JP2018068165A - 細胞の表面処理方法及びその装置、並びに被覆細胞の製造方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

【課題】被覆細胞の製造のような細胞の表面処理において、細胞へのダメージを低減し、細胞の回収率を向上し、かつ表面処理品質を向上する。
【解決手段】
被覆細胞製造装置１は、内部で細胞の表面への被膜形成が実行される処理内槽３３を備える。処理内槽３３の一部は液透過性膜３７で構成されている。処理内槽３３は、処理外槽３４に配置される。処理内槽３３と処理外槽３４との間には、貯液空間４２が形成される。貯液空間４２には、液搬送部５によって処理液が供給される。貯液空間４２に貯液された処理液は、水頭圧によって、液透過性膜３７を介して処理内槽３３内に逆流する。
【選択図】図４

Description

本発明は、細胞の表面処理方法及びその装置、並びに被覆細胞の製造方法及びその装置に関する。

近年、新たな医療分野として再生・細胞医療が注目されており、骨、軟骨、皮膚等の比較的単純な構造を持つ組織については、実用化され臨床応用の段階にまで進んでいる。しかしながら、心臓、腎臓、肝臓等の複雑な三次元構造を有し、多種細胞により組織化されている組織は、細胞を培養することのみで組織化することが困難であり、実用化には至っていない。

生体外で細胞を取り扱う場合、プラスチックディッシュやガラスシャーレ等の培養容器を用い、二次元的に細胞培養を行う方法が一般的である。一般的な接着性細胞である場合、細胞は培養容器に播種された後、培養容器へ接着し、その後に伸展していく事で扁平な形状を示す。そして、その培養容器に細胞が接着していないスペースがある場合、細胞は成長や増殖等により、それらスペースを埋めるように二次元的に拡がっていく。しかしながら、我々生体は三次元体であり、三次元的に細胞培養を行う方法が望まれてきた。そこで近年、細胞を三次元的に取り扱う研究が進み、いくつかの三次元培養方法が報告され始めた。

代表的な手法としては、二次元で培養したシート状の細胞を重ね合わせて三次元化する方法がある（特許文献１〜３）。しかしながら、この方法では、単層の細胞シートを作製した後に重ね合わせて三次元化させていくため、厚みのある三次元組織の作製には多大な時間が必要であり現実的では無い。

一方、特許文献４には、細胞層を形成する工程と、細胞層を第１物質含有液と第２物質含有液とに交互に接触させる工程とを繰り返し行い、ナノメートルサイズの厚みの接着膜（細胞外マトリックス（EMC）等）を介して連続的に細胞層を積層する技術が開示されている。これにより、単層の細胞シートの剥離や、剥離した細胞シートの重ね合わせ等が不要であるため、優れた再現性及び効率で、極めて簡便に三次元組織を作製できるとされている。しかしながら、この技術は、細胞を一層ずつ培養して三次元構造体を作製するものであるため、厚みのある組織の作製には長時間を必要とする。

特許文献５には、細胞表面を第１物質からなる接着膜及び第２物質からなる接着膜で交互に被覆し、得られた被覆細胞を基材上で培養することによって、細胞の三次元組織をより短時間で簡便に作製する方法が開示されている。しかしながら、この方法では、細胞表面に接着膜を被覆する際に、第１物質もしくは第２物質を含有する処理液に細胞浸漬した後、遠心分離を用いて細胞と処理液とを遊離するため、被覆形成時に細胞へのダメージが問題となる。また、遊離した処理液をピペット等により除去する際に液と共に細胞が取り除かれるため、細胞の回収率が低下する問題がある。

特許文献６には、液透過性膜および揺動を用いることによって処理液と細胞とを分離する方法が開示されている。この方法によれば、遠心分離を用いる際と比較して細胞に与えるダメージないしストレスを低減することができ、処理液を除去する際のピペッティングが無いため回収率が改善すると記載されている。しかしながら、液透過性膜に細胞が付着もしくは膜孔に詰まるため、回収率と表面処理品質が低下しやすいという問題がある。

特開２００４−２６１５３２ 特開２００４−２６１５３３ 特開２００５−６０８ 特許第４９１９４６４号 特開２０１２−１１５２５４号 国際公開ＷＯ／２０１６／０２７８５３号

本発明は、細胞へのダメージが少なく、細胞の回収率が高く、かつ表面処理品質の高い細胞の表面処理方法及びその装置、並びに被覆細胞の製造方法及びその装置を提供することを目的とする。

本発明の一態様は、細胞の表面処理方法であって、少なくとも一部が液透過性膜で構成された処理部内において、表面処理のための第１の液体に細胞を浸漬する表面処理工程と、前記液透過性膜を透過させることで、前記処理部内の前記第１の液体を前記処理部外へ分離する液分離工程と、表面処理済みの前記細胞を第２の液体に懸濁することを含む回収工程とを少なくとも含み、前記回収工程における前記懸濁は、前記液透過性膜に付着した前記細胞を剥離することを含む、細胞の表面処理方法を提供する。

回収工程において液透過性膜に付着した細胞を剥離することで、細胞へのダメージを低減できる。また、液透過性膜に残留する細胞を減少させ、細胞の回収率を向上できる。さらに、液透過性膜から細胞を剥離することで、表面処理品質を向上できる。

本発明によれば、被覆細胞の製造のような細胞の表面処理において、細胞へのダメージを低減し、細胞の回収率を向上し、かつ表面処理品質を向上できる。

本発明の第１実施形態に係る被覆細胞製造装置の模式的な正面図。 本発明の第１実施形態に係る被覆細胞製造装置の模式的な平面図。 容器台の模式的な縦断面図。 処理容器の模式的な縦断面図。 蓋を取り外した状態での処理容器の模式的な平面図。 処理内槽の模式的な斜視図。 本発明の第１実施形態に係る被覆細胞の製造方法を説明するためのフローチャート。 図７のステップＳ７−５（細胞被覆処理）の詳細を示すフローチャート。 図８のステップＳ８−２（第１物質被膜工程）の詳細を示すフローチャート。 図８のステップＳ８−３（第２物質被膜工程）の詳細を示すフローチャート。 細胞懸濁液セットの概要を示す模式図。 細胞分離工程の概要を示す模式図。 表面処理工程及び洗浄工程の概要を示す模式図。 液分離工程の概要を示す模式図。 回収工程の概要を示す模式図。 揺動の周波数の変化の一例を示すグラフ。 本発明の第２実施形態に係る被覆細胞製造装置が備える処理容器の模式的な縦断面図。 貯液部の断面積の設定を説明するための模式図。 本発明の第３実施形態に係る被覆細胞製造装置が備える処理容器の模式的な縦断面図。 本発明の第４実施形態に係る被覆細胞製造装置が備える処理容器の模式的な縦断面図。 本発明の第５実施形態に係る被覆細胞製造装置が備える処理容器の模式的な縦断面図。 比較例と実施例の逆流量を示すグラフ。 比較例と実施例の収率を示すグラフ。

次に、添付図面を参照して、本発明の実施形態を説明する。これらの実施形態では、細胞の表面処理方法の一例として、細胞の三次元構造体を作成する際に用いる被覆細胞の製造方法を説明する。また、これらの実施形態では、細胞の表面処理装置の一例として、被覆細胞製造装置を説明する。しかし、これらの実施形態は例示に過ぎず、本発明は、被覆細胞の製造以外にも適用できる。また、これらの実施形態に対して、特許請求の範囲又はその均等の範囲において、種々の変更、置き換え、付加、省略等を行うことができる。

まず、被覆細胞の製造方法の概要を説明する。

被覆細胞は、第１物質と、第１物質と相互作用する第２物質とが、細胞表面に積層された細胞であり、第１物質と第２物質とが交互に積層されたものである。

被覆細胞の製造に供される細胞は、組織を形成する多細胞生物の細胞であればどのような細胞でもよく、動物細胞であってもよいし、植物細胞であってもよい。特に動物細胞が好ましく、より好ましくは哺乳類由来細胞である。哺乳類由来の細胞として、肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、乳腺細胞、筋細胞、神経細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、骨細胞、及び免疫細胞等があげられる。細胞は１種類でもよいし、２種類以上を用いてもよい。

第１物質と第２物質は、RGD配列を有する高分子とRGD配列を有する高分子と相互作用する高分子、又は正の電荷を有する高分子と負の電荷を有する高分子等である。第１物質と第２物質の例としては、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε-ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、及びラミニンとゼラチン等が挙げられる。

第１物質を含有する第１処理液と、第２物質を含有する第２処理液に浸漬し、攪拌することによって、細胞表面に第１物質と第２物質を被覆させる。第１処理液と第２処理液の溶媒は、特に制限されないが、細胞への毒性がない水や緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。また、これらの処理液の緩衝液としては、Tris緩衝液（Tris-HCl等）、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液等が使用できる。これらの処理液の溶媒pHは、特に制限はないが、pH６〜８程度に調整済みのものが好ましい。

（第１実施形態）
図１及び図２を参照すると、本発明の第１実施形態に係る被覆細胞製造装置（細胞処理装置の一例）１は、基台２上に設置された液配置部３、表面処理部４、及び液搬送部５を備える。液配置部３には、処理液及び洗浄液が配置される。表面処理部４は、細胞に対する被覆処理を行う。液搬送部（本発明における液供給部の一例）５は、液配置部３から処理液及び洗浄液を取り出して搬送し、表面処理部４に供給する。また、被覆細胞製造装置１は、入出力装置６と制御装置７を備える。

液配置部３は、容器台８と液温調ユニット９を備える。基台２上に液温調ユニット９が設置され、液温調ユニット９上に容器台８が設置されている。

図３を併せて参照すると、容器台８には、上部が開口する３個の容器配置溝１１ａ，１１ｂ，１１ｃが設けられている。また、容器台８には、互いに隣接する容器配置溝１１ａ，１１ｂ間に、上部が開口する２個のノズル退避溝１２ａ，１２ｂが設けられている。さらに、容器台８には、互いに隣接する容器配置溝１１ｂ，１１ｃ間に、上部が開口する２個のノズル退避溝１２ｃ，１２ｄが設けられている。図２に表れているように、平面視では、容器配置溝１１ａ〜１１ｃとノズル退避溝１２ａ〜１２ｄとが一つの直線上に等間隔で配置されている。

容器配置溝１１ａ〜１１ｃには、上部が開口した処理液容器１３ａ〜１３ｃが取出可能にそれぞれ配置されている。本実施形態では、処理液容器１３ａに前述した第１処理液１４が収容され、処理液容器１３ｂに前述した第２処理液１５が収容され、処理液容器１３ｃには洗浄液１６が収容されている。洗浄液１６は、第１処理液１４及び第２処理液１５の溶媒として例示したものを使用できる。以下の説明において、第１処理液１４、第２処理液１５、及び洗浄液１６の総称として、「処理液」という用語を使用する場合がある。

容器配置溝１１ａ〜１１ｃは、処理液容器１３ａ〜１３ｃの外面と溝壁面とが可能な限り広い面積で接触する形状及び寸法を有することが好ましい。熱媒体として、生体適合性の液体で容器配置溝１１ａ〜１１ｃを満たしてもよい。

液温調ユニット９は、図示しない温度測定手段と温度調節手段を具備しており、容器配置溝１１ａ〜１１ｃに配置された処理液容器１３ａ〜１３ｃ内の第１処理液１４、第２処理液１５、及び洗浄液１６の温度を調節できる。また、液温調ユニット９は、図示しない液量計測手段を具備しており、第１処理液１４、第２処理液１５、及び洗浄液１６の液量不足を検知することが可能である。

図１及び図２を参照すると、液搬送部５は、基台２上に設置された門型構造体１８を備える。門型構造体１８の横梁部１９には、液配置部３及び表面処理部４の上方に位置するように、水平方向に延びるＸ軸ステージ２０が固定されている。液搬送部５はＸ軸キャリッジ２１を備える。Ｘ軸キャリッジ２１は、符号２２で概念的に示すＸ軸駆動部で駆動されることにより、Ｘ軸ステージ２０上を位置決め可能に移動する。Ｘ軸キャリッジ２１には、鉛直方向に延びるＺ軸ステージ２３が固定されている。液搬送部５は、Ｚ軸キャリッジ２４を備える。Ｚ軸キャリッジ２４は、符号２５で概念的に示すＺ軸駆動部で駆動されることにより、Ｚ軸ステージ２３上を位置決め可能に移動する。

Ｚ軸キャリッジ２４には、それぞれノズルアタッチメント２６を介して３個のノズル２７ａ，２７ｂ，２７ｃが保持されている。個々のノズル２７ａ〜２７ｂは、ノズルアタッチメント２６に嵌合により接続されており、Ｚ軸キャリッジ２４に対して着脱可能である。ノズル２７ａ〜２７ｃは吸排ポンプ２８ａ，２８ｂ，２８ｃにそれぞれ流体的に接続されている。吸排ポンプ２８ａ〜２８ｃにより、ノズル２７ａ〜２７ｂは定量の処理液の吸引、貯留、及び排出が可能となっている。ノズル２７ａ〜２７ｃは、それぞれ第１処理液１４、第２処理液１５、及び洗浄液１６の搬送に用いられる。

ノズル２７ａ〜２７ｃのうち互いに隣接する２個間の間隔は、容器配置溝１１ａ〜１１ｃ及びノズル退避溝１２ａ〜１２ｄのうち互いに隣接する２個間の間隔と等しく設定されている。そのため、例えば図３に示すように、ノズル２７ａが容器配置溝１１ａに配置された処理液容器１３ａ内に進入しているとき、残りのノズル２７ｂ，２７ｃは、ノズル退避溝１２ａ，１２ｂ内に位置している。

本実施形態における液搬送部５は、Ｘ軸ステージ２０とＺ軸ステージ２３を備える直交座標型である。しかし、液搬送部の形態は、必要な機能を実現できる限り特に限定されず、例えばθ軸ステージとＺ軸ステージとを備える円筒座標型であってもよい。

図１、図２、図４、及び図５を参照すると、表面処理部４は、揺動ユニット３１と処理容器３２を備える。図４に最も明瞭に示すように、処理容器３２は、処理内槽（処理部）３３と、処理内槽３３が取出可能に配置される処理外槽（配置部）３４と、処理外槽３４上に配置される蓋３５とを備える。揺動ユニット３１は基台２上に設置され、処理容器３２が揺動ユニット３１上に搭載されている。処理容器３２は、揺動ユニット３１に対して取り付け及び取外可能である。例えば細胞種毎に処理容器３２を取り替えることで、細胞の汚染及び混入を防止できる。

図６を併せて参照すると、処理内槽３３は液体を透過しない材料（例えばポリエチレンテレフタレートのような樹脂）からなる筒状部３６と、筒状部３６の下部の開口を閉鎖するように筒状部３６の下端に設けられた平坦な液透過性膜３７とを備える。言い換えれば、処理内槽３３の底部が液透過性膜３７によって構成されている。液透過性膜３７とは、処理液を透過させ、処理液と細胞とを分離可能な膜をいう。液透過性膜３７の材質等について特に制限はなく、不織布、多孔質、フィルター、メッシュ等を液透過性膜３７として選択できる。筒状部３６の上部は開口している。筒状部３６の上端には、フランジ部３８が設けられている。処理内槽３３は、セルカルチャーインサートであってもよい。

本実施形態では、処理内槽３３の底部の実質的に全体が液透過性膜３７によって構成されている。しかし、処理内槽３３の底部の一部、例えば筒状部３６の最下端に近い部分が、液体を透過しない材料で構成されていてもよい。また、筒状部３６の一部、例えば筒状部３６の下端側の部分が、液体を透過する材料で構成されていてもよい。

処理外槽３４は、液体を透過しない材料（例えばポリエチレンテレフタレートのような樹脂）からなる。図４及び図５を参照すると、処理外槽３４は、処理内槽３３を収容するための収容凹部４１を備える。収容凹部４１は上部が開口している。図４に最も明瞭に示すように、収容凹部４１の周壁４１ａ及び底壁４１ｂの形状及び寸法は、収容凹部４１内に収容された処理内槽３３との処理外槽３４との間に隙間、すなわち貯液空間４２が形成されるように設定されている。詳細には、収容凹部４１の底壁４１ｂと処理内槽３３の液透過性膜３７との間に隙間４３ａが形成され、収容凹部４１の周壁４１ａと処理内槽３３の筒状部３６との間に、隙間４３ｂが形成される。言い換えれば、これらの隙間４３ａ，４３ｂが貯液空間４２を構成している。収容凹部４１の周壁４１ａの上端部には、処理内槽３３のフランジ部３８を支持し、貯液空間４２が形成された状態で収容凹部４１内に処理内槽３３を保持する支持部４４が形成されている。収容凹部４１に保持されているとき、処理内槽３３は液透過性膜３７が水平面内で拡がる姿勢で保持される。

蓋３５は、蓋３５は処理外槽３４に対して取り外し可能に配置されており、処理外槽３４と収容凹部４１に収容された処理内槽３３に対してピン等の手段によって位置決めされている。

蓋３５には、外側給液口４５と内側給液口４６とが、厚み方向に貫通するように設けられている。外側給液口４５は、本実施形態では処理外槽３４の上部に形成された溝である給液路４７を介して、貯液空間４２（より具体的には隙間４３ｂ）と流体的に連通している。外側給液口４５を介して、処理液が貯液空間４２に供給される。内側給液口４６は、処理内槽３３の内部（処理部内）に流体的に連通している。内側給液口４６を介して、表面処理を行う細胞の懸濁液が処理内槽３３の内部に供給される。また、内側給液口４６を介して、表面処理済みの細胞が懸濁された洗浄液が処理内槽３３から回収される。図２に表れているように、外側給液口４５と内側給液口４６は、平面視では、容器配置溝１１ａ〜１１ｃとノズル退避溝１２ａ〜１２ｄと共通する一つの直線上に配置されている。

貯液空間４２に処理液を供給するための構造、及び処理内槽３３の内部に対して液体の供給と回収を行うための構造は、本実施形態のものに限定されない。例えば、蓋３５を省略し、給液路４７を外側給液口として使用すると共に、収容凹部４１の上部開口から露出している筒状部３６の開口を内側給液口として使用してもよい。

図４、図５を参照すると、処理外槽３４は、貯液空間４２から液体（処理液及び表面処理を行う細胞の懸濁液の分散媒）を排出するための排液口４８を備えている。本実施形態では、収容凹部４１の底壁４１ｂに複数個（５個）の排液口４８が設けられている。排液口４８の個数は１個でもよい。例えば、収容凹部４１の底壁４１ｂの平面視での中央領域に、単一の排液口４８を設けてもよい。排液口４８は、貯液空間４２と、処理外槽３４に形成された排液流路４９とを流体的に連通している。排液流路４９の出口は、パイプやチューブで構成された外部流路５０を介して、廃液槽５１に流体的に接続されている。廃液槽５１には排液ポンプ５２が流体的に接続されている。排液ポンプ５２が作動すると、廃液槽５１の内部が負圧となり、貯液空間４２内の液体が排液口４８、排液流路４９、及び外部流路５０を介して廃液槽５１内に流入する。図２において符号５０ａで示すように、外部流路５０にはいったん上向きに延びた後で下向きに折り返す部分を有する。この折り返し部５０ａを設けたことで、排液ポンプ５２が動作しない限り、排液口４８を介して貯液空間４２からの液体の排出は生じない。言い換えれば、この折り返し部５０ａを設けたことで、排液ポンプ５２を動作しない限り、貯液空間４２内に液体が保持される。折り返し部５０ａに代えて、排液ポンプ５２の動作時にのみ開弁する電磁弁を外部流路５０に設けてもよい。

容器から容器へ液を搬送するには、チューブをコネクタでポンプを接続した構成が一般的であるが、細胞の表面処理においては汚染や異物の混入を確実に防ぐ必要があるため、被覆細胞作製毎に接液部を交換する必要がある。そのため、処理液容器１３ａ〜１３ｂ、ノズル２７ａ〜２７ｂ、及び処理容器３２を含む処理液が接液する部材は、簡便に着脱して置換が可能となっている。

揺動ユニット３１は処理容器３２を振動ないし揺動させる。処理容器３２が揺動することで、貯液空間４２や処理内槽３３内の液体が振とうされる。

本実施形態では、揺動ユニット３１は水平面内の円運動で処理容器３２を連続的に揺動させる。揺動のための具体的機構は特に限定されない。例えばモータ軸が鉛直方向に延びる姿勢でモータを配置し、モータ軸と処理容器３２側とをリンクを介して連結することで、モータ軸の連続回転を処理容器３２の水平面内での連続的な円運動に変換できる。揺動ユニット３１の水平面内での揺動の軌道は、円軌道に限定されず、楕円軌道、直線又は曲線に沿った往復軌道、８の字状の軌道等であってもよい。言い換えれば、本明細書における「揺動」という用語は、周期的な運動である限り、往復運動と無端軌道に沿った運動の両方を含む。

後に詳述するように、処理容器３２が水平面内で揺動することで、揺動時に細胞が液透過性膜３７の膜孔に詰まるのを防止できる。しかし、この膜孔の詰まりを生じない程度であれば、処理容器３２が完全に水平面内のみで揺動している必要はなく、処理容器３２の揺動運動が鉛直方向（上下方向）の成分を含んでいてもよい。

揺動後の処理容器３２の位置が変わると、正確に外側給液口４５と内側給液口４６に処理液を入れることができなくなるため、揺動ユニット３１は、終了位置補正機構を持つ。この補正機構の具体的な構造は特に制限はないが、バネ等による押し当て機構が簡便で望ましい。

入出力装置６は、例えば装置前面に設置されたタッチパネルである。入出力装置６は、オペレータによるパラメータ設定の入力を受け付ける。また、入出力装置６は、工程状況をオペレータに対して視覚的に表示する。

制御装置７は、入出力装置６で設定されたパラメータと各種センサからの入力等に基づいて、液配置部３の液温調ユニット９、液搬送部５のＸ軸駆動部２２、Ｚ軸駆動部２５、及び吸排ポンプ２８ａ〜２８ｃ、並びに表面処理部４の揺動ユニット３１及び排液ポンプ５２を含む、被覆細胞製造装置１全体を統括的に制御する。制御装置７は、ＣＰＵ、ＲＡＭ、ＲＯＭ等を備える一般的なコンピュータ等のハードウェアと、ハードウェアに実装されるソフトウェアとにより構築できる。

次に、第１処理液１４、第２処理液１５、及び洗浄液１６の液配置部３から表面処理部４への搬送に関し、液搬送部５の動作を説明する。

第１処理液１４の搬送時には、Ｘ軸駆動部２２によって駆動されたＸ軸キャリッジ２１がＸ軸ステージ２０上を移動することで、第１処理液１４が収容された処理液容器１３ａの上方にノズル２７ａが移動する。次に、Ｚ軸駆動部２５によって駆動されたＺ軸キャリッジ２４がＺ軸ステージ２３に沿って降下することで、ノズル２７ａが処理液容器１３ａ内に進入に、第１処理液１４に接液する。この際、図３に示すように、ノズル２７ｂ，２７ｃはノズル退避溝１２ａ，１２ｂに進入するので、容器台８と干渉しない。次に、吸排ポンプ２８が作動し、ノズル２７ａの内部に定量の第１処理液１４を吸引する。

ノズル２７ａへの第１処理液１４の定量貯留完了後、Ｚ軸キャリッジ２４がＺ軸ステージ２３に沿って上昇することで、ノズル２７ａが処理液容器１３ａ内から退出する。続いて、Ｘ軸キャリッジ２１がＸ軸ステージ２０上を移動することで、ノズル２７ａが表面処理部４の外側給液口４５の上方に移動する。次に、Ｚ軸キャリッジ２４がＺ軸ステージ２３に沿って降下し、外側給液口４５に接近する。続いて、吸排ポンプ２８が作動し、ノズル２７ａの内部の第１処理液１４が外側給液口４５に注入される。

ノズル２７ｂによる第２処理液１５の搬送時及びノズル２７ｃによる洗浄液１６の搬送時にも、液搬送部５が同様に動作する。第２処理液１５の搬送では、ノズル２７ｂが処理液容器１３ｂ内に進入するとノズル２７ａ，２７ｃがノズル退避溝１２ｂ，１２ｃに進入し、定量貯留後のノズル２７ｂは外側給液口４５に対向する位置に移動して、第２処理液１５を外側給液口４５に注入する。洗浄液１６の搬送では、ノズル２７ｃが処理液容器１３ｃに進入するとノズル２７ａ，２７ｂが退避溝１２ｃ，１２ｄに進入し、定量貯留後のノズル２７ｂは外側給液口４５に対向する位置に移動して、洗浄液１６を外側給液口４５に注入する。

以下、被覆細胞製造装置１を用いた被覆細胞の製造方法について説明する。

図７のフローチャートは、被覆細胞製造方法の概要を示す。

（接液部材セット：ステップＳ７−１）
前述のように、細胞の表面処理においては汚染や異物の混入を確実に防ぐため、接液部材は被覆細胞作製毎に使い捨て、もしくは取り外し洗浄するようになっている。そのため、処理開始前に処理液容器１３ａ〜１３ｂ、ノズル２７ａ〜２７ｃ、処理容器３２等の接液部材を所定部にセットする。

（細胞懸濁液セット：ステップＳ７−２，図１１）
接液部材のセットが完了した後、図１１において矢印Ａ１で概念的に示すように、内側給液口４６から処理内槽３３内に表面処理を行う細胞６０の懸濁液６１を注入する。この懸濁液６１の注入は、手動操作で行ってもよいし、図１にのみ符号１００で概念的に示すように、ロボットアームの先端に備えられたノズルと吸排ポンプを使用して自動的に実行してもよい。

（パラメータ設定：ステップＳ７−３）
入出力装置６を使用して被覆細胞製造装置１のパラメータを設定する。設定可能なパラメータとしては、例えば被膜工程回数、処理内槽液量、処理外槽液量、給排速度、揺動周波数、揺動時間等がある。

細胞懸濁液セット（ステップＳ７−２）とパラメータ設定（ステップＳ７−３）を実行する順序を入れ換えてもよい。

（処理開始操作：ステップＳ７−４）
パラメータ設定が完了した後、被覆細胞製造装置１に対する処理開始の指令が入出力装置６により入力される。入出力装置６がタッチパネルである場合、例えばタッチパネルに表示された処理開始ボタンの押下により、処理開始の指令が入力される。

（細胞被膜処理：ステップＳ７−５）
処理開始指令が入力されると、被覆細胞製造装置１は細胞被膜処理を自動的に実行し、細胞６０の表面に第１物質の被膜と第２物質の被膜を交互に形成する。

図８のフローチャートは、被覆細胞製造装置１によって自動的に実行される細胞被覆処理の詳細を示す。

細胞被覆処理では、まず細胞分離工程（ステップＳ８−１）が実行される。次に、第１物質被膜工程（ステップＳ８−２）とそれに続く第２物質被膜工程（ステップＳ８−３）が規定回数だけ繰り返される。この規定回数は、前述のパラメータ設定（図７のステップＳ７−３）で設定される。規定回数の第１物質被膜工程と第２物質被膜工程の繰り返しが完了した後、回収工程（ステップＳ８−４）が実行される。回収工程が実行されると、細胞被膜処理が終了し、被膜細胞の製造が完了する。

（細胞分離工程：ステップＳ８−１，図１２）
細胞分離工程の開始時には、処理容器３２の処理内槽３３内には細胞懸濁液セット（図７のステップＳ７−１，図１１）で注入された細胞懸濁液６１が貯液されているが、処理内槽３３と処理外槽３４との間に形成された貯液空間４２は、液体が存在せず空状態である（図１２の「状態１」）。この状態で揺動ユニット３１が作動し、処理容器３２を揺動させる（図１２の「状態２」）。また、図１２の「状態２」に矢印Ａ２で概念的に示すように、排液ポンプ５２を作動させる。処理内槽３３の揺動により細胞懸濁液６１が振とうされる。その結果、細胞６０は処理内槽３３に残り、細胞懸濁液６１の分散媒のみが液透過性膜３７の膜孔を通って処理内槽３３内から貯液空間４２に流出する。貯液空間４２に流出した分散媒は、排液ポンプ５２の吸引により、排液口４８と外部流路５０を通って廃液槽５１に回収される。処理内槽３３内の分散媒がなくなるまで、処理容器３２の揺動と排液ポンプ５２による吸引が継続される（図１２の「状態３」）。

処理容器３２を鉛直方向（上下方向）に揺動させると、処理内槽３３内の細胞６０は液透過性膜３７に対して上方から衝突する傾向が強まるので、液透過性膜３７への細胞６０の付着、もしくは細胞６０の膜孔への詰まりが発生する可能性が高くなる。しかし、本実施形態では、前述のように揺動ユニット３１は水平面内で処理容器３２を揺動させている。言い換えれば、処理容器３２は液透過性膜３７に平行な方向に揺動する。そのため、処理内槽３３内の細胞６０が液透過性膜３７に対して上方から衝突する傾向を緩和ないし低減し、細胞６０の液透過性膜３７への付着や、膜孔への詰まりを防止ないし抑制できる。

揺動ユニット３１による揺動周波数が高いほど、処理内槽３３から貯液空間４２への分散剤の排出能力は高くなる。しかし、揺動周波数が高すぎると細胞６０にダメージを与える可能性があるため、細胞種によって適切に揺動周波数を選択する必要がある。揺動周波数は３０００rpm以下が好ましく、１００〜２０００rpmがより好ましく、さらに好ましくは５００〜１０００ｒｐｍである。ダメージに弱い細胞としては、ヒトiPS細胞、ES細胞、心筋細胞、肝細胞、血管平滑筋細胞、膵島細胞等が挙げられる。

（第１物質被膜工程：ステップＳ８−２）
図９のフローチャートは、第１物質被膜工程の詳細を示す。第１被膜工程では、表面処理工程（ステップＳ９−１）、１回目の液分離工程（ステップＳ９−２）、洗浄工程（ステップＳ９−３）、及び２回目の液分離工程（ステップＳ９−４）が、この順に実行される。

（表面処理工程：ステップＳ９−１，図１３）
表面処理工程の開始時には、処理内槽３３内には液透過性膜３７上に細胞６０が存在するが液体は存在せず、貯液空間４２も液体が存在せず空状態である（図１３の「状態１」）。この状態で、図１３の「状態２」に矢印Ａ３で概念的に示すように、液搬送部５のノズル２７ａから外側給液口４５及び給液路４７を介して貯液空間４２に第１処理液１４を定量貯留する。また、揺動ユニット３１を動作させることにより、処理容器３２を水平面内で揺動させる（図１３の「状態２」）。揺動周波数は、細胞分離工程（図１２）と同様に、細胞にダメージを与えない周波数に設定される。

貯液空間４２は給液流路４７と外側給液口４５を介して大気と連通し、処理内槽３３内は内側給液口４６を介して大気と連通している。つまり、貯液空間４２と処理内槽３３内には、いずれも大気圧が作用している。従って、貯液空間４２に定量貯留された第１処理液１４は、第１処理液１４自体の水頭圧により、液透過性膜３７の膜孔を介して貯液空間４２から処理内槽３３内に流入ないし逆流する。処理内槽３３内の細胞６０は、逆流した第１処理液１４に浸漬される。処理内槽３３内に流入する第１処理液１４の量が増加して処理内槽３３内の液面が上昇するのに伴って、貯液空間４２の液面が低下する。処理内槽３３内の液面上昇と貯液空円４２の液面低下によって、処理内槽３３の第１処理液１４の水頭圧と貯液空間４２の第１処理液１４の水頭圧が釣り合うと、液透過性膜３７を介した処理内槽３３への第１処理液１４の流入が停止する。

このように、本実施形態では、水頭圧を利用することで第１処理液１４が液透過性膜３７を透過して処理内槽３３内に逆流させているので、ポンプ等の圧力付与手段は必要がない。また、処理内槽３３内と貯液空間４２の水頭圧が釣り合う液面高さまで貯液空間４２側の第１処理液が減少すると逆流が停止する。言い換えれば、貯液空間４２に貯液される第１液体の量（液面高さ）を制御することによって逆流量を制御することが可能である。そのため、逆流の制御に液面センサ、圧力センサ等を使用する必要がない。これらの理由により、被覆細胞製造装置１の構成を簡素化できる。

処理容器３２を揺動せることで、液透過性膜３７を介した第１処理液１４の処理内槽３３内への逆流を促進できる。つまり、処理容器３２を揺動することで、逆流による処理内槽３３内への第１処理液１４の供給完了までに要する時間を短縮できる。

液透過性膜３７を介して処理内槽３３内へ逆流する第１処理液１４によって、処理内槽３３内の細胞の乖離を促し、液透過性膜３７に付着した細胞を剥離することができる。その結果、細胞６０の表面処理品質が向上し、細胞回収率も向上する。特に、処理容器３２を揺動することで、逆流が促進されるので、液透過性膜３７に付着した細胞をより効率よく剥離することができる。

貯液空間４２から処理内槽３３内への第１処理液１４の逆流が完了し、処理内槽３３の細胞６０が第１処理液１４で浸漬された後も、引き続き揺動ユニット３１によって処理容器３２が水平面内で揺動される（図１３の状態３）。この揺動により、第１処理液１４と細胞６０が十分に攪拌され、細胞６０の表面に第１物質の被膜が形成される。揺動によって、第１処理液１４と細胞６０を十分に攪拌することで、均質な表面処理を実現できる。揺動周波数は、細胞分離工程と同様に、細胞にダメージを与えない周波数に設定される。入出力装置６でパラメータの１つとして設定された揺動時間が経過するまで、揺動が継続される。

外部流路５０に折り返し部４０ａを設けているので、貯液空間４２の第１処理液１４が排液口４８から流出することがない。そのため、第１処理液１４の不足による細胞６０の表面処理品質の低下を防ぐことができる。また、揺動により処理内槽３３内から第１処理液１４が流出することがないので、細胞６０の乾燥による死滅を回避し、回収率を向上できる。

図１３の「状態３」における揺動の周波数が固定であると、液透過性膜３７上の振動の節に相当する領域に細胞６０が偏在し、偏在している細胞６０は第１物質で十分に被覆されない傾向がある。つまり、揺動の周波数が固定であると、表面処理が不均一となる傾向がある。本実施形態では、図１３の「状態３」における揺動の周波数を連続的に変化させている。周波数の連続的な変化の具体的な態様は特に限定されないが、例えば図１６に示すように、一定時間は周波数ｆ１を維持した後、周波数ｆ１から周波数ｆ２（ｆ１＜ｆ２）へ周波数させて周波数ｆ２を一定時間維持し、その後再び周波数ｆ１の一定時間の維持を行うという周波数変化を連続的に繰り返してもよい。かかる揺動の振動の周波数の連続的な変化によって、液透過性膜３７上の特定の領域に細胞６０が偏在するのを防止し、均質な表面処理を実現できる。また、液透過性膜３７上で細胞６０が偏在することに起因する細胞６０の凝集を防止できる。

（液分離工程：ステップＳ９−２，図１４）
液分離工程の開始時には、処理内槽３３内と貯液空間４２の両方に第１処理液１４が貯液されている。この状態で、この状態で揺動ユニット３１を動作させることにより、処理容器３２を揺動させる（図１４の「状態１」）。また、図１４の「状態１」に矢印Ａ２で概念的に示すように、排液ポンプ５２を作動させる。貯液空間４２の第１処理液１４は、排液ポンプ５２の吸引により、排液口４８と外部流路５０を通って廃液槽５１に回収される。処理内槽３３内の第１処理液１４は、液透過性膜３７の膜孔を通って、貯液空間４２に流出し、廃液槽５１に回収される。処理内槽３３内及び貯液空間４２の第１処理液１４がなくなるまで、処理容器３２の揺動と排液ポンプ５２による吸引が継続される（図１４の「状態２」）。入出力装置６でパラメータの１つとして設定された揺動時間が経過するまで、揺動が継続される。

揺動ユニット３１は水平面内で処理容器３２を揺動させる。言い換えれば、処理容器３２は液透過性膜３７に平行な方向に揺動する。そのため、液分離工程中の処理内槽３３内では、液透過性膜３７の液透過方向（上下方向）に垂直な第１処理液１４の流れ（液透過性膜３７に沿った横方向の流れ）が、液透過性膜３７の近傍に発生している。第１処理液１４の横方向の流れにより、液透過性膜３７の膜孔に細胞６０が詰まることや、液透過性膜３７に細胞６０が付着することを防止し、細胞６０の回収率を向上できる。また、この横方向の流れによって、細胞６０と液透過性膜３７との衝突ないし干渉を防止し、細胞６０のダメージを防止ないし軽減でき、表面処理品質を向上できる。

（洗浄工程：ステップＳ９−３，図１３）
洗浄工程は、使用される処理液が第１処理液１４ではなく洗浄液１６である点を除いて、表面処理工程（ステップＳ９−１）と同様である。

洗浄工程の開始時には、処理内槽３３には液透過性膜３７上に細胞６０が存在するが液体は存在せず、貯液空間４２も液体が存在せず空状態である（図１３の「状態１」）。この状態で、液搬送部５のノズル２７ｂから外側給液口４５及び給液路４７を介して貯液空間４２に洗浄液１６を定量貯留する（矢印Ａ３）。また、揺動ユニット３１により処理容器３２を水平面内で揺動させる（図１３の「状態２」）。揺動周波数は、細胞分離工程及び表面処理工程と同様に、細胞にダメージを与えない周波数に設定される。

貯液空間４２に定量貯留された洗浄液１６は、第１処理液１４自体の水頭圧により、液透過性膜３７の膜孔を介して貯液空間４２から処理内槽３３内に逆流する。処理内槽３３内の細胞６０は逆流した洗浄液１６に浸漬される。処理内槽３３内の洗浄液１６の水頭圧と貯液空間４２の洗浄液の水頭圧が釣り合うと、液透過性膜３７を介した処理内槽３３への洗浄液１６の流入が停止する。

水頭圧を利用することで液透過性膜３７を介して洗浄液１６を処理内槽３３内に逆流させるので、ポンプ等の圧力付与手段は必要がなく、逆流の制御に液面センサ、圧力センサ等も必要がないので、被覆細胞製造装置１の構成を簡素化できる。

処理容器３２を揺動せることで、液透過性膜３７を介した洗浄液１６の処理内槽３３内への逆流を促進し、処理内槽３３内への洗浄液１６の供給完了までに要する時間を短縮できる。

液透過性膜３７を介して処理内槽３３内へ逆流する洗浄液１６によって、処理内槽３３内の細胞の乖離を促し、液透過性膜３７に付着した細胞を剥離することができる。その結果、細胞６０の表面処理品質が向上し、細胞回収率も向上する。特に、処理容器３２を揺動することで、逆流が促進されるので、液透過性膜３７に付着した細胞をより効率よく剥離することができる。

貯液空間４２から処理内槽３３内への洗浄液１６の逆流が完了し、処理内槽３３の細胞６０が洗浄液１６で浸漬された後も、引き続き揺動ユニット３１によって処理容器３２が水平面内で揺動される（図１３の「状態３」）。揺動によって、第１処理液１４と細胞６０を十分に攪拌し、残留する第１処理液及び第１物質を洗浄液１６に効果的に溶解させることができる。揺動周波数は、細胞分離工程及び表面処理工程と同様に、細胞にダメージを与えない周波数に設定される。入出力装置６でパラメータの１つとして設定された揺動時間が経過するまで、揺動が継続される。

外部流路５０に折り返し部５０ａを設けているので、揺動によって貯液空間４２の洗浄液１６が排液口４８から流出することに起因する洗浄液１６の不足や、揺動によって処理内槽３３内から第１処理液１４が流出することに起因する細胞６０の乾燥による死滅を回避できる。

揺動ユニット３１は揺動の周波数を連続的に変化させているので、液透過性膜３７上の特定の領域に細胞６０が偏在するのを防止し、残留する第１処理液及び第１物質を洗浄液１６により効果的に溶解させることができる。また、液透過性膜３７上で細胞６０が偏在することに起因する細胞６０の凝集を防止できる。

（液分離工程：ステップＳ９−２，図１４）
洗浄工程後の液分離工程（ステップＳ９−４）は、廃液槽５１に回収されるのが第１処理液１４ではなく洗浄液１６である点を除いて、表面処理工程後の液分離工程（ステップＳ９−２）と同様である。

（第２物質被膜工程：ステップＳ８−３）
図１０のフローチャートは、第２物質被膜工程の詳細を示す。第１被膜工程では、表面処理工程（ステップＳ１０−１）、液分離工程（ステップＳ１０−２）、洗浄工程（ステップＳ１０−３）、及び液分離工程（ステップＳ１０−４）が、この順に実行される。これらの工程は、第１物質被覆工程（ステップＳ８−２）の対応する工程（図９のステップＳ９−１〜Ｓ９−４）と同様である。

前述のように、第１物質被膜工程（ステップＳ８−２）と第２物質被膜工程（ステップＳ８−３）が交互に繰り返されることで被膜細胞を形成される。これらの工程を繰り返す規定回数は、特に制限されないが、被膜厚みが１nm以上になるように設定することが好ましい。細胞種、各処理液濃度等に応じて規定回数を設定する必要がある。第１物質被膜工程（ステップＳ８−２）と第２物質被膜工程（ステップＳ８−３）の繰り返し回数が規定回数に達すると、処理容器３２から細胞を回収する回収工程が実行される。

（回収工程：ステップＳ８−４，図１５）
回収工程の開始時には、処理内槽３３内には液透過性膜３７上に細胞６０が存在するが液体は存在せず、貯液空間４２も液体が存在せず空状態である（図１５の「状態１」）。この状態で、図１５において矢印Ａ３で概念的に示すように、液搬送部５のノズル２７ｃから外側給液口４５及び給液路４７を介して貯液空間４２に洗浄剤を定量貯留する。また、揺動ユニット３１を動作させることにより、処理容器３２を水平面内で揺動させる（図１５の「状態２」）。揺動周波数は、細胞分離工程、表面処理工程、洗浄工程、及び液分離工程と同様に、細胞にダメージを与えない周波数に設定される。

貯液空間４２は給液路４７と外側給液口４５を介して大気と連通し、処理内槽３３内は内側給液口を介して大気と連通している。つまり、貯液空間４２と処理内槽３３内には、いずれも大気圧が作用している。従って、貯液空間４２に定量貯留された洗浄液１６は、洗浄液１６自体の水頭圧により、液透過性膜３７の膜孔を介して貯液空間４２から処理内槽３３内に逆流する。処理内槽３３内の細胞６０は逆流した洗浄液１６に浸漬される。処理内槽３３内に流入する洗浄液１６の量が増加して処理内槽３３内の液面が上昇するのに伴って、貯液空間４２の液面が低下する。処理内槽３３の洗浄液１６の水頭圧と貯液空間４２の洗浄液１６の水頭圧が釣り合うと、液透過性膜３７を介した処理内槽３３への洗浄液１６の流入が停止する。

水頭圧を利用することで液透過性膜３７を介して洗浄液１６を処理内槽３３内に逆流させるので、ポンプ等の圧力付与手段は必要がなく、逆流の制御に液面センサ、圧力センサ等も必要がないので、被覆細胞製造装置１の構成を簡素化できる。

処理容器３２を揺動せることで、液透過性膜３７を介した洗浄液１６の処理内槽３３内への逆流を促進し、処理内槽３３内への洗浄液１６の供給完了までに要する時間を短縮できる。

液透過性膜３７を介して処理内槽３３内へ逆流する洗浄液１６によって、処理内槽３３内の細胞の乖離を促し、液透過性膜３７に付着した細胞を剥離することができる。特に、処理容器３２を揺動することで、逆流が促進されるので、液透過性膜３７に付着した細胞をより効率よく剥離することができる。液透過性膜３７に付着した細胞６０を剥離することで、細胞６０へのダメージを低減できる。また、液透過性膜３７に残留する細胞６０を減少させ、細胞６０の回収率を向上できる。さらに、液透過性膜３７から細胞を剥離することで、表面処理品質を向上できる。さらにまた、懸濁のための洗浄液１６を処理内槽３３内へ供給するのと同時に、液透過性膜３７から細胞６０を剥離できるので、処理効率を向上できる。

貯液空間４２から処理内槽３３内への洗浄液１６の逆流が完了し、処理内槽３３の細胞６０が洗浄液１６で浸漬された後も、引き続き揺動ユニット３１によって処理容器３２が水平面内で揺動される。揺動によって、洗浄液１６に対して細胞６０を十分に懸濁させることができる。入出力装置６でパラメータの１つとして設定された揺動時間が経過するまで、揺動が継続される。

外部流路５０に折り返し部５０ａを設けているので、揺動によって貯液空間４２の洗浄液１６が排液口４８から流出することに起因する洗浄液１６の不足や、揺動によって処理内槽３３内から第１処理液１４が流出することに起因する細胞６０の乾燥による死滅を回避できる。

揺動停止後、図１５の「状態３」に矢印Ａ４で概念的に示すように、内側給液口４６から細胞を懸濁させた洗浄液１６を取り出す。この懸濁液６１の取り出しは手動操作で行ってもよいし、図１にのみ符号１００で概念的に示すように、ロボットアームの先端に備えられたノズルと吸排ポンプを使用して自動的に実行してもよい。

本実施形態の回収工程では、揺動ユニット３１により処理容器３２全体を揺動させている。言い換えれば、貯液空間４２の洗浄液１６、処理内槽３３内の洗浄液１６、及び液透過性膜３７を揺動させている。しかし、貯液空間４２の洗浄液１６、処理内槽３３内の洗浄液１６、及び液透過性膜３７のうち１つ又は２つを揺動させてもよい。例えば、貯液空間４２内に超音波振動子を配置することで、液透過性膜３７を揺動させることなく、貯液空間４２の洗浄液１６を揺動ないし振とうできる。また、処理内槽３３内に超音波振動子を配置することで、液透過性膜３７を揺動させることなく、処理内槽３３内の洗浄液１６を揺動ないし振とうできる。この点は、細胞分離工程、表面処理工程、及び液分離工程における揺動についても同様である。

回収工程は、液透過性膜に付着する細胞を十分に剥離するため複数回行うことが望まし。

以上のように、被覆細胞製造装置１によって被覆細胞を作製できる。

以下、本発明の第２から第５実施形態を説明する。これらの実施形態における被覆細胞製造装置１の特に言及しない構造及び機能は、第１実施形態と同様である。また、これらの実施形態に関する図面では、第１実施形態と同一又は同様の要素には、同一の符号を付している。

（第２実施形態）
図１７に示す第２実施形態では、処理外槽３４の収容凹部４１は上端側に他の部分よりも広い拡大部４１ｂを備える。そのため、貯液空間４２の隙間４３ｂの水平断面の断面積は、下部よりも上部で大きくなっている。

図１８を併せて参照すると、同図の「構成Ａ」において、処理液６２が貯液空間４２に貯液された時点（水頭圧による逆流前）の貯液空間４２の液面高さ（初期液面高さ）を符号Ｈ１で示す。また、「構成Ａ」において、水頭圧による液透過性膜３７を介した処理内槽３３内への処理液６２の逆流が完了した時点での貯液空間４２の液面高さ（釣り合い液面高さ）を符号Ｈｂで示す。使用する処理液６２の量を低減するためには、貯液空間４２の容積を減少させる必要がある。しかし、「構成Ｂ」のように、単に貯液空間４２の隙間４３ｂを狭くすると、釣り合い液面Ｈｂを維持するためには、水頭圧の不足を補うために、初期液面高さＨ１を「構成Ａ」の場合よりも高く設定する必要がある。一方、構成Ｃ（本実施形態）のように、拡大部４１ｂを設けて貯液空間４２の隙間４３ｂの水平断面の断面積を下部よりも上部で大きく設定すれば、釣り合い液面Ｈｂを維持しつつ、貯液空間４２の隙間４３ｂを狭く設定できる。

以上のように、本実施形態では、拡大部４１ｂを設けて貯液空間４２の隙間４３ｂの水平断面の断面積を下部よりも上部で大きく設定することで、処理内槽３３内への処理液６２の逆流が完了するまで逆流に必要な水頭圧差を確保しつつ、貯液空間４２の高さの抑制と、貯液空間内の貯液する必要がある処理液の量の低減とを両立できる。

（第３実施形態）
図１９に示す本発明の第３実施形態では、収容凹部４１の周壁４１ａは、上端側から下端側に向けて収容凹部４１の幅が狭まるテーパー状である。この場合も、貯液空間４２の隙間４３ｂの水平断面の断面積が下部よりも上部で大きくなる。そのため、処理内槽３３内への処理液の逆流が完了するまで逆流に必要な水頭圧差を確保しつつ、貯液空間４２の高さの抑制と、貯液空間内の貯液する必要がある処理液の量の低減とを両立できる。

（第４実施形態）
図２０に示す本発明の第４実施形態では、表面処理部４は、貯液空間４２の上部に空気を供給するための加圧ポンプ６３を備える。また、外側給液口４５を密閉状態で閉鎖できる、開閉可能な栓体６４が設けられている。

外側給液口４５から貯液空間４２に処理液が注入された後、栓体６４によって外側給液口４５が閉鎖される。その後、加圧ポンプ６３により貯液空間４２の上部（液面よりも上方）に空気が送り込まれる。貯液空間４２の処理液は、それ自体の水頭圧と、加圧ポンプ６３からの空気供給によって上昇した貯液空間４２内の空気圧とによって、液透過性膜３７を透過して処理内槽３３内に逆流する。

（第５実施形態）
図２１に示す本発明の第５実施形態では、収容凹部４１の底壁４１ｂに、平面視で環状の隔壁６６が設けられている。この隔壁６６によって貯液空間４２の隙間４３ａは、内側領域６７と外側領域６８に区画されている。また、処理内槽３３の筒状部３６と収容凹部４１の周壁４１ａとは隙間なく密接している。

第１実施形態のような外側給液口４５と給液路４７（例えば図４参照）は設けられていない。これらの代わりに、内側領域６７に対して処理液を供給する第１給液部６９と、外側領域６８に対して処理液を供給する第２給液部７０が設けられている。

第１給液部６９と第２給液部７０から内側領域６７と外側領域６８に、それぞれ処理液を供給して加圧することで、液透過性膜３７を透過して処理液が処理内槽３３内に逆流する。第１給液部６９から内側領域６７に対して処理液を供給する圧力（供給圧Ｐｉ）と、第２給液部７０から外側領域６８に対して処理液を供給する圧力（供給圧力Ｐｏ）とは別個に制御できる。例えば、処理内槽３３内において液透過性膜３７の平面視で中央領域に細胞が偏在する傾向がある場合、供給圧Ｐｉを供給圧力Ｐｏよりも高く設定される。この圧力設定により、処理内槽３３内では、液透過性膜３７の近傍に中央側から外側に向かう処理液の流れが生じる。この流れにより、液透過性膜３７の中央領域の細胞は外側に移動するので、偏在が防止ないし緩和される。

（実施例１）
第１実施形態の被覆細胞製造装置１を用いて、ヒト皮膚由来繊維芽（NHDF）細胞をフィブロネクチン及びゼラチンで被覆した被覆細胞を作製した。

処理内槽３３としては6wellセルカルチャーインサート（Corning社製、孔径３μm、孔密度２×１０^６ pores/cm²）を用いた。表面処理工程開始時の貯液空間４２の液量を２３００μL、処理内槽３３内の液量を０μL、洗浄工程開始時の貯液空間４２の液量を２３００μL、処理内槽３３内の液量を０μL、回収工程開始時の貯液空間４２の液量を２３００μL、処理内槽３３内の液量を０μLとした。各工程における液量は、貯液空間４２と処理内槽３３内で意図的に大きな水頭圧を発生させる条件であり、貯液空間４２から処理内槽３３内へ４００〜８００μL程度の逆流が起こる条件である。本条件にて発生する逆流量を測定した。

前記の条件にて、５×１０^６個のNHDF細胞に対して、フィブロネクチンを被覆する被膜工程５回、ゼラチンを被覆する被膜工程4回を規定回数とし、被膜処理を行った。被膜処理によって得られた被覆細胞の生存細胞数をトリパンブルー染色と血球計により測定し、収率（処理後生細胞数÷処理前生細胞数）を算出した。

（実施例２）
また、第１実施形態の被覆細胞製造装置１を用いて、表面処理工程開始時の貯液空間４２の液量を１０００μL、処理内槽３３の液量を５００μL、洗浄工程開始時の貯液空間４２の液量を１０００μL、処理内槽３３の液量を５００μL、回収工程開始時の排出部側液量を１０００μL、処理内槽３３の液量を５００μLとしてヒト皮膚由来繊維芽（NHDF）細胞をフィブロネクチンおよびゼラチンで被覆した被覆細胞を作製した。本条件にて発生した逆流量を測定した。

前記の条件にて、５×１０^６個のNHDF細胞に対して、フィブロネクチンを被覆する被膜工程を５回、ゼラチンを被覆する被膜工程４回を規定回数として、被膜処理をおこなった。実施例同様、被膜処理によって得られた被覆細胞の生存細胞数をトリパンブルー染色と血球計により測定し、収率（処理後生細胞数÷処理前生細胞数）を算出した。

逆流量及び収率の結果を図２２及び図２３に示す。実施例１はいずれの場合においても実施例２よりも収率が高かった。

１ 被覆細胞製造装置
２ 基台
３ 液配置部
４ 表面処理部
５ 液搬送部
６ 入出力装置
７ 制御装置
８ 容器台
９ 液温調ユニット
１１ａ〜１１ｃ 容器配置溝
１２ａ〜１２ｄ ノズル退避溝
１３ａ〜１３ｃ 処理液容器
１４ 第１処理液
１５ 第２処理液
１６ 洗浄液
１８ 門型構造体
１９ 横梁部
２０ Ｘ軸ステージ
２１ Ｘ軸キャリッジ
２２ Ｘ軸駆動部
２３ Ｚ軸ステージ
２４ Ｘ軸キャリッジ
２５ Ｚ軸駆動部
２６ ノズルアタッチメント
２７ａ〜２７ｃ ノズル
２８ａ，２８ｂ，２８ｃ 吸排ポンプ
３１ 揺動ユニット
３２ 処理容器
３３ 処理内槽
３４ 処理外槽
３５ 蓋
３６ 筒状部
３７ 液透過性膜
３８ フランジ部
４１ 収容凹部
４１ａ 周壁
４１ｂ 底壁
４１ｃ 拡大部
４２ 貯液空間
４３ａ，４３ｂ 隙間
４４ 支持部
４５ 外側給液口
４６ 内側給液口
４７ 給液路
４８ 排液口
４９ 排液流路
５０ 外部流路
５０ａ 折り返し部
５１ 廃液槽
５２ 排液ポンプ
６０ 細胞
６１ 懸濁液
６２ 処理液
６３ 加圧ポンプ
６４ 栓体
６５ 電磁弁
６６ 隔壁
６７ 内側領域
６８ 外側領域
６９ 第１給液部
７０ 第２給液部

Claims (12)

1. 細胞の表面処理方法であって、
   少なくとも一部が液透過性膜で構成された処理部内において、表面処理のための第１の液体に細胞を浸漬する表面処理工程と、
   前記液透過性膜を透過させることで、前記処理部内の前記第１の液体を前記処理部外へ分離する液分離工程と、
   表面処理済みの前記細胞を第２の液体に懸濁することを含む回収工程と
   を少なくとも含み、
   前記回収工程における前記懸濁は、前記液透過性膜に付着した前記細胞を剥離することを含む、細胞の表面処理方法。
2. 前記剥離は、前記液透過性膜を介して前記処理部外から前記処理部内へ前記第２の液体を逆流させることを含む、請求項１に記載の細胞の表面処理方法。
3. 前記逆流は、前記処理部外の前記第２の液体の水頭圧によって生じる、請求項２に記載の細胞の表面処理方法。
4. 前記逆流は、前記処理部外の前記第２の液体、前記処理部内の前記第２の液体、及び前記液透過性膜のうちの少なくとも１つを揺動しながら行うことを含む、請求項２又は３に記載の細胞の表面処理方法。
5. 前記表面処理工程は、前記処理部内から前記処理部外への前記第１の液体の流出が許容されない状態で、前記処理部外の前記第１の液体、前記処理部内の前記第１の液体、及び前記液透過性膜のうちの少なくとも１つを揺動しながら行うことを含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞の表面処理方法。
6. 前記表面処理工程における前記揺動は、前記揺動の周波数を変化させつつ行うことを含む、請求項５に記載の細胞の表面処理方法。
7. 前記液分離工程における前記透過は、前記処理部内において前記液透過性膜の液透過方向に垂直な前記第１の液体の流れを発生させつつ行うことを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞の表面処理方法。
8. 内部で細胞に対する表面処理が実行される、少なくとも一部が液透過性膜で構成された処理部を配置可能であり、前記処理部が配置されると、前記処理部との間に貯液空間が形成される配置部と、
   前記貯液空間に液体を供給して貯液させる液体供給部と
   を備え、
   前記貯液空間に貯液された液体が、前記液透過性膜を介して前記貯液空間から前記処理部内へ前記液体を逆流するように構成されている、細胞表面処理装置。
9. 前記逆流は、前記貯液空間に貯液された前記液体の水頭圧によって生じる、請求項８に記載の細胞表面処理装置。
10. 前記貯液空間は、下部の断面積よりも上部の断面積が大きい、請求項９に記載の細胞表面処理装置。
11. 細胞の表面に被膜を形成することを含む、被覆細胞の製造方法であって、
    少なくとも一部が液透過性膜で構成された処理部内において、被膜成分を含有する第１の液体に前記細胞を浸漬させる表面処理工程と、
    前記液透過性膜を透過させることで、前記処理部内の前記第１の液体を前記処理部外へ分離する液分離工程と、
    前記被膜を形成済みの前記細胞を第２の液体に懸濁することを含む回収工程と
    を少なくとも含み、
    前記回収工程における前記懸濁は、前記液透過性膜に付着した前記細胞を剥離することを含む、被覆細胞の製造方法。
12. 内部で細胞の表面への被膜形成が実行される、少なくとも一部が液透過性膜で構成された処理部を配置可能であり、前記処理部が配置されると、前記処理部との間に貯液空間が形成される配置部と、
    前記貯液空間に液体を供給して貯液させる液体供給部と
    を備え、
    前記貯液空間に貯液された液体が、前記液透過性膜を介して前記貯液空間から前記処理部内へ前記液体を逆流するように構成されている、被覆細胞製造装置。

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