BE1028324A1 - Ge(meth)acryleerd gelatine laag in endotoxines - Google Patents
Ge(meth)acryleerd gelatine laag in endotoxines Download PDFInfo
- Publication number
- BE1028324A1 BE1028324A1 BE20205347A BE202005347A BE1028324A1 BE 1028324 A1 BE1028324 A1 BE 1028324A1 BE 20205347 A BE20205347 A BE 20205347A BE 202005347 A BE202005347 A BE 202005347A BE 1028324 A1 BE1028324 A1 BE 1028324A1
- Authority
- BE
- Belgium
- Prior art keywords
- gelatin
- acryloyl
- less
- pyrogens
- gelma
- Prior art date
Links
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 title claims abstract description 220
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 title claims abstract description 219
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 title claims abstract description 180
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 title claims abstract description 180
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 title claims abstract description 179
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 60
- 125000003647 acryloyl group Chemical group O=C([*])C([H])=C([H])[H] 0.000 claims abstract description 56
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 49
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 45
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 34
- -1 methacryloyl Chemical group 0.000 claims abstract description 33
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 39
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 39
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 30
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims description 24
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 22
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 20
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 11
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 9
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 8
- DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N methacrylic anhydride Chemical compound CC(=C)C(=O)OC(=O)C(C)=C DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 5
- ARJOQCYCJMAIFR-UHFFFAOYSA-N prop-2-enoyl prop-2-enoate Chemical compound C=CC(=O)OC(=O)C=C ARJOQCYCJMAIFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 4
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 229920004892 Triton X-102 Polymers 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 claims description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 abstract description 9
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 195
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M acrylate group Chemical group C(C=C)(=O)[O-] NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 11
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- JUYQFRXNMVWASF-UHFFFAOYSA-M lithium;phenyl-(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate Chemical compound [Li+].CC1=CC(C)=CC(C)=C1C(=O)P([O-])(=O)C1=CC=CC=C1 JUYQFRXNMVWASF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 3
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- VFHVQBAGLAREND-UHFFFAOYSA-N diphenylphosphoryl-(2,4,6-trimethylphenyl)methanone Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1C(=O)P(=O)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 VFHVQBAGLAREND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Chemical compound CC(C)(O)C(=O)C1=CC=C(OCCO)C=C1 GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VVBLNCFGVYUYGU-UHFFFAOYSA-N 4,4'-Bis(dimethylamino)benzophenone Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 VVBLNCFGVYUYGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100032814 ATP-dependent zinc metalloprotease YME1L1 Human genes 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000763579 Homo sapiens Toll-like receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000669460 Homo sapiens Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 description 2
- 101000669402 Homo sapiens Toll-like receptor 7 Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 101800000795 Proadrenomedullin N-20 terminal peptide Proteins 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 102100027010 Toll-like receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100039357 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100039390 Toll-like receptor 7 Human genes 0.000 description 2
- 229960001171 acetohydroxamic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- DAZSWUUAFHBCGE-KRWDZBQOSA-N n-[(2s)-3-methyl-1-oxo-1-pyrrolidin-1-ylbutan-2-yl]-3-phenylpropanamide Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCCC1)C(=O)CCC1=CC=CC=C1 DAZSWUUAFHBCGE-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 2
- PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N pamp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)C1=CC=CC=C1 PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N 0.000 description 2
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052615 phyllosilicate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical group 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- UTXPMECBRCEYCI-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-(4-nonylphenoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=C(OCCOCCOCCOCCO)C=C1 UTXPMECBRCEYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWHLVBVRNXHSAN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4-nonylphenoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 KWHLVBVRNXHSAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCDADJXRUCOCJE-UHFFFAOYSA-N 2-chlorothioxanthen-9-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC(Cl)=CC=C3SC2=C1 ZCDADJXRUCOCJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMLYCEVDHLAQEL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-methyl-1-phenylpropan-1-one Chemical compound CC(C)(O)C(=O)C1=CC=CC=C1 XMLYCEVDHLAQEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSMGLVDZZMBWQB-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-phenylpropan-1-one Chemical compound CC(C)C(=O)C1=CC=CC=C1 BSMGLVDZZMBWQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 1
- MXRGSJAOLKBZLU-UHFFFAOYSA-N 3-ethenylazepan-2-one Chemical compound C=CC1CCCCNC1=O MXRGSJAOLKBZLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYVYAPXYZVYDHN-UHFFFAOYSA-N 9,10-phenanthroquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 YYVYAPXYZVYDHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000004594 Masterbatch (MB) Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 description 1
- 208000034972 Sudden Infant Death Diseases 0.000 description 1
- 206010042440 Sudden infant death syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 1
- 102100033117 Toll-like receptor 9 Human genes 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003848 UV Light-Curing Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- ZEDSKTISNTXEQI-UHFFFAOYSA-N [(2,6-dichlorobenzoyl)-(4-propylphenyl)phosphoryl]-(2,6-dichlorophenyl)methanone Chemical compound C1=CC(CCC)=CC=C1P(=O)(C(=O)C=1C(=CC=CC=1Cl)Cl)C(=O)C1=C(Cl)C=CC=C1Cl ZEDSKTISNTXEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BEUGBYXJXMVRFO-UHFFFAOYSA-N [4-(dimethylamino)phenyl]-phenylmethanone Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 BEUGBYXJXMVRFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIMKGBGMXUPKJT-UHFFFAOYSA-N [diethyl-(4-methoxybenzoyl)germyl]-(4-methoxyphenyl)methanone Chemical compound C=1C=C(OC)C=CC=1C(=O)[Ge](CC)(CC)C(=O)C1=CC=C(OC)C=C1 KIMKGBGMXUPKJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000012431 aqueous reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229920006025 bioresin Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008619 cell matrix interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- SNVTZAIYUGUKNI-UHFFFAOYSA-N dibenzo[1,2-a:1',2'-e][7]annulen-11-one Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2C(=O)C2=CC=CC=C21 SNVTZAIYUGUKNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002019 doping agent Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L eosin Y Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C([O-])=C(Br)C=C21 SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007421 fluorometric assay Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002519 galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 108700004892 gelatin methacryloyl Proteins 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 1
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 108091005434 innate immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920004921 nonoxynol-15 Polymers 0.000 description 1
- 229940073554 nonoxynol-30 Drugs 0.000 description 1
- 229940116391 nonoxynol-4 Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- JVCXFJJANZMOCM-UHFFFAOYSA-N phenyl(trimethylgermyl)methanone Chemical compound C[Ge](C)(C)C(=O)C1=CC=CC=C1 JVCXFJJANZMOCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000518 rheometry Methods 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 102220143740 rs760001831 Human genes 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910021647 smectite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
- C08H1/06—Macromolecular products derived from proteins derived from horn, hoofs, hair, skin or leather
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/222—Gelatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
- C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
- C08J3/075—Macromolecular gels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J5/00—Manufacture of articles or shaped materials containing macromolecular substances
- C08J5/18—Manufacture of films or sheets
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
- C08L89/04—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair
- C08L89/06—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair derived from leather or skin, e.g. gelatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
- C08J2389/04—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair
- C08J2389/06—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair derived from leather or skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L2203/00—Applications
- C08L2203/16—Applications used for films
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op methacryloyl-gelatine en acryloyl-gelatine met lage pyrogene activiteit, in het bijzonder met een laag lipopolysaccharidegehalte. De (meth)acryloyl-gelatine wordt verder gekenmerkt door een laag (meth)acrylzuurgehalte. De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het bereiden van de (meth)acryloyl- gelatine, welke geen dialysestap vereist. De uitvinding heeft verder betrekking op hydrogels die deze (meth)acryloyl-gelatine omvatten, alsook op het gebruik daarvan voor weefseltechnologische toepassingen, en als bio-inkt of biohars.
Description
TECHNISCH GEBIED De aanvrage heeft in het algemeen betrekking op chemisch gefunctionaliseerde gelatine, in het bijzonder methacryloyl-gelatine en acryloyl-gelatine. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op methacryloyl-gelatine en acryloyl-gelatine met lage pyrogene activiteit, in het bijzonder een laag lipopolysaccharidegehalte, op hydrogels die de methacryloyl-gelatine of acryloyl-gelatine omvatten, op een werkwijze voor het bereiden van de methacryloyl-gelatine en acryloyl-gelatine en op het gebruik daarvan.
ACHTERGROND Er wordt veel aandacht besteed aan reconstructie van functioneel biologisch weefsel, biologische implantaten en multiorgaanmodellen op basis van cellen voor klinisch, diagnostisch of farmaceutisch onderzoek. Hydrogels zijn uitgegroeid tot de belangrijkste kandidaten voor uiteenlopende weefseltechnologische toepassingen vanwege hun overeenkomst met de natieve extracellulaire matrix.
Gelatinehydrogels zijn bijzonder aantrekkelijk vanwege hun biologische verenigbaarheid en biologische afbreekbaarheid. Gelatine wordt geproduceerd door de gedeeltelijke hydrolyse van collageen, het meest voorkomende eiwit in het lichaam en het voornaamste molecuul van de extracellulaire matrix. De overvloedige aanwezigheid van de celherkenningssequentie Arginine-Glycine-Asparaginezuur (RGD) vergemakkelijkt hechting van cellen aan gelatine, wat hun verspreiding en proliferatie bevordert. Deze cel-matrixinteracties zijn cruciaal voor de organisatie van complex weefsel. Dankzij de lange geschiedenis van gelatine als een vertrouwd excipiëns in de farmaceutische industrie, voldoet deze aan de hoogste standaards van veiligheid en naleving van regelgeving. Verder maakt de aanwezigheid van vrije aminogroepen, hydroxylgroepen en carboxylaatgroepen chemische modificatie mogelijk om gewenste eigenschappen voor specifieke toepassingen te bereiken.
Gelatinehydrogels worden gemaakt door verknoping van gelatinepolymeren, hetzij zonder voorafgaande modificatie of na functionalisering van hun zijgroepen. De toevoeging van functionele groepen aan de gelatinehoofdketen is een verknopingsstrategie met een hoge mate van controle over hydrogelontwerp en -eigenschappen. De meest wijdverbreid gebruikte en bestudeerde modificatie voor verknoping van gelatine is methacryloylering. MA- gemodificeerde gelatine wordt in het algemeen aangeduid als gelMA. Een alternatief voor de gevestigde methacryloyl-gelatine is acryloyl-gelatine (Billiet et al. 2013 “Quantitative Contrasts in the Photopolymerization of Acrylamide en Methacrylamide-Functionalized Gelatine Hydrogel Building Blocks” Macromolecular Bioscience 13:1531-45). Afhankelijk van de (meth)acryloyleringsgraad en de polymeerconcentratie kunnen de fysische eigenschappen (verknopingsdichtheid, zwelling en stijfheid) van de gelatine-(meth})acryloylhydrogels worden afgestemd, wat dit materiaal een veelzijdig platform maakt voor uiteenlopende weefseltechnologische toepassingen. De verknoping wordt geïnitieerd door radicalen die worden gegenereerd door UV of zichtbar licht, afhankelijk van de gebruikte foto-initiator (bijvoorbeeld Irgacure® 2959 of lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP)).
Een van de voornaamste nadelen van hydrogels op basis van gelatine voor (bio)medische toepassingen is de aanwezigheid van endotoxinen (hierin ook wel aangeduid als lipopolysacchariden) in op gebruikelijke wijze geproduceerde gelatine. Endotoxinen zijn grote in hoge mate immunogene moleculen en de voornaamste component van het uitwendige membraan van Gram-negatieve bacteriën. Zij zijn in hoge mate warmtebestendig, waardoor zij moeilijk zijn te inactiveren. Wanneer zij worden blootgesteld aan het immuunsysteem, initiëren endotoxinen een immuunreactie, wat kan leiden tot weefselontsteking, verhoogde gevoeligheid voor andere allergenen en het risico op fatale shock. Het meeste onderzoek wordt op het moment uitgevoerd met gelMA dat op basis is van gelatine met hoge endotoxinegehalten.
Op gebruikelijke wijze geproduceerde gelatine kan eveneens zijn verontreinigd door andere microbiële componenten dan endotoxinen, waarvan sommige, evenals endotoxinen, een nadelige immuunreactie bij mensen kunnen veroorzaken. Niet-endotoxinepyrogenen omvatten bijvoorbeeld stoffen zoals als lipoteichoïnezuur (LTA) die afkomstig zijn van Gram- positieve bacteriën, en andere verbindingen die afkomstig zijn van schimmels, gist, virussen, bacteriën, en parasieten (Hasiwa et al. (2013) “Evidence for the detection of non-endotoxin pyrogens by the whole blood monocyte activation test. ALTEX 30:169-208). Deze niet- endotoxinepyrogenen, en bij voorkeur pyrogenen of pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) in het algemeen, dienen eveneens tot een minimum te worden beperkt voor (bio)medische toepassingen van hydrogels op basis van gelatine om ongewenste neveneffecten bij activering van van nature aanwezige immuunreceptoren te voorkomen. Daarnaast wordt tijdens de functionalisering en verknoping van gelatine tot gelatinehydrogel een aantal reagentia gebruikt. Resten van reagentia en reactieproducten kunnen in het gelMA aanwezig zijn. Wanneer men bijvoorbeeld gelatine met methacrylzuuranhydride laat reageren,
dan kunnen methacrylzuuranhydride (MAAH) en/of methacrylzuur (MAA) in het gelMA BE2020/5347 aanwezig zijn, welke als gevaarlijk worden beschouwd. MAA kan nadelige effecten op de plaats van toepassing veroorzaken, afhankelijk van de concentratie en frequentie of blootstellingstijd. Uit SIDS Initial Assessment Profile (SIAM 11, 2001) is gebleken dat het onverdunde zuur huid- en oogcorrosie en schade aan luchtwegen veroorzaakt. Ongereageerde methacrylzuuranhydride en methacrylzuur kunnen door dialyse tegen gedestilleerd water uit het reactiemengsel worden verwijderd. Typisch wordt dialyse gedurende één week uitgevoerd. Deze tijdrovende stap is derhalve niet efficiënt voor productie van gelMA op grote schaal. Verder neemt tijdens deze week van dialyse het risico op microbiële verontreiniging en afbraak van gelatine toe. Voor (bio)medische toepassingen van hydrogels op basis van gelatine bestaat er behoefte aan biologisch verenigbare (meth)acryloyl-gelatine (bijvoorbeeld niet-toxisch voor biologisch weefsel en niet-immunogeen), wat het mogelijk maakt om hydrogels met gewenste mechanische eigenschappen (bijvoorbeeld, sterkte en elasticiteit) op maat te maken. Er bestaat eveneens behoefte aan het produceren van dergelijke (meth)acryloyl-gelatine door een efficiënte werkwijze die productie op industriële schaal mogelijk maakt.
SAMENVATTING VAN DE UITVINDING De onderhavige uitvinding biedt een oplossing voor één of meer van de bovenbeschreven problemen van de stand van de techniek. In het bijzonder worden methacryloyl-gelatine en acryloyl-gelatine verschaft die een laag pyrogeengehalte, in het bijzonder een laag endotoxinegehalte, en geringe verontreiniging met methacrylzuur of acrylzuur hebben. De (meth)acryloyl-gelatine heeft een verbeterde biologische verenigbaarheid vanwege het lage pyrogeengehalte, in het bijzonder het lage endotoxinegehalte. De (meth)acryloyl-gelatine volgens de onderhavige uitvinding is bijzonder nuttig voor verknoping vanwege de geringe verontreiniging met methacrylzuur of acrylzuur, welke het verknopingsproces blijkt te verstoren. Verder kan de (meth)acryloyl-gelatine met voordeel worden bereid door een eenvoudige productiewerkwijze die geen tijdrovende dialysestap vereist. De onderhavige uitvinding wordt in het bijzonder vastgelegd door één of meer van de hieronder opgesomde aspecten en uitvoeringsvormen (i) tot (xv) of een combinatie daarvan: {i) Gelatine die met een methacryloylgroep of een acryloylgroep is gemodificeerd en een lipopolysaccharidegehalte van minder dan 100 EU/g, bij voorkeur minder dan 50 EU/g, met meer voorkeur minder dan 20 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 10 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 5 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 2 EU/g, met de meeste voorkeur minder dan 1 EU/g heeft.
(ii) Gelatine volgens (i), omvattende minder dan 30 ppm methacrylzuur of acrylzuur.
(iii) Gelatine volgens (i) of (ii) die een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën, pyrogenen van geflagelleerde bacteriën, enkelstrengig viraal RNA en bacterieel DNA dat rijk is aan ongemethyleerde CpG-motieven, bij voorkeur een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën en van geflagelleerde bacteriën, met meer voorkeur een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën heeft.
(iv) Gelatine volgens een van (i) tot (iii), waarbij de gelatine type A gelatine is (v) Gelatine volgens een van (i) tot (iv) die een methacrylamidesubstitutie- of acrylamidesubstitutiegraad tussen 20% en 100%, bij voorkeur tussen 50% en 100%, met meer voorkeur tussen 80% en 100%, en een methacrylaatsubstitutiegraad van minder dan 10% heeft.
(vi) Gelatine volgens een van (i) tot (v), waarbij de gelatine verder met een acetylgroep is gemodificeerd.
(vii) Hydrogel omvattende een gelatine die met een methacryloylgroep of een acryloylgroep is gemodificeerd volgens een van (i) tot (vi), en een verknopingsmiddel.
(viii) Een film omvattende een hydrogel volgens (vii).
(ix) Werkwijze voor het bereiden van gelatine die met een methacryloylgroep of acryloyl is gemodificeerd volgens een van (i) tot (vi), omvattende de volgende stappen: a) het modificeren van gelatine met een methacryloylgroep of een acryloylgroep door het laten reageren van gelatine met methacrylzuuranhydride of acrylzuuranhydride; b) het verlagen van de pH van het reactiemedium tot een waarde tussen 3 en 4; c) het toevoegen van 0,01 — 1,5 gew.% van een micel-vormend oppervlakteactief middel aan het zure reactiemedium; d) het in contact brengen van het medium van stap c) met een vast adsorptiemiddel; e) het afscheiden van het vaste adsorptiemiddel van stap d) van het medium; en f) het winnen van het medium omvattende de methacryloyl-gelatine of de gelatine-acryloyl.
(x) De werkwijze volgens (ix), waarbij het micel-vormende oppervlakteactieve middel een niet- ionisch oppervlakteactief middel omvat, waarbij bij voorkeur het oppervlakteactieve middel Triton X-100 of Triton X-102 of mengsels daarvan is.
(xi) De werkwijze volgens (ix) of (x), waarbij het vaste adsorptiemiddel een hydrofoob adsorptiemiddel, bij voorkeur geactiveerde koolstof is. (xii) De werkwijze volgens een van (ix) tot (xi), verder omvattende een stap van het drogen van het medium omvattende de methacryloyl-gelatine of de gelatine-acryloyl. 5 (xiii) Gelatine volgens een van (i) tot (vi) of een hydrogel volgens (vii) voor gebruik in de geneeskunde. (xiv) In-vitro- of ex-vivogebruik van gelatine volgens een van (i) tot (vi) of een hydrogel volgens (vii) voor het produceren van een biologisch construct, zoals een weefsel of een orgaan of een deel daarvan, een bekleding, een steunstructuur of een doseringsvorm met geregelde afgifte. (xv) Gebruik van gelatine volgens een van (i) tot (vi) of een hydrogel volgens (vii) als een bio- inkt of biohars.
KORTE BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN De lering van de aanvrage wordt geïllustreerd door de volgende figuren die louter als illustratief dienen te worden beschouwd en de beschermingsomvang van de conclusies op generlei wijze beperken. Figuur 1: Effect van verontreinigend MAA in het gelMA op opslagmodulus (G’) van hydrogels op basis van gelMA. Uiteindelijke G’ (Pa, gemiddelde laatste 10 min) bij 20°C van hydrogels op basis van gelMA-oplossing met 0, 100, 300 of 600 ppm vrije MAA-dotering.
GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING Tenzij anders gedefinieerd, hebben alle bij het openbaren van de uitvinding gebruikte termen, met inbegrip van technische en wetenschappelijke termen, de betekenis zoals gewoonlijk daaraan wordt gegeven door een gemiddelde deskundige op het gebied waartoe deze uitvinding behoort. Als verdere leidraad zijn definities van termen opgenomen om de lering van de onderhavige uitvinding beter te begrijpen. Zoals hierin gebruikt, omvatten de enkelvoudsvormen "een", "de" en "het" verwijzingen naar zowel het enkelvoud als het meervoud, tenzij de context duidelijk anders voorschrijft. De termen "omvattende", "omvat" en "omvatten" zoals hierin gebruikt, zijn synoniem met "met inbegrip van", “inbegrepen" of "bevattende", "bevat", en zij zijn inclusief of met een open einde en zij sluiten verdere niet-genoemde leden, elementen of stappen van een werkwijze niet uit. Waar wordt verwezen naar uitvoeringsvormen als omvattende bepaalde elementen of stappen, omvat dit eveneens uitvoeringsvormen die in hoofdzaak bestaan uit de vermelde elementen of stappen. De vermelding van numerieke waarden door middel van eindpunten omvat alle waarden en fracties die in de betreffende gebieden liggen, alsook de genoemde eindpunten.
De term ongeveer" zoals hierin gebruikt wanneer wordt verwezen naar een meetbare waarde, zoals een parameter, een hoeveelheid, een tijdsduur en dergelijke, is bedoeld om variaties van +/- 10% of minder, bij voorkeur +/- 5% of minder, met meer voorkeur +/- 1% of minder en met nog meer voorkeur +/- 0,1% of minder van de opgegeven waarde te dekken, voor zover de variaties van toepassing zijn voor de geopenbaarde uitvinding. Het dient eveneens duidelijk te zijn dat de waarde waarnaar de bepaling "ongeveer" verwijst, als zodanig eveneens specifiek en bij voorkeur is geopenbaard. Alle in de onderhavige octrooibeschrijving aangehaalde documenten zijn hierbij door verwijzing in hun geheel opgenomen. De onderhavige aanvrage heeft in het algemeen betrekking op gefunctionaliseerde gelatine voor het verknopen van gelatine voor het bereiden van bijvoorbeeld hydrogels en films op basis van gelatine. Meer in het bijzonder heeft de aanvrage betrekking op methacryloyl- gelatine en acryloyl-gelatine Gelatine is een mengsel van in water oplosbare eiwitten die zijn afgeleid van collageen. Gelatine wordt bijvoorbeeld verkregen door gedeeltelijke hydrolyse van collageen, dat is verkregen door waterige extractie van huid, pezen, ligamenten, botten enz., van bijvoorbeeld runderen, varkens, pluimvee of vis, onder zure of alkalische omstandigheden of door enzymatische hydrolyse, zoals in de techniek bekend is. Gelatine die is verkregen door zuurbehandeling wordt “type A gelatine” genoemd, terwijl “type B gelatine” is afgeleid van een werkwijze op basis van alkali. Vanwege een hogere mate van deaminering van asparagine en glutamine in type B gelatine liggen de iso-elektrische punten (IEP) van type A gelatine en type B gelatine respectievelijk bij pH 7,0-9,0 en pH 4,9-5,1, wat het mogelijk maakt dat zij bij neutrale fysiologische pH positief en negatief zijn geladen. In voorkeursuitvoeringsvormen heeft de uitvinding betrekking op type A gelatine Gelatine vormt geen uniform eiwitmolecuul, maar omvat een variabele hoeveelheid eiwitmoleculen met variabele lengte. Bij voorkeur heeft de gelatine die hierin wordt gebruikt een gemiddeld molecuulgewicht in het gebied van 1500 Da tot 300 kDa, bij voorkeur tussen 2000 Da en 300 kDa, tussen 4000 Da en 300 kDa, tussen 5000 Da en 300 kDa, tussen 10 kDa en 300 kDa, of tussen 20 kDa en 300 kDa, met meer voorkeur tussen 50 kDa en 300 kDa, met de meeste voorkeur tussen 100 kDa en 300 kDa, zoals tussen 100 kDa en 275 kDa of tussen 100 kDa en 250 kDa.
De molecuulgewichtsverdeling van gelatine wordt gewoonlijk gemeten door technieken op basis van grootte-uitsluitingsvloeistofchromatografie met groot scheidend vermogen (HPLC) en geëlueerde fracties worden gedetecteerd door UV-adsorptie en de gemeten gegevens worden beoordeeld met geschikte software, welke technieken alle in de techniek bekend zijn, zie bijvoorbeeld Olijve et.al. (2000. Journal of Colloid and Interface Science 243: 476-482). De uitdrukking “gelatine die met een chemische groep (bijvoorbeeld een methacryloylgroep of een acryloylgroep) is gemodificeerd” zoals hierin gebruikt, geeft gelatine aan die de chemische groep (bijvoorbeeld een methacryloylgroep of een acryloylgroep) gehecht aan ten minste één aminegroep en/of ten minste één hydroxylgroep van de gelatine omvat.
Zoals hierin gebruikt, is “gelatine die met een methacryloylgroep is gemodificeerd”, hierin ook wel aangeduid als “methacryloyl-gemodificeerde gelatine”, “methacryloyl-gesubstitueerde gelatine” of "methacryloyl-gelatine" of ‘gelatine-methacryloyl” of ‘gelMA”, gedefinieerd als gelatine met vrije amine- en/of vrije hydroxylgroepen die zijn gesubstitueerd met ten minste één methacrylamidegroep en/of ten minste één methacrylaatgroep.
Zoals hierin gebruikt, is “gelatine die met een acryloylgroep is gemodificeerd”, hierin ook wel aangeduid als “acryloyl- gemodificeerde gelatine”, “acryloyl-gesubstitueerde gelatine” of "acryloyl-gelatine" of ‘gelatine-acryloyl”, gedefinieerd als gelatine met vrije amine- en/of vrije hydroxylgroepen die zijn gesubstitueerd met ten minste één acrylamidegroep en/of ten minste één acrylaatgroep.
Gelatine omvat aminozuren, waarvan sommige zijketens hebben die eindigen in aminegroepen (bijvoorbeeld lysine, arginine, asparagine, glutamine) of hydroxylgroepen (bijvoorbeeld serine, threonine, asparaginezuur, glutaminezuur, tyrosine, hydroxyproline). Eén of meer van deze eindstandige amine- en/of hydroxylgroepen kunnen zijn gesubstitueerd met (meth)acryloylgroepen zodat (meth)acryloyl-gelatine omvattende respectievelijk (meth)acrylamide- en/of (meth)acrylaatgroepen wordt gevormd.
De “functionaliseringsgraad (DoF)” van gelatine verwijst in het algemeen naar het percentage van gefunctionaliseerde primaire aminegroepen en/of hydroxylgroepen ten opzichte van het totaal van primaire aminegroepen en/of hydroxylgroepen.
Zoals hierin gebruikt, verwijst de “(meth)acrylamidesubstitutiegraad” naar het percentage van vrije aminegroepen in de gelatine die zijn gesubstitueerd met een (meth)acrylamidegroep.
Zoals hierin gebruikt, verwijst de “(meth)acrylaatsubstitutiegraad” naar het percentage van vrije hydroxylgroepen in de gelatine die zijn gesubstitueerd met een (meth)acrylaatgroep.
De functionaliseringsgraad, zoals de (meth)acrylamidesubstitutiegraad en/of de (meth)acrylaatsubstitutiegraad, van gelatine kan worden bepaald met methoden die op zich bekend zijn.
Zo kan bijvoorbeeld de Fe(lI!)-acetohydroxaminezuurmethode worden gebruikt voor het bepalen van (meth)acrylering op hydroxylgroepen.
De methode van Habeeb (spectrofotometrische bepaling op basis van trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) van (meth)acrylamide; Habeeb 1996. Anal.
Biochem. 14:328- 336), H-NMR en de fluoraldehydeassay (ook bekend als fluorometrische bepaling op basis van o-ftaaldialdehyde (OPA) van (meth)acrylamide) kunnen worden gebruikt voor het bepalen van (meth)acrylering op aminegroepen.
Men kan eveneens een combinatie van de voornoemde methoden gebruiken, zoals een combinatie van een fluoraldehydeassay voor het kwantificeren van aminegroepomzetting en een Fe(lI!)-acetohydroxaminezuurmethode voor kwantificering van (meth)acrylaatgroepen, wat het mogelijk maakt om de verhouding van (meth)acrylaat- tot (meth)acrylamidegroepen te bepalen.
In uitvoeringsvormen wordt de fluoraldehydeassay gebruikt voor het bepalen van de (meth)acrylamidesubstitutiegraad.
In de hierin geopenbaarde (meth)acryloyl-gelatine is (meth)acryloylering bij voorkeur aanwezig op de vrije aminegroepen.
In uitvoeringsvormen heeft de methacryloyl-gelatine methacrylamidesubstitutiegraad tussen 20% en 100%, bij voorkeur tussen 50% en 100%, met meer voorkeur tussen 80% en 100%, zoals tussen 85% en 100%, tussen 90% en 100 of tussen 95% en 100%. In uitvoeringsvormen heeft de methacryloyl-gelatine een methacrylaatsubstitutiegraad van minder dan 20%, bij voorkeur minder dan 10%, 9%, 8%, 7% of 6%, met meer voorkeur minder dan 5%, 4%, 3%, 2% of 1%. In uitvoeringsvormen heeft de methacryloyl-gelatine een methacrylamidesubstitutiegraad tussen 20% en 100% en een methacrylaatsubstitutiegraad van minder dan 20%, bij voorkeur een methacrylamidesubstitutiegraad tussen 20% en 100% en een methacrylaatsubstitutiegraad van minder dan 10%, met meer voorkeur een methacrylamidesubstitutiegraad tussen 50% en 100% en een methacrylaatsubstitutiegraad van minder dan 10%, met nog meer voorkeur een methacrylamidesubstitutiegraad tussen 80% en 100% en een methacrylaatsubstitutiegraad van minder dan 10%. In uitvoeringsvormen omvat de methacryloyl-gelatine methacrylamidesubstitutie en methacrylaatsubstitutie en is de verhouding van methacrylamidesubstitutie tot methacrylaatsubstitutie tussen 80:20 en 99:1, bij voorkeur tussen 90:10 en 99:1, met meer voorkeur tussen 95:5 en 99:1. In uitvoeringsvormen heeft de acryloyl-gelatine een acrylamidesubstitutiegraad tussen 20% en 100%, bij voorkeur tussen 50% en 100%, met meer voorkeur tussen 80% en 100%, zoals tussen 85% en 100%, tussen 90% en 100 of tussen 95% en 100%. In uitvoeringsvormen heeft de acryloyl-gelatine een acrylaatsubstitutiegraad van minder dan 20%, bij voorkeur minder dan
10%, 9%, 8%, 7% of 6%, met meer voorkeur minder dan 5%, 4%, 3%, 2% of 1%. In uitvoeringsvormen heeft de acryloyl-gelatine een acrylamidesubstitutiegraad tussen 20% en 100% en een acrylaatsubstitutiegraad van minder dan 20%, bij voorkeur een acrylamidesubstitutiegraad tussen 20% en 100% en een acrylaatsubstitutiegraad van minder dan 10%, met meer voorkeur een acrylamidesubstitutiegraad tussen 50% en 100% en een acrylaatsubstitutiegraad van minder dan 10%, met nog meer voorkeur een acrylamidesubstitutiegraad tussen 80% en 100% en een acrylaatsubstitutiegraad van minder dan 10%. In uitvoeringsvormen omvat de acryloyl-gelatine acrylamidesubstitutie en acrylaatsubstitutie, en is de verhouding van acrylamidesubstitutie tot acrylaatsubstitutie tussen 80:20 en 99:1, bij voorkeur tussen 90:10 en 99:1, met meer voorkeur tussen 95:5 en 99:1. De hierin geopenbaarde (meth)acryloyl-gelatine kan verder zijn gemodificeerd.
In uitvoeringsvormen is de (meth)acryloyl-gelatine verder gemodificeerd met een acetylgroep, een galactosylgroep, bij voorkeur een acetylgroep.
Dubbel chemisch gefunctionaliseerd gelatine- (meth)acryloyl-acetyl kan worden geproduceerd zoals beschreven in Hoch et al. (2012. Chemical tailoring of gelatine to adjust its chemical and physical properties for functional bioprinting.
Mater.
Chem.
B 1:5675). Het gelMA en de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard, hebben een lage pyrogene activiteit.
Pyrogene activiteit kan worden gemeten met gebruikmaking van een Monocyte Activation Test (MAT) -assay zoals in de techniek bekend is.
De MAT-assay maakt het mogelijk om zowel endotoxine- als niet-endotoxinepyrogeenniveaus te kwantificeren, maar maakt geen onderscheid tussen het type PAMP-verontreiniging.
Een pyrogeendetectieassay op celbasis (PAMP-assay) werd ontwikkeld door Fraunhofer Institute for Interfacial Engineering and Biotechnology IGB voor detectie en kwantificering van verschillende PAMP's, eveneens niet- endotoxinen.
Dit testsysteem op celbasis detecteert PAMP's met gebruikmaking van menselijke Toll-achtige receptoren (TLR's) (Burger-Kentischer et al. (2010) A new cell-based innate immune receptor assay for the examination of receptor activity, ligand specificity, signaling pathways and the detection of pyrogens.
J Immunol Methods, 358: 93-103). Meer in het bijzonder brengen cellen, bijvoorbeeld NIH3T3-cellen, verschillende TLR-combinaties tot expressie, wat de detectie van verschillende PAMP's mogelijk maakt.
Zo maken bijvoorbeeld cellijnen met de receptorcombinatie TLR1/2, TLR2/6, TLR4/CD14, TLR5, TLR7 en TLR9 de detectie mogelijk van pyrogenen van Gram-positieve bacteriën (TLR1/2, TLR2/6), pyrogenen van geflagelleerde bacteriën (TLR5), enkelstrengig viraal RNA (TLR7), maakt de cellijn TLR4/CD14 de detectie mogelijk van endotoxine van Gram-negatieve bacteriën en detecteert de TLRS-cellijn bacterieel DNA dat rijk is aan ongemethyleerde CpG-motieven.
In uitvoeringsvormen hebben het gelMA en de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën, pyrogenen van geflagelleerde bacteriën, enkelstrengig viraal RNA, endotoxine va Gram-negatieve bacteriën en bacterieel DNA dat rijk is aan ongemethyleerde CpG-motieven.
In bijzondere uitvoeringsvormen hebben het gelMA en de acryloyl-gelatine een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën en van geflagelleerde bacteriën, meer in het bijzonder een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën.
In bijzondere uitvoeringsvormen worden het gelMA en de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard, gekenmerkt door een laag gehalte aan endotoxine of lipopolysaccharide (LPS), in het bijzonder een LPS-gehalte van minder dan 100 EU/g, met meer voorkeur minder dan 50 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 20 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 10 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 5 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 2 EU/g, met de meeste voorkeur minder dan 1 EU/g.
De term EU is in de techniek bekend en staat voor ‘endotoxine-eenheden.
Eén EU is ongeveer equivalent aan 100 pg E. coli-lipopolysaccharide, de hoeveelheid die aanwezig is in ongeveer 10°-10° bacteriën.
Hierin staat de term EU/g voor het aantal EU per droog gewicht van gelatine/gelMA.
De Limulus-assay (LAL) is een in de techniek algemeen bekende bioassay voor het meten van hoeveelheden van LPS tot minder dan een picogram.
Limulusamebocytlysaat (LAL) is een waterig extract van bloedcellen (amoebocyten) uit de degenkrab, Limulus polyphemus.
LAL reageert met bacteriële endotoxine of lipopolysaccharide.
Deze reactie is de basis van de LAL-test, die daarom wordt gebruikt voor de detectie en kwantificering van bacteriële endotoxinen.
Zo is voorbeeld een geschikte LAL- methode voor het kwantificeren van de LPS-niveaus de chromogene Endosafe-methode, bijvoorbeeld van Charles River USA.
Andere aanvaarde en aanbevolen methoden zijn de EndoZyme recombinant factor C-methode van Hyglos GmbH (Duitsland). Deze beide methoden resulteren in soortgelijke of identieke meetwaarden en kunnen derhalve door elkaar worden gebruikt.
Verder zijn het gelMA en de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard met voordeel nagenoeg vrij van reagentia en reactieproducten.
In uitvoeringsvormen omvat de hierin geopenbaarde methacryloyl-gelatine minder dan 100 ppm MAA of minder dan 50 ppm MAA, bij voorkeur minder dan 30 ppm MAA, met meer voorkeur minder dan 25 ppm MAA, met nog meer voorkeur minder dan 20 ppm MAA.
In uitvoeringsvormen omvat de hierin geopenbaarde acryloyl-gelatine minder dan 100 ppm acrylzuur of minder dan 50 ppm acrylzuur, bij voorkeur minder dan 30 ppm acrylzuur, met meer voorkeur minder dan 25 ppm acrylzuur, met nog meer voorkeur minder dan 20 ppm acrylzuur.
MAA kan worden gemeten zoals in detail in de voorbeelden beschreven.
Zoals door de onderhavige uitvinders getoond, kunnen resten van methacrylzuur in het gelMA de verknoping van gelMA-moleculen storen.
Vanwege zijn lage methacrylzuurgehalte is het hierin geopenbaarde gelMA dus bijzonder geschikt voor verknoping ter vorming van een hydrogel of een film.
Dienovereenkomstig heeft een verder aspect betrekking op een hydrogel omvattende verknoopt gelMA of verknoopte acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard.
Verder worden hierin producten geopenbaard die zijn afgeleid van de hydrogels, zoals films, biologische hechtmiddelen, enz.
De term “hydrogel" zoals hierin gebruikt, verwijst naar een netwerk van hydrofiele polymeerketens, zoals verknoopt gelMA of verknoopte acryloyl-gelatine, wat een gel vormt.
De term "gel" geeft een aanzienlijk verdund verknoopt systeem aan dat geen stroming vertoont wanneer het zich in de stationaire toestand bevindt.
Werkwijzen voor verknoping van gelMA en acryloyl-gelatine zijn in de techniek algemeen bekend.
Typisch kunnen de (meth)acryloylgroepen op één gelatinemolecuul bij blootstelling aan licht bij aanwezigheid van een foto-initiator reageren met de (meth)acryloylgroepen op een ander gelatinemolecuul, zodat de (meth)acryloylgelatine wordt verknoopt.
De term "foto- initiator" zoals hierin gebruikt, verwijst een chemische verbinding of een mengsel van verbindingen die ontleden tot vrije radicalen bij blootstelling aan licht, bijvoorbeeld ultraviolet licht (UV) of zichtbaar licht (VIS). Niet-beperkende voorbeelden van op ultraviolet reagerende foto-initiators omvatten 1-[4-(2-hydroxyethoxy)fenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propaan-1-on (ook bekend onder de handelsnaam Irgacure® 2959) en lithiumfenyl-2,4,6-tri- methylbenzoylfosfinaat (LAP). Op zichtbaar licht reagerende foto-initiators produceren vrije radicalen wanneer zij worden blootgesteld aan zichtbaar licht.
Typische gebieden van zichtbaar licht dat bruikbaar is voor het exciteren van een op zichtbaar licht reagerende foto-initiator omvatten groen, blauw, indigo en violet.
Bij voorkeur heeft het zichtbaar licht een golflengte in het gebied van 450-550 nm.
Niet-beperkende voorbeelden van op zichtbaar licht reagerende foto-initiators omvatten Eosine Y, riboflavine/triethanolamine, vinylcaprolactam, di-2,3-diketo-1,7,7- trimethylnorcamfaan (CQ), 1-fenyl-1,2-propadion (PPD), 2,4,6-trimethylbenzoyl- difenylfosfineoxide (TPO), bis(2,6-dichloorbenzoyl)-(4-propylfenyl)fosfineoxide (Ir819), 4,4'- bis(dimethylamino)benzofenon, 4,4'-bis(diethylamino)benzofenon, 2-chloorthioxantheen-9- on, 4-(dimethylamino)benzofenon, fenanthreenchinon, ferroceen, difenyl-(2,4,6- trimethylbenzoyl)fosfineoxide/2-hydroxy-2-methylpropiofenon (50/50 mengsel),
dibenzosuberenon, (benzeen)tricarbonylchroom, resazurine, resorufin, benzoyltrimethylgermaan (Ivocerin®), derivaten daarvan en combinaties daarvan.
De lichtbestralingstijd kan elke geschikte tijd zijn die verknoping van het polymeer mogelijk maakt.
De bestralingstijd kan bijvoorbeeld in het gebied liggen van 10 seconden tot 20 minuten, bij voorkeur 1 minuut tot 20 minuten, met meer voorkeur 2-15 minuten (bijvoorbeeld 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 of 15 minuten). De mechanische eigenschappen van een hydrogel op basis van gelatine kunnen worden afgestemd voor uiteenlopende toepassingen bijvoorbeeld aan de hand van het molecuulgewicht van de gebruikte gelatine, door verandering van de (meth)acryloylsubstitutiegraad, de gelMA- of acryloyl-gelatineconcentratie, de hoeveelheid foto-initiators en de lichtblootstellingstijd.
Zoals hierin gebruikt, is de concentratie van (meth)acryloyl-gesubstitueerde gelatine gedefinieerd als het gewicht van (meth)acryloyl-gesubstitueerde gelatine gedeeld door het volume van oplosmiddel (w/v), uitgedrukt als een percentage.
Het oplosmiddel kan een farmaceutisch aanvaardbare drager zijn.
In uitvoeringsvormen van de hydrogel is de methacryloyl-gesubstitueerde gelatine of de acryloyl-gesubstitueerde gelatine aanwezig in een concentratie tussen 5% en 25% (w/v), tussen 17% en 25% (w/v), tussen 17% en 23% (w/v), of ongeveer 20% (w/v). In sommige uitvoeringsvormen is de methacryloyl-gesubstitueerde gelatine of de acryloyl-gesubstitueerde gelatine aanwezig in een concentratie tussen 5% en 15% (w/v), tussen 8% en 12% (w/v), of ongeveer 10% (w/v). In sommige uitvoeringsvormen is de methacryloyl-gesubstitueerde gelatine of de acryloyl-gesubstitueerde gelatine aanwezig in een concentratie tussen 10% en 40% (w/v), 15% en 35% (w/v), 20% en 30% (w/v), of ongeveer 5%, 10%, 15%, 20%, of 25% (w/v). De chemisch gemodificeerde gelatine, in het bijzonder de methacryloyl-gelatine en acryloyl- gelatine, en de hydrogel volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen met inbegrip van, zonder daartoe beperkt te zijn, de productie of reparatie van weefsel (bijvoorbeeld kraakbeen, zacht weefsel) in een mens of niet-menselijk dier, en het gebruik als een bio-inkt of biohars voor de driedimensionale biologische productie of het driedimensionaal bioprinten van een biologisch construct.
Het biologische construct kan om het even welk dierlijk weefsel of orgaan of deel daarvan zijn dat kan worden geproduceerd met gebruikmaking van een biologische productietechniek of bioprinttechniek, bijvoorbeeld een cellen-bevattende steunstructuur die poreus of niet-poreus kan zijn.
De term "bio-inkt" verwijst naar een hydrogel die kan worden 3D-geprint, 3D-geplot of vervaardigd tot een bijzondere vorm of construct, en die cytologisch verenigbaar is. In de hydrogel kunnen al dan niet levende cellen en/of groeifactoren, enz. worden opgenomen De term “biohars" geeft een hydrogel aan die kan worden 3D-geprint of vervaardigd tot een bijzondere vorm of construct met gebruikmaking van lichtstereolithografie op basis van laser- of lichtprojectie of soortgelijke lithografische technieken, en die cytologisch verenigbaar is. In de hydrogel kunnen al dan niet levende cellen, geneesmiddelen en/of groeifactoren, enz.
worden opgenomen.
Dienovereenkomstig heeft een aspect betrekking op een gelMA of een acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard of een hydrogel omvattende het gelMA of de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard voor gebruik in de geneeskunde. Een verder aspect heeft betrekking op een gelMA of een acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard of een hydrogel omvattende het gelMA of de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard voor gebruik voor reparatie van een weefsel of een orgaan of een deel daarvan, in een mens of niet-menselijk dier. In uitvoeringsvormen wordt het weefsel of orgaan gekozen uit botweefsel, kraakbeen en vaatweefsel. In uitvoeringsvormen wordt een gelMA of een acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard of een hydrogel omvattende het gelMA of de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard, verschaft voor gebruik als biologisch hechtmiddel of biologische lijm. Het gel MA of de acryloyl-gelatine of de hydrogel omvattende het gelMA of de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard, kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor orthopedische toepassingen, voor orthodontische toepassingen of voor cosmetische en plastische chirurgie.
Een daarmee samenhangend aspect is gericht op in-vitro- of ex-vivogebruik van een gelMA of een acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard of een hydrogel omvattende het gelMA of de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard voor de productie van een weefsel of een orgaan, of een deel daarvan. In uitvoeringsvormen wordt het weefsel of orgaan gekozen uit botweefsel, kraakbeen en vaatweefsel. Verder wordt hierin een door weefseltechnologie geconstrueerd weefsel of orgaan of deel daarvan geopenbaard, omvattende een gelMA of een acryloyl- gelatine zoals hierin geopenbaard of een hydrogel omvattende het gelMA of de acryloyl- gelatine zoals hierin geopenbaard.
Een ander aspect is gericht op in-vitro- of ex-vivogebruik van een gelMA of een acryloyl- gelatine zoals hierin geopenbaard of een hydrogel omvattende het gelMA of de acryloyl- gelatine zoals hierin geopenbaard voor de productie van een doseringsvorm met geregelde afgifte of een biologisch construct. Het biologische construct kan bijvoorbeeld een bekleding zijn op een (vaste) drager die geschikt is voor hechting en proliferatie van cellen of een steunstructuur die geschikt is om cellen of geneesmiddelen en/of vectoren te bevatten.
Nog een verder aspect heeft betrekking op het gebruik van een gelMA of een acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard of een hydrogel omvattende het gelMA of de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard als een bio-inkt of biohars.
In verdere uitvoeringsvormen wordt de bio-inkt of biohars gebruikt voor driedimensionale biologische vervaardiging of driedimensionaal bioprinten van een biologisch construct.
Het biologische construct kan een dierlijk weefsel of orgaan of deel daarvan zijn.
Het biologische construct kan eveneens bestaan uit een steunstructuur die geschikt is om cellen te bevatten of een steunstructuur die geschikt is om bijvoorbeeld geneesmiddelen en/of vectoren te bevatten (bijvoorbeeld voor geneesmiddelaflevering/gentherapietoepassingen). Het biologische construct kan eveneens een biologisch resorbeerbare schroef of ander biologisch materiaal (bijvoorbeeld biologisch hechtmiddel) zijn.
In uitvoeringsvormen is het biologische construct een steunstructuur die geschikt is om cellen te bevatten.
In uitvoeringsvormen is het biologische construct een bekleding.
Verder wordt hierin een biologisch construct geopenbaard, omvattende het gelMA of de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard of een hydrogel omvattende het gelMA of de acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard.
Nog een verder aspect heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een methacryloyl-gelatine en een acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard.
De onderhavige uitvinders hebben verrassend gevonden dat zuivering van een waterig reactiemedium van gelMA of acryloyl-gelatine volgens de in WO 2016/085345 beschreven werkwijze niet alleen lipopolysacchariden uit het medium verwijdert, maar eveneens andere pyrogenen alsook het methacrylzuur en acrylzuur die tijdens respectievelijk de methacryloyleringsreactie en acryloyleringsreactie worden gevormd.
Als zodanig is geen dialyse van het reactiemedium vereist, wat leidt tot een snellere werkwijze die gelMA verschaft dat een laag LPS-gehalte, een laag pyrogeengehalte en een laag methacrylzuur- of acrylzuurgehalte heeft zoals elders hierin gespecificeerd.
Dienovereenkomstig heeft de uitvinding in een verder aspect betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een (meth)acryloyl-gelatine zoals hierin geopenbaard, waarbij de werkwijze de volgende stappen omvat: a) het modificeren van gelatine met een (meth)acryloylgroep door het laten reageren van gelatine met (meth)acrylzuuranhydride; b) het verlagen van de pH van het reactiemedium tot een waarde tussen 2,0 en 5,0, bij voorkeur tussen 2,0 en 4,0;
c) het toevoegen van een micel-vormend oppervlakteactieve middel aan het reactiemedium; d) het in contact brengen van het medium van stap c) met een vast adsorptiemiddel; e) het afscheiden van het vaste adsorptiemiddel van stap d) van het medium; f) het winnen van het medium omvattende de methacryloyl-gelatine; en g) eventueel het drogen van het medium omvattende de (meth)acryloyl-gelatine van stap f). Elk type gelatine, bijvoorbeeld type A of type B gelatine, afkomstig van bijvoorbeeld runderen, varkens, pluimvee of vis, kan worden gebruikt bij de werkwijzen zoals hierin beschreven.
In uitvoeringsvormen wordt type A gelatine gebruikt.
Methacryloylering en acryloylering van gelatine kan worden uitgevoerd door het laten reageren van gelatine met respectievelijk methacrylzuuranhydride en acrylzuuranhydride in een geschikte buffer, bijvoorbeeld in carbonaatbuffer bij pH 9,0, bij een temperatuur van 50°C gedurende 120-180 minuten.
De (meth)acryloyleringsgraad van het gelMA kan worden afgestemd door de (meth)acrylzuuranhydride:gelatineverhouding te variëren zoals beschreven in Shirahama et al. (2016). Tijdens de reactie worden respectievelijk gelMA en acryloyl-gelatine gevormd alsook methacrylzuur of acrylzuur.
De pH van het reactiemedium wordt voordat het micel-vormende oppervlakteactieve middel wordt toegevoegd, verlaagd tot een waarde tussen 2,0 en 5,0, bij voorkeur tussen 2,0 en 4,0, met meer voorkeur tussen 3,0 en 4,0, zoals een waarde van ongeveer 3,5. Wanneer de volgende stappen van de werkwijze bij lage pH worden uitgevoerd, dan worden met voordeel LPS, pyrogenen en methacrylzuur of acrylzuur doeltreffender verwijderd.
Bij de hierin beschreven werkwijzen wordt een micel-vormend oppervlakteactief middel aan het reactiemedium toegevoegd.
Een micel-vormend oppervlakteactief middel is in staat tot vorming van micellen (oplosbare aggregaten} in oplossing.
Micel-vormende oppervlakteactieve middelen zijn in de techniek bekend en zijn bijvoorbeeld beschreven in WO 2009/15440. Het micel-vormende oppervlakteactieve middel kan een ionisch oppervlakteactieve middel, zoals een kationisch of anionisch oppervlakteactief middel, zijn.
Bij voorkeur is het oppervlakteactieve middel een niet-ionisch oppervlakteactief middel, omdat een dergelijk oppervlakteactief middel de neiging heeft micellen bij een lagere concentratie te vormen in vergelijking met ionische oppervlakteactieve middelen.
Verder kunnen ionische oppervlakteactieve middelen interageren met de gelatine door ionische bindingen en zijn zij moeilijker te verwijderen.
Bij voorkeur is het micel-vormende niet-ionische oppervlakteactieve middel een geëthoxyleerd oppervlakteactief middel, bij voorkeur een alkylfenolethoxylaat, welk alkylfenolethoxylaat bij voorkeur wordt voorgesteld door de formule C,Hz,--CsH4-O-(C,H,0)nH, waarbij x 4 -12 is en n 7,5 - 14 is, waarbij X bij voorkeur 8 is en n bij voorkeur 8-13, met meer voorkeur 8,5-12,5, met de meeste voorkeur 9-12, is, in het bijzonder Triton X-100, Triton X-102 of mengsels daarvan. De Triton X-serie van niet-ionische oppervlakteactieve middelen wordt bereid door de reactie van octylfenol met ethyleenoxide. De producten zijn van het type dat in het algemeen wordt beschreven als alkylarylpolyetheralcoholen en hebben de volgende structuurformule: CgH,7 CsH5(CHz2CH20)e 7 (Triton X-100) en CgH19 CgHs(CH;CH;0}123 (Triton X-102). Andere niet-ionische oppervlakteactieve middelen die geschikt zijn, omvatten nonylfenoxypolyethoxyethanolen C,5H:40(C:H,0)n, waarbij n 3-40 is, zoals nonoxynol-4, nonoxynol-15 en nonoxynol-30, of polyethyleenglycolsorbitanmonoesters van C12-C18- vetzuren, zoals TWEEN. CHAPSO (3-([3-cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxyl-1- propaansulfonaat is een ander geschikt niet-ionisch oppervlakteactief middel. Zoals beschreven in WO 2009/15440 wordt LPS als gevolg van het toevoegen van een micel- vormend oppervlakteactief middel gemonomeriseerd en interageren de monomeren naar wordt aangenomen met het oppervlakteactieve middel, wat micelcomplexen vormt die oppervlakteactief middel en LPS omvatten.
Teneinde doeltreffendere verwijdering van de LPS, en bij voorkeur eveneens andere pyrogenen, in het bijzonder pyrogenen van Gram-positieve bacteriën en pyrogenen van geflagelleerde bacteriën, meer in het bijzonder pyrogenen van Gram-positieve bacteriën, mogelijk te maken, is de gewichtsverhouding van gelatine, in het bijzonder gelMA of acryloyl- gelatine, tot toegevoegd oppervlakteactief middel, in het bijzonder niet-ionisch oppervlakteactief middel, bij voorkeur 2000 : 1 of minder, met meer voorkeur 500 : 1 of minder, met nog meer voorkeur 250 : 1 of minder, met de meeste voorkeur 50 : 1 of minder. Bij hogere gewichtsverhoudingen, dat wil zeggen in het geval dat er relatief meer gelatine is, zal namelijk niet alle LPS door het oppervlakteactieve middel worden gebonden. Bij voorkeur wordt het oppervlakteactieve middel aan het reactiemedium toegevoegd in een concentratie van 0,01 — 1,5 gew.%, bij voorkeur 0,015 — 1,0 gew.%, met meer voorkeur 0,020-0,50 gew.%.
In stap d) van de hierin beschreven werkwijze wordt het medium van stap c), dat oplosbare aggregaten omvattende oppervlakteactief middel, LPS en monomeren daarvan en/of andere pyrogenen, in het bijzonder pyrogenen van Gram-positieve bacteriën en pyrogenen van geflagelleerde bacteriën, meer in het bijzonder pyrogenen van Gram-positieve bacteriën, kan bevatten, in contact gebracht met een vast adsorptiemiddel. Naast binding van het oppervlakteactieve middel, en bij voorkeur eveneens LPS, bindt het adsorptiemiddel eveneens bij voorkeur andere pyrogenen, in het bijzonder pyrogenen van Gram-positieve bacteriën, pyrogenen van geflagelleerde bacteriën, enkelstrengig viraal RNA en bacterieel DNA dat rijk is aan ongemethyleerde CpG-motieven, en methacrylzuur of acrylzuur. Het vaste adsorptiemiddel kan elk de deskundige bekend geschikt adsorptiemiddel zijn dat het oppervlakteactieve middel, en bij voorkeur eveneens LPS, andere pyrogenen en (meth)acrylzuur kan binden, zoals een hydrofoob adsorptiemiddel.
Het adsorptiemiddel is bij voorkeur onoplosbaar en geschikte adsorptiemiddelen omvatten kleien, zoals (geactiveerde) diatomeeënaarde of kleien, fyllosilicaten, zoals aluminiumfyllosilicaat, smectietmineralen en hydrofobe adsorptiemiddelen, zoals geactiveerde koolstof, bijvoorbeeld Norit SX Plus of Norit ROX 0.8 (Cabot, Nederland), of 3M ZetaCarbon filterpatronen, bijvoorbeeld zoals van het type R55S of R30L3S (3M, USA). Verder kunnen mengsels van één of meer adsorptiemiddelen worden toegepast.
In voorkeursuitvoeringsvormen is het vaste adsorptiemiddel geactiveerde koolstof.
Het in contact brengen van het medium met een vast adsorptiemiddel kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door het toevoegen van deeltjesvormig adsorptiemiddel aan het medium of door het medium te leiden door een filterelement dat het adsorptiemiddel omvat of over een kolom waarin het adsorptiemiddel als een laag is aangebracht of door het incuberen van het medium met een drager op het uitwendige oppervlak waarvan het adsorptiemiddel aanwezig is.
Het vaste adsorptiemiddel wordt bij voorkeur aan het medium toegevoegd in een gewichtsverhouding tot het oppervlakteactieve middel van ten minste 2,5 : 1, met meer voorkeur van ten minste 3,0 : 1, met de meeste voorkeur van ten minste 3,5 : 1. Het vaste adsorptiemiddel wordt bij voorkeur aan het medium toegevoegd in een concentratie van 0,1 - 3 gew.%, bij voorkeur van 0,5 - 1 gew.%. In het geval dat filterelementen of -systemen worden gebruikt, kan het de voorkeur hebben om overeenkomende hoeveelheden adsorptiemiddel in het filtersystem te gebruiken.
De stap van het in contact brengen wordt een voldoende tijd uitgevoerd om behoorlijke adsorptie van het oppervlakteactieve middel mogelijk te maken, wat leidt tot verwijdering van het oppervlakteactieve middel en de LPS en/of andere pyrogenen, in het bijzonder pyrogenen van Gram-positieve bacteriën en pyrogenen van geflagelleerde bacteriën, meer in het bijzonder pyrogenen van Gram-positieve bacteriën, die aan het oppervlakteactieve middel zijn gebonden, en bij voorkeur eveneens om adsorptie van het (meth)acrylzuur, LPS en andere pyrogenen, in het bijzonder pyrogenen van Gram-positieve bacteriën, pyrogenen van geflagelleerde bacteriën, enkelstrengig viraal RNA en bacterieel DNA dat rijk is aan ongemethyleerde CpG-motieven, en methacrylzuur, die aan het adsorptiemiddel zijn gebonden, mogelijk te maken.
Bij voorkeur wordt het adsorptiemiddel 5 minuten tot 1 uur, met meer voorkeur 10 - 30 minuten, met het (waterige) medium in contact gebracht.
In de volgende stap (e)) van de hierin beschreven werkwijze wordt het vaste adsorptiemiddel uit het medium verwijderd.
De deskundige kent geschikte wijzen om een waterig medium in contact te brengen met een vast adsorptiemiddel en om het adsorptiemiddel van het medium af te scheiden.
De scheiding kan bijvoorbeeld centrifugatie of filtratie omvatten in het geval dat het adsorptiemiddel als een deeltjesvormig materiaal aan het medium wordt toegevoegd, in welk geval met het oog op industriële toepasbaarheid filtratie de voorkeur heeft.
Zo kan het vaste adsorptiemiddel bijvoorbeeld aan het medium (van stap b)) worden toegevoegd en kan het adsorptiemiddel nadat het oppervlakteactieve middel en bij voorkeur eveneens de LPS, andere pyrogenen en MAA of acrylzuur de gelegenheid is gegeven aan het adsorptiemiddel te binden, worden verwijderd, bijvoorbeeld door filtratie, sedimentatie of centrifugatie en dergelijke.
In een ander voorbeeld kan het vaste adsorptiemiddel in een filter aanwezig zijn en wordt het medium (van stap c) van de hierin beschreven werkwijze) door het filter of door een reeks van dergelijke filters geleid, waarbij de filters eventueel kunnen worden gewassen teneinde de opbrengst van het filtraat te optimaliseren.
Op deze wijze kunnen stappen dj), e) en f) van de hierin beschreven werkwijze worden gecombineerd in een enkele filtratiestap.
Na de afscheiding van het vaste adsorptiemiddel wordt het medium dat de methacryloyl- gelatine of de acryloyl-gelatine omvat, gewonnen.
Zoals hiervoor opgemerkt, leidt de hierin beschreven werkwijze tot methacryloyl-gelatine of acryloyl-gelatine met een laag LPS-gehalte, in het bijzonder een LPS-gehalte van minder dan 100 EU/g, met meer voorkeur minder dan 50 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 20 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 10 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 5 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 2 EU/g, met de meeste voorkeur minder dan 1 EU/g.
In het bijzonder omvat het gelMA of de acryloyl-gelatine ten minste 50 maal minder LPS, bij voorkeur ten minste 100 maal, met meer voorkeur ten minste 150 maal, met nog meer voorkeur ten minste 200 maal en met de meeste voorkeur ten minste 250 maal minder LPS in vergelijking met het LPS-gehalte van de als uitgangsmateriaal van stap a) gebruikte gelatine.
De LPS-waarde kan met gebruikmaking van bijvoorbeeld de LAL-assay zoals elders hierin beschreven uit het gewonnen medium worden bepaald.
De verkregen methacryloyl-gelatine of acryloyl-gelatine wordt verder gekenmerkt door een laag gehalte aan niet-endotoxinepyrogenen, in het bijzonder een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën, pyrogenen van geflagelleerde bacteriën, enkelstrengig viraal RNA, endotoxine van Gram-negatieve bacteriën en bacterieel DNA dat rijk is aan ongemethyleerde CpG-motieven, meer in het bijzonder een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën en van geflagelleerde bacteriën, nog meer in het bijzonder een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën.
In het bijzonder omvat het gelMA of de acryloyl-gelatine ten minste 10 maal minder pyrogenen van Gram-positieve bacteriën, bij voorkeur ten minste 20 maal minder, met meer voorkeur ten minste 50 maal, met nog meer voorkeur ten minste 100 maal, ten minste 150 maal, ten minste 200 maal of ten minste 250 maal minder, in vergelijking met het gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën van de als uitgangsmateriaal van stap a) gebruikte gelatine.
In het bijzonder omvat het gelMA of de acryloyl-gelatine ten minste 10 maal minder pyrogenen van geflagelleerde bacteriën, bij voorkeur ten minste 20 maal minder, met meer voorkeur ten minste 50 maal, met nog meer voorkeur ten minste 100 maal, ten minste 150 maal, ten minste 200 maal of ten minste 250 maal minder, in vergelijking met het gehalte aan pyrogenen van geflagelleerde bacteriën van de als uitgangsmateriaal van stap a) gebruikte gelatine.
In het bijzonder omvat het gelMA of de acryloyl-gelatine ten minste 10 maal minder bacterieel DNA dat rijk is aan ongemethyleerde CpG-motieven, bij voorkeur ten minste 20 maal minder, met meer voorkeur ten minste 50 maal, met nog meer voorkeur ten minste 100 maal, ten minste 150 maal, ten minste 200 maal of ten minste 250 maal minder, in vergelijking met het gehalte van minder bacterieel DNA dat rijk is aan ongemethyleerde CpG-motieven van de als uitgangsmateriaal van stap a) gebruikte gelatine. minder enkelstrengig viraal RNA.
Verder leidt de hierin beschreven werkwijze tot methacryloyl-gelatine met een laag methacrylzuurgehalte, in het bijzonder minder dan 30 ppm methacrylzuur, of acryloyl-gelatine met een laag acrylzuurgehalte, in het bijzonder minder dan 30 ppm acrylzuur.
Aldus verschaft de onderhavige werkwijze een gezuiverd gelMA of een gezuiverde acryloyl- gelatine in een enkele ronde van de hierboven beschreven 6 stappen a)-f). Omdat de hierin beschreven werkwijze leidt tot (meth)acryloyl-gelatine met een laag (meth)acrylzuurgehalte zonder de noodzaak van een dialysestap, is de werkwijze bij voorkeur vrij van een dialysestap.
Een dergelijke dialysestap is in het algemeen tijdrovend en derhalve is de onderhavige werkwijze doeltreffender, met name voor productie van een gezuiverd gelMA en een gezuiverde acryloyl-gelatine op grote schaal.
In uitvoeringsvormen omvat de werkwijze verder een stap van het drogen van het gewonnen medium dat het gelMA of de acryloyl-gelatine omvat, bijvoorbeeld door vriesdrogen tot een wit poreus schuim (Van Den Bulcke et al. 2000. Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.
Biomacromolecules 1:31-38). De onderhavige uitvinding zal nu verder worden toegelicht aan de hand van de volgende niet- beperkende voorbeelden.
VOORBEELDEN Voorbeeld 1: Werkwijze voor bereiding van GelMA en eigenschappen van het gelMA Materialen en werkwijzen Synthese van gelMA Een oplossing van 15-20 % gelatine (varkenshuid, type A, Bloom 200) in 1,25 M carbonaatbuffer bij pH 9,0 werd de gelegenheid gegeven te reageren met methacrylzuuranhydride in een verhouding van 1:1 gedurende 120-180 minuten bij 50°C.
Tijdens de reactie werd methacrylzuur gevormd.
De pH van het reactiemedium werd met gebruikmaking van HCI tot pH 3,5 verlaagd om het carbonaat te verwijderen. 1,12% (betrokken op het gewicht van gelatine) triton X100 werd aan het medium toegevoegd en het medium werd 1 uur geagiteerd gehouden.
Het medium werd vervolgens over een met actieve koolstof gepakte kolom gefiltreerd.
Bepaling van LPS-gehalte Het LPS-gehalte werd bepaald met gebruikmaking van de EndoZyme Il-assaykit (Hyglos) volgens de instructies van de producent.
In het kort werden gelMA-oplossingen in ultrazuiver water van 2,50 gew.% en verdunningen van 10x, 20x, 50x, 100x, enz. afhankelijk van het verwachte LPS-gehalte bereid. 100 ul van elk monster werd aan een putje van een microtiterplaat toegevoegd en gemengd met 100 ul van het assayreagens dat is bereid volgens de instructies van de producent.
De fluorescentie-intensiteit van de ontstane mengsels werd gevolgd in een microplaatfluorescentielezer (BopTek; excitatie/emissie = 380 nm/455 nm). Een verdunningsreeks van een endotoxinestandaard (E. coli 055:B5) aangemaakt in endotoxinevrij water bij 50 EU/ml werd als ijkstandaard gebruikt; en endotoxinevrij water werd als blanco gebruikt.
Bepaling van MAA-gehalte Oplossingen van 8 gew.% van de gelMA-monsters in water werden gemaakt.
De monsters werd 15 min de gelegenheid gegeven bij kamertemperatuur te zwellen en vervolgens werden zij 30 min bij 50°C gehouden totdat de monsters op het oog volledig waren opgelost. 0,5 ml van de monsteroplossingen werd toegevoegd aan 10-kDa Amicon Ultra Centrifugal Filters (Milipore) en 10 min bij 50°C (oven) gehouden, waarna zij 30 min at 40°C bij 12.000 xg werden gecentrifugeerd.
Daarna werden de filtraten voor HPLC-analyse verzameld.
Een verdunningsreeks van methacrylzuur in het gebied van 0,1 ppm tot 100 ppm werd gemaakt door een oplossing van 1 gew.% methacrylzuur in water te bereiden en tweevoudige verdunningen in water te maken, en als standaard gebruikt.
Bepaling van DNA-gehalte Een voorraadconcentratie van 0,1 mg/ml zalmtestis-dsDNA-standaard werd bereid in TE-buffer (10mM Tris-HCI met 1mM EDTA in water, pH = 8) en verder verdund tot een voorraadconcentratie van 10 ug/ml.
Kwantificeringsstandaards in het gebied van 10 ug/ml tot O g/ml in TE-buffer. 10 gew.%'s gelatinemonsters werden bereid in TE-buffer; de monsters werd 30 min de gelegenheid gegeven te zwellen waarna zij bij 40°C met gebruikmaking van een waterbad werden opgelost. 95 ul van een basismengsel bevattende 94 ul TE-buffer en 1 ul SYBR Green (100x), en 5 ul van een monster of standaard werden toegevoegd aan de putjes van een fluorescerende microtiterplaat met 96 zwarte putjes en gemengd door op en neer te pipetteren.
De microtiterplaat met 96 putjes werd afgedekt en 30 min bij 37°C en 700 rpm geïncubeerd.
Fluorescentie werd gemeten bij Ex535nm/Em617nm met gebruikmaking van een Synergy" Mx fluorometer (BioTek) bij 25°C volgens de instructies van de producent.
Resultaten Tabel 1. Vergelijking van LPS-gehalte, MAA-gehalte en DNA-gehalte van gelMA's volgens de uitvinding (Rousselot 1-3) en in de handel verkrijgbare gelMA's.
Sigma gelMA 90.000 43 17,45 (900629, 40% sub, 300 bl) Sigma GelMA 110 53 15,88 (900496, 80% sub, 300 bl)
De methacryloyl-gelatine volgens de onderhavige uitvinding wordt dus gekenmerkt door een laag endotoxinegehalte en een laag MAA-gehalte, bijvoorbeeld in vergelijking met in de handel verkrijgbare gelMA's. Zij worden verder gekenmerkt door een laag DNA-gehalte, wat erop duidt dat in de gelMA's volgens de uitvinding pyrogene activiteit op basis van nucleïnezuren laagis.
Voorbeeld 2: Verknoping De invloed van verontreinigend methacrylzuur op reologische eigenschappen van gelMA- hydrogels werd getest.
Materialen en werkwijzen 65 g oplossing 10% (w/v) van gelMA (bereid volgens Voorbeeld 1) en 0,5% (w/v) Irgacure (Irgacure 2959 foto-initiator (2-hydroxy-4"-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon)) werd bereid in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 in 150 ml Falcon-buizen gewikkeld in aluminiumfolie. Eerst werd 2x162,5 mg Irgarcure opgelost in 2x29,1 ml PBS. Het Irgacure- poeder werd gedispergeerd in PBS door het mengsel enkele malen op en neer te pipetteren en de oplossingen werden ongeveer 20 min in een waterbad bij 60°C gedaan, 2x3,25 g gelMA werd toegevoegd, gevortext en in het waterbad bij 60°C bewaard. De mengsels werden regelmatig gevortext totdat de solubilisatie volledig was. Beide oplossingen werden in één buis samengevoegd en gevortext.
De oplossing van gelMA en Irgarcure werd gesplitst in 8x7ml in 15 ml Flacon-buizen gewikkeld in aluminiumfolie, en O ul (geen MAA), 0,7 ul (100 ppm MAA), 2,1 ul (300 ppm MAA) of 4,2 ul (600 ppm MAA) methacrylzuur (11,67 M) werd in duplo aan de buizen toegevoegd. De buizen werden gevortext en 90 minuten in een waterbad bij 40°C bewaard, waarna zij uit het waterbad werden genomen en hun een nacht de gelegenheid werd gegeven bij kamertemperatuur te rusten.
20 minuten voorafgaand aan analyse werden de monsters in een waterbad bij 40°C opnieuw gesmolten, en voor elk monster werd 3 x 2 ml oplossing uit de buis overgebracht in 3 Elastosens"" monsterhouders, die op de machine waren geijkt. Eén druppel oppervlakteactief middel werd in elke monsterhouder toegevoegd en UV-licht (365 nm) werd 20 min bij kamertemperatuur (UV-lamp (UVMLS-38 EL Series 3UV-254/302/365 nm/8W, 0,16A) ingesteld op 365 nm) op de monsters geschenen. Onmiddellijk na deze UV-harding werden de monsterhouders in het Elastosens”" Bio? instrument geplaatst en werd reologieanalyse 45 min bij 20°C met metingen elke 15 seconden uitgevoerd.
Resultaten Zoals getoond in Figuur 1 neemt de uiteindelijke opslagmodulus (G’) af met toenemende concentratie van MAA, wat erop duidt dat elasticiteit van de hydrogel op basis van gelMA afneemt wanneer verontreinigend MAA in het gelMA aanwezig is.
Voorbeeld 3: Biologische verenigbaarheid van gelMA's Celkweek Menselijke EA.hy926 endotheelcellen (ATCC) worden volgens standaardprocedures gekweekt, dat wil zeggen in kweekmedium bestaande uit DMEM + Glutamax (hoog glucosegehalte) gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% niet-essentiële aminozuren en 1% penicilline/streptomycineoplossing, en bij 10% CO2 en 37°C.
Opslagmedium Drie verschillende opslagmedia worden bereid, waarvan de samenstelling in Tabel 2 is vermeld.
Tabel 2. Samenstelling van het opslagmedium en opslagtemperatuur.
Omstandigheid gelMA gelMA serumvrij Temperatuur volgens (Sigma) medium (mi) (°C) Voorbeeld (mg) 1 (mg) 1 0 0 10 37,22 en 4 2 1000,0 0 10 37,22 en 4 3 0 900 9 37,22 en 4 De hoeveelheid gelMA wordt gestandaardiseerd op 10% w/v.
Voor de gelMA-bevattende media wordt gelMA-poeder afgewogen en in medium gesuspendeerd.
Vervolgens wordt dit mengsel tot 45°C verwarmd om het gelMA te solubiliseren en homogeniseren.
Alle opslagmedia worden gesteriliseerd met gebruikmaking van een spuit gehecht aan een 0,22 um poriefilter met geringe binding.
Biologische verenigbaarheid/opslagtests De opslagmedia worden in een beker met gedestilleerd water gedaan en één uur in een warmwaterbad bij 37°C gezet.
Vervolgens wordt na trypsinisatie de celsuspensie uit 2 dicht bezette T75-kolven samengevoegd en verdeeld in 9 buizen van 15 ml, 3 min bij 1000 rpm gecentrifugeerd, en de supernatant wordt verwijderd.
De cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 3 ml opslagmedium.
Ten slotte wordt 400 ul celsuspensie overgebracht naar steriele Eppendorf-buizen.
Deze buizen worden elk 1, 2 of 3 dagen bij 4°C, 22°C en 37°C opgeslagen.
GelMA-vrij kweekmedium (met serum) wordt tot 37°C verwarmd, en 1,3 ml wordt onmiddellijk overgebracht naar de Eppendorf-buizen die zijn opgeslagen.
De Eppendorf-buizen worden in een warmwaterbad bij 37°C geplaatst om het gelMA te smelten.
Vervolgens worden de cellen met gebruikmaking van een microcentrifuge 3 min bij kamertemperatuur bij 1300 rpm gecentrifugeerd.
Vervolgens wordt de supernatant verwijderd, worden cellen in 1,5 ml kweekmedium opnieuw gesuspendeerd en wordt 750ul celsuspensie overgebracht naar een putje van twee microtiterplaten met 24 putjes.
Eén plaat wordt 24 h en één plaat wordt 72 h in een incubator bij 37°C en 10% CO2 geïncubeerd.
Na incubatie worden microscoopfoto's bij 10X10 genomen.
De resazurineassay, die de mitochondriale activiteit van de cellen volgt aan de hand van de omzetting van resazurine in resorufin (gemeten door fluorescentie Aexcitatie/Aemissie 560/590 in het medium), wordt gebruikt als een indirecte werkwijze voor de totale hoeveelheid cellen.
Daarnaast wordt het eiwitgehalte van de gehechte cellen bepaald met gebruikmaking van de sulforhodamine B (SRB)-assay.
In het kort wordt TCA toegevoegd om de cellen 1 h te fixeren, waarna de cellen 5x met leidingwater worden gewassen.
Vervolgens wordt de SRB-kleurstof 30 min toegevoegd, waarna de cellen 5x met 1% ijsazijn in water worden gewassen.
Ten slotte wordt de kleurstof opgelost in 10 mM Tris-buffer en wordt de absorbantie bij 490nm met gebruikmaking van een microtiterplaatlezer gemeten.
Alle tests worden in drievoud uitgevoerd (3 eppendorf-buizen per opslagomstandigheid).
Claims (15)
1. Gelatine die met een methacryloylgroep of een acryloylgroep is gemodificeerd en een lipopolysaccharidegehalte van minder dan 100 EU/g, bij voorkeur minder dan 50 EU/g, met meer voorkeur minder dan 20 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 10 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 5 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 2 EU/g, met de meeste voorkeur minder dan 1 EU/g heeft.
2. Gelatine volgens conclusie 1, omvattende minder dan 30 ppm methacrylzuur of acrylzuur.
3. Gelatine volgens conclusie 1 of 2, die een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën, pyrogenen van geflagelleerde bacteriën, enkelstrengig viraal RNA en bacterieel DNA dat rijk is aan ongemethyleerde CpG-motieven, bij voorkeur een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën en van geflagelleerde bacteriën, met meer voorkeur een laag gehalte aan pyrogenen van Gram-positieve bacteriën heeft.
4. Gelatine volgens een van conclusies 1 tot 3, waarbij de gelatine type A gelatine is.
5. Gelatine volgens een van conclusies 1 tot 4, die een methacrylamidesubstitutiegraad of acrylamidesubstitutiegraad tussen 20% en 100%, bij voorkeur tussen 50% en 100%, met meer voorkeur tussen 80% en 100%, en een methacrylaatsubstitutiegraad van minder dan 10% heeft.
6. Gelatine volgens een van conclusies 1 tot 5, waarbij de gelatine verder met een acetylgroep is gemodificeerd.
7. Hydrogel omvattende een gelatine die met een methacryloylgroep of een acryloylgroep is gemodificeerd volgens een van conclusies 1 tot 6, en een verknopingsmiddel.
8. Film omvattende een hydrogel volgens conclusie 7.
9. Werkwijze voor het bereiden van gelatine die met een methacryloylgroep of acryloyl is gemodificeerd volgens een van conclusies 1 tot 6, omvattende de volgende stappen:
a) het modificeren van gelatine met een methacryloylgroep of een acryloylgroep door het laten reageren van gelatine met methacrylzuuranhydride of acrylzuuranhydride; b) het verlagen van de pH van het reactiemedium tot een waarde tussen 3 en 4; c) het toevoegen van 0,01 — 1,5 gew.% van een micel-vormend oppervlakteactief middel aan het zure reactiemedium; d) het in contact brengen van het medium van stap c) met een vast adsorptiemiddel; e) het afscheiden van het vaste adsorptiemiddel van stap d) van het medium; en f) het winnen van het medium dat de methacryloyl-gelatine of het gelatine-acryloyl omvat.
10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij het micel-vormende oppervlakteactieve middel een niet-ionisch oppervlakteactief middel omvat, waarbij bij voorkeur het oppervlakteactieve middel Triton X-100 of Triton X-102 of mengsels daarvan is.
11. Werkwijze volgens conclusie 9 of 10, waarbij het vaste adsorptiemiddel een hydrofoob adsorptiemiddel, bij voorkeur geactiveerde koolstof, is.
12. Werkwijze volgens een van conclusies 9 tot 11, verder omvattende een stap van het drogen van het medium dat de methacryloyl-gelatine of het gelatine-acryloyl omvat.
13. Gelatine volgens een van conclusies 1 tot 6 of hydrogel volgens conclusie 7 voor gebruik in de geneeskunde.
14. In-vitro- of ex-vivogebruik van gelatine volgens een van conclusies 1 tot 6 of een hydrogel volgens conclusie 7 voor het produceren van een biologisch construct, zoals een weefsel of een orgaan of een deel daarvan, een bekleding, een steunstructuur of een doseringsvorm met geregelde afgifte.
15. Gebruik van gelatine volgens een van conclusies 1 tot 6 of een hydrogel volgens conclusie 7 als een bio-inkt of biohars.
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE20205347A BE1028324B1 (nl) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | Ge(meth)acryleerd gelatine laag in endotoxines |
| BR112022021727A BR112022021727A2 (pt) | 2020-05-19 | 2021-05-19 | Gelatina de (met)acriloíla com endotoxina baixa |
| CN202180033387.9A CN115551924A (zh) | 2020-05-19 | 2021-05-19 | 低内毒素(甲基)丙烯酰基明胶 |
| US17/917,774 US20230133041A1 (en) | 2020-05-19 | 2021-05-19 | Low endotoxin gelatin-(meth)acryloyl |
| EP21724526.5A EP4153662B1 (en) | 2020-05-19 | 2021-05-19 | Low endotoxin gelatin-(meth)acryloyl |
| CA3179000A CA3179000C (en) | 2020-05-19 | 2021-05-19 | Low endotoxin gelatin-(meth)acryloyl |
| PCT/EP2021/063257 WO2021233981A1 (en) | 2020-05-19 | 2021-05-19 | Low endotoxin gelatin-(meth)acryloyl |
| IL298322A IL298322B1 (en) | 2020-05-19 | 2021-05-19 | GELATIN–(METH)ACRYLOYL with low endotoxin |
| KR1020227044343A KR102685654B1 (ko) | 2020-05-19 | 2021-05-19 | 내독소 저함량 젤라틴-(메트)아크릴로일 |
| AU2021274046A AU2021274046B2 (en) | 2020-05-19 | 2021-05-19 | Low endotoxin gelatin-(meth)acryloyl |
| JP2022570316A JP7523585B2 (ja) | 2020-05-19 | 2021-05-19 | 低エンドトキシンゼラチン－（メタ）アクリロイル |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE20205347A BE1028324B1 (nl) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | Ge(meth)acryleerd gelatine laag in endotoxines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BE1028324A1 true BE1028324A1 (nl) | 2021-12-14 |
| BE1028324B1 BE1028324B1 (nl) | 2021-12-22 |
Family
ID=71514919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BE20205347A BE1028324B1 (nl) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | Ge(meth)acryleerd gelatine laag in endotoxines |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230133041A1 (nl) |
| EP (1) | EP4153662B1 (nl) |
| JP (1) | JP7523585B2 (nl) |
| KR (1) | KR102685654B1 (nl) |
| CN (1) | CN115551924A (nl) |
| AU (1) | AU2021274046B2 (nl) |
| BE (1) | BE1028324B1 (nl) |
| BR (1) | BR112022021727A2 (nl) |
| CA (1) | CA3179000C (nl) |
| IL (1) | IL298322B1 (nl) |
| WO (1) | WO2021233981A1 (nl) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114246285B (zh) * | 2021-12-22 | 2022-10-04 | 无锡江大百泰科技有限公司 | 微胶囊防腐剂及其制备方法和应用 |
| WO2023196236A2 (en) * | 2022-04-04 | 2023-10-12 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Adaptive patches for dynamic organs |
| WO2024113021A1 (en) * | 2022-12-02 | 2024-06-06 | Gelomics Pty Ltd | Modified gelatins, hydrogels, and processes for their production |
| WO2024137461A2 (en) * | 2022-12-19 | 2024-06-27 | Terasaki Institute For Biomedical Innovation | Aerogel compositions and methods |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009015440A1 (en) | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Aquatrek Pty Ltd | Liquid diverter |
| WO2016085345A1 (en) | 2014-11-26 | 2016-06-02 | Rousselot B.V. | Gelatin purification |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102099379B (zh) * | 2008-06-19 | 2013-12-11 | 本德尔分析控股有限公司 | 用于从生物聚合物材料中去除杂质的方法 |
| US10016506B2 (en) | 2014-04-17 | 2018-07-10 | Hitachi, Ltd. | Method for producing hydrogel, method for enveloping envelopment target, and method for releasing envelopment target |
| EP3413940A4 (en) | 2016-02-08 | 2020-07-15 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | BIOADHESIVE FOR CORNEAL REPAIR |
| GB201614053D0 (en) | 2016-08-17 | 2016-09-28 | Microarray Ltd | Determining the condition of a wound |
| CN107281550B (zh) * | 2017-06-22 | 2020-06-23 | 苏州大学 | 一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法 |
| JP7530886B2 (ja) | 2018-05-16 | 2024-08-08 | インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル） | 増殖性肝細胞を培養する方法 |
-
2020
- 2020-05-19 BE BE20205347A patent/BE1028324B1/nl active IP Right Grant
-
2021
- 2021-05-19 KR KR1020227044343A patent/KR102685654B1/ko active IP Right Grant
- 2021-05-19 BR BR112022021727A patent/BR112022021727A2/pt unknown
- 2021-05-19 CA CA3179000A patent/CA3179000C/en active Active
- 2021-05-19 WO PCT/EP2021/063257 patent/WO2021233981A1/en unknown
- 2021-05-19 CN CN202180033387.9A patent/CN115551924A/zh active Pending
- 2021-05-19 JP JP2022570316A patent/JP7523585B2/ja active Active
- 2021-05-19 US US17/917,774 patent/US20230133041A1/en active Pending
- 2021-05-19 IL IL298322A patent/IL298322B1/en unknown
- 2021-05-19 EP EP21724526.5A patent/EP4153662B1/en active Active
- 2021-05-19 AU AU2021274046A patent/AU2021274046B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009015440A1 (en) | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Aquatrek Pty Ltd | Liquid diverter |
| WO2016085345A1 (en) | 2014-11-26 | 2016-06-02 | Rousselot B.V. | Gelatin purification |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| BILLIET ET AL.: "Quantitative Contrasts in the Photopolymerization of Acrylamide en Methacrylamide-Functionalized Gelatine Hydrogel Building Blocks", MACROMOLECULAR BIOSCIENCE, vol. 13, 2013, pages 1531 - 45 |
| BURGER-KENTISCHER ET AL.: "A new cell-based innate immune receptor assay for the examination of receptor activity, ligand specificity, signaling pathways and the detection of pyrogens", J IMMUNOL METHODS, vol. 358, 2010, pages 93 - 103, XP055012870, DOI: 10.1016/j.jim.2010.03.020 |
| HABEEB, ANAL. BIOCHEM., vol. 14, 1996, pages 328 - 336 |
| HASIWA ET AL.: "Evidence for the detection of non-endotoxin pyrogens by the whole blood monocyte activation test", ALTEX, vol. 30, 2013, pages 169 - 208 |
| HOCH ET AL.: "Chemical tailoring of gelatine to adjust its chemical and physical properties for functional bioprinting", J. MATER. CHEM. B, vol. 1, 2012, pages 5675 |
| OLIJVE, JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE, vol. 243, 2000, pages 476 - 482 |
| VAN DEN BULCKE ET AL.: "Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels", BIOMACROMOLECULES, vol. 1, 2000, pages 31 - 38, XP055519827, DOI: 10.1021/bm990017d |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021233981A1 (en) | 2021-11-25 |
| IL298322B1 (en) | 2024-07-01 |
| BE1028324B1 (nl) | 2021-12-22 |
| BR112022021727A2 (pt) | 2022-12-06 |
| EP4153662B1 (en) | 2024-04-03 |
| AU2021274046B2 (en) | 2024-01-18 |
| KR20230013079A (ko) | 2023-01-26 |
| CA3179000C (en) | 2024-05-14 |
| IL298322A (en) | 2023-01-01 |
| US20230133041A1 (en) | 2023-05-04 |
| EP4153662A1 (en) | 2023-03-29 |
| CN115551924A (zh) | 2022-12-30 |
| JP7523585B2 (ja) | 2024-07-26 |
| KR102685654B1 (ko) | 2024-07-17 |
| AU2021274046A1 (en) | 2023-02-02 |
| JP2023526077A (ja) | 2023-06-20 |
| CA3179000A1 (en) | 2021-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BE1028324B1 (nl) | Ge(meth)acryleerd gelatine laag in endotoxines | |
| CN113372579B (zh) | 可注射大孔水凝胶 | |
| Reichl et al. | Keratin films for ocular surface reconstruction | |
| KR20110106440A (ko) | 생체의료 용도를 위한 생분해성 히드로겔의 제법 | |
| Nguyen et al. | Photocrosslinkable, biodegradable hydrogels with controlled cell adhesivity for prolonged siRNA delivery to hMSCs to enhance their osteogenic differentiation | |
| Raemdonck et al. | Dextran microgels for time‐controlled delivery of siRNA | |
| Vieira et al. | Fish sarcoplasmic proteins as a high value marine material for wound dressing applications | |
| US8877500B2 (en) | Thermally induced gelation of collagen hydrogel and method of thermally inducing gelling a collagen hydrogel | |
| Arndt et al. | Tuneable Recombinant Spider Silk Protein Hydrogels for Drug Release and 3D Cell Culture | |
| Sneha Letha et al. | In vitro and In vivo biocompatibility evaluation of freeze dried gelatin haemostat | |
| BE1029488B1 (nl) | Vernetbare gefunctionaliseerde gelatine met lage pyrogene activiteit | |
| KR102046263B1 (ko) | 내수성이 우수한 재생 단백질 섬유의 제조방법 | |
| CN112543791B (zh) | 基于双官能改性的生物聚合物的聚合物和能够由这种基于双官能改性的生物聚合物的聚合物获得的水凝胶 | |
| RU2715715C1 (ru) | Стерильный прозрачный концентрированный раствор биосовместимого коллагена, способ его получения и применения | |
| US20240217166A1 (en) | A bio-ink for 3d printing, related conjugate and preparation process of an intermediate consisting of a photoreactive linker | |
| CN117500885A (zh) | 具有低热原活性的可交联官能化的明胶 | |
| EA035414B1 (ru) | Комбинация, содержащая гликозаминогликаны и белки | |
| JP2019195347A (ja) | 血管新生促進材 | |
| US20230270679A1 (en) | Method for the production of biocompatible nanomaterials with selective recognition capabilities and uses thereof | |
| Keller et al. | Azido‐functionalized gelatin via direct conversion of lysine amino groups by diazo transfer as a building block for biofunctional hydrogels | |
| Tihauan et al. | Axinie (Bucos), M.; Marinas, IC; Nicoara, A | |
| CN116874892A (zh) | 一种水凝胶及其制备方法与应用 | |
| Gold | Multi-Growth Factor Releasing Hydrogel System Controlled by DNA Hybridization |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Effective date: 20211222 |