BE1029488B1 - Vernetbare gefunctionaliseerde gelatine met lage pyrogene activiteit - Google Patents
Vernetbare gefunctionaliseerde gelatine met lage pyrogene activiteit Download PDFInfo
- Publication number
- BE1029488B1 BE1029488B1 BE20225445A BE202205445A BE1029488B1 BE 1029488 B1 BE1029488 B1 BE 1029488B1 BE 20225445 A BE20225445 A BE 20225445A BE 202205445 A BE202205445 A BE 202205445A BE 1029488 B1 BE1029488 B1 BE 1029488B1
- Authority
- BE
- Belgium
- Prior art keywords
- gelatin
- group
- carboxylic acid
- preferably less
- unit
- Prior art date
Links
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 title claims abstract description 278
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 title claims abstract description 270
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 title claims abstract description 259
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 title claims abstract description 259
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 title claims abstract description 259
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 title description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 78
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims abstract description 67
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 55
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 44
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 13
- 150000001735 carboxylic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 43
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 38
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 37
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 23
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 22
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 19
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 8
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 8
- 125000003518 norbornenyl group Chemical group C12(C=CC(CC1)C2)* 0.000 claims description 8
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 7
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 5
- HRVGJQMCNYJEHM-UHFFFAOYSA-N 2-(5-bicyclo[2.2.1]hept-2-enyl)acetic acid Chemical compound C1C2C(CC(=O)O)CC1C=C2 HRVGJQMCNYJEHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 claims description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical group C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DPOPAJRDYZGTIR-UHFFFAOYSA-N Tetrazine Chemical group C1=CN=NN=N1 DPOPAJRDYZGTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920004892 Triton X-102 Polymers 0.000 claims description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 4
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 claims description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M acrylate group Chemical group C(C=C)(=O)[O-] NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 94
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 51
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 41
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 37
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 8
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- -1 methacryloyl Chemical group 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 6
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N tyramine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 5
- 125000003647 acryloyl group Chemical group O=C([*])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(4-hydroxyphenyl)propanoate Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 3
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 3
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100032814 ATP-dependent zinc metalloprotease YME1L1 Human genes 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000669402 Homo sapiens Toll-like receptor 7 Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800000795 Proadrenomedullin N-20 terminal peptide Proteins 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 2
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100039390 Toll-like receptor 7 Human genes 0.000 description 2
- 102100033117 Toll-like receptor 9 Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229960001171 acetohydroxamic acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 2
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- JUYQFRXNMVWASF-UHFFFAOYSA-M lithium;phenyl-(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate Chemical compound [Li+].CC1=CC(C)=CC(C)=C1C(=O)P([O-])(=O)C1=CC=CC=C1 JUYQFRXNMVWASF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N pamp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)C1=CC=CC=C1 PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052615 phyllosilicate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 229960003732 tyramine Drugs 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Chemical compound CC(C)(O)C(=O)C1=CC=C(OCCO)C=C1 GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTXPMECBRCEYCI-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-(4-nonylphenoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=C(OCCOCCOCCOCCO)C=C1 UTXPMECBRCEYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWHLVBVRNXHSAN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4-nonylphenoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 KWHLVBVRNXHSAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMLYCEVDHLAQEL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-methyl-1-phenylpropan-1-one Chemical compound CC(C)(O)C(=O)C1=CC=CC=C1 XMLYCEVDHLAQEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMAMWVWRXVQGOC-UHFFFAOYSA-N 3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O.OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 OMAMWVWRXVQGOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 1
- MXRGSJAOLKBZLU-UHFFFAOYSA-N 3-ethenylazepan-2-one Chemical compound C=CC1CCCCNC1=O MXRGSJAOLKBZLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYVYAPXYZVYDHN-UHFFFAOYSA-N 9,10-phenanthroquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 YYVYAPXYZVYDHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000763579 Homo sapiens Toll-like receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100027010 Toll-like receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- ZEDSKTISNTXEQI-UHFFFAOYSA-N [(2,6-dichlorobenzoyl)-(4-propylphenyl)phosphoryl]-(2,6-dichlorophenyl)methanone Chemical compound C1=CC(CCC)=CC=C1P(=O)(C(=O)C=1C(=CC=CC=1Cl)Cl)C(=O)C1=C(Cl)C=CC=C1Cl ZEDSKTISNTXEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BEUGBYXJXMVRFO-UHFFFAOYSA-N [4-(dimethylamino)phenyl]-phenylmethanone Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 BEUGBYXJXMVRFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000012431 aqueous reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- NWCHELUCVWSRRS-UHFFFAOYSA-N atrolactic acid Chemical compound OC(=O)C(O)(C)C1=CC=CC=C1 NWCHELUCVWSRRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229920006025 bioresin Polymers 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 125000006267 biphenyl group Chemical group 0.000 description 1
- VYHBFRJRBHMIQZ-UHFFFAOYSA-N bis[4-(diethylamino)phenyl]methanone Chemical compound C1=CC(N(CC)CC)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(N(CC)CC)C=C1 VYHBFRJRBHMIQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000008619 cell matrix interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- SNVTZAIYUGUKNI-UHFFFAOYSA-N dibenzo[1,2-a:1',2'-e][7]annulen-11-one Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2C(=O)C2=CC=CC=C21 SNVTZAIYUGUKNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L eosin Y Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C([O-])=C(Br)C=C21 SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 1
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 108091005434 innate immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- DAZSWUUAFHBCGE-KRWDZBQOSA-N n-[(2s)-3-methyl-1-oxo-1-pyrrolidin-1-ylbutan-2-yl]-3-phenylpropanamide Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCCC1)C(=O)CCC1=CC=CC=C1 DAZSWUUAFHBCGE-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920004921 nonoxynol-15 Polymers 0.000 description 1
- 229940073554 nonoxynol-30 Drugs 0.000 description 1
- 229940116391 nonoxynol-4 Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- AUONHKJOIZSQGR-UHFFFAOYSA-N oxophosphane Chemical compound P=O AUONHKJOIZSQGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N phenylbenzene Natural products C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007539 photo-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 102220143740 rs760001831 Human genes 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910021647 smectite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
- C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
- C08J3/075—Macromolecular gels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
- C08J2389/04—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair
- C08J2389/06—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair derived from leather or skin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Processes Of Treating Macromolecular Substances (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
De uitvinding heeft betrekking op een via een amidebinding gefunctionaliseerde gelatine met een gesubstitueerd verknoopbaar carbonzuurdeel R- (CH2) n-COOH waarin n een geheel getal is van 1 tot 10 en verder een lipopolysacharidegehalte heeft van minder dan 100 EU/g evenals een werkwijze voor de bereiding ervan met gebruikmaking van een N-hydroxysuccinimide-ester van het gesubstitueerde verknoopbare carbonzuur.
Description
-1- BE2022/5445 Titel: Vernetbare gefunctionaliseerde gelatine met lage pyrogene activiteit Veld van de uitvinding De aanvrage heeft in het algemeen betrekking op chemisch gefunctionaliseerde gelatine, in het bijzonder gelatine gefunctionaliseerd met een vernetbaar, gesubstitueerd carbonzuur. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op vernetbare, gesubstitueerde carbonzuur- gefunctionaliseerde gelatine met lage pyrogene activiteit, in het bijzonder een laag lipopolysacharidegehalte, hydrogels die vernetbare, gesubstitueerde carbonzuur- gefunctionaliseerde gelatine omvatten, een werkwijze voor het bereiden van vernetbare, gesubstitueerde carbonzuur-gefunctionaliseerde gelatine en toepassingen hiervan. Achtergrond van de uitvinding Reconstructie van functioneel biologisch weefsel, biologische implantaten, en cel-gebaseerde multi-orgaan modellen voor klinisch, diagnostisch of farmaceutisch onderzoek krijgen veel aandacht. Hydrogels zijn naar voren gekomen als vooraanstaande opties voor verscheidene weefselmanipulatietoepassingen door hun gelijkenis met de oorspronkelijke extracellulaire matrix.
Gelatine hydrogels zijn in het bijzonder aantrekkelijk dankzij hun biocompatibiliteit en bioafbreekbaarheid. Gelatine wordt vervaardigd door de gedeeltelijke hydrolyse van collageen, het meest voorkomende eiwit in het lichaam en het meest aanwezige molecuul van de extracellulaire matrix. De overvloedige aanwezigheid van de celherkenningssequentie arginine- glycine-asparaginezuur (RGD) faciliteert hechting van cellen aan gelatine wat hun verspreiding en deling bevorderd. Deze celmatrix-interacties zijn cruciaal voor de organisatie van complex weefsel. Dankzij de lange geschiedenis van gelatine als betrouwbare excipiëns binnen de farmaceutische industrie, voldoet het aan de hoogste veiligheidsstandaarden en regelnaleving. Bovendien maken hydroxylgroepen en carboxylaatgroepen, in de aanwezigheid van vrije aminogroepen, chemische modificatie mogelijk om gewenste eigenschappen voor specifieke toepassingen te verkrijgen.
Gelatinehydrogels worden vervaardigd door vernetting van gelatinepolymeren, ofwel zonder voorafgaande modificatie of na functionalisatie van hun zijgroepen. De toevoeging van gefunctionaliseerde groepen aan de gelatinehoofdketen is een vernettingstrategie met een hoge mate van controle over ontwerp en eigenschappen van de hydrogel. De meest gebruikte en bestudeerde modificatie voor het vernetten van gelatine is methacryloylering. MA- gemodificeerde gelatine wordt in het algemeen aangeduid als gelMA. Een alternatief voor de gerenommeerde methacryloyl-gelatine is acryloyl-gelatine (Billiet et al. 2013 “Quantitative
-2- BE2022/5445 Contrasts in the Photopolymerization of Acrylamide and Methacrylamide-Functionalized Gelatin Hydrogel Building Blocks” Macromolecular Bioscience 13:1531-45). Andere gefunctionaliseerde gelatinen zijn bijvoorbeeld tyramine-gefunctionaliseerde gelatinen (Wang et al, 2010, Biomaterials. 31(6):1148-57). Wang et al. beschrijft de functionalisering van gelatine door modificatie met een combinatie van 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuur (HPA), een overmaat N-hydroxysuccinimide (NHS) en 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide- hydrochloride ( EDC). WO2006/010066 openbaart modificatie van gelatine gebruikmakend van een carodiimide-gemedieerde koppeling van tyramine aan gelatine. Andere aanverwante publicaties zijn WO2020/050779, die hydrogels met aan te passen eigenschappen op basis van tyramine of op hydroxyfenylpropionzuur gebaseerde vernettingsmiddelen openbaart. De verbinding 3-(4-hydroxyfenyl)propaanzuur (HOCsH4(CHz2}2C02H)} word soms afgekort als HPA en is ook bekend als floretzuur of desaminotyrosine (soms afgekort ais DAT). Deze aanduidingen kunnen door elkaar gebruikt worden.
Elvin et al. 2010, Biomaterials. 31(6):8323-8331 beschrijft de creatie van een fotopolymeriseerbaar materiaal op gelatinebasis gebaseerd op het verhogen van het (tyrosine- achtige) gehalte van de koppelbare groep parahydroxylfenyl van de gelatine door koppeling van vrije aminen met 3-(4-hydroxyfenyl)propaanzuur. Het DAT-gehalte werd verhoogd door de gelatine met een Bolton-Hunter reagens (/V-succinimidyl-3-[4-hydroxyfenyl]propionaat) te laten reageren. Dit is een voorbeeld van een carbonzuur-gefunctionaliseerde gelatine.
Afhankelijk van de functionalisatiegraad en de polymeerconcentratie, kunnen de fysieke eigenschappen (vernettingsdichtheid, zwelling en stijfheid) van de hydrogels op gelatinebasis worden aangepast, hetgeen ervoor zorgt dat dit materiaal een veelzijdig platform is voor verscheidene weefselmanipulatietoepassingen. De vernetting kan op verschillende manieren geïnitieerd worden. Een van deze manier geschiedt door radicalen welke door UV of zichtbaar licht gecreëerd worden, afhankelijk van de gebruikte foto-initiator. Anderzijds via thiol-een- fotoclickchemie, thiol-Michael-additie, omgekeerde electron-demand Diels-Alder reactie, Diels- Alder clickreatie, disulfidebrug vorming, Schiff’s base, pi-pi cycloadditie, foto-oxidatie en/of enzymatische vernetting.
Een van de grootste nadelen van hydrogels op basis van gelatine voor (bio)medische toepassingen is de aanwezigheid van endotoxinen (hierin ook aangeduid als lipopolysachariden) in traditioneel vervaardigde gelatine. Endotoxinen zijn grote, zeer immunogene moleculen en de hoofdcomponent van het uitwendige membraan van Gram- negatieve bacteriën. Ze zijn zeer hittebestendig, waardoor ze moeilijk te inactiveren zijn. Endotoxinen initiëren een immuunrespons wanneer ze aan het immuunsysteem worden blootgesteld, wat tot ontsteking van weefsel, verhoogde gevoeligheid voor andere allergenen, en het risico op fatale shock kan leiden. Het meeste onderzoek wordt tegenwoordig uitgevoerd
-3- BE2022/5445 op vernette gefunctionaliseerde gelatinen dat gebaseerd is op gelatine met hoge endotoxineniveaus.
Traditioneel vervaardigde gelatine kan ook zijn besmet met andere componenten dan endotoxinen, waarvan sommige, zoals endotoxinen, in mensen een ongunstige immuunrespons kunnen veroorzaken. Niet-endotoxine pyrogenen zijn, bijvoorbeeld, verbindingen zoals lipoteichoïnezuur (LTA) afkomstig van Gram-positieve bacteriën, en andere verbindingen afkomstig van schimmels, gist, virussen, bacteriën, en parasieten (Hasiwa et al. (2013) “Evidence for the detection of nonendotoxin pyrogens by the whole blood monocyte activation test.” ALTEX 30:169-208). Deze niet-endotoxine pyrogenen, en bij voorkeur pyrogenen of Pathogeen-Gerelateerde Moleculaire Patronen (PAMPs) in het algemeen, zouden ook geminimaliseerd moeten worden voor (biomedische toepassingen van hydrogels op gelatinebasis om ongewenste bijwerkingen op het moment van activatie van lichaamseigen immuunreceptoren te voorkomen. Daarnaast worden, tijdens de functionalisatie en vernetting van gelatine tot gelatinehydrogel, een aantal reagentia gebruikt. Residuen van reagentia en reactieproducten kunnen in de gefunctionaliseerde gelatine aanwezig zijn. Bijvoorbeeld kunnen, op het moment van reageren van gelatine N-succinimidyl-3-[4-hydroxyfenyl]propionaat zoals beschreven door Elvin et al. (zie hierboven), hydrolyseproducten zoals 3-[4-hydroxy]propionzuur (HPA, floretzuur) en niet gereageerde reagentia zoals N-succinimidyl-3-[4-hydroxyfenyl]propionaat in de gefunctionaliseerde gelatinesamenstelling aanwezig zijn. Deze restanten worden als ongewenst aangemerkt. Andere op te lossen problemen met chemisch gemodificeerde gelatine zijn dat het chemische proces tot achteruitgang of hydrolyse van de gelatine (het verlagen van het Mw) of tot ongewenste vernetting (verhoogd molecuulgewicht) kan leiden. Het is daarvoor gewenst dat de chemische modificatie tot een gelatine leidt die voor en na functionalisatie ongeveer hetzelfde Mw heeft. Gebruikelijke procedures berusten op zuivering van het reactiemengsel door dialyse met behulp van gedistilleerd water. Doorgaans wordt dialyse gedurende een week uitgevoerd. Deze tijdverslindende stap is daarom niet efficiënt bij grootschalige productie van gefunctionaliseerde gelatinen. Bovendien vergroot, gedurende deze week van dialyse, het risico op microbiële contaminatie en gelatine-afbraak. Voor (bio)medische toepassingen van hydrogels op gelatinebasis, bestaat de behoefte voor biocompatibele gefunctionaliseerde gelatinen (bijv. niet- toxisch voor biologisch weefsel en niet-immunogeen), wat aanpassing van hydrogels met gewenste mechanische eigenschappen (bijvoorbeeld, sterkte en elasticiteit) toelaat. Er bestaat ook een behoefte aan de vervaardiging van dergelijke gelatinen door een efficiënt proces dat productie op industriële schaal mogelijk maakt. Beschrijving van de uitvinding
-4- BE2022/5445 De onderhavige uitvinding lost één of meer van de hierboven beschreven problemen in de stand van de techniek op. In het bijzonder wordt carbonzuur-gemodificeerde gelatine (gemodificeerde gelatine die primaire aminen omvat die met een gesubstitueerd carbonzuur zijn gefunctionaliseerd) verschaft die een laag pyrogeengehalte heeft, in het bijzonder een laag endotoxinegehalte, en lage vervuiling met reagentia, bijproducten en hydrolyseproducten. De carbonzuur-gefunctionaliseerde gelatine heeft verbeterde biocompatibiliteit dankzij het lage pyrogeengehalte, in het bijzonder het lage endotoxinegehalte. De carbonzuur- gefunctionaliseerde gelatine van de onderhavige uitvinding is in het bijzonder bruikbaar voor vernetting dankzij de lage vervuiling met reactanten, waarvan bekend is dat ze het vernettingsproces verstoren. Ook voordelig is dat de carbonzuur-gefunctionaliseerde gelatine door een eenvoudig productieproces dat geen langdurige dialysestap vereist kan worden bereid. De onderhavige uitvinding wordt in het bijzonder beschreven door één of een combinatie van één of meer van de hieronder genummerde kenmerken en uitvoeringsvormen (i) tot (xv), waarbij: (1) Gelatine gefunctionaliseerd via een amidebinding met een carbonzuurgroep R-(CHz)n-COOH waarbij n een geheel getal is van 1 tot 10 en verder een lipopolysacharidegehalte van minder dan 100 EU/g heeft. 100 EU/g, bij voorkeur minder dan 50 EU/g, liever minder dan 20 EU/g, met meer voorkeur minder dan 10 EU/g, met meer voorkeur minder dan 5 EU/g, met meer voorkeur minder dan 2 EU/g, met de meeste voorkeur minder dan 1 EU/g.
(il) Gelatine volgens (i), omvattende minder dan 100 ppm reactanten en reagentia, bij voorkeur vrij, gesubstitueerd, carbonzuur.
(iii) Gelatine volgens (1) of (ij), met een laag gehalte pyrogenen van Gram+ bacteriën, pyrogenen van bacteriën met flagellen, enkelstrengs viraal RNA en bacterieel DNA rijk in niet- gemethyleerde CpG-motieven, bij voorkeur een laag gehalte pyrogenen van Gram+ bacteriën en van bacteriën met flagellen, met meer voorkeur een laag gehalte pyrogenen van Gram+ bacteriën.
(iv) Gelatine volgens één van (1) tot (iii), waarbij de genoemde gelatine type A gelatine is. (v) Gelatine volgens één van (i) tot (iv), met een carbonzuursubstitutiegraad tussen 5% en 100%, bij voorkeur tussen 25% en 100%, met meer voorkeur tussen 50 en 100%, met nog meer voorkeur tussen 80% en 100%.
(vi) Gelatine volgens één van (1) tot (v), waarbij de genoemde gelatine verder gemodificeerd is met een (meth)acryloylgroep of gedeelte, een acetylgroep of gedeelte, een fenolgroep of gedeelte, een thiolgroep of gedeelte, een norborneengroep of gedeelte, een tetrazinegroep of gedeelte, een azidegroep of gedeelte, een furaangroep of gedeelte, een allylgroep of gedeelte, een maleimidegroep of gedeelte of een combinatie daarvan.
(vi) Hydrogel omvattende een met een carbonzuur gemodificeerde gelatine volgens één van (i) tot (vi), en een vernettingsmiddel.
-5- BE2022/5445 (vii) Een film die een hydrogel volgens (vii) of een gelatine volgens één van (i) tot (vi) omvat. (ix) Werkwijze voor het verschaffen van een gefunctionaliseerde gelatine volgens één van (i) tot (vi), waarbij de werkwijze de stappen omvat van a. het modificeren van gelatine door gelatine te laten reageren met een reagens die een N-hydroxysuccinimide-ester van de carbonzuurgroep R-(CH2),-COOH bevat waarbij n een geheel getal van 1 tot 10 is (bij voorkeur R-(CHz)n-COO-NHS) in een reactiemedium; b. het verlagen van de pH van het reactiemedium zodat deze een waarde tussen 2,0 en 4,0 heeft, bij voorkeur tussen 2,5 en 3,5, met meer voorkeur tussen 3,0 en 3,5; c. het toevoegen van 0,01 — 1,5 ww% van een micel-vormende oppervlakte-actieve stof aan het zure reactiemedium; d. het in contact brengen van het micel-bevattende medium met een adsorptiemiddel, bij voorkeur een vast adsorptiemiddel, bij voorkeur actieve koolstof. e. het scheiden van het adsorptiemiddel van het medium; f. het terugwinnen van het medium dat de gefunctionaliseerde gelatine omvat. (x) De werkwijze volgens (ix), waarbij de genoemde micel-vormende oppervlakte-actieve stof een niet-ionische oppervlakte-actieve stof omvat, bij voorkeur waarbij de oppervlakte-actieve stof Triton X-100 of Triton X-102, of mengsels daarvan is. (xi) De werkwijze volgens (ix) of (x), waarbij het genoemde vaste adsorptiemiddel een hydrofoob adsorptiemiddel is, bij voorkeur actieve koolstof. (xii) De werkwijze volgens één van (ix) tot (xi), verder omvattend een stap van het drogen van het medium dat de carbonzuur-gemodificeerde gelatine omvat. (xii) Gelatine volgens één van (1) tot (vi) of een hydrogel volgens (vii) voor gebruik in de geneeskunde. (xiv) In vitro of ex vivo gebruik van gelatine volgens één van (i) tot (vi) of een hydrogel volgens (vit) voor het vervaardigen van een biologische constructie zoals een weefsel of een orgaan, of een deel daarvan, een coating, een stellage, of een gecontroleerde afgifte doseringsvorm. (xv) Gebruik van gelatine volgens één van (i) tot (vi) of een hydrogel volgens (vii) als een bioinkt of biohars.
Korte figuurbeschrijving Fig 1 Grafische weergave van de zuivering van 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuur-gemodificeerde gelatine door van dialyse gebruik te maken wat na dialyse tot een verlaging van 98% bij T=5 leidt.
-6- BE2022/5445 Fig 2 Grafische weergave van de zuivering van 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuur-gemodificeerde gelatine door van micelvorming, absorptie en filtratie gebruik te maken. Fig 3 Voor de AC-filtratiemonsters gedetecteerd HPLC-signaal. PA wordt niet gedetecteerd. Fig. 4a MW-verdeling voor de uitgangsgelatine (1) en de resultaten van een modificatie via een route met een in situ mengsel van NHS, HPA en EDC gevolgd door zuivering met behulp van éénstapsdialyse (2) en tweestapsdialyse ( 3). Fig. 4B MW-verdeling voor dezelfde uitgangsgelatine (1) en de resultaten van een modificatie via een route met behulp van een NHS-HPA in essentiële afwezigheid van EDC, gevolgd door zuivering met behulp van een tweestapszuivering op basis van micelvorming.
Gedetailleerde beschrijving Tenzij anders aangeduid hebben alle begrippen die zijn gebruikt bij de openbaarmaking van de uitvinding, waaronder technische en wetenschappelijke begrippen, dezelfde betekenis als in het algemeen begrepen door de vakman in wiens veld deze uitvinding ligt. Voor een beter begrip zijn definities van begrippen opgenomen om de leer van de onderhavige uitvinding beter tot zijn recht te laten komen. De enkelvoud-vormen “een”, “de”, en “het” behelzen zowel enkelvoudige als meervoudige verwijzingen tenzij de context duidelijk anders aangeeft. De termen “omvat”, “omvatten” en “samengesteld uit” zoals hierin gebruikt zijn synoniem met “waaronder”, “inclusief” of “bevat”, “bevatten” en zijn inclusief of open en sluiten geen aanvullende, niet genoemde groepen, elementen of werkwijzestappen uit. Waar wordt verwezen naar uitvoeringsvormen als omvattende bepaalde elementen of stappen, behelst dit ook uitvoeringsvormen die hoofdzakelijk uit de genoemde elementen of stappen bestaan. Het door eindpunten noemen van numerieke bereiken behelst alle nummers en fracties die in de betreffende bereiken zijn opgenomen, alsmede de genoemde eindpunten. Het is de bedoeling dat het begrip “ongeveer” zoals hierin gebruikt wanneer naar een meetbare waarde zoals een parameter, een hoeveelheid, een tijdsduur, en dergelijke wordt verwezen variaties van +/-10% of minder, bij voorkeur +/-5% of minder, met meer voorkeur +/-1% of minder, en met nog meer voorkeur +/-0,1% of minder vanaf de gespecificeerde waarde omvat, in zoverre dergelijke variaties geschikt zijn om de geopenbaarde uitvinding uit te voeren. Met dien verstande dat de waarde waar de modificator “ongeveer” naar verwijst zelf ook specifiek, en bij voorkeur, is geopenbaard. Alle in de onderhavige specificatie geciteerde documenten zijn hierbij door middel van verwijzing in hun geheel opgenomen. De onderhavige aanvrage heeft in het algemeen betrekking op gefunctionaliseerde gelatine voor het vernetten van gelatine om hydrogels en films op gelatinebasis te bereiden. In het bijzonder heeft de aanvrage betrekking op carbonzuur-gefunctionaliseerde gelatine. Gelatine is een mengsel van wateroplosbare eiwitten afkomstig van collageen. Gelatine wordt bijv. verkregen door gedeeltelijke hydrolyse van collageen, verkregen door waterige extractie
-7- BE2022/5445 van huid, pezen, gewrichtsbanden, botten, etc., van bijv. rund, varken, gevogelte of vis, in zure of basische omstandigheden, of door enzymatische hydrolyse, zoals in de stand van de techniek bekend is. Gelatine die door zuurbehandeling is verkregen wordt “type A gelatine” genoemd, terwijl “type B gelatine” afkomstig is van een proces op alkalibasis. Als gevolg van uitgebreidere deaminatie van asparagine en glutamine in type B gelatine liggen de iso- elektrische punten (IEP) van type A gelatine en type B gelatine respectievelijk bij pH 7,0-9,0 en pH 4,9-5,1, wat het mogelijk maakt dat ze positief en negatief geladen zijn bij neutrale fysiologische pH. In voorkeursuitvoeringsvormen heeft de uitvinding betrekking op type A gelatine.
Gelatine vormt niet een gelijkmatig eiwitmolecuul, maar omvat een variabele hoeveelheid eiwitmoleculen met een variabele lengte. Bij voorkeur heeft de hierin gebruikte gelatine een gemiddeld molecuulgewicht binnen het bereik van 1500 Da tot 300 kDa, bij voorkeur tussen 2000 Da en 300 kDa, tussen 4000 Da en 300 kDa, tussen 5000 Da en 300 kDa, tussen 10 kDa en 300 kDa, of tussen 20 kDa en 300 kDa, met meer voorkeur tussen 50 kDa en 300 kDa, met de meeste voorkeur tussen 100 kDa en 300 kDa, zoals tussen 100 kDa en 275 kDa of tussen 100 kDa en 250 kDa. De molecuulgewichtsverdeling van gelatine wordt gebruikelijk gemeten door grootte-uitsluiting high performance liquid chromatography (HPLC) technieken, waarbij geëlueerde fracties door UV-adsorptie worden gedetecteerd en waarbij de gemeten data door geschikte software worden geëvalueerd, allemaal technieken die in de stand van de techniek bekend zijn, zie bijv. Olijve et.al. (2000. Journal of Colloid and Interface Science 243: 476-482). Zoals hierin gebruikt omvat het begrip “gelatine” ook “gelatinederivaten”, waaronder chemisch gemodificeerde gelatine. De uitdrukking “gelatine gemodificeerd met een chemische groep of gedeelte (bijv. een carbonzuurgroep of gedeelte, een tyraminegroep of gedeelte, een methacryloylgroep of gedeelte, een acryloylgroep of gedeelte, een acetylgroep of gedeelte, een fenolgroep of gedeelte, etc.)” zoals hierin wordt gebruikt duidt gelatine aan die de genoemde chemische groep of gedeelte (bijv. een carbonzuurgroep, een tyraminegroep of gedeelte, een methacryloylgroep of een acryloylgroep, een acetylgroep of gedeelte, een fenolgroep of gedeelte, etc.) omvat bijv. verbonden aan ten minste één aminegroep, ten minste één hydroxylgroep, ten minste één carboxylgroep en/of ten minste één fenolgroep van de gelatine.
Zoals hierin gebruikt is “gelatine gemodificeerd met een carbonzuurgroep”, of “gelatine gemodificeerd met een vernetbare, gesubstitueerde carbonzuurgroep”, hierin ook aangeduid als “carbonzuur-gemodificeerde gelatine”, “carbonzuur-gesubstitueerde gelatine” of “carbonzuurgelatine” of “gelatinecarbonzuur’ gedefinieerd als gelatine die vrije aminen heeft die met ten minste één carbonzuurgroep zijn gesubstitueerd, bij voorkeur via een amidebinding.
Gelatine omvat aminozuren, waarvan sommige zijketens hebben die eindstandige aminen (bijv. lysine, arginine, asparagine, glutamine) bevatten of hydroxylen (bijv. serine, threonine, asparaginezuur, glutaminezuur, tyrosine, hydroxyproline). Bovendien bevat gelatine ook N-
-8- BE2022/5445 eindstandige aminen. Al deze eindstandige aminen kunnen met carbonzuurgroepen gesubstitueerd worden om gefunctionaliseerde gelatine te produceren die carbonzuurgroepen omvat. De substitutie van N-eindstandige aminen met carbonzuren om een amidebinding te vormen heeft de voorkeur.
Het carbonzuur dat in de functionalisatie van de gelatine van de onderhavige uitvinding wordt gebruikt is een carbonzuur met de formule R-(CHz)n-COOH waarbij n een geheel getal van 1 tot is.
In uitvoeringsvormen is in het carbonzuur, dat bij de functionalisatie van de gelatine is gebruikt, R gekozen uit de groep bestaande uit 4-fenol, norbornenyl of SH. In uitvoeringsvormen, waarbij 10 n1tot 5, bij voorkeur 2 of 3 is. In voorkeursuitvoeringsvormen, in het voor de functionalisatie van de gelatine gebruikte carbonzuur, is de carbonzuurgroep één of meer van 3-(4- hydroxyfenyl)-propionzuur, 3-(SH)-propionzuur, en 2-(5-norbornenyl)-azijnzuur, bij voorkeur 3- (4-hydroxyfenyl)-propionzuur.
De “functionalisatiegraad (DoF)” van gelatine verwijst in het algemeen naar het percentage gefunctionaliseerde primaire aminegroepen ten opzichte van het totaal aan primaire aminegroepen. Zoals hierin gebruikt, verwijst de “carbonzuursubstitutiegraad” naar het percentage vrije aminegroepen in de gelatine die met een carbonzuurgroep zijn gesubstitueerd. De functionalisatiegraad zoals de carbonzuursubstitutiegraad van gelatine kan door op zichzelf bekende methoden worden bepaald.
De Fe(Il!)-acetohydroxamzuurmethode kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor het bepalen van substitutie op hydroxylgroepen. De Habeeb-methode (op trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) gebaseerde spectrofotometrische bepaling van (meth)acrylamide; Habeeb 1996. Anal. Biochem. 14:328-336), 1H-NMR en de fluoraldehyde-assay (ook bekend als op o- ftaaldialdehyde (OPA) gebaseerde fluorometrische bepaling van vrije aminen kan worden gebruikt voor het bepalen van carbonzuursubstitutie bij aminegroepen. Men kan ook een combinatie van de bovengenoemde methoden gebruiken, zoals een combinatie van een fluoraldehyde-assay voor het kwantificeren van aminegroepomzetting en een Fe(Ill)- acetohydroxamzuur-methode voor het kwantificeren van hydroxylgroepen. In uitvoeringsvormen wordt de fluoraldehyde-assay gebruikt voor het bepalen van de mate van carbonzuursubstitutie door bepaling van de vrije aminen.
In de hierin beschreven carbonzuur-gefunctionaliseerde gelatine vindt de carbonzuur- functionalisatie bij voorkeur plaats bij de vrije aminegroepen. In uitvoeringsvormen heeft de met carbonzuur gefunctionaliseerde gelatine een mate van carbonzuursubstitutie tussen 20% en 100%, bij voorkeur tussen 50% en 100%, met meer voorkeur tussen 80% en 100% zoals tussen 85% en 100%, tussen 90% en 100% of tussen 95% en 100%. In uitvoeringsvormen heeft de met carbonzuur gefunctionaliseerde gelatine een mate van carbonzuursubstitutie van minder
-9- BE2022/5445 dan 20%, bij voorkeur minder dan 10%, 9%, 8%, 7% of 6%, met meer voorkeur minder dan 5%, 4% , 3%, 2% of 1%.
De hierin beschreven met carbonzuur-gefunctionaliseerde gelatine kan verder worden gemodificeerd en/of gefunctionaliseerd. In uitvoeringsvormen wordt de carbonzuur-gelatine verder gemodificeerd met een (meth)acryloylgroep of -eenheid, een acetylgroep of -eenheid, een fenolgroep of -eenheid, een thiolgroep of -eenheid, een norborneengroep of -eenheid, een tetrazinegroep of eenheid, een azidegroep of eenheid, een furaangroep of eenheid, een allylgroep of eenheid, een maleïmidegroep of eenheid of een combinatie daarvan, bij voorkeur een acetylgroep. Dubbel chemisch gefunctionaliseerde gelatine kan worden geproduceerd zoals beschreven in Hoch et al. (2012. Chemical tailoring of gelatin to adjust its chemical and physical properties for functional bioprinting. J. Mater. Chem. B 1:5675).
De hierin beschreven carbonzuurgelatine heeft een lage pyrogene activiteit. Pyrogene activiteit kan worden gemeten met behulp van een monocyt-activatietest (MAT)-assay zoals bekend in de stand van de techniek. Het MAT-assay maakt het mogelijk om zowel endotoxine- als niet- endotoxine-pyrogeenniveaus te kwantificeren, maar maakt geen onderscheid tussen het type PAMP-besmetting. Een op cellen gebaseerde pyrogeendetectietest (PAMP-test) is ontwikkeld door het Fraunhofer Institute for Interfacial Engineering and Biotechnology |GB voor detectie en kwantificering van verschillende PAMP's, ook niet-endotoxinen. Dit cel-gebaseerde testsysteem detecteert PAMP's met behulp van menselijke Toll-achtige receptoren (TLR's) (Burger- Kentischer et al. (2010 A new cell-based innate immune receptor assay for the examination of receptor activity, ligand specificity, signaling pathways and the detection of pyrogens. J Immunol Methods, 358: 93-103). Meer in het bijzonder brengen cellen, b.v. NIH3T3-cellen, verschillende TLR-combinaties tot expressie, waardoor verschillende PAMP's kunnen worden gedetecteerd. Cellijnen met de receptorcombinatie TLR1/2, TLR2/6, TLR4/CD14, TLR5, TLR7 en TLR9 maken bijvoorbeeld de detectie mogelijk van pyrogenen van Gram+ bacteriën (TLR1/2, TLR2/6), pyrogenen van bacteriën met flagellen ( TLR5), enkelstrengs viraal RNA (TLR7), de cellijn TLR4/CD14 maakt de detectie van endotoxine van Gram- bacteriën mogelijk en de TLR9- cellijn detecteert bacterieel DNA dat rijk is aan niet-gemethyleerde CpG-motieven. In uitvoeringsvormen hebben de hierin beschreven HPA-gelatinen een laag gehalte aan pyrogenen van Gram+ bacteriën, pyrogenen van bacteriën met flagellen, enkelstrengs viraal RNA, endotoxine van Gram- bacteriën en bacterieel DNA dat rijk is aan niet-gemethyleerde CpG-motieven.
In bepaalde uitvoeringsvormen heeft het carbonzuur-gelatine een laag gehalte aan pyrogenen van Gram+ bacteriën en van bacteriën met flagellen, meer in het bijzonder een laag gehalte aan pyrogenen van Gram+ bacteriën. In bepaalde uitvoeringsvormen wordt het carbonzuur-gelatine dat hierin wordt geopenbaard gekenmerkt door een laag gehalte aan endotoxine of lipopolysacharide (LPS), in het bijzonder een gehalte aan LPS van minder dan 100 EU/g, met
- 10 -
BE2022/5445 meer voorkeur minder dan 50 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 20 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 10 EU/ g, met nog meer voorkeur minder dan 5 EU/g, met nog meer voorkeur 5 minder dan 2 EU/g, met de meeste voorkeur minder dan 1 EU/g.
In verdere specifieke uitvoeringsvormen is de hierin beschreven carbonzuur-gelatine (afgeleid van) een type A gelatine en is gekenmerkt door een LPS-gehalte van minder dan 100 EU/g, met meer voorkeur minder dan 50 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 20 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 10 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 5 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 2 EU/g, met de meeste voorkeur minder dan 1 EU/g.
In andere verdere specifieke uitvoeringsvormen is de hierin beschreven carbonzuur-gelatine (afgeleid van) een type B gelatine en is gekenmerkt door een LPS-gehalte van minder dan minder dan 20 EU/g, bij voorkeur minder dan 10 EU/g, meer bij voorkeur minder dan 5 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 2 EU/g, met de meeste voorkeur minder dan 1 EU/g.
De term EU is in de techniek bekend en staat voor 'endotoxine-eenheden'. Eén EU is ongeveer gelijk aan 100 pg E. coli lipopolysacharide, de hoeveelheid die aanwezig is in ongeveer 104-105 bacteriën.
Hierin staat de term EU/g de EU-hoeveelheid per droog gewicht van carbonzuur-gefunctionaliseerde gelatine.
Het Limulus-assay (LAL) is een bekende bioassay in de stand van de techniek om tot subpicogram-hoeveelheden LPS te meten.
Limulus-amoebocytlysaat (LAL) is een waterig extract van bloedcellen (amoebocyten) van de degenkrab, Limulus polyphemus.
LAL reageert met bacterieel endotoxine of lipopolysaccharide.
Deze reactie staat aan de basis van de LAL- test, die vervolgens wordt gebruikt voor de detectie en kwantificering van bacteriële endotoxinen.
Een geschikte LAL-methode om de LPS-niveaus te kwantificeren is bijvoorbeeld de chromogene Endosafe-methode, b.v. van Charles River USA.
Andere geaccepteerde en aanbevolen methoden zijn de EndoZyme recombinant factor C methode van Hyglos GmbH (Duitsland). Beide genoemde methoden resulteren in vergelijkbare of identieke meetwaarden en kunnen daarom door elkaar worden gebruikt.
Ook voordelig is dat de hierin beschreven carbonzuur-gelatine nagenoeg vrij van reagentia en reactieproducten is.
In uitvoeringsvormen omvat de hierin beschreven carbonzuur-gelatine een laag gehalte aan vrij carbonzuur, dwz carbonzuur dat niet aan gelatine gebonden is, van minder dan 150 ppm carbonzuur of minder dan 100 ppm carbonzuur of minder dan 50 ppm carbonzuur bij voorkeur minder dan 30 ppm carbonzuur, met meer voorkeur minder dan 25 ppm carbonzuur, met nog meer voorkeur minder dan 20 ppm carbonzuur.
In uitvoeringsvormen omvat het hierin beschreven carbonzuur-gelatine minder dan 150 ppm carbonzuur, zoals minder dan 140 ppm carbonzuur, minder dan 130 ppm carbonzuur, minder dan 120 ppm carbonzuur of minder dan 110 ppm carbonzuur, bij voorkeur minder dan 100 ppm carbonzuur zoals minder dan 90 ppm carbonzuur, minder dan 80 ppm carbonzuur, minder dan 70 ppm of minder dan 60 ppm, waarbij bij voorkeur het carbonzuurgehalte wordt bepaald in een monster van de opgeloste carbonzuur-gelatine in 50 mM fosfaatbuffer, pH 9,5. Carbonzuur kan worden
- 11 - BE2022/5445 gemeten zoals beschreven in de voorbeelden, in het bijzonder door een monster van de carbonzuur-gelatine op te lossen in water of in 50 mM fosfaatbuffer, pH 9,5, ultrafiltratie van het opgeloste monster (bijv. met behulp van 10-kDa Amicon Ultracentrifugale filters) en HPLC- analyse van het filtraat. Residuen van carbonzuur in de met carbonzuur gefunctionaliseerde gelatine kunnen interfereren met de vernetting van carbonzuur-gefunctionaliseerde gelatinemoleculen. Vanwege het lage carbonzuurgehalte is de hierin beschreven carbonzuur- gefunctionaliseerde gelatine dus bijzonder geschikt voor vernetting om een hydrogel of een film te vormen. Dienovereenkomstig heeft een ander aspect betrekking op een hydrogel die vernette carbonzuur-gelatine of hierin geopenbaarde vernette carbonzuur-gelatine omvat. Verder zijn hierin producten geopenbaard die zijn afgeleid van de genoemde hydrogels, zoals films, bioadhesieven, enz. De term "hydrogel" zoals hierin gebruikt verwijst naar een netwerk van hydrofiele polymeerketens, zoals vernet carbonzuur-gelatine, die een gel vormen. De term "gel" duidt een in hoofdzaak verdund vernet systeem aan dat geen stroming vertoont in de stabiele toestand.
Werkwijzen voor het vernetten van carbonzuur-gelatine zijn algemeen bekend in de stand van de techniek. Doorgaans kunnen bij blootstelling aan licht in aanwezigheid van een foto-initiator de carbonzuurgroepen op één gelatinemolecuul reageren met de carbonzuurgroepen op een ander gelatinemolecuul om de carbonzuur-gelatine te vernetten.
De zoals hierin gebruikte term "foto-initiator" verwijst naar een chemische verbinding, of een mengsel van verbindingen, die ontleedt in vrije radicalen bij blootstelling aan licht, b.v. ultraviolet licht (UV) of zichtbaar licht (VIS). Niet-beperkende voorbeelden van ultraviolette foto-initiatoren omvatten 1-[4-(2-hydroxyethoxy)-fenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propan-1-on (ook bekend onder de handelsnaam Irgacure® 2959) en lithium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP). Zichtbaar licht foto-initiatoren produceren vrije radicalen bij blootstelling aan zichtbaar licht.
Voorbeeldbereiken van zichtbaar licht die bruikbaar zijn voor het exciteren van een foto-initiator van zichtbaar licht omvatten groen, blauw, indigo en violet. Bij voorkeur heeft het zichtbare licht een golflengte in het bereik van 450-550 nm. Niet-beperkende voorbeelden van zichtbaar licht foto-initiatoren omvatten Eosine Y, riboflavine/triethanolamine, vinylcaprolactam, dI-2,3-diketo- 1,7,7-trimethylnorcamfaan (CQ), 1-fenyl-1,2-propadion (PPD ), 2,4,8-trimethylbenzoyl- difenylfosfineoxide (TPO), bis(2,6-dichloorbenzoyl)-(4-propylfenyl)fosfineoxide (Ir819), 4,4"- bis(dimethylamino)benzofenon, 4,4 '- bis(diethylamino)benzofenon, 2-chloorthioxanthen-9-0n, 4-(dimethylamino)benzofenon, fenantreenchinon, ferroceen, difenyl 1(2,4,6 trimethylbenzoyl)fosfineoxide / 2-hydroxy-2-methylpropiofenon (50/ 50-mengsel), dibenzosuberenon, (benzeen)tricarbonylchroom, resazurin, resorufine, 5- benzoyltrimethylgermane (lvocerin®), derivaten daarvan en combinaties daarvan.
De bestralingstijd met licht kan elke geschikte tijd zijn om vernetting van het polymeer mogelijk te maken. De bestralingstijd kan bijvoorbeeld variëren van 10 seconden tot 20 minuten, bij
-12- BE2022/5445 voorkeur van 1 minuut tot 20 minuten, met meer voorkeur van 2-15 minuten (bijvoorbeeld 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 of 15 minuten).
De mechanische eigenschappen van een op gelatine gebaseerde hydrogel kunnen worden afgestemd op verschillende toepassingen, bijv. door het molecuulgewicht van de gebruikte gelatine, door de mate van HPA-substitutie, carbonzuur-gelatineconcentratie, hoeveelheid foto- initiators en blootstelling aan licht te veranderen .
Zoals hierin gebruikt, wordt de concentratie van carbonzuur-gesubstitueerde gelatine gedefinieerd als het gewicht van carbonzuur-gesubstitueerde gelatine gedeeld door het volume van het oplosmiddel (w/v), uitgedrukt als een percentage. Het oplosmiddel kan een farmaceutisch aanvaardbare drager zijn. In uitvoeringsvormen van de hydrogel is de carbonzuur-gesubstitueerde gelatine aanwezig in een concentratie tussen 5% en 25% (w/v), tussen 17% en 25% (w/v), tussen 17% en 23% (w/v), of ongeveer 20% (w/v). In sommige uitvoeringsvormen is de carbonzuur-gesubstitueerde gelatine aanwezig in een concentratie tussen 5% en 15% (w/v), tussen 8% en 12% (w/v), of ongeveer 10% (w/v). In sommige uitvoeringsvormen is de carbonzuur-gesubstitueerde gelatine aanwezig in een concentratie tussen 10% en 40% (w/v), 15% en 35% (w/v), 20% en 30% (w/v), of ongeveer 5%, 10%, 15%, 20% of 25% (w/v).
De chemisch gemodificeerde gelatine, in het bijzonder de carbonzuurgelatine, en de hydrogel volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder, maar niet beperkt tot, de vervaardiging of reparatie van weefsel (bijv. kraakbeen, zacht weefsel ) in een menselijk of niet-menselijk dier, en het gebruik als bio-inkt of bio-hars voor de 3-dimensionale biofabricage of 3-dimensionale bioprinting van een biologisch construct. Het biologische construct kan elk dierlijk weefsel of orgaan zijn, of een deel daarvan, dat kan worden vervaardigd met behulp van een biofabricage- of bioprinttechniek, b.v. een stellage die cellen bevat die poreus of niet-poreus kunnen zijn.
De term "bio-inkt" verwijst naar een hydrogel die 3D kan worden geprint, 3D geplot of in een bepaalde vorm of constructie kan worden gefabriceerd, en die cytocompatibel is. De hydrogel kan al dan niet levende cellen en/of groeifactoren, enz. bevatten. De term "bio-hars" verwijst naar een hydrogel die 3D kan worden geprint of gefabriceerd in een bepaalde vorm of constructie met behulp van op laser- of op lichtprojectie gebaseerde lichtstereolithografie, of soortgelijke lithografische technieken, en die cytocompatibel is. De hydrogel kan al dan niet levende cellen, medicijnen en/of groeifactoren, enz. bevatten.
Een gerelateerd aspect is gericht op /n vitro of ex vivo gebruik van een hierin beschreven carbonzuur-gelatine of een hydrogel die de hierin beschreven carbonzuur-gelatine omvat voor het vervaardigen van een weefsel of een orgaan, of een deel daarvan. In uitvoeringsvormen wordt het weefsel of orgaan gekozen uit botweefsel, kraakbeen en vaatweefsel. Ook hierin geopenbaard is een weefsel-gemanipuleerd weefsel of orgaan, of een deel daarvan,
- 13 - BE2022/5445 omvattende een hierin geopenbaarde carbonzuur-gelatine of een hydrogel die de hierin geopenbaarde carbonzuur-gelatine omvat.
Een ander aspect is gericht op in vitro of ex vivo gebruik van een hierin geopenbaarde carbonzuur-gelatine of een hydrogel die de hierin geopenbaarde carbonzuur-gelatine omvat voor de vervaardiging van een doseringsvorm met gecontroleerde afgifte of een biologisch construct. Het biologische construct kan bijvoorbeeld een coating op een (vaste) drager zijn die geschikt is voor adhesie en proliferatie van cellen, of een stellage die geschikt is om cellen, of medicijnen en/of vectoren te bevatten.
Nog een ander aspect heeft betrekking op toepassingen van een hierin geopenbaarde carbonzuur-gelatine of een hydrogel die de hierin geopenbaarde carbonzuur-gelatine omvat als een bio-inkt of bio-hars.
In verdere uitvoeringsvormen wordt de bio-inkt of bio-hars gebruikt voor 3-dimensionale biofabricage of 3-dimensionale bioprinting van een biologisch construct. Het biologische construct kan een dierlijk weefsel of orgaan zijn, of een deel daarvan. Het biologische construct kan ook een stellage zijn die geschikt is om cellen te bevatten, of een stellage die geschikt is om bijv. geneesmiddelen en/of vectoren (bijv. voor geneesmiddelafgifte/gentherapietoepassingen) te bevatten. Het biologische construct kan ook een bioresorbeerbare schroef of ander biomateriaal (bijvoorbeeld biokleefmiddel) zijn. In uitvoeringsvormen is het biologische construct een stellage die geschikt is om cellen te bevatten. In uitvoeringsvormen is het biologische construct een coating. Ook hierin geopenbaard is een biologisch construct dat de hierin beschreven carbonzuur-gelatine omvat of een hydrogel die de hierin beschreven carbonzuur-gelatine omvat. Nog een ander aspect heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een carbonzuur-gelatine zoals hierin beschreven. De onderhavige uitvinders hebben verrassenderwijs gevonden dat zuivering van een waterig reactiemedium van carbonzuur-gelatine volgens een gewijzigde versie van de methode beschreven in WO 2016/085345, niet alleen lipopolysachariden uit het medium verwijdert, maar ook andere pyrogenen evenals het vrije carbonzuur en andere reactanten die worden gevormd tijdens of die achterblijven na de carbonzuur-functionalisatie van de gelatinereactie. Als zodanig is geen dialyse van het reactiemedium vereist, wat resulteert in een sneller proces dat carbonzuur-gelatine verschaft met een laag LPS-gehalte, een laag pyrogeengehalte en een laag carbonzuurgehalte zoals elders hierin gespecificeerd.
Dienovereenkomstig heeft de uitvinding in een ander aspect betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een carbonzuur-gelatine zoals hierin geopenbaard, welke werkwijze de volgende stappen omvat: a. het modificeren van gelatine door gelatine te laten reageren met een reagens dat een N-hydroxysuccinimide-ester van de carbonzuurgroep R-(CH2)n-COOH bevat, waarbij n een geheel getal is van 1 tot 10 (R-(CH2)n-COO-NHS) in een reactiemedium,;
-14- BE2022/5445 b. het verlagen van de pH van het reactiemedium tot een waarde tussen 2,0 en 4,0, bij voorkeur tussen 2,5 en 3,5, met meer voorkeur tussen 3,0 en 3,5; c. het toevoegen van 0,01-1,5 w/w% van een micelvormende oppervlakte-actieve stof aan het zure reactiemedium; d. het in contact brengen van het micel-bevattende medium met een adsorbens, bij voorkeur actieve kool; e. het scheiden van het adsorbens van het medium: f. het terugwinnen van het medium dat de gefunctionaliseerde gelatine omvat. g.
Eventueel het drogen van het medium dat de gefunctionaliseerde gelatine van stap f) omvat.
Een alternatieve werkwijze voor het bereiden van een carbonzuur-gefunctionaliseerde gelatine zoals hierin geopenbaard, omvat de volgende stappen: a) het modificeren van gelatine door gelatine te laten reageren met een reagens dat een N-hydroxysuccinimide-ester van de carbonzuurdeel R-(CHz)n-COOH bevat, waarbij n een geheel getal van 1 tot 10 is (R-(CHz)n-COO-NHS) in een reactiemedium; b1) het verlagen van de pH van het reactiemedium tot een waarde tussen 4,0 en 9,0, bij voorkeur tussen 4,0 en 6,0, met meer voorkeur tussen 4,0 en 6,0, met nog meer voorkeur tussen 4,5 en 5,5; c) het toevoegen van 0,01 — 1,5 w/w% van een micelvormende oppervlakte-actieve stof aan het reactiemedium; b2) het verlagen van de pH van het reactiemedium tot een waarde tussen 2,0 en 4,0, bij voorkeur tussen 2,5 en 3,5, met meer voorkeur tussen 3,0 en 3,5; d) het in contact brengen van het medium van stap b2) met een vast adsorbens; e) het scheiden van het vaste adsorbens van stap d) van het medium; en f). het terugwinnen van het medium dat de gefunctionaliseerde gelatine omvat. g) eventueel het drogen van het medium dat de carbonzuur-gefunctionaliseerde gelatine van stap f) omvat.
Elk type gelatine, bijv. type A of type B gelatine, afkomstig van b.v. runderen, varkens, pluimvee of vis, kunnen worden gebruikt in de hierin beschreven werkwijzen.
In uitvoeringsvormen wordt type A gelatine gebruikt.
In andere uitvoeringsvormen wordt type B gelatine gebruikt.
Carbonzuur-functionalisatie van gelatine met N-hydroxy-succinimidyl-geactiveerde carbonzuren kan worden uitgevoerd door gelatine te laten reageren met de betreffende N-hydroxy- succinimidyl-geactiveerde carbonzuren in een geschikte buffer, bijv. in carbonaatbuffer bij pH 9,0 of in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), bij een temperatuur van 50°C gedurende 60- 180 min, zoals 80 minuten of 120-180 minuten.
De mate van carbonzuur-functionalisatie van de gelatine kan worden aangepast door de N-hydroxy-succinimidyl-geactiveerde
- 15 - BE2022/5445 carbonzuurreagens-tot-gelatineverhouding te variëren zoals beschreven in Shirahama et al. (2016). Tijdens de reactie wordt zowel carbonzuur-gelatine als vrij carbonzuur gevormd.
In uitvoeringsvormen is het N-hydroxy-succinimidyl-geactiveerde carbonzuur dat gebruikt wordt bij de functionalisering van de gelatine van de onderhavige uitvinding een N-hydroxy- succinimidyl-(NHS)-geactiveerd carbonzuur met de formule R-(CHz)n-COO-NHS waarin n een geheel getal van 1 tot 10 is, bij voorkeur in de essentiële afwezigheid van 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide-hydrochloride (EDC).
In uitvoeringsvormen, in het N-hydroxy-succinimidyl- (NHS)-geactiveerde carbonzuur dat wordt gebruikt bij de functionalisatie van de gelatine, wordt R gekozen uit de groep bestaande uit 4- fenol, 5-norbornenyl of SH. In uitvoeringsvormen loopt n van 1 tot 10, bij voorkeur van 1 tot 5, bij voorkeur 2 of 3. In voorkeursuitvoeringsvormen, in het N-hydroxy-succinimidyl-(NHS)- geactiveerde carbonzuur dat wordt gebruikt bij de functionalisatie van de gelatine, is de zuurgroep één of meer van 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuur, 3-(SH)-propionzuur en 2-(5- norbornenyl)-azijnzuur, bij voorkeur 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuur. In voorkeursuitvoeringsvormen ia het N-hydroxy-succinimidyl-(NHS)-geactiveerde carbonzuur dat gebruikt wordt bij de functionalisering van de gelatine, gekozen uit de groep bestaande uit N- hydroxy-succinimidyl-3-(4-hydroxyfenyl)-propionaat, N-hydroxy-succinimidyl-3-(SH)-propionaat, en N-hydroxy-succinimidyl-2-(5-norbornenyl)-acetyl, bij voorkeur N-hydroxy-succinimidyl-3-(4- hydroxyfenyl)-propionaat.
De pH van het reactiemedium kan worden verlaagd voorafgaand aan het toevoegen van de micelvormende oppervlakte-actieve stof tot een waarde tussen 2,0 en 5,0, bij voorkeur tussen 2,0 en 4,0, met meer voorkeur tussen 3,0 en 4,0 zoals een waarde van ongeveer 3,5 of tussen 2,0 en 3,5 zoals een waarde van ongeveer 3,0, met nog meer voorkeur tussen 3,0 en 3,5 (stap b) in de hierin beschreven werkwijzen). Als alternatief kan de pH van het reactiemedium worden verlaagd tot een waarde tussen 4,0 en 9,0, bij voorkeur tussen 4,0 en 6,0, met meer voorkeur tussen 4,0 en 6,0, met nog meer voorkeur tussen 4,5 en 5,5 voorafgaand aan het toevoegen van de micelvormende oppervlakte-actieve stof (stap b1) in de hierin beschreven werkwijzen), en kan verder worden verlaagd tot een waarde tussen 2,0 en 4,0, met meer voorkeur tussen 3,0 en 4,0 zoals een waarde van ongeveer 3,5 of tussen 2,0 en 3,5 zoals een waarde van ongeveer 3,0, met nog meer voorkeur tussen 3.0 en 3.5, na toevoeging van de micelvormende oppervlakte-actieve stof en voorafgaand aan het in contact brengen van het medium met het vaste adsorbens (stap b2) in de hierin beschreven werkwijzen). Op voordelige wijze, worden bij het uitvoeren van de volgende werkwijzestappen bij lage pH, LPS, pyrogenen en carbonzuur efficiënter verwijderd.
In de hierin beschreven werkwijzen wordt een micelvormende oppervlakte-actieve stof aan het reactiemedium toegevoegd. Een micelvormende oppervlakte-actieve stof is in staat micellen (oplosbare aggregaten) in oplossing te vormen. Micelvormende oppervlakte-actieve stoffen zijn
- 16 - BE2022/5445 in de stand van de techniek bekend. De micelvormende oppervlakte-actieve stof kan een ionische oppervlakte-actieve stof zijn, zoals een kationische of anionische oppervlakte-actieve stof. Bij voorkeur is de oppervlakte-actieve stof een niet-ionische oppervlakte-actieve stof, aangezien een dergelijke oppervlakte0-actieve stof de neiging heeft micellen te vormen bij een lagere concentratie in vergelijking met ionische oppervlakte-actieve stoffen. Verder kunnen ionische oppervlakte-actieve stoffen een interactie aangaan met de gelatine door ionische bindingen, en zijn deze moeilijker te verwijderen.
Bij voorkeur is de micelvormende niet-ionogene oppervlakte-actieve stof een geëthoxyleerde oppervlakte-actieve stof, bij voorkeur een alkylfenolethoxylaat, waarbij het alkylfenolethoxylaat bij voorkeur wordt weergegeven door de formule CxH2.1-CsH4-O-(C:H4O)nH, waarbij x 4 — 12 is enn 7,5 — 14 is, X bij voorkeur 8 is en n bij voorkeur 8-13 is, met meer voorkeur 8,5-12,5, met de meeste voorkeur 9-12, in het bijzonder Triton X-100, Triton X-102, of mengsels daarvan. De Triton X-serie van niet-ionische oppervlakte-actieve stoffen worden bereid door de reactie van octylfenol met ethyleenoxide. De producten zijn van het type dat in het algemeen wordt beschreven als alkylarylpolyetheralcoholen en hebben de volgende structuurformule: CgH17- CsHs(CH2CH20O)s7 (Triton X-100) en CeH1e CeHs(CH:CH20)123 (Triton X-102). Andere niet- ionische oppervlakte-actieve stoffen die geschikt zijn, omvatten nonylfenoxypolyethoxyethanolen C15H240-(C2H4O)nH, waarbij n 3-40 is, zoals nonoxynol-4, nonoxynol-15 en nonoxynol-30, of polyethyleenglycolsorbitanmono-esters van C12-C18- vetzuren, zoals TWEEN. CHAPSO (3-([3-cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxyl-1- propaansulfonaat is een andere geschikte niet-ionische oppervlakte-actieve stof.
Als resultaat van het toevoegen van een micelvormende oppervlakte-actieve stof, wordt LPS gemonomeriseerd en wordt aangenomen dat genoemde monomeren een interactie aangaan met de oppervlakte-actieve stof, waarbij micelcomplexen worden gevormd die oppervlakte- actieve stof en LPS omvatten. Om een efficiënte verwijdering van de LPS mogelijk te maken, en bij voorkeur ook van andere pyrogenen, in het bijzonder pyrogenen van Gram+ bacteriën en pyrogenen van bacteriën met flagellen, meer in het bijzonder pyrogenen van Gram+ bacteriën, moet de gewichtsverhouding van gelatine, in het bijzonder carbonzuur-gelatine, tot toegevoegde oppervlakte-actieve stof, in het bijzonder niet-ionische oppervlakte-actieve stof, bij voorkeur 2000 : 1 of minder zijn, met meer voorkeur 500 : 1 of minder, met nog meer voorkeur 250 : 1 of minder, met de meeste voorkeur 50 : 1 of minder. Bij hogere gewichtsverhoudingen, d.w.z. waar er relatief meer gelatine is, zal niet alle LPS door de oppervlakte-actieve stof worden gebonden. Bij voorkeur wordt de oppervlakte-actieve stof aan het reactiemedium toegevoegd in een concentratie van 0,01 — 1,5 w/w%, bij voorkeur 0,015 — 1,0 w/w®%, met meer voorkeur 0,020-0,50 w/w%.
In stap d) van de hierin beschreven werkwijzen, wordt het medium van stap c) of het medium van stap b2), dat oplosbare aggregaten kan bevatten die oppervlakte-actieve stof, LPS en
- 17 - BE2022/5445 monomeren daarvan en/of andere pyrogenen omvatten, in het bijzonder pyrogenen van Gram+ bacteriën en pyrogenen van bacteriën met flagellen, meer in het bijzonder pyrogenen van Gram+ bacteriën, in contact gebracht met een (vast) adsorbens. Naast het binden van de oppervlakte-actieve stof, en bij voorkeur ook LPS, bindt het adsorbens bij voorkeur ook andere pyrogenen, in het bijzonder pyrogenen van Gram+ bacteriën, pyrogenen van bacteriën met flagellen, enkelstrengs viraal RNA, en bacterieel DNA dat rijk is aan niet-gemethyleerde CpG- motieven, en HPA.
Het vaste adsorbens kan elk geschikt adsorbens zijn dat de oppervlakte-actieve stof kan binden, en bij voorkeur ook LPS, andere pyrogenen en carbonzuur, bekend bij de vakman, zoals een hydrofoob adsorbens. Het adsorbens is bij voorkeur onoplosbaar en geschikte adsorbentia zijn kleien, zoals (geactiveerde) diatomeeënaarde of kleien, fyllosilicaten, zoals aluminiumfyllosilicaat, smectietmineralen en hydrofobe adsorbentia, zoals actieve kool, bijvoorbeeld Norit SX Plus of Norit ROX 0.8 (Cabot, Nederland), of 3M ZetaCarbon filterpatronen, bijv zoals van het type R55S of R30L3S (3M, VS). Ook mengsels van een of meer adsorbentia kunnen worden toegepast. In voorkeursuitvoeringsvormen is het vaste adsorbens actieve kool.
Het in contact brengen van het medium met een vast adsorbens kan bijv. door deeltjesvormig adsorbens aan het medium toe te voegen, of door het medium door een filterelement te leiden dat het adsorbens bevat of over een kolom die met het adsorbens is gevuld, of door het medium meteen drager te incuberen waarbij het adsorbens op het uitwendige oppervlak daarvan aanwezig is.
Het vaste adsorbens wordt bij voorkeur aan het medium toegevoegd in een gewichtsverhouding tot de oppervlakte-actieve stof van ten minste 2,5 : 1, met meer voorkeur van ten minste 3,0 : 1, met de meeste voorkeur van ten minste 3,5 : 1. Het vaste adsorbens wordt bij voorkeur toegevoegd aan het medium in een concentratie van 0,1 - 3 w/w%, bij voorkeur van 0,5 - 1 w/w%. In het geval dat filterelementen of -systemen worden gebruikt, kan het de voorkeur hebben om vergelijkbare hoeveelheden adsorbens in het filtersysteem te gebruiken.
De stap van het in contact brengen wordt voldoende lang uitgevoerd om een goede adsorptie van de oppervlakte-actieve stof mogelijk te maken, resulterend in verwijdering van de oppervlakte-actieve stof en de LPS en/of andere pyrogenen, in het bijzonder pyrogenen van Gram+ bacteriën en pyrogenen van bacteriën met flagellen, meer in het bijzonder pyrogenen van Gram+ bacteriën, die aan de oppervlakte-actieve stof zijn gebonden, en bij voorkeur ook om adsorptie van de HPA, LPS en andere pyrogenen mogelijk te maken, in het bijzonder pyrogenen van Gram+ bacteriën, pyrogenen van bacteriën met flagellen, enkelstrengs viraal RNA en bacterieel DNA dat rijk is aan niet-gemethyleerde CpG-motieven en methacrylzuur, die aan het adsorbens zijn gebonden. Bij voorkeur wordt het adsorbens gedurende 5 minuten tot 1
- 18 - BE2022/5445 uur in contact gebracht met het (waterige) medium, met meer voorkeur gedurende 10 - 30 minuten.
In de volgende stap (e)) van de hierin beschreven werkwijzen wordt het vaste adsorbens uit het medium verwijderd.
De vakman kent geschikte manieren om een waterig medium in contact te brengen met een vast adsorbens en om het adsorbens van het medium te scheiden.
De genoemde scheiding kan bijv. centrifugatie of filtratie omvatten in het geval dat het adsorbens als deeltjes aan het medium wordt toegevoegd, waarbij filtratie de voorkeur heeft met het oog op industriële toepasbaarheid.
Het vaste adsorbens kan bijvoorbeeld worden toegevoegd aan het medium (van stap c) of stap b2) en, nadat de oppervlakte-actieve stof en bij voorkeur ook de
LPS, andere pyrogenen en carbonzuur aan het adsorbens kunnen binden, kan het adsorbens worden verwijderd b.v. door filtratie, sedimentatie of centrifugatie en dergelijke.
In een ander voorbeeld kan het vaste adsorbens in een filter aanwezig zijn, en het medium (van stap c) of stap b2) van de hierin beschreven methoden) wordt door het genoemde filter of door een reeks van dergelijke filters geleid, terwijl de filters eventueel kunnen worden gewassen om de opbrengst van het filtraat te optimaliseren.
Op deze manier kunnen stappen d), e) en f) van de hierin beschreven werkwijzen worden gecombineerd in een enkele filtratiestap.
Na de afscheiding van het vaste adsorbens wordt het medium, dat het carbonzuur-gelatine omvat, teruggewonnen.
Bij voorkeur worden de stappen c)-f) van de hierin beschreven werkwijzen uitgevoerd bij een temperatuur onder het troebelingspunt van de gebruikte oppervlakte-actieve stof.
Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "troebelingspunt" naar de temperatuur waarbij de oppervlakte-actieve stof onoplosbare aggregaten vormt in het medium.
Deze temperatuur is afhankelijk van de omstandigheden van het medium, zoals de zoutconcentratie.
Wanneer er geen specifieke omstandigheden worden aangegeven, wordt het troebelingspunt hierin gedefinieerd als de temperatuur waarbij een 1 w/w®% waterige oplossing onoplosbare aggregaten vormt.
Dus als wordt beschreven dat de temperatuur onder het troebelingspunt van een oppervlakte-actieve stof ligt, is deze temperatuur 68 - 69 °C (d.w.z. voor een 1 w/w% Triton X-100-oplossing), maar in het geval van een 16-25 w/w% NaCl-oplossing, is het genoemde troebelingspunt kamertemperatuur.
Het troebelingspunt kan onder de gegeven omstandigheden gemakkelijk worden bepaald door de lichtabsorptie van de oplossing bij 620 nm zonder toevoeging van de oppervlakte-actieve stof te bepalen en te controleren of de absorptie toeneemt wanneer de beoogde hoeveelheid oppervlakte-actieve stof wordt toegevoegd.
Boven het troebelingspunt verhoogd de absorptie.
In uitvoeringsvormen worden stappen c)-f) uitgevoerd bij een temperatuur van 65°C of lager,
met meer voorkeur van 62°C of lager, met nog meer voorkeur van 60°C of lager.
In uitvoeringsvormen worden stappen c)-f) uitgevoerd bij een temperatuur tussen 30 °C en 65 °C,
- 19 - BE2022/5445 bij voorkeur tussen 30 °C en 60 °C, met meer voorkeur tussen 30 °C en 50 °C of tussen 30 °C en 40 °C, met nog meer voorkeur tussen 30 °C en 35°C.
In uitvoeringsvormen ligt de pH van het medium tussen 2,0 en 5,0, bij voorkeur tussen 2,0 en 4,0, met meer voorkeur tussen 3,0 en 4,0 zoals bij ongeveer 3,5 of tussen 2,0 en 3,5 zoals bij ongeveer 3,0, met nog meer bij voorkeur tussen 3,0 en 3,5 tijdens de werkwijzestappen c)-f). Bij een dergelijke pH is de temperatuur bij voorkeur lager dan 35°C, met meer voorkeur tussen 30°C en 35°C, zoals bij ongeveer 30°C.
In andere uitvoeringsvormen ligt de pH van het medium tussen 2,0 en 5,0, bij voorkeur tussen 2,0 en 4,0, met meer voorkeur tussen 3,0 en 4,0 zoals bij ongeveer 3,5 of tussen 2,0 en 3,5 zoals bij ongeveer 3,0, met nog meer voorkeur tussen 3,0 en 3,5 tijdens de werkwijzestappen d)-f). Bij een dergelijke pH is de temperatuur bij voorkeur lager dan 35°C, met meer voorkeur tussen 30°C en 35°C, zoals bij ongeveer 30°C.
Na het terugwinnen van het medium dat de carbonzuur-gelatine omvat, kunnen de werkwijzen verder een stap omvatten van het verhogen van de pH van het medium tot tussen 3,5 en 9,0, bij voorkeur tussen 4,0 en 8,0, met meer voorkeur tussen 5,0 en 7,0. Zoals eerder opgemerkt, resulteren de hierin beschreven werkwijzen in carbonzuur-gelatine met een laag LPS-gehalte, in het bijzonder een LPS-gehalte van minder dan 100 EU/g, met meer voorkeur minder dan 50 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 20 EU/g met nog meer voorkeur minder dan 10 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 5 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 2 EU/g, met de meeste voorkeur minder dan 1 EU/g. In het bijzonder omvat de carbonzuur-gelatine ten minste 50 keer minder LPS, bij voorkeur ten minste 100 keer, met meer voorkeur ten minste 150 keer, met nog meer voorkeur ten minste 200 keer en met de meeste voorkeur ten minste 250 keer minder LPS in vergelijking met het LPS-gehalte van de gelatine die als uitgangsmateriaal van stap a) wordt gebruikt. Het LPS-gehalte kan worden bepaald op het teruggewonnen medium met behulp van bijv. het LAL-assay zoals elders hierin beschreven.
Het verkregen carbonzuur-gelatine wordt verder gekenmerkt door een laag gehalte aan niet- endotoxinepyrogenen, in het bijzonder een laag gehalte aan pyrogenen van Gram+ bacteriën, pyrogenen van bacteriën met flagellen, enkelstrengs viraal RNA, endotoxine van Gram- bacteriën en bacterieel DNA rijk aan niet-gemethyleerde CpG-motieven, meer in het bijzonder een laag gehalte aan pyrogenen van Gram+ bacteriën en van bacteriën met flagellen, en meer in het bijzonder een laag gehalte aan pyrogenen van Gram+ bacteriën. In het bijzonder bevat de carbonzuur-gelatine minstens 10 keer minder pyrogenen van Gram+ bacteriën, bij voorkeur minstens 20 keer minder, meer bij voorkeur minstens 50 keer, zelfs meer bij voorkeur minstens 100 keer, minstens 150 keer, minstens 200 keer of ten minste 250 keer minder, vergeleken met het gehalte aan pyrogenen van Gram+ bacteriën van de gelatine die als uitgangsmateriaal van stap a) werd gebruikt. In het bijzonder omvat de carbonzuur-gelatine minstens 10 keer minder pyrogenen van bacteriën met flagellen, bij voorkeur minstens 20 keer minder, meer bij voorkeur
- 20 - BE2022/5445 minstens 50 keer, met meer voorkeur minstens 100 keer, minstens 150 keer, minstens 200 keer of ten minste 250 keer minder, in vergelijking met het gehalte aan pyrogenen van bacteriën met flagellen van de gelatine die als uitgangsmateriaal van stap a) is gebruikt. In het bijzonder omvat de carbonzuur-gelatine ten minste 10 keer minder bacterieel DNA dat rijk is aan niet- gemethyleerde CpG-motieven, bij voorkeur ten minste 20 keer minder, met meer voorkeur ten minste 50 keer, met nog meer voorkeur ten minste 100 keer, ten minste 150 keer, minstens 200 keer of minstens 250 keer minder, vergeleken met het gehalte aan minder bacterieel DNA dat rijk is aan niet-gemethyleerde CpG-motieven van de gelatine die als uitgangsmateriaal van stap a) wordt gebruikt. minder enkelstrengs viraal RNA.
Verder resulteren de hierin beschreven werkwijzen in met carbonzuur-gemodificeerde gelatine met een laag gehalte aan vrij (niet-gelatinegebonden) carbonzuur, in het bijzonder minder dan 100 ppm, bij voorkeur minder dan 50 ppm, met meer voorkeur minder dan 30 ppm carbonzuur zuur. De gelatine met lage carbonzuurfunctionaliteit werd opgelost in 50 mM fosfaatbuffer, pH 9,5 voor het bepalen van het gehalte aan vrij (niet-gelatinegebonden) 3-(4- hydroxyfenyl)propionzuur.
Bij voorkeur zoals bepaald op een monster van de carbonzuur-gelatine opgelost in water, van minder dan 150 ppm, bij voorkeur minder dan 100 ppm carbonzuur zoals bepaald op een monster van de carbonzuur-gelatine opgelost in 50 mM fosfaat buffer, pH 9,5.
De onderhavige werkwijzen verschaffen dus een gezuiverd carbonzuur-gelatine in een enkele ronde van de (6 of 7) stappen a)-f) die hierboven zijn beschreven.
Aangezien de hierin beschreven werkwijzen resulteren in carbonzuur-gelatine met een laag carbonzuurgehalte zonder de noodzaak van een dialysestap, zijn de werkwijzen bij voorkeur vrij van een dialysestap. Een dergelijke dialysestap is in het algemeen tijdrovend en daarom zijn de onderhavige werkwijzen efficiënter, in het bijzonder voor productie van een gezuiverd carbonzuur-gelatine op grote schaal.
In uitvoeringsvormen omvatten de werkwijzen verder een stap van het drogen van het teruggewonnen medium dat de carbonzuurgelatine omvat, eventueel na verhoging van de pH van het medium, bijv. door vriesdrogen tot een wit poreus schuim (Van Den Bulcke et al., 2000, Biomacromolecules, 1:31-38).
De onderhavige uitvinding zal nu verder worden toegelicht door middel van de volgende niet- beperkende voorbeelden.
VOORBEELDEN Voorbeeld 1: 3-(4-hydroxyfenyl)-propionaat-gefunctionaliseerde gelatine bereidingswerkwijze en eigenschappen van de 3-(4-hydroxyfenyl)-propionaat-gefunctionaliseerde gelatine
-21- BE2022/5445 Materialen en methodes 15-20% gelatine (varkenshuid, type A, Bloom 200) oplossing in 1,25 M carbonaatbuffer bij pH 9,0 werd gereageerd met N-hydroxysuccinimide-3-(4-hydroxyfenyl)-propionaat in een 1:1 verhouding tot het totaal aan beschikbare aminogroepen in de gelatine gedurende 120-180 minuten bij 50°C. Tijdens de reactie werd 3-(4-hydroxyfenylpropionzuur (PA) gevormd. De pH van het reactiemedium werd verlaagd tot pH 3,5. HCI werd gebruikt om het carbonaat te verwijderen. 1,12% (op gewicht van gelatine) Triton-X100 werd aan het medium toegevoegd en het medium werd gedurende 1 uur geroerd. Het medium werd vervolgens gefiltreerd over een kolom gepakt met actieve kool. De andere N-hydroxysuccinimide-esters van carbonzuren werden analoog gereageerd. Bepaling van LPS-gehalte Het LPS-gehalte werd bepaald met behulp van de EndoZyme |!-assaykit (Hyglos) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden gefunctionaliseerde gelatineoplossingen in ultrapuur water bereid met 2,50% (w/w) en 10x, 20x, 50x, 100x, enz. verdunningen, afhankelijk van het verwachte LPS-gehalte. 100 uL van elk monster werd toegevoegd aan een putje van een plaat met meerdere putjes en gemengd met 100 HL van het testreagens bereid volgens de instructies van de fabrikant. De fluorescentie-intensiteit van de resulterende mengsels werd gevolgd in een microplaatfluorescentielezer (BopTek; excitatie/emissie = 380 nm/455 nm). Een verdunningsreeks van een endotoxinestandaard (E. coli 055:B5) gereconstitueerd in endotoxinevrij water bij 50 EU/mI werd gebruikt als ijkstandaard; en endotoxinevrij water werd gebruikt als blanco bepaling van 4-hydroxyfenyl-propionzuurgehalte 8% (w/w) oplossingen van de gefunctionaliseerde gelatine (GelDAT)-monsters in water of 50 mM fosfaatbuffer, pH 9,5 werden gemaakt. Men liet de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur opzwellen en werden vervolgens gedurende 30 minuten bij 50°C geplaatst totdat de monsters visueel volledig waren opgelost. 0,5 ml van de monsteroplossingen werden toegevoegd aan 10-kDa Amicon Ultra Centrifugal Filters (Milipore) en gedurende 10 min bij 50°C (oven) geplaatst, waarna ze 30 min bij 40°C bij 12000 xg werden gecentrifugeerd. Daarna werden de filtraten verzameld voor HPLC-analyse. Een verdunningsreeks van 4-hydroxyfenylpropionzuur variërend van 0,1 ppm tot 100 ppm werd gemaakt door een 1% (w/w) 4-hydroxyfenylpropionzuur in water of 50 mM fosfaatbuffer, pH 9,5 te bereiden en 2-voudige verdunningen in water of 50 mM fosfaatbuffer, pH 9,5, te maken, en als standaard te gebruiken.
Bepaling van het DNA-gehalte Een voorraadconcentratie van 0,1 mg/ml zalmtestes dsDNA-standaard werd bereid in TE- buffer (10 mM Tris-HCI met 1 MM EDTA in water, pH = 8) en verder verdund tot een
-22- BE2022/5445 voorraadconcentratie van 10 ug/ML. Kwantificeringsstandaarden variërend van 10 ug/ml tot 0 g/ml in TE-buffer. 10% (w/w) gelatinemonsters werden bereid in TE-buffer; men liet de monsters 30 min opzwellen en oplossen bij 40°C met behulp van een waterbad. 95 ul van een mastermix die 94 ul TE-buffer en 1 ul SYBR Green (100x) bevat, en 5 pl van een monster of standaard werden toegevoegd in de putjes van een zwarte fluorescerende plaat met 96 putjes en gemengd door op en neer te pipetteren. De plaat met 96 putjes werd afgedekt en gedurende 30 minuten bij 37°C en 700 rpm geïncubeerd. Fluorescentie werd gemeten bij Ex535nm/Em617nm met behulp van een Synergy TM Mx-fluorometer (BioTek) bij 25°C volgens de instructies van de fabrikant.
Voorbeeld 2: Vergelijking van gefunctionaliseerde gelatines bereid met een werkwijze volgens een Uitvoeringsvorm van de uitvinding en een werkwijze gebaseerd op dialyse. Materiaal en methoden Gelatine werd gemodificeerd volgens de hierin beschreven werkwijze. De startgelatine was verontreinigd met 2229 endotoxine-eenheden (EU) per gram gelatine (Hyglos-endozym). 3-(4- hydroxyfenyl)-propionzuurresten en LPS-verontreiniging werden gemeten zoals beschreven in voorbeeld 1 in respectievelijk ppm en EU per gram gelatine. De gefunctionaliseerde gelatine werd opgelost in 50 mM fosfaatbuffer, pH 9,5 voor het bepalen van het 3-(4-hydroxyfenyl)- propionzuurgehalte. In de vergelijkende werkwijze werd 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuur bijproduct verwijderd uit de gefunctionaliseerde-gelatineoplossingen door dialyse tegen ultrapuur water (MilliQ, Merck Millipore). Porties van twintig milliliter van de 3-(4-hydroxyfenyl)- propionzuuroplossingen werden overgebracht naar 5 dialysebuizen (dialyse buiscellulosemembraan, MWCO 14 kDa, cat. N°: D9527-100FT, Sigma-Aldrich) en elk van deze werd ondergedompeld in 2,5 liter water. De dialyse vond plaats bij 40°C en het water werd elke 24 uur ververst. Op dagen T1=1, T2=2, T3=3, T4=4 en T5=7 werd één buis verwijderd en werden het 3-(4-hydroxyfenyl)propionzuur en LPS-gehalte gemeten zoals beschreven in voorbeeld 1. De gefunctionaliseerde gelatine werd opgelost in 50 mM fosfaatbuffer, pH 9,5 voor het bepalen van het 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuurgehalte. Bij de werkwijze volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding werden vijf porties van 40 ml van de gefunctionaliseerde gelatineoplossingen op pH gebracht door verdund HCI toe te voegen tot een pH van 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 en 4,0 (allemaal gemeten bij 40°C) en 0,1% (op gelatinegehalte) Triton-X100 werd aan elk monster toegevoegd. Elke portie werd vervolgens in tweeën gedeeld, waarbij één ervan diende als een negatieve controle op het effect van de pH-verlaging en Triton-X100-toevoeging op het methacrylzuurgehalte en de LPS-verontreiniging. Vijf gram Norit actieve koolpoeder (S268, actieve kool Norit SX plus 8013-1) werd aan elk van de experimentele buisjes toegevoegd en deze buisjes werden gedurende 1 uur bij 40°C op een roterende schudder geïncubeerd. Vervolgens werden deze buizen gedurende 30 minuten bij 2000 rpm
-23- BE2022/5445 gecentrifugeerd en het supernatant werd gefiltreerd (0,45 um) en geanalyseerd zoals beschreven in voorbeeld 1 op het gehalte aan 3-(4-hydroxyfenyl)propionzuur en LPS. De gefunctionaliseerde gelatine werd opgelost in 50 mM fosfaatbuffer, pH 9,5 voor het bepalen van het gehalte aan vrij (niet-gelatinegebonden) 3-(4-hydroxyfenyl)propionzuur.
Resultaten Tabel 1 toont het 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuur (PA)-gehalte (ppm) en LPS-gehalte (EU/g) van gezuiverde gefunctionaliseerde gelatine verkregen met de werkwijze die hierin elders wordt beschreven. Figuur 1 is de grafische weergave.
- 24 - BE2022/5445 Zuivering via dialyse: |_Tabel 1 Figuur1 | | Water | PBS | eas | zoa we] vn] 70] an cel 12m m) 2 jm droog product 2229| 1745| 181 70| 40| 45| 1203| 186| 94 50 opmeting Io | | bm | | | bm] Opmerking TO punt punt Vermindering% | ___O| | @| 97| | ©| 4| | 9] 97] 98 Zuivering via micelvorming en filtratie Tabel 2. toont het 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuurgehalte (ppm) en LPS-gehalte (EU/g) van gezuiverde gefunctionaliseerde gelatine verkregen met een methode op basis van dialyse of met een werkwijze volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding. Figuur 2 is de grafische weergave. Figuur 3 toont de HPLC. EP |“Epom [Top droog product 2937 | <1ppm* Vermindering % |__| 100 | 100 | 100 | 100 | *Onder kwantificatieniveau Figuur 4 toont in figuur 4A de MW-verdeling voor de uitgangsgelatine (1) en de resultaten van een modificatie via een route met een in situ mengsel van NHS, HPA en EDC gevolgd door zuivering met behulp van éénstapsdialyse (2) en tweestapsdialyse (3). De gemodificeerde gelatine heeft een bredere Mw-verdeling in vergelijking met de uitgangsgelatine, wat wijst op ongewenste verknoping. Figuur 4B toont in figuur 4A de MW-verdeling voor dezelfde uitgangsgelatine (1) en de resultaten van een modificatie via een route met een NHS-HPA in essentiële afwezigheid van EDC, gevolgd door zuivering met een zuivering op basis van micelvorming . De gemodificeerde gelatine heeft een Mw-verdeling die bijna identiek is aan de uitgangsgelatine, wat wijst op succesvolle derivatisering in essentiële afwezigheid van ongewenste verknoping.
De derivatisering met NHS-HPA in afwezigheid van EDC in vergelijking met een mengsel van NHS, HPA en EDC leidt tot een product met een ander Mw-profiel, dichter bij de oorspronkelijke gelatine. De zuivering door micellenvorming leidt tot een product dat zowel laag in LPS als laag in HPA is en dus tot een verbeterde kwaliteit.
Claims (23)
1. Gelatine gefunctionaliseerd via een amidebinding met een carbonzuurgroep R-(CH2)n-COOH waarin n een geheel getal is van 1 tot 10 en verder een lipopolysacharidegehalte heeft van minder dan 100 EU/g, bij voorkeur minder dan 50 EU/ g, met meer voorkeur minder dan 20 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 10 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 5 EU/g, met nog meer voorkeur minder dan 2 EU/g, met de meeste voorkeur minder dan 1 EU/g, waarin R is gekozen uit de groep bestaande uit 4-fenol, norbornenyl of SH.
2. Gelatine volgens conclusie 1, waarbij n 1 tot 5 is, bij voorkeur 2 of 3.
3. Gelatine volgens conclusie 1 of 2, waarbij de carbonzuurgroep een of meer van 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuur, 3-(SH)-propionzuur en 2-(5-norbornenyl)-azijnzuur is. zuur, bij voorkeur 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuur.
4. Gelatine volgens conclusies 1-3, waarbij de gefunctionaliseerde gelatine een modificatiegraad met de carbonzuurgroep heeft tussen 5% en 100%, bij voorkeur tussen 25% en 100%, met meer voorkeur tussen 50% en 100%, zelfs met meer voorkeur tussen 75 en 100%.
5. Gelatine volgens conclusies 1-4, waarbij de gefunctionaliseerde gelatine een hoeveelheid vrij carbonzuur R-(CH2)n-COOH bevat van minder dan 100 ppm, bij voorkeur minder dan 50 ppm, met meer voorkeur minder dan 20 ppm, zelfs met meer voorkeur minder dan 10 ppm, met nog meer voorkeur minder dan 5 ppm, met nog meer voorkeur minder dan 2 ppm, met de meeste voorkeur minder dan 1 ppm.
6. Gelatine volgens de voorgaande conclusies, waarbij de gefunctionaliseerde gelatine een type A gelatine is.
7. Gelatine volgens de bovenstaande conclusies, waarbij gefunctionaliseerd gelatine verder is gemodificeerd met een (meth)acrylaatgroep of -eenheid, een acetylgroep of -eenheid, een fenolgroep of -eenheid, een thiolgroep of -eenheid, een norborneengroep of -eenheid, een tetrazinegroep of -eenheid, een azidegroep of - eenheid, een furangroep of -eenheid, een allylgroep of -eenheid, een maleïmidegroep of -eenheid of een combinatie daarvan.
8. Werkwijze voor het verschaffen van een gefunctionaliseerde gelatine volgens een van de conclusies 1 tot 7, waarbij de werkwijze de stappen omvat van: a. het modificeren van gelatine door gelatine te laten reageren met een reagens dat een N-hydroxysuccinimide-ester van het carbonzuurdeel R-(CH2)n-COOH bevat, waarbij n een geheel getal is van 1 tot 10 (R-(CH2)n-COO-NHS) in een reactiemedium;
- 26 - BE2022/5445 b. het verlagen van de pH van het reactiemedium tot een waarde tussen 2,0 en 4,0, bij voorkeur tussen 2,5 en 3,5, met meer voorkeur tussen 3,0 en 3,5; c. het toevoegen van 0,01-1,5 w/w% van een micelvormende oppervlakteactieve stof aan het zure reactiemedium; d. het in contact brengen van het micelbevattende medium met een adsorbens, bij voorkeur actieve kool; e. het scheiden van het adsorbens van het medium; f. het terugwinnen van het medium dat de gefunctionaliseerde gelatine omvat, waarin R is gekozen uit de groep bestaande uit 4-fenol, norbornenyl en SH.
9. Werkwijze voor het bereiden van een gefunctionaliseerde gelatine volgens een van de conclusies 1 tot 7, omvattende de stappen van: a) het modificeren van gelatine door gelatine te laten reageren met een reagens dat een N-hydroxysuccinimide-ester van het carbonzuurdeel R-(CH2)n-COOH bevat, waarbij n een geheel getal van 1 tot 10 is (R-(CH2)n-COO-NHS) in een reactiemedium; b1). het verlagen van de pH van het reactiemedium tot een waarde tussen 4,0 en 9,0, bij voorkeur tussen 4,0 en 6,0, met meer voorkeur tussen 4,0 en 6,0, met nog meer voorkeur tussen 4,5 en 5,5; c) het toevoegen van 0,01 — 1,5 w/w% van een micelvormende oppervlakteactieve stof aan het reactiemedium; b2). het verlagen van de pH van het reactiemedium tot een waarde tussen 2,0 en 4,0, bij voorkeur tussen 2,5 en 3,5, met meer voorkeur tussen 3,0 en 3,5; ; d). het in contact brengen van het medium van stap b2) met een vast adsorbens; e). het scheiden van het vaste adsorbens van stap d) van het medium; en f). het terugwinnen van het medium dat de gefunctionaliseerde gelatine omvat, waarin R is gekozen uit de groep bestaande uit 4-fenol, norbornenyl en SH.
10. Werkwijze volgens conclusie 8 of 9, waarbij n 1 tot 5 is, bij voorkeur 2 of 3.
11. Werkwijze volgens conclusie 8-10, waarbij het reagens dat een N- hydroxysuccinimide-ester van de carbonzuurgroep R-(CH2)n-COOH bevat, waarbij n een geheel getal van 1 tot 10 is, R-(CH2)n- is. COO-NHS.
12. Werkwijze volgens conclusies 8-10, waarbij de carbonzuurgroep een of meer van 3-(4-hydroxyfenyl)propionzuur, 3-(SH)-propionzuur en 2-(5-norbornenyl)azijnzuur is. zuur, bij voorkeur 3-(4-hydroxyfenyl)-propionzuur.
13. Werkwijze volgens conclusies 8-12, waarbij de primaire aminegroepen van gelatine worden gemodificeerd met de carbonzuurrest.
14. Werkwijze volgens conclusies 8-13, waarbij een primaire aminegroep van de gefunctionaliseerde gelatine via een amidebinding aan de carbonzuurgroep wordt gekoppeld.
-27- BE2022/5445
15. Werkwijze volgens conclusies 8-14, waarbij de werkwijze geen dialysestap omvat.
16. Werkwijze volgens een van de conclusies 8 tot 15, waarbij de micelvormende oppervlakteactieve stof een niet-ionische oppervlakteactieve stof omvat, bij voorkeur waarbij de oppervlakteactieve stof Triton X-100 of Triton X-102 is, of mengsels daarvan.
17. Werkwijze volgens conclusies 8-16, waarbij de gefunctionaliseerde gelatine een lipopolysacharidegehalte heeft van minder dan 100 EU/g. 100 EU/g, bij voorkeur minder dan 50 EU/g, meer bij voorkeur minder dan 20 EU/g, nog meer bij voorkeur minder dan 10 EU/g, nog meer bij voorkeur minder dan 5 EU/g, nog meer bij voorkeur minder dan 2 EU/ g, met de meeste voorkeur minder dan 1 EU/g.
18. Werkwijze volgens conclusies 8-17, waarbij de gefunctionaliseerde gelatine een mate van modificatie met de carbonzuurgroep heeft tussen 5% en 100%, bij voorkeur tussen 25% en 100%, met meer voorkeur tussen 50% en 100%, zelfs meer bij voorkeur tussen 75 en 100%.
19. Werkwijze volgens conclusies 8-18, waarbij de gefunctionaliseerde gelatine een hoeveelheid vrij carbonzuur R-(CH2)n-COOH bevat van minder dan 100 ppm, bij voorkeur minder dan 50 ppm, met meer voorkeur minder dan 20 ppm, zelfs met meer voorkeur minder dan 10 ppm, met nog meer voorkeur minder dan 5 ppm, met nog meer voorkeur minder dan 2 ppm, met de meeste voorkeur minder dan 1 ppm.
20. Werkwijze volgens conclusies 8-19, waarbij de hoeveelheid vrij carbonzuur wordt bepaald op een monster van de gelatine opgelost in 50 mM fosfaatbuffer bij een pH van 9,5.
21. Werkwijze volgens conclusies 8-20, waarbij gefunctionaliseerd gelatine verder wordt gemodificeerd met een (meth)acrylaatgroep of -eenheid, een acetylgroep of -eenheid, een fenolgroep of -eenheid, een thiolgroep of -eenheid, een norborneengroep of -eenheid, een tetrazinegroep of -eenheid, een azidegroep of -eenheid, een furangroep of -eenheid, een allylgroep of -eenheid, een maleïmidegroep of -eenheid of een combinatie daarvan.
22. Hydrogel omvattende een gefunctionaliseerde gelatine zoals gedefinieerd in een van de conclusies 1-7 en een verknopingsmiddel.
23. Film omvattende een hydrogel volgens conclusie 22 of een gefunctionaliseerde gelatine volgens conclusies 1-7.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE202105461 | 2021-06-10 | ||
| BE202105534 | 2021-07-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BE1029488A1 BE1029488A1 (nl) | 2023-01-11 |
| BE1029488B1 true BE1029488B1 (nl) | 2023-01-16 |
Family
ID=82163565
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BE20225445A BE1029488B1 (nl) | 2021-06-10 | 2022-06-09 | Vernetbare gefunctionaliseerde gelatine met lage pyrogene activiteit |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240270823A1 (nl) |
| EP (1) | EP4314160A1 (nl) |
| JP (1) | JP2024521634A (nl) |
| KR (1) | KR20240019774A (nl) |
| AR (1) | AR126103A1 (nl) |
| AU (1) | AU2022288580A1 (nl) |
| BE (1) | BE1029488B1 (nl) |
| BR (1) | BR112023022743A2 (nl) |
| CA (1) | CA3217076A1 (nl) |
| IL (1) | IL307811A (nl) |
| TW (1) | TW202317213A (nl) |
| WO (1) | WO2022258763A1 (nl) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006010066A2 (en) | 2004-07-09 | 2006-01-26 | The Cleveland Clinic Foundation | Hydroxyphenyl cross-linked macromolecular network and applications thereof |
| NL2013880B1 (en) | 2014-11-26 | 2016-10-11 | Rousselot B V | Gelatin purification. |
| SG11202100809RA (en) | 2018-09-07 | 2021-02-25 | Univ Nanyang Tech | Hydrogels with tunable electrostatic properties |
-
2022
- 2022-06-08 AR ARP220101515A patent/AR126103A1/es unknown
- 2022-06-09 US US18/567,385 patent/US20240270823A1/en active Pending
- 2022-06-09 WO PCT/EP2022/065716 patent/WO2022258763A1/en active Application Filing
- 2022-06-09 IL IL307811A patent/IL307811A/en unknown
- 2022-06-09 CA CA3217076A patent/CA3217076A1/en active Pending
- 2022-06-09 AU AU2022288580A patent/AU2022288580A1/en active Pending
- 2022-06-09 KR KR1020237043014A patent/KR20240019774A/ko active Search and Examination
- 2022-06-09 BR BR112023022743A patent/BR112023022743A2/pt unknown
- 2022-06-09 EP EP22733046.1A patent/EP4314160A1/en active Pending
- 2022-06-09 BE BE20225445A patent/BE1029488B1/nl active IP Right Grant
- 2022-06-09 JP JP2023567109A patent/JP2024521634A/ja active Pending
- 2022-06-10 TW TW111121602A patent/TW202317213A/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL307811A (en) | 2023-12-01 |
| BE1029488A1 (nl) | 2023-01-11 |
| WO2022258763A1 (en) | 2022-12-15 |
| CA3217076A1 (en) | 2022-12-15 |
| US20240270823A1 (en) | 2024-08-15 |
| TW202317213A (zh) | 2023-05-01 |
| EP4314160A1 (en) | 2024-02-07 |
| AU2022288580A1 (en) | 2023-11-09 |
| JP2024521634A (ja) | 2024-06-04 |
| BR112023022743A2 (pt) | 2024-01-02 |
| KR20240019774A (ko) | 2024-02-14 |
| AR126103A1 (es) | 2023-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7523585B2 (ja) | 低エンドトキシンゼラチン－（メタ）アクリロイル | |
| EP3347061B1 (en) | Injectable macroporous hydrogels | |
| Elvin et al. | A highly elastic tissue sealant based on photopolymerised gelatin | |
| Bae et al. | Evaluation of a thiolated chitosan scaffold for local delivery of BMP‐2 for osteogenic differentiation and ectopic bone formation | |
| Abbate et al. | Photocrosslinked bovine serum albumin hydrogels with partial retention of esterase activity | |
| AU2022211848B2 (en) | Bifunctional modified biopolymer based polymers and hydrogels obtainable from such bifunctional modified biopolymer based polymers | |
| Barik et al. | Montmorillonite stabilized chitosan-co-mucin hydrogel for tissue engineering applications | |
| BE1029488B1 (nl) | Vernetbare gefunctionaliseerde gelatine met lage pyrogene activiteit | |
| Armengol et al. | The progress on sulfhydryl modified polymers with regard to synthesis, characterization and mucoadhesion | |
| CN117500885A (zh) | 具有低热原活性的可交联官能化的明胶 | |
| Zhong | Mucin preparation and assembly into new biomaterials | |
| JP2024509177A (ja) | 架橋性バイオポリマーの製造方法 | |
| WO2023230213A1 (en) | Keratin protein extracts, compositions, methods and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Effective date: 20230116 |