KR20210105252A - 수축 제어가 가능한 진피층 개발, 및 이를 이용한 균일한 성능의 인공피부 의 제조 - Google Patents

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Abstract

알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔, 이를 포함하는 인공피부, 및 인공피부의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔은 기존의 인공 진피층 형성에 사용되었던 콜라겐의 진피층 수축 현상 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 알지네이트 및 젤라틴의 함량 또는 바이오겔의 겔화 방법을 조절함으로써, 표피층의 부착능을 향상시킬 수 있다. 더욱이, 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔은 효과적인 약물 담지 및 서방형 방출 기능이 있으므로, 장기간 효과를 필요로 하는 약물의 전달체로도 활용될 수 있다.

Description

수축 제어가 가능한 진피층 개발, 및 이를 이용한 균일한 성능의 인공피부 의 제조 {Development of dermal layer with shrinkage control, and preparation of artificial skin with uniform performance}
알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔, 이를 포함하는 인공피부, 및 인공피부의 제조방법에 관한 것이다.
인공피부는 창상 치유뿐만 아니라 신약/화장품 개발 및 피부 기초 연구에 개발되고 있다. 인공 피부는 피부 기능의 일부를 대신할 수 있도록 인체에 적응시킨 인공 장기라 할 수 있으며, 임상학적으로 볼 때, 일시적으로 손상된 부위의 보호를 목적으로 하는 창상피복제(wound dressing) 및 환자 자신의 정상피부에서 채취한 섬유아세포 혹은 표피 세포를 in vitro에서 배양한 배양 피부(cultured skin equivalent)로 나눌 수 있다. 인공피부로 연구되고 있는 것 중에는 실리콘 가아제, 가교 폴리비닐알코올 스폰지, 특수직물(폴리아미드 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 레이온 섬유 등을 재료로 한 velour), 또 이와 같은 특수직물에 특정 단백질을 피복한 것, 실리콘 고무로 된 막, 피브린 막 및 셀룰로오스 막 등이 있으나 생체와의 거부반응, 기계적 성질 및 밀착성의 결여 등의 문제점으로 인공피부로서의 충분한 기능을 발휘하지 못하고 있다.
특히, 인공피부 모델 개발의 가장 큰 이슈 중 하나는 배양 기간 동안의 수축이다. 이러한 수축은 세포가 세포 외 기질에 붙을 때, 기계적 물성이 약한 하이드로젤의 특성 때문에 발생하기 한다. 생체 내에 이식 후의 하이드로겔의 수축은 생체 내 환경에서 상처가 아무는 과정에서 흉터를 발생시키고 이는 미용상 또는 운동장애를 발생시켜 흉터제거를 위한 2차 수술이 필요한 경우가 생기며, 생체 외에서 오랜 시간 동안 인공 피부를 배양하는데 한계를 가지고 있다. 기존의 제작 공정에서는 이러한 문제점을 극복하기 위해, 세포를 봉입하지 않은 하이드로젤(hydrogel)을 세포를 봉입한 하이드로젤 위에 제작하기 전에 위치시킴으로써 수축을 억제 시킨다. 하지만, 이것은 고가의 하이드로젤을 소모시키고, 이러한 여분의 제작 공정은 인공피부 개발의 반복성 및 비용적인 측면에서 한계점을 가지고 있다. 일반적으로 콜라겐 등을 이용한 인공피부의 제작방법은 진피층 형성에 따른 재료의 수축이 완료된 후 표피층 형성을 유도하기 때문에 초기에 설계한 인공피부의 크기보다 작은 사이즈로 제작될 뿐만 아니라, 수축 후의 크기 변형이 일정하지 않아 최종 완성된 인공피부의 사이즈 예측이 힘들어 공정 프로토콜의 확립에 어려움이 있다. 이에, 일부 연구에서는 합성폴리머 등을 이용한 골격구조의 사용을 통해 수축 방지를 시도하고 있으나, 이 경우 골격 구조 안에 세포와 혼합된 하이드로겔이 담지되는 형태이므로, 실제 인공피부의 재현이 어려운 단점이 있다(B S Kim et al., "Direct 3D-cell printing of human skin with functional transwell system", Biofabrication 9 (2017) 025034).
또한, 현재까지 개발된 인공피부는 표피와 진피층 사이에 존재하는 기저막(basement membrane)이 부재하여, 이에 따른 두 조직간의 결착력 소실은 이식 후 기계적 마찰 등에 의해 표피층이 탈락되는 물집(blister) 현상의 주원인이 되며 이식한 피부의 흡입율을 떨어뜨리는 원인이 된다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 인공피부 제작을 위해 사용되었던 콜라겐 소재의 단점인 진피층 수축 현상을 제어하고, 표피층의 부착능을 향상할 수 있는, 알지네이트 및 젤라틴을 포함한 바이오겔을 개발하였다.
일 양상은 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔, 및 상기 바이오겔에 혼입된 진피 형성세포를 포함하는 진피층; 및 표피 형성세포를 포함하는 표피층을 포함하는 인공피부를 제공하는 것이다.
다른 양상은 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔, 및 상기 바이오겔에 혼입된 진피 형성세포를 포함하는 진피층; 및 표피 형성세포를 포함하는 표피층을 포함하는 인공피부를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔, 및 상기 바이오겔에 혼입된 진피 형성세포를 포함하는 진피층; 및 표피 형성세포를 포함하는 표피층을 포함하는 인공피부를 제공한다.
본 명세서에서 용어, "인공피부"는 창상 피복제로 사용하는 것과 배양피부에 의한 피부 대체물로 나뉘는 인위적인 피부를 포함하는 것으로, 피부 세포와 피부 구성물질 등을 이용하여 3차원적으로 피부를 재구성한 것으로써, 실제 피부와 유사한 형태학적, 생리학적 특성을 나타내기 때문에 피부 모사체(skin equivalent 또는 reconstructed skin)라고도 불린다.
상기 바이오겔은 알지네이트 및 젤라틴을 포함하고, 상기 알지네이트 및 젤라틴은 각각 가교된 것일 수 있다. 또한, 상기 바이오겔은 세포를 3차원으로 공배양할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이오겔은 진피 형성세포를 3차원으로 배양할 수 있다. 또한, 상기 바이오겔은 콜라겐을 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "알지네이트(Alginate)"는 그의 일반적 의미로 사용되고, 알긴(algin), 알긴산의 염, 및 알긴산의 유도체 및 알긴산 자체를 포함한다. 상기 알지네이트는 칼슘, 소듐, 포타슘, 암모늄 또는 마그네슘 알지네이트를 포함할 수 있다. 일부 구체예에 있어서 알지네이트는 알긴산의 칼슘, 마그네슘, 및 나트륨염으로 갈조류의 세포벽으로부터 수득할 수 있다. 알지네이트의 일부 상업적인 종류는 해초류로부터 추출될 수 있다. 소듐 알지네이트는 갈조류로부터 추출된 천연 다가음이온성 공중합체(polyanionic copolymer)이고, 글루론산(guluronic acid) 및 만누론산(mannuronic acid) 구성 요소를 포함할 수 있다. 일부 구체예에 있어서, 칼슘, 소듐, 포타슘, 암모늄 및 마그네슘 알지네이트는 수용성이다. 염화 칼슘은 안정하고 일부 경우에 있어서 칼슘 알지네이트로 명명된 수 중 불용성 물질을 형성하기 위하여 소듐 알지네이트를 가교하는데 사용될 수 있다. 알지네이트는 글루로네이트(guluronate) (G) 및 만누로네이트(mannuronate) (M) 단량체의 공중합체일 수 있다. G 및 M 단위는 일반적으로 GG, MM, 및 MG/GM 블록으로 서로 연결된다. 이들 블록의 비율, 분산, 및 길이는 알지네이트 분자의 화학적 및 물리적 특성을 결정할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "젤라틴(gelatin)"은 동물의 뼈, 연골, 가죽 등 결합조직의 주요 단백질 성분인 콜라겐의 부분적인 가수분해에 의해 얻어지는 단백질을 의미할 수 있다. 상기 젤라틴은, 순수 젤라틴 외에, 젤라틴 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 젤라틴 유도체는 프탈화 젤라틴, 에스터화 젤라틴, 아미드화 젤라틴, 또는 포르밀화 젤라틴 중에서 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 젤라틴과 관련하여, 그의 종류 (원천)은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 포유류, 어류, 예를 들면, 소 뼈, 소 피부, 돼지 뼈, 돼지 피부 등으로부터 유래된 다양한 젤라틴을 사용할 수 있다. 또한, 상기 젤라틴은 분자량이 10,000 내지 30,000인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 알지네이트는 바이오겔 100 중량%에 대하여 0.1 내지 10 중량%, 0.5 내지 10 중량%, 1 내지 10 중량%, 1 내지 8 중량%, 1.5 내지 8 중량%, 1.5 내지 6 중량%, 2 내지 6 중량%, 또는 2.5 내지 6 중량%로 포함된 것일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 알지네이트의 함량이 높으면 재료의 강도(stiffness)가 증가하여 세포 부착능이 떨어지게 될 수 있고, 알지네이트의 함량이 낮으면 재료의 물성이 저하되어 3차원 형태로 배양이 어려운 문제가 있다. 따라서, 상기 바이오겔은 알지네이트를 상기 범위의 함량으로 포함할 경우, 세포 부착능 및 세포 배양 능력이 개선될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 젤라틴은 바이오겔 100 중량%에 대하여 3 내지 15 중량%, 4 내지 13 중량%, 5 내지 12 중량%, 5 내지 10 중량%, 5.5 내지 10 중량%, 6 내지 10 중량%, 6.5 내지 10 중량%, 또는 7 내지 10 중량%로 포함된 것일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 젤라틴의 함량이 높으면 구조체의 형상을 유지할 수 없을 정도의 물성을 가지므로 세포 배양이 어려울 수 있고, 젤라틴의 함량이 낮으면 세포 부착능이 떨어지는 문제가 있다. 따라서, 상기 바이오겔은 젤라틴을 상기 범위의 함량으로 포함할 경우, 세포 부착능 및 세포 배양 능력이 개선될 수 있다.
상기 바이오겔은 이중 가교를 갖는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 이중 가교는 상기 알지네이트 및 젤라틴이 각각 가교된 것을 의미할 수 있으며, 이는 알지네이트와 젤라틴 사이의 가교와는 구분된다. 예를 들면, 상기 가교된 젤라틴에 의해 알지네이트가 고정되고, 상기 가교된 알지네이트에 의해 젤라틴이 고정되어 있는 것일 수 있다. 또한, 특정 이론에 제한됨이 없이, 상기 알지네이트 및 젤라틴 각각의 가교인 이중 가교에 의해 세포 배양 또는 세포 분화 온도에서 겔화의 상태를 유지할 수 있다. 통상적인 세포 배양 온도 또는 세포를 다른 세포로 분화시키는 온도인 세포 분화 온도에서 젤라틴은 졸화되어 바이오겔로부터 빠져나올 수 있다. 따라서, 통상적인 젤라틴은 지지체로서 사용하기 위해 안정성을 높여주기 위한 독성의 화학물질을 사용해야 한다. 그러나, 일 구체예에 따른 바이오겔은 이단계 가교에 의한 상기한 이중 가교에 의해 화학적 물질이 없이도 젤라틴이 세포 배양 또는 세포 분화 온도에서 녹아서 바이오겔로부터 실질적으로 빠져나오지 않을 수 있다. 상기 젤라틴이 바이오겔로부터 실질적으로 빠져나오지 않는다는 것은 세포의 배양 또는 세포의 분화시에 세포를 3차원적으로 배양할 수 있을 정도로 바이오겔이 3차 구조의 형태를 가지는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 상기 가교는 화학적 가교제 의한 것이 아닌 물리적 가교인 것일 수 있다. 또한, 일구체예에 따른 바이오겔은 화학적 가교제를 사용하지 않고도, 이단계 가교에 의해 물리적 물성이 강화된 것일 수 있다.
상기 바이오겔에 피부 상태 개선용 또는 피부 질환 치료용 약물이 담지된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 약물은 항균, 항염증, 항산화, 피부 상처 치유용, 피부 건조증 개선용, 피부 염증 개선용, 피지분비억제용, 피부질환 관련 미생물의 생육 억제용, 피부세포 산화 방지용, 피부 영양 개선용, 피부 노화 방지용, 피부 보습용, 피부 미백용, 지루성 피부염 치료용, 무좀 치료용, 건선 치료용, 습진 치료용, 여드름 피부 질환 치료용, 아토피 피부 질환 치료용, 피부 색소 질환 치료용, 또는 피부암 치료용 약물일 수 있다. 예를 들어, 상기 약물은 사이토크롬 C (cytoC: cytochrome C), 염기성 섬유모세포 생장인자 (bFGF: Basic fibroblast growth factor), 표피증식인자(EGF: epidermal growth factor), 아스코르브산, 또는 리보플라빈일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 바이오겔은 높은 약물 담지 효율과 장기간에 걸쳐 약물의 서방형 방출이 이루어짐을 확인하였다. 따라서, 상기 장기간 약물 효과가 필요한 약물의 경우, 상기 바이오겔에 담지되어 효율적인 치료 효과를 발생시킬 수 있다.
상기 바이오겔에 진피 형성세포가 혼입되는 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 진피 형성세포는 알지네이트 및 젤라틴을 포함한 바이오겔에 혼입되어 배양되는 것일 수 있다.
상기 진피 형성세포는 진피를 구성하는 모든 세포를 의미하는 것으로, 예를 들어, 무세포진피 파우더, 섬유아세포 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 무세포진피 파우더는 피부조직 내 진피층의 3차원적 구조를 손상시키지 않고 다양한 구조 단백질 및 성분들을 유지한 상태에서 면역반응의 대상인 세포성 항원과 표피만을 선별적으로 제거한 것이다. 상기 섬유아세포는 표피세포와의 상호작용을 통해 안정적으로 구조형성 단백질을 생산하도록 하며, 이로 인해 실제 피부와 유사한 진피 표피연결부 (Dermal epidermal junction, DEJ) 구조를 형성할 수 있다.
상기 표피 형성세포는 표피를 구성하는 모든 세포를 의미하는 것으로, 예를 들어, 상기 표피 형성세포는 각질형성세포일 수 있다. 상기 각질형성세포는 피부의　각질층으로　분화하는　과정에서　케라틴을　생성하는　표피와　구강　상피층의　세포로서, 피부　표피　세포의　95%를　차지한다.
상기 진피 형성세포 및 표피 형성세포는 포유류의 피부조직으로부터 분리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간의 피부조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
일 양상에 따른 인공피부는 형태학상으로 인체 피부의 표피와 매우 유사하게 기저층, 유극층, 과립층, 각질층을 갖는 중층의 표피일 수 있다. 특히, 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔 및 진피 형성세포를 포함하는 진피층은 시간이 경과한 후에도 수축 현상이 일어나지 않고, 표피 형성세포의 부착 효율을 현저히 증가시킬 수 있다.
일 양상에 따른 인공피부는 인간을 포함하는 포유류와 관련된 피부의 생리학적, 분자학적 연구의 수행에 유용하게 적용될 수 있다. 뿐만 아니라, 통상적인 방법으로 피부접촉물질에 대한 피부독성 검사에도 사용될 수 있다. 상기 피부접촉물질은 외용 제재, 화장품, 섬유, 또는 세제 등의 피부에 접촉하는 모든 물질을 총칭한다. 또한, 일 양상에 따른 인공피부는 통상적인 방법에 의하여 인간을 포함하는 포유류의 화상, 창상, 피부궤양 등으로 피부가 결손된 부위 또는 당뇨병성 족부궤양 부위에 이식하기 위한 치료 목적으로 적용될 수 있다. 일 양상에 따른 인공 피부는 인체를 대상으로 적용되는 것이 바람직할 수 있다.
다른 양상은 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔, 및 상기 바이오겔에 혼입된 진피 형성세포를 포함하는 진피층; 및 표피 형성세포를 포함하는 표피층을 포함하는 인공피부를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 바이오겔, 인공피부 등의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 인공피부를 제조하는 방법은 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔을 겔화하는 단계; 상기 겔화가 완료된 바이오겔에 진피 형성세포를 혼입하여 배양하는 단계; 및 상기 배양을 통해 제조된 진피층에 표피 형성세포를 부착시키고 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 바이오겔을 겔화하는 단계는 캐스팅 겔(casting gel)을 1차 겔화하는 단계; 및 겔화된 캐스팅 겔 상에서 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오 겔을 2차 겔화하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 캐스팅 겔은 바이오겔을 겔화시키는 성분으로, 캐스팅 버퍼를 사용한 경우 보다 겔화 속도는 느리지만, 기공의 형성이 균일하게 표면까지 이루어지는 장점이 있다.
상기 진피 형성세포는 인간을 포함하는 포유류의 피부 조직으로부터 분리 및 배양한 것이 바람직하며, 상기 세포의 분리 및 배양 방법에는 특별한 제한이 없으며, 통상적으로 알려진 모든 방법을 사용 가능하다.
상기 표피층을 제조하는 단계는 상기 진피층에 표피 형성세포를 부착시키고 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 표피 형성세포의 배양 단계에 있어서, 배양 조건은 일반적인 생체 세포 조건을 따르며, 배지 또한 생체 세포 배양에 사용 가능한 것이면 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 배양 온도는 30 내지 40℃, 바람직하게는 37℃로 하고, 배양 기간은 7 내지 10 일 동안으로 할 수 있으며, 배양 배지로서 케라틴 세포 성장 배지(Keratinocyte Growth Media; KGM) 또는 Epi-life (예컨대, Cascade Biologics, Inc, Portland, OR 제품 등) 등으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 각질형성세포의 배양은 초기 16 내지 24 시간 동안은 배지에 침지시켜 배양하고, 그 후 12 내지 14 일 동안은 공기 중에 노출시켜 배양하는 것이 좋다. 이와 같이, 배양 후기에 공기에 노출시켜 배양함으로써, 배양된 피부의 적절한 중층화를 유도할 수 있어서, 생체내 피부와 유사한 성상의 인공피부를 얻는데 유리할 수 있다.
일 양상에 따른 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔은 기존의 인공 진피층 형성에 사용되었던 콜라겐의 진피층 수축 현상 문제점을 해결할 수 있다.
일 양상에 따른 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔은 알지네이트 및 젤라틴의 함량 또는 바이오겔의 겔화 방법을 조절함으로써, 표피층의 부착능을 향상시킬 수 있다.
따라서, 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔을 이용하여 제조된 인공피부는 수축 현상을 방지하여 제조 공정의 프로토콜 확립이 가능하고, 표피 세포의 부착능이 향상되어 보다 효율적으로 인공피부를 제조할 수 있다.
일 양상에 따른 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔은 효과적인 약물 담지 및 서방형 방출 기능이 있으므로, 장기간 효과를 필요로 하는 약물의 전달체로 활용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 제작된 알지네이트 기반의 바이오겔 (BG), 기존의 바이오겔 (HG, CG, 및 MG), 및 배양 접시 (Culture plate)에서 배양한 세포의 세포 생존능을 확인한 그래프이다.
도 2는 콜라겐 또는 알지네이트 바이오겔을 이용하여 형성된 진피층의 4일 후 수축 정도를 육안으로 관찰한 사진이다.
도 3은 일 실시예에서 제조된 바이오겔을 이용한 진피층 형성을 확인한 도면으로, 구체적으로는 측면 및 윗면을 육안으로 관찰한 사진, H&E 염색 및 MT 염색 후 현미경을 통해 관찰 사진이다.
도 4는 일 실시예에서 제조된 바이오겔의 겔화 방법을 달리한 경우, 제조된 표피 세포의 부착능을 확인한 도면으로, 구체적으로는 겔화된 바이오겔의 표면을 주사전자현미경을 통해 관찰한 사진, 및 겔화된 바이오겔에 대한 표피 형성세포의 부착능을 비교한 회흐스트 염색 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 일 실시예에서 제조된 바이오겔의 젤라틴 함량을 달리한 경우, 제제조된 표피 세포의 부착능을 비교한 도면으로, 구체적으로는 겔화된 바이오겔에 대한 표피 형성세포의 부착능을 비교한 회흐스트 염색 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 사이토크롬 C를 이용한 예비 실험에서 본 발명의 바이오겔의 약물 담지 및 방출 기능을 확인한 것으로, 구체적으로, 도 5a는 바이오 겔의 약물 담지 양(ug) 및 백분율(%)을 나타낸 도면이고, 도 5b는 500 ug/ml 농도의 사이토크롬 C를 바이오겔에 로딩한 경우 시간 경과에 따른 바이오겔의 약물 방출 양(ug)을 나타낸 도면이다.
도 7은 약물 효과를 나타낼 수 있는 bFGF를 이용한 실험에서 본 발명의 바이오겔의 약물 담지 및 방출 기능을 확인한 것으로, 구체적으로, 최종 담지 양(ug) 및 시간 경과에 따른 방출 양(ug)을 나타낸 도면이다.
도 8은 일 실시예에서 제조된 바이오겔을 이용하여 제작된 인공피부의 표피층을 관찰한 현미경 사진, 및 ImageJ S/W를 이용하여 측정된 표피층의 두께의 평균 값을 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 알지네이트 기반의 바이오겔의 제조
3D 공배양이 가능한 바이오젤을 제조하기 위하여 이단계 가교(two-step crosslinking)를 수행하였다. 구체적으로, 젤라틴(porcine skin type A, Sigma, 미국) 3g을 DPBS(Dubecco's Phosphate-Buffered Saline)(Welgene, 한국) 100㎖에 넣고 자력가열 교반기에서 60℃로 유지하면서 완전히 용해시켜 젤라틴 용액을 제조하였다. 이후, 알지네이트 분말(Sigma, 미국) 2g을 상기 제조한 젤라틴 용액에 첨가하여 1시간 동안 자력가열 교반기를 사용하여 완전히 용해시켜, 알지네이트-젤라틴 혼합 용액을 제조하였다. 상기 혼합 용액을 0.2㎛의 시린지 필터로 여과한 후 배지병(media bottle)에 보관하여 사용하였다. 다음으로는 이단계 가교를 수행하였다. 이단계 가교는 1차적으로 젤라틴을 가교하기 위해 상기 혼합 용액을 4℃에서 30분간 겔화시켰고, 2차적으로 알지네이트를 가교하기 위해 300 mM CaCl2 용액과 혼합하여 4℃에서 30분간 반응시켰다. 상기한 바와 같이 이단계 가교를 수행함으로써 알지네이트 및 젤라틴 혼합 하이드로젤을 제조하였다.
실시예 2. 바이오겔의 세포 독성 확인
상기 실시예 1에서 제작된 알지네이트 기반의 바이오겔의 세포 독성을 확인하기 위하여, 조골전구세포 MC3TC-E1 및 파골전구세포 RAW264.7을 각각 알지네이트 기반의 바이오겔 또는 배양 접시에 부착시킨 후 배양하였다. 상기 바이오겔에 MC3TC-E1 및 RAW264.7을 각각 1x106 세포/mL 및 5x105 세포/mL의 양으로 각각 혼합하고 캐스팅 겔을 이용하여 바이오겔과 세포 혼합맥 100 μL를 겔화한 후 MC3TC-E1 배양체와 RAW264.7 배양체를 각각 α-MEM(Welgene, 한국) 100 U/㎖ 및 스트렙토마이신(Welgene, 한국) 100 ㎕/㎖이 보충된 성장배지에서 배양하였다.
1일, 3일, 및 7일 동안의 세포 증식을 Cellrix® Viability Assay kit (B1007)을 이용하여 정량적으로 비교하였다. 도 1은 실시예 1에서 제작된 알지네이트 기반의 바이오겔 (BG), 기존의 바이오겔 (HG, CG, 및 MG), 및 배양 접시 (Culture plate)에서 배양한 세포의 세포 생존능을 확인한 그래프이다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 세포의 증식을 Cellrix Cell Viability assay kit를 이용하여 보다 정량적으로 확인한 결과, MC3TC-E1 및 RAW264.7 세포 모두 배양 7일 차까지 바이오겔 내에서 잘 증식되는 것을 확인할 수 있다. 특히, 본 발명의 바이오겔에서의 7일 차의 세포 증식능은 배양 접시와 유사한 수준이고, 비교군인 기존의 바이오겔에 비해서는 높은 수준임을 확인하였다.
따라서, 상기 결과를 통해, 일 양상에 따른 본 발명의 알지네이트 기반읜 바이오겔은 세포 독성이 없음을 확인할 수 있다.
실시예 2. 알지네이트 기반의 바이오겔의 진피층 수축 제어 효과 및 진피층 형성 확인
2-1. 알지네이트 기반의 바이오겔을 이용한 진피층 수축 제어 효과 확인
상기 실시예 1에서 제작된 알지네이트 기반의 바이오겔은 기존의 인공 피부 제작에 이용된 콜라겐 기반의 겔에 비해 진피층 수축 제어 효과가 있음을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 바이오겔 0.5 ml를 24 웰 플레이트에 넣은 후 4 ℃에서 1차 겔화시켰다. 1차 겔화된 바이오겔 위에 캐스팅 버퍼(casting buffer) 0.5 ml를 넣은 후, 4 ℃에서 2차 겔화시켰다. 겔화가 완료된 후 섬유아세포 세포주 (Fibroblast cell line (CCD-986SK))를 분주하고 배양시켰다. 상기 과정을 총 5회 반복하였다. 일정 시간(예를 들어, 7일, 14일, 21일) 경과 후에, 버니어 캘리퍼스를 활용하여 배양된 지지체의 지름을 측정하고, 이의 평균값 비교를 통해 수축 비율을 계산하였다. 대조군으로 콜라겐 겔, 및 콜라겐 겔에 각질형성세포를 분주하여 배양한 지지체의 지름을 측정하였다.
하기 표 1은 콜라겐 기반의 하이드로겔, 및 알지네이트 기반의 바이오겔을 이용한 경우의 배양 지지체의 지름 값을 나타낸 것이다. 도 2는 콜라겐 또는 알지네이트 바이오겔을 이용하여 형성된 진피층의 4일 후 수축 정도를 육안으로 관찰한 사진이다.
구분 시험결과 (단위: mm)
1 2 3 4 5 평균
콜라겐 1
(세포 없음)		 9.62 9.58 9.55 9.51 9.54 9.56
콜라겐 2
(세포 있음, 7일 후)		 3.08 3.02 3.00 3.01 3.04 3.03
알지네이트 1(세포 없음) 9.15 9.48 9.57 9.58 9.49 9.45
알지네이트 2(세포 있음, 7일 후) 9.08 9.27 9.42 9.41 9.48 9.33
알지네이트 3(세포 있음, 14일 후) 9.55 9.51 9.51 9.60 9.61 9.56
알지네이트 4(세포 있음, 21일 후) 9.68 9.53 9.69 9.57 9.42 9.58
그 결과, 상기 표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 콜라겐 기반의 겔은 각질형성세포 유무에 따라, 배양 후 겔의 지름이 현저히 감소하였고, 구체적으로는 콜라겐 기반의 겔에 각질형성세포를 더하여 배양하는 경우, 약 68.3%로 수축이 일어나 최종적으로 약 31%의 겔이 유지됨을 확인하였다.
이와 달리, 알지네이트 기반의 바이오겔은 각질형성세포 유무에 따라, 배양 후 겔의 지름 변화가 거의 없었으며, 구체적으로는 알지네이트 기반의 바이오겔에 각질형성세포를 더하여 배양하는 경우, 최대 약 1.3%로 수축이 일어나, 약 98.7%로 겔이 유지됨을 확인하였다. 특히, 7일, 14일, 21일 경과 후에도 배양 후 겔의 지름 변화가 거의 나타나지 않으므로, 장기간 보관 시에도 겔의 일정한 크기를 유지할 수 있는 우수한 수축 제어 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
상기 결과를 통해, 기존의 인공피부 제작을 위해 사용되었던 콜라겐 기반의 겔은 진피 세포 증식에 따른 수축 현상이 일어나는 문제점이 존재하며, 더욱이 수축 후의 크기 변형도 일정하지 않아, 최종 완성된 인공 피부의 크기 예측이 어려우므로 제조 공정 프로토콜을 확립하기 어려운 문제점이 존재하였다.
이와 달리, 알지네이트 기반의 바이오겔은 진피 세포 증식에 따른 수축 현상을 제어할 수 있으므로, 재료의 수축이 일어나지 않아 보다 안정적으로 표피층 형성을 유도할 수 있어 경제적이고, 실제 인공피부의 재현이 가능한 장점이 있음을 확인할 수 있다.
2-2. 알지네이트 기반의 바이오겔을 이용한 인공 진피층 형성 확인
상기 실시예 2-1에서 진피층 수축 제어 효과가 확인된 알지네이트 기반의 바이오겔이 실제로 인공 진피층 형성이 가능한지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 캐스팅 겔(casting gel) 500 ul를 24 웰 플레이트에 넣은 후, 인서트(insert)를 삽입하여 굳혔다. 상기 실시예 1에서 제조된 바이오겔에 섬유아세포 세포주 (CCD-986SK) 를 혼합하여 24 웰 인서트 80 ul에 주입한 후 겔화시켰다. 겔화가 완료된 이후, 배지 (High glucose DMEM + 10% inactivated FBS + 1% P/S)를 넣어 2-3일에 한번씩 배지를 교환해주며 배양하였다. 이후, 진피층 형성을 확인하기 위해, H&E 염색(Hematoxylin and eosin stain) 및 MT 염색(Masson's trichrome stain)을 각각 수행하였다. H&E 염색은 파라포름알데하이드(PFA: paraformaldehyde)에 상기 배양된 배양체를 고정한 후, 동결 절단(cryosection)을 통해 슬라이드를 제작하였다. 섹션이 완료된 슬라이드 글라스를 D.W.에 담가 OCT compound(Optimal Cutting Temperature)를 제거하였다. 헤마톡실린 염색을 5분 동안 진행한 후, 흐르는 물에 5분 동안 세척하였다. 이오신 Y 용액을 10분 동안 처리한 후, 흐르는 물에 5분 동안 세척하였다. 최종적으로, 탈수시킨 후 마운팅(mounting)하여 말린 후 현미경을 통해 관찰하였다. 또한, MT 염색은 PFA에 상기 배양된 배양체를 고정한 후, 동결 절단을 통해 슬라이드를 제작하였다. 섹션이 완료된 슬라이드 글라스를 D.W.에 담가 OCT compound(Optimal Cutting Temperature)를 제거하였다. 보우잉 시약(Bouin’s solution)에 넣고 오븐에서 1시간 동안 처리한 후, 흐르는 물에 5분 동안 세척하였다. 비에브리치 진홍색(Biebrich scarlet)을 슬라이드 위에 분주하여 5분 동안 처리한 후, 흐르는 물에 5분 동안 세척하였다. 아닐린블루(Aniline blue)를 슬라이드 위에 분주하여 15분 동안 처리한 후, 1% 아세트산에 넣고 1분 동안 처리하였다. 최종적으로, 탈수시킨 후 마운팅하여 말린 후 현미경을 통해 관찰하였다.
도 3은 일 실시예에서 제조된 바이오겔을 이용한 진피층 형성을 확인한 도면으로, 구체적으로는 측면 및 윗면을 육안으로 관찰한 사진, H&E 염색 및 MT 염색 후 현미경을 통해 관찰 사진이다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 바이오겔은 각질형성세포를 혼합하여 겔화 후 배양할 경우, 인공 진피층을 성공적으로 형성할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3. 알지네이트 기반의 바이오겔의 표피층 부착능 향상 효과
3-1. 겔화 방법에 따른 표피층의 부착능 향상 효과
상기 실시예 1에서 제작된 알지네이트 기반의 바이오겔을 이용한 인공피부 제작 과정에서 겔화 방법을 달리하는 경우, 표피층의 부착능을 향상할 수 있음을 확인하고자 하였다. 캐스팅 버퍼 및 캐스팅 겔을 각각 이용하여 겔화하는 경우, 형성된 표피 세포의 부착능을 비교하였다.
구체적으로, 캐스팅 버퍼를 이용하여 겔화하는 경우, 상기 실시예 1에서 제작된 바이오겔 0.5 ml를 24 웰 플레이트에 넣은 후 4 ℃에서 1차 겔화시키고, 이 위에 캐스팅 버퍼 0.5 ml를 넣은 후 4 ℃에서 2차 겔화시켰다. 겔화가 완료된 후 세포를 분주하고 배양하였다. 캐스팅 겔을 이용하여 겔화하는 경우, 캐스팅 겔 0.5 ml를 24 웰 플레이트에 넣은 후 4 ℃에서 1차 겔화 시키고, 이 위에 상기 실시예 1에서 제작된 바이오겔 0.5 ml를 넣은 후 4 ℃에서 2차 겔화시켰다. 겔화가 완료된 후 세포를 분주하고 배양하였다. 이후, 회흐스트 염색 (Hoechst stain) 및 주사전자현미경 (SEM) 사진을 통해, 표피 세포의 부착능을 비교하였다.
도 4는 일 실시예에서 제조된 바이오겔의 겔화 방법을 달리한 경우, 제조된 표피 세포의 부착능을 확인한 도면으로, 구체적으로는 겔화된 바이오겔의 표면을 주사전자현미경을 통해 관찰한 사진, 및 겔화된 바이오겔에 대한 표피 형성세포의 부착능을 비교한 회흐스트 염색 사진을 나타낸 것이다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 겔화 방법을 달리하여 겔화된 바이오겔의 표면을 관찰한 결과, 캐스팅 버퍼를 이용한 겔화 방법으로 겔화된 바이오겔은 표면이 매끈하게 형성된 반면에, 캐스팅 겔을 이용한 겔화 방법으로 겔화된 바이오겔은 표면이 세포 부착에 보다 용이한 형태인, 기공이 규칙적으로 형성되어 있음을 확인하였다. 또한, 캐스팅 버퍼를 이용하여 겔화한 경우 보다, 캐스팅 겔을 이용하여 겔화한 경우에 바이오겔에 대한 표피 형성세포의 부착능이 현저히 우수함을 회흐스트 염색을 통해 확인하였다.
따라서, 상기 결과를 통해, 캐스팅 버퍼를 이용하여 바이오겔을 급속히 겔화시키는 방법 보다, 캐스팅 겔을 이용하여 바이오겔의 겔화 유도인자인 Ca2+를 방출하여 서서히 겔화시키는 방법이 표피세포의 부착능 향상을 위해 보다 유리함을 확인할 수 있다.
3-2. 바이오겔의 알지네이트 및 젤라틴 함량에 따른 표피층의 부착능 향상 효과
알지네이트 기반의 바이오겔을 이용한 인공피부를 제작하는 경우, 알지네이트 기반의 바이오겔 내의 알지네이트 및 젤라틴 함량을 조절하는 경우, 표피층의 부착능을 향상할 수 있음을 확인하고자 하였다. 실시예 2에서 진피층 수축 제어 효과를 확인한 바이오겔(젤라틴 2.5 w/w% 함유)에서 젤라틴의 함량만을 증가시켜 바이오겔을 이용하여 제조된 표피 세포의 부착능을 비교하였다.
구체적으로, 젤라틴의 함량을 5 w/w%, 7.5 w/w%, 또는 10 w/w%로 증가시킨 바이오겔을 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다. 캐스팅 겔을 이용한 실시예 3에 기재된 겔화 방법을 이용하였다. 이후, 회흐스트 염색을 통해 표피 세포의 부착능을 확인하였다.
도 5는 일 실시예에서 제조된 바이오겔의 젤라틴 함량을 달리한 경우, 제조된 표피 세포의 부착능을 비교한 도면으로, 구체적으로는 겔화된 바이오겔에 대한 표피 형성세포의 부착능을 비교한 회흐스트 염색 사진을 나타낸 것이다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 젤라틴 농도의 증가에 따라 표피 세포의 부착능이 향상되는 것을 확인하였다. 따라서, 표피층을 포함한 인공피부의 제작을 위해, 수축 제어가 가능한 알지네이트 기반의 바이오겔에서 젤라틴의 함량을 상향 조설함으로써 표피세포의 일종인 각질형성세포(HaCaT, Human Keratinocyte Cell Line)의 부착 효율을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
다만, 바이오겔의 세포 부착능 및 물성 유지를 위해 알지네이트 및 젤라틴의 농도의 비율이 일정 수준으로 유지되어야 한다. 구체적으로, 도 4에 나타낸 바와 같이, 젤라틴의 함량이 7.5 w/w% 미만인 경우, 예를 들어, 5 w/w%인 경우에는, 7.5 w/w% 이상인 경우에 비해 세포 부착능이 현저히 떨어짐을 확인할 수 있다. 또한, 젤라틴의 함량이 10 w/w% 초과할 경우, 구조체의 형상을 유지할 수 없을 정도의 물성을 가지므로, 세포 배양을 할 수 없음을 확인하였다.
실시예 4. 알지네이트 기반의 바이오겔의 약물 담지 및 방출 효과
알지네이트 기반의 바이오겔의 약물 담지 및 방출 효과를 확인하고자 하였다. 우선 시험 단백질로서 사이토크롬 C를 이용한 예비실험을 진행하였고, 추가로 약물의 기능을 하는 염기성 섬유모세포 생장인자 (bFGF: Basic fibroblast growth factor)를 이용한 약물 담지 및 방출 효과를 확인하였다.
4-1. 사이토크롬 C를 이용한 약물 담지 및 방출 효과 확인
실시예 1에서 제조된 바이오겔 40ul을 이용하여 실시예 3에 기재된 방법으로 겔화시켰다. 50 ug/ml, 100 ug/ml, 또는 500 ug/ml 농도로 제조된 사이토크롬 C 용액 1ml에 바이오겔 1개씩을 담궈 놓은 후, 1일 동안 상온에서 사이토크롬 C를 바인딩시켰다. 이후, 약물이 로딩된 바이오겔을 세척한 후, D.W. 1ml씩 담지시켜 약물 방출을 유도하였다. 측정하고자 하는 시점 별로 샘플을 수거하여 보관한 후 ELISA 분석을 통해 약물 담지 및 방출 양을 측정하였다.
도 6은 사이토크롬 C를 이용한 예비 실험에서 본 발명의 바이오겔의 약물 담지 및 방출 기능을 확인한 것으로, 구체적으로, 도 5a는 바이오 겔의 약물 담지 양(ug) 및 백분율(%)을 나타낸 도면이고, 도 5b는 500 ug/ml 농도의 사이토크롬 C를 바이오겔에 로딩한 경우 시간 경과에 따른 바이오겔의 약물 방출 양(ug)을 나타낸 도면이다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 알지네이트 기반의 바이오겔의 약물 담지 효율은 약물 농도가 증가함에 따라 다소 감소하는 추세를 나타내긴 하였으나, 최대 500 ug/ml 농도로 약물을 담지한 경우, 약 80%가 효율적으로 담지됨을 확인하였다. 또한, 약물 방출은 3주에 걸쳐 서방형 방출(sustained release)을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 바이오겔은 장기간의 약물 효과가 필요한 치료에 효율적인 약물의 전달체로 활용 가능함을 확인할 수 있다.
4-2. 염기성 섬유모세포 생장인자(bFGF)를 이용한 약물 담지 및 방출 효과 확인
실시예 1에서 제조된 바이오겔 40ul을 이용하여 실시예 3에 기재된 방법으로 겔화시켰다. 50 ug/ml 농도로 제조된 bFGF 용액 1ml에 바이오겔 1개씩을 담궈 놓은 후, 1일 동안 상온에서 사이토크롬 C를 바인딩시켰다. 이후, 약물이 로딩된 바이오겔을 세척한 후, D.W. 1ml씩 담지시켜 약물 방출을 유도하였다. 측정하고자 하는 시점 별로 샘플을 수거하여 보관한 후 ELISA 분석을 통해 약물 담지 및 방출 양을 측정하였다.
도 7은 약물 효과를 나타낼 수 있는 bFGF를 이용한 실험에서 본 발명의 바이오겔의 약물 담지 및 방출 기능을 확인한 것으로, 구체적으로, 최종 담지 양(ug) 및 시간 경과에 따른 방출 양(ug)을 나타낸 도면이다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 알지네이트 기반의 바이오겔은 초기 처리한 약물의 약 80% (41.3 ug)가 효율적으로 담지할 수 있음을 확인하였다. 또한, 2주에 걸쳐 서방형 방출을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 상기 결과 역시 본 발명의 바이오겔은 일반 약물 제형 보다 장시간에 걸쳐 서서히 방출될 수 있도록 설계된 약물 전달체로 활용 가능함을 확인할 수 있다.
실시예 5. 알지네이트 기반의 바이오겔의 실제 피부와의 기능 비교
5-1. 수분 투과성 비교
실시예 1에서 제작된 알지네이트 기반의 바이오겔의 실제 피부의 기능 중 하나인 수분 흡수력 및 투과성을 측정하기 위해, 식품의약안전처에 2016년 고시된 피부 시험법 가이드라인에 따라 수행하였다. 구체적으로, 상기 바이오겔 시료를 제작하여 지름 5cm 크기로 잘라 페트리디쉬에 놓고 무게(W1)를 재었다. 증류수를 ± 0.5 g으로 정확하게 측정 (W0)하여 시료 위에 첨가하였다. 30분 동안 방치한 후 시료의 무게(W2)를 재었다. 이후, 다음 계산식을 이용하여 흡수력을 측정하였다: 흡수력 (g/m2/hr) = W2-W1 (g)/ 초기 지지체의 면적 (m2)/ 시험 시간(hr). 또한, 다음의 계산식을 이용하여 투과도를 측정하였다: 수분 투과성 (%) = (W1+W0) - W2 / (W1 + W0) X 100.
하기 표 2는 일 양상에 따른 바이오겔의 수분 흡수력 및 수분 투과력을 계산한 결과를 나타낸 것이다.
시료 1 2 3 평균 표준편차
W0 (g) 0.5 0.5 0.5
W1 (g) 9.868 9.333 9.420
W2 (g) 9.875 9.351 9.440
초기 지지체 면적 (m2) 0.002 0.002 0.002
흡수력 (g/m2/hr) 8.849 17.699 17.699 13.274 6.194
수분 투과성 (%) 4.755 4.902 4.838 4.83 0.073
그 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 일 양상에 따른 바이오겔의 흡수력은 14.75 g/m2/hr이고, 수분 투과성은 4.81 %로 측정 되었다. 이러한 수치는 실제 사람 피부의 수분 투과성이 약 15 g/m2/hr인 것으로 미루어 보아, 유의 수준 안에서의 데이터 값으로 확인되었다. 따라서, 상기 결과로부터, 일 양상에 따른 알지네이트 기반의 바이오겔은 실제 피부의 주요 기능 중 하나인 체온 조절을 가능하게 하는 피부의 성능을 가짐, 즉, 실제 피부와 유사한 수분 흡수력 및 투과성을 가짐을 확인 할 수 있다.　
5-2. 표피층의 두께 비교
실시예 1에서 제작된 알지네이트 기반의 바이오겔을 이용하여 제작된 인공 피부의 표피층의 두께를 측정하여, 실제 사람 피부의 평균 표피층 두께와 비교하였다. 구체적으로, CCD-27Sk (Homo sapiens, human) 및 HaCaT (Homo sapiens, human) 세포 (공급원: ATCC, USA)를 10% 소 태아 혈청 (Fetal bovine serum) 및 항생제 (페니실린 (100 Units/mL), 스트렙토마이신 (100 μg/mL))를 포함하는 Eagle 최소 필수 배양액 (MEM: Minimum Essential Medium Eagle)(1X)에서 5±1% CO2, 37±1℃에서 배양하고, 3 ~ 4일마다 계대 배양하였다. 배양된 피부조직을 PFA에 고정시키고, 그 후 수세하여 OCT 화합물에 포매하여 절단(section) 전까지 보관하였다. 동결 절단(Cryosection) 기기를 -20℃로 세팅하고, 조직을 10 μm로 절단하였다. 절단 후 샘플링된 슬라이드 글라스에 D.W. 10분 처리하여 OCT 화합물을 녹여내었다. 그 후, 헤마톡실린 염색 5분, 및 D.W.로 5번 세척한 후 헤마톡실린 용액을 제거한 후 이오신 Y (Eosin Y)를 10분간 처리하였다. D.W.로 5번 세척하였다. 최종적으로 여과지 (Filter paper)로 용액을 제거한 후 마운팅하여 평평하도록 하루 건조 시킨 후, 현미경 관찰을 통해 인공피부가 성공적으로 제작되었음을 확인하였다. 이후, ImageJ S/W를 사용하여 현미경 사진을 바탕으로 표피의 두께를 측정하여 평균값을 산정하였다.
도 8은 일 실시예에서 제조된 바이오겔을 이용하여 제작된 인공피부의 표피층을 관찰한 현미경 사진, 및 ImageJ S/W를 이용하여 측정된 표피층의 두께의 평균 값을 나타낸 도면이다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 일 양상에 따른 바이오겔을 이용하여 제작된 인공피부의 표피층은 실제 사람피부의 평균 표피층 두께와 유사한 수준인 약 200 μm의 두께로 측정되었다. 또한, 상기 인공피부의 표피층에 부착시킨 HaCaT 세포의 안정적인 수직 성장(vertical growth)을 확인하였다. 따라서, 상기 결과로부터, 일 양상에 따른 알지네이트 기반의 바이오겔은 실제 피부의 주요 기능 중 하나인 외부로부터 신체를 보호하는 기능을 가짐, 즉, 실제 사람 피부만큼의 안전성이 확보됨을 확인할 수 있다.

Claims (9)

  1. 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔, 및 상기 바이오겔에 혼입된 진피 형성세포를 포함하는 진피층; 및
    표피 형성세포를 포함하는 표피층을 포함하는 인공피부.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 바이오겔은 0.1 내지 10 중량%의 알지네이트, 및 5 내지 10 중량%의 젤라틴을 포함하는 것인 인공피부.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 진피 형성세포는 무세포 진피 파우더, 섬유아세포 또는 이들의 조합인 것인 인공피부.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 표피 형성세포는 각질형성세포인 것인 인공피부.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 진피층은 엘라스틴(Elastin), 키토산(Chitosan), 글리코사미노글루칸(GAGs; glycosaminoglycans), 히알루론산(HA; hyaluronic acid) 또는 이들의 조합인 진피를 구성하는 세포외기질 (extracellular matrix)을 더 포함하는 것인 인공피부.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 바이오겔에 피부 상태 개선용 또는 피부 질환 치료용 약물이 담지되는 것인 인공피부.
  7. 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오겔을 겔화하는 단계;
    상기 겔화가 완료된 바이오겔에 진피 형성세포를 혼입하여 배양하는 단계; 및
    상기 배양을 통해 제조된 진피층에 표피 형성세포를 부착시켜 배양하는 단계를 포함하는 인공피부를 제조하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 바이오겔을 겔화하는 단계는 캐스팅 겔(casting gel)을 1차 겔화하는 단계; 및 겔화된 캐스팅 겔 상에서 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 바이오 겔을 2차 겔화하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 바이오겔은 0.1 내지 10 중량%의 알지네이트, 및 5 내지 10 중량%의 젤라틴을 포함하는 것인 방법.
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