FR2927632A1 - Cornee et muqueuse reconstruites. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un modèle de cornée reconstruite, notamment utilisable en ingénierie tissulaire, un biomatériau utilisable pour la réalisation de cornée reconstruite, ainsi qu'un dispositif de culture permettant une meilleure reproductibilité des cultures du modèle de cornée reconstruite.L'invention concerne également un modèle de muqueuse et un dispositif de culture pour la préparation de ce modèle.

Description

L'invention concerne un modèle de cornée reconstruite en ingénierie tissulaire, un biomatériau utilisable pour la réalisation de cornée reconstruite, ainsi qu'un dispositif de culture permettant une meilleure reproductibilité des cultures du modèle de cornée reconstruite. L'invention concerne également un modèle de muqueuse et un dispositif de culture pour la préparation de ce modèle.

ETAT DE L'ART La reconstruction des cornées par ingénierie tissulaire a pour but 10 d'obtenir des modèles pharmacotoxicologiques et de progresser vers leur utilisation thérapeutique (Germain et al. 2000 ; Carlsson et al. 2003). Les modèles actuels sont constitués d'un support, généralement un gel de collagène, dans lequel sont dispersés des kératocytes pour reconstituer un stroma. Ce stroma est ensemencé par la suite avec des cellules épithéliales 15 et parfois des cellules endothéliales pour reconstituer une cornée artificielle. Il est essentiel d'avoir des cellules en nombre suffisant et bien caractérisées. Il existe deux méthodes pour obtenir de telles cellules : utiliser des lignées transfectées, ou démarrer la culture à partir de cellules humaines primaires. Cette dernière méthode présente le double avantage 20 de donner des modèles plus proches de la physiologie et d'ouvrir des possibilités thérapeutiques. Seules les cellules souches épithéliales cornéennes, localisées dans le limbe, ont été identifiées et caractérisées (Pellegrini et al. 1999 ; 2001). La culture des cellules endothéliales est à ses début et les quantités obtenues restent modestes du fait de leur faible capacité proliférative. Les cellules souches endothéliales n'ont pas été identifiées bien que l'on suspecte la présence de progéniteurs endothéliaux près de la ligne de Schwalbe. Les cellules endothéliales utilisées dans les modèles sont issues de lignées transfectées (Reich) et al. 2005 ; Griffith et al. 1999).

Les kératocytes sont quiescents à l'état physiologique et sont bien identifiés morphologiquement in situ. Ils présentent des phénotypes différents selon les conditions environnementales. Il existe au moins trois phénotypes kératocytaires in vivo : le kératocyte quiescent, le kératocyte activé (fibroblaste) et le myofibroblaste (Musselmann et al. 2003). A ces trois phénotypes s'ajoutent trois types de kératocytes morphologiquement différents en fonction de leur localisation dans l'épaisseur cornéenne. Chez l'homme, il existe des différences morphométriques entre les kératocytes du stroma antérieur (0-200pm), médian (200-400pm) et postérieur (400- 10 600pm). La taille moyen des cellules in situ, lorsqu'elles sont aplaties et étalée, est d'environ 300-400pm (mesuré par microscopie électronique à transmission). Lorsque ces cellules sont en suspension, elles deviennent sphériques et leur taille est beaucoup plus faible mais reste proportionnelle à la taille in situ (environ 5-20pm). La différence la plus importante entre 15 ces trois populations est le volume cellulaire : les kératocytes antérieurs et centraux ont un volume identique d'environ 5.103 pm3 alors que les kératocytes du stroma postérieur ont un volume plus important d'environ 14,4.103 pm3 (Hahnel et al. 2000). Les phénotypes peuvent être différenciés par certains marqueurs : 20 en particulier l'antigène CD34 a été identifié comme marqueur du phénotype kératocytaire dans la cornée. L'alpha actine muscle lisse (a-SMA) est un isoforme de l'actine caractéristique du myofibroblaste qui apparaît lors de la transformation du kératocyte en myofibroblaste dans le processus de cicatrisation. La tendance à l'apoptose des myofibroblastes, normale dans le processus de cicatrisation, et ses différences qualitatives de synthèse des collagènes ne permettent pas la reconstruction d'un stroma en ingénierie tissulaire à partir de ce phénotype ()ester et al. 2003 ; Gabbiani 2003).

L'art antérieur ne propose pas de modèle réellement optimisé pour la culture de cellules de muqueuse. Il n'existe pas à ce jour de modèle de cornée satisfaisant. L'invention se propose de résoudre ces problèmes.

BUTS DE L'INVENTION

L'invention a pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un nouveau support ou dispositif de culture de cellules aptes à la formation d'un modèle de cornée, et/ou d'un 10 biomatériau du type cornée reconstruite dans l'ingénierie tissulaire, et/ou d'un modèle de muqueuse reconstruite. L'invention a pour but de fournir un tel dispositif de culture en particulier de manière automatisée et industrielle. Ainsi l'invention a pour but de fournir un procédé de préparation d'un tel dispositif de culture, 15 stérile, de manière reproductible, sûre et fiable, à grande échelle pour une utilisation industrielle et médicale, notamment afin de permettre la réalisation de criblages haut débit. L'invention a également pour but de fournir un modèle de cornée, notamment pour être utilisé comme une alternative aux tests de toxicité sur 20 les animaux pour des applications en cosmétologie et pharmacologie. L'invention a aussi pour but de fournir un modèle de muqueuse, et en particulier de cornée, compétent pour simuler une réparation tissulaire, notamment telle que obtenue sur l'oeil de lapin. L'invention a également pour but de fournir une cornée reconstruite -)$ notamment pour être utilisée dans les greffes de cornée, ou la chirurgie correctrice. 3 U DESCRIPTION DE L'INVENTION

L'invention permet de cultiver des cellules de cornée et/ou de muqueuse sur ou dans un support tissulaire qui n'est pas une membrane de cornée humaine, de manière industrielle, fiable, peu coûteuse et automatisable. Selon un premier aspect, l'invention concerne un support de culture cellulaire (ou substrat de culture cellulaire ou encore biomatériau) pour cultiver des cellules de cornée ou de muqueuse, ledit support comprenant 1 o un gel aqueux, éventuellement déshydraté, d'au moins un biopolymère adapté à la culture de cellules stromales de cornée ou de muqueuse. Le gel aqueux, éventuellement déshydraté, est également adapté à la culture d'un autre type cellulaire comme des cellules épithéliales, et/ou des cellules endothéliales, de cornée ou de muqueuse. 1 Avantageusement les cellules sont des cellules humaines, comme par exemple des cellules humaines primaires ou issues de lignées cellulaires. Avantageusement, le support selon la présente invention comprend un gel aqueux réalisé à base d'une solution aqueuse d'au moins un 20 biopolymère. Par l'expression "matériau à base de" on entend un matériau qui comprend ou est essentiellement constitué ou uniquement constitué du matériau considéré. Ainsi par exemple le matériau à base d'au moins un biopolymère comprend de préférence au moins deux biopolymères en 25 mélange. On entend par biopolymère une macromolécule qui participe à l'organisation structurale et fonctionnelle, au processus métabolique et à l'entretien d'un organisme vivant, et éventuellement synthétisée par un organisme vivant. Un biopolymère comprend généralement des liaisons covalentes entre des amino acides, et/ou des nucléotides, et/ou des 4 carbohydrates. On entend aussi par biopolymères pour des biopolymères identiques à ceux trouvés dans le vivant, mais obtenus par d'autres moyens, comme par synthèse, etc. On préfère une macromolécule jouant un rôle dans la formation des structures macromoléculaires d'un organisme vivant, et de préférence dans la matrice extracellulaire (MEC). Ainsi, les biopolymères préférés sont choisis parmi les glycoprotéines, comme le collagène, la fibronectine, la laminine, ou les protéines pures, comme l'élastine, ou les polysaccharides éventuellement substitués, comme la chitine ou le chitosane. Ces biopolymères peuvent être évidemment des 10 biopolymères recombinants ou isolés (d'origine artificielle ou naturelle). De préférence, le gel aqueux est réalisé à base d'une solution aqueuse d'une macromolécule de la MEC, de préférence d'au moins une glycoprotéine, et de préférence encore à base d'une solution aqueuse de collagène. Avantageusement, la glycoprotéine, et de préférence un 1 > collagène, est associé à au moins un polysaccharide, éventuellement substitué. Le collagène est notamment d'origine bovine, porcine, équine, ou marine, et de préférence un collagène de type I/III éventuellement en association avec un collagène de type V, supplémentés ou non en collagènes IV et/ou VI et/ou VII. 20 Au biopolymère, et de préférence à la glycoprotéine, et encore de préférence au collagène, on associe de préférence un ou plusieurs polysaccharides éventuellement substitués, comme un glycosaminoglycanne, tel que le chondroïtine 4-sulfate, le chondroïtine 6-sulfate, l'acide hyaluronique, ou un de leurs mélanges, et/ou la chitine, et/ou le chitosane ; et/ou un ou plusieurs protéoglycanes. De préférence on associe au moins un polysaccharide et du chitosane, éventuellement modifié. La répartition en pourcentage en poids par rapport à la matière sèche finale entre les biopolymère est de : FR 0850948 Modifiée le 13 juin 2008

Collagène (60-90), Chitosane (10-30), Glycosaminoglycanne (0-15) ; avantageusement Collagène (62-72), Chitosane (20-25), Glycosaminoglycanne (8-12) et en particulier Collagène (72), Chitosane (20), Glycosaminoglycanne (8).

Le support de culture cellulaire peut être un gel ou un gel déshydraté, notamment formant une matrice ou une éponge. La déshydratation peut être obtenue par déshydratation thermique ou par lyophilisation. Il a été découvert de manière tout à fait surprenante qu'un support lo de culture cellulaire préparé par déshydratation d'un gel comprenant au moins un biopolymère permet une très bonne culture de cellules stomates, et permet de préparer une cornée reconstruite et/ou muqueuse reconstruite de bonne qualité, On préfère dans ce cadre utiliser comme biopolymère une macromolécule de la MEC, et de préférence le collagène. 15 Parmi les polysaccharides, éventuellement substitués, on peut avantageusement utiliser un glycosaminoglycanne (GAG), éventuellement associé à une chitine ou à un chitosane. Avantageusement, le support de culture est un gel aqueux réalisé à base d'un mélange de collagène, d'au moins un polysaccharide, et de 20 chitosane, éventuellement modifié, et permet une très bonne culture de cellules stromales de cornée et/ou de muqueuse, notamment lorsqu'il est déshydraté. On peut citer comme chitosane modifié par exemple un chitosane ayant un taux d'acylation, de préférence d'acétylation, réglé en fonction de 25 l'application envisagée, différents taux d'acétylation étant bien connus de l'homme de l'art et en particulier décrits dans le document européen précité EP 0296 078. L'invention concerne donc également une matrice formée par ce support de culture, poreuse, et permettant la culture de cellules stomates 30 de cornée ou de muqueuse. On parle d'éponge du fait de la structure poreuse. La diversité de phénotypes et de formes des kératocytes n'a pas été prise en compte, à ce jour à la connaissance des inventeurs, dans la reconstruction de la partie stromale des modèles actuels, à l'exclusion des myofibroblastes. Cette prise en compte apparaît importante pour une meilleure culture des cellules. Les modèles de culture proposés sur le marché aujourd'hui ne sont pas bien adaptés à la culture de cellules de cornée. La présente invention propose un modèle de culture adapté à la culture de cellules de cornée. Par adapté à la culture de cellules , on entend dans la présente 10 invention un modèle permettant une prolifération satisfaisante pour les besoins de la fabrication d'un support ou modèle de culture cellulaire. En particulier l'invention couvre un support de culture cellulaire pour cultiver des cellules de cornée, ledit support comprenant au moins un biopolymère sous forme de matrice poreuse dont la taille des pores est 15 définie pour laisser diffuser et adhérer des cellules stromales de cornée au sein du support. La taille des pores de la présente invention ne nécessite pas de gradient dans la mesure où les cellules vont naturellement pénétrer dans la matrice après leur dépôt en surface, puis adhérer sur les fibres du support. Ainsi, on ne cherche pas à faire pénétrer les cellules par des 2) grandes tailles de pores, puis à les faire adhérer en rétrécissant la taille des pores en fonction de la profondeur du matériau. La taille des pores est assez grande pour laisser diffuser ou pénétrer les cellules, et notamment les cellules stromales, au sein de la matrice, mais suffisamment petite pour que les cellules adhèrent aux parois et ne traversent pas la matrice sans y adhérer. Avantageusement, la répartition de la taille des pores est homogène. Avantageusement les pores sont formés par élimination du solvant d'une solution (déshydratation dans le cas d'une solution aqueuse) comprenant le ou les biopolymères de la présente invention. Le biopolymère peut être seul ou en mélange comme expliqué dans la présente invention. Avantageusement, la matrice poreuse est réalisée à base d'un mélange de collagène, d'au moins un polysaccharide, et de chitosane, éventuellement modifié, et de préférence à une proportion de collagène comprise entre 60 et 90%, de GAG comprise entre 0 et 15%, et de chitosane comprise entre 10 et 30%, en pourcentage en poids sec du poids total sec de ce mélange. Le procédé de préparation de la matrice poreuse comprend les 1O variantes décrites dans la présente invention. Les paramètres du procédé de déshydratation sont fonction de la porosité à obtenir, qui est adaptée aux dimensions des cellules de cornée ou de muqueuse à cultiver. L'invention concerne ainsi un support de culture cellulaire pour cultiver des cellules de cornée ou de muqueuse, ledit 15 support comprenant un gel aqueux, éventuellement déshydraté, d'au moins un biopolymère adapté à la culture de cellules stromales de cornée ou de muqueuse, ledit gel aqueux éventuellement déshydraté présentant une porosité adaptée à la culture de cellules stromales, notamment de cellules stromales de cornée ou de cellules stromales de muqueuse. Le support de 20 culture présente généralement une porosité comprise entre 10 et 100 microns (diamètre moyen). On vise de préférence une porosité comprise entre 30 et 70 microns, et plus particulièrement compris entre 40 et 50 microns, comme par exemple entre 42 et 49 microns. Le calcul de la porosité a été effectué par des études de microscopie électronique à 25 balayage à des grossissements allant de 50x à 7000x. Parmi les gels de collagène, on peut utiliser les collagènes de type I/III éventuellement en association avec un collagène de type V, supplémentés ou non en collagènes IV et/ou VI et/ou VII. Avantageusement, le support de culture est un gel aqueux, éventuellement déshydraté, à base d'un mélange de collagène, de glycosaminoglycanne et de chitosane, éventuellement modifié, et a une concentration adaptée à la culture de cellules stromales et en particulier à l'obtention d'une éponge après déshydratation. Cette concentration est généralement comprise entre 1,25 à 1,6% du mélange de collagène, de glycosaminoglycanne, et de chitosane, éventuellement modifié, par rapport au milieu aqueux (généralement de l'eau, de préférence de laboratoire ou eau distillée). Cette concentration influence la porosité de l'éponge obtenue après déshydratation. Ainsi la porosité est fonction de la viscosité du gel. Avantageusement, la préparation de la couche de matériau poreux 10 est effectuée par lyophilisation du gel aqueux, notamment par congélation à une température comprise entre -30°C et -196°C, et de préférence, pour des raisons industrielles, à une température comprise entre -40°C et -80°C. Cette température influence la porosité du support et doit être adapté à la porosité souhaitée. 15 L'invention concerne aussi un dispositif de culture cellulaire pour cultiver des cellules de cornée ou de muqueuse comprenant un évidement et au moins un support tel que défini précédemment formant une couche pour la culture des cellules à cultiver, cette couche étant obtenue par une gélification d'une solution aqueuse d'au moins un biopolymère coulée 20 directement dans l'évidement du dispositif. Selon un mode de réalisation particulier, le dispositif de culture cellulaire pour cultiver des cellules de cornée ou de muqueuse comprend un évidement et au moins un support tel que défini précédemment formant une couche pour la culture des cellules à cultiver, cette couche étant 25 obtenue par déshydratation d'un gel aqueux d'au moins un biopolymère coulé directement dans l'évidement du dispositif. Le dispositif décrit dans le brevet FR 2 881 434 convient particulièrement à la présente invention, d'autant plus qu'il est adapté à une préparation automatisée des supports de culture cellulaire. Ce dispositif de support de culture cellulaire est adapté à une utilisation industrielle, et notamment à un criblage haut débit. Selon un mode de réalisation, le dispositif comprend une première zone de culture de cellules stromales dite zone stromale et une seconde zone de culture soit de cellules épithéliales dites zone épithéliale , soit de cellules endothéliales dite zone endothéliale . Selon un autre mode de réalisation, le dispositif comprend une première zone de culture de cellules stromales dite zone stromale et une seconde zone de culture de cellules épithéliales dites zone épithéliale , et une troisième zone de culture de 10 cellules endothéliales dite zone endothéliale . Par zone stromale , zone épithéliale , ou zone endothéliale , il est entendu un compartiment comprenant essentiellement respectivement des cellules stromales, épithéliales, ou endothéliales, ainsi que leur environnement cellulaire y compris les molécules qu'elles sécrètent ou 15 synthétisent. Selon un mode de réalisation particulier, le corps du substrat ou support de culture cellulaire décrit ci-dessus forme la zone stromale décrite ci-dessus et la surface de ce substrat ou support de culture forme la base de la zone épithéliale ou endothéliale. Dans ce mode de réalisation, on peut 20 par exemple ensemencer des cellules stromales à la surface du support de culture cellulaire. Les cellules stromales pénètrent dans le corps du support, migrent puis synthétisent de la matrice extracellulaire permettant de combler progressivement les pores du support. On peut également ensemencer les cellules stromales dans une solution aqueuse du biopolymère, puis gélifier cette solution aqueuse pour obtenir un gel aqueux du biopolymère comprenant les cellules ensemencées. Puis on ensemence les cellules épithéliales ou endothéliales à la surface du support ou substrat de culture.

Avantageusement, la zone épithéliale est distincte de la zone stromale, et comprend une couche de matériau poreux pour la culture de kératocytes. Avantageusement, le dispositif comprend un insert (ou une nacelle) de dimension adaptée pour être insérable dans le volume de l'évidement du dispositif. On peut positionner le substrat de support de culture cellulaire dans cet insert ou nacelle. Dans ce mode de réalisation, le gel aqueux d'au moins un biopolymère est coulé dans le fond de l'insert. Dans le cas d'une solution aqueuse, on gélifie cette solution dans le fond de l'insert. Le gel aqueux est de préférence déshydraté. Ce gel comprend un substrat ou support tel que défini ci-dessus. Lorsque l'on utilise un insert, on introduit de préférence le milieu de culture dans le fond de l'évidement et on cultive les cellules sur le substrat positionné dans l'insert. Cependant on peut également positionner le substrat dans le fond de l'évidement immergé dans le milieu de culture pour la culture des cellules. Le gel aqueux est avantageusement coulé directement à l'intérieur de l'évidement et/ou de la nacelle. Le gel aqueux utilisé pour préparer le matériau poreux de la nacelle peut être différent de celui utilisé pour préparer le matériau poreux de l'évidement.

Avantageusement, le matériau poreux de la nacelle comprend du collagène, de préférence en mélange avec un polysaccharide et/ou du chitosane, éventuellement modifié. En particulier, l'insert comprend un épaulement apte à maintenir en place l'insert dans l'évidement en positionnant l'épaulement sur au moins 25 une partie du bord de l'évidement. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend de préférence un élément de maintien en position d'au moins le bord périphérique de la couche de substrat, éventuellement poreux, en réalisant un effet anti-rétractation du o substrat, et de préférence assurant aussi l'étanchéité à l'interface périphérique dudit substrat et de la paroi interne latérale, lui faisant face, du fond. Dans le cadre de l'invention, cette étanchéité à la périphérie est avantageusement prévue pour éviter les échanges de matière par la périphérie, c'est-à-dire éviter une communication par le bord latéral du substrat entre des substances déposées sur la surface supérieure du substrat et le milieu de culture ou les cellules qui peuvent être présentes dans le substrat. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'élément de 10 maintien en position précité comprend une bague annulaire d'une dimension suffisante pour prendre appui sur le bord périphérique du substrat. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce que ledit fond de la nacelle est amovible et 15 solidarisable à la nacelle, elle-même solidarisable à l'évidement. Selon encore une caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce que ledit fond amovible de la nacelle est solidarisé par emboîtage légèrement à force ou clipsage à l'évidement, en assurant ainsi l'étanchéité de manière sûre et fiable. 20 Selon encore une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce que ledit fond amovible de la nacelle est solidarisé à l'extérieur de l'évidement ou de la nacelle, le bord inférieur de la paroi latérale de l'évidement ou de la nacelle constituant ainsi un élément de maintien en position du bord périphérique dudit substrat. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend une pluralité de nacelles ou inserts par puits de culture. Selon une autre variante de réalisation avantageuse de ce mode de réalisation, ce dispositif comprend aussi un couvercle pourvu d'autant L) d'orifices que de nacelles ou inserts, chaque orifice permettant de recevoir et maintenir en position une nacelle ou insert. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce qu'au moins le fond de l'évidement ou de la nacelle ou insert contenant du substrat poreux est stérilisé après ladite déshydratation, et de préférence dans un conditionnement étanche. Avantageusement, le dispositif est stérilisé. De préférence, le dispositif de culture complet est stérilisé et avantageusement conditionné dans un conditionnement étanche. I O Selon encore une autre caractéristique avantageuse de l'invention, la stérilisation précitée est choisie parmi le groupe consistant en une stérilisation par irradiation de préférence aux rayons Beta ou Gamma, ou en un traitement avec un gaz stérilisant tel que l'oxyde d'éthylène. Avantageusement, au moins une partie de la paroi interne du fond 15 ou de la nacelle est traitée physiquement ou chimiquement ou biologiquement, ou une combinaison de ceux-ci, pour favoriser la culture cellulaire, par exemple avec un revêtement favorisant l'adhésion et/ou la prolifération des cellules. Dans le cadre de l'invention, on peut utiliser tout procédé physique 20 ou chimique qui modifie la charge ionique globale du matériau de la paroi, avantageusement un matériau plastique et/ou utiliser un revêtement de la paroi avec toute molécule biologique favorisant l'adhésion et/ou la prolifération des cellules, telle que collagène, fibronectine, laminine, etc. Selon une variante, au moins une partie de la paroi interne du fond 2 ou de la nacelle peut comprendre des reliefs de surface, notamment pour mimer les stries ou cavités d'un tissu naturel, comme par exemple un épithélium. Selon encore un mode de réalisation avantageux de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce que au moins le fond de l'évidement ou de la 30 nacelle est fabriqué en un matériau support inerte, par exemple choisi parmi le groupe consistant d'un matériau synthétique, de matériau à base de nitrocellulose, d'un matériau à base de polyamide tel qu'un "nylon", d'un matériau à base de polytétrafluoroéthylène ou téflon , d'un matériau à base de polycarbonate, d'un matériau à base de polyéthylène ou de polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, d'un matériau à base d'un polyester, par exemple un polyester de cellulose, notamment un acétate, d'un matériau à base d'une membrane Biopore-CM semi-perméable, ou encore la polyvinylpyrrolidone. Selon un second aspect, l'invention concerne un procédé automatisé 10 de préparation d'un dispositif tel que défini précédemment. Avantageusement, une plate-forme robotisable ou automatisable peut être utilisée, de préférence pour permettre de positionner des dispositifs de culture cellulaire tel qu'un dispositif d'injection ou d'aspiration de milieu de culture commandé par un robot ou un automate par exemple 15 lui-même commandé par un ordinateur. Avantageusement, la zone épithéliale ou endothéliale est déposée automatiquement au-dessus de la zone stromale. Avantageusement, le gel aqueux est coulé par un dispositif automatisé, et/ou les cellules sont ensemencées par un dispositif 20 automatisé. Selon un troisième aspect, l'invention concerne un conditionnement étanche comprenant un dispositif tel que défini précédemment. Selon un quatrième aspect, l'invention concerne un modèle de cornée ou de muqueuse, notamment humaine, comprenant au moins des 25 cellules stromales de cornée ou de muqueuse (respectivement) et au moins un support de culture des cellules stromale de cornée ou de muqueuse (respectivement), ledit support étant tel que défini précédemment. Avantageusement, le modèle comprend également des cellules épithéliales et/ou des cellules endothéliales, et de préférence des cellules 3o épithéliales et/ou des cellules endothéliales, de cornée ou de muqueuse.

Le type de cellules ensemencées peut avoir un impact important sur la néosynthèse d'une matrice extracellulaire ou dans les interactions avec l'épithélium et l'endothélium. Pour reconstruire un stroma artificiel proche du stroma cornéen il est intéressant d'utiliser des cellules souches kératocytaires, ou à défaut, des kératocytes dotés d'une capacité proliférative importante et conservant au maximum les caractéristiques du phénotype kératocytaire. Ainsi l'invention concerne également un procédé de sélection de kératocytes ou de cellules stromales de cornée en fonction de leur capacité de prolifération comprenant la sélection d'une zone de prélèvement prédéterminée sur le tissu, de préférence humain, un tri phénotypique des kératocytes ou des cellules stromales de cornée prélevés pour sélectionner les cellules ayant une forte capacité de prolifération. L'invention concerne également l'utilisation d'un modèle de cornée, ou de muqueuse, tel que défini précédemment comme modèle de test alternatif aux tests de toxicité notamment cosmétologie en pharmacologie, sur les animaux. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un modèle de cornée définie précédemment pour la préparation d'une cornée reconstruite notamment pour être utilisé dans les greffes de cornée ou en chirurgie correctrice. Avantageusement, le modèle est préparé dans un dispositif tel que défini précédemment ou par un procédé tel que défini précédemment. On comprend que grâce à l'invention, on résout bien les différents problèmes techniques précédemment énoncés, de manière simple, sûre et fiable, reproductible à l'échelle industrielle et médicale, en particulier pharmaceutique et en cosmétique.

Les dispositifs de culture décrits dans cette invention, et qui sont avantageusement adaptés à l'utilisation de biomatériau pour la culture de 30 cornées reconstruites, sont présentés dans les figures 1 et 2.

La figure 1 représente un exemple des différents formats de culture dans lesquels le biomatériaux selon la présente invention est fabriqué. De la gauche vers la droite sont présentés une plaque 96 puits, une plaque 24 puits, une plaque 12 puits, et une plaque 6 puits. La figure 2a représente une photographie d'une perspective, et la figure 2b une photographie prise de dessus, des inserts de culture dans lesquels peuvent être fabriqué le biomatériaux selon la présente invention. a représente un insert Transwell (Corning, diamètre 24mm), b représente un insert Snapwell (Corning, diamètre 12 mm), c représente un insert 10 Netwell (Corning, diamètre 24mm), d représente un insert de culture (Nunc, diamètre 25mm), e représente un insert Thincert (Greiner bioone, diamètre 24 mm), f représentant un insert CellCrown (Scaffdex, diamètre 24mm). Sur la figure 2b, les inserts sont positionnés dans une plaque de culture 6 puits. La figure 2c représente d'autres plaques de 15 culture avec en bas une plaque Millicell (Millipore, diamètre 9mm), à gauche une plaque appui collective, et en haut à droite une plaque 24 puits. La figure 3 représente des photographies de culture de cellules épithéliales et de kératocytes de cornées humaines normales. La 20 photographie 3a représente une culture in vitro de cellules épithéliales de cornées humaines sur une couche nourricière de fibroblastes irradiés. La photographie 3b représente une culture in vitro de kératocytes de cornées humaines. La figure 4 représente une étude de visualisation par microscopie 25 électronique à balayage d'un biomatériaux selon la présente invention composé de collagène à 72%, de glycosaminoglycannes à 8%, et de chitosane à 20%. Ces visualisations sont effectuées à différents pourcentages de matière sèche et à différentes températures de lyophilisation.

La figure 5 représente une étude histologique de la production in vitro d'un stroma cornéen humain reconstruit avec un biomatériaux de la présente invention. La figure 5a représente un biomatériaux comprenant 1,6% de matière sèche et réalisé par une étape de congélation à une température de -80 °C. La figure 5b représente un biomatériaux comprenant 1,4% de matière sèche et réalisé par une étape de congélation à une température de -40 °C. La figure 5c représente un biomatériaux comprenant 1,25% de matière sèche et réalisé par une étape de congélation à une température de -40 °C.

La figure 6 représente une étude de la prolifération cellulaire des kératocytes après production in vitro d'un stroma cornéen humain reconstruit avec un biomatériaux selon la présente invention, à différents jours de culture (37, J14, J28), exprimée en valeur de DO (densité optique) à 550nm.

La figure 7 représente une étude histologique du traitement des hémi-cornées humaines reconstruites avec l'agent irritant SDS (dodécylsulfate de sodium). La figure 8 représente l'étude de la viabilité cellulaire après traitement des hémi-cornées humaines reconstruites avec le SDS.

La figure 9 représente une étude de la sécrétion d'un facteur soluble (ici : IL-6 ou interleukine-6) par les hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec le SDS. La figure 10 représente une analyse histologique montrant l'étude de la récupération des hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec le SDS. La figure 11 représente une analyse de la viabilité cellulaire montrant l'étude de la récupération des hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec le SDS. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention 30 apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invertion. Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité. Ainsi, chaque exemple a une portée générale. 10 D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire.

15 EXEMPLES Exemple 1 : Culture de cellules épithéliales et de kératocytes de cornées humaines normales (figure 3). Les cornées humaines sont prélevées selon les règles d'éthiques et ne sont pas utilisables pour la thérapeutique à cause d'une densité endothéliale 20 trop faible. Les cornées sont conservées en organoculture à 31°C jusqu'à l'extraction des cellules épithéliales et des kératocytes.

Extraction et culture de cellules épithéliales de cornées humaines Les cornées sont incubées en présence de trypsine/EDTA (0,05%/0,01%) 25 pendant 80 minutes à 37°C afin de récupérer le compartiment épithélial de la biopsie. L'épithélium est ensuite dissocié en présence de trypsine/EDTA (0,05%/0,01%) et les cellules épithéliales obtenues sont ensemencées, préférentiellement à la densité de 1,5.104 cellules/cm2, sur un support de culture tel qu'une couche nourricière de fibroblastes irradiés et dans un 30 milieu de culture avantageusement composé de DMEM/HAM F12 (2/1), 10% sérum de veau foetal (SVF), insuline (5 pg/mL), adénine (0,18 mM), hydrocortisone (0,4 pg/mL), toxine cholérique (0,1 nM), triiodothyronine (2 nM), glutamine (4 mM), Penicilline G (100 UI/mL), Gentamicine (20 pg/mL) et Amphotericine B (1 pg/mL). EGF (10 ng/mL) est ajouté préférentiellement après 3 jours de culture. La culture est effectuée à 37°C et 5% de CO2 sous une atmosphère humide. Les cellules épithéliales cultivées in vitro (figure 3a) peuvent être congelées et/ou réensemencées en culture, par exemple sur une couche nourricière de fibroblastes irradiés et/ou utilisées pour la production in vitro 10 d'hémicornées/cornées humaines reconstruites.

• Extraction et culture des kératocytes de cornées humaines Les cornées sont incubées en présence de trypsine/EDTA (0,05%/0,01%) pendant 80 minutes à 37°C afin de récupérer le compartiment stromal de la 15 biopsie. Le stroma est ensuite incubé pendant 3h à 31°C et sous agitation en présence de collagénase A (3 mg/mL). L'extrait cellulaire obtenu est ensuite purifié, par exemple sur un tamis de 70 pm, puis mis en culture, préférentiellement à la densité de 1,0.104 cellules/cm2, dans un milieu de culture composé avantageusement de DMEM/HAM F12, 10% de sérum de 20 veau nouveau né, b-FGF (5 ng/mL), Penicilline G (100 UI/mL), Gentamicine (20 pg/mL) et Amphotericine B (1 pg/mL). Les kératocytes cultivés in vitro (figure 3b) peuvent être congelées et/ou réensemencées en culture et/ou utilisées pour la production in vitro de stroma cornéens et d'hémicornées/cornées humains reconstruits. Exemple 2 : Etude de la porosité du biomatériau de l'invention à base de collagène, glycosaminoglycanne et chitosane pour la production in vitro de stroma cornéens et d'hémicornées/cornées humains reconstruits (figure 4), Afin de démontrer que la taille des pores du biomatériau est un paramètre 30 fondamental dans la production in vitro de stroma cornéens et d'hémicornées/cornées humains reconstruits, les inventeurs ont fait varier sa porosité de 30 pm à 100 pm. Pour cela, les inventeurs ont modifié préférentiellement deux paramètres de fabrication qui influencent directement le diamètre des pores du biomatériau : (1) le pourcentage de matière sèche de la composition aqueuse de collagène (72%), glycosaminoglycanne (GAG) (8%) et chitosane (20%), (2) la cinétique des températures de congélation du gel aqueux avant sa déshydratation par lyophilisation. Trois compositions de gel aqueux, dont le ratio collagène/GAG/chitosane ne 10 change pas (72%/8%/20%, respectivement), ont été préparées de la façon suivante : - un gel aqueux à 2% de matière sèche, soit 5,6g de collagène + 1,56g de chitosane + 0,62g de GAG a été préparé. - un gel aqueux à 1,6% de matière sèche, préparé par dilution avec de 15 l'eau du gel à 2%. - un gel aqueux à 1,4% de matière sèche, préparé par dilution avec de l'eau du gel à 2%. - un gel aqueux à 1,25% de matière sèche, préparé par dilution avec de l'eau du gel à 2%. 20 Les gels aqueux sont ensuite déposés dans des inserts de culture de type Snapwell sous la quantité de 450 mg/insert.

La lyophilisation des gels aqueux (dans les inserts Snapwell ) est ensuite réalisée à -40°C. Cette étape de lyophilisation nécessite au préalable une 25 étape de congélation qui a été réalisée selon 4 variantes et de la façon suivante : - une congélation directe des gels aqueux à -40°C, - une congélation directe des gels aqueux à -80°C, - une congélation directe des gels aqueux à -196°C, 21 - une congélation progressive des gels aqueux de +20°C à -40°C (temps de congélation de préférence 30 à 45 minutes minimum).

L'évaluation de la porosité du biomatériau est effectuée par des études de microscopie électronique à balayage, à des grossissements allant de 50x à 7000x, et par des études d'analyse d'image automatique. Les résultats sont présentés dans la figure 4. Les conditions de fabrication sélectionnées pour la réalisation d'un biomatériau présentant une porosité comprise entre 40 et 50 pm sont les suivantes : - Un gel aqueux à 1,6% de matière sèche suivi d'une étape de congélation à -80°C présente une porosité de 42,3 pm, - Un gel aqueux à 1,4% de matière sèche suivi d'une étape de congélation à -40°C présente une porosité de 48,5 pm, - Un gel aqueux à 1,25% de matière sèche suivi d'une étape de congélation à -40°C présente une porosité de 47,3 pm.

Exemple 3 : Production in vitro de stroma cornéens humains reconstruits avec notre biomatériau poreux : Etude histologique (figure 5). Afin de démontrer que le biomatériau qui présente une porosité comprise entre 40 et 50 pm est adapté pour la culture de kératocytes humains, les inventeurs ont étudié la capacité des kératocytes à s'intégrer et à s'organiser dans le biomatériau, au cours d'une culture in vitro d'un stroma cornéen humain reconstruit. L'étude histologique des stroma cornéens humains reconstruits dans le biomatériau poreux s'est réalisée de la manière suivante : • Préparation des kératocytes : telle que décrit dans l'exemple 1. • Préparation du biomatériau poreux : telle que décrit dans l'exemple 2. • Préparation du stroma cornéen humain reconstruit : Une suspension cellulaire contenant préférentiellement 2.10' kératocytes/500 01 de milieu de culture est ensemencée à la surface de 22 notre biomatériau poreux. Le milieu de culture utilisé est préférentiellement composé de DMEM/HAM F12, 10% de sérum de veau nouveau né, b-FGF (5 ng/mL), acide ascorbique (1 mM), Pénicilline G (100 UI/mL), Gentamicine (20 pg/mL) et Amphotéricine B (1 pg/mL). Les kératocytes sont ensuite cultivés par exemple 14 jours dans le milieu de culture décrit ci-dessus. • Etude histologique : Après 14 jours de culture, les stroma cornéens humains reconstruits sont rincés avec du milieu de culture, par exemple du DMEM, puis fixés, par 10 exemple avec du formaldéhyde, puis inclus en paraffine. Des coupes paraffine sont ensuite effectuées au microtome, préférentiellement à 5pm d'épaisseur, puis colorées, par exemple avec de l'hématoxyline, de la phloxine et du safran. Les résultats sont présentés dans la figure 5 : a/ gel aqueux à 1,6% de matière sèche suivi d'une étape de congélation à -80°C 15 (porosité de 42,3 pm), b/ gel aqueux à 1,4% de matière sèche suivi d'une étape de congélation à -40°C (porosité de 48,5 pm), c/ gel aqueux à 1,25% de matière sèche suivi d'une étape de congélation à -40°C (porosité de 47,3 pm). Les kératocytes cultivés dans le biomatériau poreux (porosité comprise entre 40 et 50 pm) sont capables de s'organiser en tissu avec la 20 formation de plusieurs couches cellulaires et la synthèse de leur propre matrice extracellulaire.

Exemple 4 : Production in vitro de stroma cornéens humains reconstruits avec le biomatériau poreux : Etude de la prolifération cellulaire des kératocytes (figure 6). Suite à l'exemple 3, les inventeurs ont ensuite étudié la capacité proliférative des kératocytes au cours d'une culture in vitro d'un stroma cornéen humain reconstruit. L'étude de la prolifération cellulaire des kératocytes dans le biomatériau 30 poreux s'est réalisée de la manière suivante : 25 • Préparation des kératocytes : telle que décrit dans l'exemple 1. • Préparation du biomatériau poreux : telle que décrit dans l'exemple 2. • Préparation du stroma cornéen humain reconstruit : telle que décrit à l'exemple 3. • Etude de la prolifération cellulaire des kératocytes dans un stroma cornéen humain reconstruit : Après 7, 14, ou 28 jours de culture, les stroma cornéens humains reconstruits sont analysés de la manière suivante : - Les cultures sont incubées 2h à 37°C dans 2 ml de MTT (Methyl Thiazolyl 10 Tetrazolium) à 1 mg/mL. Le témoin négatif correspond au biomatériau ne contenant pas de kératocytes ; - Les cultures sont ensuite récupérées puis incubées dans 4 ml de DMSO (Dimethyl Sulfoxide) pendant 4h sous agitation ; - Une fraction du surnageant de culture (200 pl) de chaque échantillon est 1 récupérée puis analysée en spectrophotocolorimétrie (550 nm). La densité optique lue est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Les résultats sont présentés dans la figure 6. Le biomatériau qui présente une porosité comprise entre 40 et 50 pm est adapté pour la prolifération des kératocytes. En effet, la cinétique de prolifération cellulaire des 20 kératocytes est proportionnelle au temps de culture des stroma cornéens humains reconstruits. De plus, quelque soit les conditions de fabrication de notre biomatériau [1,6%, 1,4% et 1,25% de matière sèche], telles que décrits dans l'exemple 2, les kératocytes présentent un taux de prolifération comparable. 25 Exemple 5 : Production in vitro d'une hémi-cornée humaine reconstruite comme modèle pharmacotoxicologique : Etude histologique (figure 7)_ Les inventeurs ont étudié l'effet de l'irritant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) sur les hémi-cornées humaines reconstruites avec le biomatériau. 24 L'étude histologique des hémi-cornées humaines reconstruites, après le traitement avec SDS, est effectuée de la manière suivante : • Préparation des cellules : telle que décrit dans l'exemple 1. • Préparation du biomatériau poreux : telle que décrit dans l'exemple 2. Pour cette étude, les inventeurs ont utilisé le gel aqueux [collagène (72%), GAG (8%) et chitosane (20%)] à 1,6% de matière sèche qui a ensuite subi l'étape de congélation -80°C. - Préparation du stroma cornéen humain reconstruit telle que décrit dans l'exemple 3. 10 • Préparation des hémi- cornées humaines reconstruites : Une suspension cellulaire contenant préférentiellement 2.105 cellules épithéliales de cornée/500 pl de milieu de culture est ensemencée à la surface du stroma cornéen humain reconstruit. Le milieu de culture utilisé est préférentiellement composé de DMEM/HAM F12 (2/1), 10% sérum de 15 veau foetal (SVF), EGF (10 ng/mL), insuline (5 pg/mL), adénine (0,18 mM), hydrocortisone (0,4 pg/mL), toxine cholérique (0,1 nM), triiodothyronine (2 nM), glutamine (4 mM), acide ascorbique (1 mM), Pénicilline G (100 UI/mL), Gentamicine (20 pg/mL) et Amphotéricine B (1 pg/mL). Les cellules épithéliales de cornée sont cultivées en immersion pendant 7 jours 20 sur le stroma cornéen équivalent et avec le milieu décrit ci-dessus. Les cultures sont ensuite élevées à l'interface air/liquide puis cultivées pendant 14 jours supplémentaires avec un milieu de culture composé préférentiellement de DMEM, hydrocortisone (0,4 pg/mL), insuline (5 pg/mL), acide ascorbique (1 mM), Pénicilline G (100 UI/mL), Gentamicine 25 (20 pg/mL) et Amphotéricine B (1 pg/mL). • Traitement des hémi-cornées humaines reconstruites avec le SDS : Les hémi-cornées humaines reconstruites sont traitées pendant 10 min, en immersion complète, avec des solutions croissantes de SDS (0,5%, 1%, 2% et 3%). Après le traitement, les hémi-cornées humaines reconstruites 30 sont rincées avec du milieu de culture, par exemple du DMEM, puis fixées, s par exemple avec du formaldéhyde, puis inclues en paraffine. Des coupes paraffine sont ensuite effectuées au microtome, préférentiellement à 5pm d'épaisseur, puis colorées, par exemple avec de l'hématoxyline, de la phloxine et du safran. Les résultats histologiques sont présentés dans la figure 7. Les inventeurs ont montré qu'il existe une corrélation directe entre les concentrations de SDS croissantes et la désorganisation des couches cellulaires superficielles de l'épithélium cornéen reconstruit. Dès 0,5% de SDS, un effet histologique sur les hémi-cornées humaines reconstruites est constaté. 10 Exemple 6 : Production in vitro d'une hémi-cornée humaine reconstruite comme modèle pharmacotoxicologique : Etude de la viabilité cellulaire (figure 8). Suite à l'exemple 5, les inventeurs ont également étudié la viabilité 15 cellulaire des hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec l'irritant SDS, de la manière suivante : • Préparation des cellules : telle que décrit dans l'exemple 1. • Préparation du biomatériau poreux : telle que décrit dans l'exemple 2. Pour cette étude, les inventeurs ont utilisé le gel aqueux [collagène (72%), 20 GAG (8%) et chitosane (20%)] à 1,6% de matière sèche qui a ensuite subi l'étape de congélation -80°C. • Préparation du stroma cornéen humain reconstruit : telle que décrit dans l'exemple 3. • Préparation des hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec le 2> SDS : telle que décrit dans l'exemple 5. • Etude de la viabilité cellulaire des hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec le SDS : telle que décrit dans l'exemple 4 pour un stroma cornéen humain reconstruit. Les résultats de viabilité cellulaire sont présentés dans la figure 8. Les 3o inventeurs ont montré qu'il existe une corrélation directe entre les concentrations de SDS croissantes et le pourcentage de viabilité cellulaire. Au-delà de 0,5°%o de SDS, la viabilité cellulaire des hémi-cornées humaines reconstruites n'est plus satisfaisante et inférieure à 75%. Les effets biologiques du SDS sur les hémi-cornées humaines reconstruites doivent donc être évalués à des concentrations proches de 0,5%.

Exemple 7 : Production in vitro d'une hémi-cornée humaine reconstruite comme modèle pharmacotoxicologique : Etude de la sécrétion de facteurs solubles (figure 9). 10 Suite aux exemples 5 et 6, les inventeurs ont étudié la sécrétion de facteurs solubles, tels que par exemple des cytokines pro-inflammatoires, produits par les hémi-cornées humaines reconstruites traités avec l'irritant SDS. Cette étude a été réalisée de la manière suivante : • Préparation des cellules : telle que décrit dans l'exemple 1. 15 • Préparation du biomatériau poreux : telle que décrit dans l'exemple 2. Pour cette étude, les inventeurs ont utilisé le gel aqueux [collagène (72%), GAG (8%) et chitosane (20%)] à 1,6% de matière sèche qui a ensuite subi l'étape de congélation -80°C. • Préparation du stroma cornéen humain reconstruit : telle que décrit 20 dans l'exemple 3. • Préparation des hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec le SDS : telle que décrit dans l'exemple 5. • Etude de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires par des hémicornées humaines reconstruites traitées avec le SDS : 25 - Après le traitement avec SDS, les hémi-cornées humaines reconstruites sont rincées avec du milieu de culture, par exemple du DMEM, puis remises en culture pendant au moins 24h supplémentaires dans le milieu de culture décrit pour la préparation des hémi-cornées humaines reconstruites (exemple 5). - Les surnageants de culture des hémi-cornées humaines reconstruites sont ensuite récupérés afin de doser les cytokines pro-inflammatoires sécrétées. Les surnageants de culture peuvent éventuellement être congelés avant leur utilisation. - les inventeurs ont évalué la sécrétion d'IL-6, par exemple par une méthode de membrane ARRAY , en fonction de la viabilité cellulaire précédemment étudiée à l'exemple 6. Les résultats du dosage de l'IL-6 sont présentés dans la figure 9. Les inventeurs ont montré qu'il existe une corrélation directe entre une forte sécrétion d'IL-6 et l'effet irritant du SDS 1 o sans mortalité cellulaire.

Exemple 8 : Production in vitro d'une hémi-cornée humaine reconstruite comme modèle pharmacotoxicologique : Etude de la récupération cellulaire par analyse histologique (figure 10). 15 Suite aux exemples 5 à 7, les inventeurs ont étudié la récupération cellulaire des hémi-cornées humaines reconstruites traitées par SDS c'est-à-dire leur capacité de régénération suite à l'effet d'un traitement, par exemple dans cette étude suite à l'effet d'un irritant. Cette étude de récupération a été effectuée de la manière suivante : 20 • Préparation des cellules : telle que décrit dans l'exemple 1. • Préparation du biomatériau poreux : telle que décrit dans l'exemple 2. Pour cette étude, les inventeurs ont utilisé le gel aqueux [collagène (72%), GAG (8%) et chitosane (20%)] à 1,6% de matière sèche qui a ensuite subi l'étape de congélation -80°C. 25 • Préparation du stroma cornéen humain reconstruit : telle que décrit dans l'exemple 3. • Préparation des hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec le SDS : telle que décrit dans l'exemple 5. • Etude de la récupération cellulaire des hémi-cornées humaines 3o reconstruites traitées avec le SDS : Après le traitement par SDS, les hémi-cornées humaines reconstruites sont rincées avec du milieu de culture, par exemple du DMEM, puis remises en culture pendant au moins 24h supplémentaires dans le milieu de culture décrit pour la préparation des hémi-cornées humaines reconstruites (exemple 5). Les études histologiques sont réalisées telles que décrit dans l'exemple 5. Les résultats histologiques sont présentés dans la figure 10. Les inventeurs ont montré que les hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec 0,5% et 1% SDS présentent, après 48h de récupération, une organisation épithéliale proche des hémi-cornées non 1 o traitées. Par contre, les traitements à 2% et 3% de SDS induisent des dommages épithéliaux irréversibles.

Exemple 9 : Production in vitro d'une hémi-cornée humaine reconstruite comme modèle pharmacotoxicologique : Etude de la récupération cellulaire 15 par analyse de la viabilité cellulaire (figure 11). Suite à l'exemple 8, les inventeurs ont ensuite étudié la viabilité cellulaire des hémi-cornées humaines reconstruites après au moins 24h de récupération suite au traitement avec l'irritant SDS. Cette étude de récupération a été effectuée de la manière suivante : 20 • Préparation des cellules : telle que décrit dans l'exemple 1. ^ Préparation du biomatériau poreux : telle que décrit dans l'exemple 2. Pour cette étude, les inventeurs ont utilisé le gel aqueux [collagène (72%), GAG (8%) et chitosane (20%)] à 1,6% de matière sèche qui a ensuite subi l'étape de congélation -80°C. 25 ^ Préparation du stroma cornéen humain reconstruit : telle que décrit dans l'exemple 3. • Préparation des hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec le SDS : telle que décrit dans l'exemple 5. • Etude de a récupération cellulaire des hémi-cornées humaines o reconstruites traitées avec le SDS : telle que décrit dans l'exemple 8.

Les études de viabilité cellulaire sont réalisées telles que décrit dans l'exemple 6. Les résultats sont présentés dans la figure 11. Les inventeurs ont montré que les hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec 0,5% de SDS et après récupération pendant au moins 24h (T= 48h) présentent une viabilité cellulaire significativement équivalente aux hémicornées humaines reconstruites après traitement (T= Oh). Par contre, les hémi-cornées humaines reconstruites traitées avec 1%, 2% et 3% de SDS présentent une viabilité cellulaire significativement plus faible après au moins 24h de récupération (T= 48h) qu'après le traitement (T= Oh).

Claims (22)

REVENDICATIONS

1. Support de culture cellulaire pour cultiver des cellules de cornée, ledit support comprenant au moins un biopolymère sous forme de matrice poreuse dont la taille des pores est définie pour laisser diffuser et adhérer des cellules stromales de cornée au sein du support.

2. Support, selon la revendication 1, caractérisé en ce la matrice poreuse est adaptée également à la culture d'un autre type cellulaire comme des 10 cellules épithéliales, et/ou des cellules endothéliales, de cornée.

3. Support, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la matrice poreuse est réalisée à base d'une solution aqueuse d'au moins un biopolymère, de préférence d'une macromolécule de la matrice 15 extracellulaire (MEC), de préférence d'une glycoprotéine, et de préférence encore à base d'une solution aqueuse de collagène.

4. Support, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la matrice poreuse comprend au moins deux biopolymères en 20 mélange.

5. Support, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la matrice poreuse comprend au moins une glycoprotéine, et de préférence du collagène, éventuellement en association avec un ou 25 plusieurs polysaccharides éventuellement substitués, comme un glycosaminoglycanne, tel que le chondroïtine 4-sulfate, le chondroïtine

6-sulfate, l'acide hyaluronique, ou un de leurs mélanges, et/ou la chitine, et/ou le chitosane ; et/ou un ou plusieurs protéoglycannes ; et de préférence avec au moins un polysaccharide, et du chitosane, 30 éventuellement modifié. FR 0850948 Modifiée le 13 juin 2008 6. Support, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la matrice poreuse est obtenue à partir d'un gel aqueux déshydraté.

7. Support, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la matrice poreuse est réalisée à base d'un mélange de collagène, d'au moins un polysaccharide, et de chitosane, éventuellement modifié, et de préférence à une proportion de collagène comprise entre 60 et 90%, de GAG comprise entre 0 et 15%, et de chitosane comprise entre 10 et 30%, en pourcentage en poids sec du poids total sec de ce mélange.

8, Support de culture cellulaire pour cultiver des cellules de cornée, ledit support de culture comprenant un gel aqueux déshydraté, d'au moins un biopolymère adapté à la culture de cellules stromales de cornée, ledit gel aqueux déshydraté présentant une porosité adaptée à la culture de cellules stromales de cornée comprise entre 30 et 70 microns, et plus particulièrement comprise entre 40 et 50 microns.

9. Support, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le gel aqueux à base d'un mélange de collagène, de glycosaminoglycanne, et de chitosane, éventuellement modifié, a une concentration comprise entre 1, 25 à 1,6 °/o du mélange de collagène, de glycosaminoglycanne, et de chitosane, éventuellement modifié, par rapport au milieu aqueux (p/p).

10. Support, selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la matrice poreuse est obtenue par lyophilisation d'un gel aqueux, notamment par congélation à une température comprise entre -30°C et -196°C, et de préférence, pour des raisons industrielles, à une température comprise entre -40°C et -80°C.FR 0850948 Modifiée le 13 juin 2008

11. Dispositif de culture cellulaire de cellules de cornée, caractérisé en ce que le dispositif de culture cellulaire comprend un évidement et au moins un support tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10 formant une couche pour la culture des cellules à cultiver, cette couche étant obtenue par déshydratation d'un gel aqueux d'au moins un biopolymère coulé directement dans l'évidement du dispositif.

12. Dispositif, selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend une première zone de culture de cellules stromales dite zone stromale et une seconde zone de culture soit de cellules épithéliales dites zone épithéliale , soit de cellules endothéliales dite zone endothéliale .

13. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 11 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend une première zone de culture de cellules stromales dite zone stromale et une seconde zone de culture de cellules épithéliales dites zone épithéliale , et une troisième zone de culture de cellules endothéliales dite zone endothéliale .

14. Dispositif, selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que la zone stromale comprend le support de culture disposé dans un insert (ou nacelle) de dimension adaptée pour être insérable dans le volume de l'évidement du dispositif.

15. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que la zone épithéliale est distincte de la zone stromale, et comprend une couche de matériau poreux pour la culture de kératocytes.

16. Procédé automatisé de préparation d'un dispositif tel que défini selon 30 l'une quelconque des revendications 11 à 15. FR 0850948 Modifiée le 13 juin 2008

17. Procédé, selon la revendication 16, caractérisé en ce que le gel aqueux est coulé par un dispositif automatisé, et/ou en ce que les cellules sont ensemencées par un dispositif automatisé.

18. Conditionnement étanche comprenant un dispositif tel que défini selon l'une quelconque des revendications 11 à 15.

19. Modèle de cornée, notamment humaine, comprenant au moins des cellules stromales de cornée et au moins un support de culture des cellules stromale de cornée, ledit support étant tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10.

20. Modèle de cornée, selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend également des cellules épithéliales et/ou des cellules endothéliales, et de préférence des cellules épithéliales et des cellules endothéliales, de cornée.

21. Utilisation d'un modèle tel que défini à la revendication 19, ou 20, comme modèle de test alternatif aux tests de toxicité sur les animaux 20 notamment en cosmétologie et pharmacologie.

22. Utilisation d'un modèle de cornée, tel que défini à la revendication 19 ou 20, pour la préparation d'une cornée reconstruite notamment pour être utilisé dans une greffe de cornée ou en chirurgie correctrice. 25