FR3124394A1 - Procede de consolidation d’un hydrogel alginate / gelatine - Google Patents

Procede de consolidation d’un hydrogel alginate / gelatine Download PDF

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Emma PETIOT
Laura CHASTAGNIER
Audrey CHERBLANC
Morgan DOS SANTOS
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
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Abstract

La présente invention concerne un procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, qui inclut une étape de consolidation par réticulation de l’hydrogel à l’aide d’une solution adaptée, afin de lui conférer des propriétés mécaniques particulièrement avantageuses. L’utilisation de cette solution de réticulation pour consolider la structure d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine constitue également un autre aspect de la présente invention. Dans tous ces aspects de cette invention, l’hydrogel peut en outre comprendre du fibrinogène et/ou des cellules vivantes.

Description

PROCEDE DE CONSOLIDATION D’UN HYDROGEL ALGINATE / GELATINE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la fabrication des matériaux en général, et en particulier des bio-matériaux ou matériaux bio-compatibles.
La présente invention concerne un procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, qui inclut une étape de consolidation par réticulation de l’hydrogel à l’aide d’une solution adaptée, afin de lui conférer des propriétés mécaniques particulièrement avantageuses. L’utilisation de cette solution de réticulation pour consolider la structure d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine constitue également un autre aspect de la présente invention. Dans tous les aspects de cette invention, l’hydrogel peut en outre comprendre du fibrinogène et/ou des cellules vivantes.
ETAT DE LA TECHNIQUE
On connaît de l’état de la technique des structures à base d’hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine mais elles manquent de tenue mécanique satisfaisante, car ces constituants présentent le plus souvent une élasticité limitée (faible module d’Young, notamment), ce qui rend les structures résultantes difficilement manipulables.
La demande internationale publiée sous le numéro W02017115056 décrit la fabrication de substituts corporels à base d’hydrogel comprenant de l’alginate, de la gélatine et du fibrinogène, qui sont ensuite traités avec une solution de réticulation contenant du calcium et de la thrombine.
Les propriétés mécaniques des structures obtenues dans l’art antérieur restent néanmoins insuffisantes pour les rendre aptes à être manipulées. De plus, dans le cas de structures destinées à être implantées dans le corps humain ou animal, et le cas échéant suturées, les procédés de l’art antérieur ne permettent pas d’obtenir des structures qui possèdent les propriétés mécaniques adéquates, et dont la dégradabilité au contact de cellules ou tissus vivants ne soit pas trop rapide.
Par ailleurs, lorsque les structures sont susceptibles d’être cellularisées lors de leur fabrication, il existe un besoin de pouvoir maintenir la survie des cellules. Ainsi, le procédé de préparation de telles structures doit être compatible avec la présence de cellules vivantes et leur maintien en vie.
Un des buts de l’invention est de surmonter ces inconvénients de l'art antérieur, et de permettre en particulier de produire des hydrogels, cellularisés ou non, qui possèdent des caractéristiques mécaniques particulièrement avantageuses et jamais décrites dans l’art antérieur, notamment sur le plan de (i) la résistance mécanique des constituants, (ii) la stabilité dans le temps, (iii) la souplesse et (iv) la résistance à la déchirure et aux chocs.
Il est à cet effet proposé de fournir, selon un premier aspect de la présente invention, un procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant la préparation de l’hydrogel, puis sa mise en contact avec une solution de consolidation comprenant au moins du calcium et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents.
Optionnellement, la solution de consolidation peut aussi contenir de la thrombine si, outre l’alginate et la gélatine, l’hydrogel contient du fibrinogène. Par ailleurs, l’étape de consolidation est compatible avec le fait que l’hydrogel puisse contenir des cellules vivantes.
Selon un deuxième aspect de la présente invention, il est décrit l’utilisation d’une solution telle que décrite ci-dessus pour consolider la structure d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ce qui présente un avantage tout particulier lorsqu’il s’agit de préparer un hydrogel destiné à être implanté dans le corps humain ou animal, c’est-à-dire en tant qu’implant corporel.
Cette utilisation peut également être mise en œuvre pour consolider un hydrogel comprenant en outre du fibrinogène. Par ailleurs, la consolidation peut également être réalisée sur un hydrogel comprenant en outre des cellules vivantes.
En résumé, la présente invention concerne un procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant la préparation de l’hydrogel, puis sa mise en contact avec une solution de consolidation comprenant au moins du calcium et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents.
De préférence, la mise en contact de l’hydrogel avec la solution de consolidation est réalisée par immersion, de préférence totale, de l’hydrogel dans la solution de consolidation, ou bien par pulvérisation de l’hydrogel avec la solution de consolidation.
De préférence, l’hydrogel comprend de 0,5 à 3 % d’alginate et de 1 à 17,5 % de gélatine.
De préférence, l’hydrogel comprend en outre du fibrinogène et en ce que la solution de consolidation comprend en outre de la thrombine.
De préférence, l’hydrogel comprend jusqu’à 2 % de fibrinogène.
De préférence, la solution de consolidation comprend :
- de 0,003 à 30 % de cation divalent,
- de 0,004 à 16 % de transglutaminase, et éventuellement
- de 2 à 25 U/ml de thrombine.
De préférence, l’hydrogel comprend en outre des cellules vivantes intégrées lors de la préparation de l’hydrogel avant sa consolidation.
De préférence, la mise en contact avec la solution de consolidation est réalisée :
- à une température allant de 15 à 40°C, et/ou
- pendant une durée allant de 30 minutes à 6h.
De préférence, l’hydrogel est mis en forme, préalablement à sa consolidation, par une technique de moulage ou d’impression 3D.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une solution comprenant du calcium et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, pour consolider un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine.
DESCRIPTION DES FIGURES
D’autres caractéristiques, buts et avantages de l’invention ressortiront de la description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative, et qui doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels :
La représente la comparaison du module d'Young et de la viscosité d’hydrogels AG et FAG qui constituent les implants selon l’invention.
La représente la comparaison des modules d’Young E0 (Pa) d’un hydrogel AG dans lequel la gélatine est réticulée avec et sans transglutaminase et conservé jusqu’à 7 jours à 37°C.
La représente la comparaison des modules d’Young E0 (Pa) d’un hydrogel AG et d’hydrogels commerciaux réticulés ou non avec la transglutaminase.
La représente la viabilité et la croissance cellulaire mesurées de manière cinétique sur des hydrogels FAG et AG qui constituent les implants selon l’invention, et qui ont été colonisésin vitropar des fibroblastes, après leur fabrication.
La représente la viabilité et la croissance cellulaire mesurées de manière cinétique sur des hydrogels FAG et AG qui constituent les implants selon l’invention, et qui ont été colonisésin vitropar des cellules souches du tissu adipeux, après leur fabrication.
La représente l’activité métabolique d’implants AG selon l’invention à différents points de culture suite à leur colonisationin vitropar une fraction de tissu adipeux purifié, après leur fabrication.
La représente les analyses histologiques par coloration Hématoxyline, Phloxine, Safran (HPS) d’implants AG selon l’invention après 2 jours (4 images de gauche) ou 7 jours (2 images de droite) d’incubationin vitroavec une fraction de tissu adipeux purifié, après leur fabrication (Haut : bords externes des matrices ; Bas : pores internes des matrices ; images prises en lumière blanche ; grossissement 100X ; échelle 100 μm).
La représente l’immunomarquage de la périlipine-1 et la coloration des noyaux cellulaires au Dapi, sur des implants AG selon l’invention après 2 jours (image du haut) ou 7 jours (image du bas) d’incubationin vitroavec une fraction de tissu adipeux purifié, après leur fabrication (imagerie à fluorescence ; grossissement 200X ; échelle 50 μm).
La représente la comparaison des modules d'Young d’implants AG pour des réticulations à durées variables à 21 et 37°C.
La représente la comparaison des modules d’Young E0 et des viscosités d’implants AG et FAG après réticulation avec différentes concentrations en CaCl2, TAG et thrombine.
La représente la comparaison des modules d’Young E0 et des viscosités d’implants AG et FAG après réticulation séquentielle ou concomitante avec CaCl2, TAG et thrombine.
La représente la comparaison des modules d’Young E0 et des viscosités d’implants AG et FAG après réticulation avec une solution contenant du chlorure de calcium ou du chlorure de baryum.
La illustre l’étude de la variation des dimensions et des pores d’implants AG et FAG selon l’invention avant et après réticulation (A) et la l’impact de la stérilisation sur les dimensions et le module d’Young de ces implants (B).
La illustre la répétabilité de la production d’implants AG selon l’invention au niveau des dimensions, du volume et de la porosité.
La illustre la répétabilité de la rétractation d’implants AG selon l’invention après consolidation.
La illustre la répétabilité de la rétractation d’implants AG selon l’invention en fonction de la méthode de stérilisation.
La illustre la répétabilité du diamètre d’extrusion (A) et la de la longueur des pores (B) d’implants AG selon l’invention.
La représente des images de pores de taille variable dans un implant AG selon l’invention.
La représente le plan chirurgical (à gauche) de l’implantationin vivoen sous cutanée (à droite) d’implants AG et FAG selon l’invention.
La représente les analyses histologiques après coloration au trichrome de Masson sur des coupes d’implants AG selon l’invention, après implantation sous-cutanéein vivodans des sites de dos de rat pendant 3 semaines (images à faible, moyen et fort grossissement).
La représente l’analyse sur 28 jours de la survie cellulaire mesurée par l’accumulation de lactate (A) et la représente l’analyse sur 28 jours de la croissance cellulaire suivie par marquage à la calcéine (B) dans un hydrogel FAG cellularisé.
La représente la mesure des modules d’Young (E0) en fonction de la concentration cellulaire initiale présente dans un hydrogel FAG cellularisé.
La représente l’évolution pendant 21 jours de la concentration en lactate mesurée dans les surnageants de culture d’hydrogels AG ou FAG cellularisés et consolidés.
La représente les analyses histologiques après coloration HPS des construits bioimprimés, pleins (planche de gauche) ou poreux (planche de droite), d’hydrogel FAG fibroblastes/cellules endothéliales après 21 jours de culture.
La représente les analyses histologiques après coloration HPS des construits bioimprimés, pleins (planche de gauche) ou poreux (planche de droite), d’hydrogel AG fibroblastes/cellules endothéliales après 21 jours de culture.
La représente l’immunomarquage CD31-DAB (noir) sur des construits bioimprimés pleins, d’hydrogel FAG fibroblastes/cellules endothéliales après 21 jours de culture.
La représente l’immunomarquage CD31-DAB (noir) sur des construits bioimprimés poreux, d’hydrogel FAG fibroblastes/cellules endothéliales après 21 jours de culture.
La représente l’analyse histologique par coloration HPS des peaux reconstruites à partir d’hydrogel FAG bioimprimé en 3D et consolidé avec de la TAG.

Claims (10)

  1. Procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant la préparation de l’hydrogel, puis sa mise en contact avec une solution de consolidation comprenant au moins du calcium et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents.
  2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en contact de l’hydrogel avec la solution de consolidation est réalisée par immersion, de préférence totale, de l’hydrogel dans la solution de consolidation, ou bien par pulvérisation de l’hydrogel avec la solution de consolidation.
  3. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l’hydrogel comprend de 0,5 à 3 % d’alginate et de 1 à 17,5 % de gélatine.
  4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’hydrogel comprend en outre du fibrinogène et en ce que la solution de consolidation comprend en outre de la thrombine.
  5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l’hydrogel comprend jusqu’à 2 % de fibrinogène.
  6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la solution de consolidation comprend :
    - de 0,003 à 30 % de cation divalent,
    - de 0,004 à 16 % de transglutaminase, et éventuellement
    - de 2 à 25 U/ml de thrombine.
  7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l’hydrogel comprend en outre des cellules vivantes intégrées lors de la préparation de l’hydrogel avant sa consolidation.
  8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la mise en contact avec la solution de consolidation est réalisée :
    - à une température allant de 15 à 40°C, et/ou
    - pendant une durée allant de 30 minutes à 6h.
  9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l’hydrogel est mis en forme, préalablement à sa consolidation, par une technique de moulage ou d’impression 3D.
  10. Utilisation d’une solution comprenant du calcium et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, pour consolider un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine.
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