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Description
本発明は、送液装置およびそれを用いた細胞培養装置に関する。
近年、細胞培養を自動化できる細胞培養装置が開発されてきた。細胞培養装置においては、培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系培養容器を用いることで、生物学的汚染リスクが低減できる。
培養細胞によっては、細胞の培養容器への接着性を高めるため、細胞培養を始める前に、足場材でコーティングする必要がある。自動培養装置では、足場材溶液の分注器を機械化し、手操作と同様に足場材溶液の分取と移送の動作を連動して足場材添加を行う方法がある(例えば、特許文献1参照)。また、分注操作にポンプを使用し、足場材溶液ボトルと培養皿を使い捨てのチューブで接続し、ポンプによって一定量の足場材溶液を送液する方法がある(例えば、特許文献2、3参照)。
本発明の目的は、新規な送液装置およびそれを用いた細胞培養装置を提供することである。
本発明の一実施態様は、第1の液体を含む第1の容器と、第2の液体を含む第2の容器と、第1の液体及び第2の液体を入れるための第3の容器と、第1の液体及び第2の液体を排出するための第4の容器と、第3の液体を含む第5の容器と、第1の液体を送液するための第1の送液管と、第2の液体を送液するための第2の送液管と、第1の送液管及び第2の送液管に接続し、第1の送液管中の第1の液体及び第2の送液管中の第2の液体を第3の容器に送液するための第3の送液管と、第3の送液管に設けられ、第3の送液管での送液を制御するための第1の送液ポンプと、第3の容器中の第1の液体を排出し、第3の液体を第3の容器に送液するための第4の送液管と、第4の送液管に接続し、第5の容器中の第3の液体を第4の送液管を通じて第3の容器に送液する第5の送液管と、第4の送液管に接続し、第3の容器中の第1の液体を第4の送液管を通じて第4の容器に排出する第6の送液管と、第4の送液管に設けられ、第4の送液管での送液を制御するための第2の送液ポンプと、を備える、送液装置である。第1の送液管、第2の送液管、第5の送液管、および第6の送液管のそれぞれに弁が設けられていてもよい。
本発明の他の実施態様は、細胞培養用培地を含む第1の容器と、細胞懸濁液を含む第2の容器と、細胞を培養するための第3の容器と、培養後の廃液を捨てるための第4の容器と、細胞の足場材を含む足場材溶液を含む第5の容器と、第1の容器中の前記細胞培養用培地を送液するための第1の送液管と、第2の容器中の前記細胞懸濁液を送液するための第2の送液管と、第1の送液管及び第2の送液管に接続し、第1の送液管中の前記細胞培養用培地及び第2の送液管中の前記細胞懸濁液を第3の容器に送液するための第3の送液
管と、第3の送液管に設けられ、第3の送液管での送液を制御するための第1の送液ポンプと、第3の容器中の前記細胞培養用培地を排出し、前記足場材溶液を第3の容器に送液するための第4の送液管と、第4の送液管に接続し、第5の容器中の前記足場材溶液を第4の送液管を通じて第3の容器に送液する第5の送液管と、第4の送液管に接続し、第3の容器中の前記細胞培養用培地を第4の送液管を通じて第4の容器に排出する第6の送液管と、第4の送液管に設けられ、第4の送液管での送液を制御するための第2の送液ポンプと、を備える、送液装置である。第1の送液管、第2の送液管、第5の送液管、および第6の送液管のそれぞれに弁が設けられていてもよい。前記細胞が幹細胞であってもよい。前記足場材が、フィブロネクチン、コラーゲン、アルブミン、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチン、またはゼラチンを含んでもよい。
管と、第3の送液管に設けられ、第3の送液管での送液を制御するための第1の送液ポンプと、第3の容器中の前記細胞培養用培地を排出し、前記足場材溶液を第3の容器に送液するための第4の送液管と、第4の送液管に接続し、第5の容器中の前記足場材溶液を第4の送液管を通じて第3の容器に送液する第5の送液管と、第4の送液管に接続し、第3の容器中の前記細胞培養用培地を第4の送液管を通じて第4の容器に排出する第6の送液管と、第4の送液管に設けられ、第4の送液管での送液を制御するための第2の送液ポンプと、を備える、送液装置である。第1の送液管、第2の送液管、第5の送液管、および第6の送液管のそれぞれに弁が設けられていてもよい。前記細胞が幹細胞であってもよい。前記足場材が、フィブロネクチン、コラーゲン、アルブミン、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチン、またはゼラチンを含んでもよい。
本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかの送液装置を1または複数備える、細胞培養装置である。
本発明によって、新規な送液装置およびそれを用いた細胞培養装置を提供できるようになった。
以下、添付図面を参照して本発明の種々の実施形態について説明する。ただし、これらの実施形態は本発明を実現するための例示に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。なお、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
<送液装置 I>
以下に、送液装置Iの構成例を示す。
以下に、送液装置Iの構成例を示す。
送液装置100は、第1の液体を含む第1の容器102と、第2の液体を含む第2の容器111と、第1の液体及び第2の液体を含む第3の容器108を有する。
第1の容器102、第2の容器111、第3の容器108は、その目的を考慮し、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。それぞれ、外気に開放している気圧調節管103を有し、容器内の気相に末端を有する。第3の容器108も、その目的を考慮し、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。第3の容器108は外気に開放している気圧調節管130を有し、容器内の気相に末端を有する。
送液装置100は、第1の容器102中の第1の液体を送液するための第1の送液管105と、第2の容器111中の第2の液体を送液するための第2の送液管112と、第1の送液管105及び第2の送液管112に接続し、第1の送液管105中の第1の液体及び第2の送液管112中の第2の液体を第3の容器108に送液するための第3の送液管107を有する。第3の送液管107は、第1の送液ポンプ106を有し、第3の送液管107内の送液を調節する。それぞれの送液管は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。例えば、第1の送液管105と第3の送液管107、または第2の送液管112と第3の送液管107を1本の管とし、それぞれ第2の送液管112、または第1の送液管105を接続させるような構造であってもよい。第1の送液管105及び第2の送
液管112はそれぞれ第1の弁113及び第2の弁114を有し、それぞれ開閉を行うことにより、送液の有り・無しを切り替えることができる。
液管112はそれぞれ第1の弁113及び第2の弁114を有し、それぞれ開閉を行うことにより、送液の有り・無しを切り替えることができる。
また、送液装置100は、第3の容器108中の第1の液体を捨てるための第4の容器121と、第3の溶液を含む第5の容器117を有する。第4の容器121や第5の容器117は、目的を考慮し、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。それぞれ、外気に開放している気圧調節管123を有し、容器内の気相に末端を有する。第3の溶液は、粘性があるものが好ましい。それによって、第3の溶液が第1〜第3の送液管を汚すことがない。
送液装置100は、さらに、第3の容器中108の第1の液体を排出し、第3の溶液を第3の容器108に送液するための第4の送液管116と、第4の送液管116に接続し、第5の容器117中の第3の溶液を第4の送液管116を通じて第3の容器108に送液する第5の送液管118と、第4の送液管116に接続し、第3の容器108中の第1の液体を第4の送液管116を通じて第4の容器121に排出する第6の送液管122と、を備える。第4の送液管116は、第2の送液ポンプ115を有し、第4の送液管116内の送液を制御する。それぞれの送液管は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。例えば、第4の送液管116と第5の送液管118、または第4の送液管116と第6の送液管122を1本の管とし、それぞれ第6の送液管122、または第5の送液管118を接続部120で接続させるような構造であってもよい。第5の送液管118及び第6の送液管122はそれぞれ第3の弁119及び第4の弁125を有し、それぞれ開閉を行うことにより、送液の有り・無しを切り替えることができる。
なお、制御部129を設け、ポンプの作動や弁の開閉などを自動的に制御できるようにすることが好ましい。
このように、第1〜第3の送液管と、第4および第5の送液管とを分けることによって、第3の容器108に必要な第3の溶液によって、第1〜第3の送液管が汚染することがない。しかも、第3の溶液の送液を、第1の液体を捨てることに使用されるのと同じポンプを用いることにより、装置構成が単純化される。
<送液装置 II>
送液装置IIを細胞培養に用いる場合について、図2の送液装置を参照しながら、以下に詳細を記載する。
送液装置IIを細胞培養に用いる場合について、図2の送液装置を参照しながら、以下に詳細を記載する。
送液装置200は、細胞培養用培地を含む培地容器202と、細胞懸濁液を含む細胞容器211と、細胞を培養するための培養容器208を有する。
培地容器202や細胞容器211は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。それぞれ、外気に開放している気圧調節管203を有し、容器内の気相に末端を有する。気圧調節管203はフィルター204を有し、培地容器202や細胞容器211に流入する外気を滅菌する。従って、例えばフィルター204は、0.22μmサイズの孔径を有する滅菌用フィルターを用いることができる。細胞培養用培地は、培養する細胞にて適したものであれば、当業者が適切に選択することができる。細胞懸濁液は、培養目的の細胞を培地またはPBSなどの緩衝液に適当な濃度で懸濁した液体である。
培養容器208は特に限定されないが、培養皿や培養ボトルであることが好ましい。培養容器208の底面は、コーティングされていないものが好ましく、例えば市販の細菌培養用プラスティックディッシュを用いることができる。培養容器208は外気に開放している気圧調節管230を有し、容器内の気相に末端を有する。気圧調節管230はフィル
ター209を有し、培養容器208に流入する外気を滅菌する。従って、例えばフィルター209は、0.22μmサイズの孔径を有する滅菌用フィルターを用いることができる。
ター209を有し、培養容器208に流入する外気を滅菌する。従って、例えばフィルター209は、0.22μmサイズの孔径を有する滅菌用フィルターを用いることができる。
送液装置200は、培地容器202中の細胞培養用培地を送液するための培地送液管205と、細胞容器211中の細胞懸濁液を送液するための細胞懸濁液送液管212と、培地送液管205及び細胞懸濁液送液管212に接続部210において接続し、培地送液管205中の細胞培養用培地及び細胞懸濁液送液管212中の細胞懸濁液を培養容器208に送液するための培養物送液管207を有する。培養物送液管207は、第1の送液ポンプ206を有し、培養物送液管207内の送液を調節する。それぞれの送液管は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。例えば、培地送液管205と培養物送液管207、または細胞懸濁液送液管212と培養物送液管207を1本の管とし、それぞれ細胞懸濁液送液管212、または培地送液管205を接続部210で接続させるような構造であってもよい。培地送液管205及び細胞懸濁液送液管212はそれぞれ培地送液弁213及び細胞懸濁液送液弁214を有し、それぞれ開閉を行うことにより、送液の有り・無しを切り替えることができる。
送液装置200は、さらに、外気と接続している2本の気体導入管231、241を有し、それぞれ接続部226、236で培養物送液管207または両方向送液管216に接続する。気体導入管231、241はフィルター227、237を有し、送液装置200に導入する外気を滅菌する。従って、例えばフィルター227、237は、0.22μmサイズの孔径を有する滅菌用フィルターを用いることができる。また、気体導入管231、241は外気流入弁228、238を有し、外気の流入の有り・無しを調節する。これらの気体導入管231、241は、複数の培養容器208にそれぞれ培地容器202からの培地または足場材溶液容器217からの足場材を注入する場合、培養容器208の交換前に外気流入弁228、238を開け、一旦培養物送液管207または両方向送液管216中の培地または足場材を空にするために用いる。
また、送液装置200は、培養後の廃液を捨てるための廃液容器221と、細胞の足場材を含む足場材溶液を含む足場材溶液容器217を有する。廃液容器221や足場材溶液容器217は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。それぞれ、外気に開放している気圧調節管223を有し、容器内の気相に末端を有する。気圧調節管223はフィルター224を有し、廃液容器221や足場材溶液容器217に流入する外気を滅菌する。従って、例えばフィルター224は、0.22μmサイズの孔径を有する滅菌用フィルターを用いることができる。足場材は、培養容器208の底面をコーティングし、培養細胞の接着を促進するものであって、培養する細胞に適合するものを選択すればよい。例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、アルブミン、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチン、またはゼラチンを含んでもよい。
送液装置200は、さらに、培養容器208中の細胞培養用培地を排出し、足場材溶液を培養容器208に送液するための両方向送液管216と、両方向送液管216に接続し、足場材溶液容器217中の足場材溶液を両方向送液管216を通じて培養容器208に送液する足場材溶液送液管218と、両方向送液管216に接続し、培養容器208中の細胞培養用培地を両方向送液管216を通じて廃液容器221に排出する廃液送液管222と、を備える。両方向送液管216は、第2の送液ポンプ215を有し、両方向送液管216内の送液を制御する。それぞれの送液管は、当業者の技術常識によって容易に作製可能である。例えば、両方向送液管216と足場材溶液送液管218、または両方向送液管216と廃液送液管222を1本の管とし、それぞれ廃液送液管222、または足場材溶液送液管218を接続部220で接続させるような構造であってもよい。足場材溶液送液管218及び廃液送液管222はそれぞれ足場材溶液送液弁219及び廃液送液弁225を有し、それぞれ開閉を行うことにより、送液の有り・無しを切り替えることができる。
各容器及び各送液管はそれぞれ気密に保つことができるような構造とするのが好ましく、それによって、装置内部を滅菌状態に維持することができる。また、制御部229を設け、ポンプの作動や弁の開閉などを自動的に制御できるようにすることが好ましい。
このように、足場材溶液送液管218と細胞懸濁液送液管212を分けることによって、送液処理の間に、足場材溶液が通過した後を細胞懸濁液が通過することがなくなり、細胞懸濁液中の細胞が、装置内に付着した足場材溶液によって不適当な場所にトラップされることがなくなる。しかも、足場材溶液の送液を、廃液の送液と同じポンプで行うことによって、全体の装置構成が単純化される。
<送液装置の作動方法>
以下に、送液装置IIを例にして送液装置200の作動方法を詳述する。この送液装置200の制御は、手で行ってもよく、制御部229に行わせてもよい。制御部229に行わせるときのフローチャートを図3に示す。また、図4には、各送液弁のオン(開放)とオフ(閉止)、各送液ポンプのオンとオフについて、時間軸に沿った制御方法を示す。なお、送液装置の作動開始時には、すべてオフとする。
以下に、送液装置IIを例にして送液装置200の作動方法を詳述する。この送液装置200の制御は、手で行ってもよく、制御部229に行わせてもよい。制御部229に行わせるときのフローチャートを図3に示す。また、図4には、各送液弁のオン(開放)とオフ(閉止)、各送液ポンプのオンとオフについて、時間軸に沿った制御方法を示す。なお、送液装置の作動開始時には、すべてオフとする。
(工程1)培養用細胞を細胞容器211に、培地を培地容器202に、足場材溶液を足場材溶液容器217に、それぞれ用意し、図1の構成になるように各流路に、細胞容器211、培地容器202、足場材溶液容器217、廃液容器221を装着する(図3S1)。
(工程2)足場材溶液容器217内の足場材溶液を培養容器208に送液し、培養容器208をコーティングする(図3S2)。以下に具体的に詳述する。
廃液送液弁225を閉止し、足場材溶液送液弁219を開放したのち、図1における反時計回りに第2の送液ポンプ215を稼働させると、足場材溶液容器217内の足場材溶液が足場材溶液送液管218及び両方向送液管216を通じて、培養容器208に送液される。所定の液量が足場材溶液送液管218より培養容器208に供給されたとき第2の送液ポンプ215を停止し、所定時間、培養容器208を静置する。足場材溶液が送液された分、足場材溶液容器217内部の空間体積は増加するが、同量の空気がフィルター227を介して外気から取り込まれるため、足場材溶液容器217内部の圧力は大気圧に維持される。また、培養容器208が気密である場合、足場材溶液が送液された分、培養容器208の空間体積は減少するが、同量の気体がフィルター209を介して外気に排気されるため、培養容器208内部の圧力は大気圧に維持される。静置時間は特に限定されないが、10分から数時間まで、技術常識から適切な時間を選択できる。
(工程3)培養容器208内の足場材溶液を排出する(図3S3)。以下に具体的に詳述する。
足場材溶液送液弁219を閉止し、廃液送液弁225を開放したのち、第2の送液ポンプ215を図1における時計回りに回転すると、培養容器208内の足場材溶液が両方向送液管216及び廃液送液管222を通じ、廃液容器221に排液される。培養容器208内の足場材溶液がほぼ全量排出されたとき第2の送液ポンプ215を停止し、廃液送液弁225を閉止する。足場材溶液が送液された分、廃液容器221内部の空間体積は減少するが、同量の気体がフィルター224を介して外気に排気されるため、廃液容器221内部の圧力は大気圧に維持される。また、培養容器208が気密である場合、足場材溶液が排液された分、培養容器208の空間体積は増加するが、同量の気体がフィルター209を介して外気から取り込まれるため、培養容器208内部の圧力は大気圧に維持される
。
。
(工程4)培地容器202内の培地を培養容器208に送液する(図3S4)。以下に具体的に詳述する。
細胞懸濁液送液弁214と外気流入弁228を閉止し、培地送液弁213を開放したのち、第1の送液ポンプ206を図2における時計回りに稼働させると、第1の送液ポンプ206は培地送液管205及び培養物送液管207を通じて、培養容器208に培地を送液する。所定の液量の培地が培地容器202から培養容器208に供給されたとき、第1の送液ポンプ206を停止する。培地が送液された分、培地容器202内部の空間体積は増加するが、同量の気体がフィルター204を介して外気から取り入れられるため、培地容器202内部の圧力は大気圧に維持される。また、培養容器208が気密である場合、培地が送液された分、培養容器208の空間体積は減少するが、同量の気体がフィルター209を介して外気に排出されるため、培養容器208内部の圧力は大気圧に維持される。最後に外気流入弁228を開放すると、全体の圧力が微調整されて、ほぼ大気圧に等しくなる。
ここで、工程203で培養容器208から除去しきれなかった足場材溶液を洗浄するため、1回または複数回、洗浄工程を行ってもよい。その場合、足場材溶液送液弁219を閉止し、廃液送液弁225を開放したのち、第2の送液ポンプ215を図1における時計回りに回転すると、培養容器208内の培地が両方向送液管216及び廃液送液管222を通じ、廃液容器221に排液される。培養容器208内の足場材溶液がほぼ全量排出されたとき第2の送液ポンプ215を停止し、廃液送液弁225を閉止する。培地が送液された分、廃液容器221内部の空間体積は減少するが、同量の気体がフィルター224を介して外気に排気されるため、廃液容器221内部の圧力は大気圧に維持される。また、培養容器208が気密である場合、培地が排液された分、培養容器208の空間体積は増加するが、同量の気体がフィルター209を介して外気から取り込まれるため、培養容器208内部の圧力は大気圧に維持される。その後、上述のようにして、再度培地容器202内の培地を培養容器208に送液する。複数回の洗浄工程を行う時は、この部分工程を繰り返して行う。
(工程5)細胞容器211内の細胞懸濁液を培養容器208に送液する(図3S5)。以下に具体的に詳述する。
培地送液弁213と外気流入弁228を閉止し、細胞懸濁液送液弁214を開放したのち、第1の送液ポンプ206を図2における時計回りに稼働させると、第1の送液ポンプ206は細胞懸濁液送液管212及び培養物送液管207を通じて、培養容器208に細胞懸濁液を送液する。所定の液量が細胞容器211より供給されたとき第1の送液ポンプ206を停止する。細胞懸濁液が送液された分、細胞容器211内部の空間体積は増加するが、同量の気体がフィルター204を介して外気から取り入れられるため、細胞容器211内部の圧力は大気圧に維持される。また、培養容器208が気密である場合、細胞懸濁液が送液された分、培養容器208の空間体積は減少するが、同量の気体がフィルター209を介して外気に排出されるため、培養容器208内部の圧力は大気圧に維持される。最後に外気流入弁228を開放すると、全体の圧力が微調整されて、完全に大気圧と等しくなる。
100…送液装置、102…第1の容器、103…気圧調節管、104…フィルター、105…第1の送液管、106…第1の送液ポンプ、107…第3の送液管、108…第3の容器、109…フィルター、110…接続部、111…第2の容器、112…第2の送
液管、113…第1の弁、114…第2の弁、115…第2の送液ポンプ、116…第4の送液管、117…第5の容器、118…第5の送液管、119…第3の弁、120…接続部、121…第4の容器、122…第6の送液管、123…気圧調節管、124…フィルター、125…第4の弁、129…制御部、130…気圧調節管、201…送液装置、202…培地容器、203…気圧調節管、204…フィルター、205…培地送液管5、206…第1の送液ポンプ、207…培養物送液管、208…培養容器、209…フィルター、210…接続部、211…細胞容器、212…細胞懸濁液送液管、213…培地送液弁、214…細胞懸濁液送液弁、215…第2の送液ポンプ、216…両方向送液管、217…足場材溶液容器、218…足場材溶液送液管、219…足場材溶液送液弁、220…接続部、221…廃液容器、222…廃液送液管、223…気圧調節管、224…フィルター、225…廃液送液弁、226…接続部、227…フィルター、228…外気流入弁、229…制御部、230…気圧調節管、231…外気流入管、236…接続部、237…フィルター、238…外気流入弁、241…外気流入管
液管、113…第1の弁、114…第2の弁、115…第2の送液ポンプ、116…第4の送液管、117…第5の容器、118…第5の送液管、119…第3の弁、120…接続部、121…第4の容器、122…第6の送液管、123…気圧調節管、124…フィルター、125…第4の弁、129…制御部、130…気圧調節管、201…送液装置、202…培地容器、203…気圧調節管、204…フィルター、205…培地送液管5、206…第1の送液ポンプ、207…培養物送液管、208…培養容器、209…フィルター、210…接続部、211…細胞容器、212…細胞懸濁液送液管、213…培地送液弁、214…細胞懸濁液送液弁、215…第2の送液ポンプ、216…両方向送液管、217…足場材溶液容器、218…足場材溶液送液管、219…足場材溶液送液弁、220…接続部、221…廃液容器、222…廃液送液管、223…気圧調節管、224…フィルター、225…廃液送液弁、226…接続部、227…フィルター、228…外気流入弁、229…制御部、230…気圧調節管、231…外気流入管、236…接続部、237…フィルター、238…外気流入弁、241…外気流入管
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