WO2019176162A1 - 細胞培養装置 - Google Patents

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WO2019176162A1
WO2019176162A1 PCT/JP2018/041603 JP2018041603W WO2019176162A1 WO 2019176162 A1 WO2019176162 A1 WO 2019176162A1 JP 2018041603 W JP2018041603 W JP 2018041603W WO 2019176162 A1 WO2019176162 A1 WO 2019176162A1
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WO
WIPO (PCT)
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culture
gas
pressure
cell culture
culture vessel
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/041603
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
政晴 木山
美登里 加藤
洸 斉藤
大山　国夫
宏子 半澤
志津 武田
Original Assignee
株式会社日立製作所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社日立製作所 filed Critical 株式会社日立製作所
Publication of WO2019176162A1 publication Critical patent/WO2019176162A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture apparatus.
  • CPC Cell Processing Center
  • an automatic culture apparatus for automating cell culture in a closed system has been developed (for example, see Patent Document 1).
  • closed bottles and culture vessels are connected by tubes to create biologically closed spaces, which are placed in a temperature space where culture is possible, medium exchange and culture vessels necessary for cell culture Perform gas exchange and humidification.
  • This equipment configuration achieves automated cell culture and reduced risk of biological contamination.
  • An object of the present invention is to provide an automatic cell culture device having a configuration for adjusting the pressure in a culture vessel.
  • the gas exchange operation is performed on the closed culture vessel.
  • Example 1 since the whole is a closed space, when the air is supplied to the culture vessel, the gas in the culture vessel is Was found to deviate from atmospheric pressure.
  • Some cell types to be cultured are sensitive to stress in the culture environment, and the results of cell culture may vary due to subtle changes in the pressure in the culture vessel. Was found. In order to solve this problem, the present inventors performed the present invention.
  • One embodiment of the present invention includes a culture container for culturing cells, an air supply part for supplying gas into the culture container, an exhaust part for exhausting the gas in the culture container, And a pressure adjusting unit for adjusting the pressure in the culture vessel.
  • the pressure adjusting unit may be a pressure reducing device for reducing the pressure in the culture vessel.
  • the decompression device may be a suction device for sucking the gas in the culture vessel.
  • Any of the cell culture devices may further include a pressure sensor for measuring the internal pressure in the culture vessel.
  • the internal pressure may be adjusted to be (atmospheric pressure) or more (atmospheric pressure + 0.1 kPa) or less.
  • Any of the cell culture devices may include a control unit that controls the air supply unit, the exhaust unit, and the pressure adjusting unit. Furthermore, you may further provide the liquid feeding part for feeding the culture medium to the said culture container, and a temperature control part.
  • FIGS. 1 and 2 are diagrams showing a basic configuration of the cell culture device 1 according to the first embodiment.
  • the internal space of the entire system is biologically closed.
  • the cell culture apparatus 1 is provided with a culture container 9 for culturing cells and tissues.
  • the shape and material of the culture vessel 9 are not particularly limited, and those commonly used by those skilled in the art can be used.
  • it may be a sealed lid 91 and a dish 92 made of hard plastic.
  • it may be a culture bag 93 made of soft plastic and having a culture surface 94 on the inner bottom surface.
  • the culture container 9 can hold the liquid medium 11 therein, but a gas phase is provided on the liquid medium 11 by adjusting the amount of the liquid medium 11.
  • a buffer system called a bicarbonate buffer system is used in order to make the pH of the medium constant.
  • a base component such as NaHCO 3
  • the pH of the medium is buffered, and by cell respiration It can be ensured that no significant change in pH is caused by the carbon dioxide released.
  • this cell culture apparatus has an air supply tube for exchanging the gas in the gas phase in the culture vessel 9. 7 and an exhaust pipe 12 are provided.
  • the air supply tube 7 has a first opening 71 opened to the gas phase in the culture vessel, and the gas is sent to the gas phase in the culture vessel 9 through the first opening 71. At that time, the lid 91 of the culture vessel 9 may be penetrated.
  • the air pipe 7 is connected directly or indirectly to the cylinder 2 filled with the gas to be ventilated.
  • the air pipe 7 may be directly connected to the cylinder 2 through the filter 5, it may be indirectly connected by providing the humidification bottle 6.
  • the latter case will be described in detail with reference to FIG.
  • the humidification bottle 6 is a sealed bottle and holds pure water or the like.
  • the air supply pipe 7 passes through the lid of the humidifying bottle 6, and the second opening 72 is open to the gas phase inside the humidifying bottle 6.
  • the air supply pipe 7 is provided with an air supply valve 8 and serves as a regulating valve for supplying the gas inside the humidifying bottle 6 to the gas phase in the culture vessel.
  • the gas pipe 3 is provided from the cylinder 2 storing the gas to be supplied to the humidifying bottle 6, and the opening 73 is opened in the pure water in the humidifying bottle 6.
  • the gas pipe 3 is provided with a gas flow rate regulator 4 and a first filter 5.
  • a resin material having flexibility is suitable, and further, a gas with low gas permeability is preferable because it is necessary to pass the inside with gas.
  • a material for example, ethyl vinyl alcohol (EVOH), polyester, polyvinyl chloride, or the like may be used, but rubber having high elasticity may be used for a portion to be closed by the electromagnetic valve.
  • the first filter 5 is provided to make the inside of the system a closed system.
  • a filter having a mesh size of 0.22 ⁇ m that prevents entry of viruses and bacteria can be used.
  • the exhaust pipe 12 is opened to the environment through the filter 13.
  • a device for making the pressure in the closed system in particular, the culture vessel 9 constant, is provided as a pressure adjustment unit for adjusting the pressure in the culture vessel 9.
  • the pressure adjusting unit includes a decompression device, for example, a suction device 14 may be connected, whereby the gas in the exhaust pipe 12 can be efficiently discharged to the environment.
  • the structure of the suction device 14 is not limited as long as it can suck the gas in the exhaust pipe 12.
  • the suction device 14 has a mechanism for reducing the pressure of the pipe side connected to the T-shape by a venturi effect with respect to the flow in the straight direction.
  • a container may be used.
  • a pressure source 15 connected to the pressure reducer by a pipe may be provided, and a flow rate regulator 16 is provided in a pipe connecting the pressure source 15 and the suction device 14. Also good.
  • the exhaust pipe 12 can be decompressed by controlling the flow rate regulator 16 and discharging the air pressurized by the pressurization source 15.
  • the suction force in the exhaust pipe 12 can be adjusted by controlling the discharge amount of the pressurized air using the flow rate regulator 16.
  • a suction pump In addition to the decompressor having such a structure, a suction pump, a diaphragm pump, a syringe pump, or the like can be used as a suction device, but a suction device having no physical valve structure is preferable. This is because when the suction is not necessary, the suction device 14 is turned off so that the exhaust pipe is not blocked even in the event of a failure and there is no risk of an abnormal increase in internal pressure.
  • the tube used for the air supply pipe 7 and the exhaust pipe 12 is preferably a resin material having flexibility like the gas pipe 3 and further needs to pass through the inside with gas, so that the gas permeability is low.
  • a material for example, ethyl vinyl alcohol (EVOH), polyester, polyvinyl chloride, or the like may be used.
  • the second filter 13 is provided in order to make the inside of the system a closed system like the first filter 5.
  • a filter having a mesh size of 0.22 ⁇ m that prevents entry of viruses and bacteria can be used.
  • a predetermined amount of liquid medium 11 containing cells is placed in the culture vessel 9.
  • the cylinder 2 is opened and the air supply valve 8 is opened.
  • the gas flow rate is adjusted by the flow rate regulator 4 so that a predetermined amount of gas enters the pure water of the humidification bottle 6 through the gas pipe 3 from the cylinder 2.
  • the gas that has been humidified through the pure water enters the gas phase in the culture vessel 9 through the air supply tube 7.
  • the gas phase in the culture vessel 9 is filled with air, but is replaced with humidified gas over time.
  • the gas pushed out from the culture vessel 9 reaches the suction device 14 through the exhaust pipe 12.
  • the gas passes through the inside of the suction device 14 with the pushed force and is exhausted into the environment.
  • the flow regulator 16 is operated, the gas is sucked. By this, it becomes possible to exhaust efficiently.
  • the culture bag 17 When the culture bag 17 is used for the culture container 9, when the culture bag 17 is supplied with air, the culture bag 17 expands. By adjusting the pressure of the entire system by the suction device 14, the internal pressure of the culture bag 17 is normal pressure. It is possible to maintain the shape of the culture bag 17 and the volume of the gas phase part constant.
  • FIG. 3 is an example of the overall configuration of the cell culture device 100. Below, the cell culture apparatus 100 provided with the liquid feeding control means to supply or discharge
  • the cell culture apparatus 100 is provided with a thermostatic chamber 63, and the culture vessel 39 is held at a culture temperature optimum for cell culture under the control of the controller 65.
  • a refrigerator 64 is provided to keep the liquid medium for medium replacement at a low temperature.
  • the closed cell culture system installed in the thermostatic chamber 63 and the refrigerator 64 can be exchanged as an integral flow channel, and the entire flow channel is removed and a new flow channel is installed and used for each culture operation. To do.
  • a sealed cell bottle 20 for holding the cell suspension, and a supply pipe 23 for supplying the cell suspension to the culture vessel 39 connected to the cell bottle 20 are provided.
  • One end of the supply tube 23 has an opening inside the cell bottle 20 and is an opening for feeding the cell suspension in contact with the held cell suspension. Therefore, the opening is preferably open near the bottom of the cell bottle 20.
  • the supply pipe 23 is connected to the branch point 25 via an on-off valve 24 that controls the supply pipe 23.
  • This branch point 25 is a plurality of branch junctions, and a gas introduction pipe 28 having a gas introduction valve 27 and a supply pipe 34 having a supply valve 35 are connected at the branch point 25, and further a gas supply toward the ventilation branch point 26.
  • a tube 51 is connected.
  • the branch point 25 is provided above the liquid level of the liquid held in the cell bottle 20 and above the liquid level of the liquid held in the culture medium bottle 33.
  • the supply pipe 34 is connected to the medium bottle 33.
  • the medium bottle 33 is a liquid bottle that holds a liquid medium for medium replacement, and is held in the refrigerator 64.
  • the lid of the cell bottle 20 is provided with an air pressure adjusting tube 21 for adjusting the air pressure, and the air pressure adjusting tube 21 is provided with a filter 22 for controlling opening and closing thereof.
  • the gas introduction pipe 28 is connected to the gas bag 29 through the filter 30.
  • the gas bag 29 holds a gas that suppresses a change in pH value of the cell suspension or liquid medium at an optimal concentration.
  • the gas bag 29 is provided with a check valve 32 via an atmospheric pressure adjustment pipe 31, and the open end of the check valve 32 is open inside the thermostatic chamber 63.
  • the check valve 32 also called a check valve, restricts the direction of fluid flow in one direction, and in this embodiment directs the gas flow from the gas bag 29 toward the space of the thermostatic chamber 63.
  • a liquid feed pump 36 is connected to the ventilation branch point 26 by a liquid feed pipe 38.
  • a third on-off valve 37 is provided to bypass the liquid feed pump 36 and is connected to the liquid feed pipe 38.
  • the culture container 39 is an airtight container whose appearance is composed of a main body and a lid.
  • the main body of the culture vessel 39 is a dish that can be cultured while holding cells on the inner bottom.
  • the lid is provided with three penetrating ports, a liquid feeding port 40, an atmospheric pressure adjustment port 41, and a discharge port 42.
  • a liquid supply pipe 38 is connected to the liquid supply port 40, and an end of the liquid supply pipe 38 is opened near the inside of the lid.
  • the atmospheric pressure adjustment port 41 is connected to the atmospheric pressure adjustment pipe 43.
  • the atmospheric pressure adjustment pipe 43 is controlled by an atmospheric pressure adjustment valve 44, is further connected to the suction device 14 via a filter 45, and opens inside the constant temperature bath 63.
  • the functions of the pressurization source 15 and the flow rate adjustment unit 16 for the suction device 14 are as described above.
  • the atmospheric pressure adjusting pipe 43 is connected to the pressure sensor 69 via the second filter 68. With the pressure sensor 69, the pressure inside the culture vessel 39 can be constantly measured.
  • the discharge port 42 is connected to a discharge pipe 46, and the discharge pipe 46 opens near the bottom of the container.
  • a method of ventilating the gas phase of the culture container 39 with a predetermined gas will be described.
  • a gas cylinder contained in a predetermined gas is connected to the gas mixer 59.
  • the gas mixer 59 is connected to a 100% CO 2 cylinder 60, a nitrogen cylinder 61, and a filter 62. From the filter 62 opened to the atmosphere, clean air can be supplied to the gas mixer 59 via the filter 62.
  • gas having a desired concentration configuration can be generated by diluting CO 2 supplied from the 100% CO 2 cylinder 60 with the atmosphere supplied from the filter 62.
  • the gas having the target concentration configuration is obtained by diluting CO 2 supplied from the 100% CO 2 cylinder 60 with the nitrogen cylinder 61. Can be generated.
  • the flow rate regulator 58 is connected to the gas mixer 59 through the filter 54, and can control the flow rate of the gas adjusted to the target concentration configuration by the gas mixer 59 from 0 to an arbitrary amount.
  • the pipe from the flow controller 58 is branched and connected to a first on-off valve 52 and a humidifying pipe 55 that control the ventilation pipe 51, respectively.
  • the humidifying tube 55 is connected to a humidifying bottle 56 that holds sterilized water therein, and is connected to a second on-off valve 53 that controls a humidifying tube 57 provided in the humidifying bottle 56.
  • the pipe having the first on-off valve 52 and the pipe having the second on-off valve 53 merge and are connected to the ventilation branch point 26 through the ventilation pipe 51.
  • the gas whose concentration has been adjusted is adjusted to a predetermined flow rate by the flow rate regulator 58, and is humidified through the humidification tube 55 through the sterilized water in the humidification bottle 56.
  • the CO 2 in the form of foam in the humidification bottle 56 stays in the gas phase in the humidification bottle 56 and reaches the culture vessel 39 from the humidification pipe 57 via the ventilation pipe 51 and the third on-off valve 37.
  • the pressure sensor 69 measures the internal pressure of the culture vessel 39.
  • the flow rate regulator 16 is activated and the internal pressure of the culture vessel 39 is connected via the exhaust pipe 43 connected to the suction machine 14. Is maintained at a predetermined pressure.
  • Gas exchange and humidification of the gas phase in the culture vessel may be performed constantly, but air supply may be stopped periodically or when unnecessary such as when the gas reaches a predetermined concentration configuration.
  • the case of one culture container is taken as an example, but when there are a plurality of culture containers, air may be supplied at the same time, and one culture container is supplied at a time for a certain period of time. It is also possible to circulate through a plurality of culture vessels by performing intermittent air supply to the container.
  • a discharge pipe 46 connected to the culture vessel 39 is connected to a discharge pump 48 via a discharge control valve 47, is connected to a drain pipe 49, and is connected to a drain bag 50. If the second on-off valve 53, the third on-off valve 37, and the discharge control valve 47 are opened, the other valves 24, 27, 35, 44, 52 are closed, and the discharge pump 48 and the flow rate regulator 58 act simultaneously, The liquid held at the bottom of the culture vessel 39 is sent to the drainage bag 49.
  • the liquid and gas corresponding to the discharge amount of the discharge pump 48 are reduced from the inside of the culture vessel 39, and the mixed gas flows into the culture vessel 39 by the pressure of the flow rate regulator 58, so the inside of the culture vessel 39 is maintained at normal pressure. Is done.
  • the pressure is not adjusted by the gas introduction pipe 28 via the filter 30 in order not to make the inside of the culture vessel 39 negative pressure. Further, in order not to allow the atmosphere to enter the culture vessel 39, the pressure adjustment by the atmospheric pressure adjustment tube 43 is not performed.
  • FIG. 4 shows a flowchart of the overall cell culture operation in the cell culture apparatus controlled by the controller 65, which is a control unit, using the cell culture apparatus 100 shown in FIG.
  • the cell bottle 20 holding a separately prepared cell suspension and the medium bottle 33 holding a liquid medium are connected to the flow path (S02).
  • the gas is automatically filled in the gas bag 29 (S03).
  • the cell suspension is supplied (S04).
  • the humidified gas is supplied to the culture vessel 39, and the cells are kept at a constant temperature (S05). It is determined whether or not the replacement of the liquid medium is started according to the progress of the cell culture (S06).
  • the gas is filled in the gas bag 29 (S07), and after the old medium in the culture container is discharged (S08), a new liquid medium is fed from the medium bottle (S09).
  • the humidified gas is supplied and allowed to stand (S10), the continuation determination of the culture is performed according to the progress of the cell culture (S11), and the medium exchange is performed again.
  • the automatic culture is terminated, the manually cultured cells are removed (S12), and the drainage bag 50 is collected (S13) to confirm the presence or absence of bacterial growth.
  • the path is removed from the thermostat 63 and the process is terminated.
  • the internal pressure of the culture vessel to be adjusted is preferably in the range of (atmospheric pressure) to (atmospheric pressure + 0.1 kPa) in order to avoid the influence of pressure stress during cell culture.
  • This apparatus even if the gas flow rate is increased to about 200 cc / min, it is possible to control the internal pressure within the above pressure range by controlling the exhaust apparatus.
  • the gas in the closed vessel is forcibly exhausted from the exhaust side, so that when the desired gas is supplied, the discharge of the gas in the culture vessel is promoted. Can reach the desired gas composition quickly.
  • the pressure in the culture vessel can be adjusted to the desired pressure (atmospheric pressure or positive pressure).
  • desired pressure atmospheric pressure or positive pressure
  • cell culture can be performed by increasing the pressure during culture.
  • corneal epithelial cells were cultured using the cell culture apparatus 100 having the configuration shown in FIG. 3 to produce corneal epithelial tissue.
  • a constant temperature incubator (Toyo Seisakusho, model number TVHA60WA12A) is used for the thermostat 63, and the inside temperature is operated at 37 ° C. Used, and the internal temperature was operated at 4 ° C.
  • a pinch valve (fluid pressure 0.15 mm, Takasago Electric, model number PSK-1615NC-9) was used for each solenoid valve.
  • a silicon rubber tube (inner diameter 1/16 inch, outer diameter 1/8 inch, Saint-Gobain, model number 3350) was used as a supply pipe corresponding to this solenoid valve.
  • Each pump has a tube pump (discharge / suction pressure +/- 0.1 MPa, Sakai Welco, model number DSW2-S1AA-WP), and a silicon rubber tube (inner diameter 1/16 inch, outer diameter 1/8 inch) as a ironing tube Used in combination with model number 3355L).
  • the sterilization operation can be performed with a silicone rubber tube (13 cm long) wrapped around the roller part.
  • the flow rate of this pump was 0.15 mL / second from the actual measurement result at DC 12 V input.
  • a closed system Erlenmeyer flask (capacity 500 mL, Corning, model number # 11440) was used for the cell bottle 20.
  • a Flexboy bag (EVA, EVOH double structure, capacity 150 mL, Sartorius, model number # FFB102643) closed system was used.
  • This product consists of a container and a lid sterilized in advance, a pipe for adjusting air pressure provided on the lid, and a filter having a mesh size of 0.22 ⁇ m.
  • a Flexboy bag (EVA, EVOH double structure, capacity 0.5L, Sartorius, model number # FFB102670) was used.
  • a Flexboy bag (EVA, EVOH double structure, capacity 1L, Sartorius, model number # FFB103547) is used, and a check valve connected to one luer port part (Aram, model number # PRC15) , Crack pressure of 0.2 to 1.5 kPa) was used.
  • the humidifying bottle 56 has a gas washing bottle (capacity 500 mL, ASONE, model number 6-129-02), and the gas exchange part has a kerami filter (filter size 15 ⁇ 15 mm, ASONE company, model number 2-554-10). ) was used in combination.
  • Midisart 2000 (mesh size 0.22 ⁇ m, Sartorius, model number # 17805-E) was used as a filter in contact with the outside air.
  • Tygon ND-100 inner diameter 1/16 inch, outer diameter 1/8 inch, Saint-Gobain, model number # ADF00002
  • SMC coupling (CPC) series was used for branching and joining the tubes. Specifically, Y Fitting (joint diameter 1/16 inch, model number # HY291) was used for the bifurcated joint, and Straight Fitting (joint diameter 1/16 inch, model number # HS291) was used for the linear connection.
  • the culture vessel 39 was produced by injection molding using polycarbonate as a material.
  • a 35 mm cell culture surface treatment dish, model No. 430165, Corning was used for the surface of the container holding the cells.
  • Corneal epithelial cells were collected from corneal limbs of rabbit eyeballs purchased from Funakoshi in accordance with a conventional method, suspended in a medium so as to be 4 ⁇ 10 4 / cm 2, and held in the cell bottle 20.
  • a medium KCM medium containing 5% FBS was used.
  • As the replacement medium 500 mL of KCM medium was held in the medium bottle 33 and installed in the refrigerator 64.
  • the sterilized closed flow path was installed in the thermostatic chamber 63, and each electromagnetic valve and the cell culture container were connected with a rubber tube, and then the thermostatic chamber 63 was maintained at 37 ° C.
  • the thermostatic chamber 63 was maintained at 37 ° C.
  • the automatic culture operation was started.
  • the amount of cell suspension fed is 1.5 mL, and the amount of medium exchanged is the same.
  • the discharge amount from the upper layer was 3 mL for the purpose of discharging the entire amount.
  • the concentration structure of the gas held in the gas bag 29 and the gas to be sent is 5% CO 2 , 20% O 2 , 75% N 2, and the humidified gas to be sent is controlled to a humidity of 95% H,
  • the air volume was 100 cc / min, and the air feeding time was 2 minutes (200 mL). It was to over-injected from the internal volume 20 cm 3 of the culture vessel.
  • the medium is used once every 5th day, 7th day, 9th day, 10th day, 11th day, 12th day, 13th day, 14th day, 15th day, 16th day from the culture start date.
  • the humidified gas was supplied 42 times a day every 20 minutes. From the fifth day, 10 areas were acquired once a day with respect to the cultured cell surface of the culture container, and the state of the cells was observed using a microscope.
  • ⁇ Method of collecting corneal epithelial tissue> After changing the medium on the 16th day of culture, the culture vessel was taken out. The cell culture container was placed in a safety cabinet and allowed to stand at room temperature (about 25 ° C.) for 30 minutes. The cell-adhered container was taken out, and then treated with trypsin according to a conventional method to recover the cells from the culture surface.
  • the pressure in the culture vessel 9 increased in proportion to the amount of air supplied.
  • the gas flow rate in the apparatus is increased, the internal pressure of the culture vessel 9 is increased, but if the flow rate is low, the gas in the vessel is exchanged. It will take a long time.
  • the culture dish used was a 35 mm cell culture surface treatment dish, model No. 430165, Corning.
  • a CO 2 incubator, model number MCO19-AIC, Sanyo Electric Co., Ltd. was used, and cell culture was performed at 37 ° C. setting, humidity 95% H setting, and CO 2 concentration 5% setting.
  • the same cells as in the examples were used.
  • Cell seeding and medium exchange were performed manually, and the same amount of liquid as in Examples was added using a sterilized dispenser (Pipetteman, GILSON, model number P5000).
  • the medium exchange frequency and interval were also the same as in the example, and the control of CO 2 was made the same as in the example throughout the culture.
  • the culture dish was placed on a 37 ° C. hot plate and the work was carried out to maintain the temperature.
  • the corneal epithelial cells produced by the cell culture apparatus of the present example became sheet-like cells and had a certain thickness, and stable peeling and collection were possible. There was no abnormality in the state of the cells in the comparison of the microscopic images of the culture process. On the other hand, the appearance was similar to the cultured cells collected by the control experiment. The number of cells grew to about 50 times the number of seeded cells, and the growth rate tended to be higher than that of the control experiment.
  • a section of corneal epithelial tissue was prepared, and cultured cells were observed by immunohistochemical staining using an antibody of a protein belonging to the CK protein family that is specifically expressed in epithelial cells.
  • CK3 that is specifically expressed in differentiated corneal epithelial cells is observed to be expressed in cells other than the basal layer, and claudin 1, which is a closed binding protein necessary for the barrier function of epithelial tissues, is the highest. Expression on the surface layer was observed. There was no significant difference in the expression of these proteins between the examples and the control experiments.
  • an automatic cell culture apparatus having a configuration for adjusting the pressure in the culture vessel can be provided.

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Abstract

本発明は、培養容器内の圧力を調節する構成を有する自動細胞培養装置を提供することを目的とする。一実施態様として、細胞を培養するための培養容器と、前記培養容器内に気体を送気するための送気部と、前記培養容器内の気体を排気するための排気部と、前記培養容器内の圧力を調節するための圧力調節部と、を備える細胞培養装置を提供する。

Description

細胞培養装置
　本発明は、細胞培養装置に関する。
　自分の細胞または他人の細胞を用いて疾病の治療を行う再生医療では、生体から採取した細胞を培養して細胞数を増やしたり、あるいは適切な形態の組織を構築させたりすることにより、細胞や組織を治療のための移植に用いる。これらの移植に用いる細胞や組織の培養は、細胞プロセシングセンター（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＰＣ）という細胞培養用クリーンルームの中で行われる。センター内での細胞培養は技術者の手作業によって行われるため、患者１名分の細胞の調製に対して労力とコストが非常にかかるという点と、手作業で行うために生物学的汚染リスクがあるという点が課題である。
　これらの課題を解決する手段として、閉鎖系で細胞培養を自動化するための自動培養装置が開発されてきた（例えば、特許文献１参照）。この装置においては、密閉ボトルや培養容器をチューブで接続して、生物学的に閉鎖された空間を作成し、これらを培養可能な温度空間に設置し、細胞培養に必要な培地交換及び培養容器内の気体交換や加湿を行う。この装置構成によって、細胞培養の自動化と生物学的汚染リスクの低減が達成される。
特開２００７－３１２６６８号公報
　本発明は、培養容器内の圧力を調節する構成を有する自動細胞培養装置を提供することを目的とする。
　自動培養装置においては、閉鎖された培養容器に対して気体交換作業が行われるが、実施例１に示すように、全体が閉鎖空間のため、培養容器に送気する際、培養容器内の気体の圧力が、大気圧からずれることが見出された。そして、培養する細胞種の中には、培養環境におけるストレスに敏感で、培養容器内の圧力の微妙な変化によって、細胞培養の結果がばらつくことがあり、ここに閉鎖空間での細胞培養における課題が見出された。この課題を解決するために本発明者らは本発明を行った。
　本発明の一実施態様は、細胞を培養するための培養容器と、前記培養容器内に気体を送気するための送気部と、前記培養容器内の気体を排気するための排気部と、前記培養容器内の圧力を調節するための圧力調節部と、を備える細胞培養装置である。前記圧力調節部は、前記培養容器内の圧力を減圧するための減圧装置であってもよい。前記減圧装置は、前記培養容器内の気体を吸引するための吸引装置であってもよい。前記いずれの細胞培養装置も、前記培養容器内の内圧を測定するための圧力センサーを、さらに備えてもよい。前記内圧が（大気圧）以上（大気圧＋０.１ｋＰａ）以下になるように調節されてもよい。前記いずれの細胞培養装置も、前記送気部と前記排気部と前記圧力調節部とを制御する制御部を有してもよい。さらに、前記培養容器に培養用培地を送液するための送液部と、温度制御部とをさらに備えてもよい。
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
　本出願は、２０１８年３月１４日付で出願した日本国特許出願２０１８－４７０８８に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明の一実施形態においてプラスティックからなる培養容器を有する細胞培養装置の構成図である。 本発明の一実施形態において軟質プラスティック機材からなる培養容器を有する細胞培養装置の構成図である。 本発明の一実施形態における、細胞培養装置の構成図である。 本発明の一実施形態における、細胞培養装置の制御フローチャートである。 本発明の参考例１において、培養容器に送気する送気量に対して培養容器内の圧力を測定した結果を表すグラフである。
　以下、添付図面を参照して、本発明の細胞培養装置の実施形態を、図を参考にしながら詳細に説明する。ただし、これらの実施形態は本発明を実施するための一例にすぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
（１）細胞培養装置の基本構成
　図１及び図２は、細胞培養装置１の第１の実施形態の基本的な構成を示す図である。この細胞培養装置１においては、系全体の内部空間が生物学的に閉鎖されている。
（１－１）培養容器
　細胞培養装置１には、細胞や組織を培養するための培養容器９を設ける。培養容器９の形状や素材は特に限定されず、当業者が通常使用するものを用いることができる。例えば、図１に示したように、硬質プラスティックからなる、密閉されたふた９１と皿９２であってもよい。あるいは図２で示したように、軟質プラスティックからなる、内側底面に培養面９４を有した培養バッグ９３であってもよい。培養容器９は、内部に液体培地１１を保持できるが、その液量を調節することにより、液体培地１１の上部に気相を設ける。
　細胞培養に使用する液体培地１１に対しては、培地のｐＨを一定にするために、例えば重炭酸緩衝系と呼ばれる緩衝系が利用されている。例えば、液体培地１１にＮａＨＣＯ3などの塩基成分を添加し、培養中に５～１０％程度にＣＯ２の濃度を高めた空気と接触させることによって、培地のｐＨを緩衝し、細胞の呼吸によって放出される二酸化炭素によってｐＨの大幅な変化が生じないようにすることができる。培養容器９内の気相では、このＣＯ２の濃度を常に一定にしておく必要があることから、この細胞培養装置には、培養容器９内の気相にある気体を交換するための送気管７及び排気管１２が設けられている。
（１－２）送気部
　送気管７は、その第１の開口７１が培養容器内の気相に開いており、気体が第１の開口７１を通じて培養容器９内の気相に送り込まれる。その際、培養容器９のふた９１を貫通していてもよい。
　送気管７は、換気したい気体を充填したボンベ２に、直接または間接的に接続される。例えば、フィルター５を通してボンベ２に直接接続されていてもよいが、加湿ボトル６を設けることによって間接的に接続されていてもよい。以下、図１を参照して、後者の場合を詳細に述べる。
　加湿ボトル６は密閉されたボトルであり純水等を保持している。加湿ボトル６を設ける場合、送気管７は加湿ボトル６のふたを貫通して、第２の開口７２が加湿ボトル６内部の気相に開いている。送気管７には、送気弁８が設けられ、加湿ボトル６内部の気体を培養容器内の気相に送気するための調節弁となっている。一方、送気したい気体を保存しているボンベ２から加湿ボトル６までガス管３が設けられ、その開口７３が加湿ボトル６内の純水内に開いている。ガス管３には、気体の流量調節器４及び第一のフィルター５が設けられている。
　ガス管３に使用するチューブには、可とう性を有した樹脂材が好適であり、さらに内部を気体で通過させる必要から、気体透過性が低いものがよい。材質として、例えばエチルビニルアルコール（ＥＶＯＨ）やポリエステル、ポリ塩化ビニルなどを用いてもよいが、電磁弁で閉止する部分には高弾性であるゴムを使用してもよい。
　第一のフィルター５は、系内を閉鎖系にするために設けられる。例えばウイルスや細菌の進入を阻止するメッシュサイズ０.２２μｍのフィルターを使用できる。
（１－３）排気部および圧力調節部
　排気管１２はフィルター１３を介して、環境に開くようにする。その途中に、培養容器９内の圧力を調節するための圧力調節部として、閉鎖系内、特に培養容器９内の圧力を一定にする装置を設ける。圧力調節部が減圧装置を含む場合、たとえば、吸引装置１４を接続してもよく、それによって、排気管１２内の気体を効率よく環境に排出することができるようになる。吸引装置１４は排気管１２内の気体を吸引することができれば、その構造は限定されないが、例えば、直方向の流れに対しＴ字に接続された管側をベンチュリ効果によって減圧する機構を有する減圧器（エジェクタ）であってもよい。減圧器による減圧を調節するために、例えば、管によって減圧器に接続された加圧源１５を設けてもよく、加圧源１５と吸引装置１４をつなぐ管に流量調節器１６とを設けてもよい。その場合、流量調節器１６を制御して、加圧源１５で加圧された空気を排出することにより、排気管１２を減圧することができる。そして、流量調節器１６を用いて、加圧された空気の排出量を制御することにより、排気管１２における吸引力を調節することができる。なお、このような構造の減圧器以外にも、吸引装置としてしごきポンプやダイヤフラム式ポンプ、シリンジポンプなどを用いることもできるが、内部には物理的な弁構造が無い吸引装置が好ましい。吸引する必要の無い場合には吸引装置１４をオフにすることにより、故障時にも排気管に閉塞を生じさせず、異常な内圧上昇を招く危険性が無いためである。
　送気管７、排気管１２に使用するチューブには、ガス管３同様、可とう性を有した樹脂材が好適であり、さらに内部を気体で通過させる必要から、気体透過性が低いものがよい。材質として、例えばエチルビニルアルコール（ＥＶＯＨ）やポリエステル、ポリ塩化ビニルなどを用いてもよい。
　第二のフィルター１３は、第一のフィルター５と同様に系内を閉鎖系にするために設けられる。例えばウイルスや細菌の進入を阻止するメッシュサイズ０.２２μｍのフィルターを使用できる。
（１－４）気体交換方法
　上述した気体交換装置を用い、以下のようにして培養容器９内の換気を行うことができる。
　まず、培養容器９に、細胞を含む所定量の液体培地１１を入れる。ボンベ２を開栓し送気弁８を開放する。流量調節器４により気体の流量を調節し、ボンベ２より所定量の気体がガス管３を通じて加湿ボトル６の純水に入るようにする。純水を通過して加湿された気体は、送気管７を通じて培養容器９内の気相に入る。初めは、培養容器９内の気相は空気で満たされているが、時間経過と共に加湿された気体で置換される。
　培養容器９から押し出された気体は、排気管１２を通じて吸引装置１４に到達する。流量調節器１６による制御がないときは、気体は、押し出された力で吸引装置１４の内部を通過し、環境中に排気されるが、流量調節器１６を作動したときは、気体は吸引力によって効率よく排気されるようになる。
　培養容器９に培養バッグ１７を用いた場合、培養バッグ１７に送気すると、培養バッグ１７は膨張するが、吸引装置１４によって系全体の圧力調節を行うことにより、培養バッグ１７の内圧は常圧に維持することができ、培養バッグ１７の形状、および気相部の体積を一定に維持することができる。
（２）細胞培養装置の全体構成
　図３は、細胞培養装置１００の全体構成の一例である。以下に、液体培地の供給または排出する送液制御手段を備えた細胞培養装置１００を説明する。
（２－１）装置構成の説明
　細胞培養装置１００には恒温槽６３を設け、コントローラ６５の制御により細胞培養に最適な培養温度で培養容器３９を保持する。培地交換用の液体培地を低温に保持するための冷蔵庫６４を設ける。恒温槽６３と冷蔵庫６４内に設置された、閉鎖された細胞培養系は、一体の流路として交換可能であり、培養作業ごとに流路全体を取り外して、新たな流路を設置して使用する。
　培養容器３９へ液体を送液したり、または気体を送気したりするための構成を以下に説明する。まず、細胞懸濁液を保持するための密閉された細胞ボトル２０、および細胞ボトル２０に接続された、培養容器３９へ細胞懸濁液を供給するための供給管２３を設ける。供給管２３の一端は、細胞ボトル２０の内部に開口を持ち、保持した細胞懸濁液に接して細胞懸濁液を送液するための開口となる。従って、開口は、細胞ボトル２０の底近くで開いているのが好ましい。供給管２３は供給管２３を制御する開閉弁２４を介して分岐点２５に接続される。この分岐点２５は複数の分岐合流点であり、気体導入弁２７を有する気体導入管２８、供給弁３５を有する供給管３４、が分岐点２５で接続し、さらに換気分岐点２６に向かう気体供給管５１が接続される。分岐点２５は細胞ボトル２０に保持される液体の液面より上方に設けられ、かつ培地ボトル３３に保持する液体の液面より上方に設けられる。
　供給管３４は、培地ボトル３３に接続される。培地ボトル３３は培地交換用の液体培地を保持する液体ボトルであり、冷蔵庫６４内に保持される。細胞ボトル２０のふたは、気圧調整のための気圧調整管２１を設け、気圧調整管２１には、その開閉を制御するフィルター２２を設ける。
　気体導入管２８はフィルター３０を介して気体バッグ２９に接続される。気体バッグ２９には、細胞懸濁液または液体培地のｐＨ値の変化を抑制する気体が至適な濃度で保持されている。気体バッグ２９には気圧調整管３１を介して逆止弁３２が設けられ、逆止弁３２の開放端は恒温槽６３内部に開放している。チェックバルブとも呼ばれる逆止弁３２は流体が流れる方向を一方向に制限するものであり、本実施例では気体バッグ２９から恒温槽６３の空間の方向に気体の流れを方向づけする。
　換気分岐点２６には送液管３８によって送液ポンプ３６が接続される。送液ポンプ３６をバイパスするように第３開閉弁３７が設けられ送液管３８に接続される。
　本実施形態では、培養容器３９は、外観が本体とふたからなる気密な容器である。培養容器３９の本体は内底に細胞を保持して培養可能なディッシュである。ふたには、送液ポート４０と気圧調整ポート４１と排出ポート４２の３つの貫通するポートが設けられている。送液ポート４０には送液管３８が接続され、送液管３８の端はふたの内側近傍で開口している。気圧調整ポート４１は、気圧調整管４３に接続されている。気圧調整管４３は気圧調整弁４４により制御され、さらにフィルター４５を介して吸引装置１４に接続され、恒温槽６３内部に開口している。吸引装置１４に対する加圧源１５および流量調節部１６の機能は上述の通りである。また気圧調整管４３は第２フィルター６８を介して圧力センサー６９に接続される。この圧力センサー６９によって、培養容器３９内部の圧力を常時計測することができる。排出ポート４２は排出管４６に接続され、排出管４６は容器底面近傍で開口している。
（２－２）細胞懸濁液と液体培地を送液する方法
　この細胞培養装置を用いて、培養容器３９に細胞懸濁液と液体培地を送液する方法を説明する。まず気圧調整弁４４を開放し送液ポンプ３６を作動させておき、細胞ボトル２０の細胞懸濁液を培養容器３９に送液するときには開閉弁２４を開放して他の弁２７、３５、３７、５２、５３を閉止し、培地ボトル３３の液体培地を培養容器３９に送液するときには培地開閉弁３５だけを開放して他の弁２４、２７、５２、５３を閉止する。そして、気体バッグ２９の気体を培養容器３９に送気するときには気体導入弁２７だけを開放して他の弁２４、３５、３７、５２、５３を閉止する。このときいずれの場合も培養容器３９内にあった元々の気体は送液ポンプ３６の圧力によりフィルター４５を介して、恒温槽６３内部へ放出される。
（２－３）培養容器の気相に所定の気体を供給する方法
　培養容器３９の気相を所定の気体で換気する方法を説明する。所定の気体に含まれる気体のボンベを気体混合機５９に接続する。一例として、気体混合機５９が１００％ＣＯ２ボンベ６０と、窒素ボンベ６１とフィルター６２に接続されているものとする。大気に開放されたフィルター６２からは、フィルター６２を介して清浄な空気を気体混合機５９に供給することができる。例えば５％ＣＯ２を含んだ空気が必要なとき、フィルター６２から供給される大気で１００％ＣＯ２ボンベ６０から供給されるＣＯ２を希釈して目的の濃度構成を有する気体が生成できる。また低酸素の気体として５％ＣＯ２、１％Ｏ２の気体が必要なとき、窒素ボンベ６１で１００％ＣＯ２ボンベ６０から供給されるＣＯ２を希釈して目的の濃度構成を有する気体が生成できる。
　流量調節器５８は、フィルター５４を介して気体混合機５９に接続されており、気体混合機５９で目的の濃度構成に調製された気体の流量を０から任意の量に制御することができる。流量調節器５８からの管は分岐され、それぞれ換気管５１を制御する第１開閉弁５２および加湿管５５に接続される。加湿管５５は滅菌水を内部に保持した加湿ボトル５６に接続され、加湿ボトル５６に設けられた加湿管５７を制御する第２開閉弁５３に接続される。第１開閉弁５２を有する管と第２開閉弁５３を有する管は合流して、換気管５１を通じて前記した換気分岐点２６に接続される。
　上述したように、細胞培養中の液体培地はｐＨ値が変化することを防止するため、例えば培地に重炭酸緩衝系を用いた場合、定期的にまたは常時ＣＯ２濃度の高い空気の供給を行う必要がある。その上、液体培地から水分が蒸発することによる液体培地成分の濃縮を防止する必要がある。培養容器３９の気相に対して気体の交換および加湿を行うときは、第１開閉弁５２を閉止し、第２開閉弁５３と第３開閉弁３７と気圧調整弁４４を開放した後に気体混合機５９を作動させると、濃度調製された気体が流量調節器５８によって所定の流量に調節され、加湿管５５を経て加湿ボトル５６内の滅菌水を通過して加湿される。加湿ボトル５６内で泡末状となったＣＯ２は、加湿ボトル５６内の気相に滞留し、加湿管５７から換気管５１、第３開閉弁３７を経由し、培養容器３９に到達する。
　このとき、圧力センサー６９は培養容器３９の内圧を計測し、所望の圧力より高いときは、流量調節器１６を作動させ、吸引機１４に接続された排気管４３を介して培養容器３９の内圧を減圧し、所定の圧力に維持する。培養容器の気相の気体交換および加湿は、常時でもよいが、定期的に、または気体が所定の濃度構成に達しているときなど不必要な場合に、送気を停止してもよい。また本実施形態では、一つの培養容器の場合を例としているが、培養容器が複数ある場合は、同時に送気してもよく、１回に培養容器一つずつを一定時間送気するというように容器間欠的な送気を行うことによって、複数の培養容器を巡回して送気もよい。
（２－４）気体バッグに気体を充填する方法
　気体バッグ２９に所望の構成成分を有する気体を必要量充填するときは、第１開閉弁５２と気体導入弁２７を開放し、他の弁２４、３５、３７、５３を閉止した後、気体混合機５９より調製された気体が流量調節器５８の流量調節によって、換気管５１、気体導入管２８を通過して気体バッグ２９に到達する。
（２－５）培養容器内の液体を排出する方法
　培養容器３９に保持されている液体を排出する方法を説明する。培養容器３９に接続された排出管４６は、排出制御弁４７を介して排出ポンプ４８に接続され、排液管４９に繋がり、排液バッグ５０に接続されている。第２開閉弁５３と第３開閉弁３７、排出制御弁４７を開放し、他の弁２４、２７、３５、４４、５２を閉止し、排出ポンプ４８と流量調節器５８が同時に作用すれば、培養容器３９の底部に保持された液体が排液バッグ４９に送液される。このとき培養容器３９内より排出ポンプ４８の吐出量に相当する液体と気体が減量し、流量調節器５８の圧力により混合気体が培養容器３９に流入するので、培養容器３９内は常圧に保持される。
　このとき、培養容器３９内を陰圧としないために、フィルター３０を介する気体導入管２８による圧力調節は行わない。また培養容器３９内に大気を進入させないために、気圧調整管４３による圧力調節は行わない。
（３）細胞培養の操作
　図４は、図３で示した細胞培養装置１００を用い制御部であるコントローラ６５で制御される細胞培養装置における細胞培養の全体的な操作のフローチャートを示している。
　まず、恒温槽６３に流路を設置したのち（Ｓ０１）、別途準備した細胞懸濁液を保持する細胞ボトル２０と、液体培地を保持した培地ボトル３３を流路に接続する（Ｓ０２）。次いで自動で気体バッグ２９に気体を充填する（Ｓ０３）。培養容器３９に気体を送気したのち細胞懸濁液を送液する（Ｓ０４）。直ちに培養容器３９に加湿された気体を送気して、細胞に対し恒温維持して静置する（Ｓ０５）。細胞培養の進行状態によって、液体培地の交換を開始するかどうかの判定を行う（Ｓ０６）。液体培地の交換の際、気体バッグ２９に気体を充填後（Ｓ０７）、培養容器の古い培地を排出したのち（Ｓ０８）、培地ボトルより新しい液体培地を送液する（Ｓ０９）。引き続き加湿した気体の送気と静置を行い（Ｓ１０）、細胞培養の進行状態によって、培養の継続判定を行い（Ｓ１１）、培地交換を再実行する。細胞培養の終了時には、自動培養を終了し、手作業で培養した細胞の取り出しを行い（Ｓ１２）、細菌増殖の有無を確認するため排液バッグ５０を回収して（Ｓ１３）、使用済みの流路を恒温槽６３より取り外して終了する。
（４）まとめ
　以上のように、本明細書で述べた細胞培養装置によれば、閉鎖された培養容器の内部圧力の上昇が抑制される。また、送気された培養容器での圧力の変化が回避され一定圧力で維持できる。その理由は、送気に伴いフィルターで生じる培養容器内の圧力上昇をフィルターの下流の吸引装置による強制排気により減圧され圧力調節されるからである。
　調節すべき培養容器の内圧としては、細胞の培養時は圧力ストレスの影響を避けるため、（大気圧）以上（大気圧＋０.１ｋＰａ）以下の範囲が好ましい。本装置の使用時には、気体流量を約２００ｃｃ／分に高めても、排気装置の制御によって内圧を前記の圧力範囲に制御することが可能である。
　特に、図２のような培養バッグを使用したとき、その内部圧力の上昇や下降を抑制するので、容器形状の変形を一定に維持できる。このことは細胞の培養する培養面の形状が内部圧力によって伸縮することを防止し、細胞増殖への影響を低減できるので、安定な細胞育成に効果がある。
　さらに本細胞培養装置を用いれば、排気側から閉鎖容器内の気体を強制排気することにより、所望の気体を送気すると、培養容器内の気体の排出が促進されるので、細胞容器内の気体を所望の気体構成に早く到達することが出来る。
　また本細胞培養装置を用いれば、培養容器中の圧力を所望の圧力（大気圧または陽圧）に調節することができ、例えば個々の圧力ストレスの違いで増殖が異なる性質を有する細胞がある場合など、培養時の圧力を加圧して細胞培養することができる。
［実施例］
　本実施例では、図３の構成を有する細胞培養装置１００を用い、角膜上皮細胞を培養し、角膜上皮組織を作製した。
　＜細胞培養装置および送液装置の構成＞
　恒温槽６３には恒温培養器（東洋製作所社、型番ＴＶＨＡ６０ＷＡ１２Ａ）を使用し、庫内温度を３７°Ｃで運用し、冷蔵部６４には電子冷熱低温恒温器（東洋製作所社、型番ＴＨＳ０３０ＰＡ）を使用し、庫内温度を４°Ｃで運用した。
　各電磁弁にはピンチバルブ（流体圧力０．１５ ＭＰａ、高砂電気工業社、型番ＰＳＫ－１６１５ＮＣ－９）を使用した。本電磁弁に対応する供給管にはシリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ、外径１／８インチ　サンゴバン社、型番３３５０）を使用した。各ポンプにはチューブポンプ（吐出/吸入圧力　＋／－０．１ＭＰａ、 ウェルコ社、型番ＤＳＷ２－Ｓ１ＡＡ－ＷＰ）としごき用チューブとしてシリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ、外径１／８インチ　サンゴバン社、型番３３５５Ｌ）を組み合わせて使用した。本品はローラー部が本体のモータ部から着脱可能であるので、シリコンゴムチューブ（１３ｃｍ長）をローラー部に巻きつけた状態で滅菌操作が可能である。本ポンプの流量は、ＤＣ１２Ｖ入力において、実測結果より０．１５ｍＬ/秒であった。
　細胞ボトル２０にはクローズドシステム　三角フラスコ（容量５００ｍＬ、コーニング社、型番＃１１４４０）を使用した。
　培地ボトル３３にはＦｌｅｘｂｏｙバッグ（ＥＶＡ、ＥＶＯＨ２重構造、容量１５０ｍＬ、ザルトリウス社、型番＃ＦＦＢ１０２６４３）クローズドシステムを使用した。本品は予め滅菌された、容器とふたと、ふたに設けられた気圧調整のための管路と、メッシュサイズ０．２２μｍのフィルターからなる。
　排液バッグ５０にはＦｌｅｘｂｏｙバッグ（ＥＶＡ、ＥＶＯＨ２重構造、容量０．５Ｌ、ザルトリウス社、型番＃ＦＦＢ１０２６７０）を使用した。
　気体バッグ２９にはＦｌｅｘｂｏｙバッグ（ＥＶＡ、ＥＶＯＨ２重構造、容量１Ｌ、ザルトリウス社、型番＃ＦＦＢ１０３５４７）を使用し、ひとつのルアーポート部に接続した逆止弁にはチェックバルブ（アラム社、型番＃ＰＲＣ１５、クラック圧０．２～１.５ｋＰａ）を使用した。
　加湿ボトル５６には、気体洗浄瓶（容量５００ ｍＬ、アズワン社、型番６－１２９－０２）と、気体交換部にはケラミフィルター（フィルターサイズ１５×１５ｍｍ、アズワン社、型番２－５５４－１０）を組み合わせて使用した。
　外気に接するフィルターにはミディザルト２０００（メッシュサイズ０．２２μｍ、ザルトリウス社、型番＃１７８０５－Ｅ）を使用した。
　電磁弁の閉止部位およびポンプ部のしごき部位以外のチューブには材質が塩化ビニルであるタイゴンＮＤ－１００（内径１／１６インチ、外径１／８インチ、サンゴバン社、型番　＃ＡＤＦ００００２）を使用した。チューブの分岐、および接合部にはＳＭＣカップリング（ＣＰＣ社）シリーズを使用した。詳細には２分岐接合にＹ　Ｆｉｔｔｉｎｇ（接合径１／１６インチ、型番＃ＨＹ２９１）、直線連結にはＳｔｒａｉｇｈｔ　Ｆｉｔｔｉｎｇ（接合径１／１６インチ、型番＃ＨＳ２９１）を使用した。
　培養容器３９はポリカーボネートを材料として射出成形により作製した。細胞を保持する容器面には３５ｍｍ細胞培養表面処理ディッシュ、型番４３０１６５、コーニング社を使用した。
　＜閉鎖系流路の作製方法＞
　以上の構成部品を安全キャビネット内で無菌的に組み立て流路を作成した。次いで、流路を滅菌バックに入れて封止した後、ガンマ線滅菌処理業者に依頼して１５ｋＧｒｙの放射線滅菌処理を行った。
　＜角膜上皮細胞＞
　角膜上皮細胞はフナコシ社より購入したウサギ眼球の角膜輪部から常法に従って角膜上皮細胞を採取し、４×１０４／ｃｍ２となるように培地で懸濁して、細胞ボトル２０に保持した。培地には、５％ＦＢＳを含むＫＣＭ培地を使用した。交換用培地はおなじくＫＣＭ培地５００ｍＬを培地ボトル３３に保持し、冷蔵庫６４に設置した。
　＜角膜上皮細胞の培養開始＞
　図４に記載したフローチャートに従い、細胞培養を行った。
　まず、恒温槽６３に滅菌処理した閉鎖系流路を設置して、各々の電磁弁と細胞培養容器をゴムチューブで接続したのち、恒温槽６３を３７°Ｃに保持した。細胞ボトル２０と培地ボトル３３を流路に接続したのち、自動培養操作を開始した。細胞懸濁液の送液量は１．５ｍＬであり、培地交換の送液量もこれと同様である。排出時は全量排出する目的から、上層からの排出量は３ｍＬとした。気体バッグ２９に保持する気体と送気する気体の濃度構成は、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２、７５％Ｎ２とし、送気する加湿した気体は湿度９５％Ｈに制御し、その送気量は送気流量１００ｃｃ／分とし、送気時間を２分（２００ｍＬ）とした。培養容器の内容積２０ｃｍ３より過剰に注入することとなった。
　培地は、培養開始日より５日目、７日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目に各１回交換した。加湿した気体の送気は１日に４２回、２０分ごとに実施した。５日目より、毎日１回、培養容器の培養細胞面に対して１０エリア取得し、顕微鏡を用いて細胞の状態の観察を行った。
　＜角膜上皮組織の回収方法＞
　培養１６日目に培地交換した後、培養容器を取り出した。安全キャビネット内に細胞培養容器を置き、室温（約２５°Ｃ）で３０分静置した。細胞の接着した容器を取り出し、その後、定法に従ってトリプシン処理を行い培養の表面より細胞を回収した。
［参考例１］
　本参考例では、図１の構成を有する従来型の細胞培養装置１を用い、流量調節器４によって、１０ｋＰａの圧力で上流から気体の送気量を変化したときの培養容器９内における圧力を測定した。
　図５に示すように、送気量に比例して培養容器９内の圧力が高くなった。このように、培養容器９内の気体をボンベの気体に迅速に換気するために、装置内の気体流量を多くすると培養容器９の内圧は高くなるが、流量が少ないと容器内の気体交換に長時間を要することとなる。
　［参考例２］
　本参考例では、実施例の対照実験を行った。
　培養皿には３５ｍｍ細胞培養表面処理ディッシュ、型番４３０１６５、コーニング社を使用した。温度環境およびＣＯ２環境は、ＣＯ２インキュベータ、型番ＭＣＯ１９－ＡＩＣ、三洋電機社を使用し、３７°Ｃ設定、湿度９５％Ｈ設定、ＣＯ２濃度５％設定により、細胞培養を実施した。細胞は実施例と同じものを使用した。
　細胞播種および培地交換は手操作により実施し、滅菌された分注器（ピペットマン、ＧＩＬＳＯＮ社、型番　Ｐ５０００）を使用して実施例と同じ液量を添加した。培地の交換頻度および間隔も実施例と同様に行い、ＣＯ２の制御は培養を通して実施例と同じ設定とした。なお、培地交換時は培養皿を３７°Ｃのホットプレート上に設置して作業実施して温度維持を図った。
　＜実験結果＞
　本実施例の細胞培養装置で作製した角膜上皮細胞は、シート状細胞となって一定の厚みを有しており、安定した剥離回収が可能であった。培養過程の顕微鏡画像の比較においても、細胞の状態に異常はなかった。一方、対照実験により実施して回収された培養細胞とも外見は同等であった。細胞数は、播種した細胞数の約５０倍に増殖し、対照実験より増殖率が高い傾向にあった。
　角膜上皮組織の切片を作成し、上皮細胞に特異的に発現するＣＫタンパク質ファミリーに属するタンパク質の抗体を用い、免疫組織染色によって培養細胞を観察した。具体的には、分化した角膜上皮細胞に特異的に発現するＣＫ３は、基底層以外の細胞での発現が観察され、上皮組織のバリア機能に必要な閉鎖結合タンパクであるクローディン１は、最表層での発現が観察された。これらのタンパク質の発現に、実施例と対照実験との間で有意な差は見られなかった。
１…細胞培養装置、２…ボンベ、３…気体管、４…流量調節器、５…フィルター、６…加湿ボトル、７…送気管、８…送気弁、９…培養容器、１１…液体培地、１２…排気管、１３…フィルター、１４…吸引装置、１５…加圧源、１６…流量調節器、２０…細胞ボトル、２１…気圧調整管、２２…フィルター、２３…供給管、２４…開閉弁、２５…分岐点、２６…換気分岐点、２７…気体導入弁、２８…気体導入管、２９…気体バッグ、３０…フィルター、３１…気圧調整管、３２…逆止弁、３３…培地ボトル、３４…供給管、３５…供給弁、３６…送液ポンプ、３７…第３開閉弁、３８…送液管、３９…培養容器、４０…送液ポート、４１…気圧調整ポート、４２…排出ポート、４３…気圧調整管、４４…気圧調整弁、４５…フィルター、４６…排出管、４７…排出制御弁、４８…排出ポンプ、４９…排液管、５０…排液バッグ、５１…換気管、５２…第１開閉弁、５３…第２開閉弁、５４…フィルター、５５…加湿管、５６…加湿ボトル、５７…加湿管、５８…流量調節器、５９…気体混合機、６０…１００％ＣＯ２ボンベ、６１…窒素ボンベ、６２…フィルター、６３…恒温槽、６４…冷蔵庫、６５…コントローラ、６８…第２フィルター、６９…圧力センサー、７１…第１の開口、７２…第２の開口、７３…開口、９１…ふた、９２…培養皿、９３…培養バッグ、９４…培養面、１００…細胞培養装置
　本発明によって、培養容器内の圧力を調節する構成を有する自動細胞培養装置を提供することができるようになった。

Claims (7)

  1. 　細胞を培養するための培養容器と、
    　前記培養容器内に気体を送気するための送気部と、
    　前記培養容器内の気体を排気するための排気部と、
    　前記培養容器内の圧力を調節するための圧力調節部と、
    　を備える細胞培養装置。
  2. 　前記圧力調節部は、前記培養容器内の圧力を減圧するための減圧装置である、請求項１に記載の細胞培養装置。
  3. 　前記減圧装置は、前記培養容器内の気体を吸引するための吸引装置である、請求項２に記載の細胞培養装置。
  4. 　前記培養容器内の内圧を測定するための圧力センサーを、さらに備える、
    　請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  5. 　前記内圧が（大気圧）以上（大気圧＋０.１ｋＰａ）以下になるように調節される、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  6. 　前記送気部と前記排気部と前記圧力調節部とを制御する制御部を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  7. 　前記培養容器に培養用培地を送液するための送液部と、
    　温度制御部と
    をさらに備える、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
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