FR2881434A1 - Dispositif de support de culture de cellules - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un dispositif de Dispositif de culture cellulaireCe dispositif (100) de culture cellulaire, destiné à recevoir des cellules avec leur milieu de culture, est caractérisé en ce qu'il contient au moins une couche de matériau poreux de support des cellules, cette couche étant obtenue par déshydratation d'un gel aqueux coulé directement soit dans ledit fond du puits (110-111), soit dans le fond d'une nacelle ou insert (150) d'une dimension adaptée pour être insérable dans le volume du puits.L'invention permet de réaliser une culture qui peut être automatisée.
Description
2881434 1
L'invention concerne un dispositif de culture permettant une meilleure reproductibilité des cultures.
Description de l'art antérieur
L'état de la technique le plus proche est constitué par le document EP 0 296 078.
Ce document décrit de nouveaux biomatériaux à base de mélange de collagène, de chitosane et de glycosaminoglycanne. Ce biomatériau est utilisé notamment comme support pour la prolifération cellulaire, notamment dans le cas de greffe sur des patients brûlés. Dans le cas d'une fabrication de support pour la prolifération cellulaire, celui-ci est généralement formé par un film support obtenu par séchage d'un gel coulé dans des flacons, des boîtes de pétri ou des plaques multipuits (voir
exemple 5, page 14).
Il est également prévu un mode de réalisation, décrit à l'exemple 1, notamment pour préparer un derme composant l'essentiel d'une peau artificielle selon lequel le gel formé par une solution homogène est lyophilisé dans des lyophilisateurs industriels, ou déshydraté par déshydratation thermique dans des étuves éventuellement sous vide.
Il est également prévu dans l'exemple 5 une variante selon laquelle une matrice lyophilisée ou déshydratée peut être utilisée in vitro pour réaliser des cultures tridimensionnelles de cellules (fibroblastes, kératinocytes, chondrocytes, etc.) (page 14, lignes 8 à 11) . Dans ce cas, comme décrit à l'exemple 1, la lyophilisation a lieu dans un lyophilisateur industriel ou la déshydratation thermique a lieu dans une étuve éventuellement sous vide, et le substrat obtenu qui est constitué d'une éponge doit tout d'abord être découpé à la dimension nécessaire et ensuite transféré par exemple dans 2881434 2 un flacon, une boîte de pétri ou une plaque multipuits pour effectuer ladite culture in vitro.
BUTS DE L'INVENTION et PROBLEMES TECHNIQUES A RESOUDRE 5 L'invention a pour but principal de résoudre le nouveau problème technique relatif à la préparation de substrats de cultures ayant une meilleure reproductibilité.
L'invention a également pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant à diminuer le nombre d'étapes du procédé de préparation des plaques de culture comprenant un milieu poreux destiné à recevoir les cellules.
La présente invention a encore pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant à fournir un procédé de préparation de dispositif support de substrat(s) de culture, stérile, de manière reproductible, sûre et fiable, à grande échelle pour une utilisation industrielle et médicale, notamment afin de permettre la réalisation d'un screening haut débit.
La présente invention a encore pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant à fournir une solution de dispositif support de substrat(s) de culture utilisable sur une plate-forme robotisable ou automatisable, de préférence permettant de positionner les substrats de manière à ce que le dispositif d'injection ou d'aspiration du milieu de culture puisse se placer automatiquement notamment en étant commandé par un robot ou un automate par exemple lui-même commandé par un ordinateur et ce de manière reproductible.
La présente invention a enfin pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant à fournir une solution de dispositif support de substrats de culture utilisable dans divers types de support, notamment utilisant des inserts amovibles, compatibles avec une automatisation ou robotisation pour le positionnement de l'insert, en vue d'une culture automatisée et/ou d'un screening automatisé.
Résumé de l'invention Selon un premier aspect, l'invention concerne un dispositif de culture cellulaire, comprenant au moins un puits de culture cellulaire destiné à recevoir des cellules à cultiver avec leur milieu de culture, comprenant un fond, caractérisé en ce qu'il contient au moins une couche de matériau poreux de support des cellules, obtenue par déshydratation, de préférence par lyophilisation ou par déshydratation thermique, d'un gel aqueux coulé directement soit dans ledit fond du puits, soit dans le fond d'une nacelle ou insert d'une dimension adaptée pour être insérable dans le volume du puits.
Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce qu'au moins le fond du puits ou de la nacelle ou insert contenant la couche de matériau poreux est stérilisé après ladite déshydratation, et de préférence dans un conditionnement étanche.
Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce que le dispositif de culture complet est stérilisé de préférence dans un conditionnement étanche.
Selon encore une autre caractéristique avantageuse de l'invention, la stérilisation précitée est choisie parmi le groupe consistant en une stérilisation par irradiation de préférence aux rayons Beta ou Gamma, ou en un traitement avec un gaz stérilisant tel que I"oxyde d'éthylène.
Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend de préférence un élément de maintien en position d'au moins le bord périphérique de la couche de 2881434 4 matériau poreux en réalisant un effet: anti-rétractation de la couche de matériau poreux et de préférence assurant aussi l'étanchéité à l'interface périphérique de ladite couche de matériau poreux et de la paroi interne latérale lui faisant face du fond.
Dans le cadre de l'invention, cette étanchéité à la périphérie est avantageusement prévue pour éviter les échanges de matière par la périphérie, c'est-à-dire éviter une communication par le bord latéral de la couche de matériau poreux entre des substances déposées sur la surface supérieure de la couche de matériau poreux et le milieu de culture ou les cellules qui peuvent être présentes dans la couche de matériau poreux.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'élément de maintien en position précité comprend une bague annulaire d'une dimension suffisante pour prendre appui sur le bord périphérique de la couche de matériau poreux.
Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce que ledit fond de la nacelle est amovible et solidarisable à la nacelle, elle-même solidarisable au puits.
Selon encore une caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce que ledit fond amovible de la nacelle est solidarisé par emboîtage légèrement à force ou clipsage au puits, en assurant ainsi l'étanchéité de manière sûre et fiable.
Selon encore une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce que ledit fond amovible de la nacelle est solidarisé à l'extérieur du puits ou de la nacelle, le bord inférieur de la paroi latérale du puits ou de la nacelle constituant ainsi un élément de maintien en position du bord périphérique de ladite couche de matériau poreux.
Selon encore une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce qu'au moins une partie de la paroi 2881434 5 interne du fond ou de la nacelle est traitée physiquement ou chimiquement ou biologiquement, ou une combinaison de ceux-ci, pour favoriser la culture cellulaire, par exemple avec un revêtement favorisant l'adhésion et/ou la prolifération des cellules.
Dans le cadre de l'invention, on peut utiliser tout procédé physique ou chimique qui modifie la charge ionique globale du matériau de la paroi, avantageusement un matériau plastique et/ou utiliser un revêtement de la paroi avec toute molécule biologique favorisant l'adhésion et/ou la prolifération des cellules, telle que collagène, fibronectine, laminine, etc. Selon encore un mode de réalisation avantageux de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce que le fond du puits ou de la nacelle est fabriqué en un matériau support inerte choisi parmi le groupe consistant d'un matériau synthétique, de matériau à base de nitrocellulose, d'un matériau à base de polyamide tel qu'un "nylon", d'un matériau à base de polytétrafluoroéthylène ou téflon, d'un matériau à base de polycarbonate, d'un matériau à base de polyéthylène ou de polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, d'un matériau à base d'un polyester, par exemple un polyester de cellulose, notamment un acétate, comme matériau à base d'une membrane Biopore-CM semi-perméable, ou encore la polyvinylpyrrolidone.
Par l'expression "matériau à base de" on entend un matériau qui comprend ou est essentiellement constitué ou uniquement constitué du matériau considéré.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend une pluralité de nacelles ou inserts par puits de culture.
Selon une autre variante de réalisation avantageuse de ce mode de réalisation, ce dispositif comprend aussi un couvercle pourvu d'autant 2881434 6 d'orifices que de nacelles ou inserts, chaque orifice permettant de recevoir et maintenir en position une nacelle ou insert.
Selon une variante de réalisation particulière de l'invention, le gel précité coulé directement à l'intérieur du puits ou de la nacelle comprend du collagène.
Selon une caractéristique avantageuse, le gel comprend un mélange de collagène et d'au moins un polysaccharide.
Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse, le gel comprend un mélange de collagène, d'au moins un polysaccharide et de chitosane, éventuellement modifié, par exemple en ayant un taux d'acylation, de préférence d'acétylation, réglé en fonction de l'application envisagée, différents taux d'acétylation étant bien connus de l'homme de l'art et en particulier décrits dans le document européen précité EP 0296 078.
Sur un deuxième aspect, l'invention concerne aussi l'utilisation du dispositif tel que défini précédemment ou dans la description suivante sur une plate-forme robotisable ou automatisable, de préférence permettant de positionner les substrats de manière à ce qu'un dispositif d'injection ou d'aspiration du milieu de culture puisse se placer automatiquement notamment en étant commandé par un robot ou un automate par exemple lui-même commandé par un ordinateur.
On comprend que grâce à l'invention, on résout bien les différents problèmes techniques précédemment énoncés, de manière simple, sûre et fiable, reproductible à l'échelle industrielle et médicale, en particulier pharmaceutique.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre faite en référence à plusieurs modes de réalisation actuellement préférés de dispositifs de culture cellulaire selon l'invention, donnés 2881434 7 simplement à titre d'illustration et qui rie sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Il est à noter que les figures annexées font partie intégrante de l'invention et que toute caractéristique qui apparaît être nouvelle, à partir de la description prise dans son ensemble et des figures annexées complétant la présente description, par rapport à un état de la technique quelconque, est revendiquée en tant que telle dans sa fonction et donc comme moyen général.
Description des figures:
- La figure 1 représente une vue en perspective éclatée d'un premier mode de réalisation d'un dispositif de support de culture cellulaire selon la présente invention comprenant ici un puits de culture individuel, pourvu d'un élément de maintien en position d'une couche de matériau poreux; 15La figure 2 représente le mode de réalisation de la figure 1 en position assemblée, à l'exception de l'élément de fermeture; -La figure 3 représente une vue en coupe transversale selon la ligne de coupe III -III de la figure 2; La figure 4 représente une variante de réalisation du premier mode de réalisation représenté aux figures 1 à 3, d'un dispositif de support de culture cellulaire selon la présente invention comprenant ici une plaque de culture multipuits La figure 5 représente une vue en perspective éclatée d'un deuxième mode de réalisation d'un dispositif de support de culture cellulaire selon la présente invention comprenant ici une nacelle pouvant être insérée dans un puits de culture individuel; - La figure 6 représente ce second mode de réalisation de la figure 5 en position assemblée, à l'exception de l'élément de fermeture; 2881434 8 la figure 7 représente une vue en coupe transversale selon la ligne de coupe VII -VII de la figure 6; - La figure 8 représente une variante du deuxième mode de réalisation d'un dispositif de support de culture cellulaire selon la présente invention, dans le cadre d'une plaque de culture multipuits; - La figure 9 représente un troisième mode de réalisation de la dispositif de support de culture cellulaire selon la présente invention, dans le cadre d'une variante de la combinaison d'un puits amovible et d'un élément de maintien en position constitué ici par une bague annulaire de maintien en position, dans le cadre d'une plaque de culture multipuits.
La figure 10 représente un quatrième mode de réalisation d'un dispositif de support de culture cellulaire selon la présente invention, comprenant un puits de culture commun d'un volume suffisant pour recevoir une pluralité de nacelles ou inserts; et 15- La figure 11 représente une vue en coupe partielle longitudinale du dispositif de culture montrant une pluralité de nacelles ou inserts maintenus dans une pluralité d'orifices prévus dans un couvercle, permettant une utilisation avantageuse dans le cadre d'une plateforme robotisée, selon laquelle une pipette peut être insérée de manière automatisée pour un versement ou un prélèvement du milieu de culture.
En référence aux figures 1 à 3, il est représenté un premier mode de réalisation d'un dispositif de culture cellulaire représenté par le numéro de référence générale 10, comprenant au moins un puits 20, par exemple de forme sensiblement cylindrique, de culture cellulaire destiné à recevoir des cellules à cultiver (naturellement non représentées) avec leur milieu de culture, comprenant un fond 21, caractérisé selon la présente invention en ce qu'il contient au moins une couche 36 de matériau poreux de support des cellules, obtenue par déshydratation, de préférence par lyophilisation ou par déshydratation thermique, d'un gel aqueux coulé 2881434 9 directement, selon ce premier mode de réalisation, dans ledit fond 21 du puits. Le gel ainsi coulé puis déshydraté, forme un film ou une éponge au fond du puit.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce que au moins le fond 21 du puits 20 contenant la couche 36 de matériau poreux est stérilisé après ladite déshydratation, et de préférence dans un conditionnement étanche (non représenté ici).
Selon encore un mode de réalisation avantageux de l'invention, le dispositif est caractérisé en ce que le dispositif de culture complet 10 est stérilisé de préférence dans un conditionnement étanche (non représenté).
Selon une variante de réalisation particulièrement avantageuse, la stérilisation est choisie parmi le groupe consistant en une stérilisation par irradiation de préférence aux rayons Beta ou Gamma, ou en une stérilisation par traitement avec un gaz stérilisant tel que l'oxyde d'éthylène.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ce dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend un élément 50 de maintien en position d'au moins le bord périphérique 36a de la couche 36 de matériau poreux, en réalisant un effet anti-rétractation de la couche 36 de matériau poreux et de préférence assurant aussi l'étanchéité à l'interface périphérique de ladite couche de matériau poreux et de la paroi interne latérale 22 lui faisant face du puits 20.
Comme l'homme de l'art le comprendra aisément, dans le cadre de l'invention, cette étanchéité à la périphérie est avantageusement prévue pour éviter les échanges de matière par la périphérie, c'est-à-dire éviter une communication par le bord latéral de la couche de matériau poreux entre des substances déposées sur la surface supérieure de la couche de 2881434 10 matériau poreux et le milieu de culture ou les cellules qui peuvent être présentes dans la couche de matériau poreux.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'élément 50 de maintien en position précité comprend une bague annulaire 52 d'une dimension suffisante pour prendre appui sur le bord périphérique 36a de la couche 36 de matériau poreux et aplatir au moins en partie ce bord périphérique 36a afin d'assurer un effet anti- rétractation de la couche 36 de matériau poreux, comme cela est bien montré dans la vue en coupe de la figure 3.
Dans le mode de réalisation représenté, la bague annulaire 52 présente une paroi interne cylindrique 53 qui constituera en pratique aussi une paroi interne effective du puits 20 de culture, surplombant la couche 36 poreuse. La bague annulaire 52 peut présenter avantageusement à sa partie supérieure un élément d'arrêt 54, tel qu'une collerette, pour faciliter également l'enlèvement de l'élément 50 de maintien. L'élément d'arrêt 54 peut être prévu pour venir se positionner sur un épaulement 23 de la paroi 22 du puits 20. On peut encore prévoir un élément de fermeture 60 classique tel qu'un couvercle.
En référence à figure 4, on a montré une variante de réalisation du premier mode de réalisation des figures 1 à 3, selon laquelle il est prévu une plaque 80 multi- ouvertures 81 pour recevoir une pluralité de dispositifs de culture 10 avec leurs puits 20 comportant chacun une couche 36 de matériau poreux et pour lesquels il est prévu une pluralité d'éléments de maintien 50, comme cela est bien compréhensible pour l'homme de l'art.
Selon une autre variante de réalisation de l'invention, il est évident que la plaque 80 peut intégrer la pluralité des puits 20 de culture dans lesquels les couches 36 de matériau poreux peuvent être formées initialement in situ par déshydratation, de préférence par lyophilisation ou 2881434 11 par déshydratation thermique, d'un gel coulé directement dans le fond 21 de chaque puits 20.
Cette plaque 80 peut être avantageusement recouverte d'un élément formant couvercle 60, pour permettre la culture en évitant des contaminations, comme cela est également bien connu de l'homme de l'art.
Selon un deuxième mode de réalisation représenté aux figures 5 à 7, de manière similaire à celui des figures 1 à 3, et pour lesquels les numéros de référence des pièces similaires ou identiques gardent le même numéro de référence ou celui-ci est augmenté de 100.
On observe qu'ici le dispositif complet de culture ici référencé 100, comprend d'une part une première pièce inférieure 110 définissant un premier puits dit extérieur de culture proprement dit, comportant à son bord supérieur un épaulement 123 similaire épaulement 23 représenté à la figure 3; et d'autre part une deuxième pièce 115 dénommée ici une nacelle, composée, selon ce mode de réalisation représenté, de deux éléments distincts, à savoir: - un premier élément dit inférieur 120 formant un deuxième puits dit intérieur de culture similaire en fonction au puits de culture 20 représenté aux figures 1 à 3, comprenant aussi une paroi formant le fond 121, une paroi latérale interne 122, et un bord supérieur, ici en forme de collerette, 124 destiné ici plus particulièrement à faciliter la préhension de ce premier élément inférieur 120; et - un deuxième élément dit supérieur 150 fonctionnant également comme élément de maintien, et ayant donc une fonction similaire à l'élément de maintien 50 du premier mode de réalisation des figures 1 à 3, comprenant ici une partie inférieure sensiblement cylindrique 152, de fonction similaire à la partie cylindrique de la bague annulaire 52 de l'élément de maintien et dont la surface interne 153 est similaire à la surface interne 53 de la 2881434 12 bague annulaire 52; une partie intermédiaire formée ici par des bras de liaison 155 reliant la partie cylindrique 152 à une partie supérieure définissant un bord supérieur ici en forme de collerette 154, similaire à la collerette 54 de l'élément de maintien 50 du premier mode de réalisation des figures 1 à 3.
Ce deuxième élément 150 comprend également une échancrure 157 dans la partie supérieure formant le bord supérieur 154, avantageusement s'étendant ici sur toute la distance séparant deux bras de liaison adjacents 155, de manière à libérer un espace suffisant pour le passage d'une partie tubulaire d'une pipette, ou pointe de pipette multicanaux ou d'une canule de versement ou de prélèvement automatique permettant la distribution et l'élimination d'une solution de milieu de culture dans l'élément formant puits 120 dans lequel a été initialement formée in situ la couche 36 de matériau poreux.
En effet, on constate que selon ce deuxième mode de réalisation de l'invention, ledit premier élément 120 constituant en pratique un puits de culture est amovible, comme bien visible à la figure 5 et solidarisable au moins provisoirement avec le deuxième élément 150.
Ainsi, il est possible de couler le gel initial directement dans le puits défini par le fond 121 et la paroi latérale 122 de ces premiers éléments 120, de placer ensuite ces premiers éléments 120 dans des lyophilisateurs ou dans des étuves éventuellement sous vide, de manière à former in situ la couche 36 de matériau poreux.
Ensuite, ces premiers éléments 120 peuvent être combinés avec les seconds éléments 150 qui sont prévus de sorte que la partie cylindrique annulaire inférieure 152 vienne prendre appui sur le bord périphérique 36 a de la couche 36 de matériau poreux pour la comprimer et assurer un effet antirétractation de ce bord périphérique 36 a de la couche de 2881434 13 matériau poreux 36 comme cela est bien visible figure 7 de manière similaire au premier mode de réalisation comme représenté à la figure 3. Ainsi, selon une variante de réalisation avantageuse de l'invention, le premier élément 120 formant le fond du puits de la nacelle 115 est solidarisé par emboîtage légèrement à force ou clipsage au second élément 150, qui dans le cas de la nacelle 115 est formé par la paroi cylindrique 152.
Selon encore un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit fond 121 du premier élément 120 est solidarisé à l'extérieur de la partie cylindrique 152 du deuxième élément supérieur 150 dont la paroi intérieure 54 définit en pratique aussi une paroi du puits de la nacelle 115, tandis que le bord inférieur 157 de la partie cylindrique 152 faisant partie de la nacelle constitue un élément 150 de maintien en position du bord périphérique 36a de ladite couche 36 de matériau poreux.
En référence à figure 8, on a représenté de manière similaire à la figure 4, une plaque, ici portant le numéro de référence 180, multiouvertures pour recevoir une pluralité de dispositifs de culture 100 avec leurs nacelles 115 comprenant les puits 120 comportant chacun une couche 36 de matériau poreux et pour lesquels il est prévu une pluralité d'éléments de maintien 150, comme cela est bien visible à la figure 8 et bien compréhensible pour l'homme de l'art.
Selon une autre variante de réalisation de l'invention représentée ici à la figure 8, il est évident que la plaque 180 peut intégrer la pluralité des puits extérieurs 110 de culture comprenant un fond 111 dans le volume desquels les nacelles 150 peuvent être disposées, lesquelles comprennent les premiers éléments 120 définissant Iles puits intérieurs définis par les parois formant fond 121 et latérale 122, contenant les couches 36 de matériau poreux et ayant été formées initialement in situ par 2881434 14 déshydratation, de préférence par lyophilisation ou par déshydratation thermique, d'un gel coulé directement dans le fond 21 de chaque puits 20.
On comprend que cette structure du dispositif de culture est en elle-même nouvelle et non évidente pour l'homme de l'art.
Cette plaque 180 peut être avantageusement recouverte d'un élément formant couvercle 160, pour permettre la culture en évitant des contaminations intempestives, de manière similaire au mode de réalisation de la figure 4.
Enfin en référence à la figure 9, il a été représenté une autre variante de réalisation pour lesquels les numéros de référence ont encore été augmentés de 100, d'une plaque 280 comprenant une pluralité de cavités ayant une paroi latérale 210 avec un épaulement sur son bord supérieur 223, et une paroi formant fond 211, définissant des puits extérieurs dans le volume desquels une pluralité de dispositifs 200 de culture selon la présente invention peuvent être insérée mais selon lesquels ici la nacelle 215 est réalisée monobloc et constitue en quelque sorte un insert définissant le puits interne proprement dit de culture 220 pouvant être ici d'une plus grande dimension que la partie inférieure formant puits 120 du mode de réalisation des figures 5 à 8.
Selon cette variante du troisième mode de réalisation, il est prévu sur la nacelle ou insert 215, des pattes 254 similaires à la collerette 54 ou 154 des modes de réalisation précédents, pour venir prendre appui sur la surface supérieure formant épaulement 223 de la plaque 280 comportant des multiples ouvertures 281 avec un fond 221, bien visibles à la figure 9.
Comme dans les modes de réalisation précédents, ces nacelles ou inserts 215 contiennent une couche 38 de matériau poreux formé in situ à partir d'un gel, par déshydratation, de préférence réalisée par lyophilisation ou par déshydratation thermique.
2881434 15 Selon l'invention, le dispositif de culture 200 comprend aussi un moyen 250 de maintien en position, similaire au moyen 50, figure 1 à 4 et au moyen 150, figure 5 à 8, avantageusement comprenant une bague annulaire 252 ayant une partie cylindrique dont le bord inférieur 257 aura la fonction anti-rétractation du bord périphérique 36a de la couche 36 de matériau poreux, comme pour les modes de réalisation précédents.
La bague annulaire 252 avantageusement également comprendre une collerette 254 comprenant des évidements 256, correspondant aux pattes 224.
L'homme de l'art comprendra aisément que l'invention peut être mise en oeuvre avec différents modes de réalisation, sans sortir de son cadre. En outre, ces modes de réalisation font partie intégrante de l'invention et sont revendiqués en tant que tels.
D'autre part, selon un deuxième aspect, l'invention concerne l'utilisation du dispositif tel que défini précédemment sur une plate- forme robotisable ou automatisable, comme montré aux figures 10 et 11, de préférence permettant de positionner les substrats de manière à ce qu'un dispositif 392 d'injection ou d'aspiration du milieu de culture puisse se placer automatiquement notamment en étant commandé par un robot ou un automate 396 par exemple lui-même commandé par un ordinateur 398.
Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, au moins une partie de la paroi interne en contact avec le milieu de culture, que ce soit du puits et/ ou de la nacelle et/ou de l'insert est traitée physiquement ou chimiquement ou biologiquement, ou une combinaison de ceux-ci, pour favoriser la culture cellulaire, par exemple avec un revêtement favorisant l'adhésion et/ou la prolifération des cellules.
Dans ce cadre on pourra utiliser tout procédé physique ou chimique quimodifie la charge ionique globale du matériau constituant la paroi interne en contact avec milieu de culture, avantageusement un matériau 2881434 16 plastique et/ou ce qui aboutit à la réalisation d'un revêtement de ladite paroi interne avec toute molécule biologique favorisant l'adhésion du milieu de culture et/ou des cellules, telle que collagène, fibronectine, laminine, etc. Dans la partie introductive de la présente description, il a été donné des exemples de matériau utilisables pour réaliser cette paroi.
En référence aux figures 10 et 1]_, il a été représenté un quatrième mode de réalisation d'un dispositif de culture cellulaire selon l'invention, représenté par le numéro de référence générale 300, celui-ci comprenant un élément à réceptacle unique 380 constituant un puits de culture commun unique 310 comprenant ainsi un fond commun 311 de culture destiné à recevoir le milieu de culture, dans lequel réceptacle il peut être inséré une pluralité de nacelles ou inserts, comme par exemple les nacelles ou inserts 150 du mode de réalisation des figures 5 à 7, ou 220-250 du mode de réalisation de la figure 9.
Avantageusement, en vue de maintenir les nacelles ou inserts 150 ou 220250 en position stable, on prévoit selon l'invention, un couvercle 360 pourvu d'autant d'orifices 390, que de nacelles ou inserts prévus. Ainsi, chaque orifice 390 peut permettre de recevoir et maintenir en position une nacelle ou insert 150 ou 220-250.
On comprend que grâce à ce mode de réalisation comprenant un réceptacle 380 formant un puits commun 310-311 de culture, par une opération unique, il est possible d'insérer une partie tubulaire d'une pipette ou pointe de pipette multicariaux telle que celle représentée schématiquement à la figure 10 portant le numéro de référence 392, et que l'on voit mieux à la figure 11, ou cle manière similaire d'une canule, pour le versement ou le prélèvement automatique permettant le versement ou l'élimination d'une solution de milieu de culture dans l'élément formant un puits commun 310311, ce milieu de culture étant 2881434 17 représenté schématiquement par le numéro de référence 394 à la figure 11.
L'homme de l'art comprend aisément que la pipette 392 peut faire partie d'une plateforme robotisable ou automatisable commandée par un robot ou un automate 396, par exemple lui-même commandé par un ordinateur 398.
Dans le cadre de l'invention, il est possible de réaliser des cultures successives.
Ainsi, avec un milieu de culture atteignant le niveau A représenté à 10 la figure 11, il est par exemple possible de réaliser une culture pour une période de la durée d'une culture cellulaire.
Ensuite, par pipetage, par la pipette 392, il est possible de changer aisément en une seule fois, de milieu de culture et d'introduire un volume de milieu de culture à un niveau différent, par exemple le niveau B, ou inversement, permettant ici de mettre les cellules à l'interface air/liquide.
Avec le niveau A, on obtient une hauteur hi de milieu de liquide et avec le niveau B, on obtient une hauteur h2 de milieu de liquide, cette hauteur étant contrôlée par le volume de milieu de culture introduit dans le puits commun 310, 311 formé par le réceptacle 380 ou plaque de fond.
Dans le mode de réalisation représenté à la figure 11, le couvercle 360 a ses bords latéraux 361 qui viennent pénétrer à l'intérieur du réceptacle 380, mais on peut évidement prévoir que le bord latéral 361 du couvercle 360 vienne à l'extérieur du réceptacle 380.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la couche 36 de matériau poreux est obtenue in situ par coulage d'un gel comprenant du collagène. Ce collagène pourra être de toute origine et sera avantageusement d'origine bovine, porcine, équine ou marine. Selon une variante de réalisation particulière, le gel comprend un mélange de collagène et d'au moins un polysaccharide. On pourra utiliser tout type 2881434 18 de polysaccharide et en particulier un glycosaminoglycanne, tel que le chondroïtine 4-sulfate, le chondroïtine 6-sulfate, l'acide hyaluronique et leurs mélanges.
Selon une autre variante de réalisation particulière, le gel comprend un mélange de collagène, d'au moins un polysaccharide et de chitosane, éventuellement modifié. Comme chitosane modifié, on pourra se reporter à la description du document le plus proche cité dans la partie introductive de la description, à savoir le brevet EP 0 296 078, et qui est incorporé ici dans sa totalité par référence.
La couche 36 de matériau poreux peut ainsi être préparée à partir de la composition d'un gel d'un mélange de collagène, d'au moins un polysaccharide et de chitosane, comme décrit, à l'exemple 1 du brevet européen EP 0296 078.
Cependant, de manière non évidente selon la présente invention, le gel est coulé : a) soit directement dans le puits 20, figures 1 à 4, b) soit directement dans le puits 120 de la nacelle 115, figures 4 à 8, c) soit encore directement dans la nacelle ou insert 215, figure 9; Ensuite, il est réalisé in situ la déshydratation de ce gel ainsi coulé dans le puits 20, ou le fond de la nacelle ou insert 120 ou 215 de préférence par lyophilisation ou par déshydratation thermique, directement dans l'appareil de déshydratation, de préférence un lyophilisateur ou une étuve éventuellement sous vide.
Dans le cadre de l'invention, le puits 20 ou le fond 120 de la nacelle 115 ou l'insert 215 comprend, par cette préparation in situ, dès l'origine la couche 36 de matériau poreux servant cle support au milieu de culture qui n'a plus besoin d'être découpée et/ou transférée d'un dispositif intermédiaire de déshydratation thermique ou de lyophilisation au puits de culture.
2881434 19 En outre, grâce au moyen de maintien en position respectivement 50; 150; 250 du bord périphérique 36a de la couche 36 matériau poreux, on obtient un effet anti-rétractation du bord périphérique 36a de la couche de matériau poreux 36, ainsi qu'avantageusement simultanément une étanchéité à l'interface de la paroi du puits de culture, c'est-à-dire au niveau du bord périphérique 36a de la couche 36 de matériau poreux, en obtenant les avantages techniques précédemment énoncés.
L'invention comprend donc tous les moyens techniques équivalents des moyens techniques décrits et représentés aux figures annexées qui font partie intégrante de l'invention, ainsi que leurs diverses combinaisons.
Claims (17)
1. Dispositif de culture cellulaire, comprenant au moins un puits de culture cellulaire destiné à recevoir des cellules avec leur milieu de culture, caractérisé en ce qu'il contient au moins une couche de matériau poreux de support des cellules, cette couche étant obtenue par déshydratation d'un gel aqueux coulé directement soit dans ledit fond du puits, soit dans le fond d'une nacelle ou insert d'une dimension adaptée pour être insérable dans le volume du puits.
2. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la déshydratation est réalisée de préférence par lyophilisation ou par déshydratation thermique.
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que au moins le fond du puits ou la nacelle ou insert contenant la couche de matériau poreux est stérilisé après ladite déshydratation, et de préférence dans un conditionnement étanche.
4. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que dispositif de culture complet est stérilisé de préférence dans un conditionnement étanche.
5. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce 25 que la stérilisation est choisie parmi le groupe consistant d'une stérilisation par irradiation de préférence aux rayons bêta ou gamma, ou par traitement avec un gaz stérilisant tel que l'oxyde d'éthylène.
2881434 21
6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un élément de maintien en position d'au moins le bord périphérique de la couche de matériau poreux de préférence assurant l'étanchéité à l'interface périphérique de ladite couche de matériau poreux et de la paroi interne latérale lui faisant face du fond.
7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'élément de maintien en position est d'une dimension suffisante pour prendre appui sur ledit bord périphérique de la couche de matériau poreux et assurer l'étanchéité à la dite interface périphérique.
8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit fond du puits ou de la nacelle est amovible et solidarisable au puits.
9. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit fond du puits ou de la nacelle est solidarisée par emboîtage légèrement en force ou clipsage au puits, assurant l'étanchéité.
10. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit fond du puits ou de la nacelle est solidarisé à l'extérieur du puits ou de la nacelle, le bord inférieur de la paroi latérale du puits ou de la nacelle constituant un élément de maintien en position du bord périphérique de ladite couche de matériau poreux.
11. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que au moins une partie de la paroi interne du fond ou de la nacelle est traitée physiquement ou chimiquement ou biologiquement, ou une combinaison de ceux-ci, pour favoriser la culture cellulaire, par exemple 2881434 22 avec un revêtement favorisant l'adhésion et/ou la prolifération des cellules.
12. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce 5 qu'il comprend une pluralité de nacelles ou inserts (150; 220-250) par puits de culture (380).
13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend un couvercle 360 pourvu d'autant d'orifices 390, que de nacelles ou inserts (150; 220-250), chaque orifice (390) permettant de recevoir et maintenir en position une nacelle ou insert (150; 220-250).
14. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gel aqueux comprend du collagène.
15. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gel aqueux comprend un mélange de collagène et d'au moins un polysaccharide.
16. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gel aqueux comprend un mélange de collagène, d'au moins un polysaccharide et/ou de chitosane, éventuellement modifié.
17. Utilisation du dispositif tel que défini l'une quelconque des revendications 1 à 16, sur une plate-forme robotisable ou automatisable, de préférence permettant de positionner les substrats de manière à ce qu'un dispositif d'injection ou d'aspiration du milieu de culture puisse se placer automatiquement notamment en étant commandé par un robot ou un automate par exemple lui-même commandé par un ordinateur.
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