KR20240038590A - 가시광선 경화용 바이오잉크 조성물, 이것의 제조 방법 및 프린팅 방법 - Google Patents

가시광선 경화용 바이오잉크 조성물, 이것의 제조 방법 및 프린팅 방법 Download PDF

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강병민
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Abstract

본 발명은 가시광선 경화용 바이오잉크 조성물, 이것의 제조 방법 및 프린팅 방법에 대한 것으로, 구체적으로는 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(decellularization) 처리하여 얻은 세포외 기질(dECM)과, 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 포함하고, 가시광선 조사에 의하여 광가교되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물이며, 이러한 조성물은 분자간 상호작용을 통한 물리적 가교로 기계적 물성이 우수하고, 형태 유지력이 높을 뿐만 아니라, 세포 적합성도 우수한 효과를 가진다.

Description

가시광선 경화용 바이오잉크 조성물, 이것의 제조 방법 및 프린팅 방법 { Bioink compositions for visible light curing, method of manufacturing the same, and method of printing the same }
본 발명은 바이오잉크 조성물에 대한 것으로, 구체적으로는 분자간 상호작용을 통한 물리적 가교로 기계적 물성이 우수하고, 형태 유지력이 높을 뿐만 아니라, 세포 적합성도 우수한 3D(3차원) 프린팅을 위한 가시광선 경화용 바이오잉크 조성물, 이것의 제조방법, 이것의 프린팅 방법, 이것을 이용한 조직 모사체의 제조방법에 관한 것이다.
조직공학 및 재생의학 분야는 장기(organs) 부족 문제점을 극복하기 위하여, 이식 가능한 기능적 조직 구조체를 만드는 데 큰 기회를 제공한다. 이 분야는 질병 기전, 약물 검사, 신약 개발, 독성 검사 등에 활용되는 체외 조직 모델을 개발하는 데도 적용될 수 있다. 기존에는 단순히 세포를 뿌리거나 생체 활성 요소를 가미하여 강화시킨 기능성 생체 재료를 이식하거나, 이러한 생체 재료 기반 이식재에 세포를 주입하는 방식이 대부분을 이루었다. 하지만, 각막 또는 심장 심실과 같은 크고 복잡한 3D 구조로 제작하는 데는 큰 어려움이 있어서, 대체 장기 공급에는 한계를 보였다.
3D 바이오프린팅은 정밀 제어가 가능하고, 지정된 위치에 세포와 재료를 원하는 배치와 구조로 제작할 수 있다. 이 기술은 뛰어난 공정 유연성으로 특히 조직 공학 분야에서 조직 특이적 세포 배열과 구조적 특징의 다양한 모사를 가능하게 하며, 바이오잉크 제조 기술 또한 개발되면서 그렇게 제작된 조직 모사체의 기능을 증가시킬 가능성을 지니고 있다. 그러나 현재까지 개발된 바이오잉크는, 형태 유지 성능과 생체 적합성 사이의 상충적 관계로 인해, 임상적으로 적용 가능한 인간 맞춤형 스케일의 조직 모사체 제작을 위한 다중 스케일 제어에 한계를 지닌다. 또한, 다양한 세포 거동을 지원하는 데 필수적인 실제 조직 내 고유 생화학적 신호가 동반되는 조직 특이적 미세 환경의 재현이 필수적이다. 결과적으로, 3D 조직 모사체를 제작하는 데 있어 공정 제어가 용이하면서도, 생물물리/화학적(biophysical/biochemical) 미세 환경 재현을 가능하게 하는 다기능성 바이오잉크 개발에 대한 수요가 여전히 높은 상태이다.
한편, 탈세포화된 세포외 기질(dECM)은 실제 조직과 장기와 유사한 생체 분자의 성분과 구성을 지닌다는 점에서 조직 모사체 내 복잡한 미세 환경을 모방 및 구현하기 위한 생체 물질로 여겨지고 있다. 오직 하나의 성분만을 포함하는 기존의 천연 바이오잉크(콜라겐, 실크 피브로인, 젤라틴 등)와 대조적으로, dECM은 세포 사양과 분화, 그리고 조직 형태 형성에 기여하는 조직 특이적 인자 및 마이크로스케일의 구조를 제공할 수 있다.
특히, dECM 기반 바이오잉크는 내부의 풍부한 단백질 콜라겐의 분자간 상호작용을 통한 물리적 가교로 열가교성 하이드로겔로 이용될 수 있는 이점을 제공한다. 또한, dECM 기반 바이오잉크에서 생화학적 환경 내 마이크로 스케일의 물리 구조는 다양한 세포 행동의 조절을 용이하게 하며, 조직 재생을 위한 세포외기질(ECM)을 지원한다.
이러한 발전에도 불구하고, 지금까지 dECM 기반 바이오잉크는 충분한 인쇄 적성과 기계적 안정성을 가지지 못하여 3D 조직 모사체를 제작하는 데 있어 실질적 적용이 어렵다는 단점이 있다. 따라서, 임상적으로 적용 가능한 큰 체적의 조직 모사체 제작을 위해 그 형태 유지력을 높이기 위한 지지층 또는 희생층 사용 등의 다양한 전략이 시도되었다. 이러한 전략을 통해 큰 체적을 지니고 복합적인 형태의 구조물을 제작할 수 있지만, 안타깝게도 제작된 구조물의 붕괴 위험을 유발하는 지지층 또는 희생층 제거 등을 비롯한 프린팅 후 물질 처리 과정이 필수적으로 동반되어야 하는 단점이 있다.
dECM 기반 바이오잉크 외 다른 가교제의 첨가, 또는 dECM 기반 바이오잉크의 화학적 변형을 통한 광경화 과정의 투입 등과 같은 방법들도 시도되었다. 그러나 이러한 방법들은 dECM의 기존 생체 활성도가 불가피하게 감소한다는 점에서 제한적일 수 밖에 없다.
최근 들어서는, dECM 내 존재하는 기질 분자 또는 단백질 간의 가교 형성을 유도하는 dECM 기반 바이오잉크 광가교 방식이 채택되고 있다. 광개시제인 리보플라빈(Riboflavin)은 각막 손상을 위한 치료에 사용되는 물질로서 임상적으로 승인되어 적용되고 있다. 하지만, 그 가교 반응을 일으키는 광원은 UVA(365nm)로 이는 세포 독성과 돌연변이 유발성을 보여 전부 기질에 손상을 가할 수 있다고 보고된 바 있다. 또한, 리보플라빈과 UVA를 활용한 광가교 방식은 큰 체적의 조직 모사체 제작에 있어 중요한 가교 속도가 느리고, 효율성이 비교적 낮다는 단점이 있다.
대한민국 등록특허 제10-2145594호 (공고일 : 2020.08.18)
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 분자간 상호작용을 통한 물리적 가교로 기계적 물성이 우수하고, 형태 유지력이 높을 뿐만 아니라, 세포 적합성도 우수한 바이오잉크 조성물을 제공하는 것이 목적이다.
본 발명의 일 실시형태는, 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(decellularization) 처리하여 세포외 기질(ExtraCellular Matrix : ECM)을 준비하는 단계; 상기 준비한 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ruthenium/Sodium PerSulfate : Ru/SPS)을 혼합하여 광가교용 세포외 기질(decellularized Extracellular matrix Ruthenium Sodium persulfate : dERS)을 제조하는 단계; 및 상기 제조한 광가교용 세포외 기질(dERS)에 가시광선을 조사하여 광가교시키는 단계;를 포함하는, 바이오잉크 조성물의 제조 방법이다.
일 구현예로서, 본 발명은 상기 가시광선 조사에 의하여, 세포외 기질(dECM) 내의 타이로신(tyrosine) 간에 디-타이로신 결합(di-tyrosine bonding)이 생성되는 것일 수 있다.
그리고, 상기 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 0.5/5mM 내지 10/100mM 범위 내의 농도로 혼합하는 것이 가능하고, 1/10mM 내지 2/20mM 범위 내의 농도로 혼합하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 가시광선은 400nm 내지 450nm 범위 내의 파장을 갖는 것일 수 있고, 상기 가시광선은 400nm 내지 425nm 범위 내의 파장을 갖는 것도 가능하다.
또한, 상기 가시광선을 조사하는 것은 5초 내지 10분 범위 내의 시간 동안 수행되는 것일 수 있다.
또한, 상기 가시광선을 조사하는 것은 1분 내지 5분 범위 내의 시간 동안 수행되는 것일 수 있다.
또한, 상기 가시광선을 조사하는 것은 3분의 시간 동안 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 광가교시킨 세포외 기질(dERS)을 열가교시키는 단계;를 더 포함하는 것이 가능하다.
본 발명의 다른 일 실시형태는, 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(decellularization) 처리하여 세포외 기질(ECM)을 준비하는 단계; 상기 준비한 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 혼합하여 광가교용 세포외 기질(dERS)을 제조하는 단계; 및 상기 제조한 광가교용 세포외 기질(dERS)을 가시광선이 조사되는 환경에서 프린팅하는 단계;를 포함하는, 바이오잉크 조성물의 프린팅 방법이다.
여기서, 상기 가시광선 조사를 통해, 세포외 기질(dECM) 내의 타이로신(tyrosine) 사이에 디-타이로신 결합(di-tyrosine bonding)을 생성하는 것이 가능하다.
본 발명의 또 다른 일 실시형태는, 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(decellularization) 처리하여 얻은 세포외 기질(dECM)과, 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 포함하고, 가시광선 조사에 의하여 광가교 될 수 있는, 바이오잉크 조성물이다.
여기서, 상기 가시광선 조사에 의하여, 세포외 기질(dECM) 내의 타이로신(tyrosine) 간에 디-타이로신 결합(di-tyrosine bonding)이 생성되는 것일 수 있다.
그리고, 상기 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)은 세포외 기질(dECM)에 1/10mM 내지 10/100mM 범위 내의 농도로 포함되는 것이 가능하다.
본 발명의 또 다른 일 실시형태는, 상기한 바이오잉크 조성물을 가시광선이 조사되는 환경에서 프린팅하는 단계;를 포함하는, 조직 모사체의 제조방법이다.
여기서, 상기 가시광선은 400nm 내지 450nm 범위 내의 파장을 갖는 것일 수 있다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명은 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 이용하고 가시광선으로 광가교시킴으로서, 세포외 기질(dECM) 내의 타이로신(tyrosine) 간에 디-타이로신 결합(di-tyrosine bonding)을 생성할 수 있는 효과가 있다.
이러한 바이오잉크 조성물은 분자간 상호작용을 통한 물리적 가교로 기계적 물성이 우수하고, 형태 유지력이 높을 뿐만 아니라, 세포 적합성도 우수한 효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 광개시제로서 Ru/SPS(2/20mM) 사용한 경우와 비교예로서 LAP, Irgacure 2959, 리보플라빈(riboflavin)을 각각 사용한 경우의, 광가교에 의한 겔화 특성을 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, 광가교가 있거나 또는 없는 타이로신 그룹의 LC-MS / MS 분석 결과이다(** p <0.01).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, Ru/SPS에 의해 시작된 디-타이로신 가교 효과로서, 디-타이로신에 의한 dECM 및 dERS의 자가 형광 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, Ru/SPS에 의해 시작된 디-타이로신 가교 효과로서, dECM 및 dERS 바이오잉크의 형광 강도 결과이다(*** p <0.0001).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, Ru/SPS에 의해 시작된 디-타이로신 가교 효과로서, 졸 분율 결과이다(* p <0.1).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, Ru/SPS에 의해 시작된 디-타이로신 가교 효과로서, 팽윤 비율 결과이다(* p <0.1, ** p <0.01).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라, Ru/SPS에 의해 시작된 디-타이로신 가교 효과로서, 광 활성화 및 열적으로 가교된 dECM 하이드로겔에서의 가교 시간에 따른 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, 2 % hdECM 및 2 % Co-dECM을 사용한 프린트 전과 후의 바이오잉크 유변학적(rheological) 특성으로서, 3분 동안 빛에 노출된 후(광원 : 가시 광선 (30mW cm-2 프린트 후 조건))의 증가된 저장 및 손실 계수(increased storage and loss moduli)를 나타내는 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라, 2 % hdECM 및 2 % Co-dECM을 사용한 프린트 전과 후의 바이오잉크 유변학적(rheological) 특성으로서, 광 활성화 및 열 가교 공정 후 디-타이로신 합성에 의한 압축 계수의 기계적 특성 개선을 나타내는 결과이다(* p <0.1, ** p <0.01).
도 10 내지 도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라, 빛 활성화 가교 시스템과 dERS를 사용하여, 센티미터 수준으로 고 종횡비(high-aspect-ratio) 구조를 갖는 3D 프린팅을 한 결과로서,
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라, 빛 활성화 가교 시스템이 있거나 또는 없는 dECM 및 dERS를 사용하여 제조한 제품의 비교 사진이다.
도 11은 도 10 제품의 높이를 나타내는 결과이다(** p < 0.01).
도 12는 도 10 제품에서 원통형 구조의 너비를 나타내는 결과이다(**** p < 0.0001) (스케일 막대 : 10mm, VIS : 가시광선).
도 13 및 도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라, dERS를 사용한 조직 프린팅 프로세스에 의하여 제조한, 각막 특유의 생화학적 환경을 제공하는 각막 간질(Corneal stroma) 모사체 구조에 대한 것으로,
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라, 안구의 해부학적 이미지를 기반으로 3D 프린트한 곡선 각막을 나타낸다(눈금 막대 : 5mm).
도 14는 도 13에 따라 프린트된 각막에서 Ru/SPS 광개시제가 용해된 상태의 변화를 시간에 따라 나타낸 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라, 심장의 해부학적 이미지(스케일 막대 : 5mm)를 기반으로 심장 특정 생화학 적 환경과 3D 프린팅된 심장을 제공하는 심장 모사체 구조이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라, 2% hdECM과 1/10mM Ru/SPS 를 혼합하여 제조한 hdERS 를 대상으로 가시광선에 노출된 시간(5초, 3분 그리고 10분)에 따른 Live/dead cell 형광 이미지 결과이다.
도 17은 도 16의 이미지 결과에서 단위 면적당 죽은 세포수를 계산한 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라, 2%의 순수 hdECM 과 0.5/5mM, 1/10mM, 그리고 2/20mM Ru/SPS를 각각 혼합한 hdERS 를 대상으로 가시광선에 노출된 시간에 따른 복합 모듈러스 값의 변화를 나타낸 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 천연생체재료(hdECM)와, 다른 천연생체재료인 젤라틴(Gelatin), 그리고 합성화합물재료인 PEGDA를 대상으로 광가교에 의해 젤이 형성되는지 여부를 확인한 사진이다.
도 20은 상기 천연생체재료(hdECM)와 젤라틴(Gelatin), 그리고 합성화합물재료인 PEGDA를 대상으로, 광조사가 되기 전과 후의 complex modulus 를 비교해 본 결과 그래프이다.
도 21은 상기 천연생체재료(hdECM)와 젤라틴(Gelatin), 그리고 합성화합물재료인 PEGDA를 대상으로, Live/dead assay 를 수행하여 생체적합성을 평가한 결과 사진이다.
도 22는 상기 천연생체재료(hdECM)와 젤라틴(Gelatin), 그리고 합성화합물재료인 PEGDA를 대상으로, 흡광도를 평가한 CCK-8 결과이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 발명의 일 실시형태는, 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(decellularization) 처리하여 세포외 기질(ExtraCellular Matrix : ECM)을 준비하는 단계; 상기 준비한 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ruthenium/Sodium PerSulfate : Ru/SPS)을 혼합하여 광가교용 세포외 기질(decellularized Extracellular matrix Ruthenium Sodium persulfate : dERS)을 제조하는 단계; 및 상기 제조한 광가교용 세포외 기질(dERS)에 가시광선을 조사하여 광가교시키는 단계;를 포함하는, 바이오잉크 조성물의 제조 방법이다.
본 발명은 가시광선 경화용 바이오잉크 조성물, 이것의 제조 방법 및 프린팅 방법에 대한 것으로, 구체적으로는 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화 처리하여 얻은 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 혼합하고, 가시광선 조사에 의하여 광가교시키는 것을 특징으로 한다.
먼저, 상기 세포외 기질(ECM)을 준비하는 단계는, 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화 처리하여 세포외 기질(ECM)을 준비하는 것이다. 생체로부터 조직을 분리하고, 탈세포화 처리하고, 세포외 기질을 준비하는 과정이나 방법은 특별히 제한되지 않고, 이 기술분야에 알려진 다양한 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포외 기질(ECM)"은 포유류 및 다세포 생물(multicellular organisms)에서 발견된 조직의 탈세포화를 통해 제조된 세포 성장용 자연 지지체를 의미한다. 상기 세포외기질은 투석 또는 가교화를 통해 더 처리할 수 있다.
상기 세포외 기질은 포유 동물에 있어서 다양한 형태로서 약 90%의 콜라겐을 포함할 수 있다. 다양한 생체 조직에서 유래한 세포외 기질은 각각의 조직에 필요한 고유 역할 때문에 전체 구조체 및 조성이 상이할 수 있다. 상기 “ 유래(derive)", "유래된(derived)"은 유용한 방법에 의해 언급한 원천으로부터 수득한 성분을 의미한다. 예컨대, 세포외 기질-유래 겔은 세포외 기질을 분리하기 위해 기술적으로 알려진 다양한 방법에 의해 조직으로부터 수득한 세포외 기질 성분을 포함하는 겔을 의미한다. 또는, 상기 조직-유래 세포외 기질은 유용한 방법에 의해 특정 조직에서 수득한 성분을 포함하는 세포외 기질을 의미할 수 있다.
상기 세포외 기질은 콜라겐, 엘라스틴(elastins), 라미닌(laminins), 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycans), 프로테오글리칸, 항균제(antimicrobials), 화학유인물질(chemoattractants), 시토카인(cytokines), 및 성장 인자에 제한되지 않는, 구조형 및 비구조형 생체 분자(biomolecules)의 혼합물일 수 있다. 상기 조직은 뇌, 안배(optic cup), 신장, 간, 췌장, 신경관, 위장, 대장, 전립선, 유방, 심장, 침샘(salivary gland), 자궁내막(endometrium), 젖샘(mammary gland), 갑상선, 혀, 및 폐로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 탈세포화 세포외 기질(dECM)은 조직 세포가 95% 이상 제거될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 조직을 탈세포화 용액에서 3 내지 24시간 동안 교반시킬 수 있고, 상기 탈세포화에 의해 상기 조직 세포가 95% 이상 제거될 수 있다. 상기 “ 탈세포화 용액”은 조직 세포를 제거하기 위한 다양한 세제 성분을 포함할 수 있고, 예컨대, 고장성 식염수(hypertonic saline), 과산화 아세트산(peracetic acid), 트리톤-X(Triton-X), SDS 또는 기타 세제 성분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 탈세포화 세포외 기질(dECM)은 건조될 수 있으며, 동결 건조되거나 공기 건조될 수 있다. 상기 건조된 세포외 기질은 박리(tearing), 제분(milling), 절단, 분쇄 및 전단 단계를 포함하는 방법에 의해 세분될 수 있다. 상기 세분된 세포외 기질은 냉동 상태 또는 냉동 건조 상태에서, 분쇄 또는 제분과 같은 방법에 의해 분말 형상으로 가공될 수 있다.
이러한 탈세포화 세포외기질(dECM)은 실제 조직과 장기와 유사한 생체 분자의 성분과 구성을 지닌다는 점에서 조직 모사체 내 복잡한 미세 환경을 모방 및 구현하기 위한 생체 물질로 여겨지고 있다. 그러나, 지금까지 dECM 기반 바이오잉크는 충분한 인쇄 적성과 기계적 안정성을 가지지 못하여 3D 조직 모사체를 제작하는 데 있어 실질적 적용이 어렵다는 단점이 있다. 그래서, dECM 기반 바이오잉크 외 다른 가교제의 첨가, 또는 dECM 기반 바이오잉크의 화학적 변형을 통한 광경화 과정의 투입 등과 같은 방법들도 시도되었다. 그러나 이러한 방법들은 dECM의 기존 생체 활성도가 불가피하게 감소한다는 점에서 제한적일 수 밖에 없다.
이러한 상황에서, 본 발명자들은 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 이용하고 가시광선으로 광가교시킴으로서, 세포외 기질(dECM) 내의 타이로신(tyrosine) 간에 디-타이로신 결합(di-tyrosine bonding)을 생성할 수 있다는 것을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다.
이에 따라, 본 발명은 상기 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 혼합하여 광가교용 세포외 기질(dERS)을 제조한 후, 상기 제조한 광가교용 세포외 기질(dERS)에 가시광선을 조사하여 광가교시키는 단계;를 포함한다.
일 구현예로서, 상기 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)은 루테늄과 황산나트륨이 미리 혼합된 혼합물일 수 있고, 순수한 루테늄과 황산나트륨을 각각 사용하는 것도 가능하다. 상기 루테늄과 황산나트륨의 혼합 또는 사용 비율은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 루테늄과 황산나트륨은 1:10 내지 10:1의 비율로 혼합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "광가교용 세포외 기질(dERS) 또는 dERS"은 탈세포화된 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)이 혼합된 것을 의미한다.
본 발명에 따라 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 이용한 가시광선 유도 가교법은 아래와 같은 장점을 가진다. 첫째, 가시광선 범위(400~450nm) 내에서의 광가교 반응은 UV(350~400nm)를 이용한 가교반응보다 세포의 DNA 손상을 방지할 수 있다. 둘째, 가시광선의 높은 분자 흡광 계수는 비교적 낮은 개시제 농도라도 효율적인 가교 반응을 일으킨다. 셋째, 가시광선에 의한 깊은 침투 깊이는 큰 체적의 구조물을 경화시키는데 유리하다.
루테늄(Ru) 광개시제는 이미 피브린, 콜라겐, 실크 등의 천연 생체 재료에 적용된 바 있다. 본 발명에 따라 루테늄(Ru)과 더불어 가시광선 그리고 황산나트륨(SPS)과 같은 전자 수용체가 있는 경우, 먼저 Ru2+는 Ru3+로 광분해된다. 이렇게 생성된 Ru3+는 세포외 기질에 존재하는 타이로신을 포함한 방향족 잔류물을 산화시킬 수 있다. 산화된 타이로신 그룹은 타이로실 자유 라디칼을 발생시키며, 이 자유 라디칼은 부근 타이로신 간의 다이타이로신 결합을 형성시킴으로써 소모된다(도 2 참조). 이에 따라, 본 발명의 일 구현예는, 상기 가시광선 조사에 의하여, 세포외 기질(dECM) 내의 타이로신(tyrosine) 간에 디-타이로신 결합(di-tyrosine bonding)이 생성되는 것일 수 있다.
dECM 바이오잉크 내에 타이로신 운반 단백질이 풍부하게 포함되어 있다는 점을 고려하여, 본 발명자들은 Ru/SPS 광개시제을 이용한 가시광선 유도 가교법을 통해 dECM 바이오잉크의 가교를 빠르고 세포 친화적인 방식으로 진행시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 이러한 가시광선 기반 광가교성 dECM은 3D 바이오프린팅에 사용될 바이오잉크로서 높은 형태 유지력을 가지고, 큰 체적과 복잡한 구조의 dECM 기반 조직 모사체를 제작하는 데 상당한 잠재력을 가질 것이고, 이러한 사실은 후술하는 실시예에서 확인할 수 있다.
본 발명에서, 상기 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 혼합하는 농도 또는 양은 특별히 제한되지 않는다. 다만, 상기 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 0.5/5mM 내지 10/100mM 범위 내의 농도로 혼합하는 것이 가능하고, 1/10mM 내지 2/20mM 범위 내의 농도로 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 범위 미만이면 광가교 효과가 미흡해서 안정적인 구조체를 제조하기가 어렵고, 상기 범위를 초과하면 Ru3+의 산화능에 의해 세포 적합성이 떨어질 수 있다.
또한, 상기 가시광선은 일반적인 가시광선 범위 내의 파장을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 가시광선은 400nm 내지 450nm 범위 내의 파장을 갖는 것일 수 있고, 400nm 내지 425nm 범위 내의 파장을 갖는 것이 더욱 바람직하다. 상기 범위 미만이면 바이오잉크 조성물의 겔화가 잘 이루어지지 않을 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우 역시 겔화가 잘 이루어지지 않거나 세포 적합성이 떨어질 수 있다.
또한, 상기 가시광선을 조사하는 시간 역시 특별히 제한되지 않지만, 그 중에서도 상기 가시광선을 조사하는 것은 수초 내지 수십분 범위 내의 시간 동안 수행되는 것이 가능하다. 예를 들어, 상기 가시광선을 조사하는 시간은 5초 내지 10분 범위 내의 시간 동안 수행하는 것일 수 있고, 그 중에서도 1분 내지 5분 범위 내의 시간 동안 수행되는 것이 바람직하며, 3분 동안 수행되는 것이 더욱 바람직하다. 가시광선 조사 기간이 상기 범위 미만이면 겔화가 잘 이루어지지 않을 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우 겔화가 잘 이루어지지 않거나 세포 적합성이 떨어질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 광가교시킨 세포외 기질(dERS)을 열가교시키는 단계;를 더 포함하는 것이 가능하다. 열가교는 상온 이상의 온도에서 10분 내지 3시간 이내로 수행할 수 있다. 이와 같이, 광가교 이후에 열가교를 순차적으로 수행하면, 가교 네트워크를 더욱 강화함으로서 형상 유지력을 더욱 높일수 있는 효과가 있다.
본 발명의 다른 일 실시형태는, 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(decellularization) 처리하여 세포외 기질(ECM)을 준비하는 단계; 상기 준비한 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 혼합하여 광가교용 세포외 기질(dERS)을 제조하는 단계; 및 상기 제조한 광가교용 세포외 기질(dERS)을 가시광선이 조사되는 환경에서 프린팅하는 단계;를 포함하는, 바이오잉크 조성물의 프린팅 방법이다.
즉, 상기 세포외 기질(ECM)을 준비하는 단계;와 상기 광가교용 세포외 기질(dERS)을 제조하는 단계;는 상술한 바와 동일하고, 상기 제조한 광가교용 세포외 기질(dERS)을 가시광선이 조사되는 환경에서 프린팅하는 과정을 포함하는, 바이오잉크 조성물의 프린팅 방법이다.
dERS을 프린팅하는 방법은 기존에 dECM을 프린팅하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 노즐에 의한 압출 기반으로 프린팅할 수 있고, 디지털 광 처리 (digital light processing : DLP) 포토 패터닝 방법으로 프린팅하는 것도 가능하다. 다만, 가시광선이 조사되는 환경으로서, dERS을 프린팅하기 전이나 후, 또는 프린팅하는 과정 중에 가시광선을 조사하면서 프린팅하는 것이 가능하다.
이에 따르면, 상기 가시광선 조사를 통해, 세포외 기질(dECM) 내의 타이로신(tyrosine) 사이에 디-타이로신 결합(di-tyrosine bonding)을 생성하는 것이 가능하다.
본 발명의 또 다른 일 실시형태는, 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(decellularization) 처리하여 얻은 세포외 기질(dECM)과, 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 포함하고, 가시광선 조사에 의하여 광가교 될 수 있는, 바이오잉크 조성물이다.
즉, 바이오잉크 조성물에 세포외 기질(dECM)과 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)이 포함되고, 이러한 바이오잉크 조성물은 가시광선 조사에 의해 광가교되는 것을 특징으로 한다. 그러면, 상기 가시광선 조사에 의하여, 세포외 기질(dECM) 내의 타이로신(tyrosine) 간에 디-타이로신 결합(di-tyrosine bonding)이 생성될 수 있다. 또한, 상기 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)은 세포외 기질(dECM)에 0.5/5mM 내지 10/100mM 범위 내의 농도로 포함되는 것이 가능하다. 이에 대해서는 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 일 실시형태는, 상기한 바이오잉크 조성물을 가시광선이 조사되는 환경에서 프린팅하는 단계;를 포함하는, 조직 모사체의 제조방법이다.
가시광선을 조사하는 방법이나 장치는 특별히 제한되지 않고, 이 기술분야에 알려진 다양한 것을 포함할 수 있다. 상기 가시광선은 400nm 내지 450nm 범위 내의 파장을 갖는 것일 수 있다.
상기한 바와 같은, 본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 분자간 상호작용을 통한 물리적 가교로 기계적 물성이 우수하고, 형태 유지력이 높을 뿐만 아니라, 세포 적합성도 우수한 효과를 가진다.
본 발명에 따라 dECM에 Ru/SPS 광개시제를 첨가하여 다이-타이로신 가교 반응을 유도하는 기술은, 광가교성 dERS에 의한 조직 모사체 바이오프린팅의 확장을 가능하게 한다. 다양한 크기와 형태의 조직 모사체를 자유롭게 만들 수 있고, 이것은 조직 공학 및 재생 의학에서 부딪히고 있는 많은 문제들을 해결할 수 있다. dERS의 광가교 방식은 기존 바이오프린팅 시스템의 인쇄 적성을 향상시킬 수 있고, 세포 독성을 야기할 수 있는 광원 또는 물질의 첨가를 배제함으로써 세포 기능 증진과 조직의 성숙을 가능하게 한다. 즉, 본 발명은 프린팅 구조물이 기존에 설계된 형태를 유지할 수 있도록 구조적 안정함을 제공할 뿐 아니라, 조직 모사체로서 생체 기능적 역할까지 우수하게 수행할 수 있는 능력 또한 제공한다는 것이다. 이러한 점을 통해 앞으로 질병 치료를 위한 조직 재생, 체외 조직 및 약물 검사를 위한 질병 모델과 같은 다운스트림(downstream) 임상 응용에 대한 막대한 잠재력을 지니고 있는 것이다. 또한, 본 발명에 따른 광경화성 dERS는 압출 기반 프린팅 시스템과 DLP 시스템에서 모두 적용 가능하다는 점을 확인함으로써, 바이오 패브리케이션 분야에서 활용 가능성이 매우 클 것으로 예측된다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
[실시예]
1. 바이오잉크 조성물의 제조
1-1. hdECM(heart decellularized ExtraCellular Matrix) 분말 제조
돼지 좌심실을 전체 심장에서 분리한 후 기존에 알려진 프로토콜에 따라 탈세포화하였다. 즉, 심장 조직을 1mm 두께로 자르고 수돗물에 1시간 동안 저어 피를 제거하였다. 그 후, 1% 황산도데실나트륨 음이온계면활성제 용액으로 60시간 동안 처리하고, 인산염완충식염수에 희석한 1% 트리톤 X-100 비이온계면활성제로 처리하였다. 세포가 제거된 조직은 이소프로필알코올에 2시간 동안 저었다. 처리한 티슈는 1×인산염완충식염수로 72시간 즉시 세척하여 잔류 세제를 제거하였다. 그 후, 에틸알코올 4%에 희석한 0.1% 페라세트산을 3시간 동안 넣어 살균한 뒤, 1× 인산염완충식염수로 세척하였다. 이렇게 얻은 분말은 나중에 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.
1-2. Co-dECM(Cornea decellularized ExtraCellular Matrix) 분말 제조
전체 각막을 소 눈알에서 해부하여 페니실린(100U mL-1)과 스트렙토마이신(0.1mg mL-1)을 포함한 인산염완충식염수으로 세척하였다. 기질층을 각막으로부터 분리하여 0.5% 트리톤 X-100을 함유한 20mM 수산화암모늄에서 4시간 동안 저었다. 그런 다음, 24시간 동안 저장성의 Tris-HCl 완충액에 24시간 동안 저었고, 37℃의 1% 트리톤 X-100를 포함한 10 mM Tris-HCl 용액에서 24시간 동안 처리하였다. Co-dECM 조직은 50% 에틸알코올에 희석한 1% 페라세트산을 10시간 동안 처리하여 멸균하였으며, 탈세포화 과정 후 밤새 동결 건조시킨 후 액체 질소와 밀링 머신을 이용하여 미세 분말로 저온 분해하여 -80℃에서 보관하였다.
1-3. dECM 바이오잉크 준비
상기 실시예 1-1 및 1-2에서 준비한 각 Co-dECM 및 hdECM 분말 샘플을 펩신 가루를 포함한 0.5M 아세트산 용액에 넣고 72시간 동안 상온에서 용해시켰다. dECM 분말을 녹인 용액은 40 μm의 모공 망사를 이용해서 여과한 후 4°C에 저장하였다. 실험에 앞서 각 Co-dECM과 hdECM 용액은 10N NaOH 수용액을 사용해서 중화(pH 7.4) 하였다. 또한 중성 hdECM 용액에는 10× 인산염완충식염수와 멸균 증류수를 첨가하였다.
1-4. dERS 바이오잉크 제조
상기 실시예 1-3에서 준비한 2% dECM 각각에 Ru/SPS(0.5/5mM, 1/10mM, 2/20mM)를 혼합하였다. 400~450nm 범위의 파장을 갖는 가시광선(30mW cm-2) 아래에 3분간 노출시킴으로써 광가교를 진행하였고, 이후 1시간 동안 37°C에 놓아서 열가교 시켜서 겔화된 구조물을 제조하였다.
2. 광개시제별 바이오잉크 조성물의 겔화 특성 평가
상기 실시예 1-3에서 준비한 2% dECM에 Ru/SPS(2/20mM)를 혼합한 후, 400~450nm 범위의 파장을 갖는 가시광선(30mW cm-2) 아래에 3분간 노출시킴으로써 광가교를 진행하였다.
비교예로서는 상기 실시예 1-3에서 준비한 2% dECM에 기존의 광개시제로서 LAP(Lithium phenyl-2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate) 0.5wt%, Irgacure 2959 0.5wt%, 리보플라빈(riboflavin) 2mM 각각을 400~450nm 범위의 파장을 갖는 가시광선(30mW cm-2) 아래에 3분간 노출시킴으로써 광가교를 진행하였다. 또한, Irgacure 2959의 경우 가시광선보다 350~400nm 범위의 UV 에서 가교시키는 것이 적합하다고 알려진 바, 추가로 UV(350~400nm)에서도 광가교를 진행하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 광개시제로서 Ru/SPS(2/20mM) 사용한 경우와 비교예로서 LAP, Irgacure 2959, 리보플라빈(riboflavin)을 각각 사용한 경우의, 광가교에 의한 겔화 특성을 나타낸 결과이다. 여기에 나타난 바와 같이, 광개시제로서 Ru/SPS을 사용한 경우에는 겔화가 잘 이루어졌지만, LAP와 Irgacure 2959를 사용한 경우에는 겔화가 전혀 이루어지지 않았고, 리보플라빈(riboflavin)을 사용한 경우에는 부분적으로만 겔화가 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 리보플라빈을 400~450nm 범위의 파장을 갖는 가시광선에서 가교시켰을 때 역시 겔화가 이루어지지 않았다.
3. 바이오잉크 조성물의 특성 평가
3-1. dECM 내 다이타이로신으로부터의 자가 형광 측정
상기 실시예 1-4에 따라 제조된 겔화된 구조물을 320nm 파장의 UV 광선 아래에 놓았고, 아이폰 11 프로에 의해 촬영하였다. GNU 이미지 조작 프로그램(GIMP 2.10.22)을 사용하여 흑백으로 변환시키었다.
3-2. 졸 비율과 팽윤 비율
상기 실시예 1에 따라 제조된 겔화된 구조물을 하이드로겔 샘플로 준비하였다. 광가교 및/또는 열가교 후에 모든 샘플의 무게를 측정하여 Miw로 기록했다. 각 조건에서 세 개의 표본을 직접 동결 건조했다. 각각의 조건에서 얻은 또 다른 세 개의 샘플은 밤새 37 °C의 인산염완충식염수에 담갔다. 부은 샘플은 Ms로 무게가 실렸고, Md로 동결 건조된 후 다시 무게가 실렸다.
실제 고분자 중량 분율은 아래 방정식 1을 사용하여 계산하였다.
방적식 1 : m% = Mid/Miw
졸 분율(Msol fraction)과 팽윤 비율(q)은 아래 방정식 2와 3을 사용하여 계산하였다.
방적식 2 : Msol fraction = 100 × (Miw × m%-Md)/(Miw × m%)
방적식 3 : q = Ms/Md
3-3. 액상 크로마토그래피 텐덤 질량분석(LC-MS/MS)
상기 실시예 1에 따라 제조된 겔화된 구조물을 샘플로 준비한 후, LC-MS/MS 분석에 사용하였다. 준비한 샘플은 질소 환경에서 1wt% 페놀을 함유한 4M메타네설폰산을 18시간 동안 처리하여 가수분해하였으며, 가수분해 과정에서 Strata C18-E(55μm, 70Å) 카트리지를 이용한 고체상 추출(SPE)을 실시하여 산을 제거하고 80% 메틸알코올로 녹여서 분리되었다. 용리액은 분석을 위해 0.1% 포름산으로 건조 및 재구성되었다. 2.6μm Kinetex C18 100Å column(150 × 2.1mm)과 애질런트 1290 바이너리 펌프(200 μL min-1)를 사용하여 역상 HPLC-MS/MS 실험을 수행했다. 0.1% 포름산을 포함한 2% 수용성 아세토니트릴로 4분동안 처리하고, 이후 3분을 초과하여 80% 아세토니트릴로 증가시켰으며, 이를 3분 이상 유지한 후 시작 용리액과 평형을 이뤘다. 분석물은 QTRAP 6500 질량 분광계로 전달되었으며 포지티브 이온 모드를 사용하여 다중 반응 모니터링 모드에서 검출되었다. 이온 스프레이는 5.5kV로 설정되었고 온도는 600℃로 설정되었다. 질소는 충돌 가스로 사용되었고 충돌 에너지는 25%로 설정되었다. 정점의 면적은 분석 소프트웨어 v 1.6.2(Sciex)를 사용하여 계산되었다.
3-4. 유변학적 시험
상기 실시예 1에 따라 제조된 겔화된 구조물을 샘플로 준비한 후, 각 바이오잉크 샘플에 대한 안정적인 전단 변화 분석을 4℃에서 수행하여 점도를 평가하였다. 시간 변화 분석을 사용하여 37℃에서 프린팅 후 하이드로겔 샘플의 복합 모듈러스를 측정하였다. 시간 변화 분석을 수행하기 전에 모든 하이드로겔 샘플이 3분 동안 가시광선에 노출되었다. 모든 측정은 세 번 실시되었다.
3-5. 기계적 특성 검사
상기 실시예 1에 따라 제조된 겔화된 구조물을 샘플로 준비하였다. 인장 시험은 최대 하중 및 하중 분해능이 각각 500 × 10-3, 50 × 10-9N인 만능재료시험기를 사용하여 수행되었다. 순수 dECM과 0.5/5mM, 1/10mM, 2/20mM Ru/SPS를 혼합한 dERS로 만들어진 구조물은 5분 동안 인산염완충식염수로 두 번 세척되었다. 그런 다음 구조물을 두 개의 클램프 사이에 고정하고 종이를 기하학적 구속조건으로 삼았다. 용지의 연결을 제거하고, 샘플은 느슨한 부분을 제거하기 위해 미리 적재하고, 고장 날 때까지 0.005s-1의 정해진 변형률로 늘렸다. 탄성 및 탄력성 모듈러스는 각각 응력-변형률 곡선의 선형 영역의 기울기와 면적에서 계산되었다. 특히, 탄성 모듈(Ur)은 방정식 4를 사용하여 계산되었다.
방정식 4 : Ur= (σy*εy)/2
여기서 σy 는 항복 응력이고 εy 는 항복 변형률이다. 압축 시험에서 압축 모듈은 5N 로드 셀이 있는 MTS Criteria 42 기계적 시험기를 사용하였고, 응력-변형률 곡선의 선형 영역(10-15%)에서 측정되었다. 하이드로겔 샘플은 자가 형광 측정 실험에서와 동일하게 준비되었으며, 검사에 앞서 밤새 37℃의 인산염완충식염수에서 추가로 보관되었다. 기계적 시험 동안 샘플은 긴 축과 평행하게 배치되었고 0.01mm s-1의 일정한 크로스헤드 속도로 압축되었다. 실험은 실온에서 수행되었고 0.1N의 프리로드 설정이었다.
3-6. 평가 결과
상기한 바와 같이, 본 발명자들은 dECM 기반 바이오잉크에 Ru/SPS 광개시제를 도입하여 새로운 가시광선 매개 가교 방식을 개발했다. dECM 기반 바이오잉크 내에서 이 가교 반응의 메커니즘을 조사하였고, 가교 반응 후 생성되는 다이타이로신 합성 비율을 조절함으로써 그 다능성(versatility)을 관찰했다. 특히, 멀티스케일의 계층 구조를 가지는 3D 조직 모사체의 제작을 위해 각막 및/또는 심장 유래 dECM 바이오잉크에 이 가교 방식을 적용했다. 서로 다른 체내 시스템으로부터 나온 이 두 종류의 dECM은 혈관과 관련된 대립 특성을 고려하여 선정하였다. 예를 들어, 각막은 혈관이 없는 투명 조직이고, 심장은 맥관성 기관 중 하나이다. 새롭게 개발된 바이오잉크(dERS)는 dECM과 Ru/SPS 광개시제를 혼합하여 준비하였다.
dERS는 가시광선(400~450nm)에 의해 활성화되고 산화되는 메커니즘을 통해 가교가 이루어진다. 가시광선에 노출되면 타이로실 자유 라디칼이 발생하며, 이는 인근 타이로신간의 다이타이로신 결합을 형성시키고 최종적으로 가교 네트워크를 형성한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, 광가교가 있거나 또는 없는 타이로신 그룹의 LC-MS / MS 분석 결과이다(** p <0.01). 필수 아미노산 중 하나인 타이로신은 단백질의 구조적 적합성 전환을 조절하는 유용한 잔류물로서 존재한다. 두 종류의 dECM 내에 가장 풍부한 단백질은 콜라겐으로, 이는 대개 타이로신을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다. LC-MS/MS 분석을 통해 dECM 내에 존재하는 타이로신을 확인하고 정량화하였다. 가시광선에 노출이 없는 비교예(Thermal)과 비교하여, 본 발명에 의하면 가시광선에 노출된 후 dERS 그룹 내에서 타이로신의 양이 현저하게 감소한 것으로 보아, 타이로신간의 다이타이로신 결합이 형성되었음을 간접적으로 알 수 있다(도 2).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, Ru/SPS에 의해 시작된 디-타이로신 가교 효과로서, 디-타이로신에 의한 dECM의 자가 형광 사진이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, Ru/SPS에 의해 시작된 디-타이로신 가교 효과로서, dECM 및 dERS 바이오잉크의 형광 강도 결과이다(*** p <0.0001). dERS 내 다이타이로신 결합의 형성을 직접적으로 확인하기 위해, UV(320nm)에 샘플을 노출시켰을 때 발생하는 자가 형광 강도를 측정했다. 페놀군이 포함된 다이타이로신은 320nm의 흡수광에 반응하여 자가 형광을 방출하는 것으로 보고된 바 있다. 촬영된 형광 사진은 dERS 내 다이타이로신 결합이 형성되었음을 나타낸다(도 3 및 도 4). 2/20mM의 Ru/SPS가 첨가된 dERS 그룹은 0.5/5mM 및 1/10mM 그룹과 비교하였을 때, 다이타이로신 함량이 가장 많음을 나타냈다. 이러한 결과는 상대적으로 고농도의 Ru/SPS가 첨가된 dERS 그룹에서의 트라이타이로신의 형성과 같은 보다 복잡한 가교 메커니즘 때문일 수 있다. 따라서 dERS 가교 반응의 메커니즘을 탐구하는 추가 실험을 수행하는 것은 흥미로울 것이라 판단하였다. 그럼에도 불구하고, 다이타이로신 결합은 dERS의 가교를 진행시키는 주요 요인 중 하나임을 확인하였다.
다음으로 졸 비율 및 팽윤 비율 분석을 통하여 dERS의 물리화학적 특성을 조사하였다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, Ru/SPS에 의해 시작된 디-타이로신 가교 효과로서, 졸 분율 결과이다(* p <0.1). 가교 반응 후 이에 참여하지 않은 중합체의 측정치인 졸 비율은 도 5에 나타난 바와 같이 Ru/SPS의 농도와 반비례의 관계를 가짐을 알 수 있었다(도 5). 이러한 결과는 위 형광 측정 데이터가 나타내는 Ru/SPS의 농도가 증가할수록 다이타이로신 결합이 더 많이 형성된다는 결과에 부합한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, Ru/SPS에 의해 시작된 디-타이로신 가교 효과로서, 팽윤 비율 결과이다(* p <0.1, ** p <0.01). 팽윤 비율 또한 Ru/SPS의 농도와 반비례함을 알 수 있었으며(도 6), 이는 가교 반응이 활발해질수록 더욱 촘촘하게 형성되는 가교 네트워크로 인해 낮아진 졸 비율과 비슷한 경향으로 낮아지는 것으로 보인다. 초 단위로 가교 반응이 이루어진다는 점에서 매우 효율적이고 빠르다고 할 수 있는 가시광선 유도 광가교 방식이 적용된 dECM 기반 바이오잉크, 즉, dERS의 개발을 강조하고자 했다. 먼저, dERS는 pH 조건과 무관하게 광가교가 가능했다. 기존 dECM에는 열가교 방식만 채택되었는데, 이는 콜라겐 성분의 자가 조립 과정에서 결합이 발생 가능한 pH 7.4 부근에서만 가능했다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라, Ru/SPS에 의해 시작된 디-타이로신 가교 효과로서, 광 활성화 및 열적으로 가교된 dECM 하이드로겔에서의 가교 시간에 따른 결과이다. 본 실시예에서 pH 7.4와 3.0 조건 모두에서 dERS가 5초 동안의 가시광선에 노출되었을 때 겔 상태로 변환될 수 있었고, 반면 dECM은 여전히 졸 상태로 남아 있었음을 확인하였다(도 7).
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, 2 % hdECM 및 2 % Co-dECM을 사용한 프린트 전과 후의 바이오잉크 유변학적(rheological) 특성으로서, 3분 동안 빛에 노출된 후(광원 : 가시광선 (30mW cm-2 프린트 후 조건))의 증가된 저장 및 손실 계수(increased storage and loss moduli)를 나타내는 결과이다. hdERS는 3분 동안 가시광선에 노출된 후 hdECM과 비교했을 때 최대 12.8배 향상된 복합 모듈러스를 가졌다(도 8). 기존 dECM에 적용되는 열가교 방식에 추가되어 적용되는 새로운 광가교 방식은 기계적 물성을 개선할 뿐 아니라, 광개시제의 농도에 따라 그 값을 조정할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
더 나아가, 만능재료시험기(UTM)를 사용하여 dERS가 가지는 다른 유형의 기계적 특성을 조사하였다. 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라, 2 % hdECM 및 2 % Co-dECM을 사용한 프린트 전과 후의 바이오잉크 유변학적(rheological) 특성으로서, 광 활성화 및 열가교 공정 후 디-타이로신 합성에 의한 압축 계수의 기계적 특성 개선을 나타내는 결과이다(* p <0.1, ** p <0.01). 이전에 게재된 dECM 관련 연구를 살펴보면 dECM은 약 0.18~3.0kPa 범위의 압축 모듈러스를 가짐을 알 수 있다. 반면, dERS는 최대 86.4kPa(1/10mM Ru/SPS가 첨가된 Co-dERS의 경우)의 압축 모듈러스를 가짐을 확인하였다. 또한, 2/20mM Ru/SPS이 첨가된 Co-dERS의 경우, 압축 모듈러스, 탄성 계수, 회복 탄성 계수에서 Co-dECM과 비교하여 각각 2.55, 3.79 및 20.04배 향상된 값을 지님을 확인하였다(도 9). 따라서 다이타이로신 결합의 형성은 다양한 형태의 스트레스에 대한 저항력의 허용 한계를 증가시킴으로써 유변학적 거동 및 기계적 특성을 개선한다고 볼 수 있다. 이러한 개선은 궁극적으로 dECM 기반 바이오잉크의 인쇄 적성 및 형상 유지력 모두에 대해 더 나은 결과물을 만드는 데 기여할 것이다.
4. 바이오잉크 조성물의 3D 프린팅에 의한 구조물 제작 및 평가
4.1. 압출 기반 프린팅
가시광선 활성화 dECM 바이오잉크를 연구실 내 3D 바이오프린팅 시스템을 사용하여 프린팅하였다. 압출 및 광경화를 동시에 진행시키기 위해 디스펜서 헤드 하단에 LED 모듈을 설치하였다. 상기 실시예 1에 따라 2/20 mM Ru/SPS이 함유되고 10M 수산화나트륨 용액으로 중화된 2% hdECM 또는 2% Co-dECM 바이오잉크를 4℃로 미리 냉각된 주사기에 담았다. 압출 과정을 위해 22G와 25G의 서로 다른 크기의 노즐을 사용하였다. 가해진 공압의 범위는 20~50 kPa였다. 돌출된 두 dERS는 40℃ 프린터 스테이지에 프린팅되었으며, LED 모듈에서 조사된 가시광선 아래에 놓여 가교되었다.
4.2. DLP 광패터닝
DLP 광패터닝 실험은 CELINK Lumen X 프린터를 사용하여 수행하였다. 상기 실시예 1에 따른 1% hdECM 용액을 10M 수산화나트륨 용액으로 중화하였다. 1/10 mM Ru/SPS를 섞은 1 mL hdECM을 페트리 접시에 놓고, 이러한 페트리 접시를 이후에 프린터 스테이지에 올려 놓았다. 3D 바이오프린팅 공정에는 500만 개의 세포도 포함시키었다. 프린팅 조건으로는 광도 50%, 노출 시간 30s, 침투 깊이 100μm를 설정하였다. 프린팅 과정을 진행한 후, 구조물을 4℃의 인산염완충식염수로 세척하여 가교되지 않은 바이오레신용 dERS를 제거하였다.
4.3. 평가 결과
상기와 같이, dERS에 압출 기반 3D 바이오프린팅 기술을 활용하여 기하적으로 크고 복잡한 구조물을 제작했다. 도 10 내지 도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라, 빛 활성화 가교 시스템과 dERS를 사용하여, 센티미터 수준으로 고 종횡비(high-aspect-ratio) 구조를 갖는 3D 프린팅을 한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라, 압출 기반 인쇄(extrusion-based printing)에 의하여, 가시광선 활성으로 디-타이로신이 합성되는 상태를 설명하기 위한 모식도이다. 가시광선 조사를 위해 압출 헤드의 하단에 LED 모듈을 장착했고, 이 모듈은 30 mW cm-2의 강도의 가시광선을 조사하도록 조정하였다. 전체 프린팅 과정은 가시광선의 조사(파장 400~450nm)를 동반하여 진행하였다(도 10). dERS의 형상 유지력을 평가하기 위해, 5.5mm의 높이와 8.0mm의 직경을 가진 원통형 관 구조를 설계하고, 이를 바탕으로 hdERS를 사용하여 구조물을 프린팅 한 뒤 앞서 만든 설계도와 함께 비교했다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라, 빛 활성화 가교 시스템이 있거나 또는 없는 dECM 및 dERS를 사용하여 제조한 제품의 비교 사진이고, 도 11은 도 10 제품의 높이를 나타내는 결과이며(** p < 0.01), 도 12는 도 10 제품에서 원통형 구조의 너비를 나타내는 결과이다(**** p < 0.0001) (스케일 막대 : 10mm, VIS : 가시광선). 그 결과, 가시광선 조사가 동반된 dERS 그룹(dERS+VIS)만이 설계도 내 높이의 최대 96.87%를 재현할 수 있었다. 반면, 다른 그룹(dECM, dECM+VIS, dERS)은 설계도 내 높이의 최대 22% 정도를 웃도는 비교적 훨씬 낮은 높이를 보여주었다(도 10 및 도 11). 또한, dERS+VIS 그룹은 가장 좁은 선폭을 보였는데, 이는 사용된 노즐의 내경과 유사한 치수임을 고려할 때, 매우 정밀하고 정교한 구조물을 제작했다고 볼 수 있다. 다른 그룹은 dERS+VIS 그룹에 비해 넓은 선폭을 보이고, 이에 따라 중간의 원형으로 빈 영역이 매우 좁다는 점에서 형태 유지력에 있어 유의미한 차이가 있음을 확인할 수 있었다(도 12).
5. 바이오잉크 조성물의 3D 프린팅에 의한 조직 모사제 제작 및 평가
도 13 및 도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 1 및 3.1에 따른 방법으로 dERS를 사용한 조직 프린팅 프로세스에 의하여 제조한, 각막 특유의 생화학적 환경을 제공하는 각막 간질(Corneal stroma) 모사체 구조에 대한 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 실시예 1 및 3.1에 따른 방법으로 dERS를 사용한 조직 프린팅 프로세스에 의하여 제조한, 심장 특유의 생화학적 환경을 제공하는 심장 모사체 구조에 대한 것이다.
5.1. 광학 투명도 특성 검사
마이크로플레이트 리더를 이용한 빛 투과 측정을 통해 각막 투명도를 검사했다. 프린팅된 각막 구조물을 200μm 두께로 준비하였다. 마이크로플레이트 리더에서 550 nm 파장의 광 흡수 값을 측정하였다. 각 샘플에 대하여 3번의 과정을 통해 평가하였고, 모든 투과 결과는 아무 샘플도 존재하지 않는 경우의 흡광도를 측정하여 보정하였다.
5.2. 평가 결과
상기한 바에 따라, 본 발명에 따른 광가교성 dERS로 프린팅된 조직 모사체가 기존 dECM과 유사한 정도의 기질 리모델링 및 조직 재생 기능을 가지고 있음을 입증하고자 했다. 기존에 Co-dECM은 봉입된 혹은 주변에 위치한 세포에 각막 조직 고유의 생물학적/생화학적 신호를 제공하기 위해 사용되어 왔다. 다만, Co-dECM은 형태 유지력이 우수한 편이 아니어서 열가교가 진행되어도 설계된 각막 조직의 곡면 구조를 온전히 유지하는 데 어려움이 있었다.
본 실시예에서는, Ru/SPS와 Co-dECM의 혼합을 통해 만들어진 Co-dERS에 빠른 광가교 방식을 도입함으로써 곡면을 포함하는 각막 형태 구조물을 프린팅할 수 있었다(도 13). 도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라, 안구의 해부학적 이미지를 기반으로 3D 프린트한 곡선 각막을 나타내고(눈금 막대 : 5mm), 도 14는 도 13에 따라 프린트된 각막에서 Ru/SPS 광개시제가 용해된 상태의 변화를 시간에 따라 나타낸 결과이다. 배양시간이 증가함에 따라서, 투명도가 증가하였음을 알 수 있었다.
마찬가지로, hdECM과 Ru/SPS를 혼합하여 만든 광가교성 hdERS이 세포 성장을 지원하면서 안정적으로 심장 형태 구조물을 프린팅하는 데 충분한 형태 유지력을 가짐을 확인하였다. 도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라, 심장의 해부학적 이미지(스케일 막대 : 5mm)를 기반으로 심장 특정 생화학 적 환경과 3D 프린팅된 심장을 제공하는 심장 모사체 구조이다. 설계도 제작을 위한 심장의 3D 해부학적 이미지는 NIH 3D Print Exchange에서 얻었으며 이를 바탕으로 비교적 단순화되어 심장 형태 구조물을 프린팅했다(도 15). 심장 형태 구조물은 중공 구조를 안정적으로 유지할 수 있었다.
6. 광조사 시간별 바이오잉크 조성물의 세포 적합성 평가
상기 실시예 1에 따라 제조된 겔화된 구조물을 준비하고, 1/10mM Ru/SPS를 혼합한 dERS로 제작하였다. 각 바이오 잉크 샘플에 Live/dead 염색을 수행하여 가시광선에 조사 시간에 따른 바이오 잉크의 세포 적합성을 평가하였다.
즉, 그룹에 따라 가시광선을 5초, 3분 그리고 10분 간 조사하였다. 가시광선을 조사한 후, 구조물은 인산염완충식염수로 두 번 세척하였다. 그런 다음, 제조사의 지시에 따라 제조된 live/dead cell 염색 시약을 샘플에 처리하였다. 이를 30 분 동안 유지한 후, Nikon Eclipse Ti inverted microscope 장비를 사용하여 Live/dead cell 형광 이미지를 얻었다. 이때, 살아있는 세포는 초록색으로, 죽은 세포는 빨간색으로 표기된다. 또한, 단위 면적 당 죽은 세포 수를 계산할 때는 Image J 소프트웨어를 사용하였다.
그 결과는 도 16 및 도 17에 나타난 바와 같다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라, 2% hdECM과 1/10mM Ru/SPS 를 혼합하여 제조한 hdERS 를 대상으로 가시광선에 노출된 시간(5초, 3분 그리고 10분)에 따른 Live/dead cell 형광 이미지 결과이고, 도 17은 도 16의 이미지 결과에서 단위 면적당 죽은 세포수를 계산한 그래프이다.
도 16에 나타난 바와 같이, 10분 동안 가시광선을 조사한 그룹은 5초 및 3분 동안 가시광선을 조사한 그룹과 비교하였을 때, 죽은 세포를 쉽게 관찰할 수 있었다. 그리고, 도 17에 나타난 바와 같이, 가시광선 조사 시간이 10분으로 길어지면 죽은세포의 수가 현저히 많아져서, 세포적합성이 떨어진다는 것을 확인할 수 있었다.
7. 광조사 시간별 바이오잉크 조성물의 기계적 특성 평가
상기 실시예 1에 따라 제조된 겔화된 구조물을 샘플로 준비하고, 상기 실시예 3-4와 동일한 방식으로 시간 변화 분석을 수행하여 상기 샘플의 복합 모듈러스를 측정하였다. 이때, 상기 샘플로는 순수 hdECM 과 0.5mM, 1/10mM 그리고 2/20mM Ru/SPS를 혼합한 hdERS 를 사용하였다. 시간 변화 분석을 수행하기 전에, 그룹에 따라 상기 샘플을 가시광선에 5초, 3분 그리고 10분 동안 각각 노출시켰다. 시간 변화 분석은 Advanced Rheometric Expansion system (TA instrument, USA) 장비를 사용하여 수행하였다. 모든 측정은 세 번 실시하였다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라, 2%의 순수 hdECM 과 0.5/5mM, 1/10mM, 그리고 2/20mM Ru/SPS를 각각 혼합한 hdERS 를 대상으로 가시광선에 노출된 시간에 따른 복합 모듈러스 값의 변화를 나타낸 결과이다.
여기에 나타난 바와 같이, hdERS 는 5초 동안 가시광선에 노출된 후, hdECM 과 비교했을 때, 시간적 변화에 따른 복합 모듈러스 값의 변화 경향에서 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
이에 반하여, hdERS가 3분 그리고 10분 동안 가시광선에 노출된 경우에는 hdECM 과 비교했을 때, 기존 hdECM 보다 현저히 높은 복합 모듈러스를 가졌다.
또한, 두 그룹 모두는 시간적 변화에 따른 복합 모듈러스 값의 변화가 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.
나아가, 1/10mM Ru/SPS를 혼합한 hdERS 의 경우, 2/20mM Ru/SPS를 혼합한 hdERS 만큼 우수한 복합 모듈러스 값을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
8. 생체재료에 따른 광가교 유도 평가
3종류의 Ru/SPS 기반 광활성 재료를 준비하였고, 각 재료를 광조사한 것과 광조사 하지 않은 그룹으로 나누어서, 광가교 유도 성능을 평가하였다.
상기 실시예 1에 따라 준비된 본 발명에 따른 천연생체재료(hdECM)와, 다른 천연생체재료인 젤라틴(Gelatin), 그리고 합성화합물재료인 Poly(ethylenglycol) diacrylate (PEGDA)를 대상으로, 동일하게 Ru/SPS 개시제를 이용하여 광가교 시킨 후, Advanced Rheometric Expansion system (TA instrument, USA) 을 사용하여, frequency sweep analysis 를 수행하였다.
구체적으로는, 본 발명에 따른 심장 유래 탈세포화세포외기질(hdECM)에 광개시제 Ru/SPS를 혼합한 광가교성 hdECM 하이드로젤(hdERS)과, Gelatin에 광개시제 Ru/SPS를 혼합한 광가교성 Gelatin 하이드로겔과, PEGDA에 광개시제 Ru/SPS를 혼합한 광가교성 PEGDA 하이드로겔을 대상으로 하였다. 상기 광개시제의 농도는 0.5/5mM를 사용하였으며, 그 외에는 실시예1에 기재된 것과 동일한 방법으로 가교시켰다.
3종류의 샘플(PEGDA + Ru/SPS, Gelatin + Ru/SPS, hdECM+ Ru/SPS)을 광가교를 유도한 것과 유도하지 않은 것으로 나눈 후, Advanced Rheometric Expansion system(TA instrument, USA) 를 사용하여 Frequency sweep analysis 를 통해 각 샘플의 complex modulus를 측정하였다. Angular frequency 는 0.1 % 의 일정한 shear strain 하에 0.01 에서 100 rad/s-1 로 증가하였다. 모든 실험은 triplicate 으로 진행하였다.
그 결과는, 도 19 및 도 20에 나타난 바와 같다. 가시광선이 조사된 후, 모든 재료들이 Ru/SPS에 의해 광가교가 유도되어 젤이 된 것을 확인하였다(도 19). 또한, 광조사가 되기 전과 후의 complex modulus 를 비교해 본 결과, 본 발명에 따른 Ru/SPS 기반의 모든 재료는 광조사 된 후에 높은 complex modulus를 가진 것으로 확인되었다(도 20).
9. 생체재료에 따른 생체적합성 평가
상기 실시예 8에서 준비한 3종류의 Ru/SPS 기반 광경화성 재료를 대상으로, Bone marrow-derived mesenchymal stem cell (BM-MSC) 를 사용해서 (세포의 농도는 cells/mL 를 사용함) Live/dead assay 를 수행하여, 생체적합성을 평가하였다.
실험 그룹은 아래와 같이 하였다.
1. PEGDA+ Ru/SPS + 세포 + light
2. Gelatin + Ru/SPS + 세포 + light
3. hdECM+ Ru/SPS + 세포 + light
상기 3 종류의 Ru/SPS 기반의 광경화성 생체재료에 세포를 봉입하고 7일 동안 배양한 후, 1일차와 7일차 결과를 비교하였다. 즉, 상기 3 종류의 Ru/SPS 기반 광경화성 생체재료 내에 세포를 봉입하고, 가교한 후 7일 동안 배양하였고, 1일 차와 7일 차에 제조사의 지시에 따라 Live/dead viability cytotoxicity kit 를 사용해서 각 그룹의 샘플을 염색하였다. 염색한 샘플의 Live/dead cell 형광 이미지는 Nikon Eclipse Ti inverted microscope 을 통해 얻었다.
그 결과는, 도 21 및 도 22에 나타난 바와 같다. Live/dead 염색 결과, 1일 차에는 모든 재료에서 세포들이 높은 생존율을 유지하는 것이 관찰되었다. 그리고, 7일 차 이미징 결과에서는 Gelatin 과 hdECM과 같은 천연 생체 재료에서는 세포고유의 형상이 발달된 세포들이 다수 관찰되었다. 그러나, PEGDA 내부에서는 세포 고유의 형상을 가진 세포들이 쉽게 관찰되지 않았다(도 21). Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 결과에 의하면, hdECM은 Gelatin 보다 세포가 증식을 하는데 있어 현저히 우수한 세포 친화적인 환경을 제공하는 것으로 확인되었다. 그러나, PEGDA에서는 흡광도 값이 감소되는 것으로 나타나, 세포가 증식하는데 있어 친화적인 환경을 제공하지 못하는 것으로 확인되었다.
상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims (17)

  1. 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(decellularization) 처리하여 세포외 기질(ExtraCellular Matrix : ECM)을 준비하는 단계;
    상기 준비한 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ruthenium/Sodium PerSulfate : Ru/SPS)을 혼합하여 광가교용 세포외 기질(decellularized Extracellular matrix Ruthenium Sodium persulfate : dERS)을 제조하는 단계; 및
    상기 제조한 광가교용 세포외 기질(dERS)에 가시광선을 조사하여 광가교시키는 단계;를 포함하는, 바이오잉크 조성물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가시광선 조사에 의하여, 세포외 기질(dECM) 내의 타이로신(tyrosine) 간에 디-타이로신 결합(di-tyrosine bonding)이 생성되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 0.5/5mM 내지 10/100mM 범위 내의 농도로 혼합하는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 1/10mM 내지 2/20mM 범위 내의 농도로 혼합하는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 가시광선은 400nm 내지 450nm 범위 내의 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 가시광선은 400nm 내지 425nm 범위 내의 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 가시광선을 조사하는 것은 5초 내지 10분 범위 내의 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 가시광선을 조사하는 것은 1분 내지 5분 범위 내의 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 가시광선을 조사하는 것은 3분의 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 광가교시킨 세포외 기질(dERS)을 열가교시키는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 제조 방법.
  11. 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(decellularization) 처리하여 세포외 기질(ECM)을 준비하는 단계;
    상기 준비한 탈세포화 세포외 기질(dECM)에 광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 혼합하여 광가교용 세포외 기질(dERS)을 제조하는 단계; 및
    상기 제조한 광가교용 세포외 기질(dERS)을 가시광선이 조사되는 환경에서 프린팅하는 단계;를 포함하는, 바이오잉크 조성물의 프린팅 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 가시광선 조사를 통해, 세포외 기질(dECM) 내의 타이로신(tyrosine) 사이에 디-타이로신 결합(di-tyrosine bonding)을 생성하는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물의 프린팅 방법.
  13. 생체로부터 분리된 조직을 탈세포화(decellularization) 처리하여 얻은 세포외 기질(dECM)과,
    광개시제로서 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)을 포함하고,
    가시광선 조사에 의하여 광가교 될 수 있는, 바이오잉크 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 가시광선 조사에 의하여, 세포외 기질(dECM) 내의 타이로신(tyrosine) 간에 디-타이로신 결합(di-tyrosine bonding)이 생성되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 루테늄/황산나트륨(Ru/SPS)은 세포외 기질(dECM)에 1/10mM 내지 10/100mM 범위 내의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 바이오잉크 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 바이오잉크 조성물을 가시광선이 조사되는 환경에서 프린팅하는 단계;를 포함하는, 조직 모사체의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 가시광선은 400nm 내지 450nm 범위 내의 파장을 갖는 것을 특징으로 하는, 조직 모사체의 제조방법.
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