CN116874892A - 一种水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水凝胶及其制备方法与应用,所述水凝胶由氧化普鲁兰多糖、羧甲基壳聚糖和溶剂制备得到。本发明制备的水凝胶,通过对普鲁兰多糖进行氧化改性将它的羟基氧化成醛基,与羧甲基壳聚糖的氨基形成席夫碱键,赋予了水凝胶自愈合性质,同时交联很稳定,降解速度适中,且拥有适于促进干细胞向神经元方向分化的机械性能,是一种很好的培养干细胞、促进神经分化的材料,且便于注射到体内治疗脊髓损伤。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域,具体涉及一种水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
水凝胶是由亲水聚合物链交联而成的三维系统,具有很高的含水量。水凝胶有很多特性比如生物相容性、机械性质灵活可调、易于进行化学修饰以及能够模拟细胞外基质等,使得它在生物再生领域有着很广泛的应用。水凝胶主要分为天然水凝胶与合成水凝胶,用于细胞培养的多用天然水凝胶,比如透明质酸、海藻酸、壳聚糖、胶原、明胶等。虽然天然水凝胶有着很好的生物相容性,但传统的水凝胶在应用于细胞培养时还存在很多局限性,比如:不够稳定,化学修饰之后成胶状态和成胶时间不稳定;交联较弱,成胶之后抗溶胀性不好,降解较快;水溶性较差,高分子量的凝胶前体溶液较粘稠,难以通过滤菌膜除菌。以上问题使得水凝胶在应用于细胞培养时变得很困难,因此,一种性质稳定、交联度可控以及易于除菌的水凝胶材料将会在生物医学共存领域有更广泛的应用。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种水凝胶。
本发明还提出一种水凝胶的制备方法。
本发明还提出上述水凝胶的应用。
在本发明的第一方面,提出了一种水凝胶,所述水凝胶由氧化普鲁兰多糖、羧甲基壳聚糖和溶剂制备得到。
在本发明的一些实施方式中,所述溶剂选自水、生理盐水或缓冲溶液。
在本发明的一些实施方式中,所述缓冲液为PBS缓冲液。
在本发明的一些实施方式中,所述氧化普鲁兰多糖和羧甲基壳聚糖的质量添加比为(1~3):(3~1)。
在本发明的一些实施方式中,所述氧化普鲁兰多糖和羧甲基壳聚糖的质量添加比为1:1。
在本发明的第二方面,提出了一种水凝胶的制备方法,所述方法包括以下步骤:将氧化普鲁兰多糖、羧甲基壳聚糖和溶质进行混合,得到所述水凝胶。
在本发明的一些实施方式中,成胶的时间为30~60s。
在本发明的一些实施方式中,氧化普鲁兰多糖溶液和羧甲基壳聚糖溶液混合前还包括除菌的步骤。
在本发明的一些实施方式中,所述除菌采用0.22μm的滤膜进行。
在本发明的一些实施方式中,所述氧化普鲁兰多糖的制备方法包括以下步骤:在普鲁兰多糖水溶液中加入高碘酸盐反应后,加入醇类溶剂终止反应,得到反应溶液;将所述反应溶液进行透析,即得。
在本发明的一些实施方式中,所述高碘酸盐包括高碘酸钠。
在本发明的一些实施方式中,所述醇类溶剂包括乙二醇和丁二醇。
在本发明的一些实施方式中,所述普鲁兰多糖水溶液中的普鲁兰多糖与高碘酸盐的添加质量比为(1~3):(1~2)。
在本发明的一些实施方式中,所述普鲁兰多糖水溶液中的普鲁兰多糖与高碘酸盐的添加质量比为2:1。
在本发明的一些实施方式中,所述普鲁兰多糖水溶液与高碘酸盐的反应时间为4~8h。
在本发明的一些实施方式中,所述反应溶液中,醇类溶剂的添加量占总反应体积的1%~3%。
在本发明的一些实施方式中,所述透析采用渗析袋进行。
在本发明的一些实施方式中,所述渗析袋的分子量为6000~8000Da。
在本发明的一些实施方式中,所述渗析袋的分子量为7000Da。
在本发明的第三方面,提出了上述水凝胶的应用,所述应用为在制备创伤修复的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中,所述应用为在制备促进神经祖细胞向神经元方向分化的产品中的应用。
根据本发明的实施方式,至少具有以下有益效果:本发明制备的水凝胶,通过对普鲁兰多糖进行氧化改性将它的羟基氧化成醛基,与羧甲基壳聚糖的氨基形成席夫碱键,赋予了水凝胶自愈合性质,同时交联很稳定,降解速度适中,且拥有适于促进干细胞向神经元方向分化的机械性能,是一种很好的培养干细胞、促进神经分化的材料,且便于注射到体内治疗脊髓损伤。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明,其中:
图1为本发明测试例中的不同配比的Opu-CMCS水凝胶的弹性模量对比结果图;
图2为本发明测试例中的不同配比的Opu-CMCS水凝胶的成胶时间的对比结果图;
图3为本发明测试例中不同配比的Opu-CMCS水凝胶的交联情况对比结果图;
图4为本发明测试例中的红外光谱表征结果图;
图5为本发明测试例中的扫描电镜结果图,其中,标尺为100μm;
图6为本发明测试例中的扫描电镜结果图,其中,标尺为100μm;
图7为本发明测试例中的Opu-CMCS水凝胶体外降解曲线图;
图8为本发明测试例中的Opu-CMCS水凝胶的细胞毒性验证结果图;
图9为本发明测试例中的Opu-CMCS水凝胶包埋NPC 1天、3天、5天和7天的活死细胞荧光染色图,其中,标尺为100μm;
图10为本发明测试例中的Opu-CMCS水凝胶包埋NPC1天、3天、5天和7天的细胞存活率的比较结果图;
图11为本发明测试例中的包埋在Opu-CMCS水凝胶中的神经祖细胞形态图,其中,标尺为100μm;
图12为本发明测试例中的Opu-CMCS水凝胶包埋NPC在分化培养基中诱导分化7天的免疫荧光染色图,其中,标尺为100μm;
图13为本发明测试例中的脊髓损伤后小鼠后肢运动功能评分结果对比图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种水凝胶(Opu-CMCS水凝胶),其制备方法如下:
(1)将2质量份的普鲁兰多糖充分溶于水,溶解浓度为1%w/v。
(2)向普鲁兰多糖水溶液中加入1质量份的高碘酸钠。
(3)在磁力搅拌器上避光、室温反应6小时后,加入乙二醇(体积为反应溶液总体积的2%)再搅拌2小时终止反应。
(4)将上述溶液转移到渗析袋(MW=7000Da)中,在去离子水中渗析至少3天,每天至少换3次水,之后冻干,得到白色絮状物,即为氧化普鲁兰多糖样品。
(5)将羧甲基壳聚糖,用PBS缓冲液溶解,配制成浓度为3%w/v的羧甲基壳聚糖溶液。将氧化普鲁兰多糖用PBS缓冲液溶解得到浓度为3%w/v的溶液(现配现用),等溶液完全变透明后才可以使用。
(6)将上述两种溶液分别通过0.22μm的滤菌膜进行除菌,然后通过1:1的体积比(即质量比也为1:1)混合,45秒左右即可成形成稳定的水凝胶。
实施例2
本实施例提供了一种水凝胶,与实施例1的区别仅在于氧化普鲁兰多糖和羧甲基壳聚糖溶液的质量比为1:3。
实施例3
本实施例提供了一种水凝胶,与实施例1的区别仅在于氧化普鲁兰多糖和羧甲基壳聚糖溶液的质量比为1:2。
实施例4
本实施例提供了一种水凝胶,与实施例1的区别仅在于氧化普鲁兰多糖和羧甲基壳聚糖溶液的质量比为2:3。
实施例5
本实施例提供了一种水凝胶,与实施例1的区别仅在于氧化普鲁兰多糖和羧甲基壳聚糖溶液的质量比为3:2。
实施例6
本实施例提供了一种水凝胶,与实施例1的区别仅在于氧化普鲁兰多糖和羧甲基壳聚糖溶液的质量比为3:1。
测试例
1、氧化普鲁兰多糖-羧甲基壳聚糖水凝胶的表征
(1)OPu-CMCS水凝胶配比的筛选
1)水凝胶的弹性模量的检测
用Kinuxus Pro+旋转流变仪对实施例1-6制备的水凝胶进行频率扫描测试,选用直径为40mm的平行板,分别取1.6mL不同配比OPu-CMCS水凝胶(即实施例1-6制备的水凝胶)到加样台上,间距设置为1mm在37℃下,设置应变(λ)为1%,动态振荡扫描频率1Hz-25Hz,记录不同水凝胶的弹性模量(G’)。
2)水凝胶的成胶时间检测
在无菌环境中,在小玻璃瓶中制备等体积(600μL)不同配比的OPu-CMCS水凝胶(即实施例1-6制备的水凝胶),由于水凝胶是无色透明的,为方便观察,事先在前体溶液中加入少量中性色素,用倾斜法(倾斜玻璃管时水凝胶不再流动)测定水凝胶的成胶时间。
3)水凝胶的交联情况检测
待步骤2)中的小瓶的水凝胶充分成胶后,在每个小瓶中沿壁加入1mL无菌PBS缓冲液,将水凝胶置于细胞培养箱中孵育,模拟细胞培养的过程,在1、3、5天时将装有水凝胶的小瓶倒置,观察水凝胶的粘附情况和交联情况,第7天将小瓶中的水凝胶全部倒出,观察不同配比水凝胶的交联情况。
检测结果如图1-3所示,从图1中可以看出,用于NPC培养的水凝胶最佳弹性模量是(G’)0.1~1kPa,OPu和CMCS配比为1:2、2:3、1:1、3:2和2:1时都符合要求;由于成胶时间既要足够在水凝胶成胶前注射到脊髓损伤部位,又不能成胶太慢导致注射到损伤部位后不能及时成胶从而流失、影响伤口的缝合,从图2中可以看出,OPu和CMCS配比为1:1和3:2时成胶时间在45秒~2分钟之间,较为适合;从图3中可以看出,水凝胶的交联要足够强才能满足细胞培养的要求,NPC诱导分化为神经元的实验至少需要7天,在此期间需要每天更换培养基,如果水凝胶交联较弱,则会在用于细胞培养及实验处理的过程中解离,使得实验无法进行。如图,在模拟细胞培养条件7天后,之后配比为1:1和3:2的水凝胶还处于交联状态,其中1:1配比的水凝胶交联最为稳定,其余配比的水凝胶完全解离成液态,且配比1:1的水凝胶粘附性最好,第5天时还能粘附在小瓶底部。因此,后续实验采用实施例1制备的水凝胶进行。
(2)红外光谱表征
将实施例1中步骤(4)制备的氧化普鲁兰多糖冻干样品、步骤(5)中的羧甲基壳聚糖粉末、步骤(6)制备的氧化普鲁兰多糖-羧甲基壳聚糖水凝胶的冻干后的样品分别制样,用红外光谱仪测定三种样品的红外光谱。
检测结果如图4所示,从图中可以看出,氧化普鲁兰多糖-羧甲基壳聚糖水凝胶相较氧化普鲁兰多糖冻干样品和羧甲基壳聚糖粉末透射比显著降低,表明,氧化普鲁兰多糖和羧甲基壳聚糖发生了交联。
(3)扫描电镜(SEM)表征
将实施例1制备得到的水凝胶样品冷冻干燥,利用导电胶将冻干样品粘附在适当大小的铜片上,通过真空蒸发器在样品表面上喷镀铂金膜以增强样品的导电性,之后用扫描电子显微镜(SEM)观察样品的内部结构。
放大40倍的检测结果如图5所示,放大50倍的检测结果如图6所示,从图中可以看出该水凝胶内部呈现出疏松多孔的特点,可清晰看到交联的网络。
2、体外降解性质分析
将现配的浓度为3%w/v的1mL氧化普鲁兰多糖溶液和1mL羧甲基壳聚糖溶液混合均匀,静置1min至成胶完全。将水凝胶进行冻干,将冻干的水凝胶进行称重,加入无菌的PBS缓冲液(pH 7.4),将水凝胶完全浸泡在PBS中,每隔3天将水凝胶冻干称重,水凝胶的剩余重量比(%)=(Wt-W0)×100%/W0,W0为初始水凝胶干重,Wt为不同时间点的水凝胶干重。每个时间间隔设置三组平行实验。
结果如图7所示,从图中可以看出,本发明方案制备得到的水凝胶可以自然降解,水凝胶的可降解性非常重要,是用于体内治疗疾病的前提。
3、细胞毒性实验
配制不同浓度的Opu溶液(当天配制)和CMCS溶液(2%、3%、4%、6%、8%、10%),将两者等体积混合均匀,静置成胶,冷冻干燥。加入NPC增殖培养基将水凝胶冻干样品完全浸润,培养基和水凝胶样品体积比为10:1,在4℃条件下放置24h,获得水凝胶浸提培养基,使用前先通过0.22μm的滤菌膜除菌后再加入细胞孔板中。在96孔板中每孔接种2×104的NPC,每孔加入100μL NPC增殖培养基,24h之后,弃去培养基,在对照组细胞孔板中每孔加入100μL NPC增殖培养基,在实验组细胞孔板中每孔加入100μL不同浓度水凝胶浸提过的浸提培养基(2%、3%、4%、6%、8%、10%)。弃去上述细胞孔板中的培养基,每孔加入10μL CCK-8和90μL NPC增殖培养基,轻轻震荡混匀,在37℃、含5% CO2的细胞培养箱中避光孵育2h,用酶标仪在450nm下测定吸光值,计算不同浓度水凝胶的浸提培养基对NPC存活率的影响。
结果如图8所示,从图中可以看出,本发明制备的水凝胶基本没有细胞毒性。
4、活死细胞染色
在单个12孔板中接种5×105个神经祖细胞,第二天将3%浓度的水凝胶前体溶液(实施例1制备得到的3%w/v无菌的氧化普鲁兰多糖溶液、3%羧甲基壳聚糖溶液,体积比为1:1)加到接种有细胞的孔板中,加入神经祖细胞维持培养基,每天更换培养基,在不同时间点(1d、3d、5d、7d)对细胞进行AM/PI荧光染色,用倒置荧光显微镜对染色后的神经祖细胞进行成像,观察细胞的存活情况,统计细胞存活率。
结果如图9和图10所示,从图中可以看出,本发明制备的水凝胶具有很好的生物相容性。
5、水凝胶包封神经祖细胞
将羧甲基壳聚糖,用PBS缓冲液溶解,浓度为3%w/v,得到羧甲基壳聚糖溶液。将氧化普鲁兰多糖用PBS缓冲液溶解得到3%w/v浓度的溶液,等溶液完全变透明后才可以使用,现配现用。将上述两种溶液分别通过0.22μm的滤菌膜除菌。将所需神经祖细胞(体积不超过1体积的普鲁兰多糖溶液)加入1体积除菌后的羧甲基壳聚糖溶液中,立即加入1体积除菌后的氧化普鲁兰多糖溶液,用移液枪迅速轻柔吹吸3次,转移到细胞孔板中,静置30秒至1分钟即可成胶。之后加入相应培养基,按时换液,观察并记录细胞状态。在显微镜下观察,包埋在水凝胶中的神经祖细胞形态如图11所示,从图中可以看出,细胞在水凝胶中形态正常,可清晰看到细胞触角,这说明神经祖细胞能在水凝胶中存活并生长。
6、细胞分化实验
在单个12孔板中接种2.5×105个神经祖细胞,用维持培养基培养,第二天将3%浓度的水凝胶前体溶液(实施例1制备得到的3%w/v无菌的氧化普鲁兰多糖溶液、3%羧甲基壳聚糖溶液,体积比为1:1)加到接种有细胞的孔板中,待水凝胶凝固后,加入分化培养基培养,对照组不加水凝胶。每天更换新的分化培养基,在分化第8天对细胞进行免疫荧光染色实验,一抗采用NF200(神经丝)和TUJ1(神经元),观察神经祖细胞分化过程中的活性,测定神经祖细胞向神经元方向分化的程度。
结果如图12所示,从图中可以看出,本发明制备的水凝胶能维持NPC的活性和分化能力,且能促进神经祖细胞向神经元方向分化。
7、水凝胶移植实验
配制1mL浓度为3%w/v无菌的氧化普鲁兰多糖溶液、羧甲基壳聚糖溶液和神经祖细胞(NPC)悬液备用。
构建小鼠T10脊髓半切动物模型:手术前一天,实验小鼠按照10mg/kg的剂量注射环孢菌素A,术前6h禁食。雌性C57小鼠(体重在25±5g,6-8周)用戊巴比妥(10mg/kg)腹腔注射麻醉,电动剃毛器剃背部毛发,取动物俯卧位固定于手术板上,医用碘伏消毒手术区皮肤。触及小鼠背部,找到胸椎最高点,往上数3个棘突对应的椎体位置即为胸椎T10节段。在T9~11节段对应背部行正中直切口,止血钳钝性分离开口皮肤与肌肉层之间的黏膜。辅助固定钩拉开两侧皮肤,充分暴露手术区肌肉视野,眼科剪于中线(棘突边缘)两侧肌肉行直切口。如有少量出血,使用棉签清洁手术区,眼科剪剪掉T9~11节段区域棘突及其他少量多余肌肉组织,充分暴露T9~11节段椎板。左手握住小鼠腋下两侧固定小鼠并使其脊柱稍往上提,右手持止血钳咬除T10节段椎板,暴露T10节段脊髓。使用自制辅助弯钩(1mL注射器制作)伸入暴露的T10节段脊髓下方,稍向上挑起脊髓。使用眼科剪从脊髓中线剪断挑起的T10节段一半的脊髓,伤口处用少量青霉素钠消炎,制备得到动物模型。OPu-CMCS gel+NPC组为取5μL NPC悬液(细胞数5×105)与6μL羧甲基壳聚糖溶液混合均匀,再加入6μL氧化普鲁兰多糖溶液,轻柔地吹吸3次,之后用1mL注射器将上述混合液快速转移到脊髓损伤的处,待1分钟稳定成胶后,缝合内层肌肉和创口皮肤(逐层缝合),止血钳夹闭缝合处皮肤,酒精棉球,干棉球擦净创口周围血迹并消毒,将小鼠俯卧位放回笼中,正常饮食饲养;Model组为模型对照组,与OPu-CMCS gel+NPC组的区别在于不添加Opu-CMCS水凝胶和NPC;NPC组与OPu-CMCS gel组的区别在于不添加Opu-CMCS水凝胶;Opu-CMCS水凝胶与OOPu-CMCS gel+NPC组的区别在于不添加NPC。
在造模和移植后对各组小鼠进行观察,在第7d、14d、21d、28d、35d、42d,采用BBB(Basso,Beattie,and Bresnahan locomotor rating scale)评分标准对每个实验组的小鼠进行打分,BBB评分是反映脊髓损伤后小鼠后肢运动功能的重要标准。正常小鼠运动功能得分为满分21分,术后刚苏醒时BBB评分为0分。评分结果如图13所示,术后7d时,四个组(Model、NPC、OPu-CMCS gel和OPu-CMCS gel+NPC组)几乎没有评分差异。第42d时,OPu-CMCSgel+NPC组的小鼠运动功能恢复最好,评分接近10分,OPu-CMCS gel组的评分接近6分。而Model和NPC两组的评分一直在4分以下。这说明,OPu-CMCS gel能显著促进了脊髓损伤小鼠运动功能的恢复。
壳聚糖(CS)由乙酰基葡萄糖胺和D-葡萄糖胺单元通过β-(1-4)键连接而成。壳聚糖(CS)是一种天然阳离子多糖,具有生物相容性、生物降解性、无毒、抗菌和抗氧化活性,在化学、生物、医学等领域具有广阔的发展和应用前景。然而,壳聚糖的分子链上含有大量的氨基和羟基,会形成分子内和分子间氢键,使得它在水中的溶解性差,在很大程度上限制了它的应用。因此,使用羧甲基壳聚糖合成水凝胶会较壳聚糖有更大优势。羧甲基化壳聚糖(CMCS)作为一种改性壳聚糖,是一种重要的水溶性壳聚糖衍生物,具有低毒、生物降解性、生物相容性、血液稳定性以及良好的成膜和成胶能力。因此,羧甲基纤维素已广泛用于许多生物医学材料,如保湿剂、杀菌剂、伤口敷料、人工组织、血液抗凝剂和药物传递基质。普鲁兰多糖(Pullulan,Pu)是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖,主要由麦芽三糖通过a-1,6糖苷键连接而成。普鲁兰多糖能迅速溶解于冷水或温水,溶解速度比羧甲基纤维素、海藻酸钠等快二倍以上,溶液中性,不离子化、不凝胶化、不结晶,且水溶液粘性较低,不会形成胶体,是粘附性强的中性溶液,很容易通过滤菌膜除菌。最重要的是,普鲁兰多糖不会引发任何生物学毒性,能够自然降解,用于食品和医药工业十分安全。对普鲁兰多糖进行氧化改性可以将它的羟基氧化成醛基,氧化普鲁兰多糖(OPullulan,Opu)的醛基和羧甲基壳聚糖的氨基形成席夫碱键,赋予了水凝胶自愈合性质,同时交联很稳定,降解速度适中,且拥有适于促进干细胞向神经元方向分化的机械性能(弹性模量在0.1~1kPa之间),是一种很好的培养干细胞、促进神经分化的材料,且便于注射到体内治疗脊髓损伤。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明,但是本发明不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种水凝胶,其特征在于,所述水凝胶由氧化普鲁兰多糖、羧甲基壳聚糖和溶剂制备得到。
2.根据权利要求1所述的水凝胶,其特征在于,所述溶剂选自水、生理盐水或缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的水凝胶,其特征在于,所述氧化普鲁兰多糖和羧甲基壳聚糖的质量添加比为(1~3):(3~1)。
4.一种水凝胶的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:将氧化普鲁兰多糖、羧甲基壳聚糖和溶质进行混合,得到所述水凝胶。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述氧化普鲁兰多糖的制备方法包括以下步骤:在普鲁兰多糖水溶液中加入高碘酸盐反应后,加入醇类溶剂终止反应,得到反应溶液;将所述反应溶液进行透析,即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述普鲁兰多糖水溶液中的普鲁兰多糖与高碘酸盐的添加质量比为(1~3):(1~2)。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述反应溶液中,醇类溶剂的添加量占总反应体积的1%~3%。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述透析采用渗析袋进行;优选地,所述渗析袋的分子量为6000~8000Da。
9.权利要求1-3任一项所述的水凝胶在制备创伤修复的产品中的应用。
10.权利要求1-3任一项所述的水凝胶在制备促进神经祖细胞向神经元方向分化的产品中的应用。
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