto agitazione, a temperatura ambiente, per 3 ore. Si rimuove il solvente tramite rotavapor, riprendendo per 3 volte con DCM, quindi si secca a rotavapor e in pompa meccanica per una notte. Un?analisi HPLC-MS conferma la natura del prodotto desiderato, a purezza cromatografica 95%.
Esempio 3: Sintesi del coniugato HA-TEG-Umbelliferone via legame ammidico da HANa PM 200 kDa
In un pallone a due colli dotato di agitazione magnetica e flusso di azoto, HANa 200 kDa (1,20 g; 2,99 mmol) viene disciolto in 40 mL di buffer MES (acido 2-(Nmorfolino)etansolfonico) 0,1 M a pH=6, a temperatura ambiente. A dissoluzione completata si aggiungono 516 mg di N-(3-dimetilamminopropil)-N-etilcarbodiimmide idrocloruro (EDC?HCl), 310 mg di N-idrossisuccinimmide e 7-(2-(2-(2-amminoetossi)etossi)etossi)-2H-cromen-2-one (pre-disciolto in 10 mL di MES), quindi si lascia procedere la reazione in atmosfera anidra a 25?C per 18 ore. Si dializza la miscela di reazione per 2 giorni contro acqua milli-Q e si liofilizza, ottenendo 1,496 g di liofilizzato bianco. Si ridiscioglie il liofilizzato in acqua milli-Q, si aggiunge NaCl(saturo) (1/10 del volume di acqua), si precipita da EtOH agitando vigorosamente la soluzione. Al termine, si effettuano lavaggi con miscela idroalcolica EtOH/H2O 9:1, quindi un lavaggio finale con EtOH(abs.). Si rimuove il solvente a bassa pressione, ottenendo il prodotto sotto forma di solido polverulento bianco (1,50 g; resa quantitativa). Il grado di derivatizzazione molare ? pari al 10-11% mol/mol (NMR). Un?analisi del titolo tramite HPLC dimostra l?assenza di cumarina libera.
Esempio 4: sintesi del coniugato Gelatina-TEG-Umbelliferone
In un pallone a due colli da 100 mL dotato di agitazione magnetica e bagno a glicole s?introducono 60 mL di PBS (tampone fosfato) 0,01 M, pH = 7,4 e 1,2 g di gelatina bovina, quindi si porta la temperatura a 50?C per 10 minuti. Si lascia raffreddare a 30?C e si degasa la miscela di reazione in flusso di azoto per 10 minuti. Si aggiungono 0,38 g di N-(3-dimetilamminopropil)-N-etil-carbodiimmide idrocloruro (EDC?HCl), 0,23 g di N-idrossisuccinimmide e 1,30 g di 7-(2-(2-(2-amminoetossi)etossi)etossi)-2H-cromen-2-one, mantenendo il pH della soluzione tra 5 e 6. Si lascia procedere sotto agitazione a 30?C per 24 ore. Si filtra la miscela di reazione su RC (cellulosa rigenerata) da 0,45 ?m, quindi si dializza per 2 giorni contro acqua Milli-Q?. Infine si liofilizza, ottenendo un liofilizzato biancogiallastro (0,74 g, resa: 57%). Il grado di sostituzione molare, calcolato tramite UV, ? risultato pari al 28%.
Esempio 5: sintesi del linker Umbelliferone-octilammina da legare ad HA via legame ammidico
Step 1 di 2: sintesi terz-butil (8-((2-osso-2H-cromen-7-il)ossi)octil) carbammato
In un pallone a due colli dotato di agitazione magnetica, flusso d?azoto, bagno ad olio e refrigerante s?introduce umbelliferone (221 mg), K2CO3 (0,94 g; 5 eq) e acetone anidro (10 mL), seguiti da 18-crown-6 in quantit? catalitica (0,01 eq), quindi 8-((terz-butossicarbonil)ammino)octil 4-metilbenzenesolfonato (0,49 g; 0,85 eq). Si lascia procedere la reazione a riflusso sotto agitazione per 48 ore. Si filtra la miscela di reazione raffreddata su imbuto Gooch e si rimuove l?acetone a bassa pressione. Si riprende con DCM, e si estrae con H2O:NaHCO3(sat) 1:1. La fase organica, passata su MgSO4?12H2O, viene seccata a rotavapor e pompa meccanica. Analisi 1H NMR e HPLC-MS confermano la formazione del prodotto desiderato sotto forma di olio giallino-bruno (0,50 g; resa: 94%).
Step 2 di 2: sintesi 7-((8-amminooctil)ossi)-2H-cromen-2-one
In un pallone a due colli, contenente terz-butil (8-((2-osso-2H-cromen-7-il)ossi)octil)carbammato (0,50 g), si crea un?atmosfera anidra. S?introduce quindi DCM (10 mL), acqua milli-Q (200 ?L), seguita da TFA (20,0 mL), e si lascia procedere la reazione sotto agitazione, a temperatura ambiente, per 3 ore. Si rimuove il solvente tramite rotavapor, riprendendo per 3 volte con DCM, quindi si secca a rotavapor e in pompa meccanica per una notte. Un?analisi HPLC-MS conferma la natura del prodotto desiderato, a purezza cromatografica 96%.
Esempio 6: sintesi HA-ottil-umbelliferone da HANa 200 kDa
In un pallone a due colli dotato di agitazione magnetica e flusso di azoto, HANa 200 kDa (1,20 g; 2.99 mmol) viene disciolto in 40 mL di buffer MES 0,1 M a pH=6, a temperatura ambiente. A dissoluzione completata si aggiungono 516 mg di N-(3-dimetilamminopropil)-N-etil-carbodiimmide idrocloruro (EDC?HCl), 310 mg di N-idrossisuccinimmide e 7-(2-(2-(2-amminoetossi)etossi)etossi)-2H-cromen-2-one (pre-disciolto in 10 mL di MES), quindi si lascia procedere la reazione in atmosfera anidra a 25?C per 18 ore. Si dializza la miscela di reazione per 2 giorni contro acqua milli-Q e si liofilizza, ottenendo 1,496 g di liofilizzato bianco. Si ridiscioglie il liofilizzato in acqua milli-Q, si aggiunge NaCl(saturo) (1/10 del volume di acqua), si precipita da EtOH agitando vigorosamente la soluzione. Al termine, si effettuano lavaggi con miscela idroalcolica (EtOH/H2O 9:1), quindi un lavaggio finale con EtOH(abs.). Si rimuove il solvente a bassa pressione, ottenendo il prodotto sotto forma di solido polverulento bianco (1,50 g; resa quantitativa). Il grado di derivatizzazione molare ? pari al 9,1% mol/mol (GPC-UV), o 10-11% (NMR). Un?analisi del titolo tramite HPLC dimostra l?assenza di cumarina libera.
Esempio 7: Formulazione di bioinchiostri
Sono stati formulati i bioinchiostri contenenti le seguenti componenti:
FID-E: HA-TEG-Umbelliferone estere, preparato come da Esesmpio 1;
FID-A: HA-TEG-Umbelliferone ammide, preparato come da Esempio 3;
GEL: gelatina-TEG-Umbelliferone, preparato come da Esempio 4.
7.1 Formulazione di FID-E 40 mg/mL
In un becker di vetro sono stati pesati 400 mg di FID-E preparato come da Esempio 1; si aggiungono 10 mL di soluzione salina (NaCl 0,9%) e si lascia sciogliere sotto agitazione magnetica. A dissoluzione completata, si filtra con filtro sterile in cellulosa acetato 0,45 ?m.
7.2 Formulazione di FID-A 40 mg/mL
In un becker di vetro sono stati pesati 400 mg di FID-A preparato come da Esempio 3; si aggiungono 10 mL di soluzione salina (NaCl 0,9%) e si lascia sciogliere sotto agitazione magnetica. A dissoluzione completata, si trasferisce la soluzione in siringhe da 3 mL in vetro e si sterilizza in autoclave a 121?C per 15 minuti.
7.3 Formulazione di FID-E 40 mg/mL GEL 20 mg/mL
In un becker di vetro sono stati pesati 400 mg di FID-E preparato come da Esempio 1 e 200 mg di GEL preparata come da Esempio 4; si aggiungono 10 mL di soluzione salina (NaCl 0.9%) e si lascia sciogliere sotto agitazione magnetica. A dissoluzione completata, si scalda la soluzione a 80 ?C per 5? e si filtra con filtro sterile in cellulosa acetato 0,45 ?m.
7.4 Formulazione di FID-A 40 mg/mL GEL 20 mg/mL
In un becker di vetro sono stati pesati 400 mg di FID-A preparato come da Esempio 3 e 200 mg di GEL preparata come da Esempio 4; si aggiungono 10 mL di soluzione salina (NaCl 0,9%) e si lascia sciogliere sotto agitazione magnetica. A dissoluzione completata, si trasferisce la soluzione in siringhe da 3 mL in vetro e si sterilizza in autoclave a 121?C per 15 minuti.
7.5 Formulazione di FID-E 10 mg/mL HYADD?-4 30 mg/mL
In un becker di vetro sono stati pesati 100 mg di FID-E preparato come da Esempio 1; si aggiungono 10 mL di PBS pH 7.0 e si lascia sciogliere sotto agitazione magnetica. A dissoluzione completata si trasferiscono i 10 mL in una provetta Falcon da 50 mL, si aggiungono 300 mg di HYADD?-4 e si pone in stufa a 80?C per 2 ore, rimescolando con una spatola ogni 20? circa. A preriscaldamento completato, si filtra su pre-filtro da 0,5 mm e si ripartisce in siringhe da 3 mL in vetro e si sterilizza in autoclave a 121?C per 15 minuti.
7.6 Formulazione di FID-E 10 mg/mL HYADD?-4 40 mg/mL
In un becker di vetro sono stati pesati 100 mg di FID-E preparato come da Esempio 1; si aggiungono 10 mL di PBS pH 7,0 e si lascia sciogliere sotto agitazione magnetica. A dissoluzione completata si trasferiscono i 10 mL in una provetta Falcon da 50 mL, si aggiungono 400 mg di HYADD?-4 e si pone in stufa a 80?C per 2 ore, rimescolando con una spatola ogni 20? circa. A preriscaldamento completato, si filtra su pre-filtro da 0,5 mm e si ripartisce in siringhe da 3 mL in vetro e si sterilizza in autoclave a 121?C per 15 minuti.
7.7 Formulazione di FID-E 10 mg/mL HBC 30 mg/mL
In un becker di vetro sono stati pesati 100 mg di FID-E preparato come da Esempio 1; si aggiungono 10 mL di PBS pH 7,0 e si lascia sciogliere sotto agitazione magnetica. A dissoluzione completata si trasferiscono i 10 mL in una provetta Falcon da 50 mL, si aggiungono 300 mg di HBC e si pone in stufa a 80?C per 2 ore, rimescolando con una spatola ogni 20? circa. A pre-riscaldamento completato, si filtra su pre-filtro da 0,5 mm e si ripartisce in siringhe da 3 mL in vetro e si sterilizza in autoclave a 121?C per 15 minuti.
7.8 Formulazione di FID-E 10 mg/mL HBC 40 mg/mL
In un becker di vetro sono stati pesati 100 mg di FID-E preparato come da Esempio 1; si aggiungono 10 mL di PBS pH 7,0 e si lascia sciogliere sotto agitazione magnetica. A dissoluzione completata si trasferiscono i 10 mL in una provetta Falcon da 50 mL, si aggiungono 400 mg di HBC e si pone in stufa a 80?C per 2 ore, rimescolando con una spatola ogni 20? circa. A pre-riscaldamento completato, si filtra su pre-filtro da 0,5 mm e si ripartisce in siringhe da 3 mL in vetro e si sterilizza in autoclave a 121?C per 15 minuti.
La caratterizzazione dei bioink qui sopra descritti ? stata fatta valutandone il comportamento reologico pre- e post-crosslinking al fine di prevederne l?estrudibilit? e le caratteristiche in fase di estrusione e post-estrusione, e il comportamento biologico, cio? l?interazione con specie cellulari, in particolare con cellule incapsulate nel bioink prima dell?estrusione.
Il comportamento reologico pre- e post-crosslinking viene valutato esaminando diversi parametri:
- viscosit? dinamica (?) (pre-crosslinking): si utilizza un reometro dotato di sistema piatto/cono da 1?, aumentando la shear rate (lo sforzo di taglio) da 0.01 s-1 a 2000 s<-1 >a 20?C e monitorando la viscosit? dinamica (?) che in un fluido nonnewtoniano decresce all?aumentare dello shear rate. La capacit? del materiale di fluire in seguito all?applicazione di uno sforzo ? detta shear thinning ed ? un parametro fondamentale per capire se il materiale che si sta valutando ha le caratteristiche reologiche di un bioink. Esiste inoltre una correlazione diretta tra shear thinning e vitalit? di cellule incapsulate nel bioink (Townsend JM et al. Progress in Polymer Science 2019, 91:126-140);
- yield stress (pre-crosslinking) ? definito come il valore di shear stress al di sopra del quale un materiale inizia a fluire e al di sotto del quale rimane statico. In altre parole, se per un materiale ? possibile misurare lo yield stress, ? probabile che quel materiale, una volta stampato, sia in grado di mantenere la forma depositata in seguito a estrusione per il tempo necessario per far avvenire la fotoreticolazione. Per i bioink questo tipo di caratteristica ? da preferire a una viscosit? elevata, in quanto un materiale con yield stress non si deforma nel tempo, a differenza di un materiale ad alta viscosit?.;
- moduli viscoelastici (post-crosslinking): i moduli viscoelastici (G?: modulo elastico; G??: modulo viscoso) vengono valutati sull?idrogel formatosi dopo crosslinking in seguito ad irraggiamento UV per confermare la capacit? dell?idrogel di polimerizzare formando una struttura compatta e in grado di mantenere una forma propria.
Pre-crosslinking
Le miscele testate, in forma di idrogel, sono:
FID-E HYADD?-4 come da Esempio 7.6;
FID-E GEL come da Esempio 7.3.
Le rispettive concentrazioni sono per comodit? riportate anche nelle legende dei grafici rappresentati nelle figure 4-7 allegate.
La valutazione ? stata fatta con un reometro Anton Paar RheoCompass, con sistema piatto/cono da 1?, aumentando lo shear rate da 0,01 s<-1 >a 2000 s<-1 >e monitorando la viscosit? dinamica (?) a 20 ?C, espressa in Pas.sec.
I valori ottenuti per le miscele testate sono rapportati ai corrispondenti valori di Nivea creme, ?gold standard? di stampa (Paxton N et al. Biofabrication 2017, 9, 044107) e di un inchiostro commerciale (Cellink Start).
I grafici riportati nella Figura 1 evidenziano che tutte le miscele testate hanno un comportamento shear thinning.
Yield Stress: per le miscele in esame i valori di yield stress sono stati misurati con un reometro dotato di sistema piatto/cono da 1?, aumentando lo shear stress da 0,01 Pa a 1000 Pa a 25?C, e sono riassunti nella seguente Tabella 1:
I valori di yield stress misurati, molto vicini a quelli di Nivea creme, confermano ulteriormente che le miscele testate sono adatte alle applicazioni secondo la presente invenzione.
Risultati sovrapponibili sono stati ottenuti, a parit? di condizioni, anche per la formulazione di FID-A+GEL preparata come da Esempio 7.4, i cui valori di viscosit? dinamica sono riportati in Figura 2.
Post-crosslinking
Gli idrogel FID-E (da Esempio 7.1) e FID-A (da Esempio 7.2) sono stati sottoposti ad irraggiamento UV (?max: 365 nm) per 30 s a PWR 100 (Dymax BlueWave QX4; output intensity 13.9 W/cm<2>, no focusing lens). I moduli viscoso ed elastico (G?; G??) sono stati valutati con reometro Anton Paar RheoCompass dotato di piatto/piatto parallelo (gap 0,3 mm, strain 10 % e ? da 0,1 a 100 rad/s). Il grafico riportato in Figura 3 dimostra che la transizione soluzione-gel avviene, dando luogo alla formazione di strutture compatte e solide. Il medesimo esperimento ripetuto per FID-E HYADD?-4 dimostra che, come atteso, l?aggiunta di un ulteriore derivato di HA migliora nettamente le propriet? reologiche post-crosslinking (Figura 4).
Per confermare che le caratteristiche viscoelastiche degli idrogel testati sono adatte alle applicazioni secondo la presente invenzione, ? stata eseguita una prova di stampa, di seguito descritta:
3 mL di formulato FID-E HYADD?-4 preparato come da Esempio 7.6 sono stati trasferiti in una cartuccia per stampante 3D (BIO X<TM >? Cellink) ed ? stato stampato un reticolo di dimensioni 3 x 3 cm (Figura 5); al termine della deposizione di ciascuno strato (layer) il materiale ? stato irraggiato a 365 nm per 15 secondi (Figura 6), prima della deposizione dello strato successivo. La stampa viene considerata ultimata dopo la deposizione di 4 strati totali. A processo completato si ? ottenuto un reticolo compatto, maneggiabile e in grado di mantenere stabilmente la forma acquisita dopo irraggiamento (Figura 7).
Il comportamento biologico valuta l?interazione degli idrogel con specie cellulari in vitro, in termini di vitalit? cellulare post-crosslinking.
Sono state testate:
FID-E: HA-TEG-Umbelliferone estere, formulato come da Es. 7.1;
FID-A: HA-TEG-Umbelliferone ammide, formulato come da Es. 7.2;
Vitalit? cellulare dopo incapsulamento in idrogel e crosslinking
La vitalit? cellulare di fibroblasti murini (BALB/3T3 clone A31, ATCC CCL-163) incapsulati in idrogel delle specie in esame ? stata valutata mediante test in vitro a 6 giorni. I fibroblasti murini sono stati tenuti in coltura in medium DMEM (Gibco, cat. n. 41965-039, Italy) contenente siero fetale bovino 10% (Life Technologies, cat. n. 10270106, Italy) in condizioni standard (37?C, 5% CO2) fino a quando essi non hanno raggiunto una confluenza dell?80%.
Le cellule sono quindi state risospese a una concentrazione pari a 7,5?10<5 >cellule/mL in soluzioni degli idrogel prescelti; 300 ?L di tali sospensioni cellulari (2,25?10<5 >cellule) sono stati pipettati in ciascun pozzetto di piastre Multiwell da 24 pozzetti (Sarstedt, cat. n. 83.3922, Germany) e sono stati crosslinkati per 10 s con lampada UV a 365 nm (DYMAX, USA). Successivamente, a ciascun pozzetto ? stato aggiunto 1 mL di medium DMEM (Gibco, cat. n. 41965-039, Italy) contenente siero fetale bovino 10% (Life Technologies, cat. n. 10270106, Italy) e le piastre sono state incubate in condizioni standard (37?C, 5% CO2). Le condizioni sperimentali testate sono state cos? suddivise in tre gruppi:
1) un gruppo di controllo, in cui le cellule sono state seminate direttamente sul pozzetto della piastra (2,25?10<5 >cellule);
2) un gruppo in cui le cellule sono state incapsulate in idrogel di FID-E, 40 mg/mL;
3) un gruppo in cui le cellule sono state incapsulate in idrogel di FID-A, 40 mg/mL.
Ciascuna condizione ? stata testata in triplicato.
Il giorno precedente al time point prestabilito gli idrogel sono stati incubati in condizioni standard (37?C, 5% CO2) con l?enzima Ialuronidasi (52000 UI - Fidia, Italy) al fine di dissolverli e permettere ai fibroblasti di aderire al fondo del pozzetto. Al termine dei tempi di incubazione prestabiliti, la vitalit? cellulare ? stata quantificata mediante il saggio Alamar blue<? >(Life Technologies, cat. n. DAL1025, Italy), secondo le indicazioni fornite dal produttore, al fine di determinare l?attivit? metabolica dei fibroblasti murini, svolta a livello mitocondriale. I dati presentati in Figura 8 sono normalizzati rispetto al controllo; dalla loro analisi ? evidente che sia FID-E sia FID-A hanno fatto registrare ottime percentuali di vitalit? dei fibroblasti murini dopo l?incapsulamento, superiori all'80%, con percentuali migliori per il derivato ammidico (FID-A).
Tale risultato evidenzia che il processo di incapsulamento e di crosslinking degli idrogel non compromette la vitalit? cellulare; il costrutto che si ottiene per crosslinking del bioink secondo la presente invenzione ? quindi popolato di cellule vitali, perci? proliferanti, perci? in grado da fungere come un vero e proprio sostituto di tessuto o d?organo vivente.
Claims (14)
- RIVENDICAZIONI 1. Bio-inchiostro per stampa 3D, comprendente un coniugato fotocrosslinkabile di acido ialuronico e linker fotoreattivo bifunzionale, o un coniugato fotocrosslinkabile di gelatina e linker fotoreattivo bifunzionale, o miscele dei due coniugati fotocrosslinkabili.
- 2. Bio-inchiostro secondo la rivendicazione 1, dove il linker fotoreattivo bifunzionale ? un linker cumarinico, costituito da un residuo di umbelliferone, legato a uno spaziatore, dove lo spaziatore pu? essere un polietilenglicole, preferibilmente trietilenglicole, o una catena alchilica lineare C4-C20, preferibilmente una catena ottilica.
- 3. Bio-inchiostro secondo la rivendicazione 1 o 2, dove il linker fotoreattivo bifunzionale ? scelto tra i linker aventi le seguenti formule (I) o (II):dove: R = - NH2 per la formazione di un legame ammidico; R = - COOH per la formazione di un legame estereo o
- 4. Bio-inchiostro secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, dove il legame tra linker fotoreattivo bifunzionale e acido ialuronico o gelatina ? - un legame estereo o ammidico nel coniugato di acido ialuronico e linker umbelliferone-polietilenglicole; - un legame ammidico nel coniugato di acido ialuronico e linker umbelliferone-C4-C20 alchile; e - un legame ammidico nel coniugato di gelatina e linker umbelliferonepolietilenglicole o linker umbelliferone-C4-C20alchile.
- 5. Bio-inchiostro secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, dove la gelatina ? di origine bovina di tipo B e ha circa 225 g Bloom.
- 6. Bio-inchiostro secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, dove l'acido ialuronico ? prodotto e purificato da Streptococcus o da Bacillus, preferibilmente Streptococcus, avente un PM medio ponderale compreso tra 100.000 e 250.000 Da, preferibilmente tra 180.000 e 230.000 Da, oppure avente un PM medio ponderale compreso tra 500.000 e 730.000 Da.
- 7. Bio-inchiostro secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni dove il coniugato fotocrosslinkabile di acido ialuronico e linker fotoreattivo bifunzionale, ? costituito da acido ialuronico e linker fotoreattivo bifunzionale coniugati mediante legame estereo o ammidico, detto linker consistente in umbelliferone legato a uno spaziatore trietilenglicolico, preferibilmente l?acido ialuronico di partenza essendo preparato e purificato da Streptococcus e avendo un PM medio ponderale compreso tra 100.000 e 250.000 Da, preferibilmente tra 180.000 e 230.000 Da.
- 8. Bio-inchiostro secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni dove il coniugato fotocrosslinkabile di gelatina e linker fotoreattivo bifunzionale, ? costituito da gelatina e linker fotoreattivo bifunzionale coniugati mediante legame ammidico, detto linker consistente in umbelliferone legato a uno spaziatore trietilenglicolico.
- 9. Bio-inchiostro secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, ulteriormente comprendente materiale cellulare e/o ulteriori componenti scelte tra i seguenti derivati dell'acido ialuronico ? derivati ammidici alifatici, preferibilmente l?ammide esadecilica preparata da un HA con peso molecolare medio ponderale compreso tra 500 kDa e 730 kDa, e avente un grado medio di ammidazione compreso tra 0,1% e 10% molare, preferibilmente compreso tra 1% e 3% molare, pi? preferibilmente l?ammide esadecilica con grado medio di derivatizzazione compreso tra 1% e 3% molare (HYADD?-4); ? esteri interni autocrosslinkati con una percentuale di esterificazione non superiore al 20%, preferibilmente tra lo 0.05 e il 10% (ACP?); ? derivati crosslinkati, ottenuti mediante l?impiego di agenti crosslinkanti quali BDDE (1,4-Butandiolo diglicil etere), con un grado di derivatizzazione tra 2,5 e 25% molare, preferibilmente tra 5 e 15% molare rispetto all?unit? ripetitiva dell?acido ialuronico, e preparati a partire da HA con PM medio ponderale compreso tra 500 e 730 kDa (HBC).
- 10. Bio-inchiostro secondo la precedente rivendicazione, dove le ulteriori componenti sono scelte tra HYADD?-4 o HBC.
- 11. Bio-inchiostro secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, comprendente ? HA coniugato con il linker fotoreattivo bifunzionale via legame estere o ammide, a concentrazioni variabili da 20 a 60 mg/mL, preferibilmente uguale a 40 mg/mL; ? gelatina coniugata con il linker fotoreattivo bifunzionale via legame ammidico, a concentrazioni variabili da 20 a 60 mg/mL, preferibilmente uguale a 40 mg/mL; ? miscele di coniugato di HA e coniugato di gelatina, la concentrazione totale delle due componenti in miscela variando da 30 a 70 mg/mL, e preferibilmente essendo uguale a 60 mg/mL; preferibilmente, rispetto alla suddetta concentrazione totale, la concentrazione del coniugato di gelatina varia da 15 a 30 mg/mL, ed ? preferibilmente uguale a 20 mg/mL; ? miscele con HBC, HYADD?-4, ACP?, detto polimero aggiuntivo scelto tra HBC, HYADD?-4, ACP? essendo miscelato in un rapporto che varia da 1:1 a 5:1, preferibilmente da 3:1 a 4:1 con il coniugato di HA o con il coniugato di gelatina, la concentrazione totale complessiva delle componenti che formano la miscela variando da 20 a 60 mg/mL, preferibilmente da 40 a 50 mg/mL.
- 12. Uso del bio-inchiostro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, per la produzione di costrutti mediante stampa 3D.
- 13. Coniugato di gelatina e di un linker fotoreattivo bifunzionale legati attraverso un legame ammidico, detto linker essendo costituito da umbelliferone e da uno spaziatore trietilenglicolico legati attraverso un legame etereo, detto coniugato essendo fotocrosslinkabile e avente la struttura di formula (III) .
- 14. Processo di preparazione di un linker fotoreattivo bifunzionale costituito da umbelliferone legato attraverso un legame etereo: ? a una catena trietilenglicolica, oppure ? a una catena alchilica lineare C4-C20, preferibilmente ottilica tale linker essendo in grado di legarsi ad HA o a gelatina attraverso la formazione di un legame ammidico e formare cos? il coniugato di HA o il coniugato di gelatina, fotocrosslinkabili, detto processo comprendendo i seguenti passaggi: i) eterificazione dell?umbelliferone con N-BOC-2-[(2-ptosilossietossi)etossi]etilammina oppure con 8-((terzbutossicarbonil)ammino)(C4-C20 alchil) 4-metilbenzenesolfonato, in presenza di acetone e carbonato di potassio; ii) reazione di deprotezione del gruppo amminico a temperatura ambiente.
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