JP2021087364A - 細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、簡便に構築できる細胞培養装置を提供することを目的とする。【解決手段】第１の気体供給源と、第２の気体供給源と、減圧源と、を含む制御部と、培地のための第１の容器と、細胞培養のための第２の容器と、排液のための第３の容器と、第１の気体供給源と第２の容器を接続点まで接続する第１の気体流路と、第２の気体供給源と第１の容器を接続する第２の気体流路と、第２の容器と減圧源を接続する第３の気体流路と、第１の容器と第２の容器を接続点まで接続する第１の液体流路と、第２の容器と第３の容器を接続する第２の液体流路と、接続点から第２の容器まで接続する気液流路と、第１の気体流路に設けられた第１のバルブと、第２の気体流路に設けられた第２のバルブと、第１の液体流路に設けられた第３のバルブと、第２の液体流路に設けられた第４のバルブと、気液流路に設けられた第５のバルブと、を含む培養部と、を有する細胞培養装置を構築する。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培養装置に関する。

自分の細胞もしくは他人の細胞を用いて疾病の治療を行う再生医療では、生体から採取した細胞を培養して細胞数を増やす、あるいはしかるべき形に組織を構築させて移植治療に用いられている。治療用途としての細胞培養は、細胞プロセシングセンタ（Ｃｅｌｌ
Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＰＣ）という細胞培養用クリーンルームの中で
、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）に準拠して行わなければならない。ここでの課題は、細胞培養は技術者の手作業によって行われるため、患者１名分の細胞の調製に対して労力とコストが非常にかかるという点と、手動で実施することによる生物学的汚染リスクがあるという点である。

これらの課題を解決する手段として、閉鎖系で細胞培養工程を自動化する装置が開発されてきた。これは、培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系培養容器を用いることで、細胞培養工程の自動化と生物学的汚染リスクの低減が達成されるものである。

培養時に手動で行う主な操作は、細胞または生体試料を懸濁した液体培地を培養皿に導入する細胞播種作業と、培養中に定期的に実施する液体培地の交換作業である。液体培地の添加の際は、使い捨てのメスピペットを使用し、手操作で液体ボトルから所定量の液体培地を分取し、培養皿へ添加する。自動培養装置では、同様の分注器と移動手段を機械化し、手操作と同様の液体添加を行う方法があるが、この場合、装置の内側の固相および気相全体を無菌環境に設置する必要から自動培養装置は大型化する。一方、分注操作にポンプを使用し、液体ボトルから培養容器までの空間を使い捨てのチューブで接続して、ポンプによる定量と送液を同時に行う方法が開発された（例えば、特許文献１参照）。この場合、送液に用いるチューブ内部を無菌状態に維持できればよいため、自動化装置は小型化できる。

特開２００７−２２２１２０号公報

培養容器の内部やチューブ内部を無菌状態に維持して細胞培養を行う方法において、液体培地が流通し細胞培養を行う交換式の培養要素を以下の説明では培養流路を呼ぶ。特許文献１をはじめとして、培養流路を利用する自動化装置は、生物学的汚染の発生リスクを小さくして細胞培養が可能な反面、再生医療の広がりにより培養対象が広範囲になると、培養する細胞の量や数に応じて閉鎖された培養流路を個別に準備する必要があった。例えば培養容器の液体培地の量が数ｍＬから数１００ｍＬになれば、培養容器の大きさや形状を変えるとともに、送液に使用すべきポンプも必要な流量に見合った吐出量が必要になる。チューブ式ポンプであれば、様々な大きさの内径を有するチューブを準備して最適なチューブ径を選択しなければならない。チューブ以外にも、多様な培養流路の構成要素を準備しなければならないが、そのためのコストが膨大になるため、ポンプの性能や容器の大きさが一定量のものを使用せざるを得ず、各自動培養装置ごとに、その制限された培養の数や液量の範囲内で培養できる細胞を選定して使用していた。

その上、培養流路は作業者が自動運転の前に装置に設置するが、培養流路の設置が煩雑であることと、培養流路の適正設置の確認手法が確立されていないことの二つの課題があった。前者は多数の弁へのチューブの設置やチューブ式ポンプの取り付けなど作業が煩雑であり、培養容器やボトルが密閉していないと、培地の漏れや生物汚染の原因となることがあった。そのため、液体培地を内部に保持した培養流路の適正設置の確認については、例えば無菌のガスを導入し、培養流路の内部の圧力を高めて漏れの有無を調べる検査方法は、従来からよく用いられていた。しかし、検査中に内部の液体が漏れ出す可能性があるため、液体保持された容器に対する正常な取り付け確認は最も困難であった。

特に、送液または排液に使用するチューブ式ポンプは、固定のモーターから発生する出力範囲のもとで得られる送液の流量が決まっているため、交換式の培養流路における組み込み部品として使いにくかった。

そこで、本発明は、簡便に構築できる細胞培養装置を提供することを目的とする。

本発明者らは、圧力発生源としてのポンプを交換式でなく、培養流路とは別途に設置されたポンプを、加圧源および減圧源として供給すれば、培養流路のうちポンプのバリエーションを増やすことなく、自動細胞培養用途の培養流路を簡便に準備することができることを考え、本発明の完成に至った。

本発明の一実施態様である細胞培養装置は、第１の気体供給源と、第２の気体供給源と、減圧源と、を含む制御部と、培地を収容するための第１の容器と、細胞培養のための第２の容器と、排液を収容するための第３の容器と第１の気体供給源と第２の容器を、接続点まで接続する第１の気体流路と、第２の気体供給源と第１の容器を接続する第２の気体流路と、第２の容器と前記減圧源を接続する第３の気体流路と、第１の容器と第２の容器を前記接続点まで接続する第１の液体流路と、第２の容器と第３の容器を接続する第２の液体流路と、前記接続点から第２の容器まで接続する気液流路と、第１の気体流路に設けられた第１のバルブと、第２の気体流路に設けられた第２のバルブと、第１の液体流路に設けられた第３のバルブと、第２の液体流路に設けられた第４のバルブと、を含む培養部と、を有している。第２の容器と外気の間を接続する第４の気体流路と、第４の気体流路に設けられた第４のフィルターと、第４の気体流路の、第４のフィルターの外気側に設けられた第４の接続部と、第４の接続部と外気の間に設けられた流量計とをさらに有してもよい。第１の気体流路に設けられた第１のフィルターと、第１の気体流路の、第１のフィルターの第１の気体供給源側に設けられ、前記制御部と前記培養部とを接続する第１の接続部と、第２の気体流路に設けられた第２のフィルターと、第２の気体流路の、第２のフィルターの第２の気体供給源側に設けられ、前記制御部と前記培養部とを接続する第２の接続部と、第３の気体流路に設けられた第３のフィルターと、第３の気体流路の、第３のフィルターの減圧源側に設けられ、前記制御部と前記培養部とを接続する第３の接続部と、をさらに有していてもよい。第２の気体流路から分岐して、外気に接続する第６の気体流路と、第６の気体流路に設けられた第６のバルブと、第６の気体流路の、第６のバルブの外気側に設けられた第５のフィルターと、をさらに有していてもよい。第３の気体流路の、第３の接続部と前記減圧源との間に設けられた第７のバルブ、をさらに有していてもよい。

本発明によって、簡便に構築できる細胞培養装置を提供することができるようになった。

本発明の一実施形態による細胞培養装置の模式図である。 本発明の一実施形態による細胞培養装置の制御方法である。 本発明の一実施形態によるキャップ形状の異なる第２の容器の模式図である。 本発明の一実施形態による第２の容器の模式図である。 本発明の一実施形態による第２の容器の模式図である。 本発明の一実施形態による自動培養装置の制御に関するフローチャートである。 本発明の一実施形態による培養流路を設置した細胞培養装置の模式図である。

以下、添付図面を参照して本発明の種々の実施例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。また各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。

＜細胞培養装置の構成＞
本開示の細胞培養装置の一実施形態は、第１の気体供給源と、第２の気体供給源と、減圧源と、を含む制御部と、培地を収容するための第１の容器と、細胞培養のための第２の容器と、排液を収容するための第３の容器と第１の気体供給源と第２の容器を、接続点まで接続する第１の気体流路と、第２の気体供給源と第１の容器を接続する第２の気体流路と、第２の容器と減圧源を接続する第３の気体流路と、第１の容器と第２の容器を接続点まで接続する第１の液体流路と、第２の容器と第３の容器を接続する第２の液体流路と、接続点から第２の容器まで接続する気液流路と、第１の気体流路に設けられた第１のバルブと、第２の気体流路に設けられた第２のバルブと、第１の液体流路に設けられた第３のバルブと、第２の液体流路に設けられた第４のバルブと、前記気液流路に設けられた第５のバルブと、第１の気体流路に設けられた第１のフィルターと、第１の気体流路の、第１のフィルターの第１の気体供給源側に設けられ、制御部と培養部とを接続する第１の接続部と、第２の気体流路に設けられた第２のフィルターと、第２の気体流路の、第２のフィルターの第２の気体供給源側に設けられ、制御部と培養部とを接続する第２の接続部と、第３の気体流路に設けられた第３のフィルターと、第３の気体流路の、第３のフィルターの減圧源側に設けられ、制御部と培養部とを接続する第３の接続部と、を含む培養部と、を有する。本開示の細胞培養装置１は、さらに、第２の容器と外気の間を接続する第４の気体流路と、第４の気体流路に設けられた第４のフィルターと、第４の気体流路の、第４のフィルターの外気側に設けられた第４の接続部と、第４の接続部と外気の間に設けられた流量計と、を有してもよい。以下、この細胞培養装置の詳細を、図１〜図７を参照しながら説明する。

図１は、第１の実施形態の細胞培養装置１の構成を示す図である。細胞培養装置１は、気体供給源２１および減圧源３３を有する。また、細胞培養装置１は細胞を培養するための第２の容器２を有する。第２の容器２は、細胞培養用の液体培地３を保持できる。第２の容器２は細胞培養用容器であれば形状は特に限定されず、プレートであってもシャーレであってもボトルであってもよく、材質も特に限定されず、ガラスであっても、プラスチックであっても構わないが、使い捨てが容易であるためプラスチックであることが好ましく、密閉可能である点でボトルであることが好ましい。ボトル２であればキャップ５により開閉可能であり、培養時にはキャップ５を気密に閉じることができる。細胞培養用に底面がコーティングされていてもよい。未使用の液体培地３はキャップ５に貫通して設けられた第１の液体流路１２および気液流路６を介して第２の容器２へ送液される。気液流路６は、第２の容器２内の液体に接しない高さに開口端を有する。気相４についても第１の気体流路１３および気液流路６を介して送気される。また、キャップ５に貫通して設けら
れた第２の液体流路７は第２の容器２の底部付近に開口端を持つ。第２の容器２内の使用後の培地は、減圧源３３が作動し、第２の液体流路７が陰圧になることによって内部の液体培地３が排出される。第２の容器２には、また、圧力調整を行うための第４の気体流路８がキャップ５に貫通して設けられる。第４の気体流路８の開口端は、第２の容器２内の液体に接しない高さに設けられる。

気液流路６は第５のバルブ１０を介して、接続点１１に接続される。接続点１１は、第２の容器２に培地を供給するための第１の液体流路１２と第２の容器２に培養用気体を供給するための第１の気体流路１３に接続される。第１の液体流路１２には、送液調整のための第３のバルブ１４が設けられる。第１の液体流路１２のもう一方は液体培地３を保持する第１の容器１５に接続される。第１の容器１５の容器は、未使用の培地を保存する容器であって、形状や材質は特に限定されない。第１の容器１５は、ふたに貫通して設けられた第１の液体流路１２と、第１の容器１５内の気体を送気するための第２の気体流路１６とに接続されている。第１の容器１５の内部は、気密に保持され得る。ふたに設けられた第１の液体流路１２は、第１の容器１５の底部に開口端を持ち、液体に接して液体供給口となり、第２の気体流路１６は、第１の容器１５の内部に開口端を有する。第２の気体流路１６の開口端は、第１の容器内の液体に接しない高さに設けられる。なお、接続点１１は、１の容器１５に保持された液体の液面より上方に設けられている。

第２の気体流路１６は、気体供給源２１から、第２のフィルター１７を介して第１の容器１５に接続される。第２の気体流路１６には、第２のフィルター１７の気体供給源２１の側に第２の接続部１８（図中では、Ｉと表示される）が設けられる。この接続部１８は、制御部と培養部とを接続するものであって、実際には培養の使用時に接続される。接続部１８は、例えばコネクターであって、オスメス構造で一方は培養部３８を囲う恒温槽３９のハウジングに固定されていてもよい。第２の接続部１８は第２のバルブ１９を介して、送気する気体の流量を制御するための気体制御計２０に接続されている。第２のバルブ１９は、気体供給源２１から圧力の高い気体が第１の容器１５に入るのを調節する。なお、第２の気体流路１６の内圧を外気に逃す常圧制御弁である第６のバルブ４２を設けてもよい。第６のバルブ４２は、第２の気体流路１６から分岐して、外気に開く第６の気体流路３４上にあって、第６の気体流路３４上の、第６のバルブ４２の外気側には、第５のフィルターを設けてもよい。気体が加圧されて充填された気体供給元である気体供給源２１からは、気体が、圧力調整器４４で所定の圧力に制御されたのち気体制御計２０に供給される。気体供給源２１からから供給される気体は特に限定されないが、例えば、細胞培養条件に適するように５％ＣＯ_２を混合した空気であってもよい。圧力調整器４４からの供給圧力は特に限定されないが、例えば２００ｋＰａ以下であってもよく、流量がより多く必要な場合は、２００ｋＰａ以上の高圧にしてもよい。

気体供給源２１から気体を送気するための第１の気体流路１３は、気体供給源２１から第１のバルブ２４を介して、第２の容器２に接続される。第１のバルブ２４は、気体供給源２１から圧力の高い気体が第２の容器２に入るのを調節する。第１の気体流路１３には、また、第１のフィルター２２と、第１のフィルター２２の気体供給源２１に第１の接続部２３（図中では、Ｇと表示される）が設けられる。この接続部２３は、制御部と培養部とを接続するものであって、実際には培養の使用時に接続される。第１の接続部２３は、例えばコネクターであって、オスメス構造で一方は培養部を囲うハウジングに固定されていてもよい。第１の気体流路１３には、気体供給源２１と接続点１１の間に、加湿用ボトル２５が設けられてもよい。その場合、加湿用ボトル２５は、第１の気体流路１３と、気体供給源２１に接続している第５の気体流路２６に、内部を気密に保持したまま接続する。これらの気体流路は、ふたを貫通し、内部で開口する。第５の気体流路２６は、気体供給源２１との間に気体制御計２０を有してもよい。また、第５の気体流路２６は、加湿用ボトル２５内では、液体内で開口することにより、気体供給源２１からの気体を加湿する
。一方、第１の気体流路１３は、加湿用ボトル２５の内部で、液体に接しない部分に開口端を有する。

第２の容器２で細胞培養で使用済みの培地は、使用済みの培地を送液するための第２の液体流路７を通じて、使用済み培地を貯蔵するための第３の容器２８に送液される。第２の液体流路７は第４のバルブ２７を介して、第３の容器２８の蓋を貫通するように接続される。第３の容器２８は、減圧源３３との間に、両者を接続する、ふたを貫通した第３の気体流路２９が設けられるが、これらを介して内部を気密に保持できる。第２の液体流路７は、第３の容器２８の内部に、液体に接しないで一方の開口端を有する。第３の容器２８は、減圧によっても変形しないボトル形状が好適であって、その材料は、変形し難いプラスチックやガラスが好ましい。第３の気体流路２９は第３の容器２８から減圧源３３に接続される。第３の気体流路２９は第３のフィルター３０を有し、第３のフィルター３０の減圧源３３側に、第３の接続部３１（図中では、Ｏと表示される）が設けられる。この第３の接続部３１は、制御部と培養部とを接続するものであって、実際には培養の使用時に接続される。第３の接続部３１は、例えばコネクターであって、オスメス構造で一方は培養部を囲うハウジングに固定されていてもよい。減圧源３３と第３の接続部３１との間には、第７のバルブ３２が設けられてもよい。第７のバルブ３２によって、減圧のオンオフや、減圧量の調整を行うことができる。第３の気体流路２９を通って減圧源３３に入ってきた気体は、外気に放出してもよい。減圧源３３は、減圧ポンプであってもよい。

圧力調整管としての第４の気体流路８は第４のフィルター９を介して外気に接続される。第４の気体流路８には、第４のフィルター９の外気側に第４の接続部３６（図中では、Ｐと表示される）が設けられる。この第４の接続部３６は、培養の使用時に接続され、例えばコネクターであって、オスメス構造で一方は培養部を囲うハウジングに固定されていてもよい。第４の気体流路８には、第４の接続部３６と外気との間に流量計３７が設けられてもよい。

以上の構成のうち、図１において破線で囲んだ範囲が培養部３８であり、その外側が制御部になる。培養部３８は、各接続部で制御部の各要素と着脱可能である。また、培養部３８は、第１〜３の容器とそれに連なった管が一体となっており、持ち運び可能である。

図７に示すように、この培養流路３８は、扉つき構造の恒温槽３９および保管庫４０の所定の位置に着脱可能に設置されてもよい。また恒温槽３９と保管庫４０を１組にして自動培養に必要な、送液操作、送気操作、排液操作を制御するコントローラー４１と共に設置されてもよい。さらに複数組の恒温槽と保管庫を同様に統合してもよく、その場合、コントローラー４１に複数の自動培養に必要な制御を平行に行わせてもよい。

なお、バルブに使用する機構は電磁弁が好適である。一般的な電磁弁は電磁石の作用により開閉する部品にゴムチューブを挟み込んで取り付けられており、電磁弁のＯＮ／ＯＦＦによりゴムチューブを弾性変形させてチューブを開放／閉止する機構を有する。

また、フィルターは、細菌やウィルス等が培養部に混入するのを防ぐことができるものであればよく、例えばメッシュサイズ０.２２μｍ以下のフィルターを好適に使用できる
。

減圧源として用いられる減圧ポンプはローラーポンプが好適であるが、ダイヤフラムポンプ、ギヤポンプなど他の方式のポンプでも使用できる。いわゆるしごきポンプ、チューブポンプともいうローラーポンプは、モーター回転軸に取り付けたローラーにゴムチューブを巻きつけて、モーター回転によってゴムチューブを弾性変形させて内部の気体や液体を送液する機構を有する。

＝＝培養のための細胞培養装置の制御方法＝＝
図２に本明細書に開示の細胞培養装置の、培養および培地交換時の制御方法を示す。横軸は操作項目と時間軸を示し、縦方向には図１で明示した第１のバルブ２４から第７のバルブ３２まで７台の電磁弁と、気体制御計２０、減圧源３３、の動作タイミングを示している。初期状態では全ての電磁弁がＯＦＦで閉じており、全てのポンプがＯＦＦで送液停止の状態である。培養部３８の第２の容器２に気体を送気するときは第５のバルブ１０を開放したのち、第１のバルブ２４と気体制御計２０を稼働させれば、気体供給源より、所定の流量で加圧された気体の供給が開始される。気体は第２の容器２の気相４と置換され、第４の気体流路８を通過して外気に放出される。所定時間の送気ののち、第１のバルブ２４と気体制御計２０を停止して、第５のバルブ１０を閉じた後、第６のバルブ４２を一時開放すれば加湿用ボトル２５内はほぼ常圧に維持できる。

培地交換のために第２の容器２から液体培地を排液するときは、第４のバルブ２７を開放したのち、減圧源３３を作用させれば、減圧源３３に接続された第３の容器２８の内部が減圧され、次いで、第２の液体流路７が減圧され、第２の容器２の開口より液体培地３が移動する。それに伴い第４のバルブ２７の開放と同時に第５のバルブ１０を開放し、第１のバルブ２４を開放し、減圧源３３の作動と同時に気体制御計２０を作用させれば、気液流路６を通じて第２の容器２内にガスが送気される。また同時に第４の気体流路８と第４のフィルター９を通じて外気に通じているので、ガス送気量が、減圧源３３による吸引量を上回っている量は、気体が放出され導入される。このようにして第２の容器２内のガス濃度の低下を防ぐとともに容器内の圧力バランスを維持している。所定量の排液がなされたら減圧源３３を停止させ、第４のバルブ２７を閉じ、第２の容器２内の減圧を停止し、また同時に第５のバルブ１０を閉じ、第２の容器２内への加圧を停止することで、第２の容器２の内部を常圧に維持する。

培地交換のために第２の容器２へ液体培地を送液するときは、第５のバルブ１０と第３のバルブ１４と第２のバルブ１９を開放したのち、気体制御計２０を作用させれば、第１の容器１５の内部が加圧され、次いで、気液流路６を介して第２の容器２へ液体培地が到達する。一定の量が送液されたのち、第５のバルブ１０と第３のバルブ１４を閉じて、気体制御計２０の加圧を停止すれば送液は停止するが、気液流路６内に液体培地が残存する。次いで第１のバルブ２４を開放すれば気液流路６内に残存した液体培地は第２の容器２へ到達する。このとき、第１の液体流路１２と接続点１１の間に液体培地が残存しており、気体制御計２０を停止し第３のバルブ１４を開放し、次いで第６のバルブ４２を開放すれば、第１の液体流路１２の内部に残存した液体培地は第１の容器１５に落差によって戻り、第６のバルブ４２を一時開放すれば、第１の容器１５および加湿用ボトル２５内はほぼ常圧に維持できる。

送液量の定量方法については、一例としてハーゲンポアズイユの法則に則った流体の式に従えばよい。具体的には加圧された管にかかる圧力と加圧時間の関係より、ボトルに保持された液体が第２の容器までつながった気液流路の長さ、圧力損失と液体の粘性条件に比例することを利用するものであり、最終的には実際に使用する管の長さや液体、圧力条件から導かれる実験式より、想定される送液量を算出する方法が好ましい。また後述するような、第１の容器１５の重量を測定しながら送液する方法も有用である。

図１では、第２の容器２としてＴフラスコと呼ばれるキャップ付きの培養容器を用いているのに対して、図３では、第２の容器２として培養皿を用い、容器自体を密閉構造にした実施形態である。図１と図３では、同じ構成要素には同じ番号を用いている。培養皿の形状であっても、キャップ５に設けられた気液流路６により送液と送気が可能であり、第２の液体流路７により液体排出は可能であり、また第４の気体流路８より各々の第２の容
器２の圧力調整が可能である。図３のように第２の容器２が複数ある場合、気液流路６については、接続点１１と第５のバルブ１０の中間に分岐を設け、第５のバルブ１０の設置と同様に所望の第２の容器２の数と同数の第５のバルブ１０を設ければよい。第２の液体流路７については、第４のバルブ２７と第３の容器２８の中間に分岐を設け、第４のバルブ２７の設置と同様に所望の第２の容器２の数と同数の第４のバルブ２７を構成すればよい。第４の気体流路８については、キャップ５と第４のフィルター９の中間に分岐を設けて管を接続すればよい。

図３において第２の容器２内の細胞を保持する培養面は底面の１層であるのに対して、図４は第２の容器２として、上層容器４５と下層容器となる第２の容器２の組み合わせを用いた実施形態である。図１と図４では、同じ構成要素には同じ番号を用いている。この実施形態では、上層容器４５の底面材料は物質透過膜であってその表面で細胞培養が可能であり、下層の培養皿の表面で同時に細胞培養を行うことが可能である。上層容器４５と第２の容器２とで、同じ細胞を培養してもよく、異なる細胞を共培養してもよい。本実施形態では、キャップ５に装着された気液流路６により上層容器４５に液体培地３の送液と気相４への送気が可能である。培地交換の際には最初に第２の液体流路７により下層の液体培地を排出したのち、次いで液体培地３の添加は上層に実施すれば、液体培地３は上層容器４５の底面を通って下層に移動する。液体送液および液体排出のそれぞれの工程で第４の気体流路８より気体が自動的に出入りするため、第２の容器２の圧力が一定に保たれる。

図３において第２の容器２の、細胞を保持する容器部は個別の容器であるのに対して、図５は第２の容器２が、複数個のウェルを備えた実施形態である。図１と図５では、同じ構成要素には同じ番号を用いている。本実施形態では、一般にマルチウェルプレートとよばれる培養容器を用いるが、例えば６ウェルや１２ウェル備えたマルチウェルプレートがよく使用される。図５に示したような６ウェルを備えた培養容器では、キャップ５に設けられた６本の気液流路６の開口は各ウェル５４内に配置され、各ウェル５４に対して、液体培地３の送液と気相への送気が可能になっている。気液流路６および第５のバルブ１０はウェル５４の数に応じて同数準備されているため、目的のウェル５４へ送液や送気を行う時、目的のウェルに対応する第５のバルブ１０を開放するように制御される。一方、キャップ５に設けられた６本の第２の液体流路７の開口はウェル５４内の底面付近に配置され、ウェル５４内から液体を排出できる。第２の液体流路７および第４のバルブ２７はウェル５４の数に応じて同数準備されているため、目的のウェル５４から排液する時、目的のウェル５４に対応する第４のバルブ２７を開放する。一方、本実施形態では、ウェル５４のそれぞれの気相がウェル５４の上部で繋がっているため、気体の排出のためには、キャップ５を貫通して１つの気液流路６および第４の気体流路８が設けられるだけでよい。この場合、気体の排出のための送気操作においても、ウェル５４と第５のバルブ１０を一致させる必要はない。

＜細胞培養の操作＞
図６は、図１に示した細胞培養装置１を用いた細胞培養工程の全体的な操作のフローチャートを示している。まず、安全キャビネット内に培養部３８である閉鎖流路を設置する（Ｓ０１）。安全キャビネット内は無菌の空間であるので、手でキャップ５を開放し第２の容器２に細胞を培地に懸濁した細胞懸濁液を所定量入れて細胞を播種する（Ｓ０２）。次に、第１の容器１５のキャップを開けて内部に液体培地を充填する（Ｓ０３）。各々のキャップを閉め、恒温槽３９に培養部３８を搭載し、チューブを電磁弁すべてに設置し、次いで恒温槽３９のハウジングに培養部３８の第２の接続部１８、第２の接続部２３、第３の接続部３１、および第４の接続部３６を順次接続する（Ｓ０４）。

細胞培養装置１は培養部３８が正常な設置がなされているか否か、流路設置確認工程を
開始する（Ｓ０５）。具体的には、例えば、図２に示したタイムチャートにおける気体の送気工程と共に気体流量計２０で制御された送気量と流量計３７で計測される気体の排出量の値が同等であるとき、培養部３８から気体の漏れがなく正常設置がなされたと判定してもよい。その場合、流量計３７の量が少ない場合は、気体が漏れているか、もしくは閉じるべきでない管に閉塞が発生して異常設置であると判定する。例えば第２の容器２のキャップ５の閉じ方が不十分であったときは、排出量が少なくなって気体が漏れていることを検出することができる。

その後、自動運転を開始する（Ｓ０６）。第２の容器２に加湿されたガス（５％Ｃ０２空気混合ガス）を所定の時間で送気し、その後は静置して恒温機による容器の温度維持を行う(Ｓ０７)。所定の培地交換の開始時期までこれを繰り返し、培地交換時になったとき（Ｓ０８）、第２の容器２より液体培地を排出し（Ｓ０９）、第２の容器２に第１の容器１５より新しい液体培地を送液する（Ｓ１０）。また送気と静置を繰り返し（Ｓ１１）、細胞培養終了時期になれば（Ｓ１２）、細胞培養の自動運転は終了する（Ｓ１３）。恒温機から培養部３８を取り出し（Ｓ１４）、安全キャビネット内において培養細胞を回収する（Ｓ１４）。必要であれば、排液ボトル２８より使用済み液体培地を回収分析して、細菌増殖の有無を確認するなどして、細胞培養工程の健全性を検証してもよい。

図７は自動培養装置１の培養制御ユニット４６に培養部３８を設置した状態を示す。培養制御ユニット４６は恒温槽３９に設置され、第３のバルブ１４や第４のバルブ２７などの電磁弁部品が組みこまれている。気体供給源２１は分岐されて、複数の気体制御計２０にガスを供給しているが、個別の細胞培養装置とガスを共有してもよい。細胞を観察可能な観察機構４９が第２の容器２の下方に設置されており、容器保持部５０と観察窓５１が培養制御ユニット４６に設けられている。また保管庫４０には重量センサー４７が構成され、重量センサー４７上に第１の容器１５を所定の位置に設置すれば、第１の容器１５とその保持された液体培地の重量変化を測定することが可能である。培養部３８の設置時には、チューブ通し４８に送液管を配置することで、扉の閉止時による管の閉塞を防止することができる。加湿用ボトル２５は保管庫４０の内部に常時設置されており、内部の加湿水を補充できるよう保管部が設けられている。

以上説明したように、培養部３８は第１の接続部２３と第２の接続部１８と第３の接続部３１と圧力調整コネクター３６でそれぞれ着脱可能であり、また取り外して連結されている第２の容器２と第１の容器１５と第３の容器２８とそれに連なった管は、一体となって持ち運び可能であるので、培養流路の設置と交換が簡便である。

また複数台の恒温槽と複数台の保管庫を統合して、送液操作、送気操作、排液操作を制御するコントローラー４１に設置されているので、ＣＰＣなどの限られた無菌空間で同時に自動培養が可能である。

培養部３８に複数の第２の容器２があっても、容器数と同数の第５のバルブ１０、第４のバルブ２７を設けることにより、他の構成は変更せずに複数の第２の容器２の自動培養が可能な装置を提供できる。

図３、図４、図５を参照しながら説明したように、本明細書に開示された細胞培養装置は、用途に応じて第２の容器２をＴフラスコと呼ばれるキャップ付きの培養容器や、培養皿や、上層容器と下層容器からなる容器の形状や、さらにマルチウェルプレートとよばれる培養容器においても、容器周辺の設置や部品数は変わっても、他の構成は変更なく様々な第２の容器２に対して自動培養が可能な装置を提供できる。

また、図６における細胞培養装置１を用いた細胞培養工程のフローチャートで示したよ
うに、手操作による細胞播種工程は安全キャビネット内に培養部３８を設置してから実施し、その後で自動装置において培養部３８が正常な設置がなされているか否か、流路設置確認工程を実施できるので、確実な自動培養を実行できる。特に第２の容器や第１の容器に液体が保持されているときは、内部に意図しない高圧を印加して内部の液体を噴出させる恐れがあるが、本願では換気するときの状態であって、ガスは大気に放出する経路をもちいて、送気を行うので、培養容器や細胞に高圧を印加する恐れが小さく、培養流路の設置の正常性を確認できる。

第２の容器２の圧力調整を行う第４の気体流路８は恒温槽３９から外気に放出されるよう構成されており、加湿された排気ガスが恒温槽３９に残存しないため、恒温槽３９の内部を乾燥して維持できる利点がある。このことは恒温槽３９の内部の金属部品の腐食リスクを低減することができる。

また培養部３８を設置する培養制御ユニット４６は恒温槽３９に設置され、保管庫４０には液体培地を保持する第１の容器１５が設置されているので、細胞培養は恒温維持ができ、液体培地は常温保存ができるので、細胞培養は安定に実施できる。

１ 細胞培養装置
２ 第２の容器
３ 液体培地
４ 気相
５ キャップ
６ 気液流路
７ 第２の液体流路
８ 第４の気体流路
９ 第４のフィルター
１０ 第５のバルブ
１１ 接続点
１２ 第１の液体流路
１３ 第１の気体流路
１４ 第３のバルブ
１５ 第１の容器
１６ 第２の気体流路
１７ 第２のフィルター
１８ 第２の接続部
１９ 第２のバルブ
２０ 気体制御計
２１ 気体供給源
２２ 第１のフィルター
２３ 第１の接続部
２４ 第１のバルブ
２５ 加湿用ボトル
２６ 第５の気体流路
２７ 第４のバルブ
２８ 第３の容器
２９ 第３の気体流路
３０ 第３のフィルター
３１ 第３の接続部
３２ 第７のバルブ
３３ 減圧源
３６ 第４の接続部
３７ 流量計
３８ 培養部
３９ 恒温槽
４０ 保管庫
４１ コントローラー
４２ 第６のバルブ
４３ 第５のフィルター
４４ 圧力調整器
４５ 上層容器
４６ 培養制御ユニット
４７ 重量センサー
４８ チューブ通し
４９ 観察機構
５０ 容器保持部
５１ 観察窓
５３ 培養容器
５４ 個別容器

Claims (5)

1. 第１の気体供給源と、
   第２の気体供給源と、
   減圧源と、
   を含む制御部と、
   培地を収容するための第１の容器と、細胞培養のための第２の容器と、排液を収容するための第３の容器と
   第１の気体供給源と第２の容器を、接続点まで接続する第１の気体流路と、第２の気体供給源と第１の容器を接続する第２の気体流路と、第２の容器と前記減圧源を接続する第３の気体流路と、
   第１の容器と第２の容器を前記接続点まで接続する第１の液体流路と、第２の容器と第３の容器を接続する第２の液体流路と、
   前記接続点から第２の容器まで接続する気液流路と、
   第１の気体流路に設けられた第１のバルブと、第２の気体流路に設けられた第２のバルブと、第１の液体流路に設けられた第３のバルブと、第２の液体流路に設けられた第４のバルブと、前記気液流路に設けられた第５のバルブと、
   を含む培養部と、
   を有する細胞培養装置。
2. 第１の気体流路に設けられた第１のフィルターと、第１の気体流路の、第１のフィルターの第１の気体供給源側に設けられ、前記制御部と前記培養部とを接続する第１の接続部と、
   第２の気体流路に設けられた第２のフィルターと、第２の気体流路の、第２のフィルターの第２の気体供給源側に設けられ、前記制御部と前記培養部とを接続する第２の接続部と、
   第３の気体流路に設けられた第３のフィルターと、第３の気体流路の、第３のフィルターの減圧源側に設けられ、前記制御部と前記培養部とを接続する第３の接続部と、
   をさらに有する、請求項１に記載の細胞培養装置。
3. 第２の容器と外気の間を接続する第４の気体流路と、
   第４の気体流路に設けられた第４のフィルターと、第４の気体流路の、第４のフィルターの外気側に設けられた第４の接続部と、
   第４の接続部と外気の間に設けられた流量計と、
   をさらに有する、請求項１または２に記載の細胞培養装置。
4. 第２の気体流路から分岐して、外気に接続する第６の気体流路と、
   第６の気体流路に設けられた第６のバルブと、
   第６の気体流路の、第６のバルブの外気側に設けられた第５のフィルターと、
   をさらに有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
5. 第３の気体流路の、第３の接続部と前記減圧源との間に設けられた第７のバルブ、
   をさらに有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
   

Images