WO2018105078A1 - 細胞培養方法、培養容器及び細胞培養装置 - Google Patents

細胞培養方法、培養容器及び細胞培養装置 Download PDF

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WO2018105078A1
WO2018105078A1 PCT/JP2016/086516 JP2016086516W WO2018105078A1 WO 2018105078 A1 WO2018105078 A1 WO 2018105078A1 JP 2016086516 W JP2016086516 W JP 2016086516W WO 2018105078 A1 WO2018105078 A1 WO 2018105078A1
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container
culture
liquid
medium
cell
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PCT/JP2016/086516
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English (en)
French (fr)
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政晴 木山
宏子 半澤
絵里乃 松本
真理 太田
志津 武田
Original Assignee
株式会社日立製作所
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present disclosure relates to a cell culture method, a culture vessel, and a cell culture apparatus.
  • cells collected from a living body are cultured in a culture vessel.
  • the cells grow by taking in nutrients from the medium contained in the culture vessel.
  • Patent Document 1 a medium is supplied from a medium storage part provided above the cell culture part in which the medium is accommodated, and the liquid level of the medium accommodated in the cell culture part has reached a predetermined liquid level.
  • a technique for automating a medium exchange operation that sometimes causes the medium to flow out of the cell culture unit has been disclosed.
  • Patent Document 2 discloses an automatic equipped with a liquid feeding tube for feeding a medium from a chemical bag to an incubator and a discharge tube for discharging a used medium from the incubator when the medium is exchanged.
  • a culture apparatus is disclosed.
  • the open end of the drainage pipe serving as the medium outlet is located in the culture vessel. Therefore, when the medium is discharged, a strong flow is generated in the vicinity of the open end, and there is a possibility that the cells to be cultured are stressed.
  • the position of the liquid feeding tube for supplying the culture medium to the culture container and the drainage pipe for discharging the culture medium from the culture container are fixed. Different from the case of inhalation at different positions depending on the procedure used, the growth state could differ between cells grown near the open end of the drainage tube and cells grown far from the open end. That is, the reproducibility of the cell culture has been impaired. Furthermore, since the automatic culture apparatus requires a medium discharge pipe for each culture vessel for culturing cells, the culture apparatus is large and expensive.
  • the culture apparatus described in Patent Document 1 has a mechanism in which the culture medium is discharged in the same amount as the supplied culture medium.
  • the flow of the culture medium inevitably occurs in the culture container. It was.
  • emitting a culture medium is not located in a culture container, the position of the supply pipe
  • the present disclosure has been made in view of the above points, and provides a technique capable of improving the reproducibility of cell culture and suppressing the influence on the growth state of cultured cells accompanying liquid feeding.
  • the present disclosure includes a plurality of means for solving the above-described problems.
  • the present disclosure includes a first container and a liquid passage portion that allows the liquid to flow in or out, and is housed in the first container.
  • a cell culture method for culturing cells using a culture container comprising: a second container; a step of seeding cells in the second container; and a liquid level that is higher than that of the liquid passage part of the second container
  • a cell culture method comprising: supplying a medium to the first container until reaching a high position; and discharging the medium in the first container.
  • the first container, a liquid passage part for inflowing or outflowing the liquid, and a liquid storage part for storing the inflowed liquid are included in the first container.
  • the first container, a liquid passage part for allowing the liquid to flow in or out, and a liquid container part for accommodating the liquid that has flowed in are provided inside the first container.
  • An insertion tube having an opening end positioned at a position lower than the liquid passage portion, and the other end of the insertion tube opposite to the opening end has a first valve that can be opened and closed.
  • a cell culture apparatus is provided, which is connected to a supply pipe for supplying liquid to the liquid and a drain pipe having a second valve that can be opened and closed and discharging the liquid from the first container.
  • FIG. 3 is a view showing the structure of the culture container of Example 1. It is a figure for demonstrating the structure of a 2nd container. It is a figure for demonstrating the replacement
  • 2 is a control flow of the cell culture device described in Example 1.
  • FIG. 3 is a control time chart of the cell culture device described in Example 1.
  • FIG. 1 is a view showing the structure of a culture vessel 1A of Example 1.
  • 1A shows a plan cross-sectional view of the culture vessel 1A
  • FIG. 1B shows a side cross-sectional view of the culture vessel 1A.
  • 1A is a cross-sectional view taken along line YY ′ in FIG. 1B
  • FIG. 1B is a cross-sectional view taken along line XX ′ in FIG. is there.
  • the culture container 1A includes a first container 2A, a second container 3 accommodated in the first container 2A, a lid 4 covering the upper openings of the first container 2A and the second container 3, and an insertion penetrating the lid 4 A tube 5 and a holding part 6 provided between the second container 3 and the lid 4 are provided.
  • the lid 4 prevents, for example, bacteria from entering the culture container 1A and infecting cells when it prevents the medium contained in the first container 2A and the second container 3 from evaporating.
  • FIG. 1B there is a gap G between the lid 4 and the first container 2A.
  • the gap G becomes a passage when CO2 gas flows into the first container 2A or flows out of the first container 2A, for example.
  • the open end 5A of the insertion tube 5 is located inside the first container 2A and outside the second container 3 and at a position lower than the liquid passage portion of the second container 3 described later, and is located on the bottom surface of the first container 2A. It is open.
  • the other end of the insertion tube 5 opposite to the opening end 5A is connected to a pump which is a liquid feeding means (not shown).
  • the restraining component 6 is a component that semi-fixes the second container 3 so that the second container 3 is not displaced by buoyancy when the first container 2A is filled with the culture medium.
  • the culture vessel 1A has a cylindrical shape and is formed of, for example, a plastic material such as polycarbonate (hereinafter referred to as PC), polystyrene (hereinafter referred to as PS), or polypropylene (hereinafter referred to as PP).
  • PC polycarbonate
  • PS polystyrene
  • PP polypropylene
  • the first container 2A is formed by, for example, injection molding.
  • the inner bottom surface of the first container 2A is subjected to surface treatment such as hydrophilic treatment. Therefore, cell adhesion performance is secured on the inner bottom surface of the first container 2A, and culture and proliferation of adhesive cells and the like are possible.
  • the second container 3 is formed by, for example, injection molding. The inner bottom surface of the second container 3 is subjected to surface treatment such as hydrophilic treatment. Therefore, cell adhesion performance is ensured on the inner bottom surface of the second container 3, and culture and proliferation of adhesive cells and the like are possible.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the configuration of the second container 3.
  • the second container 3 is connected to a liquid passage portion 7 that allows the liquid to flow in or out, a liquid storage portion 8 that stores the liquid that has flowed in, and a part of the edge of the liquid storage portion 8 and holds the liquid storage portion 8.
  • Part 9 The second container 3 is housed inside the first container 2A with the other end of the holding part 9 detachably hooked on the upper end of the first container 2A. Therefore, the height of the edge of the first container 2 ⁇ / b> A is higher than the height of the liquid passage portion 7 of the second container 3. Alternatively, the height of the edge of the first container 2 ⁇ / b> A is higher than the height of the edge of the liquid container 8 of the second container 3.
  • the liquid passage part 7 allows the medium to flow into the liquid storage part 8 and fills the liquid storage part 8 when the liquid level of the culture medium supplied to the first container 2A reaches the height of the liquid passage part 7.
  • the spent medium begins to mix with fresh medium. Therefore, the amount of liquid retained in the first container 2A is determined by setting the height of the liquid passage portion 7 from the bottom surface of the first container 2A.
  • the holding portion 9 may be provided with an opening O through which liquid can flow into the liquid storage portion 8 from the same height as the position of the liquid passage portion 7. In this case, the liquid flows into the liquid storage portion 8 from a plurality of directions.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining a method of replacing the medium 10 performed in cell culture.
  • the exchange of the medium and the seeding of the cells in FIG. 3 may be performed by a technique using, for example, a measuring pipette, or the medium may be exchanged using the insertion tube 5.
  • FIG. 3A shows a state where the medium 10 is accommodated in the second container 3 and the cells 11 are seeded.
  • the diagram shown in FIG. 3A shows a state before the medium 10 is replaced, and the medium 10 is not yet supplied to the first container 2A.
  • FIG. 3 (B) shows a state in which the new medium 10 supplied from the insertion tube 5 and the medium 10 used for culturing the cells 11 accommodated in the second container 3 are mixed.
  • the culture medium 10 is supplied into the first container 2A via the insertion tube 5 by a pump (not shown), and the liquid level of the supplied culture medium 10 reaches the height of the liquid passage portion 7 of the second container 3. Thereafter, when the desired amount of liquid feeding is continued, the medium 10 flows out into the second container 3 and is mixed with the medium 10 in the second container 3.
  • cultivation of the cell 11, the new culture medium 10 supplied from the insertion tube 5 with the pump, and the culture medium 10 which mixed them are respectively attached
  • the symbol d indicates the distance from the opening end 5A of the insertion tube 5 and the bottom surface of the first container 2A.
  • the insertion tube 5 is designed so that the open end 5A is substantially in contact with the bottom surface of the first container 2A, and d is substantially zero.
  • FIG. 3C is a diagram illustrating a state in which the mixed medium 10 is sucked and discharged from the first container 2A by a pump.
  • the culture medium 10 positioned above the open end 5A is discharged from the first container 2A.
  • the medium 10 is in contact with the outer bottom surface of the second container 3.
  • the culture medium 10 needs to remain in the first container 2A.
  • the distance d between the bottom surface of the first container 2A and the opening end 5A is designed so that the position of the opening end 5A is slightly higher than the position of the outer bottom surface of the second container 3.
  • the medium 10 can be replaced by feeding and draining.
  • the replacement of the culture medium 10 is, for example, mixing the old culture medium 10 accommodated in the second container 3 with the new culture medium 10 and then changing the mixed culture medium 10 from the first container 2A. Means discharging.
  • the culture vessel 1A of Example 1 When culturing the cells 11, the culture vessel 1A of Example 1 is installed in the CO2 incubator, and the ventilation of the CO2 gas and the first vessel 2A from the gap G between the first vessel 2A and the lid 4 are performed. Humidification of the gas inside. In this way, the culture container 1 enables the cells 11 to be cultured in the second container 3.
  • the second container 3 has a bottom having a substance-permeable membrane
  • the first container 2A has an amount of the medium 10 in contact with the outer bottom surface of the second container 3. Need to be retained.
  • the new and old ratio of the medium 10 that is a standard indicating the purity of the mixed medium 10 is, for example, the total amount of the medium 10 held in the first container 2A and the second container 3 by adding the amount of the new medium 10 Determined by the value divided by.
  • the new culture medium 10 is added after the old culture medium 10 held in the first container 2A is discharged.
  • the above-described replacement of the medium 10 may be performed a plurality of times.
  • the medium is supplied to the first container 2A until the liquid level reaches a position higher than the liquid passage part 7 of the second container 3, and the medium 10 in the first container 2A is discharged.
  • Example 2 [Configuration of Culture Container of Example 2]
  • the case where the culture container 1A includes only one second container 3 has been described.
  • Example 2 a case where the culture container includes a plurality of second containers 3 will be described. Below, the structure of the culture container of Example 2 is demonstrated, referring FIG.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of a culture vessel 1B including a plurality of second vessels 3.
  • FIG. 4A is a diagram showing the shape of the inner bottom surface of the first container 2B.
  • FIG. 4B is a plan sectional view of the culture vessel 1B.
  • FIG. 4C is a side sectional view of the culture vessel 1B.
  • 4B is a cross-sectional view taken along line XX ′ in FIG. 4C, and FIG. 4C is taken along line YY ′ in FIG. 4B.
  • FIG. 4A is a diagram showing the shape of the inner bottom surface of the first container 2B.
  • FIG. 4B is a plan sectional view of the culture vessel 1B.
  • FIG. 4C is a side sectional view of the culture vessel 1B.
  • 4B is a cross-sectional view taken along line XX ′ in FIG. 4C
  • FIG. 4C is taken along line YY ′ in FIG. 4B.
  • the first container 2 ⁇ / b> B can accommodate a plurality of second containers 3, and the shape of the bottom of the first container 2 ⁇ / b> B is the shape of a part of the bottom of each of the plurality of second containers 3. And is partially similar.
  • the first container 2B is formed by, for example, injection molding.
  • the inner bottom surface of the first container 2B is subjected to surface treatment such as hydrophilic treatment. Therefore, cell adhesion performance is secured on the inner bottom surface of the first container 2B, and culture and proliferation of adhesive cells and the like are possible.
  • the culture vessel 1B includes the lid 12 and the insertion tube 5, and there is a gap G between the lid 12 and the first vessel 2B.
  • Each of the plurality of second containers 3 is hooked along the edge or upper end of the first container 2B, as in the case of the first embodiment.
  • FIG. 4 three second containers 3 are arranged in one row, but a plurality of second containers 3 may be arranged in a plurality of rows.
  • the first container is shaped so that the second containers 3 can be arranged in a plurality of rows.
  • the shape of the portion of the first container 2B that accommodates the second container 3 may be any shape that conforms to the shape of the second container 3, and may not partially have a circular shape.
  • the shape of the bottom surface of the first container is, for example, a shape having a partially rectangular shape if the bottom surface shape of the second container 3 is rectangular.
  • the area of the inner bottom surface of the first container is set to about 1.5 to 2 times the total bottom surface area of the second container 3 to be arranged. If it does in this way, the quantity of the culture medium 10 required in order to fill a 2nd container can be decreased. In particular, since the medium 10 used for culturing the cells 11 is expensive, the amount used is preferably suppressed.
  • the culture container 1B can culture the cells 11 on the plurality of second containers 3 by the same method as described in Example 1. In that case, unlike the culture container 1A of Example 1, the culture container 1B of Example 2 can exchange the culture media of a plurality of second containers 3 at one time using one insertion tube 5.
  • FIG. 5 is a view showing a cross section of the closed culture vessel 1C.
  • FIG. 5A is a plan sectional view of the closed culture vessel 1C.
  • FIG. 5B is a side cross-sectional view of the closed culture vessel 1C.
  • 5A is a cross-sectional view taken along line XX ′ in FIG. 5B, and
  • FIG. 5B is taken along line YY ′ in FIG. 5A.
  • a packing 13 is provided at a joint portion between the lid 12 and the first vessel 2B, and an exhaust pipe 14 penetrating the lid 12 and a plurality of air / liquid feeding pipes 15 are provided. It becomes the composition.
  • the exhaust pipe 14 exhausts a gas corresponding to the amount from the closed culture vessel 1C when the medium is supplied from the insertion pipe 5 or when the liquid is supplied or supplied from the air / liquid supply pipe 15. Can do.
  • the inside of the closed culture vessel 1C is maintained at the same pressure as the external pressure via the exhaust pipe 14, and the medium, CO2 gas, and the like are smoothly fed or sent into the closed culture vessel 1C.
  • Each of the plurality of air / liquid feeding tubes 15 has an opening end 15 ⁇ / b> A located above the liquid storage portion 8 of each of the plurality of second containers 3 and higher than the liquid passage portion 7, and the second container 3. To the liquid container 8.
  • the same number of air / liquid feeding pipes 15 as the number of installed second containers 3 are provided.
  • the other end opposite to the opening end 15A of the air / liquid feeding tube 15 is connected to a pump (not shown).
  • the cell suspension can be supplied to the second container 3 by operating the pump. That is, the cells can be seeded on the inner bottom surface of the second container 3 through the air / liquid feeding tube 15. Further, by switching the flow path, a gas containing CO 2 can be supplied to the closed culture vessel 1C via the air / liquid feeding tube 15 to adjust the pH of the culture medium to be constant.
  • the above-described method of exchanging the medium 10 can be performed by keeping the pressure constant by the exhaust pipe 14. Further, the CO 2 gas and the cell suspension can be supplied into the closed culture vessel 1C via the air / liquid feeding tube 15, and as a result, the cells are cultured in the closed culture vessel 1C without opening the lid 12. be able to.
  • Example 3 [Configuration of cell culture device] Next, a cell culture apparatus that includes the above-described closed culture vessel 1C and that can automatically culture the cells 11 will be described.
  • FIG. 6 is a diagram showing the configuration of the cell culture apparatus S.
  • the cell culture device S includes a thermostat 16 and a refrigerator 17.
  • the thermostat 16 keeps the closed culture vessel 1 ⁇ / b> C at a temperature suitable for culturing the cells 11.
  • the refrigerator 17 accommodates items that need to be kept cool, such as the drainage bottle 54, the trap bottle 43, and the medium bottle 57.
  • the first cell bottle 21 is a bottle that holds the first cell suspension.
  • the first cell bottle 21 can keep the inside airtight by a lid.
  • the pipe line 22 is provided through the lid and adjusts the atmospheric pressure in the first cell bottle 21.
  • a filter 23 having a mesh size of 0.22 ⁇ m is provided at the open end of the conduit 22 and is open to the outside air of the thermostatic chamber 16.
  • the supply pipe 24 has an open end inside the first cell bottle 21 through the lid, and the open end serves as a discharge port for the cell suspension.
  • the supply pipe 24 is branched into two pipe lines via a branch point 25.
  • One pipe is connected to the first gas introduction valve 26, and the other pipe is connected to the first cell opening / closing valve 27.
  • the branch point 25 is provided above the liquid level of the liquid held in the first cell bottle 21.
  • a filter 28 having a mesh size of 0.22 ⁇ m is provided at the open end of the supply pipe 24 and is open to the outside air in the thermostatic chamber 16.
  • the pipe connected to the first cell opening / closing valve 27 branches into two pipes, one pipe is connected to a common pipe 29 described later, and the other pipe leads to the first gas opening / closing valve 30. Connected to the branch point.
  • a humidifying bottle 31 is connected to the first gas on-off valve 30.
  • a filter 32 having a mesh size of 0.22 ⁇ m and a pressure control valve 33 are connected upstream of the humidifying bottle 31.
  • a gas mixture cylinder 34 containing CO 2 and O 2 is connected upstream of the pressure control valve 33.
  • the mixed gas cylinder 34 is pressurized at a gas concentration suitable for culturing the cells 11.
  • the CO 2 gas derived from the mixed gas cylinder 34 is humidified to a humidity suitable for culturing the cells 11 in the humidifying bottle 31 and waits.
  • the other pipe of the branch point leading to the first gas on-off valve 30 is branched into the suction port and the second gas on-off valve 35 in the first pump P1.
  • the discharge port in the first pump P1 and the second gas on-off valve 35 are integrated into a liquid feed pipe 36. That is, the second gas on-off valve 35 functions as a bypass for the first pump P1.
  • a pipe for feeding a liquid between the suction port of the first pump P1 and the first cell bottle 21 is used as a supply pipe, and between the discharge port of the first pump P1 and the closed culture vessel 1C for cell culture.
  • the liquid feeding pipe is referred to as a liquid feeding pipe 36.
  • the liquid supply pipe 36 is branched by a multi-branch portion 37 and is connected to the air supply / liquid supply pipe 15 via a plurality of air supply / liquid supply valves 38, 39, 40 in the closed culture vessel 1C.
  • the exhaust pipe 14 provided in the closed culture vessel 1C is connected to the trap bottle 43 by the atmospheric pressure control pipe 42 via the exhaust opening / closing valve 41.
  • the pipe 44 is a pipe for adjusting the atmospheric pressure provided on the lid of the trap bottle 43, and a filter 45 having a mesh size of 0.22 ⁇ m is provided at the open end of the pipe 44 to open to the outside of the thermostatic chamber 16. is doing.
  • the second cell bottle 46 is a bottle for holding a cell suspension or the culture medium 10.
  • the second cell bottle 46 has the same configuration as that of the first cell bottle 21, and the lid, the pressure adjustment conduit, the filter, and the supply pipe 47 included in the second cell bottle 46 correspond to the first cell bottle 21. Plays the same role as the component.
  • the configurations of the supply pipe 47, the branch point 48, the second gas introduction valve 49, and the second cell opening / closing valve 50 also play the same role as the corresponding components of the first cell bottle 21.
  • the supply pipe 47 is branched into two via the second cell opening / closing valve 50, one pipe is connected to the common pipe 29, and the other pipe is connected to the suction port of the second pump P2.
  • a supply pipe 51 extending from the discharge port of the second pump P2 is branched into two via a liquid feeding valve 52, one of the pipes is connected to the insertion pipe 5 in the closed culture vessel 1C, and the other pipe Is connected to the first discharge valve 53. That is, the cell suspension or the culture medium 10 in the second cell bottle 46 is supplied to the first container 2B in the closed culture container 1C by the action of the second pump P2.
  • the drainage bottle 54 is connected to a drainage pipe 55 in an airtight manner. Further, the drainage bottle 54 is provided with a pipe for adjusting the atmospheric pressure provided in one of the lids and a filter at the opening end thereof.
  • the drainage pipe 55 is connected to the discharge port of the third pump P3 via the second discharge valve 56.
  • the suction port of the third pump P3 is connected to the first discharge valve 53. That is, the liquid stored in the first container 2B in the closed culture container 1C is discharged by the action of the third pump P3, and is collected from the first discharge valve 53 through the drain pipe 55 to the drain bottle 54. .
  • the medium bottle 57 is a bottle that holds the replacement medium 10 and is held in the refrigerator 17.
  • the culture medium bottle 57 has the same configuration as the first cell bottle 21, and the lid, the pressure adjustment conduit, the filter, and the supply pipe 58 provided in the culture medium bottle 57 are the same as the corresponding components of the first cell bottle 21.
  • the configuration of the supply pipe 58, the branch point 59, and the third gas introduction valve 60 also plays the same role as the corresponding component of the first cell bottle 21.
  • the suction port of the fourth pump P4 is connected to the supply pipe 58.
  • the medium preheating bottle 61 is a bottle that holds a necessary amount of the medium 10 for replacement.
  • the culture medium preheating bottle 61 and the discharge port of the fourth pump P4 are connected via a branch point 62 that the supply pipe 63 has.
  • the medium preheating bottle 61 is held inside the thermostatic chamber 16. That is, the medium 10 held by the medium bottle 57 is supplied to the medium preheating bottle 61 by the action of the fourth pump P4.
  • the culture medium preheating bottle 61 has the same configuration as that of the first cell bottle 21, and the lid, the pressure adjustment pipe, the filter and the supply pipe 63 provided in the culture medium preheating bottle 61 correspond to the corresponding components of the first cell bottle 21.
  • the configuration of the supply pipe 58, the branch point 59, and the third gas introduction valve 60 also plays the same role as the corresponding component of the first cell bottle 21.
  • the configurations of the supply pipe 63, the branch point 64, the fourth gas introduction valve 65, and the medium opening / closing valve 66 also have the same role as the corresponding components of the first cell bottle 21.
  • the supply pipe 63 is connected to the common pipe 29 via the branch point 64 and the medium opening / closing valve 66 and branches.
  • One branched pipe is connected to the supply pipe 24 extending from the first cell bottle 21 via the first cell opening / closing valve 27, and the other is connected to the supply pipe 47 extending from the second cell bottle 46 and the second cell opening / closing. Connected via a valve 50.
  • the common pipe 29 is connected to three on-off valves including the first cell on-off valve 27, the second cell on-off valve 50, and the medium on-off valve 66. If the first cell opening / closing valve 27 and one of the air / liquid feeding valves 38, 39, 40 are open when the first pump P1 is activated, the first cell The cell suspension in the bottle 21 is supplied to one of the plurality of second containers 3 in the closed culture container 1C.
  • the second pump P2 when the second pump P2 is operated, if the second cell opening / closing valve 50 and the liquid feeding valve 52 are opened, the cell suspension or the medium 10 in the second cell bottle 46 is removed from the first container in the closed culture container 1C. Supply to 2B. Further, when the second pump P2 is operated, if the medium opening / closing valve 66 and the liquid feeding valve 52 are opened, the medium 10 held in the medium preheating bottle 61 is supplied to the first container 2B in the closed culture container 1C.
  • the closed culture vessel 1C is installed on the inclination stage 67.
  • the inclination stage 67 is kept horizontal during normal culture.
  • One end of the inclination stage 67 is supported by the link mechanism 68, and the other end is supported by an actuator 69 driven in the vertical direction.
  • the actuator 69 When draining the culture medium 10 accommodated in the closed culture vessel 1C, if the actuator 69 is driven so that the bottom surface of the first vessel 2B on the insertion tube 5 side is downward, the first vessel 2B is held in the first vessel 2B. Among the applied liquids, the liquid at a position far from the opening end 5A can be collected and discharged earlier. At that time, the inclination of the inclination stage 67 can be designed arbitrarily.
  • the actuator 69 when sending the liquid to the closed culture vessel 1C, if the actuator 69 is driven so that the bottom surface on the insertion tube 5 side in the first vessel 2B is upward, among the liquids held in the first vessel 2B, The liquid at a position far from the opening end 5A can be dispersed and fed faster.
  • FIG. 7 is a flowchart showing a flow of cell culture operation in the cell culture apparatus S.
  • the cell culture device S is controlled by a controller (not shown).
  • the flowchart starts from a process (S01) of installing a pipe line in a thermostat. Thereafter, the first cell bottle 21 holding the prepared cell suspension and the second cell bottle 46 holding the culture medium 10 are connected to the pipeline (S02).
  • the cell culture device S fills the closed culture vessel 1C with gas (S03). Thereafter, the cell culture device S sends the medium 10 to the first container 2B (S04), and then sends the cell suspension to the second container 3 (S05). The cell culture device S immediately feeds the humidified gas to the closed culture vessel 1C, and keeps the thermostatic bath at a constant temperature (S06).
  • the cell culture device S determines whether to start the exchange of the medium 10 according to the progress of the cell culture (S07). When the medium 10 does not need to be replaced (NO in S07), the cell culture device S returns to the process of S06. When the medium 10 needs to be replaced (YES in S07), the cell culture device S sends a predetermined amount of the medium 10 from the medium bottle 57 to the medium preheating bottle 61 (S08), and is sufficiently preheated to the first container 2B. A new medium 10 is supplied (S09), and then the medium 10 is discharged from the first container 2B (S10).
  • the cell culture device S supplies the first container 2B with an amount of the medium 10 in which the liquid level of the medium 10 is higher than the height of the liquid passage portion 7 of the second container 3.
  • the cell culture device S supplies the medium 10 to the first container 2B for the operating time of a pump that is determined in advance by experiments.
  • the cell culture device S continues to supply humidified gas and stand still (S11), and determines whether or not to end the cell culture depending on the progress of cell culture (S12).
  • the cell culture device S performs replacement of the medium 10 again.
  • the closed culture vessel 1C is collected from the automatic device, and the cultured cells 11 are taken out manually (S13).
  • the drainage bottle 54 is collected and tested for bacteria (S14), the used pipeline is removed from the thermostatic chamber 16 (S15), and the process ends (END).
  • FIG. 8 shows a time chart of liquid feeding and air feeding processing in the closed culture vessel 1C.
  • the liquid supply and air supply processes are controlled by a controller (not shown).
  • the horizontal axis of FIG. 8 shows the operation items and the time axis, and the vertical axis shows the operation timing of the plurality of solenoid valves and the first pump P1 to the fourth pump P4 shown in FIG.
  • the initial state all solenoid valves and pumps are OFF. That is, all the solenoid valves are closed, and the pump is in a state of stopping liquid feeding.
  • each operation item described on the horizontal axis of FIG. 8 will be described.
  • the operation item of “CO2 gas filling” corresponds to the process of filling the inside of the closed culture vessel 1C with CO2 gas (S03 in FIG. 6).
  • the air supply / liquid supply valve 40, the second gas on / off valve 35, and the exhaust on / off valve 41 are turned on from OFF to open the valves, the first gas on / off valve 30 and the air supply / liquid supply valve 40 communicate with each other.
  • the flow path to the liquid pipe 15 is communicated.
  • the exhaust opening / closing valve 41 communicates from the filter 74 communicating with the outside air, and the conduit from the filter connected to the outside air to the exhaust pipe 14 communicates.
  • the CO 2 gas reaches the humidification bottle 31 from the mixed gas cylinder 34 and is humidified.
  • the appropriately humidified CO2 gas reaches the closed culture vessel 1 ⁇ / b> C through the air / liquid feeding tube 15 from the air / liquid feeding valve 40.
  • the closed culture vessel 1C is sealed, the pressure from the exhaust pipe 14 inserted into the closed culture vessel 1C to the filter 45 leading to the outside air is opened, so that the pressure inside the closed culture vessel 1C is balanced with the atmospheric pressure. .
  • the first gas on-off valve 30 is first closed, then the second gas on-off valve 35 is closed, and the pressure in the closed culture vessel 1C becomes equal to the atmospheric pressure. When closing the other valve.
  • the operation item of “medium addition” corresponds to the process of feeding the medium 10 to the first container 2B in the closed culture container 1C (S04 in FIG. 6).
  • the second cell opening / closing valve 50, the liquid feeding valve 52, and the exhaust opening / closing valve 41 are turned on from the OFF state and these valves are opened, the second cell opening / closing valve 50 and the liquid feeding valve are opened from the second cell bottle 46. Via, the flow path to the insertion tube 5 is communicated. Further, a pipe line from the filter 45 connected to the outside air to the exhaust pipe 14 communicates.
  • the feeding of the medium 10 from the second cell bottle 46 is started, and when the predetermined amount of liquid is in the pipeline downstream from the branch point 48, the feeding of the second pump P2. Stop once. Subsequently, when the second gas introduction valve 49 is opened, outside air is introduced from the filter 70 and the culture medium 10 in the tube from the branch point 48 to the second cell bottle 46 returns to the second cell bottle 46 due to a drop.
  • a predetermined liquid amount is fed from the insertion tube 5 of the closed culture vessel 1C.
  • the exhaust pipe 14 inserted into the closed culture vessel 1C is opened to the filter 45 communicating with the outside air, the pressure inside the closed culture vessel 1C is balanced with the atmospheric pressure.
  • the second pump P2 is stopped, the opened valves are turned OFF to close them, and the liquid feeding is finished.
  • the operation item of “cell seeding” corresponds to a process of seeding cells in the second container 3 in the closed culture container 1C (S05 in FIG. 6).
  • the air / liquid feeding valve 40 and the exhaust gas opening / closing valve 41 are turned ON and these valves are opened, the first cell opening / closing valve 27 and the air feeding / fluidizing valve 40 are switched from the first cell bottle 21. Via, the flow path to the air / liquid feeding pipe 15 is communicated. Further, a pipe line extending from the filter 45 communicating with the outside air to the exhaust pipe 14 through the exhaust opening / closing valve 41 is communicated.
  • the first pump P1 when the first pump P1 is turned on for a predetermined time, the cell suspension liquid feeding from the first cell bottle 21 is started, and when the predetermined liquid amount is in the pipeline downstream from the branch point 25, the first pump P1 Stop feeding the solution. Subsequently, when the first gas introduction valve 26 is opened, outside air is introduced from the filter 28 and the cell suspension in the tube from the branch point 25 to the first cell bottle 21 returns to the first cell bottle 21 due to a drop. When liquid feeding of the first pump P1 is started again, a predetermined liquid amount is fed from the air feeding / feeding tube 15 of the closed culture vessel 1C.
  • an amount of cell suspension that can be distributed to a plurality of cell culture containers is held in advance in the first cell bottle 21, and the air / liquid supply valve 40 is closed in the above operation. If the air / liquid feeding valve 39 is opened and the above operations are repeated sequentially, the same amount of the cell suspension is fed to the other second container 3 in the closed culture container 1C.
  • the next operation item for CO2 gas filling corresponds to the processing for filling the inside of the closed culture vessel 1C with CO2 gas (S06), and the same processing as the operation item for CO2 gas filling described above is performed.
  • the cell suspension In culturing the cells 11, the cell suspension is held in the second container 3, the internal space of the closed culture container 1C is filled with appropriately humidified CO2 gas, and the closed culture container 1C is held at an appropriate temperature. It is left standing for a predetermined time in a state of being, and is continued. Since the cells 11 contained in the cell suspension grow by adhering to the upper surface of the substance-permeable membrane that forms the inner bottom surface of the second container 3, the medium 10 whose components have changed with the culture is separated from the cells 11. Can be discharged.
  • observation is performed using a microscopic observation unit (not shown) to obtain cell growth information.
  • a phase contrast microscope is preferably used for microscopic observation, but an inverted optical microscope or the like may be used. If there is an imaging function, the observation progress of the cells 11 during the culture can be recorded, and the cell culture can be more suitably performed.
  • the operation item of “medium preheating liquid feeding” corresponds to the process (S08) of exchanging the medium 10 in the closed culture vessel 1C.
  • the culture medium bottle 57 communicates with the culture medium preheating bottle 61 via the fourth pump P4.
  • the culture medium preheating bottle 61 is connected to a filter that communicates with the outside air from the lid.
  • the fourth pump P4 supplies the amount of the medium 10 that is the sum of the amount of the medium 10 supplied to the closed culture container 1C and the volume of the conduit from the medium preheating bottle 61 to the closed culture container 1C from the medium bottle 57 to the medium preheating bottle. Transport to 61.
  • the culture medium 10 existing in the pipeline from the branch point 59 to the culture medium bottle 57 is transferred to the culture medium bottle 57 by atmospheric pressure. Pushed back. As a result, it is possible to obtain a target amount of the medium 10 whose rear end is the branch point 59 and whose front end is the medium preheating bottle 61.
  • the fourth pump P4 when the fourth pump P4 is operated, the medium 10 is transported into the medium preheating bottle 61. At this time, since the culture medium preheating bottle 61 communicates with the outside air through the filter, it is balanced with the atmospheric pressure. After the target amount of the culture medium 10 is transported to the culture medium preheating bottle 61, the fourth pump P4 is stopped, the opened valves are turned off, and the liquid feeding is finished.
  • the amount of the medium 10 transported from the medium bottle 57 to the medium preheating bottle 61 is determined, for example, from the number of the second containers 3 provided in the closed culture container 1C, the number of times the medium 10 is replaced, and the like.
  • the operation item of “medium feeding” corresponds to the process of feeding the medium 10 to the first container 2B (S09).
  • the medium opening / closing valve 66, the liquid feeding valve 52, and the exhaust opening / closing valve 41 are turned ON, and the valves are opened.
  • the flow path from the culture medium preheating bottle 61 to the insertion tube 5 communicates via the culture opening / closing valve 66 and the liquid feeding valve 52.
  • the inside of the closed culture vessel 1C is balanced with the atmospheric pressure through the filter 45, the trap bottle 43, the exhaust opening / closing valve 41, and the exhaust pipe 14 communicating with the outside air.
  • the second pump P2 is turned on for a predetermined time, the medium 10 is sucked from the medium preheating bottle 61, and when the desired amount of the medium 10 is in the pipeline downstream from the branch point 64, the second pump P2 is operated. Stop once. Subsequently, the fourth gas introduction valve 65 is opened, and the medium 10 existing below or upstream from the branch point 64 is returned to the medium preheating bottle 61 by the pressure difference.
  • the second pump P2 again, a predetermined amount of the medium 10 is transported into the closed culture vessel 1C via the insertion tube 5. At this time, since the exhaust pipe 14 communicates with the outside air, the pressure inside the closed culture vessel 1C is balanced with the atmospheric pressure. After a predetermined amount of the medium 10 has been injected into the closed culture vessel 1C, the operation of the second pump P2 is stopped, and the opened valves are turned off to complete the liquid feeding.
  • the operation item of “medium discharge” corresponds to the process of discharging the medium 10 from the first container 2B (S10).
  • the first discharge valve 53, the second discharge valve 56, and the exhaust opening / closing valve 41 are turned ON to be opened. Then, the flow path from the drainage bottle 54 to the insertion tube 5 is communicated via the second discharge valve 56, the third pump P 3, and the first discharge valve 53. Further, the pressure in the space in the closed culture vessel 1C is balanced with the pressure of the outside air through the exhaust pipe 14, the exhaust on-off valve 41, the trap bottle 43, and the filter 45.
  • the third pump P3 when the third pump P3 is operated for a predetermined time, the medium 10 is sucked from the first container 2B while the medium 10 is left in the liquid container 8 of the second container 3, and the sucked medium 10 is drained.
  • the bottle 54 is reached.
  • the closed culture vessel 1C is in balance with the external pressure because the exhaust on-off valve 41 is open.
  • each electromagnetic valve is turned off, and the liquid feeding is finished.
  • the thermostat 16 was operated using a thermostat (model number: TVHA60WA12A, Toyo Seisakusho Co., Ltd.) at an internal temperature of 37 ° C. Moreover, the refrigerator 17 used the electronic cold / cold low temperature thermostat (model number: THS030PA, Toyo Manufacturing Co., Ltd.), and operated the internal temperature at 4 degreeC.
  • a pinch valve (fluid pressure 0.15 MPa, model number: PSK-1615NC-9, Takasago Electric Industry Co., Ltd.) was used as the solenoid valve.
  • a silicon rubber tube (inner diameter 1/16 inch, outer diameter 1/8 inch, model number: 3350, Saint-Gobain) was used as a supply pipe corresponding to the solenoid valve.
  • Each pump is a tube pump (discharge / suction pressure +/- 0.1 MPa, model number: DSW2-S1AA-WP, Welco) and a silicon rubber tube (inner diameter 1/16 inch, outer diameter 1/8 inch) as a tube for ironing. (Model number: 3355L, Saint-Gobain) was used. Since the roller part is removable from the motor part of the main body, the pump can be sterilized with a silicone rubber tube (13 cm long) wrapped around the roller part. The flow rate of the pump was measured to be 0.15 mL / second at DC 12 V input.
  • a closed system centrifuge tube (capacity 50 mL, model number: # 11706, Corning) was used for the cell bottle.
  • a closed system centrifuge tube (capacity 500 mL, model number: # 11750, Corning) was used for the medium bottle.
  • This product consists of a container portion sterilized in advance, a lid portion, a supply pipe provided on the lid portion, and a pipe line with a filter having a mesh size of 0.22 ⁇ m for adjusting the atmospheric pressure.
  • a Flexboy bag (EVA, EVOH double structure, capacity 0.5 L, model number: # FFB102670, Sartorius) was used as the drainage bottle.
  • the humidification bottle has a gas cleaning bottle (capacity 500 mL, model number: 6-129-02, ASONE) that combines a gas exchange part with a kerami filter (filter size 15 x 15 mm, model number: 2-554-10, ASONE). Used).
  • Midisart 2000 (mesh size 0.22 ⁇ m, model number: # 17805-E, Sartorius Co., Ltd.) was used as a gas inlet valve or a filter in contact with the outside air of the humidifying bottle.
  • Tygon ND-100 inner diameter 1/16 inch, outer diameter
  • non-DEHP-PVC (Di (2-EthylHexyl) Phthalate)-PolyVinylChloride) for tubes other than the solenoid valve closing part and the pumping part. 1/8 inch, model number: # ADF00002, Saint-Gobain
  • SMC coupling (CPC) series was used for branching and joining the tubes. Specifically, Y Fitting (joint diameter 1/16 inch, model number: # HY291) was used for the bifurcated joint, and Straight Fitting (joint diameter 1/16 inch, model number: # HS291) was used for the linear connection.
  • the first container 2B was made by injection molding using polycarbonate as a material.
  • a cell culture insert (model number: 353180, Corning) was used for the second container 3 holding the cells 11.
  • Corneal epithelial cells were collected from the corneal limbs of rabbit eyeballs purchased from Funakoshi by a known technique, suspended in a medium so as to be 4 ⁇ 10 4 / cm 2, and held in a cell bottle.
  • KCM medium containing 5% FBS was used as the medium.
  • 500 mL of KCM medium was held in a medium bottle and installed in the apparatus refrigerator.
  • the amount of the medium 10 newly supplied to the first container 2B was 0.7 ml. Moreover, the discharge amount of the culture medium 10 was 3 ml including gas so that the culture medium 10 was not left outside the liquid container 8 of the second container 3 as much as possible.
  • the concentration of the gas to be sent was 5% CO2, 20% O2, and 75% N2.
  • the humidified gas to be supplied was controlled to a humidity of 95% RH. The amount of humidified gas supplied was injected in excess of the internal volume of the closed culture vessel 1C. In this experimental example, the humidified gas was supplied at 80 cc / min for 2 minutes to the inner volume of 5 cm 3 of the closed culture vessel 1C.
  • the processing flow when culturing the cells 11 was as shown in FIG.
  • the medium 10 was replaced on the fifth, seventh, ninth, tenth, eleventh, twelfth, thirteenth, fourteenth, fifteenth, fifteenth and sixteenth days from the culture start date. Each was carried out once.
  • the humidified gas was supplied 42 times a day every 20 minutes.
  • Observation of the culture state of the cells 11 was performed once a day with a microscope from the fifth day after the start of the culture. Specifically, ten areas were defined on the bottom surface where the cells 11 of the second container 3 were cultured, and the observation results of the culture state were used as judgment data for each area. (Method for collecting corneal epithelial tissue)
  • Cell culture insert (model number: 353180, Corning) was used as a culture dish. Using a CO2 incubator (model number: MCO19-AIC, Sanyo Electric Co., Ltd.), setting the environmental temperature to 37 ° C, setting the humidity to 95% RH, setting the CO2 concentration to 5%, and culturing cells 11 Carried out.
  • the control cells were the same as the corneal epithelial cells described above.
  • the seeding of the cells 11 and the replacement work of the culture medium 10 were performed manually, and the same amount of liquid as in the experimental example was added using a sterilized dispenser (Pipetteman (registered trademark), model number: P5000, GILSON). .
  • the replacement frequency and interval of the medium 10 were the same as in the experimental example.
  • the control of CO 2 gas was set to the same during the culture period of the cells 11.
  • the culture dish was placed on a 37 ° C. hot plate and the operation was carried out to maintain the temperature of the culture dish. (Comparison between experimental example and control experiment)
  • the corneal epithelial cells produced in the cell culture apparatus S of this example were sheet-like cells and had a certain thickness.
  • the corneal epithelial cells could be stably peeled and collected.
  • no abnormality was found in the growth of the cell 11.
  • it was a shape equivalent to the cell 11 grown in the control experiment.
  • the number of cells after culturing was about 50 times (converted amount) of the number of seeded cells, and was comparable to the results of the control experiment.
  • CK protein family expressed in epithelial cells In both experimental examples and controls, CK3 expressed in differentiated corneal epithelial cells is expressed in cells other than the basal layer, and claudin 1 which is a closed binding protein necessary for the barrier function of epithelial tissue is the outermost layer. There was no significant difference.
  • the cell culture device S includes, for example, the first container 2B, the liquid passage portion 7 that allows the liquid to flow in or out, the liquid storage portion 8 that stores the liquid that flows in, and the liquid storage portion 8.
  • a holding portion 9 that is connected to a part of the edge and holds the liquid storage portion 8, and the other end of the holding portion 9 is detachably hooked on the upper end portion of the first container 2 ⁇ / b> B, And a second container 3 housed in the container.
  • the cell culture device S of the present disclosure includes a lid 12 that covers the first container 2B, and the lid 12 that passes through the lid 12, is inside the first container 2B and outside the second container 3, and the liquid in the second container 3
  • 5A is provided, and an air / liquid feeding pipe 15 for feeding the liquid container 8 of the second container 3 is provided.
  • the other end of the insertion pipe 5 opposite to the opening end 5A has a valve that can be opened and closed.
  • the cell culture device S having the above-described configuration can suppress the influence on the growing state of the cells 11 being cultured when the culture medium 10 is supplied. Moreover, the cell culture apparatus S can avoid the influence which impairs the reproducibility of the culture result of the cell 11. This is because the position of the open end 5A of the insertion tube 5 where the flow of the culture medium 10 becomes faster is more distant than the location where the cells 11 are cultured, and the side wall of the liquid container 8 of the second container 3 is separated. It is because the influence by the flow rate of the culture medium 10 is suppressed by performing the fluid supply / drainage.
  • the cell culture device S of the present disclosure may include a plurality of second containers 3 and a plurality of air supply / liquid supply tubes 15 corresponding to the plurality of second containers 3.
  • the cell culture device S can culture the cells 11 in the plurality of second containers 3, and can uniformly reduce the influence of the flow rate on the cells 11 accommodated in each second container 3.
  • tubes can be reduced.
  • the number of the insertion tubes 5 for feeding and draining the liquid used for the first container 2B is one regardless of the number of the second containers 3, and the exhaust is performed.
  • the number of pipes can be 2 + N. Therefore, the cell culture device S can further reduce the number of tubes per culture container when the number of culture containers increases. That is, the cell culture device S of the present disclosure can increase the number of cell cultures per unit area and highly integrate the cells 11 to be cultured as compared with the prior art, and the culture efficiency is improved.
  • the cell culture device S also includes the exhaust pipe 14 that balances the pressure inside the closed culture vessel 1C with the atmospheric pressure. Therefore, the cell culture device S of the present disclosure can automatically perform all the consistent cell culture work steps from cell seeding to medium exchange. Furthermore, since the cell culture apparatus S can maintain cell lines and culture vessels in contact with the cells 11 and the culture medium 10 in a sterile state, the cell 11 obtained by culturing can be safely treated. Can be used.
  • the closed culture vessel 1C of the present disclosure is installed on the inclination stage 67 and can be inclined at the time of draining and feeding. Therefore, the cell culture device S of the present disclosure can efficiently feed and drain the liquid by slightly accelerating the flow of the medium 10, and the variation in the shape between the containers in the liquid feeding amount and the draining amount. It is possible to reduce individual differences in the amount of liquid delivered and the amount of drainage caused by.
  • the cell culture device S of the present disclosure can reduce variation in ventilation due to air supply, unlike the case where the cells 11 are cultured using a plurality of conventional closed culture vessels.
  • the reason is that the pipe resistance connected to the closed culture vessel is different, and the amount of gas flowing through the closed culture vessel changes.
  • the culture container 1B includes a plurality of second containers 3, and the shape of the bottom of the first container 2B is partially the same as the shape of a part of the bottom of each of the plurality of second containers 3. It may be similar to If it does in this way, the supply amount of the new culture medium 10 required for replacement
  • an opening O through which a liquid can flow from the same height as the position of the liquid passage portion 7 may be provided in the holding portion 9. If it does in this way, it will become difficult to produce the position shift of the 2nd container 3 which can reduce the drag which the 2nd container 3 receives from culture medium 10.
  • the bottom surface of the second container 3 may be a substance permeable membrane that allows the culture medium 10 to permeate. If it does in this way, when supplying culture medium 10 to the 1st container 2B in order to exchange culture medium 10, the 2nd container 3 becomes difficult to lift.
  • the cell culture device S of the present disclosure may be installed semi-fixed so that the insertion tube 5 can change the height of the opening end A. If it does in this way, the quantity of the culture medium 10 discharged
  • the present disclosure is not limited to the above-described embodiment, and includes various modifications.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.
  • the present invention is useful as a culture vessel and a cell culture apparatus for culturing cells.

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Abstract

細胞培養方法は、第１容器と、液体を流入又は流出させる液体通過部を有し、第１容器の内部に収納された第２容器と、を備える培養容器を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、第２容器に細胞を播種するステップと、液面が第２容器の液体通過部よりも高い位置に達するまで第１容器へ培地を供給するステップと、第１容器内の培地を排出するステップと、を含む。

Description

細胞培養方法、培養容器及び細胞培養装置
　本開示は、細胞培養方法、培養容器及び細胞培養装置に関するものである。
　従来、患者本人又は他人の細胞を用いて疾病の治療を行う再生医療において、生体から採取した細胞を培養容器で培養することが行われている。細胞は、上記培養容器内に収容された培地において当該培地から養分を摂取して成長する。
　細胞を培養する際は、細胞が成長するのに欠かせない養分を補給するなどの理由から、必要に応じて培地を補充又は交換する。細胞を治療に用いる場合、細菌の感染等を防ぐためにクリーンな環境で培養する必要があり、上記培地の補充作業又は交換作業も生物学的汚染リスクが低減された環境において実施される。上記クリーンな環境を提供する手段としては、細胞の培養を自動で行える自動培養装置がある。
　特許文献１には、培地が収容されている細胞培養部の上方に備えられた培地貯留部から培地を供給し、細胞培養部内に収容されている培地の液位が所定の液位に達したときに培地を細胞培養部外に流出させる、培地交換作業の自動化技術が開示されている。
　また、特許文献２には、薬品バッグから培地を培養器に送液するための送液チューブと培地を交換する際に使用済みの培地を培養器から排出するための排出チューブとを備えた自動培養装置が開示されている。
特開２００４－８９１３７号公報 特開２００７－２２２１２０号公報
　上記の特許文献２に記載された自動培養装置では、培地の排出口となる排液管の開口端が培養容器内に位置する。そのため、培地の排出を行うと上記開口端付近に強い流れが生じ、培養する細胞にストレスを与えている可能性があった。
　また、上記自動培養装置では、培養容器に培地を供給するための送液管と培養容器から培地を排出するための排液管との位置が固定されているため、培地が分注器等を用いた手技によってばらばらな位置で吸入される場合と異なり、排液管の開口端付近で育成される細胞と上記開口端から遠い位置で育成される細胞とで育成状態に差異が生じえた。即ち、細胞培養の再現性が損なわれる原因となっていた。さらには、上記自動培養装置は、細胞を培養する培養容器ごとに培地の排出管を必要とするため、培養装置が大きくなり高コストでもあった。
　特許文献１に記載された培養装置は、供給した培地の量と同じ量の培地が培養容器が排出される仕組みとなっており、培地を供給すると必然的に培養容器内に培地の流れが生じていた。また、上記培養装置では、培地を排出するための排液管の開口端が培養容器内に位置していないものの、培地を供給するための供給管の位置が固定されている。そのため、上記培養装置では、特許文献２に記載された自動培養装置と同様に、細胞培養の再現性が損なわれている可能性があった。
　本開示は、上記の点に鑑みて為されたものであり、細胞培養の再現性を向上させ、送液に伴う培養細胞の育成状態への影響を抑制できる技術を提供する。
　本開示は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例を挙げるならば、第１容器と、液体を流入又は流出させる液体通過部を有し、前記第１容器の内部に収納された第２容器と、を備える培養容器を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、前記第２容器に細胞を播種するステップと、液面が前記第２容器の前記液体通過部よりも高い位置に達するまで前記第１容器へ培地を供給するステップと、前記第１容器内の前記培地を排出するステップと、を含む細胞培養方法を提供する。
　上記課題を解決する手段の別の例として、第１容器と、液体を流入又は流出させる液体通過部と流入した前記液体を収容する液体収容部とを有し、前記第１容器の内部に着脱可能に収納される第２容器と、前記第１容器を覆う蓋と、前記蓋を貫通し、前記第１容器の内部且つ前記第２容器の外部であって、前記第２容器の前記液体通過部よりも低い位置に開口端が位置する挿入管と、を備える培養容器を提供する。
　上記課題を解決する手段のさらに別の例として、第１容器と、液体を流入又は流出させる液体通過部と流入した前記液体を収容する液体収容部とを有し、前記第１容器の内部に着脱可能に収納される複数の第２容器と、前記第１容器を覆う蓋と、前記蓋を貫通し、前記第１容器の内部且つ前記第２容器の外部であって、前記第２容器の前記液体通過部よりも低い位置に開口端が位置する挿入管と、を備え、前記挿入管の前記開口端と反対側の他端は、開閉可能な第１の弁を有し前記第１容器に液体を供給する供給管と、開閉可能な第２の弁を有し前記第１容器から液体を排出する排液管と、に接続されている、細胞培養装置を提供する。
　本開示によれば、細胞培養の再現性を向上させ、送液に伴う培養細胞の育成状態への影響を抑制できる技術を提供することができる。上記以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
実施例１の培養容器の構造を示す図である。 第２容器の構成を説明するための図である。 細胞培養で行われる培地の交換方法を説明するための図である。 第２容器を複数備える培養容器の例を示す図である。 閉鎖培養容器の断面を示す図である。 細胞培養装置の構成を示した図である。 実施例１記載の細胞培養装置の制御フローである。 実施例１記載の細胞培養装置の制御タイムチャートである。
　以下、添付図面を参照して本開示の種々の実施例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本開示の技術的範囲を限定するものではない。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。なお、本明細書において「培地」は、特にことわりがない限り液体の培地をさす。
［実施例１］
　以下、本開示の培養容器及びそれを用いた細胞培養装置の実施例１を説明する。
　図１は、実施例１の培養容器１Ａの構造を示す図である。図１（Ａ）は培養容器１Ａの平面断面図を示し、図１（Ｂ）は培養容器１Ａの側面断面図を示す。図１（Ａ）は、図１（Ｂ）のＹ-Ｙ’線に沿った断面図であり、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＸ-Ｘ’線に沿った断面図である。
　培養容器１Ａは、第１容器２Ａと、第１容器２Ａ内に収容される第２容器３と、第１容器２Ａ及び第２容器３の上方開口を覆う蓋４と、蓋４を貫通する挿入管５と、第２容器３と蓋４との間に設けられた抑え部品６とを備える。蓋４は、例えば、第１容器２Ａと第２容器３とが収容する培地が蒸発するのを防ぐと供に培養容器１Ａに細菌が侵入して細胞が感染するのを防ぐ。図１（Ｂ）に示すように、蓋４と第１容器２Ａとの間には隙間Ｇがある。隙間Ｇは、例えばＣＯ２ガスが第１容器２Ａに流入する際又は第１容器２Ａから流出する際の通路となる。
　挿入管５の開口端５Ａは、第１容器２Ａの内部且つ第２容器３の外部であって、後述する第２容器３の液体通過部よりも低い位置に位置し第１容器２Ａの底面に開放している。挿入管５の上記開口端５Ａと反対側の他端は、図示しない送液手段であるポンプに接続されている。抑え部品６は、第１容器２Ａが培地で満たされた際に、浮力で第２容器３が位置ずれしないように、第２容器３を半固定する部品である。
　培養容器１Ａは円筒形状であって、例えば、ポリカーボネート（以下、ＰＣ）、ポリスチレン（以下、ＰＳ）、ポリプロピレン（以下、ＰＰ）等のプラスチック材料によって形成される。第１容器２Ａは、例えば射出成形により形成される。
　第１容器２Ａの内側底面は、親水性処理などの表面処理が為されている。そのため、第１容器２Ａの内側底面は、細胞接着性能が確保されており、接着性細胞等の培養及び増殖が可能である。同様に、第２容器３は、例えば射出成形により形成される。第２容器３の内側底面は、親水性処理などの表面処理が為されている。そのため、第２容器３の内側底面は、細胞接着性能が確保されており、接着性細胞等の培養及び増殖が可能である。
　図２は、第２容器３の構成を説明するための図である。第２容器３は、液体を流入又は流出させる液体通過部７と、流入した液体を収容する液体収容部８と、液体収容部８のふちの一部と接続され液体収容部８を保持する保持部９と、を有する。第２容器３は、保持部９の他端が第１容器２Ａの上端部に着脱可能に掛止されて第１容器２Ａの内部に収納されている。したがって、第１容器２Ａのふちの高さは、第２容器３の液体通過部７の高さよりも高い。或いは、第１容器２Ａのふちの高さは、第２容器３の液体収容部８のふちの高さよりも高い。
　液体通過部７は、第１容器２Ａに供給された培地の液面が液体通過部７の高さに達したときに、培地を液体収容部８に流入させ、また、液体収容部８に満たされていた培地が新しい培地と混合し始める。したがって、第１容器２Ａにおける液体保持量は、液体通過部７の第１容器２Ａの底面からの高さを設定することにより決まる。また、図２に示すように、保持部９には液体通過部７の位置と同じ高さから液体が液体収容部８に流入できる開口部Ｏが設けられてもよい。この場合、液体収容部８には複数の方向から液体が流入する。
［培地の交換方法］
　図３は、細胞培養で行われる培地１０の交換方法を説明するための図である。図３における培地の交換及び細胞の播種は、例えば、メスピペットを用いて手技によって実施されてもよく、挿入管５を利用して培地の交換を実施してもよい。図３（Ａ）は、第２容器３に培地１０が収容され細胞１１が播種された状態を示している。図３（Ａ）に示した図は、培地１０を交換する前の状態を示し、第１容器２Ａには培地１０がまだ供給されていない。
　図３（Ｂ）は、挿入管５から供給される新しい培地１０と第２容器３に収容されている細胞１１の培養に供した培地１０とが混合する様子を示している。培地１０は、図示しないポンプによって挿入管５を介して第１容器２Ａ内に供給され、供給された培地１０の液面が第２容器３の液体通過部７の高さに到達する。その後、所望量の送液を継続すると、培地１０は第２容器３内部に流出し第２容器３内の培地１０と混合する。なお、本明細書では、細胞１１の培養に供した古い培地１０とポンプによって挿入管５から供給される新しい培地１０とそれらが混合した培地１０とは、それぞれ、同じ符号が付されているが、それらの成分又は組成は異なる。
　図３（Ａ）において、符号ｄは挿入管５の開口端５Ａと第１容器２Ａの底面からの距離を示す。第１容器２Ａから培地を全量排出したい場合、挿入管５は開口端５Ａが第１容器２Ａの底面にほぼ接するように設計され、ｄは略０である。
　図３（Ｃ）は、混合された培地１０をポンプにより第１容器２Ａから吸引排出した様子を示す図である。この場合、開口端５Ａより上方に位置する培地１０が第１容器２Ａから排出される。なお、第１容器２Ａの底面でフィーダ細胞を培養し、第２容器３の底面で所望の細胞１１を培養する２層培養を実施する場合は、第２容器３の外底面に培地１０が接するように第１容器２Ａ内に培地１０が残留する必要がある。その場合、第１容器２Ａの底面と開口端５Ａとの距離ｄは、開口端５Ａの位置が第２容器３の外底面の位置よりわずかに高い位置となるように設計される。
　以上のように送液と排液を行うことにより培地１０の交換が可能となる。上記の説明からわかるとおり、培地１０の交換とは、一例として、第２容器３に収容された古い培地１０を新しい培地１０と混合させた後、第１容器２Ａから当該混合された培地１０を排出することを意味する。
　なお、細胞１１の培養をする際は、実施例１の培養容器１ＡをＣＯ２インキュベータ内に設置して、第１容器２Ａと蓋４との間の隙間ＧからＣＯ２ガスの換気及び第１容器２Ａ内の気体の加湿を行う。こうすることにより、培養容器１は第２容器３内での細胞１１の培養を可能とする。
　また、上述した２層培養を行う場合には、第２容器３は底面が物質透過膜であるものを使用し、第１容器２Ａには第２容器３の外底面に接する量の培地１０が保持される必要がある。また、混合された培地１０の純度を示す目安である培地１０の新旧比率は、例えば、新しい培地１０の添加量を、第１容器２Ａと第２容器３とに保持された培地１０の合計量で除した値によって決定される。当該新旧比率を高めたいときは、例えば、第１容器２Ａに保持された古い培地１０を排出した後に、新しい培地１０を添加する。
　また、上述の培地１０の交換は、複数回実施してもよい。その場合も同様に、液面が第２容器３の液体通過部７よりも高い位置に達するまで第１容器２Ａへ培地を供給し、第１容器２Ａ内の培地１０を排出する。
［実施例２］
［実施例２の培養容器の構成］
　実施例１では、培養容器１Ａが第２容器３を一つだけ備える場合について説明した。実施例２では、培養容器が第２容器３を複数備える場合について説明する。以下に、図４を参照しながら実施例２の培養容器の構成について説明する。
　図４は、第２容器３を複数備える培養容器１Ｂの例を示す図である。図４（Ａ）は第１容器２Ｂの内側底面の形状を示す図である。図４（Ｂ）は、培養容器１Ｂの平面断面図である。図４（Ｃ）は、培養容器１Ｂの側面断面図である。図４（Ｂ）は、図４（Ｃ）においてＸ－Ｘ’線に沿って切断した場合の断面図であり、図４（Ｃ）は、図４（Ｂ）においてＹ－Ｙ’線に沿って切断した場合の断面図である。
　図４に示すように、第１容器２Ｂは、複数の第２容器３を収納することができ、第１容器２Ｂの底部の形状は複数の第２容器３のそれぞれの底部の一部の形状と部分的に相似である。第１容器２Ｂは、例えば、射出成形により形成される。第１容器２Ｂの内側底面は、親水性処理などの表面処理が為されている。そのため、第１容器２Ｂの内側底面は、細胞接着性能が確保されており、接着性細胞等の培養及び増殖が可能である。
　実施例１の場合と同様に、培養容器１Ｂは蓋１２と挿入管５とを備え、蓋１２と第１容器２Ｂとの間には隙間Ｇがある。また、複数の第２容器３のそれぞれは、実施例１の場合と同様に、第１容器２Ｂのふち又は上端部にそって掛止されている。
　なお、図４では、三つの第２容器３が１列で配置されているが、複数の第２容器３は複数列で配置されてもよい。その場合は、第１容器の形状は、第２容器３を複数列で配置できるような形状とする。複数の第２容器３を第１容器に配置する場合は、複数の第２容器３のそれぞれにおける液体通過部７の向きを同一方向に揃えることが望ましい。
　また、第１容器２Ｂの第２容器３を収容する部分の形状は、第２容器３の形状に沿ったものであればよく、部分的に円形形状を有さなくてもよい。第１容器の底面の形状は、例えば第２容器３の底面形状が矩形であれば部分的に矩形形状を有する形状とする。また、第１容器の内側底面の面積は、配置する第２容器３の底面面積の合計に対し、１．５から２倍程度とする。このようにすると、第２容器を満たすために必要な培地１０の量を減少させることができる。特に細胞１１の培養に使用する培地１０は高価であるため、使用量は抑制されることが好ましい。
　培養容器１Ｂは、実施例１に記載した方法と同様の方法で、細胞１１を複数の第２容器３上で培養することができる。その場合、実施例２の培養容器１Ｂは、実施例１の培養容器１Ａと異なり、一つの挿入管５を用いて一度に複数の第２容器３の培地を交換することができる。
［閉鎖培養容器における細胞の培養］
　次に、培養容器１Ｂにおいて蓋１２と第１容器２Ｂとの接合部位にパッキンが接して設けられた閉鎖培養容器内で細胞１１を培養する場合について説明する。
　図５は、閉鎖培養容器１Ｃの断面を示す図である。図５（Ａ）は、閉鎖培養容器１Ｃの平面断面図である。図５（Ｂ）は、閉鎖培養容器１Ｃの側面断面図である。図５（Ａ）は、図５（Ｂ）においてＸ－Ｘ’線に沿って切断した場合の断面図であり、図５（Ｂ）は、図５（Ａ）においてＹ－Ｙ’線に沿って切断した場合の断面図である。
　閉鎖培養容器１Ｃは、培養容器１Ｂにおいて、蓋１２と第１容器２Ｂとの接合部位にパッキン１３が設けられ、蓋１２を貫通する排気管１４と複数の送気送液管１５とが設けられた構成となっている。
　排気管１４は、挿入管５から培地が供給された際、又は、送気送液管１５から送液又は送気された際に、その量に応じた気体を閉鎖培養容器１Ｃから排気することができる。換言すると、閉鎖培養容器１Ｃの内部は排気管１４を介して外気圧と同じ圧力に保たれており、培地及びＣＯ２ガス等は閉鎖培養容器１Ｃ内へスムーズに送液又は送気される。
　複数の送気送液管１５のそれぞれは、複数の第２容器３のそれぞれの液体収容部８の上方であって液体通過部７よりも高い位置に開口端１５Ａが位置し、第２容器３の液体収容部８へ送液する。送気送液管１５は、例えば、設置された第２容器３の個数と同一の個数だけ設けられている。
　送気送液管１５の開口端１５Ａと反対側の他端は、図示しないポンプと接続されている。例えば、上記ポンプを稼働することにより細胞懸濁液を第２容器３に供給できる。つまり、送気送液管１５を介して第２容器３の内側底面に細胞を播種することができる。また、流路を切り替えることにより、送気送液管１５を介してＣＯ２を含むガスを閉鎖培養容器１Ｃに供給し、培地のｐＨを一定に調節することができる。
　以上の説明からわかるとおり、容器内部がパッキン１３によって密封されている閉鎖培養容器１Ｃにおいても、排気管１４によって圧を一定に保つことにより、上述した培地１０の交換方法を実施することができる。また、送気送液管１５を介して閉鎖培養容器１Ｃ内にＣＯ２ガス及び細胞懸濁液を供給することができ、その結果、閉鎖培養容器１Ｃにおいて、蓋１２を開けずとも細胞を培養することができる。
［実施例３］
［細胞培養装置の構成］
　続いて、上記の閉鎖培養容器１Ｃを備え、自動で細胞１１の培養を行うことができる細胞培養装置について説明する。
　図６は、細胞培養装置Ｓの構成を示した図である。以下、閉鎖培養容器１Ｃへの培地の供給又は排出をする送液制御手段を備えた細胞培養装置Ｓの例を説明する。細胞培養装置Ｓは、恒温槽１６と冷蔵庫１７とを備える。恒温槽１６は、細胞１１の培養に適した温度に閉鎖培養容器１Ｃを保つ。冷蔵庫１７は、排液ボトル５４、トラップボトル４３及び培地ボトル５７といった冷温に保つ必要があるものを収容する。
　第１細胞ボトル２１は第１の細胞懸濁液を保持するボトルである。第１細胞ボトル２１は、蓋により内部を気密に保持できる。管路２２は、上記蓋を貫通して設けられ、第１細胞ボトル２１内の気圧を調整する。管路２２の開口端には、メッシュサイズ０．２２μｍのフィルタ２３が設けられ、恒温槽１６の外気に開放している。
　供給管２４は、蓋を貫通して第１細胞ボトル２１の内部に開口端を持ち、上記開口端は細胞懸濁液の排出口となる。供給管２４は分岐点２５を介して二つの管路に分岐している。一方の管路は、第１気体導入弁２６に接続され、もう一方の管は第１細胞開閉弁２７に接続される。分岐点２５は、第１細胞ボトル２１に保持される液体の液面より上方に設けられる。供給管２４の開口端には、メッシュサイズ０．２２μｍのフィルタ２８が設けられており、恒温槽１６内の外気に開放している。
　第１細胞開閉弁２７に接続された管路は二つの管路に分岐し、一方の管路は後述する共通管２９に接続され、もう一方の管路は第１ガス開閉弁３０へと通じる分岐点に接続される。第１ガス開閉弁３０には加湿ボトル３１が接続されている。
　加湿ボトル３１の上流にはメッシュサイズ０．２２μｍのフィルタ３２及び圧力制御弁３３が接続されている。圧力制御弁３３の上流にはＣＯ２とＯ２とを含む混合ガスボンベ３４が接続されている。混合ガスボンベ３４は、細胞１１の培養に適したガス濃度で加圧されている。
　細胞１１を培養する際は、培地１０のｐＨ値が径時的に変化することを防止するため、定期的にＣＯ２ガスで培地１０の表面を通してガス交換を行う必要がある。加えて、細胞１１を培養する際は、培地１０に含まれる水分の蒸発による培地１０の成分の濃縮を防止する必要がある。混合ガスボンベ３４より導出したＣＯ２ガスは、加湿ボトル３１において細胞１１を培養するのに適した湿度に加湿されて待機する。
　第１ガス開閉弁３０へと通じる分岐点のもう一方の管路は、第１ポンプＰ１における吸引口と第２ガス開閉弁３５とに分岐される。第１ポンプＰ１における吐出口と第２ガス開閉弁３５とは統合されて送液管３６となる。即ち第２ガス開閉弁３５は、第１ポンプＰ１のバイパスとして機能する。
　ここで、第１ポンプＰ１の吸引口と第１細胞ボトル２１との間の送液用の管を供給管とし、第１ポンプＰ１の吐出口と細胞培養を行う閉鎖培養容器１Ｃとの間の送液用の管を送液管３６とする。送液管３６は多分岐部３７で分岐され、閉鎖培養容器１Ｃにおける複数の送気送液弁３８、３９、４０を介して、送気送液管１５に接続される。
　閉鎖培養容器１Ｃが備える排気管１４は、排気開閉弁４１を介し気圧調節管４２によりトラップボトル４３に接続される。管路４４はトラップボトル４３の蓋に設けられた気圧調整のための管路であり、管路４４の開口端にはメッシュサイズ０．２２μｍのフィルタ４５が設けられて恒温槽１６の外気に開放している。
　第２細胞ボトル４６は、細胞懸濁液又は培地１０を保持するボトルである。第２細胞ボトル４６は第１細胞ボトル２１と同様の構成であり、第２細胞ボトル４６が備える蓋、気圧調整のための管路、フィルタ及び供給管４７は、第１細胞ボトル２１の対応する構成要素と同じ役割をする。また、供給管４７、分岐点４８、第２気体導入弁４９、第２細胞開閉弁５０の構成も第１細胞ボトル２１の対応する構成要素と同じ役割をする。
　第２細胞開閉弁５０を介して供給管４７は二つに分岐されて、一方の管路は共通管２９に接続され、もう一方の管路は第２ポンプＰ２における吸引口に接続される。第２ポンプＰ２の吐出口より延長する供給管５１は、送液弁５２を介して二つに分岐され、一方の管路は閉鎖培養容器１Ｃにおける挿入管５に接続され、もう一方の管路は第１排出弁５３に接続される。即ち、第２細胞ボトル４６の細胞懸濁液または培地１０は、第２ポンプＰ２の作用によって、閉鎖培養容器１Ｃにおける第１容器２Ｂに供給される。
　排液ボトル５４は、排液管５５が気密に接続されている。また、排液ボトル５４には、蓋の一つに設けた気圧調整のための管路及びその開口端にフィルタが設けられている。排液管５５は第２排出弁５６を介して第３ポンプＰ３の吐出口に接続されている。第３ポンプＰ３の吸引口には第１排出弁５３に接続される。即ち、閉鎖培養容器１Ｃにおける第１容器２Ｂに収容された液体は、第３ポンプＰ３の作用によって排出され、第１排出弁５３から排液管５５を通って排液ボトル５４に捕集される。
　培地ボトル５７は交換用の培地１０を保持するボトルであり、冷蔵庫１７内に保持される。培地ボトル５７は第１細胞ボトル２１と同様の構成であり、培地ボトル５７が備える蓋、気圧調整のための管路、フィルタ及び供給管５８は、第１細胞ボトル２１の対応する構成要素と同じ役割をする。供給管５８、分岐点５９及び第３気体導入弁６０の構成も第１細胞ボトル２１の対応する構成要素と同じ役割をする。
　第４ポンプＰ４の吸引口は供給管５８と接続されている。培地予熱ボトル６１は、交換用の培地１０を必要量だけ保持するボトルである。培地予熱ボトル６１と第４ポンプＰ４の吐出口とは、供給管６３が有する分岐点６２を介して接続される。培地予熱ボトル６１は恒温槽１６の内部に保持される。即ち、培地ボトル５７が保持する培地１０は、第４ポンプＰ４の作用によって、培地予熱ボトル６１に供給される。
　培地予熱ボトル６１は第１細胞ボトル２１と同様の構成であり、培地予熱ボトル６１が備える蓋、気圧調整のための管路、フィルタ及び供給管６３は、第１細胞ボトル２１の対応する構成要素と同じ役割をする。供給管５８、分岐点５９及び第３気体導入弁６０の構成も第１細胞ボトル２１の対応する構成要素と同じ役割をする。供給管６３、分岐点６４、第４気体導入弁６５、培地開閉弁６６の構成も第１細胞ボトル２１の対応する構成要素と同じ役割をする。供給管６３は分岐点６４及び培地開閉弁６６を介して共通管２９に接続されて分岐する。分岐した一方の管路は第１細胞ボトル２１から延長する供給管２４と第１細胞開閉弁２７を介して接続され、もう一方は第２細胞ボトル４６から延長する供給管４７と第２細胞開閉弁５０を介して接続される。
　即ち、共通管２９は第１細胞開閉弁２７と第２細胞開閉弁５０と培地開閉弁６６との３つの開閉弁に接続されている。第１ポンプＰ１が作用するとき、前記３つの開閉弁のうち第１細胞開閉弁２７と、送気送液弁３８、３９、４０のうちの一つと、が開放していれば、第１細胞ボトル２１の細胞懸濁液を閉鎖培養容器１Ｃにおける複数の第２容器３内の一つに供給する。
　また第２ポンプＰ２が作用するとき、第２細胞開閉弁５０と送液弁５２が開放されていれば、第２細胞ボトル４６の細胞懸濁液又は培地１０を閉鎖培養容器１Ｃにおける第１容器２Ｂに供給する。さらに第２ポンプＰ２が作用するとき、培地開閉弁６６と送液弁５２が開放されていれば、培地予熱ボトル６１に保持された培地１０を閉鎖培養容器１Ｃにおける第１容器２Ｂに供給する。
　閉鎖培養容器１Ｃは斜度ステージ６７に設置される。斜度ステージ６７は、通常の培養時は水平に維持される。斜度ステージ６７の一端はリンク機構６８により支持され、もう一端は垂直方向に駆動されるアクチュエータ６９によって支持される。
　閉鎖培養容器１Ｃ内に収容されている培地１０を排液するときは、第１容器２Ｂにおける挿入管５側の底面を下方とするようにアクチュエータ６９を駆動すれば、第１容器２Ｂ内に保持された液体のうち、開口端５Ａから遠い位置の液体をより早く収集して排出することができる。その際、斜度ステージ６７の傾度は任意に設計できる。一方で、閉鎖培養容器１Ｃに送液するときは、第１容器２Ｂにおける挿入管５側の底面を上方とするようアクチュエータ６９を駆動すれば、第１容器２Ｂ内に保持された液体のうち、開口端５Ａから遠い位置の液体をより早く分散して送液することができる。
［細胞培養の操作］
　図７は、細胞培養装置Ｓにおける細胞培養の操作のフローを示すフローチャートである。細胞培養装置Ｓは、図示しないコントローラによって制御される。フローチャートは、恒温槽に管路を設置する処理（Ｓ０１）から開始する。その後、準備した細胞懸濁液を保持する第１細胞ボトル２１と、培地１０を保持した第２細胞ボトル４６とを管路に接続する（Ｓ０２）。
　続いて、細胞培養装置Ｓは、閉鎖培養容器１Ｃにガスを充填する（Ｓ０３）。その後、細胞培養装置Ｓは、培地１０を第１容器２Ｂに送液した後（Ｓ０４）、細胞懸濁液を第２容器３に送液する（Ｓ０５）。細胞培養装置Ｓは、直ぐに閉鎖培養容器１Ｃに加湿されたガスを送気し、恒温槽を恒温に維持して静置する（Ｓ０６）。
　細胞培養装置Ｓは、細胞培養の進行状態によって、培地１０の交換を開始するか否かを判定する（Ｓ０７）。培地１０の交換が必要ない場合（Ｓ０７においてＮＯ）、細胞培養装置ＳはＳ０６の処理に戻る。培地１０の交換が必要な場合（Ｓ０７においてＹＥＳ）、細胞培養装置Ｓは、培地ボトル５７から培地予熱ボトル６１へ培地１０を所定量送液し（Ｓ０８）、第１容器２Ｂに十分予熱された新しい培地１０を供給し（Ｓ０９）、その後、第１容器２Ｂから培地１０を排出する（Ｓ１０）。
　この際、細胞培養装置Ｓは、第２容器３の液体通過部７の高さよりも培地１０の液面が高くなる量の培地１０を第１容器２Ｂへ供給する。細胞培養装置Ｓは、例えば、予め実験によって定めたポンプの稼働時間だけ培地１０を第１容器２Ｂへ供給する。
　細胞培養装置Ｓは、引き続き加湿ガスの送気と静置を行い（Ｓ１１）、細胞培養の進行状態によって、細胞培養を終了するか否か判定を行う（Ｓ１２）。細胞培養を継続する場合（Ｓ１２においてＮＯ）、細胞培養装置Ｓは培地１０の交換を再実行する。細胞培養を終了する場合（Ｓ１２においてＹＥＳ）、閉鎖培養容器１Ｃを自動装置より回収し、手作業により培養した細胞１１の取り出しを行う（Ｓ１３）。続いて、細菌増殖の有無を確認するため排液ボトル５４を回収して細菌検査を行い（Ｓ１４）、使用済みの管路を恒温槽１６より取り外して（Ｓ１５）終了する（ＥＮＤ）。
　図８は、閉鎖培養容器１Ｃにおける送液及び送気処理のタイムチャートを表している。閉鎖培養容器１Ｃにおいて上記送液及び送気処理は図示しないコントローラによって制御される。図８の横軸は操作項目と時間軸を示し、縦軸には図６において示した複数の電磁弁及び第１ポンプＰ１～第４ポンプＰ４の動作タイミングを示している。初期状態では全ての電磁弁及びポンプがＯＦＦである。即ち、全ての電磁弁が閉止していて、かつ、ポンプは送液停止の状態である。以下、図８の横軸に記載した各操作項目について説明する。
　「ＣＯ２ガス充填」の操作項目は、閉鎖培養容器１Ｃの内部をＣＯ２ガスで満たす処理（図６のＳ０３）に対応する。送気送液弁４０と第２ガス開閉弁３５と排気開閉弁４１とをＯＦＦからＯＮにして各弁を開放すると、第１ガス開閉弁３０と送気送液弁４０が通じて送気送液管１５までの流路が通じる。また外気に連通するフィルタ７４から排気開閉弁４１が通じて、外気と接続されたフィルタから排気管１４までの管路が通じる。
　次いで第１ガス開閉弁３０を所定時間ＯＮすると、ＣＯ２ガスが混合ガスボンベ３４より加湿ボトル３１へ到達して加湿される。適切に加湿されたＣＯ２ガスは送気送液弁４０から送気送液管１５を経て閉鎖培養容器１Ｃに到達する。閉鎖培養容器１Ｃは密閉されているが、閉鎖培養容器１Ｃに挿入された排気管１４から外気に通じるフィルタ４５までが開放されているため、閉鎖培養容器１Ｃの内部の圧力は大気圧と均衡する。所定量のＣＯ２ガスの注入が為された後、先ず第１ガス開閉弁３０を閉止し、次いで第２ガス開閉弁３５を閉止し、閉鎖培養容器１Ｃ内の圧力が大気圧と同等となったとき、他の弁を閉止する。
　「培地添加」の操作項目は、閉鎖培養容器１Ｃ内の第１容器２Ｂに培地１０の送液を行う処理（図６のＳ０４）に対応する。第２細胞開閉弁５０と送液弁５２と排気開閉弁４１とをＯＦＦの状態からＯＮにしてこれらの弁を開放すると、第２細胞ボトル４６から第２細胞開閉弁５０と送液弁とを介して挿入管５までの流路が通じる。また外気と接続されたフィルタ４５から排気管１４までの管路が通じる。
　次いで第２ポンプＰ２を所定時間ＯＮすると、第２細胞ボトル４６から培地１０の送液が開始され、所定の液量が分岐点４８より下流の管路にあるとき、第２ポンプＰ２の送液を一端停止する。続いて第２気体導入弁４９を開放すれば、フィルタ７０より外気が導入されて分岐点４８から第２細胞ボトル４６までの管内の培地１０は落差によって第２細胞ボトル４６に戻る。第２ポンプＰ２の送液を開始すると、所定の液量が閉鎖培養容器１Ｃの挿入管５より送液される。このとき閉鎖培養容器１Ｃに挿入された排気管１４から外気に通じるフィルタ４５までが開放されているため、閉鎖培養容器１Ｃの内部の圧力は大気圧と均衡する。所定量の培地１０が閉鎖培養容器１Ｃに注入された後、第２ポンプＰ２を停止し、開放されている各弁をＯＦＦにして閉止し、送液を終了する。
　「細胞播種」の操作項目は、閉鎖培養容器１Ｃ内の第２容器３に細胞播種を行う処理（図６のＳ０５）に対応する。第１細胞開閉弁２７と送気送液弁４０と排気開閉弁４１とをＯＮとしこれらの弁を開放すると、第１細胞ボトル２１から第１細胞開閉弁２７と送気送液弁４０とを介して、送気送液管１５までの流路が通じる。また外気に連通するフィルタ４５から排気開閉弁４１を介して、排気管１４までの管路が通じる。
　次いで第１ポンプＰ１を所定時間ＯＮすると、第１細胞ボトル２１から細胞懸濁液の送液が開始され、所定の液量が分岐点２５より下流の管路にあるとき、第１ポンプＰ１の送液を一端停止する。続いて第１気体導入弁２６を開放すれば、フィルタ２８より外気が導入されて分岐点２５から第１細胞ボトル２１までの管内の細胞懸濁液は落差によって第１細胞ボトル２１に戻る。再度第１ポンプＰ１の送液を開始すると、所定の液量が閉鎖培養容器１Ｃの送気送液管１５より送液される。このとき閉鎖培養容器１Ｃに挿入された排気管１４から外気に通じるフィルタ４５までが開放されているため、閉鎖培養容器１Ｃの内部の圧力は大気圧と均衡する。所定量の注入が為された後、第１ポンプＰ１を停止し、開放されている各弁をＯＦＦにして閉止し、送液を終了する。
　第２容器３が複数あるときは、予め第１細胞ボトル２１には複数の細胞培養容器に分配できる量の細胞懸濁液を保持し、上記の操作において送気送液弁４０を閉止して、送気送液弁３９を開放し、順次前記の操作を繰り返せば、閉鎖培養容器１Ｃにおける他の第２容器３に細胞液懸濁液が同量送液される。
　次のＣＯ２ガス充填の操作項目は、閉鎖培養容器１Ｃの内部をＣＯ２ガスで満たす処理（Ｓ０６）に対応し、先に説明したＣＯ２ガス充填の操作項目と同様の処理をする。
　細胞１１の培養は、細胞懸濁液が第２容器３に保持され、閉鎖培養容器１Ｃの内部空間が適切に加湿されたＣＯ２ガスで満たされ、閉鎖培養容器１Ｃが適切な温度に保持されている状態で所定時間静置され、継続される。なお、細胞懸濁液中に含まれる細胞１１は第２容器３の内部底面を形成する物質透過膜の上面に接着して増殖するため、培養に伴い成分が変化した培地１０は細胞１１と分離して排出できる。
　細胞１１の培養中には「培養静置」の操作項目中では、図示しない顕微観察ユニットを用いて観察を実施し、細胞の育成情報を得る。顕微観察には、位相差顕微鏡が好適に用いられるが、倒立型などの光学顕微鏡であってもよい。撮像機能があればより培養中の細胞１１の観察経過を記録でき、細胞培養をより好適に実施できる。
　「培地予熱の送液」の操作項目は、閉鎖培養容器１Ｃの培地１０の交換を行う処理（Ｓ０８）に対応する。初期状態において、培地ボトル５７は、第４ポンプＰ４を介して培地予熱ボトル６１と通じている。培地予熱ボトル６１は蓋から外気に通じるフィルタが接続されている。
　第４ポンプＰ４は、閉鎖培養容器１Ｃに供給する培地１０の量と培地予熱ボトル６１から閉鎖培養容器１Ｃまでの管路の体積とを合わせた量の培地１０を、培地ボトル５７から培地予熱ボトル６１へ輸送する。第４ポンプＰ４の稼働時間が所定の時間経過した後、第３気体導入弁６０を開放すると、分岐点５９から培地ボトル５７までの管路に存在する培地１０は、大気圧によって培地ボトル５７へ押し戻される。その結果、後端が分岐点５９であり先端が培地予熱ボトル６１となる目標量の培地１０を得ることができる。
　さらに、第４ポンプＰ４を稼働すると、培地予熱ボトル６１内に培地１０が輸送される。この際、培地予熱ボトル６１は、フィルタを介して外気に通じているため、大気圧と均衡している。目標量の培地１０が培地予熱ボトル６１に輸送された後、第４ポンプＰ４を停止し、開放されている各弁をＯＦＦにして送液を終了する。なお、培地ボトル５７から培地予熱ボトル６１へ輸送する培地１０の量は、例えば、閉鎖培養容器１Ｃ内に備えられている第２容器３の数及び培地１０を交換する回数等から決定される。
　「培地送液」の操作項目は、第１容器２Ｂに培地１０の送液を行う処理（Ｓ０９）に対応する。培地送液の操作項目では、先ず、培地開閉弁６６と送液弁５２と排気開閉弁４１とをＯＮにし、弁を開放する。すると、培地予熱ボトル６１から挿入管５までの流路が、培地開閉弁６６と送液弁５２を介して通じる。また、外気に連通するフィルタ４５とトラップボトル４３と排気開閉弁４１と排気管１４とを介して、閉鎖培養容器１Ｃの内部は大気圧と均衡する。
　次いで、第２ポンプＰ２を所定の時間ＯＮして培地予熱ボトル６１から培地１０を吸引し、所望の量の培地１０が分岐点６４から下流の管路にあるとき、第２ポンプＰ２の稼働を一端停止する。続いて、第４気体導入弁６５を開放し、分岐点６４より下方又は上流に存在する培地１０を気圧差によって培地予熱ボトル６１へ戻す。再度第２ポンプＰ２を稼働することにより、所定の量の培地１０が閉鎖培養容器１Ｃ内へ挿入管５を介して輸送される。この際、排気管１４は外気に通じているため、閉鎖培養容器１Ｃの内部の圧力は大気圧と均衡する。所定の量の培地１０が閉鎖培養容器１Ｃ内に注入された後、第２ポンプＰ２の稼働を停止し、開放されている各弁をＯＦＦにして送液を終了する。
　「培地排出」の操作項目は、第１容器２Ｂから培地１０の排出を行う処理（Ｓ１０）に対応する。この操作項目では、第１排出弁５３と第２排出弁５６と排気開閉弁４１とをＯＮにして開放する。そうすると、排液ボトル５４から挿入管５までの流路が、第２排出弁５６、第３ポンプＰ３及び第１排出弁５３を介して通じる。また、閉鎖培養容器１Ｃ内の空間の圧が、排気管１４、排気開閉弁４１、トラップボトル４３及びフィルタ４５を介して外気の圧力と均衡する。
　次いで、第３ポンプＰ３を所定の時間稼働すると、第２容器３の液体収容部８に培地１０が残された状態で第１容器２Ｂから培地１０が吸引され、吸引された培地１０は排液ボトル５４に到達する。この際、閉鎖培養容器１Ｃ内は、排気開閉弁４１が開いているため、外気圧と均衡しているため。所定量の培地１０が閉鎖培養容器１Ｃから排出された後、第３ポンプＰ３の稼働を停止し、各電磁弁をＯＦＦにして送液を終了する。
　次いで、閉鎖培養容器１Ｃ内のＣＯ２ガス濃度が低下した場合に行うＣＯ２ガス送気の処理（Ｓ１１）は、既述のＣＯ２ガス充填の処理（Ｓ０３）と同様に行う。ＣＯ２ガスを充填した後は、閉鎖培養容器１Ｃを静置して細胞１１の培養を続ける。
［細胞培養の実験例］
　以下に、実施例３の細胞培養装置Ｓを用いた、角膜上皮細胞培養による角膜上皮組織作製方法の具体例、及びその結果について説明する。
　（細胞培養装置の詳細）
　恒温槽１６には恒温培養器（型番：ＴＶＨＡ６０ＷＡ１２Ａ、東洋製作所社）を使用し、庫内温度を３７°Ｃで運用した。また、冷蔵庫１７には、電子冷熱低温恒温器（型番：ＴＨＳ０３０ＰＡ、東洋製作所社）を使用し、庫内温度を４°Ｃで運用した。
　電磁弁には、ピンチバルブ（流体圧力０．１５ ＭＰａ、型番：ＰＳＫ－１６１５ＮＣ－９、高砂電気工業社）を使用した。上記電磁弁に対応する供給管には、シリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ、外径１／８インチ　型番：３３５０、サンゴバン社）を使用した。各ポンプは、チューブポンプ（吐出/吸入圧力　＋／－０．１ＭＰａ、型番：ＤＳＷ２－Ｓ１ＡＡ－ＷＰ、ウェルコ社）にしごき用チューブとしてシリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ、外径１／８インチ　型番：３３５５Ｌ、サンゴバン社）を組み合わせたものを使用した。当該ポンプは、ローラー部が本体のモータ部から着脱可能であるため、シリコンゴムチューブ（１３ｃｍ長）をローラー部に巻きつけた状態で滅菌操作が可能である。当該ポンプの流量は、ＤＣ１２Ｖ入力において、実測したところ０．１５ｍＬ/秒であった。
　細胞ボトルにはクローズドシステム　遠心管（容量５０ｍＬ、型番：＃１１７０６、コーニング社）を使用した。培地ボトルにはクローズドシステム　遠心管（容量５００ｍＬ、型番：＃１１７５０、コーニング社）を使用した。本品は予め滅菌された容器部と蓋部と蓋部に設けられた供給管と気圧調整のためのメッシュサイズ０．２２μｍのフィルタ付き管路とから成る。
　排液ボトルにはFlexboyバッグ（ＥＶＡ、ＥＶＯＨ２重構造、容量０．５Ｌ、型番：＃ＦＦＢ１０２６７０、ザルトリウス社）を使用した。
　加湿ボトルには、ガス交換部にケラミフィルター（フィルタサイズ１５×１５ｍｍ、型番：２－５５４－１０、アズワン社）を組み合わせたガス洗浄瓶（容量５００ ｍＬ、型番：６－１２９－０２、アズワン社）を使用した。
　気体導入弁又は加湿ボトルの外気に接するフィルタには、ミディザルト２０００（メッシュサイズ０．２２μｍ、型番：＃１７８０５－Ｅ、ザルトリウス社）を使用した。
　電磁弁の閉止部位及びポンプ部のしごき部位以外のチューブには材質が非ＤＥＨＰ-ＰＶＣ（（Di(2-EthylHexyl)Phthalate）- PolyVinylChloride）であるタイゴンＮＤ－１００（内径１／１６インチ、外径１／８インチ、型番：＃ＡＤＦ００００２、サンゴバン社）を使用した。チューブの分岐、及び接合部にはＳＭＣカップリング（ＣＰＣ社）シリーズを使用した。具体的には２分岐接合にY Fitting（接合径１／１６インチ、型番：＃ＨＹ２９１）を使用し、直線連結にはStraight Fitting（接合径１／１６インチ、型番：＃ＨＳ２９１）を使用した。第１容器２Ｂはポリカーボネートを材料として射出成形により作製した。細胞１１を保持する第２容器３にはセルカルチャーインサート（型番：３５３１８０、コーニング社）を使用した。
（閉鎖系流路の作製方法）
　以上の構成部品を安全キャビネット内において無菌状態で組み立て、流路を作成した。次いで、流路を滅菌バックに入れて封止した後、ガンマ線滅菌処理業者に依頼して１５ｋＧｒｙの放射線滅菌処理を行った。
（角膜上皮細胞の準備）
　続いて、角膜上皮細胞の培養方法について説明する。角膜上皮細胞は、フナコシ社より購入したウサギ眼球の角膜輪部から公知の技術によって角膜上皮細胞を採取し、４×１０４／ｃｍ２となるように培地で懸濁して細胞ボトルに保持した。培地には、５％ＦＢＳを含むＫＣＭ培地を使用した。交換用培地はおなじくＫＣＭ培地５００ｍＬを培地ボトルに保持し、装置冷蔵庫に設置した。
（角膜上皮細胞の培養開始）
　先ず、予め滅菌処理した流路を設置して、当該流路に各電磁弁と閉鎖培養容器１Ｃとをゴムチューブで接続した。恒温槽１６は、温度を３７°Ｃに保持した。続いて、細胞ボトルと培地ボトルとを流路に接続した。その後、細胞の自動培養を開始した。
　第１容器２Ｂが収容する培地１０を交換する際は、第１容器２Ｂへ新しく供給する培地１０の量を０．７ｍｌとした。また、培地１０の排出量は、第２容器３の液体収容部８の外側には培地１０をできるだけ残さないように、気体も含めて３ｍｌとした。送気するガスの濃度は、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２、７５％Ｎ２とした。また、送気する加湿ガスは湿度９５％ＲＨに制御した。加湿ガスの送気量は、閉鎖培養容器１Ｃの内容積より過剰に注入した。本実験例では、閉鎖培養容器１Ｃの内容積５ｃｍ３に対して加湿ガスを８０ｃｃ／分で２分間送気した。細胞１１を培養する際の処理フローは図７にしたがった。
　培地１０の交換は、培養開始日より５日目、７日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目及び１６日目に各１回実施した。加湿ガスの送気は、１日に４２回、２０分ごとに実施した。細胞１１の培養状態の観察は、培養開始から５日目より毎日１回顕微鏡により行った。具体的には、第２容器３の細胞１１を培養している底面に対し、十個のエリアを定義し、各エリアを培養状態の観察結果を判断データとした。
（角膜上皮組織の回収方法）
　細胞１１の培養を開始してから１６日目に、最後の培地１０の交換操作を行い、細胞１１の培養を終了し、閉鎖培養容器１Ｃを取り出した。閉鎖培養容器１Ｃを、安全キャビネット内に置き、室温（約２５°Ｃ）で３０分静置した。続いて、細胞１１が接着した第２容器３を取り出し、トリプシン処理を行って細胞１１を第２容器３の内側底面から剥離して回収した。
（対照の実験方法）
　培養皿としてセルカルチャーインサート（型番：３５３１８０、コーニング社）を使用した。ＣＯ２インキュベータ（型番：ＭＣＯ１９－ＡＩＣ、三洋電機社）を使用して、環境温度を３７°Ｃに設定し、湿度を９５％ＲＨに設定し、ＣＯ２濃度を５％に設定し、細胞１１の培養を実施した。対照の細胞は、上述の角膜上皮細胞と同じものを使用した。
　細胞１１の播種及び培地１０の交換作業は手操作により実施し、滅菌された分注器（ピペットマン（登録商標）、型番：Ｐ５０００、ＧＩＬＳＯＮ社）を使用して実験例と同じ液量を添加した。培地１０の交換頻度及び間隔は、実験例と同じとした。また、ＣＯ２ガスの制御は、細胞１１の培養期間中は同じ設定にした。なお、培地１０の交換時は培養皿を３７°Ｃのホットプレート上に設置して作業を実施し、培養皿の温度維持を図った。
（実験例と対照実験との比較）
　本実施例の細胞培養装置Ｓにおいて作製した角膜上皮細胞は、シート状細胞となって一定の厚みを有していた。また、当該角膜上皮細胞は安定した剥離回収が可能であった。細胞１１の育成過程における各顕微鏡画像を確認したところ、細胞１１の育成に異常は見られなかった。また、対照実験において育成した細胞１１と同等の形状であった。培養後の細胞数は播種した細胞の数のおよそ５０倍（換算量）であり、対照実験の結果と比較しても同等であった。
　角膜上皮組織の切片を作成し、ヘマトキシリン―エオジン染色及び免疫組織染色によって培養した細胞１１を観察した結果、実験例において培養した細胞１１と対照実験において培養した細胞１１との双方とも、全ての細胞で上皮細胞に発現するＣＫタンパク質ファミリが発現した。また、実験例と対照との双方において、分化した角膜上皮細胞に発現するＣＫ３が基底層以外での細胞で発現し、上皮組織のバリア機能に必要な閉鎖結合タンパクであるクローディン１が最表層に発現し、有意差は無かった。
［本実施例が奏する効果］
　上述したように、本開示に係る細胞培養装置Ｓは、例えば、第１容器２Ｂと、液体を流入又は流出させる液体通過部７と流入した液体を収容する液体収容部８と液体収容部８のふちの一部と接続され液体収容部８を保持する保持部９とを有し、保持部９の他端が第１容器２Ｂの上端部に着脱可能に掛止されて第１容器２Ｂの内部に収納される第２容器３とを備える。また、本開示の細胞培養装置Ｓは、第１容器２Ｂを覆う蓋１２と、蓋１２を貫通し、第１容器２Ｂの内部且つ第２容器３の外部であって、第２容器３の液体通過部７よりも低い位置に開口端５Ａが位置する挿入管５と、蓋１２を貫通し、第２容器３の液体収容部８の上方であって液体通過部７よりも高い位置に開口端５Ａが位置し、第２容器３の液体収容部８へ送液する送気送液管１５と、を備え、挿入管５の開口端５Ａと反対側の他端は、開閉可能な弁を有し第１容器２Ｂに液体を供給する供給管と、上記弁とは異なる開閉可能な別の弁を有し第１容器２Ｂから液体を排出する排液管と、に接続されている。
　上記構成を有する細胞培養装置Ｓは、培地１０を供給する際に培養中の細胞１１の育成状態への影響を抑制することができる。また、細胞培養装置Ｓは、細胞１１の培養結果の再現性を損なう影響を回避できる。これは、培地１０の流れが速くなる箇所である挿入管５の開口端５Ａの位置が、細胞１１を培養する箇所よりも離れていることと、第２容器３の液体収容部８の側壁を介した送排液を行うこととによって、培地１０の流速による影響が抑制されるからである。
　また、本開示の細胞培養装置Ｓは、複数の第２容器３と当該複数の第２容器３のそれぞれに対応した複数の送気送液管１５とを備えてもよい。こうすることにより、細胞培養装置Ｓは、複数の第２容器３で細胞１１を培養でき、各第２容器３に収容されている細胞１１への流速の影響を一様に低減できる。また、第２容器３のそれぞれに培地１０を排出する管を用意する従来技術と異なり、管数を減らすことができる。
　具体的には、本実施例の細胞培養装置Ｓによれば、第１容器２Ｂに使用する送液及び排液をする挿入管５は第２容器３の数によらず１本であり、排気に伴う排気管も同様に１本であるため、第２容器の数がＮである場合、管数は２+Ｎで対応できる。したがって、細胞培養装置Ｓは、培養容器の数が増加した場合に培養容器当たりの管数をより低減できる。即ち、本開示の細胞培養装置Ｓは、従来技術に比べて単位面積当たりの細胞培養数を増加させること及び培養する細胞１１の高集積化することが可能となり培養効率が向上する。
　また、上述のとおり、細胞培養装置Ｓは、閉鎖培養容器１Ｃの内部の圧力を大気圧と均衡させる排気管１４も備えている。したがって、本開示の細胞培養装置Ｓは、細胞播種から培地交換までの一貫した細胞培養の作業工程を全て自動で実施できる。さらに、細胞培養装置Ｓは、細胞１１と培地１０とが接触する管路及び培養容器を無菌状態で維持して細胞培養を実施できるため、培養して得られた細胞１１を安全に治療等に使用できる。
　また、図６において示したように、本開示の閉鎖培養容器１Ｃは斜度ステージ６７上に設置され、排液及び送液時に、斜めにすることができる。そのため、本開示の細胞培養装置Ｓは、培地１０の流れをわずかに加速させることにより、効率よく送液及び排液が可能であるとともに、送液量や排液量における容器間の形状のばらつきによって生じる送液量や排液量の個体差を低減できる。
　また、本開示の細胞培養装置Ｓは、従来の複数の閉鎖培養容器を使用して細胞１１の培養を行った場合と異なり、送気に伴う換気のばらつきを低減できる。その理由は、閉鎖培養容器に接続された管路ごとに管内抵抗が異なり、閉鎖培養容器に流れる気体の量が変化するためである。
　また、本開示の細胞培養装置Ｓは、培養容器１Ｂが複数の第２容器３を備え第１容器２Ｂの底部の形状は複数の第２容器３のそれぞれの底部の一部の形状と部分的に相似であってもよい。このようにすると、培地１０の交換に必要な新しい培地１０の供給量を節約することができる。
　また、本開示の細胞培養装置Ｓは、液体通過部７の位置と同じ高さから液体が流入できる開口部Ｏが保持部９に設けられていてもよい。このようにすると、第２容器３が培地１０から受ける抗力を減少させることができる第２容器３の位置ずれが生じにくくなる。
　また、本開示の細胞培養装置Ｓは、第２容器３の底面は培地１０を透過させる物質透過膜であってもよい。このようにすると、培地１０を交換するために第１容器２Ｂへ培地１０を供給する際に、第２容器３が浮き上がりにくくなる。
　また、本開示の細胞培養装置Ｓは、挿入管５が開口端Ａの高さを変えられるように半固定で設置されていてもよい。このようにすると、第１容器２Ｂから排出する培地１０の量を調節することができる。
　なお、本開示は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　本発明は、細胞を培養する培養容器及び細胞培養装置として有用である。
　１Ａ、１Ｂ…培養容器、２Ａ、２Ｂ…第１容器、３…第２容器、４…蓋、５…挿入管、５Ａ…開口端、６…抑え部品、７…液体通過部、８…液体収容部、９…保持部、１０…培地、１１…細胞、１２…蓋、１３…パッキン、１４…排気管、１５…送気送液管、１５Ａ…開口端、１Ｃ…閉鎖培養容器、Ｓ…細胞培養装置、６Ｇ…隙間、１６…恒温槽、１７…冷蔵庫、２１…第１細胞ボトル、２２…管路、２３…フィルタ、２４…供給管、２５…分岐点、２６…第１気体導入弁、２７…第１細胞開閉弁、２８…フィルタ、２９…共通管、３０…第１ガス開閉弁、３１…加湿ボトル、３２…フィルタ、３３…圧力制御弁、３４…混合ガスボンベ、３５…第２ガス開閉弁、３６…送液管、３７…多分岐部、３８、３９、４０…送気送液弁、４１…排気開閉弁、４２…気圧調節管、４３…トラップボトル、４４…管路、４５…フィルタ、４６…第２細胞ボトル、４７…供給管、４８…分岐点、４９…第２気体導入弁、５０…第２細胞開閉弁、５１…供給管、５２…送液弁、５３…第１排出弁、５４…排液ボトル、５５…排液管、５６…第２排出弁、５７…培地ボトル、５８…供給管、５９…分岐点、６０…第３気体導入弁、６１…培地予熱ボトル、６２…分岐点、６３…供給管、６４…分岐点、６５…第４気体導入弁、６６…培地開閉弁、６７…斜度ステージ、６８…リンク機構、６９…アクチュエータ、７０…フィルタ、Ｐ１…第１ポンプ、Ｐ２…第２ポンプ、Ｐ３…第３ポンプ、Ｐ４…第４ポンプ

Claims (9)

  1. 　第１容器と、
    　液体を流入又は流出させる液体通過部を有し、前記第１容器の内部に収納された第２容器と、
    　を備える培養容器を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、
    　前記第２容器に細胞を播種するステップと、
    　液面が前記第２容器の前記液体通過部よりも高い位置に達するまで前記第１容器へ培地を供給するステップと、
    　前記第１容器内の前記培地を排出するステップと、
    　を含む細胞培養方法。
  2. 　請求項１に記載の細胞培養方法において、
    　液面が前記第２容器の前記液体通過部よりも高い位置に達するまで前記第１容器へ培地を再度供給するステップと、
    　前記第１容器内の前記培地を再度排出するステップと、
    　をさらに含む細胞培養方法。
  3. 　請求項１に記載の細胞培養方法において、
    　前記培養容器は、
    　前記第１容器の内部且つ前記第２容器の外部であって、前記第２容器の前記液体通過部よりも低い位置に開口端が位置する挿入管をさらに備え、
    　前記挿入管から前記第１容器へ前記培地を供給し、
    　前記挿入管から前記培地を排出する、
    　細胞培養方法。
  4. 　第１容器と、
    　液体を流入又は流出させる液体通過部と流入した前記液体を収容する液体収容部とを有し、前記第１容器の内部に着脱可能に収納される第２容器と、
    　前記第１容器を覆う蓋と、
    　前記蓋を貫通し、前記第１容器の内部且つ前記第２容器の外部であって、前記第２容器の前記液体通過部よりも低い位置に開口端が位置する挿入管と、
    　を備える培養容器。
  5. 　請求項４に記載の培養容器において、
    　前記培養容器は複数の前記第２容器を備え、
    　前記第１容器の底部の形状は前記複数の第２容器のそれぞれの底部の一部の形状と部分的に相似である、
    　培養容器。
  6. 　請求項４に記載の培養容器において、
    　前記第２容器は、前記液体収容部を保持する保持部を備え、
    　前記保持部は前記液体通過部の位置と同じ高さから液体が前記液体収容部に流入できる開口部が設けられている、
    　培養容器。
  7. 　請求項４に記載の培養容器において、
    　前記第２容器の底面は培地を透過させる物質透過膜である、
    　培養容器。
  8. 　第１容器と、
    　液体を流入又は流出させる液体通過部と流入した前記液体を収容する液体収容部とを有し、前記第１容器の内部に着脱可能に収納される複数の第２容器と、
    　前記第１容器を覆う蓋と、
    　前記蓋を貫通し、前記第１容器の内部且つ前記第２容器の外部であって、前記第２容器の前記液体通過部よりも低い位置に開口端が位置する挿入管と、
    　を備え、
    　前記挿入管の前記開口端と反対側の他端は、開閉可能な第１の弁を有し前記第１容器に液体を供給する供給管と、開閉可能な第２の弁を有し前記第１容器から液体を排出する排液管と、に接続されている、
    　細胞培養装置。
  9. 　請求項８に記載の細胞培養装置において、
    　前記蓋を貫通し、前記第２容器の前記液体収容部の上方であって前記液体通過部よりも高い位置に開口端が位置し、前記第２容器の前記液体収容部へ送液する複数の送液管をさらに備える、細胞培養装置。
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