WO2001014514A1 - Dispositif a usage biologique, notamment pour la culture cellulaire - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un dispositif à usage biologique, notamment pour la culture cellulaire qui comporte au moins une unité élémentaire comprenant un container, lequel container comprend une enveloppe externe souple biocompatible et au moins une voie d'accès. De manière caractéristique selon l'invention l'unité élémentaire comporte des moyens de rigidification d'au moins une zone périphérique du container. La présente invention concerne également un cadre de rigidification pour un dispositif à usage biologique, notamment pour la culture cellulaire qui de manière caractéristique selon l'invention comporte des moyens de fixation sur une zone périphérique d'un container.

Description

DISPOSITIF A USAGE BIOLOGIQUE, NOTAMMENT POUR LA CULTURE CELLULAIRE

La présente invention concerne le domaine des containers souples, du type poche, utilisés dans le domaine médical pour le conditionnement de liquides ou encore, plus récemment en biologie pour le conditionnement de culture de cellules.

Plus particulièrement, la présente invention concerne un dispositif à usage biologique, notamment pour la culture cellulaire.

L'avènement des cultures in vitro de cellules directement transplantables chez l'homme est à l'origine du développement de poches flexibles pour le conditionnement desdites cultures. Depuis la démonstration du potentiel des cultures de monocytes humains et de cellules de moelle osseuse humaine dans une poche en Téflon ; cette méthodologie s'est constamment développée dans le cadre de la préparation et/ou ' de l'activation ex vivo de cellules sanguines immunocompétentes telles que les macrophages, les cellules dendritiques, les lymphocytes et cellules LAK (Lymphokine-activated killer cells). Récemment, l'utilisation de poches de culture cellulaire s'est accrue dans le cadre du développement des protocoles cliniques d'expansion ex vivo des cellules souches hématopoïetiques issues de prélèvements de moelle osseuse, de sang périphérique comme de sang ombilical Ces protocoles visent principalement à augmenter la qualité et/ou la quantité de cellules exploitées en thérapeutique humaine.

Contrairement aux dispositifs conventionnels utilisés pour la culture cellulaire in vitro tels que boîtes de Pétri ou flacons, une poche présente en effet de nombreux avantages. D'une part, elle constitue un système clos d'expansion cellulaire présentant des garanties notamment en matière de prévention des risques de contamination et des erreurs techniques de manipulation. D'autre part, le transfert des cellules adopte les contraintes et règles de bonne pratique approuvées pour les produits transfusables. Aux côtés de ces applications thérapeutiques, les poches de culture cellulaire connaissent également un développement dans le cadre de la culture in vitro de modèles cellulaires ainsi que dans le cadre de la production de métabolites cellulaires, en particulier la production d'anticorps monoclonauxτ

Traditionnellement, les poches de culture cellulaire définissent un compartiment utile dans lequel les cellules sont cultivées. Les films entrant dans la composition de ces poches sont en matériaux polymères perméables aux gaz le plus souvent à base de polymères fluorés (PTFE, FEP), de polyurethane, de poly(éthylène-vinylacétate), de silicone, de poly(méthyl-pentène) ou de polyoléfines tel que le polyéthylène ou le polypropylène. Compte-tenu du caractère hydrophobe et non adhérent des matériaux entrant dans la composition des poches de culture cellulaire, celles-ci s'avèrent particulièrement adaptées à la culture in vitro de cellules en suspension dans un milieu de culture liquide.

Cependant, d'un point de vue pratique, ces containers souples de culture cellulaire sont délicats à manipuler, par exemple, lorsqu'il s'agit de pratiquer l'ensemencement des cultures ou un prélèvement du contenu de la poche. En effet, du fait de la souplesse même de ces containers, l'ouverture d'une voie d'accès implique un maintien en position verticale et il est difficile de les tenir en main sans risquer d'expulser leur contenu sous l'effet d'une pression trop forte exercée sur leur enveloppe externe. Ce problème est d'autant plus important que le volume de conditionnement du container est important. D'autre part, ces poches de culture cellulaire imposent des limites méthodologiques. A l'instar des dispositifs conventionnels de culture cellulaire in vitro tels que boîtes de Pétri ou flacons, ces poches ne permettent qu'un conditionnement stagnant du milieu de culture. Ainsi, l'amplification des cellules entraîne une dégradation au cours du temps des qualités du milieu de culture par épuisement des substances nutritives et accumulation de débris et métabolites toxiques ou potentiellement inhibiteurs. Un tel conditionnement est préjudiciable au maintien de la qualité des cellules cultivées et constitue un facteur hautement limitant à la réalisation de cultures cellulaires à long terme et/ou à forte densité cellulaire. Il faut alors considérer un apport périodique de milieu frais avec ou sans retrait total ou partiel du milieu usagé. Cependant, un reconditionnement périodique du milieu de culture multiplie d'autant les difficultés de manipulation précédemment évoquées, les risques de contamination et d'erreurs techniques de manipulation. Dans tous les cas, la qualité du milieu de culture ne peut être maintenue constante tout au long de la culture cellulaire.

Des poches à plusieurs compartiments utiles ont bien été développées afin de pallier au conditionnement stagnant du milieu de culture. Notamment, différents concepts à deux compartiments définissent un compartiment de culture cellulaire et un compartiment réservoir adjacent de milieu 'de culture. Le compartiment de culture cellulaire est séparé du compartiment réservoir par une membrane semi-perméable. Cette membrane permet des échanges moléculaires par diffusion entre le milieu du compartiment de culture cellulaire et le milieu du compartiment réservoir selon le différentiel de concentration. Par exemple, ces concepts de poches à deux compartiments utiles ont été utilisés dans le cadre de la culture de lymphocytes humains ainsi que dans le cadre de la culture d'hybridomes pour la production d'anticorps monoclonaux. Cependant, les échanges moléculaires par simple diffusion au travers d'une membrane semi-perméable relèvent du phénomène de la dialyse. Passifs, ces échanges s'opèrent avec lenteur et jusqu'à l'équilibre des concentrations moléculaires entre le milieu de culture et le milieu du compartiment réservoir. De ce fait, la qualité du milieu de culture ne peut être maintenue constante. Il demeure toujours une concentration résiduelle de métabolites toxiques ou potentiellement inhibiteurs dans le milieu de culture. D'autre part pour être potentiellement efficace, ce phénomène de diffusion implique que le volume du compartiment réservoir soit très supérieur à celui du compartiment de culture cellulaire. Ainsi, pour un compartiment réservoir de 1000 cm³, la capacité maximum du compartiment de culture cellulaire n'est que de 20 cm³ [Nakamura et al. 1989 J. Immunol. Methods 118: 31-35]. Cette restriction de volume du compartiment de culture cellulaire compromet fortement une exploitation clinique de ces concepts, la thérapie cellulaire impliquant en effet la manipulation et la production d'un grand nombre de cellules.

Dans un premier temps, la présente invention vise à proposer un dispositif du type container souple qui soit plus facile à manipuler que les containers souples de l'art antérieur.

Dans un second temps, la présente invention vise à proposer un dispositif à usage biologique, en particulier pour la culture cellulaire, qui remédie aux limites méthodologiques préalablement invoquées et répond mieux aux besoins de la pratique que les poches de culture cellulaire de l'art antérieur.

Le premier but que s'est fixé la présente invention est parfaitement atteint au moyen d'un dispositif à usage biologique, notamment pour la culture cellulaire, qui comporte au moins une unité élémentaire comprenant- un container, lequel container comprend une enveloppe externe souple biocompatible et au moins une voie d'accès ; de manière caractéristique, selon l'invention, l'unité élémentaire comporte des moyens de rigidification d'au moins une zone périphérique du container. En plus de la rigidification apportée au container souple, ces moyens de rigidification peuvent selon leur forme servir également de moyens de préhension et/ou de support du container.

De préférence, ces moyens de rigidification sont amovibles par rapport au container ce qui permet de les adapter sur des containers souples existants, par exemple, du type poche.

La présente invention concerne également un assemblage de plusieurs unités élémentaires, chaque unité élémentaire comporte de manière caractéristique selon l'invention, des moyens d'accouplement externe, les moyens d'accouplement externe d'une unité élémentaire coopérant avec les moyens d'accouplement externe d'une ou plusieurs autres unités élémentaires pour former l'assemblage. Les avantages apportés par l'utilisation de tels dispositifs seront plus amplement décrits par la suite. Selon l'invention, le mode de réalisation des moyens de rigidification n'est pas limité.

Selon un mode de réalisation particulier, ces moyens de rigidification comprennent un cadre rigide solidaire d'avec au moins un bord périphérique du container. Selon une variante préférée de ce mode de réalisation, le cadre comporte une plaque plane s'étendant sous le container. La présence de cette plaque plane permet de poser le container souple à plat sur un support plan. Par ailleurs, lorsque le container souple est posé à plat, la plaque plane étant en contact avec le support, l'enveloppe externe du container vient se plaquer contre la plaque ce qui permet d'obtenir, dans le cas où le dispositif de l'invention est utilisé pour la culture cellulaire, une surface plane offrant une aire de culture maximale et permettant une répartition homogène des cellules. De préférence, lorsque le dispositif de l'invention est utilisé pour la culture cellulaire, la structure de la plaque est telle qu'elle permet les échanges gazeux entre l'enveloppe externe perméable aux gaz du container et l'air ambiant. Par exemple, la face supérieure de la plaque en regard du container peut être ajourée. La plaque peut également comprendre des perforations. Le dispositif de l'invention peut donc permettre la culture de cellules sans nécessiter l'utilisation d'un dispositif coûteux de mise en circulation de gaz.

Le mode de coopération du cadre et de l'enveloppe externe du container n'est pas limitatif de l'invention. Ainsi, le cadre peut être collé, soudé ou clipsé sur l'enveloppe externe.

Selon l'invention, le cadre peut également comporter des moyens de fixation temporaire du container souple. Ces moyens de fixation temporaire seront plus amplement décrits ultérieurement. Selon un mode de réalisation préféré, le cadre est constitué de deux parties qui coopèrent ensemble et avec au moins une zone périphérique du container.

Selon une variante le dispositif de l'invention comporte également un élément indépendant, le cadre de l'unité élémentaire étant emboîtable sur un cadre compatible de l'élément indépendant. L'élément indépendant peut, par exemple être un agitateur, un microscope ou tout autre appareil d'analyse, d'observation ou d'intervention sur le contenu de l'unité élémentaire. Notamment dans le cas où le cadre n'est pas amovible de l'enveloppe externe du container mais fait partie intégrante de ce dernier, le cadre comporte au moins deux faces internes en regard présentant chacune des cotés courbes et/ou plans, l'enveloppe externe étant solidaire du cadre, notamment au niveau de ces cotés. Ce mode de réalisation permet ' entre autres d'optimiser le volume délimité par l'enveloppe externe.

Selon une variante particulière de réalisation, la ou les voies d'accès sont intégrées dans le cadre, de préférence au niveau des deux faces internes en regard du cadre. Le second but que s'est fixé l'invention est atteint lorsque le dispositif de l'invention tel que précédemment décrit comporte au moins une unité élémentaire qui comporte au moins deux voies d'accès et des moyens de mise en circulation d'un milieu liquide ou gazeux à l'intérieur du container, ce qui s'avère particulièrement intéressant pour la culture de cellules. La mise en circulation peut être réalisée, selon les besoins, en circuit ouvert ou fermé et de manière continue ou discontinue.

Selon une variante, l'unité élémentaire du dispositif de l'invention comporte au moins deux voies d'accès et au moins une membrane interne filtrante séparant ledit container en au moins deux compartiments, chaque compartiment comportant au moins une voie d'accès. Selon l'invention le type de membrane filtrante utilisable n'est pas limité. Il peut s'agir d'une membrane du type film polymère poreux ou d'une membrane du type réseau capillaire ou fibre creuse. Cette membrane peut présenter une surface non adhérente aux cellules ou au contraire permettant la fixation de certaines cellules. Selon une variante de réalisation, le dispositif de l'invention peut comprendre au moins une structure tridimensionnelle apte à promouvoir notamment le développement cellulaire, disposée à l'intérieur du container.

De préférence, pour éviter toute formation d'irrégularités à la surface de la membrane filtrante qui pourrait conduire à une hétérogénéité de répartition des cellules, l'unité élémentaire comprend une armature plane et rigide pour la membrane filtrante. Le dispositif de l'invention peut également comprendre une armature plane et rigide pour la structure tridimensionnelle précédemment citée. Selon une variante particulière, cette armature fait partie intégrante du cadre.

La présente invention concerne également un ensemble d'éléments constituant un prêt-à-monter du dispositif précédemment décrit. La présente invention sera mieux comprise et ses caractéristiques et avantages apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit et fait référence aux dessins annexés représentant un mode de réalisation préféré d'un dispositif permettant la mise en œuvre du procédé de la présente invention présenté à titre d'exemple non limitatif et sur lesquels : - la figure 1 représente un mode de réalisation particulier d'un cadre selon la présente invention qui peut être adapté sur une poche souple ;

- la figure 2 représente un mode de réalisation particulier de deux unités élémentaires différentes du dispositif de l'invention, l'une des unités étant une unité élémentaire perfusable de culture cellulaire, l'autre étant du type réservoir pour milieux liquides ; - la figure 3 représente de manière schématique une vue en coupe selon l'axe lll-lll d'une unité élémentaire du dispositif de l'invention représentée sur la figure 2 et utilisée pour la culture cellulaire avec un flux continu de milieu de culture ; et - la figure 4, représente un assemblage d'unités élémentaires du dispositif de l'invention.

En référence à la figure 1 , le cadre 1 de rigidification de l'invention comprend deux montants parallèles 1 a et 1 b. Chaque montant 1 a et 1 b est constitué de deux parties emboîtables 1 c et 1d faisant office de moyens de fixation de la poche souple P et qui permettent de maintenir pincée cette dernière. La largeur du cadre 1 qui correspond à la largeur obtenue par l'assemblage de la poche P et des deux parties 1 c et 1d de chacun des montants 1 a et 1b est telle qu'elle permet une préhension facile de cet assemblage. Le cadre 1 comporte de plus, dans l'exemple particulier représenté, un fond plat 1e s'étendant entre les deux montants 1 a et 1 b et sur lequel vient s'appuyer l'enveloppe souple de la poche P ce qui permet de maintenir la poche P non écrasée et de former ainsi un volume en son sein. Par ailleurs, le cadre 1 est muni de moyens de fixation temporaires 1f de la poche P. Ces moyens de fixation temporaires 1f permettent de conforter le maintien de la poche déjà réalisé par emboîtement des parties 1 c et 1 d des montants 1 a et 1 b.

- Dans l'exemple représenté, les moyens de fixation temporaires 1f s'étendent du fond 1 e du cadre 1 vers la face supérieure de la partie 1 c de chacun des montants 1 a et 1 b sur laquelle ils viennent s'emboîter. Lorsque le dispositif est utilisé pour la culture cellulaire, le fond 1e possède une structure ajourée en sorte de permettre les échanges gazeux entre l'enveloppe externe perméable aux gaz de la poche P et l'air ambiant. Le fond 1 e peut comporter des ouvertures sur tout ou partie de sa surface. Avantageusement, les extrémités 1g des parties 1 c et 1d de chacun des montants 1 a et 1b forment des surfaces planes ce qui permet éventuellement de disposer verticalement et de manière stable la poche P. Il est également possible, selon l'invention d'équiper le cadre de moyens de stabilisation tels que des pieds ou autres, éventuellement amovibles et permettant le positionnement stable de la poche P dans une configuration donnée, notamment dans un plan horizontal pour l'incubation et dans un plan incliné ou vertical pour sa manipulation.

De même, il est possible d'équiper le cadre 1 de moyens d'accouplement externe aptes à coopérer avec les moyens d'accouplement externes équipant un cadre identique ou par exemple, un appareil de mesure muni éventuellement d'un cadre compatible. Par exemple, il est possible de munir les montants 1 a et 1b du cadre 1 de crochets ou de formes emboîtables en sorte de solidariser plusieurs poches P maintenues par une cadre 1 soit verticalement, les cadres 1 étant empilés les uns sur les autres, soit horizontalement, la solidarisation se faisant alors selon les cotés des montants 1 a et 1 b. Lorsque les cadres sont empilés les uns sur les autres, le cadre ou les moyens d'accouplement externe de celui-ci sont conformés en sorte que les surfaces externes de deux poches P empilées ne soient pas en contact, ce qui permet le passage d'air entre les deux poches P. Le mode de réalisation représenté sur la figure 2 concerne des unités élémentaires A et B dont le cadre de rigidification 1 et l' fait partie intégrante de celles-ci. Selon ce mode de réalisation particulier ici représenté, l'unité élémentaire A qui est perfusable et plus précisément destinée à la culture cellulaire, comprend un cadre de rigidification 1 solidaire d'une membrane filtrante 2. Le cadre de rigidification 1 fait ici office d'armature à la membrane filtrante 2 ce qui permet de tendre cette dernière et d'obtenir une surface parfaitement plane empêchant toute sédimentation des cellules. A la place de la membrane filtrante, il est possible de disposer une structure tridimensionnelle apte à promouvoir notamment le développement cellulaire. L'armature permet dans ce cas de maintenir en place cette structure et/ou de lui conférer une forme appropriée à une utilisation spécifique.

Le cadre de rigidification 1 intègre deux voies d'accès 3a et 3b disposées de part et d'autre de la membrane filtrante 2 selon deux cotés opposés du cadre 1 de préférence, des cotés correspondants à la largeur du cadre 1. Deux portions 4a et 4b d'un film polymère souple biocompatible sont fixées sur les bords du cadre 1 en sorte de définir une poche étanche, faisant office de container, de part et d'autre de la membrane filtrante 2.

La seconde unité élémentaire B du type réservoir de milieux liquides comporte également un cadre rigide l' dont l'ouverture centrale correspond à l'emplacement de la membrane filtrante 2 dans l'unité élémentaire A. Sur chaque face de ce cadre l' est fixée une portion 4a, 4b de film polymère biocompatible. Le cadre 1 ' intègre deux voies d'accès 3'a et 3'b opposées et permettant notamment une circulation traversante de milieux liquides. Le nombre et la disposition des voies d'accès ne sont pas limitatifs de l'invention. Il est également possible, selon l'invention de disposer des voies d'accès directement sur l'enveloppe externe souple du container.

Les cadres 1 et l' de ces deux unités élémentaires A et B intègrent également des moyens de préhension 5 formés par un rebord 5a en forme de T sur chaque bord longitudinal des cadres 1 et l' qui facilite la prise en main des unités élémentaires lors de leur manipulation. Il est ainsi possible de tenir le dispositif de l'invention sans risquer un reflux de liquide lié à une pression exercée sur l'enveloppe externe souple du container. Par ailleurs ce rebord en forme de T permet d'accentuer la rigidité du cadre et peut servir à apposer un signe distinctif.

Les cadres 1 et l' de ces deux unités élémentaires comportent également des moyens d'accouplement externe 6 formés par des rebords transversaux 6a et 6b de forme parallélépipèdique disposés sur des faces opposées du cadre. Ces rebords 6a et 6b font également office de moyens de stabilisation puisqu'ils permettent de par leur forme de poser facilement l'unité élémentaire sur un support plan. Chaque rebord 6a comporte une face supérieure équipée d'une forme femelle, la face inférieure étant équipée d'une forme mâle. Respectivement la face supérieure des rebords 6b comporte une pièce mâle tandis que la face inférieure de ces rebords 6b comporte une pièce femelle. Il est ainsi possible d'emboîter les unités élémentaires A et B les unes sur les autres soit en emboîtant les rebords 6a sur les rebords 6a d'une autre unité élémentaire, soit en emboîtant les rebords 6a dans les rebords 6b d'une autre unité élémentaire. Ces moyens d'accouplement externe permettent l'assemblage des unités élémentaires facilitant ainsi leur manipulation et leur stockage, par exemple dans un incubateur.

Les cadres 1 et l' présentent chacun deux faces internes en regard 7a et 7b qui comprennent les voies d'accès 3a, 3'a et 3b, 3'b et dont les cotés opposés 7c et 7d sont courbes. Les portions 4a, 4b de film biocompatible sont solidaires respectivement des cotés en regard 7c et 7d ainsi que des^' bords longitudinaux correspondant du cadre ; les portions 4a, 4b épousant la forme convexe respectivement des côtés 7c, 7d sont donc bombées ce qui permet de délimiter un volume entre les portions 4a et 4b. La forme convexe de ces cotés 7c et 7d permet également d'éviter le contact éventuel des deux portions de film 4a et 4b. II est également possible de concevoir des faces internes en regard présentant des cotés 7c, 7d opposés plans et/ou courbes ce qui permet de définir un volume délimité par deux faces planes ou par une face bombée et une face plane formées par les portions 4a et 4b. L'utilisation d'une unité élémentaire dont le container présente deux surfaces (correspondant aux portions 4a et 4b) convexes permet une réduction du volume de conditionnement de l'unité élémentaire et une circulation plus homogène du fluide dans le container. L'utilisation d'une unité élémentaire dont le container présente une surface plane s'avère intéressante, notamment pour la culture cellulaire, offrant une aire de culture maximale et permettant une répartition homogène des cellules.

Les rebords transversaux 6 possèdent une hauteur h permettant d'éviter tout contact des films souples biocompatibles 4 lors de l'empilement des unités élémentaires, cette hauteur restant toutefois compatible avec le champ d'observation longue distance d'un microscope optique. Il est également possible selon l'invention d'équiper le cadre de tout élément permettant de maintenir distantes les enveloppes externes les unes des autres lorsque les unités élémentaires sont assemblées.

Les voies d'accès 3a, 3b, 3'a et 3'b disposent de raccords externes de type " Luer Lock ", elles sont compatibles avec les techniques de remplissage, d'échantillonnage et de transfert adoptant les contraintes et règles de bonne pratique approuvées pour les produits transfusables.

La membrane polymère filtrante 2 de l'unité élémentaire perfusable de culture cellulaire A, est constituée dans l'exemple particulier représenté d'un film microporeux à base de polycarbonate, polyoléfines, polymères fluorés ou polyester. Elle présente une porosité précise comprise entre 0,1 μm et 12μm obtenue par bombardement ionique et dissolution chimique (technique du Track-Etched). Une porosité de l'ordre du μm est utilisée notamment pour conditionner une alimentation des cellules par perfusion tout en garantissant le maintien des cellules cultivées au sein du dispositif. Le type et la porosité de la membrane seront choisis en fonction de l'utilisation du dispositif de l'invention.

Les portions 4a et 4b de film polymère souple biocompatible sont perméables aux gaz au moins de type 0₂ et C0₂.et possèdent une épaisseur comprise entre 20 et 500 μm.

La membrane filtrante 2 ainsi que les films 4 sont fixés sur les cadres de rigidification 1 et l' par une soudure à impulsion thermique. Les unités élémentaires sont fabriquées, montées puis stérilisées par rayonnement β. La transparence des films souples biocompatibles 4 et de la membrane polymère filtrante 2 permet une observation microscopique des cellules au sein de l'unité élémentaire de culture cellulaire A. La souplesse de ces matériaux permet de malaxer manuellement la suspension cellulaire lors de son inoculation et de sa récolte pour faciliter respectivement, un ensemencement cellulaire homogène puis le détachement et la récupération des cellules. La surface interne de culture cellulaire définie par la membrane interne filtrante 2 est de l'ordre de 25 cm². Les dimensions des unités élémentaires et par conséquent les volumes de conditionnement sont aisément extrapolables, ce qui confère au dispositif selon l'invention un réel potentiel d'application pour la thérapie cellulaire.

En référence à la figure 3, la membrane filtrante 2 sépare l'intérieur de la poche P en deux compartiments, un premier compartiment D et un second compartiment E. Les cellules C flottent dans le milieu liquide dans le compartiment D ou se déposent à la surface de la membrane filtrante 2. Lorsque des moyens de mise en circulation du milieu liquide équipent le dispositif de l'invention, il est alors possible de réaliser la culture des cellules C avec un flux continu ou intermittent de liquide. La disposition des différents éléments constitutifs de l'unité élémentaire A et en particulier de la membrane filtrante 2 et des voies d'accès 3a et 3b permet d'obtenir un flux traversant la membrane filtrante 2 selon la flèche F1 et traversant également le volume de l'unité élémentaire selon la direction indiquée par la flèche F2, c'est-à-dire tangentiellement à la membrane filtrante 2. Selon une variante non représentée, chacun des compartiments D et E comprend une seconde voie d'accès en regard respectivement de la voie d'accès 3a ou 3b. Ces voies d'accès supplémentaires sont intégrées au cadre 1 ou disposées sur l'enveloppe externe du container. La présence de ces voies d'accès en regard permet d'éviter toute surpression à l'intérieur du container. En effet, les cellules ont tendance, du fait de leur prolifération à colmater la membrane filtrante provoquant ainsi une accumulation de milieu dans le compartiment contenant les cellules. La présence d'une voie d'accès en regard de celle permettant l'approvisionnement en milieu fait office de soupape de sécurité. La présence d'une voie d'accès en regard de la voie d'accès permettant l'évacuation du liquide permet, en cas de colmatage de la membrane d'éviter la stagnation du milieu liquide dans le compartiment E et d'alimenter les cellules de part et d'autre de la membrane filtrante.

De préférence, la membrane filtrante 2 et les portions 4a et 4b sont constituées d'un matériau qui peut être facilement découpé avec, par exemple, un scalpel, ce qui facilite grandement le prélèvement des cellules.

En référence à la figure 4, l'unité élémentaire perfusable de culture cellulaire A est montée en série avec l'unité élémentaire du type réservoir de milieux liquides B. L'unité élémentaire A est utilisée pour réaliser une culture cellulaire in vitro sous perfusion tandis que l'unité élémentaire B constitue un simple réservoir d'alimentation de milieux de culture cellulaire. L'assemblage de ces deux unités élémentaires A et B comprend des moyens de montage en série sous la forme de tuyaux 8 en matériau biocompatible. L'assemblage de deux unités élémentaires A et B comprend en outre des moyens de distribution et de commutation sous la forme de robinets manuels à trois voies 9. Pour chaque robinet manuel à trois voies 9, une voie est raccordée directement à l'unité élémentaire A ou B, une seconde voie est utilisée pour raccorder les deux unités élémentaires A et B entre elles par l'intermédiaire des tuyaux 8, la troisième voie est disponible pour procéder à de multiples interventions sur l'une ou l'autre desdites unités élémentaires A et B. Cette troisième voie disponible peut être munie d'un bouchon, d'un filtre ou d'un système d'injection autoscellant, elle peut être connectée notamment à tout type de moyen permettant la réalisation notamment d'étapes stériles de remplissage, d'injection, d'échantillonnage ou de récupération des milieux et/ou cellules. L'assemblage de ces deux unités élémentaires A et B comprend en outre des moyens de mise en circulation en boucle (circuit fermé) des milieux liquides comprenant un raccord de pompe péristaltique 10. Les tuyaux 8, les robinets trois voies 9 ainsi que les raccords " Luer Lock " sont des produits connus et commercialisés.

Lorsque les unités élémentaires A et B sont assemblées via leurs moyens d'accouplement externes 6a et 6b, le dispositif présente des dimensions externes de l'ordre de 75 mm pour la largeur, 200 mm pour la longueur (hors tuyaux 8) et 35 mm pour la hauteur.

L'utilisation du dispositif selon l'invention, notamment pour la culture cellulaire, ne nécessite pas de systèmes complexes et coûteux de régulation de température et d'apport des gaz. Au contraire, le dispositif de l'invention ne nécessite que l'utilisation d'incubateurs conventionnels de culture cellulaire. Les contrôles de la température et des gaz sont réalisés par l'incubateur, les échanges gazeux avec la culture cellulaire s'effectuant directement au travers des enveloppes externes des unités élémentaires perméables aux gaz. Le dispositif de l'invention est donc d'une utilisation aussi aisée que celle d'une boîte de Pétri et offre de plus des possibilités méthodologiques très supérieures et comparables à celles offertes par des bioréacteurs ou dispositifs de culture cellulaire plus complexes, coûteux^' et compliqués à mettre en œuvre.

Selon une variante non illustrée, le dispositif tel que représenté sur la figure 4 comprend en outre au moins une seconde unité élémentaire du type réservoir de milieux liquides B montée en série ; la mise en série de plusieurs unités réservoirs augmente d'autant la capacité d'alimentation en milieu de l'unité élémentaire perfusable de culture cellulaire A.

Selon une autre variante non illustrée, le dispositif tel que représenté sur la figure 4 comprend au moins deux unité élémentaires du type réservoir de milieux liquides B montées en parallèle ; la mise en parallèle de plusieurs unités réservoirs permet d'alimenter l'unité élémentaire perfusable de culture cellulaire A en milieu de culture suivant un protocole d'ouverture successive de chacune desdites unités réservoirs B. Le manipulateur peut ainsi promouvoir une expansion cellulaire par étapes successives dans différents milieux de culture préalablement conditionnés dans les unités réservoirs B. Selon une autre variante non illustrée, le dispositif tel que représenté sur la figure 4 ne comprend que des unités élémentaires perfusables de culture cellulaire A. Un tel dispositif permet alors de mettre en œuvre des cocultures dynamiques aptes à conditionner la circulation d'un même milieu de culture d'une population de cellules à une autre.

L'assemblage des unités élémentaires du dispositif de l'invention grâce aux moyens d'accouplement notamment des cadres de rigidification permet de réduire l'encombrement et de faciliter notamment la manipulation, l'incubation et la mise sous agitation du dispositif de l'invention. La possibilité de dissocier les unités élémentaires facilite alors toutes les manipulations et observations pratiquées sur chacune d'elles, notamment l'observation des développements cellulaires dans les unités perfusables de culture cellulaire A.

Le dispositif de l'invention peut être compatible avec d'autres systèmes clos d'exploitation. A titre d'exemple, il peut être envisagé de connecter le dispositif avec au moins un système clos de préparation des cellules, les cellules étant ainsi directement ensemencées en conditions stériles. De même, le dispositif peut en outre être relié à au moins un système clos de lavage, d'échantillonnage, de récupération, de repiquage ou d'exploitation des cellules après culture. La notion de systèmes clos peut également être exploitée dans le cadre de la préparation de " kits " complets de culture cellulaire dans lesquels les milieux de culture cellulaire voire les cellules elles-mêmes sont directement conditionnés au sein du dispositif de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS

1/ Dispositif à usage biologique, notamment pour la culture cellulaire qui comporte au moins une unité élémentaire comprenant un container, lequel container comprend une enveloppe externe souple biocompatible et au moins une voie d'accès, caractérisé en ce que ladite unité élémentaire comporte des moyens de rigidification d'au moins une zone périphérique dudit container. 2/ Dispositif selon la revendication 1 , caractérisé en ce que lesdits moyens de rigidification sont amovibles par rapport audit container.

3/ Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend un assemblage de plusieurs unités élémentaires et en ce que chaque unité élémentaire comporte en outre des moyens d'accouplement externe, les moyens d'accouplement externe d'une unité élémentaire coopérant avec les^' moyens d'accouplement externe d'une ou plusieurs autres unités élémentaires pour former ledit assemblage. 4/ Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que dans ledit assemblage lesdits moyens d'accouplement externe sont conformés en sorte que - les enveloppes externes respectives desdites unités élémentaires assemblées sont distantes les unes des autres.

5/ Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite unité élémentaire comporte en outre des moyens de stabilisation.

6/ Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdits moyens de rigidification comprennent un cadre rigide solidaire d'avec au moins un bord périphérique dudit container.

7/ Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit cadre comporte une plaque plane s'étendant sous ledit container.

8/ Dispositif selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que ledit cadre comporte en outre des moyens de fixation temporaire dudit container. 9/ Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le cadre est constitué de deux parties qui coopèrent ensemble et avec au moins une zone périphérique dudit container. 10/ Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte un élément indépendant et en ce que ledit cadre est emboîtable sur un cadre compatible dudit élément indépendant.

11/ Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que^" ladite enveloppe externe est solidaire dudit cadre et en ce que ledit cadre comporte au moins deux faces internes en regard présentant chacune des côtés courbes et/ou plans, ladite enveloppe externe étant solidaire du cadre notamment au niveau desdits côtés. 12/ Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 11 , caractérisé en ce que la ou lesdites voies d'accès est ou sont intégrées dans ledit cadre, de préférence au niveaux de deux faces internes en regard dudit cadre.

13/ Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ladite unité élémentaire comporte au moins deux voies d'accès et en ce qu'il comporte en outre des moyens de mise en circulation d'un milieu liquide ou gazeux à l'intérieur dudit container.

14/ Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite unité élémentaire comporte au moins une membrane interne filtrante séparant ledit container en au moins deux compartiments, chaque compartiment comportant au moins une voie d'accès. 15/ Dispositif selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une structure tridimensionnelle apte à promouvoir notamment le développement cellulaire et disposée à l'intérieur du container. 16/ Dispositif selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que l'unité élémentaire comprend au moins une armature plane et rigide pour au moins une desdites membranes internes filtrantes et/ou pour au moins une desdites structures tridimensionnelles

17/ Dispositif selon la revendication 16 et l'une quelconque des revendications 6 à 12, caractérisé en ce que ladite armature fait partie intégrante dudit cadre. 18/ Cadre de rigidification pour un dispositif à usage biologique notamment pour la culture cellulaire, selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de fixation sur une zone périphérique dudit container.

19/ Ensemble d'éléments constituant un prêt-à-monter (kit) pour la constitution du dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à

17, caractérisé en ce qu'il comprend :

- un ou plusieurs éléments aptes à constituer un container, lequel comprend une enveloppe externe souple biocompatible et au moins une voie d'accès ; et - des moyens de rigidification d'au moins une zone périphérique dudit container.

20/ Ensemble d'éléments selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une portion de film polymère biocompatible apte à former un container et en ce que lesdits moyens de rigidification comprennent un cadre de rigidification, ladite voie d'accès étant disposée sur ladite portion de polymère et/ou sur ledit cadre de rigidification.