KR20230013079A - 내독소 저함량 젤라틴-(메트)아크릴로일 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 발열 활성이 작은 메타크릴로일-젤라틴 및 아크릴로일-젤라틴, 구체적으로 리포다당체 함량이 낮은 메타크릴로일-젤라틴 및 아크릴로일-젤라틴에 관한 것이다. (메트)아크릴로일-젤라틴은 낮은 (메트)아크릴로일 함량에 의해 추가로 특징지어진다. 본 발명은 또한 상기 (메트)아크릴로일-젤라틴을 제조하기 위한 방법으로서, 투석 단계를 필요로 하지 않는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 (메트)아크릴로일-젤라틴을 포함하는 하이드로겔뿐 아니라, 조직 공학 분야에서의 이의 용도 및 바이오잉크 또는 바이오수지로서의 이의 용도에 관한 것이기도 하다.
Description
본 발명은 화학 작용화 젤라틴, 구체적으로 메타크릴로일-젤라틴 및 아크릴로일-젤라틴에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 발열 활성(pyrogenic activity)이 작은 메타크릴로일-젤라틴 및 아크릴로일-젤라틴, 구체적으로 상기 메타크릴로일-젤라틴 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 리포다당체 저함량 하이드로겔, 상기 메타크릴로일-젤라틴 및 아크릴로일-젤라틴을 제조하기 위한 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
작용성 생물 조직, 생물 임플란트 및 세포 기반 다기관 모델의 임상, 진단 또는 약학적 연구를 위한 재구성이 주목을 많이 받고 있다. 하이드로겔은 원산 세포외 매트릭스와 유사하기 때문에 다양한 조직 공학 분야에서 선도적인 후보물질로서 부상되고 있다.
젤라틴 하이드로겔은 생체적합성 및 생물분해성을 가지기 때문에 특히 매력적이다. 젤라틴은 체내 가장 풍부한 단백질이자 세포외 매트릭스에 가장 많이 존재하는 분자인 콜라겐의 부분 가수분해에 의해 제조된다. 세포 인지 서열인 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)이 풍부하게 존재하면, 세포와 젤라틴의 부착이 가속화되고, 그 결과 세포의 확산 및 증식이 촉진된다. 이러한 세포-매트릭스 상호작용은 복잡한 조직을 구성하는데 결정적이다. 젤라틴은 제약 산업에 있어 신뢰받는 부형제로서 오래 사용되어 온 덕분에 최고 수준으로 안전 및 규정이 준수되어야 한다는 조건도 충족한다. 더욱이, 자유 아미노기, 하이드록실기 및 카복실산기가 존재하면, 화학 변형으로 하여금 특정 분야에 요망되는 특성들을 달성시킬 수 있도록 만든다.
젤라틴 하이드로겔은, 자체의 측기를 사전 변형하지 않거나, 자체의 측기를 작용화한 후 젤라틴 중합체를 가교시킴으로써 제작된다. 작용기를 젤라틴 주쇄에 부가하는 것은, 하이드로겔 디자인 및 특성에 대한 고도의 제어가 동반되는 가교 전략이다. 가장 광범위하게 사용되고 연구된 가교 젤라틴 변형은 메타크릴로일화이다. MA 변형 젤라틴은, 일반적으로 젤MA라 지칭된다. 널리 확립된 메타크릴로일-젤라틴에 대한 대안은 아크릴로일-젤라틴이다(Billiet et al. 2013 "Quantitative Contrasts in the Photopolymerization of Acrylamide and Methacrylamide-Functionalized Gelatin Hydrogel Building Blocks" Macromolecular Bioscience 13:1531-45). 젤라틴-(메트)아크릴로일 하이드로겔의 물리적 특성(가교 밀도, 팽창 및 강성)은 (메트)아크릴로일화 정도 및 중합체 농도에 따라서 조정될 수 있으며, 이러한 조정은 본 재료를, 다양한 조직 공학 분야를 위한 다목적 플랫폼으로 만든다. 가교는 사용된 광 개시제(예컨대 Irgacure®2959 또는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스핀산염(LAP))에 따라 UV 또는 가시 광선에 의해 생성되는 라디칼에 의해 개시된다.
(생체)의학 분야용인 젤라틴 기반 하이드로겔의 주요 단점들 중 1가지는 전통적으로 제조된 젤라틴에 내독소(본원에서는 리포다당체라고도 지칭됨)가 존재한다는 점이다. 내독소는 대형이면서, 면역원성이 큰 분자이자, 그램 음성 세균 외막의 주요 구성성분이다. 내독소는 내열성이 매우 큰데, 이 점은 내독소가 비활성화되기 어렵게 만든다. 내독소가 면역계에 노출될 때, 이 내독소는 면역 반응을 개시하고, 이로 말미암아 조직에 염증이 발생할 수 있고, 다른 알레르기원에 대한 감수성이 증가할 수 있으며, 치명적 쇼크(fatal shock)가 발생할 위험이 초래될 수 있다. 현재 대부분의 연구는, 내독소 수준이 높은 젤라틴을 기반으로 하는 젤MA로 수행된다.
전통적으로 제조된 젤라틴은 또한 내독소를 제외한 미생물 구성성분들로 오염될 수 있는데, 이 미생물 구성성분들중 일부는 내독소와 마찬가지로 인간의 체내에서 불리한 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 비 내독소 발열원으로서는, 예컨대 그램 양성 세균으로부터 기원하는 리포테이코산(LTA)과 같은 물질과, 진균, 효모, 바이러스, 세균 및 기생체로부터 기원하는 기타 화합물을 포함한다(Hasiwa et al. (2013) "Evidence for the detection of non-endotoxin pyrogens by the whole blood monocyte activation test." ALTEX 30:169-208). (생체)의학 분야에서 선천적 면역 수용체가 활성화될 때 원치않는 부작용이 발생하는 것이 방지되도록, 일반적으로 이러한 비 내독소 발열원, 바람직하게는 발열원 또는 발열원 연관 분자 패턴(PAMP)은 젤라틴 기반 하이드로겔중 최소로 유지되어야 한다.
뿐만 아니라, 젤라틴의 젤라틴 하이드로겔로의 작용화 및 가교중 다수의 시약이 사용된다. 시약 및 반응 생성물의 잔류물이 젤MA에 존재하게 될 수 있다. 예를 들어 젤라틴과 메타크릴산 무수물이 반응할 때, 메타크릴산 무수물(MAAH) 및/또는 메타크릴산(MAA)이 젤MA에 존재할 수 있는데, 이 MAAH 및 MAA는 유해한 것으로 간주된다. MAA는 농도 및 노출 횟수 또는 노출 시간에 따라 적용 부위에서 부작용을 유발할 수 있다. SIDS 초기 평가 프로파일(SIDS Initial Assessment Profile; SIAM 11, 2001)에 의하면, 희석되지 않은 산은 피부와 눈이 썩어들어가게 만들고, 호흡기에 병변이 생기게 하는 것으로 보였다. 미반응 메타크릴산 무수물 및 메타크릴산은 증류수에 대한 투석을 통해 반응 혼합물로부터 제거될 수 있다. 통상적으로 투석은 1주일 동안 수행되지만, 이보다 더 짧은 기간 및 더 긴 기간 동안 수행되는 투석도 또한 본원에서 상상된다. 따라서 이처럼 시간이 소요되는 단계는 젤MA의 대규모 제조에는 비효율적이다. 게다가, 이처럼 (주 단위로) 투석이 수행되는 중 미생물 오염 및 젤라틴 분해 위험은 증가하고, 이 점은 전체적으로 공정을 복잡하게 만든다.
젤라틴 기반 하이드로겔의 (생체)의학 분야에의 적용을 위해서는, 요망되는 기계적특성(예컨대 내구력 및 탄성)을 가지는 하이드로겔의 조정을 허용하는 (예컨대 생물 조직에 무독성이며 비면역원성인) 생체적합성 (메트)아크릴로일 젤라틴이 필요하다. 또한 산업 규모로의 제조를 허용하는 효율적 방법에 의해 이러한 (메트)아크릴로일 젤라틴을 제조할 필요도 있다.
본 발명은 전술된 선행 기술의 문제점들중 1가지 이상을 해결한다. 구체적으로 발열원 함량, 구체적으로 내독소 함량이 낮고, 메타크릴산 또는 아크릴산의 오염이 적은 메타크릴로일-젤라틴 및 아크릴로일-젤라틴이 제공된다. (메트)아크릴로일-젤라틴은 발열원 함량, 구체적으로 내독소 함량이 낮은 것으로 보아 생체적합성이 개선되었다. 본 발명의 (메트)아크릴로일-젤라틴은, 가교 과정을 방해하는 것으로 보이는 메타크릴산 또는 아크릴산에 의한 오염이 낮은 것으로 보아 가교에 특히 유용하다. (메트)아크릴로일-젤라틴은 (오랜) 투석 단계를 필요로 하지 않는 간단한 제조 방법에 의해 제조될 수 있음도 또한 유리한 점이다.
본 발명은, 구체적으로 이하에 나열된 양태들 및 구현예들 (i) ~ (xvi), 즉
(i) 리포다당체 함량이 100 EU/g 미만, 바람직하게는 50 EU/g 미만, 더욱 바람직하게는 20 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 10 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 5 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 2 EU/g 미만, 가장 바람직하게 1 EU/g 미만이고, 메타크릴산 또는 아크릴산을 30 ppm 미만 포함하며, 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 변형된 젤라틴[여기서 메타크릴산 또는 아크릴산 함량은 수중에 용해된 젤라틴 시료, 또는 메타크릴산 또는 아크릴산을 100 ppm 미만 포함하는 젤라틴 시료를 기준으로 확정되고, 메타크릴산 또는 아크릴산 함량은 인산염 완충제(pH 9.5) 50 mM중에 용해된 젤라틴 시료를 기준으로 확정됨];
(ii) (i)에 따른 젤라틴으로서,
그램 양성 세균으로부터의 발열원, 편모 세균으로부터의 발열원, 단일 가닥 바이러스 RNA, 및 비메틸화 CpG 모티프가 풍부한 세균 DNA의 함량이 낮고, 바람직하게 그램 양성 세균 및 편모 세균으로부터의 발열원 함량이 낮으며, 더욱 바람직하게 그램 양성 세균으로부터의 발열원 함량이 낮은 젤라틴;
(iii) (i) 또는 (ii)에 따른 젤라틴으로서, A 유형 젤라틴인 젤라틴;
(iv) (i) ~ (iii)중 어느 하나에 따른 젤라틴으로서, 메타크릴아미드 치환도 또는 아크릴아미드 치환도가 20% ~ 100%, 바람직하게 50% ~ 100%, 더욱 바람직하게 80% ~ 100%이고, 메타크릴산염 치환도가 10% 미만인 젤라틴;
(v) (i) ~ (iv)중 어느 하나에 따른 젤라틴으로서, 상기 젤라틴은 아세틸기 또는 아세틸부, 페놀기 또는 페놀부, 티올기 또는 티올부, 노르보넨기 또는 노르보넨부, 테트라진기 또는 테트라진부, 아지드기 또는 아지드부, 푸란기 또는 푸란부, 또는 이의 임의의 조합으로 추가 변형된 젤라틴;
(vi) (i) ~ (iv)중 어느 하나에 따른 것으로서, 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 변형된 젤라틴과 가교제를 포함하는 하이드로겔;
(vii) (vi)에 따른 하이드로겔을 포함하는 필름;
(viii) (i) ~ (v)중 어느 하나에 따른, 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 변형된 젤라틴을 제조하기 위한 방법으로서,
a) 젤라틴을 메타크릴산 무수물 또는 아크릴산 무수물과 반응시켜 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 젤라틴을 변형하는 단계;
b) 반응 매질의 pH를 2.0 ~ 4.0, 바람직하게 2.0 ~ 3.5, 또는 3 ~ 4, 더욱 바람직하게 3.0 ~ 3.5의 값으로 강하시키는 단계;
c) 미셀 형성 계면활성제(micelle-forming surfactant) 0.01 w/w% ~ 1.5 w/w%를 산성 반응 매질에 첨가하는 단계;
d) 단계 c)의 매질과 고체 흡착제를 접촉시키는 단계;
e) 단계 d)의 고체 흡착제를 매질과 분리하는 단계; 및
f) 메타크릴로일 젤라틴 또는 젤라틴-아크릴로일을 포함하는 매질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법;
(ix) (i) ~ (v)중 어느 하나에 따른, 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 변형된 젤라틴을 제조하기 위한 방법으로서,
a) 젤라틴을 메타크릴산 무수물 또는 아크릴산 무수물과 반응시켜 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 젤라틴을 변형하는 단계;
b1) 반응 매질의 pH를 4.0 ~ 9.0, 바람직하게는 4.0 ~ 6.0, 더욱 바람직하게 4.0 ~ 6.0, 더욱더 바람직하게 4.5 ~ 5.5의 값으로 강하시키는 단계;
c) 미셀 형성 계면활성제 0.01 w/w% ~ 1.5 w/w%를 반응 매질에 첨가하는 단계;
b2) 단계 c)의 매질의 pH를 2.0 ~ 4.0, 바람직하게는 3.0 ~ 4.0, 더욱 바람직하게 3.0 ~ 3.5의 값으로 강하시키는 단계;
d) 단계 b2)의 매질을 고체 흡착제와 접촉시키는 단계;
e) 단계 d)의 고체 흡착제를 매질과 분리하는 단계; 및
f) 메타크릴로일 젤라틴 또는 젤라틴-아크릴로일을 포함하는 매질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법;
(x) (viii) 또는 (ix)에 따른 방법으로서, 투석 단계를 생략한 방법;
(xi) (viii) ~ (x)중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 미셀 형성 계면활성제는 비이온성 계면활성제를 포함하고, 바람직하게 이 계면활성제는 Triton X-100 또는 Triton X-102, 또는 이의 혼합물인 방법;
(xii) (viii) ~ (xi)중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 고체 흡착제는 소수성 흡착제, 바람직하게 활성탄인 방법;
(xiii) (viii) ~ (xii)중 어느 하나에 따른 방법으로서, 메타크릴로일 젤라틴 또는 젤라틴-아크릴로일을 포함하는 매질을 건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법;
(xiv) 의료분야에 사용하기 위한 것으로서, (i) ~ (v)중 어느 하나에 따른 젤라틴 또는 (vi)에 따른 하이드로겔;
(xv) (i) ~ (v)중 어느 하나에 따른 젤라틴 또는 (vi)에 따른 하이드로겔의, 생물학적 구조, 예컨대 조직 또는 장기, 또는 이의 일부, 코팅, 스캐폴드 또는 제어 방출 제형을 제조하기 위한 시험관내 또는 생체외 용도; 및
(xvi) (i) ~ (v)중 어느 하나에 따른 젤라틴 또는 (vi)에 따른 하이드로겔의 바이오잉크(bio-ink) 또는 바이오수지(bio-resin)로서의 용도
중 임의의 것 1가지 또는 이것들중 1가지 이상의 임의의 조합에 의해 공략된다.
본 출원의 교시내용은 본 발명의 특허청구의 범위를 단지 예시하는 것으로 간주될뿐 어떤 방식으로든 제한하는 것이 아닌 이하 도면에 의해 설명된다.
도 1: 젤MA중 오염 MAA의, 젤MA 기반 하이드로겔 저장 모듈러스(G')에 대한 영향. 젤MA 용액을 기반으로 하고, 0 ppm, 100 ppm, 300 ppm 또는 600 ppm의 자유 MAA가 도핑(doping)된 하이드로겔의, 20℃에서의 최종 G'(Pa, 평균 지속시간 10분).
도 1: 젤MA중 오염 MAA의, 젤MA 기반 하이드로겔 저장 모듈러스(G')에 대한 영향. 젤MA 용액을 기반으로 하고, 0 ppm, 100 ppm, 300 ppm 또는 600 ppm의 자유 MAA가 도핑(doping)된 하이드로겔의, 20℃에서의 최종 G'(Pa, 평균 지속시간 10분).
달리 정의되지 않는 한, 기술 용어 및 과학 용어를 포함하여 본 발명을 개시하는데 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가진다. 용어의 정의는 추가 지침에 의해 본 발명의 교시가 더 잘 이해되도록 포함된다.
본원에 사용된 단수 형태 "한(a)", "하나의(an)" 및 "본(the)"은 문맥에 달리 명시되어 있지 않는 한 단수 및 복수의 지시 대상을 모두 포함한다.
본원에 사용된 용어 "~를 포함하는(comprising)", "~를 포함한다(comprise)" 및 "~으로 구성된(comprised of)"은 "~를 포함하는(including)", "~를 포함한다(include)" 또는 "~를 함유하는(containing)", "~를 함유한다(contain)"과 동의어이며, 포괄적이거나 개방형(open-ended)이며, 추가의 나열되지 않은 구성원, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 임의의 요소들 또는 단계들을 포함하는 것과 같은 구현예가 언급되는 경우, 여기에는 나열된 요소들 또는 단계들로 본질적으로 이루어진 구현예들도 포함된다.
종말점에 의한 수치 범위의 나열은 각각의 범위내에 포함된 모든 숫자와 분수뿐 아니라 여기에 나열된 종말점도 포함한다.
매개변수, 양, 시간상의 지속기간 등과 같이 측정 가능한 값이 언급될 때 본원에 사용되는 용어 "약"은 명시된 값 또는 이러한 값으로부터 +/- 10% 이하, 바람직하게는 +/- 5% 이하, 더욱 바람직하게는 +/- 1% 이하, 더욱더 바람직하게는 +/- 0.1% 이하의 변차를 포함하는 의미이며, 이러한 변차는 개시된 발명에서 수실현되기 적절하다. "약"이라는 수식어가 지칭하는 값 자체도 구체적으로, 그리고 바람직하게 개시되어 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 인용된 모든 문서는 그 전체가 참고문헌으로 본원에 포함되어 있다.
본 출원은, 일반적으로, 예컨대 젤라틴 기반 하이드로겔 및 필름을 제조하기 위해 젤라틴을 가교하도록 작용화된 젤라틴에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 출원은 메타크릴로일-젤라틴 및 아크릴로일-젤라틴에 관한 것이다.
젤라틴은 콜라겐으로부터 유래한 수용성 단백질들의 혼합물이다. 젤라틴은, 예컨대 당 분야에 공지된 바와 같이 산성 또는 알칼리 조건에서 소, 돼지, 가금류 또는 어류로부터 유래한 피부, 힘줄, 인대, 뼈 등의 수성 추출에 의해 수득된 콜라겐의 부분 가수분해, 또는 효소에 의한 가수분해에 의해 수득된다. 산 처리에 의해 수득된 젤라틴은 "A 유형 젤라틴"이라 지칭되는 반면, "유형 젤라틴"은 알칼리 기반 방법으로부터 유래한다. B 유형 젤라틴중 아스파라긴 및 글루타민의 더욱 광범위한 탈아민화로 말미암아, 중성의 생리적 pH에서 A 유형 젤라틴 및 B 유형 젤라틴이 양 하전 및 음 하전되도록 만드는, A 유형 젤라틴 및 B 유형 젤라틴의 등전점(IEP)은 각각 pH 7.0 ~ 9.0 및 pH 4.9 ~ 5.1일 때이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 A 유형 젤라틴에 관한 것이다.
젤라틴은 균일한 단백질 분자를 구성하지 않지만, 길이가 가변적인 단백질 분자를 다양한 양으로 포함한다. 바람직하게 본원에 사용된 젤라틴의 평균 분자량은 1500 Da ~ 300 kDa, 바람직하게 2000 Da ~ 300 kDa, 4000 Da ~ 300 kDa, 5000 Da ~ 300 kDa, 10 kDa ~ 300 kDa, 또는 20 kDa ~ 300 kDa, 더욱 바람직하게 50 kDa ~ 300 kDa, 가장 바람직하게 100 kDa ~ 300 kDa의 범위, 예컨대 100 kDa ~ 275 kDa 또는 100 kDa ~ 250 kDa의 범위이다. 젤라틴의 분자량 분포는, 보통 크기별 배제 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 기술에 의해 측정되고, 용리된 분획들은 UV 흡수에 의해 검출되며, 측정된 데이터는 당 분야에 공지된 적합한 소프트웨어와 모든 기술에 의해 평가된다[예를 들어 문헌(Olijve et.al., 2000. Journal of Colloid and Interface Science 243: 476-482)을 참조한다].
본원에 사용된 바와 같은 "젤라틴"이란 용어는 또한 화학 변형 젤라틴을 비롯한 "젤라틴 유도체"를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "화학기 또는 화학부(예컨대 메타크릴로일기 또는 메타크릴로일부, 아크릴로일기 또는 아크릴로일부, 아세틸기 또는 아세틸부, 페놀기 또는 페놀부 등)로 변형된 젤라틴"이란 표현은, 상기 화학기 또는 화학부(예컨대 메타크릴로일기 또는 메타크릴로일부, 아크릴로일기 또는 아크릴로일부, 아세틸기 또는 아세틸부, 페놀기 또는 페놀부 등)가, 예컨대 젤라틴의 아민기 적어도 1개, 하이드록실기 적어도 1개, 카복실기 적어도 1개 및/또는 페놀기 적어도 1개에 부착되어 포함된 젤라틴을 나타낸다.
본원에서 "메타크릴로일 변형 젤라틴", "메타크릴로일 치환 젤라틴" 또는 "메타크릴로일-젤라틴" 또는 "젤라틴 메타크릴로일" 또는 "젤MA"라고도 지칭되는, 본원에 사용된 바와 같은 "메타크릴로일기로 변형된 젤라틴"이란, 메타크릴아미드기 적어도 1개 및/또는 메타크릴산염기 적어도 1개로 치환된 자유 아민 및/또는 자유 하이드록실을 가지는 젤라틴으로서 정의된다. 본원에서 "아크릴로일 변형 젤라틴", "아크릴로일 치환 젤라틴" 또는 "아크릴로일-젤라틴" 또는 "젤라틴 마크릴로일"이라고도 지칭되는, 본원에 사용된 바와 같은 "아크릴로일기로 변형된 젤라틴"이란, 아크릴아미드기 적어도 1개 및/또는 아크릴산염기 적어도 1개로 치환된 자유 아민 및/또는 자유 하이드록실을 가지는 젤라틴으로서 정의된다. 젤라틴은 아미노산들을 포함하는데, 이 아미노산들중 몇 개는 아민으로 종결되는 측쇄를 가지거나(예컨대 리신, 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민) 또는 하이드록실로 종결되는 측쇄를 가진다(예컨대 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 티로신, 하이드록시프롤린). 이러한 종결 아민 및/또는 하이드록실중 1개 이상은 각각 (메트)아크릴아미드기 및/또는 (메트)아크릴산염기를 포함하는 (메트)아크릴로일-젤라틴으로 제조되도록 (메트)아크릴로일기로 치환될 수 있다.
젤라틴의 "작용화도(DoF)"란, 일반적으로 전체 1차 아민기 및/또는 하이드록실기 대비 작용화된 1차 아민기 및/또는 하이드록실기의 %를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "(메트)아크릴아미드 치환도"란, (메트)아크릴아미드기로 치환된 자유 아민기의 젤라틴중 %를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 "(메트)아크릴산염 치환도"란, (메트)아크릴산염기로 치환된 자유 하이드록실기의 젤라틴중 %를 지칭한다. 젤라틴의 작용화도, 예컨대 (메트)아크릴아미드 치환도 및/또는 (메트)아크릴산염 치환도는 그 자체로서 공지된 방법에 의해 확정될 수 있다. 예를 들어 Fe(III)-아세토하이드록사민산 방법은 하이드록실기에서의 (메트)아크릴화를 확정하는데 사용될 수 있다. Habeeb 방법((메트)아크릴아미드의 트리니트로벤젠설폰산(TNBS) 기반 분광광도확정법; Habeeb 1996. Anal. Biochem. 14:328-336), 1H-NMR 및 플루오르알데히드 검정법((메트)아크릴아미드의 o-프탈디알데히드(OPA) 기반 형광분석 확정법이라고도 공지됨)은 아민기에서의 (메트)아크릴화를 확정하는데 사용될 수 있다. 전술된 방법들의 조합, 예컨대 (메트)아크릴산염 대 (메트)아크릴아미드기의 비율 확정을 허용하는 방법으로서, (메트)아크릴산염기를 정량하기 위한 Fe(III)-아세토하이드록사민산 방법과, 아민기 전환을 정량하기 위한 플루오르알데히드 검정법의 조합도 또한 사용될 수 있다. 구현예들에서, 플루오르알데히드 검정법은 (메트)아크릴아미드 치환도를 확정하는데 사용된다.
본원에 개시된 (메트)아크릴로일-젤라틴에 있어, (메트)아크릴로일화는, 바람직하게 유리 아민기에서 일어난다. 구현예들에서, 메타크릴로일-젤라틴의 메타크릴아미드 치환도는 20% ~ 100%, 바람직하게 50% ~ 100%, 더욱 바람직하게 80% ~ 100%, 예컨대 85% ~ 100%, 90% ~ 100% 또는 95% ~ 100%이다. 구현예들에서, 메타크릴로일-젤라틴의 메타크릴산염 치환도는 20% 미만, 바람직하게 10%, 9%, 8%, 7% 또는 6% 미만, 더욱 바람직하게 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이다. 구현예들에서, 메타크릴로일-젤라틴중 메타크릴아미드 치환도는 20% ~ 100%이고, 메타크릴산염 치환도는 20% 미만이고, 바람직하게 메타크릴아미드 치환도는 20% ~ 100%이고, 메타크릴산염 치환도는 10% 미만이고, 더욱 바람직하게 메타크릴아미드 치환도는 50% ~ 100%이고, 메타크릴산염 치환도는 10% 미만이고, 더욱더 바람직하게 메타크릴아미드 치환도는 80% ~ 100%이고, 메타크릴산염 치환도는 10% 미만이다.
구현예들에서, 메타크릴로일-젤라틴은 메타크릴아미드 치환 및 메타크릴산염 치환을 포함하고, 메타크릴아미드 치환 대 메타크릴산염 치환의 비율은 80:20 ~ 99:1, 바람직하게 90:10 ~ 99:1, 더욱 바람직하게 95:5 ~ 99:1이다.
구현예들에서, 아크릴로일-젤라틴의 아크릴아미드 치환도는 20% ~ 100%, 바람직하게 50% ~ 100%, 더욱 바람직하게는 80% ~ 100%, 예컨대 85% ~ 100%, 90% ~ 100%, 또는 95% ~ 100%이다. 구현예들에서, 아크릴로일-젤라틴의 아크릴산염 치환도는 20% 미만, 바람직하게는 10%, 9%, 8%, 7% 또는 6% 미만, 더욱 바람직하게는 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이다. 구현예들에서, 아크릴로일-젤라틴의 아크릴아미드 치환도는 20% ~ 100%이고, 아크릴산염 치환도는 20% 미만이고, 바람직하게 아크릴아미드 치환도는 20% ~ 100%이고, 아크릴산염 치환도는 10% 미만이고, 더욱 바람직하게 아크릴아미드 치환도는 50% ~ 100%이고, 아크릴산염 치환도는 10% 미만이고, 더욱더 바람직하게 아크릴아미드 치환도는 80% ~ 100%이고, 아크릴산염 치환도는 10% 미만이다.
구현예들에서, 아크릴로일-젤라틴은 아크릴아미드 치환 및 아크릴산염 치환을 포함하고, 아크릴아미드 치환 대 아크릴산염 치환의 비율은 80:20 ~ 99:1, 바람직하게 90:10 ~ 99:1, 더욱 바람직하게 95:5 ~ 99:1이다.
본원에 개시된 (메트)아크릴로일-젤라틴은 추가로 변형될 수 있고/있거나 작용화될 수 있다. 구현예들에서, (메트)아크릴로일-젤라틴은 아세틸기 또는 아세틸부, 페놀기 또는 페놀부, 티올기 또는 티올부, 노르보넨기 또는 노르보넨부, 테트라진기 또는 테트라진부, 아지드기 또는 아지드부, 푸란기 또는 푸란부, 갈락토실기 또는 갈락토실부, 또는 이의 임의의 조합으로 추가 변형되고, 바람직하게는 아세틸기로 추가 변형된다. 이중 화학 작용화 젤라틴-(메트)아크릴로일아세틸은 문헌[Hoch et al. (2012. "Chemical tailoring of gelatin to adjust its chemical and physical properties for functional bioprinting." J. Mater. Chem. B 1:5675]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
본원에 개시된 젤MA 및 아크릴로일-젤라틴은 발열 활성이 작다. 발열 활성은 당 분야에 공지된 바와 같은 단핵구 활성화 테스트(Monocyte Activation Test; MAT) 검정이 사용되어 측정될 수 있다. MAT 검정은 내독소 수준과 비 내독소 발열원 수준 둘 다의 정량을 허용하지만, PAMP 오염의 유형들은 구별하지는 못한다. 세포 기반 발열원 검출 검정(PAMP 검정)이 비 내독소라고도 공지된 상이한 PAMP를 검출 및 정량하기 위해 프라운호퍼 인터페이스 공학 연구소(Fraunhofer Institute for Interfacial Engineering) 및 Biotechnology IGB에 의해 개발되었다. 이러한 세포 기반 테스트 시스템은 인간의 Toll 유사 수용체(TLR)를 사용하여 PAMP를 검출한다[Burger-Kentischer et al. (2010) "new cell-based innate immune receptor assay for the examination of receptor activity, ligand specificity, signaling pathways and the detection of pyrogens."J Immunol Methods, 358: 93-103]. 더욱 구체적으로 세포, 예컨대 NIH3T3 세포는 상이한 PAMP의 검출을 허용하는 상이한 TLR 조합을 발현한다. 예를 들어 수용체 조합 TLR1/2, TLR2/6, TLR4/CD14, TLR5, TLR7 및 TLR9를 가지는 세포주는 그램 양성 세균으로부터의 발열원 검출을 허용하고(TLR1/2, TLR2/6), 편모 세균으로부터의 발열원 검출을 허용하고(TLR5), 단일 가닥 바이러스 RNA 검출을 허용하고(TLR7), 세포주 TLR4/CD14는 그램 음성 세균으로부터의 내독소 검출을 허용하고, TLR9 세포주는 비메틸화 CpG 모티프가 풍부한 세균 DNA를 검출한다. 구현예에서, 본원에 개시된 젤MA 및 아크릴로일-젤라틴은 그램 양성 세균으로부터의 발열원, 편모 세균으로부터의 발열원, 단일 가닥 바이러스 RNA, 그램 음성 세균으로부터의 내독소, 그리고 비메틸화 CpG 모티프가 풍부한 세균 DNA의 함량이 낮다.
특정 구현예에서, 젤MA 및 아크릴로일-젤라틴은 그램 양성 세균으로부터의 발열원, 편모 세균으로부터의 발열원 함량이 낮고, 더욱 구체적으로 그램 양성 세균으로부터의 발열원 함량이 낮다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 젤MA 및 아크릴로일-젤라틴은 내독소 또는 리포다당체(LPS)의 함량이 낮은 것을 특징으로 하는데, 구체적으로 LPS 함량이 100 EU/g 미만, 더욱 바람직하게는 50 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게는 20 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 10 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게는 5 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게는 2 EU/g 미만, 가장 바람직하게는 1 EU/g 미만인 것을 특징으로 한다. 추가의 특정 구현예에서, 본원에 개시된 젤MA 및 아크릴로일-젤라틴은 A 유형의 젤라틴이고(A 유형의 젤라틴으로부터 유래하고), LPS 함량이 100 EU/g 미만, 더욱 바람직하게는 50 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 20 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 10 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 5 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 2 EU/g 미만, 가장 바람직하게 1 EU/g 미만인 것을 특징으로 한다. 기타 추가의 특정 구현예에서, 본원에 개시된 젤MA 및 아크릴로일-젤라틴은 B 유형의 젤라틴이고(B 유형의 젤라틴으로부터 유래하고), LPS 함량이 20 EU/g 미만, 바람직하게 10 EU/g 미만, 더욱 바람직하게 5 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 2 EU/g 미만, 가장 바람직하게 1 EU/g 미만인 것을 특징으로 한다. EU란 용어는 당 분야에 공지되어 있으며, "내독소 단위"를 반영한다. EU 1개는 이.콜라이(E. coli) 리포다당체 대략적으로 100 pg에 해당하는데, 이 양은 약 104개 ~ 약 105개 세균에 존재하는 양이다. 본원에서 "EU/g"란 용어는, 젤라틴/젤MA의 건조 중량당 EU 개수를 반영한다. 리물러스 검정법(LAL)은 피코그램 이하의 양만큼의 LPS를 측정하기 위한 방법으로서, 당 분야에 널리 공지된 생물검정법이다. 리물러스 유주세포 용해물(Limulus Amebocyte Lysate; LAL)은 투구게인 리물러스 폴리페무스(Limulus polyphemus)로부터 유래하는 혈구 세포(유주세포)의 수성 추출물이다. LAL은 세균 내독소 또는 리포다당체와 반응한다. 이 반응은 세균 내독소를 검출 및 정량하는데 사용되는 LAL 테스트의 근강을 이룬다. 예를 들어 LPS 수준을 정량하기 적합한 LAL 방법은, 예컨대 Charles River USA의 비색 Endosafe 방법이다. 기타 수용되고 권장되는 방법으로서는 EndoZyme 제조합 요소 C 방법(Hyglos GmbH(독일))이 있다. 상기 방법들 둘 다로부터는 유사하거나 동일한 측정값이 수득되므로, 이 두 방법은 호환되어 사용될 수 있다.
본원에 개시된 젤MA 및 아크릴로일-젤라틴에는 실질적으로 시약과 반응 생성물이 존재하지 않는다는 점 또한 유리하다. 구현예에서, 본원에 개시된 메타크릴로일-젤라틴은 150 ppm 미만의 MAA 또는 100 ppm 미만의 MAA 또는 50 ppm 미만의 MAA를 포함하고, 바람직하게 30 ppm 미만의 MAA, 더욱 바람직하게는 25 ppm 미만의 MAA, 더욱더 바람직하게 20 ppm 미만의 MAA를 포함한다. 구현예들에서, 본원에 개시된 메타크릴로일-젤라틴은 150 ppm 미만의 MAA, 예컨대 140 ppm 미만의 MAA, 130 ppm 미만의 MAA, 120 ppm 미만의 MAA, 110 ppm 미만의 MAA, 바람직하게 100 ppm 미만의 MAA, 예컨대 90 ppm 미만의 MAA, 80 ppm 미만의 MAA, 70 ppm 미만의 MAA 또는 60 ppm 미만의 MAA를 포함하는데, 여기서 MAA 함량은 50 mM 인산염 완충제(pH 9.5)에 용해된 메타크릴로일-젤라틴 시료를 기준으로 확정된다. 구현예에서, 본원에 개시된 메타크릴로일-젤라틴은 100 ppm 미만의 MAA 또는 50 ppm 미만의 MAA, 바람직하게는 30 ppm 미만의 MAA, 더욱 바람직하게는 25 ppm 미만의 MAA, 더욱더 바람직하게 20 ppm 미만의 MAA를 포함하는데, 여기서 MAA 함량은 수중에 용해된 메타크릴로일-젤라틴 시료를 기준으로 확정된다. 구현예에서, 본원에 개시된 아크릴로일-젤라틴은 100 ppm 미만의 아크릴산 또는 50 ppm 미만의 아크릴산, 바람직하게는 30 ppm 미만의 아크릴산, 더욱 바람직하게 25 ppm 미만의 아크릴산, 더욱더 바람직하게 20 ppm 미만의 아크릴산을 포함한다. MAA는 실시예에 상세히 기재된 바와 같이 측정될 수 있는데, 구체적으로 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴 시료를 수중 또는 50 mM 인산염 완충제(pH 9.5)중에 용해한 다음, 용해된 시료를 (예컨대 10-kDa Amicon Ultra Centrifugal Filter를 사용하여) 한외여과한 후, 이 여과액을 HPLC로 분석함으로써 측정될 수 있다. 본 발명자들에 의해 보인 바와 같이 젤MA중 메타크릴산 잔류물은 젤MA 분자의 가교를 방해할 수 있다. 본원에 개시된 젤MA는 메타크릴산 함량이 낮은 관계로 하이드로겔 또는 필름을 제조하기 위한 가교에 특히 적합하다.
그러므로 추가의 양태는 본원에 개시된 바와 같이 가교된 젤MA 또는 가교된 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 하이드로겔에 관한 것이다. 상기 하이드로겔로 제조된 물품, 예컨대 필름, 생체접착제 등이 추가로 본원에 개시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "하이드로겔"이란 용어는, 겔을 형성하는 친수성 중합체 사슬들의 네트워크, 예컨대 가교된 젤MA 또는 가교된 아크릴로일-젤라틴을 지칭한다. "젤"이란 용어는, 정상 상태일 때 유동성을 보이지 않고, 실질적으로 희석 가교된 시스템을 나타낸다.
젤MA 및 아크릴로일-젤라틴을 가교하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 통상적으로 광 개시제가 존재할 때 젤라틴 분자상 (메트)아크릴로일기가 광선에 노출되면, 이 (메트)아크릴로일기는 또 다른 젤라틴 분자상에 존재하는 (메트)아크릴로일기와 반응할 수 있으며, 그 결과 (메트)아크릴로일 젤라틴이 가교될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "광 개시제"란 용어는, 광선, 예컨대 자외선(UV) 또는 가시광선(VIS)에 노출될 때 자유 라디칼로 분해되는 임의의 화학적 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 지칭한다. 자외선 광 개시제의 비제한적 예로서는, 1-[4-(2-하이드록시에톡시)-페닐]-2-하이드록시-2-메틸-1-프로판-1-온(상표명 Irgacure® 2959로도 공지됨) 및 리튬페닐-2,4,6-트리-메틸벤조일포스핀산염(LAP)을 포함한다. 가시 광선 광 개시제는 가시광선에 노출될 때 자유 라디칼을 생성한다. 가시 광선 광 개시제를 여기시키기 유용한 가시광선의 예시적 범위는 녹색광, 청색광, 남색광 및 보라색광을 포함한다. 바람직하게 가시광선의 파장은 450 nm ~ 550 nm의 범위에 있다. 가시 광선 광 개시제의 비제한적 예로서는 에오신 Y, 리보플라빈/트리에탄올아민, 비닐 카프로락탐, 디-2,3-디케토-1,7,7-트리메틸노르캄판(CQ), 1-페닐-1,2-프로판디온(PPD), 2,4,6-트리메틸벤조일-디페닐포스핀 산화물(TPO), 비스(2,6-디클로로벤조일)-(4-프로필페닐)포스핀 산화물(Ir819), 4,4'-비스(디메틸아미노)벤조페논, 4,4'-비스(디에틸아미노)벤조페논, 2-클로로티옥산텐-9-온, 4-(디메틸아미노)벤조페논, 페난트렌퀴논, 페로센, 디페닐(2,4,6-트리메틸벤조일)포스핀 산화물/2-하이드록시-2-메틸프로피오페논(50/50 배합물), 디벤조수베레논, (벤젠)트리카보닐크롬, 레사주린, 레소루핀, 벤조일트리메틸게르만(Ivocerin®), 이것들의 유도체 및 이것들의 임의의 조합을 포함한다.
광선 조사 시간은 중합체를 가교시킬 수 있는데 적합한 임의의 시간일 수 있다. 예를 들어 조사 시간은 10초 ~ 20분, 바람직하게는 1분 ~ 20분, 더욱 바람직하게 2분 ~ 15분(예컨대 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분 또는 15분)의 범위일 수 있다.
젤라틴 기반 하이드로겔의 기계적 특성은, 예컨대 사용된 젤라틴의 분자량, (메트)아크릴로일 치환도, 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴 농도, 광 개시제 양 및 광선 노출 시간을 변경하여 다양한 용도를 위해 조정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 (메트)아크릴로일 치환 젤라틴의 농도는 (메트)아크릴로일 치환 젤라틴 중량을 용매 부피로 나눈 값(w/v)으로서 정의되고, %로 표현된다. 용매는 약학적으로 허용 가능한 담체일 수 있다. 하이드로겔에 관한 구현예에서, 메타크릴로일 치환 젤라틴 또는 아크릴로일 치환 젤라틴은 5%(w/v) ~ 25%(w/v), 17%(w/v) ~ 25%(w/v), 17%(w/v) ~ 23%(w/v), 또는 약 20%(w/v)의 농도로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 메타크릴로일 치환 젤라틴 또는 아크릴로일 치환 젤라틴은 5%(w/v) ~ 15%(w/v), 8%(w/v) ~ 12%(w/v), 또는 약 10%(w/v)의 농도로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 메타크릴로일 치환 젤라틴 또는 아크릴로일 치환 젤라틴은 10%(w/v) ~ 40%(w/v), 15%(w/v) ~ 35%(w/v), 20%(w/v) ~ 30%(w/v), 또는 약 5%(w/v), 10%(w/v), 15%(w/v), 20%(w/v) 또는 25%(w/v)의 농도로 존재한다.
화학적으로 변형된 젤라틴, 구체적으로 메타크릴로일-젤라틴 및 아크릴로일-젤라틴, 그리고 본 발명에 따른 하이드로겔은 다양한 용도, 예컨대 인간 및 인간을 제외한 동물의 조직(예컨대 연골, 연조직) 제조 또는 수복용으로 사용될 수 있고, 생물학적 구조의 3차원 생체조직제조 또는 3차원 바이오프린팅용 바이오잉크 또는 바이오수지(이에 한정되는 것은 아님)로 사용될 수 있다. 생물학적 구조는 생체조직제조 또는 바이오프린팅 기술이 사용되어 제조될 수 있는 임의의 동물 조직 또는 장기이거나, 이의 일부, 에컨대 다공성일 수 있거나 다공성이 아닐 수 있는, 세포 함유 스캐폴드일 수 있다.
"바이오잉크"란 용어는, 특정의 형상 또는 구조로 3D 인쇄될 수 있거나, 3D 플롯팅(plotting)될 수 있거나, 또는 제작될 수 있으며, 세포적합성(cytocompatible)인 하이드로겔을 지칭한다. 하이드로겔은 생세포 및/또는 성장 인자 등을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
"바이오수지"란 용어는, 레이저 또는 광선 투영 기반 광선 입체리소그래피또는 유사한 리소그래피 기술이 사용되어 특정의 형상 또는 구조로 3D 인쇄될 수 있거나 제작될 수 있고, 세포적합성인 하이드로겔을 나타낸다. 하이드로겔은 생세포, 약물 및/또는 성장 인자 등을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
그러므로 한 양태는 의료분야에 사용하기 위한 것으로서, 본원에 개시된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴, 또는 이 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 하이드로겔에 관한 것이다. 추가의 양태는 인간 또는 인간 이외의 동물의 조직 또는 장기 또는 이의 부분을 수복하는데 사용하기 위한 것으로서, 본원에 개시된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴, 또는 본원에 개시된 이 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 하이드로겔에 관한 것이다. 구현예에서, 조직 또는 장기는 뼈 조직, 연골 및 혈관 조직으로부터 선택된다. 구현예에서, 본원에 개시된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴, 또는 본원에 개시된 이 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 하이드로겔은 생체접착제 또는 바이오글루(bioglue)로 사용되도록 제공된다. 본원에 개시된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴, 또는 본원에 개시된 이 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 하이드로겔은, 예컨대 정형외과적 용도, 치과적 용도 또는 화장품 및 성형수술에 사용될 수 있다.
관련된 양태는 본원에 개시된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴, 또는 본원에 개시된 이 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 하이드로겔의, 조직 또는 장기 또는 이의 일부를 제조하기 위한 시험관내 또는 생체외 용도에 관한 것이다. 구현예에서, 조직 또는 장기는 뼈 조직, 연골 및 혈관 조직으로부터 선택된다. 본원에 개시된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴, 또는 본원에 개시된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 하이드로겔을 포함하고, 조직 공학에 의하여 제조된 조직 또는 장기 또는 이의 일부도 또한 본원에 개시되어 있다.
또 다른 양태는 본원에 개시된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴, 또는 본원에 개시된 이 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 하이드로겔의, 제어 방출 제형 또는 생물학적 구조를 제조하기 위한 시험관내 또는 생체외 용도에 관한 것이다. 생물학적 구조는, 예컨대 세포의 접착과 증식에 적합한 (고체) 지지체상 코팅, 또는 세포 또는 약물 및/또는 벡터를 함유하기 적합한 스캐폴드일 수 있다.
또 다른 양태는 본원에 개시된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴, 또는 본원에 개시된 이 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 하이드로겔의, 바이오잉크 또는 바이오수지로서의 용도에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, 바이오잉크 또는 바이오수지는 생물학적 구조의 3차원 생체조직제조 또는 3차원 바이오프린팅에 사용된다. 생물학적 구조는 동물 조직 또는 장기 또는 이의 일부일 수 있다. 생물학적 구조는 또한 세포를 함유하는데 적합한 스캐폴드 또는, 예컨대 약물 및/또는 벡터를 함유하기 적합한(예컨대 약물 전달 및/또는 유전자 치료 분야에 적합한) 스캐폴드일 수 있다. 생물학적 구조는 또한 생체흡수성 스크루 또는 기타 생체재료(예컨대 생체접착제)일 수도 있다. 구현예에서, 생물학적 구조는 세포를 함유하기 적합한 스캐폴드이다. 구현예에서, 생물학적 구조는 코팅이다. 본원에 개시된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴, 또는 본원에 개시된 이 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴의 하이드로겔을 포함하는 생물학적 구조도 또한 본원에 개시되어 있다.
또 다른 양태는 본원에 개시된 바와 같은 메틸아크로일-젤라틴 및 아크릴로일-젤라틴을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 놀랍게도 WO 2016/085345에 기재된 방법에 따른 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴의 수성 반응 매질을 정제함으로써, 매질로부터 리포다당체가 제거될뿐 아니라, 또 다른 발열원이 제거되고, 각각 메타크릴화 반응 및 아크릴로일화 반응중에 형성된 메타크릴산 및 아크릴산이 제거된다는 것을 발견하였다. 그러므로 반응 매질은 투석할 필요가 없고, 그로 말미암아 본 방법은 본원의 어딘가에 명시된 바와 같이 LPS 함량이 낮고, 발열원 함량이 낮으며, 메타크릴산 또는 아크릴산 함량이 낮은 젤MA를 더 신속하게 제공한다.
그러므로 추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 (메트)아크릴로일-젤라틴을 제조하는 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 이하의 단계들, 즉
a) 젤라틴을 (메트)아크릴산 무수물과 반응시켜 (메트)아크릴로일기로 젤라틴을 변형하는 단계;
b) 반응 매질의 pH를 2.0 ~ 5.0, 바람직하게 2.0 ~ 4.0, 더욱 바람직하게 3.0 ~ 4.0 또는 2.0 ~ 3.5, 더욱더 바람직하게 3.0 ~ 3.5의 값으로 강하시키는 단계;
c) 미셀 형성 계면활성제를 반응 매질에 첨가하는 단계;
d) 단계 c)의 매질과 고체 흡착제를 접촉시키는 단계;
e) 단계 d)의 고체 흡착제를 매질과 분리하는 단계;
f) 메타크릴로일-젤라틴을 포함하는 매질을 회수하는 단계; 및
g) 선택적으로 단계 f)의 (메트)아크릴로일-젤라틴을 포함하는 매질을 건조하는 단계
를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 (메트)아크릴로일-젤라틴을 제조하는 대안적 방법은 이하의 단계들, 즉
a) 젤라틴을 (메트)아크릴산 무수물과 반응시켜 (메트)아크릴기로 젤라틴을 변형하는 단계;
b1) 반응 매질의 pH를 4.0 ~ 9.0, 바람직하게는 4.0 ~ 6.0, 더욱 바람직하게 4.0 ~ 6.0, 더욱더 바람직하게 4.5 ~ 5.5의 값으로 강하시키는 단계;
c) 미셀 형성 계면활성제를 반응 매질에 첨가하는 단계;
b2) 단계 c)의 매질의 pH를 2.0 ~ 4.0, 바람직하게는 3.0 ~ 4.0, 또는 2.0 ~ 3.5,더욱 바람직하게 3.0 ~ 3.5의 값으로 강하시키는 단계;
d) 단계 b2)의 매질을 고체 흡착제와 접촉시키는 단계;
e) 단계 d)의 고체 흡착제를 매질과 분리하는 단계;
f) 메타크릴로일-젤라틴을 포함하는 매질을 회수하는 단계; 및
g) 선택적으로 단계 f)의 (메트)아크릴로일-젤라틴을 포함하는 매질을 건조하는 단계
를 포함한다.
예컨대 소, 돼지, 가금류 또는 어류로부터 기원하는 임의의 젤라틴 유형, 예컨대 A 유형 젤라틴 또는 B 유형 젤라틴은 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 구현예에서, A 유형 젤라틴이 사용된다. 다른 구현예에서는, B 유형 젤라틴이 사용된다.
젤라틴의 메타크릴로일화 및 아크릴로일화는 적합한 완충제, 예컨대 탄산염 완충제(pH 9.0) 또는 인산염 완충 염수(PBS)중 50℃의 온도에서 60분 ~ 180분, 예컨대 60분 또는 120분 ~ 180분 동안 젤라틴을 메타크릴산 무수물 및 아크릴산 무수물 각각과 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 젤MA의 (메트)아크릴로일화도는 (메트)아크릴산 무수물 : 젤라틴의 비율을 문헌[Shirahama et al. (2016)]에 기재된 바와 같이 가변화함으로써 조정될 수 있다. 반응중 젤MA 및 아크릴로일-젤라틴뿐 아니라 메타크릴산 또는 아크릴산이 각각 생성된다.
반응 매질의 pH는 본원에 기재된 방법에 있어 미셀 형성 계면활성제가 첨가되기 전 2.0 ~ 5.0, 바람직하게 2.0 ~ 4.0, 더욱 바람직하게 3.0 ~ 4.0의 값, 예컨대 약 3.5 또는 2.0 ~ 3.5의 값, 예컨대 약 3.0의 값, 더욱 바람직하게 3.0 ~ 3.5의 값(단계 b)으로 낮아질 수 있다. 대안적으로 반응 매질의 pH는 본원에 기재된 방법에 있어 미셀 형성 계면활성제를 첨가하기 전(단계 b1) 4.0 ~ 9.0, 바람직하게 4.0 ~ 6.0, 더욱 바람직하게 4.0 ~ 6.0, 더욱더 바람직하게 4.4 ~ 5.5의 값으로 낮아질 수 있으며, 본원에 기재된 방법에 있어 미셀 형성 계면활성제를 첨가한 후와 매질을 고체 흡착제와 접촉시키기 전(단계 b2) 2.0 ~ 4.0, 더욱 바람직하게 3.0 ~ 4.0의 값, 예컨대 약 3.5 또는 2.0 ~ 3.5의 값, 예컨대 약 3.0의 값, 더욱더 바람직하게는 3.0 ~ 3.5의 값으로 더욱 낮아질 수 있다. 유리하게, 낮은 pH에서 그 다음 방법 단계가 수행될 때, LPS, 발열원 및 메타크릴산 또는 아크릴산은 더욱 효율적으로 제거된다.
본원에 기재된 방법에 있어 미셀 형성 계면활성제가 반응 매질에 첨가된다. 미셀 형성 계면활성제는 용액중 미셀(가용성 응집체)을 형성할 수 있다. 미셀 형성 계면활성제는 당 분야에 공지되어 있으며, 예컨대 WO 2009/15440에 기재되어 있다. 미셀 형성 계면활성제는 이온성 계면활성제, 예컨대 양이온성 또는 음이온성 계면활성제일 수 있다. 바람직하게 계면활성제는 비이온성 계면활성제이며, 이 비이온성 계면활성제는 이온성 계면활성제보다 더 낮은 농도에서 미셀을 형성한다. 또한 이온성 계면활성제는 이온 결합에 의해 젤라틴과 상호작용할 수 있으며, 제거하기 더욱 어렵다. 바람직하게 미셀 형성 비이온성 계면활성제는 에톡실화된 계면활성제, 바람직하게 알킬페놀 에톡실레이트로서, 바람직하게는 화학식 CxH2x-i-C6H4-O-(C2H4O)nH[식 중 x는 4 ~ 12이고, n은 7.5 ~ 14이며, X는 바람직하게 8이고, n은 바람직하게 8 ~ 13, 더욱 바람직하게 8.5 ~ 12.5이며, 가장 바람직하게 9 ~ 12임]으로 표시되는 알킬페놀 에톡실레이트, 구체적으로 Triton X-100, Triton X-102 또는 이의 혼합물이다. 비이온성 계면활성제 Triton X 계열은 옥틸페놀을 산화에틸렌과 반응시킴으로써 제조된다. 이 제품은 알킬아릴폴리에테르알코올로서 통상적으로 기재되는 유형의 것이며, 이하의 구조식, 즉 C8H17 C6H5(CH2CH2O)9.7(Triton X-100) 및 C9H19 C6H5(CH2CH2O)12.3(Triton X-102)을 가진다. 적합한 기타 비이온성 계면활성제는 노닐페녹시폴리에톡시에탄올 C15H24O(C2H4O)n [식 중, n은 3 ~ 40임]로서, 예컨대 노녹시놀-4, 노녹시놀-15 및 노녹시놀-30, 또는 C12 ~ C18 지방산의 폴리에틸렌글리콜솔비탄 모노에스테르, 예컨대 TWEEN을 포함한다. CHAPSO (3-([3-콜아미도프로필]디메틸암모니오)-2-하이드록실-1-프로판설폰산염은 또 다른 적합한 비이온성 계면활성제이다.
WO 2009/15440에 기재된 바와 같이, 미셀 형성 계면활성제를 첨가하였을 때의 결과로서 LPS는 단량체화되고, 상기 단량체는 계면활성제와 상호작용하여, 계면활성제와 LPS를 포함하는 미셀 복합체를 형성할 것으로 생각된다.
LPS뿐 아니라, 바람직하게는 다른 발열원, 구체적으로 그램 양성 세균으로부터의 발열원 및 편모 세균으로부터의 발열원, 더욱 구체적으로 그램 양성 세균으로부터의 발열원의 효율적인 제거가 허용되도록 하기 위해, 젤라틴, 구체적으로 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴 대 첨가된 계면활성화제, 구체적으로 비이온성 계면활성화제의 중량비는, 바람직하게 2000 : 1 이하, 더욱 바람직하게 500 : 1 이하, 더욱더 바람직하게 250 : 1 이하, 가장 바람직하게 50 : 1 이하이다. 실제로 중량비가 더 클 때, 즉 젤라틴이 비교적 더 많이 있을 때, 모든 LPS가 계면활성제에 의해 결합되지는 않을 것이다. 바람직하게 계면활성제는 0.01 w/w% ~ 1.5 w/w%, 바람직하게 0.015 w/w% ~ 1.0 w/w%, 더욱 바람직하게 0.020 w/w% ~ 0.50 w/w%의 농도로 반응 매질에 첨가된다.
본원에 기재된 방법의 단계 d)에 있어, 계면활성제, LPS 및 이의 단량체 및/또는 다른 발열원, 구체적으로 그램 양성 세균으로부터의 발열원 및 편모 세균으로부터의 발열원, 더욱 구체적으로 그램 양성 세균으로부터의 발열원을 포함하는 가용성 응집체를 함유할 수 있는 단계 c)의 매질 또는 단계 b2)의 매질은 고체 흡착제와 접촉한다. 흡착제는 또한 계면활성제뿐 아니라, 바람직하게는 LPS에 더하여, 바람직하게 다른 발열원, 구체적으로 그램 양성 세균으로부터의 발열원, 편모 세균으로부터의 발열원, 단일 가닥 바이러스 RNA, 그리고 비메틸화 CpG 모티프가 풍부한 세균 DNA, 그리고 메타크릴산 또는 아크릴산과 결합한다.
고체 흡착제는 계면활성제와, 바람직하게는 LPS, 기타 발열원 및 (메트)아크릴산과 결합할 수 있는 것으로서, 당 업자에게 공지된 임의의 적합한 흡착제, 예컨대 소수성 흡착제일 수 있다. 흡착제는, 바람직하게 불용성이고, 적합한 흡착제는 점토, 예컨대 (활성화된) 규조토 또는 점토, 엽상규산염, 예컨대 엽상규산알루미늄, 녹점토 무기물 및 소수성 흡착제, 예컨대 활성탄, 예컨대 Norit SX Plus 또는 Norit ROX 0.8(Cabot, the Netherlands), 또는 3M ZetaCarbon 필터 카트리지, 예컨대 R55S 유형 또는 R30L3S 유형의 것(3M, USA)을 포함한다. 1가지 이상의 흡착제의 혼합물도 또한 적용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 고체 흡착제는 활성탄이다.
매질과 고체 흡착제를 접촉시키는 것은, 예컨대 미립자 흡착제를 매질에 첨가하거나, 상기 흡착제를 포함하는 필터 부재에 매질을 통과시키거나 또는 흡착제가 적재된 컬럼 자체로 매질을 통과시키거나, 또는 그 외표면에 흡착제가 존재하는 담체와 함께 매질을 항온처리함으로써 수행될 수 있다.
고체 흡착제는, 바람직하게 계면활성제에 대한 중량비 적어도 2.5 : 1, 더욱 바람직하게 적어도 3.0 : 1, 가장 바람직하게 적어도 3.5 : 1로 매질에 첨가된다. 고체 흡착제는, 바람직하게 0.1 w/w% ~ 3 w/w%, 바람직하게 0.5 w/w% ~ 1 w/w%의 농도로 매질에 첨가된다. 필터 부재 또는 시스템이 사용되는 경우, 필터 시스템내 흡착제는 유사한 양만큼 사용되는 것이 바람직할 수 있다.
접촉 단계는 계면활성제, 이 계면활성제와 결합한 LPS 및/또는 다른 발열원, 구체적으로 그램 양성 세균으로부터의 발열원 및 편모 세균으로부터의 발열원, 더욱 구체적으로 그램 양성 세균으로부터의 발열원의 제거가 달성되도록 계면활성제의 적당한 흡착이 허용되기 충분한 시간 동안, 그리고 바람직하게는 이 계면활성제와 결합한 (메트)아크릴산, LPS 및 기타 발열원, 구체적으로 그램 양성 세균으로부터의 발열원, 편모 세균으로부터의 발열원, 단일 가닥 바이러스 RNA, 그리고 비메틸화 CpG 모티프가 풍부한 세균 DNA, 그리고 메타크릴산의 흡착이 허용되기 충분한 시간 동안 수행된다. 바람직하게 이 흡착제는 5분 ~ 1시간, 더욱 바람직하게 10분 ~ 30분 동안 (수성) 매질과 접촉한다.
본원에 기재된 방법의 그 다음 단계 (e)에서, 고체 흡착제는 매질로부터 제거된다. 당 업자는 수성 매질과 고체 흡착제를 접촉시키고, 흡착제를 매질과 분리하기 적합한 방법을 인지하고 있다. 상기 분리 방법은, 예컨대 흡착제가 미립자로서 매질에 첨가되는 경우에는 원심분리 또는 여과를 포함할 수 있는데, 산업상 이용 가능성에 비추어볼 때 여과가 바람직하다. 예를 들어 고체 흡착제는 (단계 c) 또는 단계 b2)의) 매질에 첨가될 수 있고, 계면활성제뿐 아니라, 바람직하게는 LPS, 기타 발열원 및 MAA 또는 아크릴산이 흡착제에 결합될 수 있도록 허용된 후, 흡착제는, 예컨대 여과, 침강 또는 원심분리 등에 의해 제거될 수 있다. 또 다른 예에 있어, 고체 흡착제는 필터내에 존재할 수 있으며, 본원에 기재된 방법의 (단계 c) 또는 단계 b2)의) 매질은 상기 필터 또는 일련의 이 필터를 통과하고, 이 때 필터는 여과액 수율을 최적화하기 위해, 선택적으로 세척될 수 있다. 이러한 방식, 즉 본원에 기재된 방법의 단계 d), e) 및 f)는 단일 여과 단계로 합하여질 수 있다.
고체 흡착제가 분리된 후, 메타크릴로일-젤라틴 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 매질이 회수된다.
바람직하게 본원에 기재된 방법의 단계 c) ~ f)는 사용된 계면활성제의 혼탁점(cloud point)보다 낮은 온도에서 수행된다. 본원에 사용된 바와 같은 "혼탁점"이란 용어는, 계면활성제가 매질중에 불용성 응집체를 형성하는 온도를 지칭한다. 상기 온도는 매질의 조건, 예컨대 염 농도에 따라 좌우된다. 특정 조건이 주어지지 않을 때, 본원에서 혼탁점은 1 w/w%의 수용액이 불용성 응집체를 형성하는 온도로 정의된다. 그러므로 만일 온도가 계면활성제의 혼탁점보다 낮다고 기재되면, 상기 온도는 68℃ ~ 69℃이지만(즉 1 w/w% Triton X-100 용액의 경우), 16 w/w% ~ 25 w/w% NaCI 용액의 경우, 상기 혼탁점은 실온이다. 혼탁점은 계면활성제가 첨가되지 않았을 때 620 nm에서의 용액의 흡광도를 측정하고, 상상된 양만큼의 계면활성제가 첨가될 때 흡광도가 증가하였는지 여부를 체크함으로써, 편리하게는 소정의 환경하에 확정될 수 있다. 혼탁점보다 높은 온도에서 흡광도는 증가한다.
구현예에서, 단계 c) ~ f)는 65℃ 이하, 더욱 바람직하게는 62℃ 이하, 더욱더 바람직하게는 60℃ 이하의 온도에서 수행된다. 구현예에서, 단계 c) ~ f)는 30℃ ~ 65℃, 바람직하게는 30℃ ~ 60℃, 더욱 바람직하게는 30℃ ~ 50℃, 또는 30℃ ~ 40℃, 더욱더 바람직하게는 30℃ ~ 35℃의 온도에서 수행된다.
구현예에서, 매질의 pH는 본 방법의 단계 c) ~ f) 전반에 걸쳐 2.0 ~ 5.0, 바람직하게 2.0 ~ 4.0, 더욱 바람직하게 3.0 ~ 4.0, 예컨대 약 3.5, 또는 2.0 ~ 3.5, 예컨대 약 3.0, 더욱더 바람직하게 3.0 ~ 3.5이다. 이러한 pH에서 온도는, 바람직하게 35℃ 이하, 더욱 바람직하게는 30℃ ~ 35℃, 예컨대 약 30℃이다.
다른 구현예에서, 매질의 pH는 본 방법의 단계 d) ~ f) 전반에 걸쳐 2.0 ~ 5.0, 바람직하게 2.0 ~ 4.0, 더욱 바람직하게 3.0 ~ 4.0, 예컨대 약 3.5, 또는 2.0 ~ 3.5, 예컨대 약 3.0, 더욱더 바람직하게 3.0 ~ 3.5이다. 이러한 pH에서 온도는, 바람직하게 35℃ 이하, 더욱 바람직하게는 30℃ ~ 35℃, 예컨대 약 30℃이다.
메타크릴로일-젤라틴 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하는 매질이 회수된 후, 본 방법은 매질의 pH를 3.5 ~ 9.0, 바람직하게 4.0 ~ 8.0, 더욱 바람직하게 5.0 ~ 7.0으로 상승시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
전술된 바와 같이, 본원에 기재된 방법은 LPS 함량이 낮은 메타크릴로일-젤라틴 또는 아크릴로일-젤라틴, 구체적으로 LPS 함량이 100 EU/g 미만, 더욱 바람직하게는 50 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게는 20 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게는 10 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게는 5 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게는 2 EU/g 미만, 가장 바람직하게는 1 EU/g 미만인 메타크릴로일-젤라틴 또는 아크릴로일-젤라틴을 제공한다. 구체적으로 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴은, 단계 a)의 출발 물질로 사용된 젤라틴의 LPS 함량에 비하여, 적어도 50배, 바람직하게 적어도 100배, 더욱 바람직하게 적어도 150배, 더욱더 바람직하게 적어도 200배, 그리고 가장 바람직하게 적어도 250배 적은 LPS 함량으로 LPS를 포함한다. LPS 개수는, 예컨대 본원의 어딘가에 기재된 바와 같은 LAL 검정을 사용하여, 회수된 매질을 기준으로 확정될 수 있다.
수득된 메타크릴로일-젤라틴 또는 아크릴로일-젤라틴은 비 내독소 발열원의 낮은 함량, 구체적으로는 그램 양성 세균으로부터의 발열원, 편모 세균으로부터의 발열원, 단일 가닥 바이러스 RNA, 그램 양성 세균으로부터의 내독소, 그리고 비메틸화 CpG 모티프가 풍부한 세균 DNA의 낮은 함량, 더욱 구체적으로 그램 양성 세균으로부터의 발열원, 편모 세균으로부터의 발열원의 낮은 함량, 더욱더 바람직하게 그램 양성 세균으로부터의 발열원의 낮은 함량에 의해 추가로 특징지어진다. 구체적으로 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴은, 단계 a)의 출발 물질로서 사용된 젤라틴중 그램 양성 세균으로부터의 발열원 함량에 비하여 적어도 10배 낮거나, 바람직하게 적어도 20배 낮거나, 더욱 바람직하게 적어도 50배 낮거나, 더욱더 바람직하게 적어도 100배 낮거나, 적어도 150배, 적어도 200배, 또는 적어도 250배 더 낮은 함량으로 그램 양성 세균으로부터의 발열원을 포함한다. 구체적으로 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴은, 단계 a)의 출발 물질로서 사용된 젤라틴중 편모 세균으로부터의 발열원 함량에 비해 적어도 10배 낮거나, 바람직하게 적어도 20배 낮거나, 더욱 바람직하게 적어도 50배 낮거나, 더욱더 바람직하게 적어도 100배 더 낮거나, 적어도 150배, 적어도 200배, 또는 적어도 250배 더 낮은 함량으로 편모 세균으로부터의 발열원을 포함한다. 구체적으로 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴은, 단계 a)의 출발 물질로서 사용된 젤라틴중 비메틸화 CpG 모티프가 풍부한 세균 DNA 또는 단일 가닥 바이러스 RNA 함량보다 적어도 10배 낮거나, 바람직하게 적어도 20배 낮거나, 더욱 바람직하게 적어도 50배 낮거나, 더욱더 바람직하게 적어도 100배 더 낮거나, 적어도 150배, 적어도 200배, 또는 적어도 250배 더 낮은 함량으로 비메틸화 CpG 모티프가 풍부한 세균 DNA 또는 단일 가닥 바이러스 RNA를 포함한다.
또한 본원에 기재된 방법은, 바람직하게 물에 용해된 메타크릴로일-젤라틴 시료를 기준으로 확정된 바와 같이, 메타크릴산 함량이 낮은(구체적으로 메타크릴산 함량이 100 ppm 미만, 바람직하게는 50 ppm 미만, 더욱 바람직하게 30 ppm 미만인) 메타크릴로일-젤라틴, 또는 50 mM 인산염 완충제(pH 9.5)에 용해된 메타크릴로일-젤라틴 시료를 기준으로 확정된 바와 같이, 메타크릴산 함량이 150 ppm 미만, 바람직하게 100 ppm 미만, 또는 아크릴산 함량이 낮은(구체적으로 아크릴산 함량이 30 ppm 미만인) 아크릴로일-젤라틴을 제공한다. 그러므로 본 방법은 전술된 단계 a) ~ f)(6회 또는 7회 수행)의 1 라운드에서 정제된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴을 제공한다.
본원에 기재된 방법은 투석 단계를 진행할 필요 없이 (메트)아크릴산 함량이 낮은 (메트)아크릴로일 젤라틴을 제공하므로, 본 방법은 바람직하게 투석 단계가 생략된다. 이러한 투석 단계는, 일반적으로 시간이 소모되는 단계이므로, 본 방법은 정제된 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴의 대규모 생산에 특히 더 효율적이다.
구현예에서, 본 방법은, 선택적으로 매질의 pH가 증가한 후 젤MA 또는 아크릴로일-젤라틴을 포함하며 회수된 매질을, 예컨대 동결건조에 의해 백색의 다공성 발포체로 건조하는 단계를 추가로 포함한다[Van Den Bulcke et al. 2000. "Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels". Biomacromolecules 1:31-38].
지금부터 본 발명은 이하 비제한적 실시예들에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예
실시예 1:
젤MA 제조 방법 및 젤MA의 특성
재료 및 방법
젤MA의 합성
1.25 M 탄산염 완충제(pH 9.0)중 15% ~ 20% 젤라틴(돼지 껍질, A 유형, Bloom 200) 용액을 50℃에서 120분 ~ 180분 동안 메타크릴산 무수물과 1 : 1 비율로 반응시켰다. 반응이 진행되는 동안 메타크릴산이 생성되었다. HCl을 사용하여 반응 매질의 pH를 강하시켜 탄산염을 제거하였다. (젤라틴 중량 대비) 1.12%의 Triton-X100을 매질에 첨가한 다음, 이 매질을 1시간 동안 계속 진탕하였다. 이후, 매질을 활성탄이 팩킹된 컬럼으로 여과하였다.
LPS 함량의 확정
제조자의 지침에 따라 EndoZyme II 검정 키트(Hyglos)를 사용하여 LPS 함량을 확정하였다. 요약하면, 예상 LPS 함량에 따라 2.50%(w/w) 및 10x, 20x, 50x, 100x 등의 희석배수로 초순수중 젤MA 용액을 제조하였다. 시료 100 μL씩을 다중웰 평판의 웰에 첨가한 다음, 제조자의 지침에 따라 제조한 검정 시약 100 μL와 혼합하였다. 얻어진 혼합물의 형광 세기를 미세평판 형광 판독기(BopTek; 여기/발광 = 380 nm/455 nm)로 모니터링하였다. 내독소 미포함 물에 50 EU/mL로 재구성한 내독소 표준(이.콜라이 055:B5)의 일련의 희석액을 교정 표준으로 사용하였으며; 내독소 미포함 물을 블랭크(blank)로 사용하였다.
MAA 함량의 확정
물 또는 50 mM 인산염 완충제(pH 9.5)중 젤MA 시료의 8%(w/w) 용액을 제조하였다. 시료가 실온에서 15분 동안 팽창하도록 허용하였으며, 이후 눈으로 보았을 때 시료가 완전히 용해될 때까지 50℃에서 30분 동안 방치하였다. 시료 용액 0.5 mL를 10-kDa Amicon 초원심분리필터(Milipore)에 부가한 다음, 50℃(오븐)에서 10분 동안 방치하였으며, 그 다음 시료를 12000 xg에서 30분 동안 원심분리하였다(40℃). 이후, HPLC 분석을 위해 여과액을 수집하였다.
물 또는 50 mM 인산염 완충제(pH 9.5)중 1%(w/w) 메타크릴산을 제조하고, 물 또는 50 mM 인산염 완충제(pH 9.5)로 2배 희석시킴으로써, 메타크릴산의 일련의 희석액(0.1 ppm ~ 100 ppm)을 제조하여, 표준으로 사용하였다.
DNA 함량 확정
0.1 mg/mL 연어 정소 dsDNA 표준의 모 농축액(stock concentration)을 TE 완충제(수중 1mM EDTA와 함께 10mM Tris-HCl 포함, pH = 8)중에 제조한 다음, 더 희석해서 10 μg/mL의 모 농축액을 제조하였다.
TE 완충제중 10 μg/ml ~ 0 μg/ml 범위의 정량 표준. 10%(w/w) 젤라틴 시료를 TE 완충제중에 제조하였으며; 시료를 30분 동안 팽창하도록 허용한 후, 수조를 사용하여 40℃에서 용해하였다.
TE 완충제 94 μL 및 SYBR Green(100x) 1 μL를 함유하는 마스터 믹스(master mix) 95 μl와, 시료 또는 표준 5 μl를 검정색 웰 형광 96웰 평판의 웰에 부가한 다음, 상하로 피펫팅(pipetting)하여 혼합하였다. 96웰 평판을 덮은 후, 37℃ 및 700 rpm에서 30분 동안 항온처리하였다. 25℃에서 제조자의 지침에 따라 SynergyTM Mx 형광계(BioTek)를 사용하여 여기 535 nm/방출 617 nm에서의 형광을 측정하였다.
결과
그러므로 본 발명에 따른 메타크릴로일-젤라틴은, 예컨대 시판중인 젤MA에 비하여 낮은 내독소 함량 및 낮은 MAA 함량에 의해 특징지어진다. 본 발명에 따른 메타크릴로일-젤라틴은, 핵산을 기반으로 한 발열 활성이 본 발명의 젤MA에서는 작음을 나타내는, 낮은 DNA 함량에 의해 추가로 특징지어진다.
실시예 2: 가교
젤MA 하이드로겔 레올로지 특징에 오염 메타크릴산이 미치는 영향력을 시험하였다.
재료 및 방법
알루미늄 호일로 감싼 150 mL들이 Falcon 튜브에서, 젤MA(실시예 1에 따라 제조) 용액 65 g(10%(w/v)) 및 Irgacure(Irgacure 2959 광 개시제 (2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논))(0.5%(w/v))를 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.4)중에 제조하였다. 우선, Irgarcure(2 x 162.5 mg)를 PBS(2 x 29.1 ml)중에 용해하였다. 믹스를 상하로 수회 피펫팅함으로써 Irgacure 분말을 PBS에 분산시켰으며, 대략 20분 동안 용액을 수조(대략 60℃)에 넣었다. 그 다음, 여기에 젤MA(2 x 3.25 g)를 첨가한 다음, 와류하여, 60℃ 수조에 보존하여 두었다. 용해가 완료될 때까지 믹스를 규칙적으로 와류하였다. 두 용액을 하나의 튜브에 함께 넣은 다음 와류하였다.
알루미늄 호일로 감싼 15 mL들이 Flacon 튜브에 젤MA 및 Irgarcure 용액을 7mL씩 8개로 나눈후, 튜브 2개씩에 메타크릴산(11.67 M) 0 μl(MAA 부재), 0.7 μl(100 ppm MAA), 2.1 μl(300 ppm MAA) 또는 4.2 μl(600 ppm MAA)만큼을 첨가하였다. 튜브들을 와류한 다음, 40℃ 수조에 90분 동안 보존한 후, 이 튜브들을 수조에서 꺼내어 실온에 밤새도록 방치하여 두었다.
분석 20분전, 40℃ 수조에 시료를 재용융하였는데, 각각의 시료를 대상으로 ElastosensTM 시료 홀더(기기상 교정됨)에 있던 튜브로부터 용액 2 ml를 3회 옮겨담았다. 각각의 시료 홀더에 계면활성제 1방울씩을 첨가하였고, 시료를 대상으로 20분 동안 실온에서 UV 광선(365 nm)을 조사하였다(365 nm로 설정한 UV 램프(UVMLS-38 EL 시리즈 3UV-254/302/365 nm/8W, 0.16A)). 이와 같은 UV 경화 직후, 시료 홀더를 ElastosensTM Bio2 기기에 넣은 다음, 20℃에서 45분 동안 레올로지 분석을 수행하였는데, 이때 15초마다 측정을 실시하였다.
결과
도 1에 보인 바와 같이, MAA 농도가 증가할 때 최종 저장 모듈러스(G')는 감소하였는데, 이는 오염 MAA가 젤MA중에 존재할 때 젤MA 기반 하이드로겔의 탄성이 감소함을 나타낸다.
실시예 3: 본 발명에 따른 방법에 의해 제조한 젤MA와 투석을 기반으로 한 방법에 의해 제조한
젤MA의 비교
재료 및 방법
젤라틴 유형 2가지: A 유형 250 Bloom 젤라틴 및 B 유형 250 Bloom 젤라틴을 문헌[Pahoff et al.(2019 J. Mater Chem. B 7:1761-1772)]에 기재된 방법에 따라 작용화도 40% 이하로 메타크릴로일 변형하였다. A 유형 및 B 유형 방법으로부터 수득한 출발 젤라틴을 각각 젤라틴(Hyglos 엔도자임) 1 그램당 1046 내독소 단위(EU) 및 4782 내독소 단위의 내독소로 오염시켰다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 메타크릴산 잔류량 및 LPS 오염을 각각 ppm 및 젤라틴 1 그램당 EU로서 측정하였다. 젤MA를 50 mM 인산염 완충제(pH 9.5) 중에 용해하여, MAA 함량을 확정하였다.
비교 방법에 있어, 초순수(MilliQ, Merck Millipore)에 대한 투석에 의해 젤MA 용액으로부터 메타크릴산 부산물을 제거하였다. 젤MA 용액 20 밀리리터 분액을 5개의 투석 튜브들(투석 튜빙 셀룰로스 막(Dialysis tubing cellulose membrane), MWCO 14 kDa, cat. N°: D9527-100FT, Sigma-Aldrich)에 옮겨담고 나서, 이 튜브 각각을 물 2.5 리터에 담가 놓았다. 투석을 40℃에서 진행시킨 후, 24시간마다 물을 교환하였다. 1일, 2일, 3일, 4일 및 7일차에 튜브 1개를 골라서, 여기에 있는 메타크릴산과 LPS의 함량을 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다. 젤MA를 50 mM 인산염 완충제(pH 9.5)중에 용해하여 MAA 함량을 확정하였다.
본 발명의 구현예에 따른 방법에서, 묽은 HCl을 첨가하여 젤MA 용액의 분액 40 ml씩 5개의 pH를 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 및 4.0으로 조정하였으며(모든 경우 40℃에서 측정), Triton-X100 0.1%(젤라틴 함량 기준)를 각각의 분액에 첨가하였다. 이후 각각의 분액을 2개로 나누었는데, 이것들중 1개는 pH 강하 효과에 대한 음성 대조군이자 메타크릴산 함량과 LPS 오염에 Triton-X100 첨가가 미치는 효과를 살피기 위한 음성 대조군으로 사용하였다. Norit 활성탄 분말(S268, 활성탄 Norit SX + 8013-1) 5 그램을, 각각의 실험 튜브에 첨가하였으며, 이 튜브들을 회전 진탕기상에서 1시간 동안 40℃에서 항온처리하였다. 그 다음, 이 튜브들을 실시예 1에 기재된 바와 같이 2000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였으며, 상청액을 여과하여(0.45 μm) 자체의 메타크릴산 및 LPS 함량에 대해 분석하였다. 젤MA를 50 mM 인산염 완충제(pH 9.5)에 용해하여, MAA 함량을 확정하였다.
결과
표 2는 투석을 기반으로 한 방법 또는 본 발명의 구현예에 따른 방법에 의해수득된 정제 젤MA의 MAA 함량(ppm) 및 LPS 함량(EU/g)을 보여준다.
실시예 4: 젤MA 제조 방법
재료 및 방법
실시예 1에 기재된 바와 같되, 이하의 수정을 가하여 젤MA를 합성하였다: 반응 매질의 pH를 pH 5.5로 강하시킨 다음, Triton-X100를 첨가하고 나서, 진탕하에 1시간 동안 항온처리하였으며, HCl을 사용하여 매질의 pH를 pH 3.5로 더 강하였고, 이후 활성탄으로 팩킹된 컬럼으로 매질을 여과하였다. 수득한 젤MA의 메타크릴산 잔류량 및 LPS 오염을 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하여, 각각 ppm과 젤라틴 1 그램당 EU로 표시하였다. 젤MA를 50 mM 인산염 완충제(pH 9.5)중에 용해하여 MAA 함량을 확정하였다.
결과
진술
본 발명은, 구체적으로 임의의 기타 양태들, 진술 및/또는 구현예들과 함께, 이하 번호를 매긴 양태들 및 구현예들중 임의의 것 1가지 또는 이것들중 1가지 이상의 임의의 조합에 의해 공략된다.
양태 1: 리포다당체 함량이 100 EU/g 미만, 바람직하게는 50 EU/g 미만, 더욱 바람직하게는 20 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 10 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 5 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 2 EU/g 미만, 가장 바람직하게 1 EU/g 미만이고, 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 변형된 젤라틴.
양태 2: 메타크릴산 또는 아크릴산을 30 ppm 미만 포함하는, 양태 1에 따른 젤라틴.
양태 3: 그램 양성 세균으로부터의 발열원, 편모 세균으로부터의 발열원, 단일 가닥 바이러스 RNA, 및 비메틸화 CpG 모티프가 풍부한 세균 DNA의 함량이 낮고, 바람직하게 그램 양성 세균 및 편모 세균으로부터의 발열원 함량이 낮으며, 더욱 바람직하게 그램 양성 세균으로부터의 발열원 함량이 낮은, 양태 1 또는 2에 따른 젤라틴.
양태 4: 상기 젤라틴은 A 유형 젤라틴인, 양태 1 내지 3중 어느 하나에 따른 젤라틴.
양태 5: 메타크릴아미드 치환도 또는 아크릴아미드 치환도가 20% ~ 100%, 바람직하게 50% ~ 100%, 더욱 바람직하게 80% ~ 100%이고, 메타크릴산염 치환도가 10% 미만인, 양태 1 내지 4중 어느 하나에 따른 젤라틴.
양태 6: 상기 젤라틴은 아세틸기로 추가 변형된, 양태 1 내지 5중 어느 하나에 따른 젤라틴.
양태 7: 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 변형된 젤라틴으로서, 양태 1 내지 6중 어느 하나에 따른 젤라틴과, 가교제를 포함하는 하이드로겔.
양태 8: 양태 7에 따른 하이드로겔을 포함하는 필름.
양태 9: 양태 1 내지 6중 어느 하나에 따른 젤라틴으로서, 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 변형된 젤라틴을 제조하기 위한 방법으로서,
a) 젤라틴을 메타크릴산 무수물 또는 아크릴산 무수물과 반응시켜 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 젤라틴을 변형하는 단계;
b) 반응 매질의 pH를 3 ~ 4의 값으로 강하시키는 단계;
c) 미셀 형성 계면활성제 0.01 w/w% ~ 1.5 w/w%를 산성 반응 매질에 첨가하는 단계;
d) 단계 c)의 매질과 고체 흡착제를 접촉시키는 단계;
e) 단계 d)의 고체 흡착제를 매질과 분리하는 단계; 및
f) 메타크릴로일 젤라틴 또는 젤라틴-아크릴로일을 포함하는 매질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법.
양태 10: 양태 9에 따른 방법으로서, 상기 미셀 형성 계면활성제는 비이온성 계면활성제를 포함하고, 바람직하게 계면활성제는 Triton X-100 또는 Triton X-102 또는 이것들의 혼합물인 방법.
양태 11: 양태 9 또는 10에 따른 방법으로서, 상기 고체 흡착제는 소수성 흡착제, 바람직하게는 활성탄인 방법.
양태 12: 양태 9 ~ 11중 어느 하나에 따른 방법으로서, 메타크릴로일 젤라틴 또는 젤라틴-아크릴로일을 포함하는 매질을 건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
양태 13: 의료분야에 사용하기 위한 것으로서, 양태 1 ~ 6중 어느 하나에 따른 젤라틴 또는 양태 7에 따른 하이드로겔.
양태 14: 양태 1 ~ 6중 어느 하나에 따른 젤라틴 또는 양태 7에 따른 하이드로겔의, 생물학적 구조, 예컨대 조직 또는 장기, 또는 이의 일부, 코팅, 스캐폴드 또는 제어 방출 제형을 제조하기 위한 시험관내 또는 생체외 용도.
양태 15: 양태 1 ~ 6중 어느 하나에 따른 젤라틴 또는 양태 7에 따른 하이드로겔의 바이오잉크 또는 바이오수지로서의 용도.
Claims (16)
- 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 변형된 젤라틴으로서, 리포다당체 함량이 100 EU/g 미만, 바람직하게는 50 EU/g 미만, 더욱 바람직하게는 20 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게 10 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게는 5 EU/g 미만, 더욱더 바람직하게는 2 EU/g 미만, 가장 바람직하게는 1 EU/g 미만이고, 메타크릴산 또는 아크릴산을 30 ppm 미만 포함하되, 단 이 메타크릴산 또는 아크릴산 함량은 수중에 용해된 젤라틴 시료를 기준으로 확정되고, 메타크릴산 또는 아크릴산을 100 ppm 미만 포함하되, 단 이 메타크릴산 또는 아크릴산 함량은 50 Mm 인산염 완충제(Ph 9.5)중에 용해된 젤라틴 시료를 기준으로 확정되는, 젤라틴.
- 제1항에 있어서, 그램 양성 세균으로부터의 발열원, 편모 세균으로부터의 발열원, 단일 가닥 바이러스 RNA, 및 비메틸화 CpG 모티프가 풍부한 세균 DNA의 함량이 낮고, 바람직하게 그램 양성 세균 및 편모 세균으로부터의 발열원 함량이 낮으며, 더욱 바람직하게 그램 양성 세균으로부터의 발열원 함량이 낮은 젤라틴.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 젤라틴은 A 유형 젤라틴인 젤라틴.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 메타크릴아미드 치환도 또는 아크릴아미드 치환도가 20% ~ 100%, 바람직하게 50% ~ 100%, 더욱 바람직하게 80% ~ 100%이고, 메타크릴산염 치환도가 10% 미만인 젤라틴.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 젤라틴은 아세틸기 또는 아세틸부, 페놀기 또는 페놀부, 티올기 또는 티올부, 노르보넨기 또는 노르보넨부, 테트라진기 또는 테트라진부, 아지드기 또는 아지드부, 푸란기 또는 푸란부, 또는 이의 임의의 조합으로 추가 변형된 젤라틴.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 젤라틴으로서, 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 변형된 젤라틴과, 가교제를 포함하는 하이드로겔.
- 제6항에 의한 하이드로겔을 포함하는 필름.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 젤라틴으로서, 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 변형된 젤라틴을 제조하기 위한 방법으로서,
a) 젤라틴을 메타크릴산 무수물 또는 아크릴산 무수물과 반응시켜 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 젤라틴을 변형하는 단계;
b) 반응 매질의 pH를 2.0 ~ 4.0, 바람직하게 3.0 ~ 4.0, 더욱 바람직하게 3.0 ~ 3.5의 값으로 강하시키는 단계;
c) 미셀 형성 계면활성제 0.01 w/w% ~ 1.5 w/w%를 산성 반응 매질에 첨가하는 단계;
d) 단계 c)의 매질과 고체 흡착제를 접촉시키는 단계;
e) 단계 d)의 고체 흡착제를 매질과 분리하는 단계; 및
f) 메타크릴로일 젤라틴 또는 젤라틴-아크릴로일을 포함하는 매질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 젤라틴으로서, 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 변형된 젤라틴을 제조하기 위한 방법으로서,
a) 젤라틴을 메타크릴산 무수물 또는 아크릴산 무수물과 반응시켜 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 젤라틴을 변형하는 단계;
b1) 반응 매질의 pH를 4.0 ~ 9.0, 바람직하게는 4.0 ~ 6.0, 더욱 바람직하게 4.0 ~ 6.0, 더욱더 바람직하게 4.5 ~ 5.5의 값으로 강하시키는 단계;
c) 미셀 형성 계면활성제 0.01 w/w% ~ 1.5 w/w%를 반응 매질에 첨가하는 단계;
b2) 단계 c)의 매질의 pH를 2.0 ~ 4.0, 바람직하게는 3.0 ~ 4.0, 더욱 바람직하게 3.0 ~ 3.5의 값으로 강하시키는 단계;
d) 단계 b2)의 매질을 고체 흡착제와 접촉시키는 단계;
e) 단계 d)의 고체 흡착제를 매질과 분리하는 단계; 및
f) 메타크릴로일 젤라틴 또는 젤라틴-아크릴로일을 포함하는 매질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 방법에는 투석 단계가 생략된 방법.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미셀 형성 계면활성제는 비이온성 계면활성제를 포함하고, 바람직하게 상기 계면활성제는 Triton-100 또는 Triton-102 또는 이의 혼합물인 방법.
- 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 흡착제는 소수성 흡착제, 바람직하게 활성탄인 방법.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메타크릴로일 젤라틴 또는 젤라틴-아크릴로일을 포함하는 매질을 건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 의료 분야에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 젤라틴 또는 제6항에 의한 하이드로겔.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 젤라틴 또는 제6항에 의한 하이드로겔의, 조직 또는 장기, 또는 이의 일부, 코팅, 스캐폴드 또는 제어 방출 제형 같은 생물학적 구조를 제조하기 위한 시험관내 또는 생체외 용도.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 젤라틴 또는 제6항에 의한 하이드로겔의, 바이오잉크 또는 바이오수지로서의 용도.
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