JP7265243B2 - セルカルチャーインサート - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞の培養等に用いられるセルカルチャーインサートに関する。

動物細胞は、血球細胞のように本来の存在場所が液体であるもの以外は固相上でなければ増殖しないので、動物細胞を増殖させる際には、固相培養が行われる。固相培養に用いられる固相としては、古くから用いられているシャーレやフラスコの他、細胞培養プレートも多用されている。細胞培養プレートは、ポリスチレン等のプラスチック製の基板内に複数（市販品では６個、１２個、２４個、９６個等）のウェル（穴）を設けたものであり、この各ウェルの底面を固相として動物細胞が培養される。各ウェルには培養液が入れられ、細胞は、この培養液内で培養される。セルカルチャーインサート（cell culture insert、直訳は細胞培養挿入物）は、このウェル内に挿入されて使用されるものである。

従来のセルカルチャーインサートの模式断面図を図１に示す。図１中、参照番号１０がウェル、１２が細胞培養プレートの上面である。図１に示されるように、ウェル１０の上部は、プレート上面１２よりも上方向に突出して外壁１０ａを形成している。セルカルチャーインサート１４は、容器状本体１４ａと、該容器状本体１４ａの上端部に設けられたフランジ１６とを具備し、このフランジ１６を、外壁１０ａの頂部に載置することにより、セルカルチャーインサート１４がウェル１０内に懸架される。図１中、参照番号１８が細胞培養液であり、セルカルチャーインサート１４の下部は、細胞培養液中に位置する。セルカルチャーインサート１４の底面は、フィルターで構成され、細胞は、このフィルターを固相として、培養液１８中で固相培養される。幹細胞を含む細胞集団（幹細胞と分化した体細胞の混合物）をこのフィルター上で下層に特別な生理活性を有する液性因子もしくは共培養用細胞を入れておくことで、フィルター下面から供給される液性因子によって、in vivoに近い環境での細胞培養が行える。

従来のセルカルチャーインサート１４では、セルカルチャーインサート１４がウェル外壁１０ａの頂部に確実に懸架されるように、フランジ１６の幅ｄは外壁１０ａの頂部の幅よりも十分に大きい。このため、フランジ１６の外縁部は、外壁１０ａの外縁よりも外側に突出しており、すなわち、フランジ１６の外縁部は空中にある。

WO2014/142038

セルカルチャーインサートをウェルに挿入する際には、セルカルチャーインサートをピンセットでつまんでウェルに挿入する。また、培養液に新たな添加物を加える場合等には、マイクロピペットで各ウェル内に液を添加する。このように、セルカルチャーインサートを用いる場合には、ピンセットやマイクロピペット等の器具が多用される。一方、上記のとおり、一枚の細胞培養プレートには多数のウェルがあり、従来のセルカルチャーインサートでは、幅広のフランジの外縁部が空中に突出している。本願発明者らは、ピンセット等を用いた操作中に、ピンセット等の先端部が、他のウェルにすでに挿入されたセルカルチャーインサートの、空中に突出しているフランジ外縁部に当たり、そのセルカルチャーインサートが斜めになったり、大きな振動を受けたりすることがかなりの頻度で起きているという問題があることに気づいた。セルカルチャーインサートが斜めになったり、大きな振動を受けると、セルカルチャーインサートの底部で培養されている細胞に偏りが生じる、場合によっては培養液がはねることで汚染が起こる等の問題が起き、好ましくない。また、複数の細胞を用いた実験を行う際、水準の区別をマーキングするには、セルカルチャーインサートを入れる細胞培養プレートの蓋部に記載することなどが行われてきたが、ピンセット等が空中に突出しているフランジ外縁部に当たり、位置ずれを起こしたりして区別が難しい状況が生まれやすかった。

本発明の目的は、このような、操作中の、意図しないセルカルチャーインサートとの接触を防止し、水準の取り違えなどを防止して、細胞培養を安定的に行うことができる新規なセルカルチャーインサートを提供することである。

上記した意図しない接触は、上記フランジ１６の幅を狭くして、フランジ１６の外縁部が、ウェル外壁１０ａの頂部から外側に向かって突出しないようにすれば防止できると考えた。しかしながら、単にフランジ１６の幅を小さくしたのでは、フランジ１６をその全周に渡って外壁１０ａの頂部に載置する操作が難しくなり、非現実的である。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、セルカルチャーインサートの容器状本体の上端部と、フランジとを複数のアームで連結すると共に、この各アームの一部分をウェルの内壁に当接させることにより、セルカルチャーインサートをウェルの中心部に来るように自動的に位置決めできることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下のものを提供する。

(1) 基板内に複数の細胞培養ウェルが設けられ、各ウェルの周縁部には、各ウェルを囲包し、前記基板の表面から突出する外壁が設けられている細胞培養プレートの前記ウェルに挿入して用いられるセルカルチャーインサートであって、
容器状本体と、
該容器状本体の底部に配置され、その表面上で細胞を培養する、複数の開孔を有するフィルターと、
前記容器状本体の上部から上方向に延びる複数の位置決めアームであって、各位置決めアームの少なくとも一部分が前記ウェルの内壁と実質的に当接する、複数の位置決めアームと、
該複数の位置決めアームの上端部に設けられたフランジであって、その外径が前記外壁の外径よりも小さく、前記外壁の内径よりも大きい、フランジと
を具備し、
前記複数の位置決めアームと前記ウェルの内壁との当接により、前記フランジが前記外壁の上端部上に支持され、前記複数の位置決めアームの上部が鉛直方向に延びており、この鉛直部分が前記ウェルの内壁と実質的に当接する、セルカルチャーインサート。
(2) 前記複数の位置決めアームの下部が、前記ウェルの内側方向に向かって斜め下方向に延び、その下端部に前記容器状本体が設けられている (1)記載のセルカルチャーインサート。
(3) 前記位置決めアームの数が３本～６本である(1)又は(2)記載のセルカルチャーインサート。
(4) 前記フランジの外縁の一部分から水平方向に突出する耳部が設けられている、(1)～(3)のいずれか１項に記載のセルカルチャーインサート。
(5) 前記耳部の表面が、粗面加工されている(4)記載のセルカルチャーインサート。
(6) 前記フィルターの開孔が、規則的に配置されている(1)～(5)のいずれか１項に記載のセルカルチャーインサート。
(7) 前記フィルターの開口率が、１８％～２２％である、(1)～(6)のいずれか１項に記載のセルカルチャーインサート。
(8) 前記フィルターの下面に、ビニルピロリドン系ポリマー、ポリエチレングリコール系ポリマー、およびビニルアルコール系ポリマーから選択される１以上の親水性ポリマーを付着させた、(1)～(7)のいずれか１項に記載のセルカルチャーインサート。

本発明では、フランジの外縁部がウェル外壁の外縁よりも外側に突出しておらず、すなわち、フランジの外縁部が空中に突出していないので、操作中の意図しないフランジとの接触が防止され、細胞培養を安定的に実施することが可能となる。

従来のセルカルチャーインサートの模式断面図である。 本発明のセルカルチャーインサートの一実施形態の斜視図である。 図２に示すセルカルチャーインサートを上下逆さまに置いて底部を上にした際の斜視図の斜視図である。 図２に示すセルカルチャーインサートを縦に二分割した斜視図である。 図２に示すセルカルチャーインサートを、細胞培養プレートのウェル内に懸架した状態を示す斜視図である。 図５の右上部分の拡大図である。 フィルター上で増殖した細胞の密度を測定するための電気抵抗値の測定方法を説明する図である。

以下、本発明の好ましい実施形態を図面に基づき説明する。なお、本明細書及び特許請求の範囲において、「上」、「下」、「上下」、「鉛直」、「水平」、「横」、「縦」、「斜め」、「傾斜」等の語は、細胞培養プレートを水平な机の上に置き、そのウェルにセルカルチャーインサートを挿入して設置した際の方向、すなわち、セルカルチャーインサートの使用時における方向を意味する。

図２は、本発明のセルカルチャーインサートの好ましい一実施形態の斜視図、図３は同セルカルチャーインサートを上下逆さまに置いて底部を上にした際の斜視図、図４は同セルカルチャーインサートを縦に二分割した斜視図、図５は、同セルカルチャーインサートを、細胞培養プレートのウェル内に懸架した状態を示す斜視図である。

図２～図４に示すように、本実施形態のセルカルチャーインサート２０は、円筒状の容器状本体２２と、該容器状本体２２の上端部から上方に延びる３本の位置決めアーム２４と、該３本の位置決めアーム２４の上端部に設けられたフランジ２６を具備する。３本の位置決めアーム２４は、容器状本体２２の上端部に等間隔に配置されている。各位置決めアーム２４は、その上部が鉛直方向に延びて鉛直部２４ａを構成し、該鉛直部２４ａの上端部にフランジ２６が設けられている。位置決めアーム２４は、鉛直部２４ａと、鉛直部２４ａの下端部から容器状本体２２の中心方向、すなわち、ウェル１０（図５参照）の中心方向に向かって斜め下方向に延びる傾斜部２４ｂとから成る。なお、本実施形態では位置決めアーム２４の数は３本であるが、３本に限定されるものではなく、もっと多くてもよい。３本～６本が好ましく、３本あれば十分であるので３本が最も好ましい。フランジ２６の一部分には、水平方向に突出する耳部２６ａが設けられている。耳部２６ａの基部の幅は、特に限定されないが、フランジ２６の外周長さの５％～１５％程度、好ましくは８％～１２％程度である。耳部２６ａの表面を祖面化しておくと、耳部に筆記具で文字やマークを書くことができるので便利である。容器状本体２２の底部は、フィルター３０によって構成される（図３、図４参照）。フィルター３０は、図４によく示されるように、容器状本体２２の下端部を肉薄にし、この肉薄部に丁度嵌まる寸法のアッパーリング３２をはめ込み、この肉薄部とアッパーリング３２の内面との間にフィルター３０の周縁部を挟み込むことにより容器状本体２２の底部に固定されている。アッパーリング３２をはめ込んだ状態で、容器状本体２２の下部に段差が生じないようにアッパーリング３２の厚さが設定されている。なお、フィルター３０は、熱圧着等により容器状本体の下端部に結合することもできる。

セルカルチャーインサートをウェル１０に懸架した状態を図５に示す。細胞培養プレートは、市販品を好ましく利用できるので、図５に示すウェル１０自体は図１に示す従来技術の場合と同じである。図５に示すように、フランジ２６をウェル外壁１０ａの頂部に載置することにより、セルカルチャーインサートがウェル１０内に懸架される。本発明においては、フランジ２６は、その外径が外壁１０ａの外径よりも小さく、外壁１０ａの内径よりも大きいので、フランジ２６の外縁全周を、外壁１０ａの頂部上に載置することができる。また、このため、フランジ２６の外縁部は、外壁１０ａの外縁部から突出することがない。この様子を図６に示す。図６は、図５の右上部分の拡大図である。図６によく示されるように、フランジ２６の外縁は、外壁１０ａの頂部の外縁よりも内側に位置し、外側（図６の右側）には全く突出していない。このように、フランジ２６の外縁が、外壁１０ａの頂部上に位置し、外壁１０ａの頂部の外縁よりも外側に全く突出していないことが、本願発明における重要な特徴の１つである。この特徴により、操作時にピンセット等がフランジに当たってセルカルチャーインサートが傾いたり大きく振動したりすることが防止される。

また、図５に示されるように、各位置決めアームの鉛直部２４ａは、ウェル１０の内壁に実質的に当接する。ここで、「実質的に当接する」とは、当接するか、又は、ウェル内壁との間に僅かな隙間が存在するが、その隙間の大きさが、セルカルチャーインサートをウェル１０内に懸架した状態で、水平方向にどのように動かしてもフランジ２６の外縁が、外壁１０ａの外壁から突出することがない程度に小さいことを意味する。３本の位置決めアームの鉛直部１０ａが同時にウェル１０の内壁に当接するのが理想的ではあるが、これは設計精度の点から容易ではないので、通常、各位置決めアーム２４の鉛直部２４ａとウェル１０内壁との間には僅かな隙間がある。この隙間の大きさは、セルカルチャーインサートがウェル１０の丁度中央に来るように懸架した状態で、通常、0.1mm～0.5mm程度、好ましくは0.2mm～0.4mm程度である。

セルカルチャーインサート２０をウェル１０内に挿入する際には、ピンセット等で耳部２６ａをつかんでウェル１０内に挿入する。この際、どこにも触れることなくセルカルチャーインサート２０をウェル１０内に挿入できる場合もあるが、これはいつも必ずできるというものではなく、多少ずれた位置でセルカルチャーインサート２０を挿入しようとしてしまう場合も少なくない。本実施形態のセルカルチャーインサート２０では、位置決めアーム２４に傾斜部２４ｂが存在するので、傾斜部２４ｂが、ウェル外壁１０ａの内縁に当たった場合でも、傾斜部２４ｂが斜めに形成されているので、セルカルチャーインサート２０がウェル１０の中央方向にスムースに誘導され、ウェル１０のほぼ中央に挿入される。ここで、３本の位置決めアーム２４の鉛直部２４ａが、それぞれ実質的にウェル１０内壁に当接するので、セルカルチャーインサート２０は、自動的に、ウェル１０のほぼ中央に挿入される。したがって、セルカルチャーインサート２０をウェル１０内に挿入する操作が非常に容易となり、かつ、確実にウェル１０のほぼ中央に挿入される。

本発明では、細胞培養プレートは市販品を利用できるので、セルカルチャーインサートの寸法は、市販の細胞培養プレートのウェルのサイズに応じて適切に設定される。典型的な市販品の１例では、ウェル１０の内径（外壁１０ａの内径も同じ）が22.77mm、ウェル１０の外径（外壁１０ａの外径も同じ）が24.3mm、深さが16.5mm、である。このウェルに対応するセルカルチャーインサートとしては、例えば、フランジ２６の直径が23.6mm、容器状本体２２の内径が10mm、同外径が12mm、同高さが10mm、フィルター３０とウェル１０底面との距離が1.4～2.2mm程度である。また、例えば、位置決めアーム２４の鉛直部２４ａの長さは3mm、位置決めアーム２４の幅は4mmとすることができる。もちろん、これらの寸法は一例であり、本発明の要件を満足する範囲内で適宜設定可能である。また、本発明のセルカルチャーインサートは、従来と同様、ポリスチレンやポリカーボネート等のプラスチックで周知の成型方法により成型して製造することができる。

フィルター３０としては、従来からセルカルチャーインサートに用いられているポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートやオレフィン系のポリマーなどから成膜された、細胞分離膜等のフィルターを用いることができる。フィルター３０には、下層の液性因子等が通過可能な貫通孔が多数設けられており、厚さは通常、５μm～４０μm程度である。なお、この貫通孔のサイズとして、幹細胞が通過可能なサイズ（通常、直径３μｍ～８μｍ程度）を採用することにより、遊走能を持つ幹細胞の分離をも行うことが可能になる。すなわち、遊走因子の存在下で固相培養すると、遊走能を有する幹細胞のみがフィルター内の開孔を通過することで、遊走活性を解析することが出来る。しかしながら、従来のセルカルチャーインサートでは、開孔を通過した細胞がフィルター下面に接着してしまい、ウェル１０の底面に落ちることはほとんどなかった。このため、従来のものは、細胞を分離して培養するといったウェル１０の底面を固相とする固相培養は実用的には実現されていなかった。遊走能を有する幹細胞の分離を行う場合には、フィルターの下面に細胞の付着を抑制する親水性ポリマーによる表面処理が施されていることが好ましい。親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン等のビニルピロリドン系ポリマー、ポリエチレングリコール等のポリエチレングリコール系ポリマー、およびポリビニルアルコール等のビニルアルコール系ポリマーを挙げることができる。これらの親水性ポリマーの分子量としては、特に限定されないが、重量平均分子量として通常、3000～1000000程度、好ましくは、6000～200000程度のものが用いられる。さらにそれぞれのポリマーにカルボキシル基、エステルなどがグラフトしたものも、好適に用いられる。フィルター下面の親水性ポリマーの付着量としては、フィルターの総重量に対して０．３％以上１．５％未満が好ましい。なお、親水性ポリマーは、フィルターの下面だけではなく、上面にも施すことも可能である。表面付着量はＸ線光電子分光法(ESCA)による公知の方法（WO2009/123088）により測定することができる。

従来から用いられているフィルターの開孔率（フィルターの面積に対する開孔部の面積の比率）は、５％程度であり、本発明のセルカルチャーインサートにおいてもこのような従来のフィルターを用いることが可能である。一方、本願出願人は、開孔率が２０％の細胞分離膜を開発した（文献：WOA12014171365、JPA_2017030357）。従来の細胞分離膜では、開孔の位置がランダムであり、貫通孔も必ずしも鉛直方向に延びていないのに対し、この新たな細胞分離膜では、開孔が整然と碁盤の目のように整列しており、かつ、貫通孔がまっすぐ鉛直方向に延びていて、孔はほぼ正円である。もっとも、細胞の通過の妨げにならないのであれば、多角形形状でも問題ない。孔の並び方については、規則的であることが好ましく、格子、千鳥、渦巻き、同心円状などが例示される。本発明のセルカルチャーインサートのフィルターとして、この新たな細胞分離膜を用いることが好ましい。

この開孔率２０％膜（ポリエチレン製。フィルター下面に酢酸ビニルとビニルピロリドンの共重合体である親水性ポリマー処理有り（ポリマー名：コリドンVA64(BASF社製）、親水性ポリマーの付着量０．３％）と、従来の開孔率５％膜（ポリカーボネート製。親水性ポリマー処理あり、親水性ポリマーの付着量０．７％）を用いて幹細胞の分取を行った実験結果を以下に示す。100μＬの培地中に2.0 x 10⁴個の細胞を含む培養物を２４時間又は４８時間培養し、開孔を通過してウェルの底面に移動した幹細胞の数を測定した。用いた培地は、100ng/mL G-CSF10%血清/DMEMであった。また、各実験に用いた個体数は３であった。結果を下記表１に示す。

さらに、従来の開口率５％膜（ポリカーボネート製。親水性ポリマー処理なし）を用いて幹細胞の分取を上記と同じヒト歯髄幹細胞を用いて実験を行った。結果は、開孔を通過してウェルの底面に移動した幹細胞数の平均は15.6であった。

表１及び上記結果に示すように、いずれの場合も、開孔率２０％膜の方が、分取された幹細胞数が遙かに多い。このことから、開孔率は１８％～２２％程度が好ましく、特に２０％が好ましいことがわかる。また、親水性ポリマー処理は、格段に分取された幹細胞の数を増やすことに効果があることがわかる。

また、フィルター上で増殖した細胞の密度は、図７に示すように、ウェル底面上と、フィルターの上方に電極を配置して電圧をかけ、電極間の抵抗値(細胞間のタイトジャンクションの形成による）を測定することにより測定することができる。この場合、従来の開孔率５％膜では、開孔の位置がランダムであるので、抵抗測定値の再現性が低いのに対し、開孔率２０％膜では、規則正しく開孔が整列しているので、再現性が高い。また、開孔率２０％膜では、規則正しく開孔が整列しており、かつ、各開孔が鉛直方向に延びているので、培養細胞に対して培養液中の栄養素や遊走因子が均一に付与されるという利点もある。

従来型のセルカルチャーインサートを用いた場合、指やピンセット等が接触することで容易にセルカルチャーインサートがガタつくため、電極間抵抗値の測定などで大きな値の変動を与え、実験を失敗することがあった。本発明のセルカルチャーインサートでは、セルカルチャーインサートのガタつきを生じさせることが少ない為、安定した測定を行いやすい。

１０ ウェル
１２ 細胞培養プレートの上面
１４ 従来のセルカルチャーインサート
１６ 従来のセルカルチャーインサートのフランジ
１８ 細胞培養液
２０ 本発明の実施形態のセルカルチャーインサート
２２ 容器状本体
２４ 位置決めアーム
２４ａ 位置決めアームの鉛直部
２４ｂ 位置決めアームの傾斜部
２６ フランジ
２６ａ 耳部
３０ フィルター
３２ アッパーリング

Claims (8)

1. 基板内に複数の細胞培養ウェルが設けられ、各ウェルの周縁部には、各ウェルを囲包し、前記基板の表面から突出する外壁が設けられている細胞培養プレートの前記ウェルに挿入して用いられるセルカルチャーインサートであって、
   容器状本体と、
   該容器状本体の底部に配置され、その表面上で細胞を培養する、開孔を有するフィルターと、
   前記容器状本体の上部から上方向に延びる複数の位置決めアームであって、各位置決めアームの少なくとも一部分が前記ウェルの内壁と実質的に当接する、複数の位置決めアームと、
   該複数の位置決めアームの上端部に設けられたフランジであって、その外径が前記外壁の外径よりも小さく、前記外壁の内径よりも大きい、フランジと
   を具備し、
   前記複数の位置決めアームと前記ウェルの内壁との当接により、前記フランジが前記外壁の上端部上に支持され、前記複数の位置決めアームの上部が鉛直方向に延びており、この鉛直部分が前記ウェルの内壁と実質的に当接する、セルカルチャーインサート。
2. 前記複数の位置決めアームの下部が、前記ウェルの内側方向に向かって斜め下方向に延び、その下端部に前記容器状本体が設けられている請求項１記載のセルカルチャーインサート。
3. 前記位置決めアームの数が３本～６本である請求項１又は２記載のセルカルチャーインサート。
4. 前記フランジの外縁の一部分から水平方向に突出する耳部が設けられている、請求項１～３のいずれか１項に記載のセルカルチャーインサート。
5. 前記耳部の表面が、粗面加工されている請求項４記載のセルカルチャーインサート。
6. 前記フィルターの開孔が、規則的に配置されている請求項１～５のいずれか１項に記載のセルカルチャーインサート。
7. 前記フィルターの開孔率が、１８％～２２％である、請求項１～６のいずれか１項に記載のセルカルチャーインサート。
8. 前記フィルターの下面に、ビニルピロリドン系ポリマー、ポリエチレングリコール系ポリマー、およびビニルアルコール系ポリマーから選択される１以上の親水性ポリマーを付着させた、請求項1～７のいずれか１項に記載のセルカルチャーインサート。

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