CN111012803A - 用于引导组织再生的生物材料装置和局部组合物 - Google Patents

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Abstract

用于引导组织再生(GTR)的装置包括壳聚糖和可变胶原组织(MCT)的基质，其中壳聚糖静电结合到MCT以形成MCT‑壳聚糖复合材料。MCT可以从无脊椎动物海洋生物中分离，诸如海绵、水母、软体动物和棘皮动物。MCT‑壳聚糖复合材料可以配制成生物膜、3D‑海绵、水凝胶或电纺纳米纤维，或MCT‑壳聚糖复合材料可以涂覆生物材料表面。该装置可包括伤口敷料和组织海绵(包括3D海绵)。应用包括组织工程和伤口愈合以及烧伤和其他相关的引导组织再生应用。包含在药学上可接受的局部载体中的MCT和MCT‑壳聚糖复合材料也具有药妆应用，用于治疗瘢痕以及皮肤变色和各种色素沉着问题(包括肝斑/黄褐斑)。

Description

用于引导组织再生的生物材料装置和局部组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年9月6日提交的申请号为16/123,942的美国非临时专利申请的优先权，并通过引用将该非临时申请的全部内容并入本文。
技术领域
本发明涉及用于引导组织再生(GTR)的生物材料装置。更具体地，本发明涉及包含用于实现GTR的可变胶原组织(MCT)的组织海绵、伤口敷料、药妆组合物和其他装置以及局部组合物。更具体地，本发明涉及包含用于实现GTR的MCT和壳聚糖生物聚合物(CHT) 的复合物的这种装置。本发明还涉及通过将MCT单独或作为复合物应用于生物材料装置中以促进GTR来治疗烧伤、伤口、溃疡和其它病变和相关的皮肤病。本发明还涉及通过在药妆制剂中应用MCT和/或MCT-壳聚糖复合物来治疗皮肤异常，诸如瘢痕和皮肤变色(包括黄褐斑的变色)。
背景技术
天然聚合物已用于许多药物应用和医疗器械技术中。一种天然聚合物壳聚糖(本文有时称为CHT)已用于制备纳米颗粒、微球体、水凝胶、膜、纤维和片剂。壳聚糖已用于制备潜在的药物递送系统，诸如口服制剂、鼻腔制剂、肠胃外制剂、透皮制剂和眼科制剂。壳聚糖也已用于制备伤口敷料和组织海绵(Kumar等，《化学评论》2004，104，6017-6084)。然而，壳聚糖制剂和材料存在许多缺点，包括受限的稳定性、生物降解性和拉伸强度。已经测试了诸如改性壳聚糖和合成复合材料的材料用于评估壳聚糖的许多相同用途，但是许多这些材料具有类似的缺点，包括生物相容性不足。
因此，需要新材料，其是可生物相容并且可生物降解，并且具有合适的稳定性和力学特性以及用于人类和其他哺乳动物治疗和疗法的性能。这些新材料和组合物优选具有优于单独的壳聚糖的优点，例如额外的和/或改进的生物相容性、高稳定性和改善的物理和生物特性。将这些材料用作组织海绵、伤口敷料、药妆品和/或用于递送治疗剂的系统的能力将进一步帮助生物医学工程、生物材料和组织工程领域的研究人员。
发明内容
本发明的实施例提供可生物降解和生物相容的可变胶原组织(MCT)和MCT-壳聚糖复合材料。这些复合材料可以形成各种材料，诸如水凝胶、生物膜、三维海绵和纳米纤维。MCT-壳聚糖复合材料比已知的壳聚糖材料更强并且具有更好的机械特性。复合物的MCT组分增加了生物相容性、细胞附着、物理和化学稳定性，以及改善了壳聚糖组分的机械特性、抗菌和止血特性，从而显著提高了复合物在治疗应用中的有效性。
因此，在一个方面，本发明提供了包含MCT或MCT和壳聚糖(CHT)的基质的组合物，其中MCT从海洋无脊椎动物中分离。在基质中，CHT可以通过静电相互作用(诸如氢键和偶极-偶极相互作用)与MCT连接，以形成MCT-CHT复合材料。在一个方面，MCT- 壳聚糖复合物包含MCT中GAG和胶原蛋白之间的聚电解质交联结构以及其与壳聚糖上的 N-葡糖胺单元的相互作用。可变胶原组织可包含胶原蛋白和糖胺聚糖(GAG)。
在一个方面，MCT可包含胶原蛋白和硫酸软骨素。组合物或用于形成组合物的MCT可基本上由I型胶原蛋白组成。壳聚糖可具有约60％至约99％的脱乙酰度。壳聚糖的平均分子量可为约20kDa至约400kDa。在一些实施例中，复合材料中MCT的质量比可以是复合材料中壳聚糖质量比的100:0至10:90。在一些实施例中，MCT的质量比为壳聚糖质量比的约100:0至50:50。
通过选择适当的海洋无脊椎动物来源(例如海绵、水母、软体动物和棘皮动物)和分离程序，可以控制以较高产率的胶原蛋白和糖胺聚糖获得的MCT的量和比例。例如，可以分离具有较高含量的I型胶原蛋白、作为若干结缔组织的关键结构组合物的原纤维型胶原的 MCT，并用于本文所述的组合物中。另外，分离的MCT可以根据原纤维胶原(I、II、III、V、XI)和糖胺聚糖(硫酸软骨素、透明质酸)的类型的性质以及它们的结构异质性而被偏置或控制。
在一个实施例中，MCT可以从海洋无脊椎动物(诸如海绵、水母、软体动物和棘皮动物)中分离。在更具体的实施例中，MCT将从海洋无脊椎动物棘皮动物(诸如海胆和海参) 中分离。在更具体的实施例中，MCT将从海参中分离。
在另一实施例中，MCT可以由胶原蛋白组成。在更具体的实施例中，胶原蛋白可以是I型、II型、III型、V型或XI型原纤维胶原。在更具体的实施例中，原纤维胶原是I型。通过本文所述的分离方法，可以选择性地分离I型原纤维胶原。
在另一实施例中，MCT可包含胶原蛋白和糖胺聚糖。在一些实施例中，糖胺聚糖可包括硫酸软骨素、透明质酸、肝素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和/或硫酸皮肤素或两种组分的混合物。在另一实施例中，MCT中的糖胺聚糖将包含硫酸软骨素和/或透明质酸或两种组分的混合物。
MCT和MCT-壳聚糖组合物可以是水凝胶、生物膜、3D-海绵或纳米纤维。纳米颗粒可以配制成各种治疗剂(诸如口服溶液、IV溶液或气溶胶)递送系统。生物膜可以形成伤口愈合、表面涂层或包装材料中。3D-海绵可以用作海绵，诸如用于组织工程和伤口敷料模板。纳米纤维可以配制成伤口敷料模板或表面涂层剂。
在一些实施例中，MCT和MCT-CHT复合材料可通过物理和/或化学方法交联。物理交联可以通过辐射处理(UV，γ)和/或热处理来完成。化学交联可以通过向MCT或MCT- 壳聚糖复合物中添加交联剂来实现，交联生物材料中使用的交联剂的量相对于MCT的含量可以为约0.1至约1.0％。可以使用的交联剂包括戊二醛、乙基-二甲基-碳二亚胺(EDC) -N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、核黄素、京尼平等。
MCT和MCT-壳聚糖复合材料也可以配制成3D-海绵的生物膜，其具有改善的吸水性、热稳定性、蒸气渗透性和细胞附着性。在这样的实施例中，生物膜和/或3D-海绵将适合作为组织工程的海绵以及用于手术和医学应用的伤口敷料模板。
本发明的方面还提供了将生物活性剂递送至哺乳动物的方法，该方法包括向哺乳动物施用本文所述的MCT或MCT-壳聚糖复合材料。MCT和MCT-壳聚糖复合材料可以形成纳米颗粒、纳米纤维、水凝胶、生物膜或3D-海绵，生物膜或3D-海绵包封生物活性剂(例如药物或营养物)。可以掺入制剂中的药物、维生素和营养素的示例包括脂质，诸如脂肪酸(包括ω-3和ω-6脂肪酸)、脂溶性维生素(例如，维生素A、D、E和/或K)，抗生素(例如，阿莫西林、氨苄青霉素、克林霉素、强力霉素、红霉素、甲硝唑、青霉素、四环素、万古霉素等)、益生菌(例如，乳酸菌、双歧杆菌等)、活性皮肤化合物(例如，视黄酸、氨甲环酸、过氧化氢、氢醌、半胱胺、壬二酸、酪氨酸酶抑制剂等)、微量营养素(诸如，β-胡萝卜素和/或抗坏血酸、蛋白质和多肽)。在一些实施例中，MCT和其他营养补充剂也可包含在MCT- 壳聚糖复合基质中或包含在包括MCT-壳聚糖复合基质中的组合物中。
通过改变组分的量和制备MCT和复合材料的方法，可以调整MCT和MCT-壳聚糖复合材料以在各种条件下在一定的速率范围内降解。因此，本发明的方面还提供了制备MCT 和MCT-壳聚糖复合材料的方法。本发明的方面进一步提供本文所述的组合物用于制造生物医学装置和药物，所述生物医学装置和药物可用于治疗哺乳动物(诸如人)中的细菌感染和/或真菌感染、烧伤、糖尿病足和炎性病症等病症。
在更进一步的方面，MCT和MCT-壳聚糖复合生物材料可以作为治疗性化妆品或药妆品提供，并通过将MCT或MCT-壳聚糖复合物与药学上可接受的局部载体结合使用，以促进胶原形成、瘢痕愈合、伤口愈合、减少肝斑和黄褐斑以及其它皮肤相关益处，所述载体包括但不限于溶液、悬浮液、液体、凝胶、软膏、洗剂或乳膏。
附图说明
以下附图构成说明书的一部分，并且包括在内以进一步说明本发明的某些实施例或各个方面。在一些情况下，通过参考附图结合本文给出的详细描述，可以最好地理解本发明的实施例。描述和附图可以突出显示本发明的某个特定示例或某个方面。然而，普通技术人员将理解，示例或方面的部分可以与根据本发明实施例的其他示例或方面组合使用。
在附图中：
图1A和图1B描绘了一般胶原蛋白结构和一般MCT结构之间的比较结构。
图2描绘了糖胺聚糖的总体结构。
图3A和图3B描绘了牛胶原蛋白和MCT之间的胶原原纤维结构的比较形态。
图4描绘了壳聚糖的总体结构。
图5A和图5B是根据实施例制备MCT-壳聚糖复合材料的示意图。
图6是根据实施例制备MCT-壳聚糖复合生物膜的示意图。
图7是根据实施例制备MCT-壳聚糖复合物3D-海绵的示意图。
图8是根据实施例制备MCT-壳聚糖复合水凝胶的示意图。
图9A是制备MCT-壳聚糖电纺纳米纤维的示意图，图9B是根据实施例的所得纳米纤维的照片。
图10A描绘了交联剂(戊二醛0.1％v/v)对MCT-CHT复合生物膜的机械特性的影响，图10B描绘了根据实施例的MCT-CHT复合生物膜的溶胀行为。
图11A和图11B描绘了MCT-壳聚糖生物膜的说明性表示及其作为伤口敷料模板的潜在应用，图11C和图11D描绘了通过扫描电子显微镜(SEM)对MCT-壳聚糖复合电纺纳米纤维的形态表征。
图12是用于GTR应用的不同MCT-壳聚糖复合材料的示意图。
图13A至图13C描绘了根据实施例以不同MCT/CHT质量比制备的MCT-壳聚糖 (MCT/CHT)复合3D-海绵的物理表观。
图14描绘了以不同MCT/CHT质量比配制的MCT-壳聚糖复合物3D-海绵的TGA热分析图。
图15描绘了以不同MCT/CHT质量比配制的不同MCT-壳聚糖复合3D-海绵的吸水能力。
图16A(未添加细胞)和图16B(添加了细胞)是SEM显微照片，显示ADSC细胞在MCT-CHT 3D-海绵上的吸附。
图17描绘了在15天孵育期间在MCT-壳聚糖复合物3D-海绵上培养的ADSC细胞的增殖曲线。
图18描绘了以不同质量比的MCT-壳聚糖复合物制备的复合电纺纳米纤维(ESNF)的ATR-FTIR光谱。
图19描绘了通过TGA对壳聚糖、MCT和MCT-壳聚糖复合物的热分析。
图20A至图20C是壳聚糖的SEM显微照片，图20D至图20F是MCT-壳聚糖ESNF 的SEM显微照片，比例尺为10μm(图20A和图20D)，比例尺为2μm(图20B和图20E) 和比例尺为200nm(图20C和图20F)，其中圆圈表示与壳聚糖ESNF中的不良静电纺丝过程相关的液滴的存在，显示了MCT-壳聚糖复合物用于获得电纺纳米纤维的改进。
图21描绘了与壳聚糖、MCT和MCT-壳聚糖复合物ESNF共培养的L929成纤维细胞的增殖。
图22A至图22C是SEM显微照片，显示了在孵育7天后细胞粘附到壳聚糖(图22A)、MCT-壳聚糖复合物(图22B)和MCT(图22C)ESNF上。
图23描绘了凝胶电泳分析(SDS-PAGE)，显示了与从小牛和鸡提取的胶原蛋白样本相比MCT的主要蛋白质条带。
图24描绘了凝胶电泳分析(SDS-PAGE)，其显示了来自海参的MCT分离过程的功效，如批次间MCT的蛋白质条带的一致性所示。
图25A描绘了与小牛胶原蛋白相比的MCT胶原蛋白的FTIR-红外光谱，显示了两个样本之间的化学结构差异，图25B描绘了显示来自海参的MCT分离过程的功效的比较性FTIR光谱，如批次间MCT的FTIR化学曲线的一致性所示。
图26描绘了胶原蛋白样本的热重分析(TGA)，显示了MCT和小牛胶原蛋白样本的热行为差异。
图27显示了从海参提取的可变胶原组织中存在的胶原蛋白结构氨基酸组成的分布，并与从小牛皮分离的牛胶原蛋白进行比较。
图28A和图28B是扫描电子显微镜(SEM)图片，显示通过溶剂浇铸技术制造的MCT-壳聚糖敷料模板(3D-海绵)的形态和孔隙率。
图29A和图29B是扫描电子显微镜(SEM)图片，显示通过静电纺丝技术制造的MCT-壳聚糖纳米纤维敷料模板的表面形态和结构。
图30A和图30B是显示根据实施例的瘢痕乳膏施用效果的施用之前和之后的照片。
图31A和图31B是显示根据实施例的瘢痕乳膏施用效果的施用之前和之后的附加照片。
图32A至图32C是显示根据实施例的瘢痕乳膏施用效果的施用之前和之后的进一步照片。
图33A和图33B是显示根据实施例的瘢痕乳膏施用效果的施用之前和之后的进一步照片。
图34A至图34D是显示根据实施例的瘢痕乳膏施用效果的施用之前和之后的进一步照片。
图35A至图35C描绘了MCT-CHT基质结构。
图36描绘了根据实施例的伤口海绵及其特性和特征。
图37描绘了根据实施例的3D海绵的功能。
图38描绘了根据实施例的装置的功能。
具体实施方式
根据本发明的方面，本申请描述了新型可生物降解的、可生物相容的复合材料，其包含可变胶原组织(MCT)和壳聚糖的组合。MCT和MCT-壳聚糖复合物用途极为广泛，可配制成各种生物材料，诸如皮肤贴片、三维海绵、可生物降解的缝合线以及组织工程中细胞增殖的海绵以及用于组织再生的水凝胶和生物膜。
另外，MCT和MCT-壳聚糖复合材料也可以配制成3D-海绵的生物膜，其具有改善的吸水性、热稳定性、蒸气渗透性和细胞附着性。在这样的实施例中，生物膜和/或3D-海绵将适合作为组织工程中引导组织再生的海绵以及用于手术和医学应用的伤口敷料模板。
定义：如本文所用，某些术语具有以下含义。如本领域普通技术人员将理解的，本说明书中使用的所有其他术语和短语具有其平常和普通的含义。这种平常和普通的含义可以通过参考技术词典来获得，诸如R.J.Lewis、John Wiley&Sons的Hawley's CondensedChemical Dictionary(霍利简明化学词典)第14版，纽约，N.Y.，2001。
说明书中对“一个实施例”、“实施例”、“示例实施例”等的引用指示所描述的实施例可包括特定方面、特征、结构、部分或特性，但不是每个实施例必须包括该方面、特征、结构、部分或特性。此外，这些短语可以但不一定是指在说明书的其他部分中提到的相同实施例。此外，当结合实施例描述特定方面、特征、结构、部分或特性时，在本领域普通技术人员的知识范围内与其他实施例(无论是否明确描述)一起影响这些方面、特征、结构、部分或特性。
术语“和/或”表示项目中的任何一个、项目的任何组合或与该术语相关联的所有项目。
除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式。因此，例如，对“化合物”的引用包括多种这样的化合物，因此化合物X包括多种化合物X.
术语“约”可以指代指定值变化±5％、±10％、±20％或±25％。例如，在一些实施例中，“约50％”可以表示45％至55％的变化。对于整数范围，术语“约”可以包括比所述整数大和/ 或小一个或两个整数。除非本文另有说明，否则术语“约”旨在包括所述范围附近的值，例如在各个成分、组合物或实施例的功能方面等同的重量百分比。另外，所述范围(例如，重量百分比、碳族等)包括该范围内的每个具体值、整数、小数或同一性。本文列出的范围等的具体值仅用于说明；它们不排除定义范围内的其他定义值或其他值。
本领域普通技术人员特别是在其使用的上下文中阅读时容易理解短语“一个或更多个”。例如，如果例如苯环是二基取代的，苯环上的一个或更多个取代基是指一至五、或一至多达四。
术语“接触”是指触摸、进行接触或使得紧邻或近距离的行为(包括在分子水平上)，例如在溶液或其他反应混合物中引起化学反应或物理变化。
“有效量”通常是指提供期望效果的量。因此，有效量是指足以增强对被治疗的疾病状态或病症的疗效的剂量。因此，有效量可以根据患者、疾病和受影响的治疗而变化。
术语“患者”或“受试者”是指任何动物，诸如哺乳动物，包括小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马、灵长类动物和人。
关于MCT，短语“基本上包含胶原蛋白”是指MCT至少包含原纤维胶原蛋白。例如，MCT原纤维胶原蛋白可包含I型、II型、III型、V型和/或XI型胶原蛋白。在一个方面，MCT 原纤维胶原蛋白将表征为I型。可以在本文描述的复合物中明确包括或排除的其他化合物包括II型、III型、V型和/或XI型原纤维胶原蛋白或其组合。术语“糖胺聚糖”是指包含含有重复二糖单元的长的无支链多糖的分子，包括例如硫酸软骨素、透明质酸、肝素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和/或硫酸皮肤素。
可变胶原组织(MCT)：棘皮动物是在所有海洋中广泛分布的海洋无脊椎动物，并且数十年来一直用作食物来源(例如海参和海胆)。它们也因其特有的结缔组织(称为可变胶原组织(MCT))而闻名，该组织能够在神经系统控制下迅速改变其被动机械特性(刚度和粘度)。MCT是棘皮动物的独特特征，已在所有五个现存类别中进行了描述(IC Wilkie，“Mutable collagenous tissue：overview and perspectives(可变胶原组织：概述和观点)”，V. Matranga(Ed.)，Echinodermata.Progress in Molecular and SubcellularBiology(分子和亚细胞生物学进展)。Marine Molecular Biotechnology(海洋分子生物技术)，第5卷，Springer，柏林(2005年)，第221-250页。可变胶原结构由不连续的胶原原纤维组成，胶原原纤维通过原纤蛋白微纤维的弹性网络组织成束(纤维)并通过由糖胺聚糖组成的应力转移基质相互连接，所述糖胺聚糖结合到原纤维并聚集原纤维。这种类型的组织最近被提出作为组织工程和再生医学应用的“智能动态生物材料”的灵感来源(A.Barbaglio,S.Tricarico,C.Di Benedetto, D.Fassini,A.P.Lima,A.R.Ribeiro,C.C.Ribeiro,M.Sugni,F.Bonasoro,I.C.Wilkie,M. Barbosa,M.D.Candia Carnevali,“The smartconnective tissue of echinoderms:a materializing promise for biotechapplications(棘皮动物的智能结缔组织：生物技术应用的物化承诺),”Cah. Biol.Mar.,54(2013),第713-720页；C.Di Benedetto,A.Barbaglio,T.Martinello,V.Alongi,D.Fassini,E.Cullorà,M.Patruno,F.Bonasoro,M.A.Barbosa,M.D.Candia Carnevali,M.Sugni, “Production,characterization and biocompatibility of marine collagenmatrices from an alternative and sustainable source:the sea urchinParacentrotus lividus”(“来自替代可持续来源(海胆 (Paracentrotus lividus))的海洋胶原蛋白基质的生产、表征和生物相容性”)，Mar. Drugs,12(2014),第4912-4933页)。特别地，海参膜(众所周知的MCT)可以提供可持续的和生物相容的天然原纤维胶原蛋白来源，以产生用于再生医学应用的薄膜。图1示出了左侧的一般胶原蛋白结构(在这种情况下是牛胶原蛋白)，右侧是MCT的总体结构。在MCT 的情况下，图1的右手侧示出了该结构的一部分的分解图，在纤维间基质之间和胶原原纤维之间具有蛋白多糖-CAG交联。
在“蓝色生物材料”中，海洋无脊椎动物胶原蛋白本身作为最常用的哺乳动物源胶原蛋白(例如，图1左侧所示的牛胶原蛋白)的有效替代物。哺乳动物源胶原蛋白通常用于广泛的人类应用，从诸如食品、药物/营养品工业和化妆品等大规模用途到更具针对性的领域(诸如细胞培养和生物医学/临床应用)。然而，由于过敏问题、宗教和社会/生活方式的限制、疾病传播相关原因(例如牛海绵状脑病)和重组技术的高成本，不断研究替代哺乳动物的胶原蛋白来源(T.H.Silva,J.Moreira-Silva,A.L.P.Marques,A.Domingues,Y.Bayon,R.L.Reis, “Marine origin collagens and its potential applications(海洋起源胶原蛋白及其潜在应用)”，Mar. Drugs,12(2014),第5881-5901页)。
糖胺聚糖(其总体结构如下图2所示)是由重复二糖单元组成的长的无支链多糖。重复单元由氨基糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以及糖醛酸(葡糖醛酸或艾杜糖醛酸) 或半乳糖组成。糖胺聚糖具有高极性并吸引水分。因此，它们主要位于细胞表面或细胞外基质(ECM)中作为润滑剂或作为减震器对身体有用。
棘皮动物MCT的另一优点是相对容易获得保持其原始结构的大量天然胶原原纤维(Di Benedetto等，2014，上文引用)。实际上，大多数哺乳动物胶原蛋白通常以其水解(酸溶)形式使用，这种特性大大降低了所生产的膜/海绵的机械性能，并且在那些需要具有原纤维三维组织的高抗性材料的生物医学应用(例如腱/韧带再生或真皮重建)中受到限制。棘皮动物MCT可用于容易且快速地产生原纤维胶原膜，其在超微结构和机械特性方面与结缔组织的生理状况具有高度相似性。图3A和图3B示出了牛胶原蛋白(图3A)和MCT(图3B) 的胶原原纤维结构的比较形态。MCT原纤维通过GAG(葡糖胺聚糖)内部交联，从而为胶原蛋白的大分子结构提供更高的稳定性并降低其生物降解性，这是伤口愈合的重要方面并且是牛胶原蛋白缺乏的属性。图35A至图35C描绘了使用GAG的原纤维的交联。图35A示出了胶原蛋白原纤维的宏观排列，并说明通过由糖胺聚糖(GAG)和胶原蛋白核心蛋白之间的相互作用驱动的纤维内交联网络将对齐的纤维状结构保持在一起。图35B更详细地示出了纤维内交联网络。图35C描绘了强组织网状物的多向稳定性，使得改善体内机械性能和生物降解特性。
其中MCT原纤维胶原适用于商业应用的特定再生医学领域是引导组织再生(GTR)。GTR的目标之一是减少手术后组织粘连，这是常见且仅部分解决的并发症，其阻止正常的组织再生。粘连是手术后或由于局部炎症在组织或器官之间形成的异常附着物或细胞混合物。直到最近，研究人员才试图提供有效和令人满意的工具来克服它们。实际上，针对GTR已经测试了包含若干种不同生物材料(例如壳聚糖和透明质酸)的屏障膜，但它们都没有显示出所有必需的功能特性，其中最重要的功能特性是避免细胞渗透到下面的解剖学隔室中(S.Tang,W.Yang,X.Mao,“Agarose/collagen composite scaffold as an anti-adhesivesheet(作为抗粘片的琼脂糖/胶原复合支架)”，Biomed.Mater.,2(2007),第S129-S134页)。基于棘皮动物MCT的膜具有根据需要进行修改的多孔性和三维结构。
壳聚糖：几丁质是由聚N-乙酰葡糖胺组成的生物聚合物。几丁质是世界上仅次于纤维素的第二丰富的生物聚合物。它通常存在于许多无脊椎动物的外骨骼或角质层(诸如海洋节肢动物的壳体)以及大多数真菌和一些藻类的细胞壁中。几丁质通常不溶于水，但可以通过用苛性碱(诸如氢氧化钠)处理来脱乙酰化，以形成可溶性阳离子多糖、壳聚糖。壳聚糖的化学名称是聚(β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖)。图4示出了壳聚糖的总体化学结构。
由HemCon Medical Technologies生产的基于壳聚糖的绷带和手术敷料最近被美国 FDA批准用作止血绷带，其具有已证实的针对多种有害生物(包括MRSA和acinetobacterbaumannii(鲍曼不动杆菌))的抗菌特性。绷带和敷料可用于快速止血(包括广泛的动脉出血)。材料的血液凝固和抗菌特性均可归因于壳聚糖(参见美国专利号7,482,503(Gregory等人)，其通过引用并入本文)。MCT-壳聚糖复合材料可用于代替本文所述组合物中的壳聚糖，同时仍可保持壳聚糖的有用特性(诸如粘膜粘附性、生物相容性和生物降解性)。
壳聚糖可从许多化学品供应商商购获得，诸如密苏里州圣路易斯的SigmaAldrich Co. (西格玛奥德里奇公司)。壳聚糖具有各种等级、平均分子量和脱乙酰度。
在一些实施例中，壳聚糖可以是“高分子量”壳聚糖。高分子量壳聚糖是指数均分子量为至少约100kDa、通常为约170kDa至约400kDa的壳聚糖。在一些实施例中，高分子量壳聚糖可具有至少约100kDa、至少约110kDa、至少约150kDa或至少约200kDa的分子量。在其他实施例中，高分子量壳聚糖可具有约100kDa至约400kDa、约120kDa至约400kDa、约 150kDa至约400kDa、约170kDa至约400kDa、100kDa至约300kDa、约120kDa至约300kDa、约150kDa至约300kDa、约170kDa至约300kDa的分子量。图4中“DA”的值可以是任何数量或范围，其产生近似本文所述的壳聚糖的N-乙酰基-D-葡糖胺含量的值。如本领域普通技术人员容易认识到的，如图4所示的壳聚糖也可以是部分乙酰化的。
其他实施例可包括低分子量壳聚糖。低分子量壳聚糖是指具有少于100个单体单元 (小于约18kDa或小于约20kDa)的壳聚糖分子。壳聚糖的分子量可以通过例如凝胶渗透色谱和毛细管粘度来确定。
壳聚糖可具有一定程度的脱乙酰化，其通常为至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％。替代地，壳聚糖可以完全脱乙酰化。
MCT-壳聚糖复合材料：由于MCT和壳聚糖的高分子量和电荷密度，壳聚糖通过由其带正电的氨基驱动的静电相互作用与MCT中的结构组分结合，以允许形成强氢键和偶极-偶极相互作用。这些相互作用使得能够开发稳定的生物材料，诸如水凝胶、生物膜、3D-海绵和纳米纤维。MCT-壳聚糖复合材料可用于GTR中以制备用于伤口愈合应用的皮肤贴片、药妆品和敷料。MCT-壳聚糖复合材料还可以用作水凝胶或海绵状材料或用于皮肤和软骨组织培养的支架、用作组织工程的基质以及用作生物医学装置的生物相容性涂层。
相对于已知的合成和动物胶原蛋白类装置，MCT和MCT-壳聚糖复合材料提供更高的生物相容性、改进的机械性能和优异的生物降解性。除了来自MCT-壳聚糖复合物的直接生物效应(抗菌、抗真菌和伤口愈合特性)之外，生物材料还可用于靶向或控释系统以包封用于口服、皮肤或呼吸递送的治疗剂。
如本文所述，纳米颗粒和生物膜可由MCT和壳聚糖制备。包含胶原蛋白的MCT特别适用于制备纳米颗粒。由于MCT主要包含原纤维胶原，因此MCT非常适合制备MCT-壳聚糖复合水凝胶、生物膜、3D-海绵和纳米纤维，与已知的基于动物胶原蛋白的生物材料相比，提供具有优异机械性能的复合生物材料。
MCT和MCT-壳聚糖复合生物材料可以在制备期间通过与生物相容性交联剂(戊二醛、ECC/NHS)反应的化学处理或通过在真空压力下热处理而交联。复合聚合物基质的溶胀可以产生更快的降解和机械性能的降低。交联减少或防止复合生物材料的自发膨胀，以增加机械性能和处理。
在一些实施例中，MCT和MCT-壳聚糖复合材料可包括或排除除壳聚糖或MCT之外的聚合物。例如，一些实施例包括葡聚糖、藻酸盐和/或源于纤维素的材料(诸如羟乙基纤维素)；其他实施例排除了这些中的一些或全部。一些实施例包括合成聚合物，诸如聚乙烯醇、聚己内酯或聚环氧乙烷，而其他实施例不包括它们中的一些或全部。
MCT、壳聚糖和组合产品的分析：可以使用多种方法分析和评估MCT、壳聚糖及其复合产品。这些技术包括质谱、机械性能(拉伸强度)和溶胀特性、扫描电子显微镜(SEM) 和原子力显微镜(AFM)以表征表面形态、用于复合生物材料热表征的差示扫描量热法(DSC)。在ASTM测量中表征复合生物材料的拉伸强度和溶胀特性。
本文所述的MCT和MCT-壳聚糖复合材料的分析表明，与仅包括壳聚糖的组合物相比，复合材料具有改善的稳定性、更高的药物负载能力、改善的药物释放性能、改善的细胞摄取、更大的孔隙率、改善的拉伸强度和热稳定性。该材料在体外也是非细胞毒性的。
伤口愈合：MCT和MCT-壳聚糖复合生物材料还具有用于伤口愈合应用的有价值的特性，这是因为它们相对于纯壳聚糖表现出增强的抑菌活性、改善的生物相容性和增强的机械特性。MCT-壳聚糖复合物表现出壳聚糖抗菌活性的增加。复合物与带负电的细菌表面结合以扰乱细胞膜。这些特性可通过配制可注射水凝胶、皮肤贴片和伤口敷料模板而应用于GTR 应用，以例如促进溃疡和烧伤愈合。MCT-壳聚糖复合物还可用作伤口和手术敷料中的止血剂。
MCT和MCT-壳聚糖复合生物材料可用于各种其他生物医学应用。由于具有诸如良好的血液相容性、增强的机械性能和细胞生长效率等生物相容性，MCT-壳聚糖复合物可用于手术应用和再生医学。MCT-壳聚糖复合膜的渗透性可通过等离子体处理来控制。因此，这种复合膜可用于透析。
上述美国专利号7,482,503(Gregory等人)描述了制备伤口敷料的方法。可以根据这些方法使用本文所述的MCT和MCT-壳聚糖复合材料代替Gregory等人描述的壳聚糖生物材料来制备伤口敷料。此外，MCT-壳聚糖复合物可用作医疗装置(诸如支架、导管和假体)的涂层，以防止在患者中形成有害的生物膜或菌血症，并且还促进生物模拟(bio-mimetization) 和骨整合。如SEM显微照片所示，MCT与壳聚糖的络合促进了胶原原纤维的表面改性，这增加了其3D-海绵支架的孔隙率。如机械分析和DSC量热法所示，还发现MCT改善了壳聚糖支架的物理性质，诸如拉伸强度、溶胀度和热稳定性。
组织工程：组织工程(TE)研究基于将细胞接种到多孔可生物降解的聚合物基质上。成功接种的主要因素是良好生物材料的可用性，良好生物材料用作细胞增殖和分化的临时基质或支架。最近，据报道壳聚糖及其衍生物作为海绵状材料的有吸引力的候选者，这是因为它们随着新组织的形成而降解，最终没有炎症反应或毒性降解。在TE应用中，壳聚糖的阳离子性质主要负责与阴离子糖胺聚糖、蛋白多糖和其他带负电的分子的静电相互作用。
如通过SEM显微照片所示，MCT与壳聚糖的络合促进壳聚糖膜的表面改性，这增加了其3D-海绵的孔隙率。如机械分析和DSC量热法所示，还发现MCT可改善壳聚糖生物膜的物理特性，诸如拉伸强度、溶胀度和热稳定性。MCT和MCT-壳聚糖复合生物材料可用于控制细胞的形态和功能，因此可用作GTR伤口愈合应用中的组织工程支架或基质。MCT和 MCT-壳聚糖复合生物材料也可以化学改性以用于TE应用。例如，可以通过将特定糖接枝到 MCT骨架来对复合物改性。某些细胞可以区别地识别特定的糖，从而为抗原呈递细胞(诸如B细胞、树突细胞和巨噬细胞)提供特异性识别。
药妆配制：本发明还提供包含本文所述的MCT和MCT-壳聚糖复合物的制剂以用作治疗性化妆品(药妆品)。可以将粉末或溶液形式的MCT和MCT-壳聚糖复合物添加到基础化妆品配方中以形成药物和/或功能性化妆品产品。这些药妆组合物可以用皮肤病学和/或药学上可接受的局部载体(包括但不限于溶液、悬浮液、液体、凝胶、软膏、洗剂或乳膏)进行配制。该组合物提供MCT和CHT向组织的延长释放，促进胶原形成、瘢痕愈合、伤口愈合、肝斑/黄褐斑或其它皮肤变色的减少以及对皮肤的其它益处。
化妆品组合物可通过普通技术人员已知的标准技术配制，诸如美国专利号9,980,894 (Herrmann等人)和美国专利号9,962,464(Herrmann等人)中描述的技术，这两个专利均通过引用并入本文。
可以并入制剂中的药物、维生素和营养素的示例包括脂质诸如脂肪酸(包括ω-3和ω-6 脂肪酸)、脂溶性维生素(例如，维生素A、D、E和/或K)、水溶性维生素(例如，维生素C、硫胺素、核黄素、烟酸、泛酸、维生素B6、叶酸、维生素B12)、抗生素(例如，阿莫西林、氨苄西林、克林霉素、强力霉素、红霉素、甲硝唑、青霉素，四环素、万古霉素等)、益生菌(例如，乳酸菌、双歧杆菌等)、活性皮肤化合物(例如，视黄酸、氨甲环酸、过氧化氢、氢醌、半胱胺、壬二酸、酪氨酸酶抑制剂等)、微量营养素(诸如，β-胡萝卜素和/或抗坏血酸、蛋白质和多肽)。
这些组合物和制剂通常含有至少0.1％的MCT或MCT-壳聚糖复合材料。当然，组合物和制剂的百分比可以变化，并且可以方便地为给定单位剂型重量的约2％至约60％。在这种治疗上有用的组合物中MCT和MCT-壳聚糖复合材料的量使得可以获得有效的剂量水平。
药妆组合物等也可含有以下物质：粘合剂，诸如黄原胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如二磷酸钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；和/或润滑剂，诸如硬脂酸镁。除了上述类型的材料之外，一些特定的药妆组合物可以含有液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。液体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和它们合适的混合物。例如，通过在分散体的情况下保持所需的粒径或通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以通过各种另外的抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来防止某些微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应该是药学上可接受的并且使用的量基本上无毒。
对于局部给药，MCT和MCT-壳聚糖复合材料可以以纯的形式施用。然而，通常期望将它们作为组合物或制剂以例如与皮肤病学和/或药学上可接受的局部载体(其可以是固体或液体)组合施用于皮肤。
有用的固体载体包括细碎的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液体载体包括水、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物，其中MCT或MCT-壳聚糖复合材料可以可选地借助于无毒的表面活性剂有效水平溶解或分散。可加入佐剂(诸如香料和另外的抗菌剂)以优化给定用途的特性。所得液体组合物可以从用于浸渍绷带和其他敷料的吸收垫施用，或使用泵型或气溶胶喷雾器喷洒到患病区域上。
诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料等增稠剂也可与液体载体一起使用以形成可涂抹的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等而直接施用于用户的皮肤。
可用于将MCT或MCT-壳聚糖复合材料递送至皮肤的有用皮肤病学组合物的示例是本领域已知的；例如，参见Jacquet等人(美国专利号4,608,392)、Geria(美国专利号4,992,478)、Smith等人(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)，所有这些专利通过引用并入本文。
本发明的方面提供治疗哺乳动物中与GTR相关的各种病症的治疗方法，包括对具有这种病症的哺乳动物施用有效量的本发明一个或更多个实施例的MCT或MCT-壳聚糖复合物。哺乳动物包括灵长类动物、人、啮齿动物、犬、猫、牛、绵羊、马、猪、山羊等。
以下示例旨在说明本发明的各方面，不应解释为缩小本发明的范围。本领域普通技术人员将容易认识到，这些示例提出了可以实施本发明的其他方式。应该理解，在保持在本发明的范围内的同时可以进行许多变化和修改。
实施例
实施例1.MCT-壳聚糖复合物：制备、数据和应用
药用级壳聚糖(通过1H NMR计算的脱乙酰度为92％；通过特定粘度测定法计算的平均分子量为185kDa)购自Sigma Aldrich(西格玛奥德里奇)(美国密苏里州圣路易斯)。可以在MCT-壳聚糖复合物的生产中控制脱乙酰度和平均分子量分布，以提供具有更高或更低脱乙酰度和/或更高或更低平均分子量的壳聚糖。
从海洋无脊椎动物棘皮动物中分离出可变胶原组织(MCT)。海胆、海星和海参的成年标本由中国、塔希提岛和日本等地的潜水员收集并立即进行解剖。收集海胆围口膜、海星对口臂壁和海参全身壁的标本并在-20℃下储存用于随后的Ferrario C.、Leggio L.、Leone R.、 Di Benedetto C.、Guidetti L.、CoccèV.、Ascagni M.、Bonasoro F.、La PortaCAM、Candia Carnevali MD、Sugni M的“Marine-derived collagen biomaterials fromechinoderm connective tissues(来自棘皮动物结缔组织的海洋源胶原生物材料)”、MarEnviron Res.(马尔环境研究所)、128 卷、第46-57页描述的胶原蛋白提取方案。根据每个国家的法律法规进行动物采集和实验操作。将海胆(围口膜)和海星(对口臂壁)解剖成小块，在人造海水中冲洗，并在室温(RT) 下在低渗缓冲液(10mM Tris，0.1％EDTA)中放置12小时，并且然后在室温下在脱细胞溶液(10mM Tris，0.1％十二烷基硫酸钠)中保持12小时。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤几次后，将样本置于解聚溶液(0.5M NaCl，0.1M Tris-HClpH8.0，0.1Mβ-巯基乙醇，0.05M EDTA-Na)中。将获得的MCT悬浮液过滤，并在室温下用0.5MEDTA-Na溶液(pH8.0)透析3小时，并在室温下对dH2O透析过夜。海星样本在脱细胞溶液和解聚溶液之间在1mM柠檬酸(pH 3-4)中进行另外的步骤，以尽可能多地除去新鲜组织中存在的碳酸钙小骨。所有步骤均在搅拌条件下进行。根据不同的方案从全身壁提取海参MCT。简言之，将起始组织切成小块，置于PBS和庆大霉素(40μg/mL)中，并在室温搅拌条件下放置至少5天，以获得 MCT悬浮液、并随后过滤。然后将从三个实验模型获得的悬浮液储存在-80℃下直至使用。
MCT-壳聚糖复合物的制备：将可变胶原组织(MCT)在室温下溶解在0.5％v/v的乙酸中过夜，并在制备生物材料和与壳聚糖的复合物之前脱气。通过在室温(RT)下将壳聚糖粉末溶解在乙酸水溶液(0.5％v/v)中来制备壳聚糖溶液。在壳聚糖粉末完全溶解后，将溶液过滤并通过真空过滤而脱气。图5A示意性地示出了根据实施例的壳聚糖溶液的溶解和脱气。然后将壳聚糖溶液(0.1-0.5％w/v)与棘皮动物分离的MCT(2.0-10.0％v/v)以不同的MCT-CHT 摩尔比(100:0、80:20、60:40、50:50、40:60、20:80和10:90)混合。将溶液在室温下搅拌反应1小时。图5B进一步示出了根据实施例的MCT-壳聚糖复合物的制备。通过添加不同比例的各组分以在形成复合材料的过程中控制壳聚糖和MCT的浓度，以提供期望的组合物。
MCT-壳聚糖复合生物膜的制备：将MCT-壳聚糖复合物溶液浇铸到玻璃或硅模具上并缓慢铺展以形成均匀的液体膜。然后将液体膜在80℃下蒸发24小时或在40℃下蒸发过夜，以提供2D浇铸复合生物膜。图6示出了根据实施例的MCT-壳聚糖生物膜的浇铸。
MCT-壳聚糖复合物3D-海绵的制备：MCT-壳聚糖3D-海绵通过在真空压力下热处理驱动通过交联方法制备。通过浇铸/冷冻干燥技术制备复合海绵(直径＝12mm，厚度＝6mm)(步骤3c)。将1克2％w/w壳聚糖水溶液或0.5％v/v乙酸溶液与MCT水溶液(0.5-2.5％v/v)混合，如图7所示。将所得混合物倒入足够大小的玻璃或硅模具中，在-20℃下冷冻，并冷冻干燥以除去溶剂，得到MCT-壳聚糖多孔3D-海绵。MCT-壳聚糖复合物3D-海绵在物理上类似于已知的壳聚糖海绵。然而，复合3D海绵具有显著的附加特性，诸如更高的保水性(溶胀)、改善的机械特性和优异的生物相容性。例如，MCT-壳聚糖复合物3D-海绵可用于提供改进的伤口和止血(凝血)敷料，这是因为壳聚糖的止血作用通过MCT组分的免疫静态特性而增加。MCT的添加还改善了其机械性能、细胞附着和生长。
MCT-壳聚糖复合水凝胶的制备：将MCT(2％v/v)、壳聚糖(1％w/v)复合溶液在 -20℃下冷冻并冷冻干燥以除去溶剂，留下粉末材料。将2克冻干的MCT-壳聚糖复合物溶解在100毫升去离子水中并剧烈搅拌，同时通过浓缩的NaOH 6N溶液逐渐增加pH，如图8所示。一旦溶液达到足够的pH值(～7.2)，就会自发形成复合水凝胶，并且分散体的粘度显著增加。在另一个实施例中，MCT-壳聚糖水凝胶还可以通过将高分子量(HMW)壳聚糖的最终浓度调节在2至10％w/v之间或通过将最终的MCT-壳聚糖复合物与粘度增强添加剂(诸如羟乙基纤维素、甘油或聚乙二醇等)混合来制造。
MCT-壳聚糖复合电纺纳米纤维的制备：通过静电纺丝技术制备MCT-壳聚糖非织造纳米纤维垫，如图9A和图9B所示。将MCT-壳聚糖复合物以0.5至2.0(％w/v)范围的壳聚糖浓度溶解在去离子水中。调节MCT-壳聚糖复合物的浓度，使其粘度和电导率适合于静电纺丝。在静电纺丝实验之前，将分散体放置在冰箱(4℃)中过夜以完全水合。最大剪切速率取决于管状几何形状的幂律材料，体积流量(Q)为2.78×10-10m3/s，管内半径为1mm(R ＝0.5×10- 3m)。为了改善用于静电纺丝的MCT-壳聚糖复合物特性，将样本与聚乙烯醇(PVA) 混合作为静电纺丝助剂。将PVA(10％w/v)在剧烈搅拌4小时下在80℃下在水中溶解。将 MCT-壳聚糖复合物和PVA混合的分散体以100：00、60：40、50：50、40：60和0：100质量比混合。使用静电纺丝装置和30kV电源(Gamma High Voltage Research，美国佛罗里达州奥蒙德海滩)对MCT-壳聚糖/PVA共混样本(5mL)进行静电纺丝。针尖和收集器之间的距离设定为20cm，电压为20kV，溶液以1mL/h泵送。将纳米纤维收集在铝箔上并储存在干燥器中以进一步表征，如图9A所示。
MCT-壳聚糖生物膜的表征：通过比较拉伸强度和溶胀行为来评估MCT-壳聚糖复合生物膜的机械特性。溶胀是生物膜物理降解的第一步。快速溶胀促进活性化合物(例如药物和/或杀虫剂)从生物膜基质中快速且不受控制地释放。通常在壳聚糖生物膜的生产中加入戊二醛作为交联剂以减缓溶胀速率。在水凝胶制剂中使用戊二醛的缺点是生物膜的拉伸强度降低。根据先前描述的方法浇铸MCT-壳聚糖复合生物膜。此外，通过首先将预浇铸壳聚糖或 MCT-壳聚糖复合生物膜浸入戊二醛溶液(0.10％v/v)中30分钟、然后用去离子水彻底洗涤、然后在80℃下干燥2小时而配制交联生物膜。
机械特性的评估：拉伸强度测量在通用机械测试机(来自法国GT测试的TEST 108型，配备有Test Winner 920软件)上进行，具有10mm/分钟的十字头速度和2kN静态称重传感器。将生物膜从尺寸为17mm×4mm×0.08mm(长×宽×厚)的哑铃形刀(H3型)切成标准拉伸样本。在50±3％RH和23±2℃的湿度室(CIAT，法国)中经历适当的储存期(3周和 20周)后，测试每种类型的生物膜的至少五个样本。通过将断裂膜的最大载荷除以横截面积来计算最大拉应力(TS)。MCT-壳聚糖复合生物膜显示出比单独的壳聚糖生物膜更高的拉伸强度。图10A和图10B示出了与单独的壳聚糖(0：100)相比，不同MCT-壳聚糖复合生物膜(质量比分别为50:50和100：0)的机械行为。数据显示为[平均值±SD；n＝5]。相对于未交联的生物膜，添加交联剂(戊二醛)降低了所有生物膜的拉伸强度。
溶胀行为的评估：通过重量分析方法评估壳聚糖和MCT-壳聚糖复合生物膜的溶胀度。首先在分析天平上称重(Wd)每个干燥生物膜。称重后，将生物膜在室温下浸没在蒸馏水中 60分钟。然后将生物膜从水中取出并在5、10、20、30、40、50和60分钟时称重(Ws)。在高精度天平上称重之前，将每个生物膜样本快速从水浴中取出并用薄纸吸干以除去过量的水。称重后，将生物膜返回水中。然后根据以下等式计算每个生物膜样本的溶胀度(％)：
溶胀度(％)＝[(Ws-Wd)/Ws]×100
结果表明，与单独的壳聚糖生物膜相比，MCT-壳聚糖复合生物膜显示出较低的溶胀速率和较低的总溶胀度。图10B示出了MCT-壳聚糖水凝胶的溶胀度随时间的变化。
这些结果表明MCT-壳聚糖复合材料充当强交联剂或其等同物，减少了复合材料的溶胀，同时提高了生物膜的拉伸强度。MCT提供的特性优于壳聚糖生物膜中的戊二醛交联剂的特性。因此，MCT是戊二醛的合适、可靠和生物相容的“绿色替代品”以用于配制包装、修补和手术生物材料的生物膜。
MCT-壳聚糖复合伤口敷料模板(生物膜、3D-海绵和电纺纳米纤维)的表征：MCT-壳聚糖复合伤口敷料模板(生物膜、3D-海绵和电纺纳米纤维)根据其化学特征使用衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet 4700ATR FT-IR，Thermo Scientific，美国纽约州格兰德岛) 和通过热重分析(TGA，Q100，TA Instruments，美国犹他州林顿)的热特性进行表征。热分析(DSc和TGA)在5℃/min下在20-400℃的温度扫描范围内在氮气氛中(20mL/min)进行。图11A和图11B示出了MCT-壳聚糖生物膜及其作为伤口敷料模板的潜在应用。使用SEM(Leo 1530-FE，蔡司，英国剑桥)检查纳米纤维的形态。通过使用ImageJ软件分析SEM图像中的至少20个纤维来确定平均纤维直径。图11C和图11D示出了表面形态。
MCT-壳聚糖复合生物材料与壳聚糖生物材料相比的优势：与壳聚糖生物材料相比， MCT-壳聚糖复合生物材料(图12)为各种应用提供了显著改善的特性。MCT-壳聚糖复合生物材料可以制备为纳米颗粒、水凝胶、生物膜、3D-海绵或电纺纳米纤维。这些形式的生物材料中的每一种都可以用于各种目标应用，并且每种复合生物材料相对于壳聚糖生物材料具有显著的优势，如下表1中所总结的。
表1.与用于GTR应用的壳聚糖和胶原生物材料相比，MCT-壳聚糖复合物的改进。
Figure BDA0002189773740000161
Figure BDA0002189773740000171
实施例2.用于GTR、伤口愈合和组织工程的MCT-壳聚糖复合物3D-海绵
据报道，壳聚糖(CHT)具有生物相容性和生物可吸收性。特别是，CHT被认为是良好的伤口愈合加速剂。另一方面，胶原蛋白(MCT)是组织工程中最广泛使用的基质生物材料之一。高度多孔的MCT单3D海绵已被用于支持许多类型组织的体外生长。通过以不同质量比混合(从海参样本中分离的)CHT和MCT、应用先前开发的涉及溶剂浇铸和冷冻干燥的方法制备混合3D-海绵生物材料。MCT/CHT杂化3D-海绵根据其吸水能力、机械特性、热行为(TGA)和形态(SEM)进行表征。与单3D海绵相比，杂化3D海绵显示出改善的稳定性、更大的孔隙率、增加的热稳定性和机械特性以及更高的生物降解性。用脂肪组织源干细胞(ADSC)和SEM成像进行的细胞培养孵育显示MCT/CHT杂化3D-海绵允许ADSC在体外粘附、扩散和生长。
MCT-壳聚糖杂化3D-海绵的制备：将壳聚糖(CHT，2.0％w/v)溶解在乙酸(0.1％ v/v)中并与胶原水溶液(MCT，5％w/v)缓慢混合而分别以MCT-CHT 100：0、80：20、60： 40和50:50的摩尔比产生杂化溶液。通过将每种溶液倒入玻璃模具、溶剂浇铸和冷冻干燥48 小时来制造MCT-壳聚糖杂化3D-海绵。将海绵切成小片段(12mm直径和3mm厚度)用于进一步表征和细胞增殖研究并在干燥器中在受控的相对湿度下储存。
MCT-壳聚糖杂化3D-海绵的物理和化学表征：在倒置显微镜(LIB-305，美国)上以4x放大率收集制造的杂化海绵的光学显微镜成像。在扫描电子显微镜(SEM，JSM-5200，JEOL，美国)上以20kx的放大率检查MCT-壳聚糖杂化3D-海绵的形态。每个样本的倾斜角度为30 度。在TGA-7仪器(Perkin Elmer，美国)上进行热重分析(TGA)。将海绵样本(5-10mg)倒入铝支架中，并根据设定在50至600℃之间的温度程序，在10℃/min的加热速率下在氮气氛(10mL/min)下分析。通过使用最大力为250N的万能拉伸试验机(Tensilon RTG，日本)负载传感器在环境条件(20℃和50％相对湿度，RH)下进行MCT/CHT杂化3D-海绵(每个条件n＝5)的单轴机械压缩试验。以5mm/min的十字头速度收集压缩(mm)和负载(N)。压缩弹性模量计算为压缩曲线的初始线性区域内的应力-应变曲线的切线斜率。在15％应变下计算压缩强度(在所有样本中应力-应变曲线呈线性的区域内)。通过电子测微计(DMH Series 293，Mitotoyo，日本)测量，干燥的3D-海绵样本具有直径为12mm且厚度为3mm的圆柱形。
细胞附着和增殖研究：从活体马中分离脂肪组织源干细胞(ADSC)。将ADSC(～105细胞/cm2)置于每个MCT-壳聚糖杂化3D-海绵的顶部。组织培养板(聚苯乙烯)孔用作对照。将培养物置于培养箱中1天，并且在除去后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并进行胰蛋白酶化。在库尔特颗粒计数仪(Model 0646，Coulter Electronics(库尔特电子公司)，美国佛罗里达州海厄利亚)上对所得的解离细胞悬浮液的等分试样进行计数。仅使用直径在8和32μm之间的计数。在培养1、3、7和10天后，通过如上所述的细胞计数确定细胞增殖。在该实验中，检查了六个重复样本。将连接和/或增殖的ADSC细胞用戊二醛(2.5％v/v)在0.1M PBS(pH7.4)中固定30分钟，然后用0.1M PBS冲洗。将固定的细胞样本冷冻干燥并用金溅射涂覆，而通过扫描电子显微镜(SEM，Hitachi Model S-2460N，日本东京日立制作所)进行形态学分析。
数据和统计分析：所有数据均报告为至少三次重复的平均值±标准偏差。使用JMPPro (版本10.0.0；SAS研究所，美国北卡罗莱纳州凯瑞)进行统计学分析，设定p＝0.05。使用双向ANOVA模型分析结果，其中独立变量“样本”和“浓度”之间的相互作用以评估显着差异。
结果和讨论
MCT-壳聚糖杂化3D-海绵的物理和化学表征：壳聚糖通过由其可用的胺和羟基驱动的氢键相互作用与胶原蛋白物理结合。这种相互作用允许开发稳定的生物材料，诸如纳米颗粒、生物膜、生物泡沫和组织海绵(Madrigal-Carballo等人，Polymer-liposomenanoparticles obtained by the electrostatic bio-adsorption of naturalpolymers onto soybean lecithin liposomes(通过静电生物吸附天然聚合物到大豆卵磷脂脂质体获得的聚合物-脂质体纳米颗粒)，Intl.J.纳米颗粒5(3)(2012)196-209；Madrigal-Carballo等人，Protein-loaded chitosan nanoparticles modulate uptakeand antigen presentation of hen egg-white lysozyme by murine peritonealmacrophages(蛋白质负载的壳聚糖纳米颗粒通过鼠腹膜巨噬细胞调节鸡蛋清溶菌酶的摄取和抗原呈递)，Intl.J.纳米颗粒3(2)(2010)179-191；Ma等人，“A preliminary in vitrostudy on the fabrication and tissue engineering applications of a novelchitosan bilayer material as a sponge of human neofetal dermal fibroblasts(新型壳聚糖双层材料作为人幼胎真皮成纤维细胞的海绵的制造和组织工程应用的初步体外研究)”，Biomaterials，22(4)(2001)，第331-336 页)。图13A示出了制备的MCT-壳聚糖杂化3D-海绵。如图13A所示，所示的杂化3D海绵以不同的MCT/CHT质量比(50:50、60:40、80:20和100:0)制造。图13B示出了海绵的光学显微镜图像，图13C是每个制造的3D-海绵的SEM显微照片。在图13C中，比例尺为 500μm。
图13C中的SEM显微照片显示了当与MCT组合时壳聚糖单海绵的表面形态的变化。通过在MCT/CHT杂化3D-海绵基质中添加MCT，表观孔径减小来显示这种变化。因此，MCT 与壳聚糖的相互作用似乎提供了更大的交联密度，这可能是由两种大分子之间可获得的更多潜在的氢键相互作用驱动的，因此增加了分子排列和紧密性。
图14是通过热重分析法(TG)对MCT-壳聚糖杂化3D海绵进行热分析的图，显示MCT/CHT(50:50)杂化3D-海绵的热行为介于MCT/CHT(100:0)和MCT/CHT(0:100)复合海绵之间。含有MCT的杂化3D海绵显示出比壳聚糖单海绵更好的热稳定性，平均分解温度为300℃，相比CHT单海绵的热稳定性提高了15倍。
生物3D海绵需要足够的机械特性以在植入后保持其完整性。因此，对MCT-壳聚糖杂化3D-海绵进行压缩试验以获得应力-应变机械曲线并分别计算弹性模量和压缩应力(在15％应变下)，如表2所示。结果显示通过在壳聚糖3D-海绵基质中加入MCT对机械特性产生积极影响。与MCT/CHT(100:0)海绵相比，杂化MCT/CHT(50:50)3D-海绵显示压缩杨氏模量增加约85倍。此外，发现MCT/CHT(60:40)杂化3-D海绵系统的压缩强度(15％应变下)增加约78倍。观察到的机械强度的增强可以与胶原蛋白和壳聚糖之间的内部氢键驱动的聚合物网络的形成相关联，聚合物网络促进基质的机械稳定并因此促进用于潜在的植入目的的合适的3D-海绵。
表2.不同MCT-壳聚糖杂化3D-海绵的杨氏机械模量
结果报告平均值±SD(n＝5)
Figure BDA0002189773740000201
溶胀特性在海绵中很重要，可促进水合作用和细胞生长。MCT-壳聚糖3D海绵显示出在MCT和壳聚糖的两个简单海绵之间的中间行为，其中具有最高比例的壳聚糖的一个显示出最高的吸水能力。这些结果可以通过壳聚糖生物分子中比在胶原蛋白生物分子中存在更多可用的氢键点来解释，这是由于胶原蛋白的四级结构驱动的官能团的旋转和移动性的降低。
图15示出了对于不同的MCT-壳聚糖杂化3D-海绵获得的吸水行为。在图15中，与在相同时间点的MCT/CHT(100:0)单3D-海绵相比，数据表示为平均值±SD，n＝3和(*) ＝p<0.05。图15还包括为了说明目的而插入的图片，以显示MCT/CHT(50:50)杂化3D-海绵的溶胀行为。图15的曲线显示了对于所有不同的杂化3D-海绵，低于70％相对湿度时的相似性。同时，在达到85％相对湿度后，随着杂化3D-海绵基质中MCT的比例增加，系统之间观察到显著差异，显示250倍范围的吸水率差异，MCT/CHT(50:50)杂化3D海绵显示出最高的吸水能力(接近300％)，MCT/CHT(100:0)单3D海绵显示出最低的吸水能力(其值接近50％)。MCT/CHT(80:20)和MCT/CHT(60:40)显示出位于MCT/CHT(100:0) 和MCT/CHT(50:50)之间的吸水能力。
复合海绵保存水的能力是评估其特性和皮肤组织工程适用性的重要方面。MCT-壳聚糖海绵的水结合能力可归因于它们的亲水性和它们对三维结构的维持。壳聚糖和MCT具有丰富的亲水基团(诸如羟基、氨基和羧基)，亲水基团能够在其微观结构中保留水。MCT 似乎在较高的相对湿度下促进亲水性的增加，从而导致更高的吸水能力。对MCT-壳聚糖海绵获得的吸水率值与先前报道的类似实验一致(Ma等人，'Chitosan porous sponges withimproved biostability for skin tissue engineering(具有用于皮肤组织工程的改善的生物稳定性的壳聚糖多孔海绵)'，Biomaterials.Elsevier，24(26)(2003)，第4833-4841页；Chhabra等人，“Optimization,characterization,and efficacy evaluation of 2％chitosan sponge for tissue engineering and wound healing(用于组织工程和伤口愈合的2％壳聚糖海绵的优化、表征和功效评估)”，Journal of pharmacy&bioalliedsciences，Medknow Publications，8(4)(2016)，第300页)。
脂肪组织源干细胞(ADSC)生长到MCT-壳聚糖杂化3D-海绵上：为了研究ADSC 和MCT-壳聚糖杂化3D-海绵之间的相互作用，使用直径约12毫米、厚度3毫米的多孔结构。培养72小时后，ADSC在海绵上达到高于90％的细胞覆盖。MCT/CHT(100:0)3D-海绵(图 16A和图16B)的截面的SEM图像显示，在细胞接种72小时后，ADSC粘附并铺展在多孔 MCT-壳聚糖(100:0)3D-海绵表面上并且彼此完全合并，使得与没有附着细胞的海绵系统(图 16A)相比，细胞间连接不可见(图16B)。在图16A和图16B中，比例尺表示10μm。多孔海绵的表面填充了细胞和膜，所述膜可以从细胞中分泌的ECM沉淀物(Lin，Li和Su，“Three-dimensionalchitosan sponges influence the extra cellular matrix expression in Schwanncells(三维壳聚糖海绵影响许旺细胞中的细胞外基质表达)”，Materials Science andEngineering C(《材料科学和工程C》)，42(2014)，第474-478页；Ji等人，“Biocompatibility study of a silk fibroin-chitosan sponge with adiposetissue-derived stem cells in vitro(具有体外脂肪组织源干细胞的丝素蛋白-壳聚糖海绵的生物相容性研究)”，Experimental and Therapeutic Medicine (《实验和治疗医学》)，6(2)(2013)，第513-518页)。
图17显示了在15天孵育期后MCT-壳聚糖(50:50)复合3D-海绵的增殖水平，其中图例(□)表示MCT/CHT(100:0)3D-海绵，图例(o)表示MCT/CHT(0:100)单3D海绵，图例(Δ)表示MCT/CHT(50:50)复合3D海绵，其中数据表示为与相同时间点的MCT/CHT (0:100)单3D-海绵相比，平均值±SD，n＝5，(*)＝p<0.05。三个曲线描绘了3D海绵 MCT/CHT(0:100)、MCT/CHT(100:0)和MCT/CHT(50:50)复合3D-海绵。与MCSC/CHT (0:100)和MCT/CHT(100:0)3D海绵相比，从ADSC孵育3天开始，MCT/CHT(50:50) 复合3D-海绵显示细胞附着和增殖显著增加。
已知聚苯乙烯培养皿的表面具有良好的细胞附着并且在孵育期间显示出快速的细胞覆盖(Jeong Park等人，“Platelet derived growth factor releasing chitosansponge for periodontal bone regeneration(血小板源生长因子释放壳聚糖海绵用于牙周骨再生)”，Biomaterials(《生物材料》)，21(2)(2000)，第153-159页)。细胞附着和增殖的程度意味着MCT-壳聚糖杂化3D-海绵具有良好的细胞适应性。检查海绵上的细胞增殖表明，在ADSC孵育3天后，实验组和对照组之间存在统计学显著差异。这可能是由于ADSC加入海绵后的适应过程造成的。在孵育3天后样本之间的差异开始明显的事实可能是因为ADSC证明了海绵上的初始缓慢增殖速率，然后在三天后恢复到一些更正常的增殖速率。此外，MCT/CHT(50:50)复合 3D-海绵显示了显著增加的细胞附着和增殖。对于15天的孵育期而言，与观察MCT/CHT(0:100) 和MCT/CHT(100:0)3D海绵相比，从MCT/CHT(50:50)复合3D海绵观察到约50倍的高度细胞附着和增殖。已知MCT刺激成骨细胞样细胞和韧带成纤维细胞的增殖、趋化性和胶原蛋白合成(Zhang等，“Novel chitosan/collagen sponge containingtransforming growth factor-β1 DNA for periodontal tissue engineering(含有用于牙周组织工程的转化生长因子-β1DNA的新型壳聚糖/胶原海绵)”，Biochemical andBiophysical Research Communications(《生化与生物物理学研究通讯》)，344(1)(2006)，第362-369页)。此外，据报道MCT可增强祖细胞的增殖(Costa-Pinto等人，“Adhesion,proliferation,and osteogenic differentiation of a mouse mesenchymal stem cellline(BMC9)seeded on novel melt-based chitosan/polyester 3D porous sponges(接种在新型熔融基壳聚糖/聚酯3D多孔海绵上的小鼠间充质干细胞系(BMC9)的粘附、增殖和成骨分化)”，Tissue engineering.Part A(《组织工程学A》)，14(6)(2008)，第1049-1057页)。MCT和壳聚糖的组合可能是非常有益的，以增加细胞增殖反应。
结论：与胶原蛋白的快速降解相反，壳聚糖在体外缓慢地生物降解。用壳聚糖改性胶原3D-海绵导致机械强度、热稳定性、生物相容性和生物降解性的改善。MCT-壳聚糖杂化3D- 海绵在表面和内部为ADSC提供多维结构，具有细胞附着、迁移和增殖的空间特征，并促进细胞生长。在孵育72小时后，发现ADSC在海绵表面上合并且形成完整的细胞层，使得表面几乎被覆盖并且仅可见少数孔，并且一些细胞在孔内迁移。MCT-壳聚糖杂化3D-海绵支持ADSC附着、增殖和分化。SEM图像显示多孔海绵的大表面积允许ADSC在海绵上粘附、扩散和生长。扁平形态和在互连多孔结构中和周围的优异扩散表明细胞的强粘附和细胞生长。因此，MCT-壳聚糖杂化3D-海绵表现出ADSC附着的生物相容性，因此是组织工程中潜在应用的良好候选者。
实施例3.电纺MCT-壳聚糖复合纳米纤维作为生物相容性海绵在伤口愈合和组织工程应用中用于细胞增殖
电纺纳米纤维(ESNF)由MCT-壳聚糖复合材料制备。聚乙烯醇(PVA)用作辅助剂。制备不同体积比(100:0、80:20、60:40、40:60、20:80和0:100)的MCT-壳聚糖/PVA 混合溶液并调节为在适合于静电纺丝的粘度和电导率方面是相似的。使用扫描电子显微镜 (SEM)、傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)和差示扫描量热仪(DSC)检查ESNF的形态。研究用于表征纳米纤维(NF)的化学组成和热特性。使用优化的MCT-壳聚糖/PVA溶液在体外研究NF支持成纤维细胞增殖的能力。结果表明，基于MCT-壳聚糖的ESNF非常适合成纤维细胞生长，明显优于PVA的ESNF。结果还表明，MCT-壳聚糖比单独的壳聚糖更好地支持细胞增殖。
制备MCT-壳聚糖复合物用于静电纺丝：在剧烈搅拌下将MCT-壳聚糖粉末在去离子水中溶胀，直至获得均匀的分散体(1％v/v)。在表征实验之前，将分散体放置在冰箱(4℃)中过夜以完全水合。MCT-壳聚糖复合分散体通过在流变仪(C-VOR，Bohlin Instruments，英国马尔文)中的应力扫描测试来测量它们的粘度进行表征，流变仪具有锥板几何形状和25℃下的电导率，具有电导率计(Orion Star A215，ThermoFisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)，电导率计的电极电导率常数为0.7265cm-1。
MCT-壳聚糖复合物的静电纺丝：在剧烈搅拌下将MCT-壳聚糖复合物与丙酮水溶液(30％v/v)混合，直至获得均匀的分散体。调节复合溶液的浓度使得它们的粘度和电导率相似并且适合于静电纺丝。在静电纺丝实验之前，将分散体放置在冰箱(4℃)中过夜以完全水合。根据管状几何中的幂律材料，计算每个MCT-CHT复合材料样本的最大剪切速率，体积流量(Q)为2.78x10-10 m3/s，管内半径为1mm(R＝0.5×10-3米)。
为了改善静电纺丝的复合性能，将样本与PVA混合作为静电纺丝助剂。在剧烈搅拌下将PVA(10％w/v)溶于80℃的水中4小时。将MCT-壳聚糖复合物和PVA共混分散体在 100:00、60:40、50:50、40:60和0:100的体积比下混合。使用静电纺丝装置和30kV电源(GammaHigh Voltage Research，美国佛罗里达州奥蒙德海滩)对MCT-壳聚糖/PVA共混样本(5mL)进行静电纺丝(参见图9A和图9B)。针尖和收集器之间的距离设定为20cm，溶液以1mL/h 泵送。将纳米纤维收集在铝箔上并储存在干燥器中以进一步表征。
MCT-壳聚糖ESNF的表征：根据其化学特征使用衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet 4700ATR FT-IR，Thermo Scientific，美国纽约州格兰德岛)和通过热重分析(TGA， Q100，TA Instruments，美国犹他州林顿)的热特性表征ESNF。在氮气氛(20mL/min)中在 100-400℃的温度扫描范围内以5℃/min进行TGA分析。使用SEM(Leo 1530-FE，蔡司，英国剑桥)检查纳米纤维的形态。通过使用ImageJ软件分析SEM图像中的至少20个纤维来确定平均纤维直径。
细胞增殖测定：通过针对活细胞数的MTT细胞增殖测定来确定细胞增殖。简言之，将先前在无菌条件下收集的ESNF置于具有培养基的无菌细胞培养板中的不同孔中，并将3mL成纤维细胞悬浮液(L929,1.5×105)加入每个处理孔中。将细胞培养板分别置于37℃的培养箱中3天、7天和14天。孵育后，除去培养基，用新鲜培养基以1:10稀释度将MTT溶液加入每个处理孔中。将板在37℃下孵育4小时，并使用酶标仪(SpectraMax Plus，MolecularDevices，美国加利福尼亚州桑尼维尔市)在560nm下测量吸光度。在细胞生长实验(第7天)后，收集ESNF并用培养基洗涤，用戊二醛(2.5％v/v)在4℃下固定2小时，并在用SEM 成像之前用金涂覆。
统计学分析：使用AssistatVR软件(Statistics，德克萨斯州阿灵顿)进行统计学分析。实验数据表示为平均值±SD值。为了比较对照组和实验组，通过广义线性模型、然后是最小均方(SAS；北卡罗莱纳州凯瑞)分析数据。在P<0.05时，差异被认为在统计学上是显著的。
图18分别显示了MCT/CHT(0:100)(由实线表示)和MCT/CHT(100:0)(由虚线“---”表示)以及两种不同的MCT/CHT复合物(60:40，用点线“….”表示，40:60，用点划线“-·-·-”表示)的ESNF的ATR-FTIR光谱图。图中的箭头表示与向壳聚糖中添加MCT相关的纳米纤维FTIR光谱的变化。特别是，可以看到在1650cm-1和1000cm-1处的吸收趋势增加。这些分别对应于与壳聚糖的多糖性质相关的羰基(实线箭头)和碳-氧(虚线箭头)伸缩频率。通常，CHT和MCT之间的差异在图中是显而易见的。对于这两种复合物，图中某些位置存在分散，但在许多地方存在大量重叠，鉴于CHT和MCT的比例相对相似，这并不奇怪。
图19显示了MCT/CHT复合物(100:0、60:40、40:60和0:100)的TGA热分析，表明由于添加MCT而对壳聚糖热稳定性产生正面影响。MCT-壳聚糖(60:40)复合物显示出比单独的壳聚糖改善的热稳定性。MCT-壳聚糖(60:40)复合物显示平均降解温度约为320℃，而单独的壳聚糖显示平均温度约为280℃
图20A至图20F显示壳聚糖电纺纳米纤维和MCT-壳聚糖电纺纳米纤维的SEM显微照片。在图20A和图20D中，比例尺为10μm；在图20B和图20E中，比例尺为2μm，在图 20C和图20F中，比例尺为200nm。虚线圆圈表示存在与壳聚糖ESNF中的不良静电纺丝过程相关的液滴，并显示MCT-壳聚糖复合物的ESNF的改善。
图21显示与壳聚糖、MCT和MCT-CHT复合物(50:50)ESNF共培养的L929成纤维细胞的增殖。该图使用PVA ESNF作为对照显示了来自MTT细胞增殖测定的数据。活细胞的平均百分比±标准偏差来自三次不同时间执行的实验。图22A至图22C是分别显示细胞粘附到壳聚糖、MCT-壳聚糖复合物和MCT上的SEM显微照片。
结论：使用PVA(10％w/v)作为辅助剂，通过静电纺丝成功制造了MCT-壳聚糖复合纳米纤维。设置MCT-壳聚糖复合纳米纤维制造的静电纺丝参数，将MCT与壳聚糖的质量比优化至50:50。ATR-FTIR分析显示在ESNF中存在MCT-壳聚糖组分。将MCT-壳聚糖复合ESNF的热稳定性与单独的壳聚糖的热稳定性进行比较，表明向壳聚糖中添加MCT改善了 ESNF的热稳定性。成纤维细胞增殖结果表明MCT-壳聚糖ESNF适合细胞生长，并且在孵育 7天后显著优于单独的壳聚糖或MCT ESNF。SEM图像显示MCT-壳聚糖ESNF的大的表面积允许L929成纤维细胞的良好粘附、扩散和生长。结果表明，MCT-壳聚糖ESNF改善了成纤维细胞附着的生物相容性和活性，因此可用于开发用于组织工程、再生医学的伤口敷料模板和用于治疗组织烧伤的伤口愈合敷料。
以下对图36至图38的讨论提供了根据实施例的GTR装置的结构和应用的概述以及那些装置的优点。
图36示出了根据实施例的3D海绵。在该图中，海绵包含由胶原蛋白和糖胺聚糖组成的MCT，胶原蛋白和糖胺聚糖是新皮的主要成分。新皮是在伤口愈合期间形成的新组织。MCT的胶原蛋白-GAG结构在愈合过程中促进整联蛋白结合。如前所述，MCT来自海洋来源，在一方面包括海洋无脊椎动物，在更具体的方面是棘皮动物、并且在更具体的方面包括海胆和/或海参。该MCT的超微结构与人类结缔组织有一些相似之处，指向有益的GTR效应，诸如新皮的形成。
图36中的海绵还提供水分管理，以促进伤口闭合和愈合。在一方面，海绵具有胶凝作用，其在愈合期间通过冷却、舒缓效果来促进患者舒适。MCT的交联处理使海绵有效长达30天，这是因为所得结构表现出低的物理降解和对蛋白水解酶的抗性。特别地，所得结构靶向过量的酶(诸如可以降解蛋白质的基质金属蛋白酶(MMP))并使其失活。这种靶向和失活促进并改善伤口闭合和愈合。
图37描绘了根据一些实施例的3D-海绵。根据实施例，海绵可以由MCT组成或由MCT-CHT的基质组成。海绵中的这种材料支持组织和血管向内生长。海绵结构的其他方面包括吸收性凝胶形成的组合物，其保持潮湿环境并控制渗出物，从而促进愈合和组织再生。
图38描绘了GTR装置，其可以由MCT组成或由MCT-CHT基质组成，GTR装置缝合到皮肤中的开口中作为治疗的一部分。该图显示了装置周围的缝线，以及作为愈合过程的一部分在装置下方形成的新皮。图38的一部分显示了新皮的分解图，单独显示了MCT或在 MCT与CHT的复合基质中显示了MCT，并显示了整联蛋白结合位点。
实施例4.药妆剂型
以下制剂说明了可用于治疗或预防性施用本文所述的MCT和MCT-壳聚糖 (MCT-CHT)组合物的代表性药物剂型，所述剂型使用皮肤病学和/或药学上可接受的局部载体，局部载体包括但不限于溶液、悬浮液、液体、凝胶、软膏、洗剂或乳膏。在以下示例中，提供凝胶或乳膏：
Figure BDA0002189773740000251
该制剂在如下分开的阶段制备：通过将卡波姆分散在水中然后在其它组分中搅拌来制备混合物的A部分。将B部分的所有组分混合在一起并加热至70℃。然后合并A部分和B部分，加入三乙醇胺和香料(C部分)。所得乳膏稳定、光滑、具有良好的保湿性和对皮肤的良好感觉。
Figure BDA0002189773740000261
通过将所有组分混合在一起来制备制剂。
Figure BDA0002189773740000262
该制剂在如下分开的阶段制备：通过将卡波姆分散在水中然后在其它组分中搅拌来制备混合物的A部分。将B部分的所有组分混合在一起并加热至70℃。然后合并A部分和B部分，加入三乙醇胺和香料(部分C)。所得乳霜富含优异的保湿性，并且不会给皮肤带来油腻感。
(iv)瘢痕乳膏组合物
Figure BDA0002189773740000271
制备程序：
1-称取150mg维生素E，并在温和搅拌下将其与膏基分散体混合。
2-称取1000mg MCT-CHT冻干粉末(以100:0至70:30的MCT:CHT质量比配制)并将其溶解于在蒸馏水(pH3.2)中制备的5.00mL乙酸(0.5M)中。
3-称取200mg辣木/维生素C提取物并将其溶解在MCT-CHT水溶液中。
4-称取50mg虾青素并将其溶解于含有MCT-CHT和辣木/维生素C提取物的水溶液中。
5-称取100mg蜂王浆，并将其与含有MCT-CHT、辣木/维生素C提取物和虾青素的水溶液混合。
6-在连续温和搅拌下，将含有MCT-CHT、辣木/维生素C提取物和虾青素的水溶液与含有维生素E的膏基混合，直至实现均匀的分散体。
7-将均质化的瘢痕乳膏制剂倒入适当的玻璃容器中并在室温下储存。
可以通过制药领域熟知的常规程序制备上述制剂。应当理解，上述药妆组合物可根据熟知的制药技术变化，以适应作为活性成分的不同量和不同类型的MCT-CHT复合物。
刚刚描述的瘢痕乳膏组合物施用于若干患者。图30A和图30B显示了一名患者的施用结果之前和之后。图30A是在施用上面列出的瘢痕乳膏之前来自剖腹产的五年瘢痕的照片。图30B是每日施用瘢痕乳膏两周后同一瘢痕的照片。从图30B可以看出，治疗后的瘢痕较短，并且具有不同的颜色、更接近周围皮肤的颜色。
图31A和图31B显示另一患者的施用结果之前和之后。图31A是在施用上面列出的瘢痕乳膏之前，左膝关节下面的15年瘢痕的照片。图31B是施用瘢痕乳膏后同一瘢痕的照片。从图31B可以看出，瘢痕具有不同的颜色、更接近周围皮肤的颜色。
图32A至图32C示出了又一患者的施用结果之前和之后。图32A是在施用上面列出的瘢痕乳膏之前，25年阑尾切除术瘢痕的照片。图32B是每日施用后同一瘢痕的照片，图32C是根据实施例在每日施用瘢痕乳膏8天后的同一瘢痕的照片。从图32B和图32C可以看出，治疗后的瘢痕较短，并且具有不同的颜色、更接近周围皮肤的颜色。
图33A和图33B显示了另一患者的施用结果之前和之后。图33A是来自膝盖手术的六个月的瘢痕的照片，图33B是在每天施用上面列出的瘢痕乳膏七天后同一瘢痕的照片。从图33A和图33B可以看出，治疗后的瘢痕比以前更不明显，并且具有不同的颜色、更接近周围皮肤的颜色。患者没有出现副作用或增生。
图34A至图34D显示另一名患者治疗瘢痕的进展性结果。图34A显示烧伤瘢痕的照片，图34B和图34C显示在每日施用上面列出的瘢痕乳膏期间瘢痕的照片，图34D显示治疗七天后瘢痕的照片。从这些图中可以明显看出，与治疗前的瘢痕外观相比，治疗后的瘢痕基本上愈合，颜色更接近周围皮肤的颜色。
除了前述治疗示例之外，例如，由于损伤、手术、整形手术或其他修复和/或愈合程序，瘢痕形成可发生在身体的各个区域，包括眼睑中和眼睑周围。上述瘢痕乳膏也已用于这种治疗，达到良好效果。
作为所述前述工作的一部分和制作示例，进行了确定和显示从海参提取的MCT和从小牛皮组织分离的牛胶原蛋白之间的结构差异的工作。胶原蛋白样本的氨基酸组成分析在 (Cui F.，Li Z.，Zhang Y.，Dong P.，Fu X.，Gao X，“Characterization and SubunitComposition of Collagen from the Body Wall of Sea Cucumber(海参、刺参体壁的胶原蛋白的表征和亚基组成)”，Food Chem(《食品化学》)100(3)(2007)：1120-5)中进行确定。简言之，将胶原蛋白样本用6M HCl在110℃下水解24小时，然后使用赛卡姆氨基酸分析仪S433D(赛卡姆，德国慕尼黑)分析水解产物的主要氨基酸组成。
下表3显示了从海参分离的不同MCT样本和从小牛皮分离的牛(小牛皮)胶原蛋白的氨基酸组成。下表中对小牛皮胶原蛋白样本1-4的分析在以下论文可以找到的研究中进行：X.Cheng，Z.Shao，C.Li，L.Yu，M.A.Raja，C.Liu，“Isolation,Characterization andEvaluation of Collagen from Jellyfish Rhopilema esculentum Kishinouye for Usein Hemostatic Applications (用于止血应用的来自海蜇胶原蛋白的分离、表征和评价)”，PLOS One，2017,0169731； Y.Han,J-R.Ahn,J-W.Woo,C-K.Jung,S-M.Cho,Y-B.Lee,S-B.Kim，“Processing Optimization and Physicochemical Characteristics ofCollagen from Scales of Yellowfin Tuna (Thunnus albacares)(黄鳍金枪鱼(Thunnusalbacares)鳞片胶原蛋白的加工优化及理化特性)”，“Fisheries and Aquatic Sciences(《渔业与水产科学》)”，第13卷，第2期，2010年，第102-111 页；H.Li,B.L.Liu,L.Z.Gao,H.L.Chen，“Studies on bullfrog skin collagen(牛蛙皮肤胶原蛋白的研究)”，FoodChemistry(《食品化学》)，第84卷，第1期，2004年1月，第65-69页； P.Kittiphattanabawon,S.Nalinanon,S.Benjakul和H.Kishimura，“Characteristics of Pepsin-SolubilisedCollagen from the Skin of Splendid Squid(Loligo formosana)(来自Splendid Squid(Loligo formosana)皮肤的胃蛋白酶溶解胶原蛋白的特性)”，”Journal of Chemistry，2015年卷，文章ID 482354，8页。
表3.氨基酸组成
Figure BDA0002189773740000291
表3显示了可变胶原组织(MCT)和牛胶原蛋白(BC)的氨基酸组成。MCT的主要氨基酸为甘氨酸(19.0％)、谷氨酸(14.0％)、脯氨酸(12.0％)、丙氨酸(9.0％)、天冬氨酸(9.0％)、精氨酸(8.0％)和羟脯氨酸(6.7％)，与表4中所示的牛胶原蛋白中存在的相似(参见参考文献)。
I型胶原蛋白的一级结构的特征在于含有连续重复Gly-X-Y序列的结构域(其中X主要是脯氨酸，Y主要是羟脯氨酸)以及非常短的N-和C-末端区域(被称为端肽(15至26个氨基酸残基))。α1链中的Gly-X-Y重复序列在二级结构的三螺旋形成中起重要作用。参见Gelse K，
Figure BDA0002189773740000301
Aigner T.2003.胶原蛋白结构、功能和生物合成.Adv Drug DeliverRev(《高级药物传输综述》)55(12)：1531-46；Gómez-GuillénM，GiménezB，López-CaballeroM， Montero M.2011来自替代来源的胶原蛋白和明胶的功能和生物活性特性：综述。FoodHydrocolloid(《食品胶体》)25(8)：1813-27。作为分子量最低的氨基酸，排列在三螺旋中心的甘氨酸残基可以帮助螺旋结构紧密折叠[3]。参见Fraser R，MacRae T，Suzuki E.1979.胶原蛋白分子中的链构象J Mol Biol 129(3)：463-81。因此，甘氨酸是牛胶原蛋白中的主要氨基酸。根据先前的参考文献，牛胶原蛋白中的甘氨酸含量范围为14至33％，约为总氨基酸的四分之一，这与MCT甘氨酸含量(19％)一致。
图23和图24显示了与小牛和鸡胶原蛋白相比海洋胶原蛋白的胶原基质的纯度分析结果，并且表明海洋胶原蛋白与小牛和鸡胶原蛋白一样安全，因此足够安全地用于刚才描述的应用。这些图显示了三螺旋结构，其底部的宽蓝色条带是α螺旋，顶部是β或γ螺旋。这些图中的MCT 1和MCT 2表示不同的MCT批次，显示结果的可重复性。
在图25A中，用实线表示牛胶原蛋白的光谱。在图中用“+”表示的峰显示小牛胶原蛋白的水解使其可溶。比较曲线通过虚线表示MCT，没有显示水解峰。图25B显示了相当的FTIR光谱，表明结果相对于海参的MCT分离过程的效力的再现性，其中MCT1用实线表示，MCT2用虚线表示。图25B显示了批次间的MCT化学特征的高度一致性。
图26显示胶原蛋白样本的热重分析(TGA)结果，并显示MCT样本的热行为差异。在图26中，随着线条朝向曲线的底部，显示减少的稳定性。小牛胶原蛋白的线在280℃时表现出增加的不稳定性，而MCT1和MCT2的线甚至在400℃时表现出稳定性。该曲线显示 MCT的热稳定性优于小牛胶原蛋白，表明存储基于MCT的产品的能力提高。
亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)是构成α链中Gly-X-Y重复序列的重要氨基酸，这是因为它们能够维持胶原蛋白三螺旋与其吡咯烷环的稳定性。参见Wong，DW.1989年.食品化学的机制和理论，纽约：Van Nostrand Reinhold。MCT中脯氨酸和羟脯氨酸的含量分别为12.0％和7.0％，总亚基氨酸含量为20.0％，略低于牛胶原蛋白的值，如图27所示。
发现脯氨酸和羟脯氨酸的含量与环境温度有关。参见Zhong M，Chen T，Hu C，RenC.2015，海参花刺参体壁胶原蛋白的分离与表征，Food Chemistry(《食品化学》)80(4)：C671-C679。然而，当与牛胶原蛋白相比时，甘氨酸与亚氨酸(Hyp/Pro)含量的比率较低，因此表明在MCT中亚氨基酸更有效地稳定了基于甘氨酸的三螺旋。
胶原蛋白稳定性可受氨基酸组成、尤其是亚氨基酸的影响。脯氨酸(PRO)和羟脯氨酸(HYP)可以与吡咯烷环保持胶原蛋白空间结构，而羟脯氨酸的羟基与相邻链形成氢键以改善三螺旋的稳定性。MCT的氨基酸组成分析表明甘氨酸和亚氨基酸的高存在、适于形成稳定的胶原蛋白三螺旋，显示出比牛胶原蛋白更低的降解速率。
图27是与若干小牛胶原蛋白样本相比，MCT1和MCT2样本的GLY、HYP、PRO和亚氨酸(HYP和PRO的总和)的条形图。MCT的一个非常有利的方面是GLY与亚氨酸的比例几乎为1：1、可重现性一致。相比之下，即使是最有利的小牛胶原蛋白样本，在图的中间，也没有像MCT1和MCT2样本那样显示接近1：1的比例。与亚氨基酸相比，高含量的 GLY表明稳定性较低。虽然高GLY含量是有利的，但GLY与亚氨基酸的1：1比率表明更高的稳定性。
图28A和图28B以及图29A和图29B是以两种不同方式形成的MCT的扫描电子显微镜(SEM)照片。图28A和图28B显示了使用溶剂浇铸技术形成MCT-壳聚糖复合物的结果。图28A显示了MCT-壳聚糖敷料模板(例如3D海绵)的结构形态。图28B表示该结构的高程度孔隙率。图29A和图29B显示使用静电纺丝技术形成MCT-壳聚糖敷料模板的结果。分别如图28A和图28B所示，图29A显示了该结构的形态，图29B显示了该结构的高程度孔隙率。孔隙率是引导组织再生的重要属性，以促进细胞附着和生长。
所有引用的出版物、专利和专利文献均通过引用并入本文，如同通过引用单独并入一样。另外，已经参考各种具体和优选的实施例和技术描述了本发明的各个方面。然而，应该理解，可以在本发明的精神和范围内进行许多变化和修改。

Claims (27)

1.一种引导组织再生(GTR)装置，包括：
可变胶原组织(MCT)和壳聚糖，其中，所述壳聚糖以大于或等于零且小于或等于90的质量百分比存在，其特征在于，所述壳聚糖(如果存在的话)静电结合到所述MCT以形成基质，并且所述壳聚糖和MCT的基质为MCT-壳聚糖复合材料的形式；和
涂药器，用于将所述MCT或所述基质递送到待治疗区域。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述MCT是从无脊椎动物海洋生物中分离的。
3.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述无脊椎动物海洋生物选自由海绵、水母、软体动物和棘皮动物组成的组。
4.如权利要求3所述的装置，其特征在于，所述MCT是从棘皮动物中分离的，所述棘皮动物选自由海胆和海参组成的组。
5.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述MCT是从海参中分离的。
6.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述MCT包括胶原蛋白和糖胺聚糖(GAG)。
7.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述MCT由原纤维胶原组成，所述原纤维胶原选自由I型、II型、III型、V型或XI型组成的组或选自I型、II型、III型、V型和XI型中的两种或更多种的混合物。
8.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述MCT由I型原纤维胶原组成。
9.如权利要求6所述的装置，其特征在于，所述糖胺聚糖选自由硫酸软骨素、透明质酸、肝素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素或硫酸皮肤素组成的组或选自硫酸软骨素、透明质酸、肝素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素中的两种或更多种的混合物。
10.如权利要求9所述的装置，其特征在于，所述糖胺聚糖选自由硫酸软骨素和透明质酸组成的组或选自硫酸软骨素和透明质酸的混合物。
11.如权利要求1所述的装置，其特征在于，MCT与壳聚糖的质量比选自由10:90、20:80、40:60、50:50、60:40、80:20、90:10或100:0组成的组。
12.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述MCT或MCT-壳聚糖复合物包括选自由水凝胶、生物膜、3D-海绵、电纺纳米纤维、纳米颗粒或伤口敷料模板的表面上的涂层组成的组的形式。
13.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述MCT-壳聚糖复合物包括MCT中GAG和胶原蛋白之间的聚电解质交联结构以及其与壳聚糖上的N-葡糖胺单元的相互作用。
14.一种实现引导组织再生(GTR)的方法，包括将可变胶原组织(MCT)和壳聚糖施用于待治疗区域，其中，所述壳聚糖以大于或等于零且小于或等于90的质量百分比存在，其特征在于，所述壳聚糖(如果存在的话)静电结合到所述MCT以形成基质，并且所述壳聚糖和MCT的基质为MCT-壳聚糖复合材料的形式。
15.如权利要求14所述的方法，还包括在选自由水凝胶、生物膜、3D-海绵、电纺纳米纤维、纳米颗粒或伤口敷料模板的表面上的涂层组成的组的装置中提供所述基质，并将所述装置施用于所述待治疗区域。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述施用包括施用含有MCT的所述基质，所述MCT是从无脊椎动物海洋生物中分离的。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述施用还包括施用含有MCT的所述基质，所述MCT是从选由海绵、水母、软体动物和棘皮动物组成的组的无脊椎动物海洋生物中分离的。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述施用还包括施用含有MCT的所述基质，所述MCT是从选自由海胆和海参组成的组的棘皮动物中分离的。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述施用还包括施用含有MCT的所述基质，所述MCT是从海参中分离的。
20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述施用还包括施用含有MCT的所述基质，所述MCT包括胶原蛋白和糖胺聚糖(GAG)。
21.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述施用还包括施用含有MCT的所述基质，所述MCT由原纤维胶原组成，所述原纤维胶原选自由I型、II型、III型、V型或XI型组成的组或选自I型、II型、III型、V型和XI型中的两种或更多种的混合物。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述MCT由I型原纤维胶原组成。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述糖胺聚糖选自由硫酸软骨素、透明质酸、肝素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素或硫酸皮肤素组成的组或选自硫酸软骨素、透明质酸、肝素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素中的两种或更多种的混合物。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述糖胺聚糖选自由硫酸软骨素和透明质酸组成的组或选自硫酸软骨素和透明质酸的混合物。
25.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述施用还包括施用壳聚糖和MCT的所述基质，其中，MCT与壳聚糖的质量比选自由10:90、20:80、40:60、50:50、60:40、80:20、90:10或100:0组成的组。
26.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述施用还包括施用壳聚糖和MCT的所述基质，所述MCT-壳聚糖复合物包括选自由水凝胶、生物膜、3D-海绵、电纺纳米纤维、纳米颗粒或伤口敷料模板的表面上的涂层组成的组的形式。
27.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述施用还包括施用壳聚糖和MCT的所述基质，所述MCT-壳聚糖复合物包括所述MCT中GAG和胶原蛋白之间的聚电解质交联结构以及其与所述壳聚糖的N-葡糖胺单元的相互作用。
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