JP7058006B2 - 遠心バッグと一体になった動物細胞培養用バッグ - Google Patents

Description

本発明は、培養バッグと細胞分離用遠心管とを一体化した培養装置、及び前記培養装置を用いた培養方法に関する。

バイオ医薬品等の生産には、微生物、動物細胞、植物細胞、菌類などの生体細胞を培養する培養法が用いられている。
培養に用いられるバイオリアクターとして、時間のかかる洗浄と殺菌の工程をなくすために、プラスチック製の一回で使い捨てされる（シングルユース）培養バッグ及び配管材料が使用されるようになっている。
使い捨ての培養バッグを利用した培養方法として、シーソー運動で培養液が入ったバイオリアクターを揺動させることで、培養液に供給された栄養源等を混合するとともに液表面から酸素の供給及び炭酸ガスの供給あるいは除去を行うウェーブ式攪拌培養があり、動物細胞や昆虫細胞の培養、抗体医薬やワクチンの種培養などに用いられている。

例えば、ウェーブ式攪拌培養に用いる培養バッグとして、特許文献１には、ボトムシートとトップシートの２枚で形成されており、互いに接合されて２つのエンドエッジ及び２つのサイドエッジを形成するバイオリアクターバッグであって、バッフルが２つのエンドエッジのいずれか１つまでの最短距離が２つのエンドエッジ間の距離の四分の一よりも大きい領域でボトムシートから伸延、膨張可能なバイオリアクターバッグが開示されている。バッフルの位置を上記の様にすることにより、攪拌強度が増大し、空気－液体界面でのガス交換が改良されると記載されている。

また、特許文献２には、可撓性を有し、内部に培養液を封入可能な培養バッグを収めるハウジング部を備え、培養バッグと当接するハウジング部の当接面の一部に、湾曲凸状の突起部を設けることにより、培養液の攪拌効率を向上させると共に、培養液が漏出する懸念をより低減させたシングルユース細胞培養装置が提案されている。

培養バッグを用いて細胞培養を行った後、培養液から培養バッグで培養された細胞を分離するために培養バッグ内の細胞を含んだ培地を細胞分離装置で処理する必要がある。このため、上記のような培養バッグを用いた場合、培養バッグの内容物を細胞分離装置に移送するための移送用チューブと細胞分離装置の接続部とを接続する作業が必要となり、また、移送用チューブを細胞分離装置の接続部と接続する際の環境をクリーンな状態とする必要があるため、取り扱いの簡便さに欠け、またコンタミネーションが発生する虞があった。

コンタミネーションの発生を極力防止する細胞の遠心分離方法として、特許文献３には、培地が漏出することのないガス透過膜を有した培養容器を用い、当該容器内において密閉状態にて細胞を付着培養した後、前記容器ごと遠心分離を行い、前記細胞を遠沈させる遠心分離方法が記載されている。この方法によると、細胞の培養時における培地の交換に際して、容器を交換することなく、細胞のみを回収することができる。この細胞の遠心分離方法は、付着培養に関し、培地に付着している細胞を、遠心分離により培地から剥離し、培養容器の下隅部に遠沈させるものである。

特表２０１４－５０７９５９号公報 特開２０１７－３５００９号公報 特開２００４－１０５１３９号公報

本発明は、浮遊培養において、培養バッグ内の細胞を含んだ培養液を培養バッグから遠心管に移送する際の取り扱いを容易にし、またコンタミネーションを防止することができる培養装置及び培養方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するための本発明は、以下のとおりである。
（１）可撓性材料からなる培養バッグと、細胞分離用遠心管と、前記培養バッグから前記細胞分離用遠心管に培養液を移送するための培養液移送用チューブと、を有し、
前記細胞分離用遠心管は、開口部を有する容器本体と、該容器本体の開口部を閉蓋する蓋体であって、蓋部と、該蓋部の容器本体とは反対側に形成された、前記培養バッグ及び前記培養液移送用チューブを収容する収容部と、を有し、
前記培養液移送用チューブは培養液の移送経路に開閉コックを有する、
ことを特徴とする培養装置。
（２）前記蓋体は、第一の蓋体と、第二の蓋体とからなり、
前記第一の蓋体は前記細胞分離用遠心管の容器本体の開口部を閉蓋する蓋部と、該蓋部の周縁部に前記容器本体とは反対側に立設された壁部とを有し、前記蓋部と前記壁部とによって、前記収容部が形成されており、
前記第二の蓋体は、前記第一の蓋体の前記壁部の端部によって形成される開口部を閉蓋する蓋体である、
ことを特徴とする、上記（１）に記載の培養装置。
（３）上記（１）または（２）に記載の培養装置を用いた培養方法であって、
前記細胞分離用遠心管の容器本体内が減圧にされた前記培養装置を準備する工程と、
前記培養バッグを用いてバッチ式で培養を行う培養工程と、
前記培養液移送用チューブの開閉コックを開いて、培養液を前記培養バッグから前記細胞分離用遠心管の容器本体に移送する培養液移送工程と、
前記培養バッグを折り畳んで、折り畳まれた培養バッグと培養液移送用チューブを前記細胞分離用遠心管の前記蓋体の収容部に収容する工程と、
前記培養液を収容した細胞分離用遠心管の容器本体、前記折り畳まれた培養バッグ、培養液移送用チューブ、及び蓋体からなる培養装置を遠心分離機にかけて細胞を分離する細胞分離工程と、
前記細胞分離用遠心管内の分離後の上清又は細胞を回収する工程と、
を有する培養方法。
（４）前記分離後の上清または細胞を回収する工程の後に、上清に含まれる抗体を精製する工程、または、分離した細胞を再度培地に懸濁させて、新しい培地に播種する工程を有する上記（３）に記載の培養方法。

本発明の培養装置及び培養方法を用いることにより、浮遊培養において、培養バッグ内の細胞を含んだ培養液を培養バッグから遠心管に移送する際の取り扱いを容易にし、またコンタミネーションを防止することができる。

本発明の培養装置を用いた培養方法の一例を示す概略図である。 本発明の細胞分離用遠心管の構造の一例を示す図である。 本発明の細胞分離用遠心管の構造の他の例を示す図である。 本発明の培養方法のフローを示す概略図である。 従来の培養方法のフローを示す概略図である。

本発明の培養装置は、培養バッグと細胞分離用遠心管とを一体化させた培養装置である。
図１及び図２に基づいて本発明の培養装置の実施形態について説明する。
図１に本発明の培養装置の基本的な構成の一例を示す。
本発明の培養装置１０は、図１に示すように、可撓性材料からなる培養バッグ１と、細胞分離用遠心管（以下「遠心管」という）２０とを、培養液を培養バッグ１から遠心管２０に移送するための培養液移送用チューブ５で接続したものである。
図２に示すように、前記遠心管２０は、開口部を有する容器本体２と、前記容器本体２の開口部を閉蓋する第一の蓋体３と、第一の蓋体３の開口部を閉蓋する第二の蓋体４とを有する。前記容器本体２は培養開始時には内部が減圧状態となっており、前記第一の蓋体３には前記培養液移送用チューブ５が接続されている。前記第一の蓋体３は、容器本体２の開口部を閉蓋する蓋部３ａと、前記培養液移送用チューブ５及び培養バッグ１を収容する収容部３ｃとを有している。前記培養液移送用チューブ５は移送経路中に開閉コック６を有している。
本発明の培養装置１０は、全てが樹脂性、滅菌済みの１回使い捨て（シングルユース）製品である。培養装置１０の培地接触部は予め滅菌されている。最初、培養液移送用チューブ５上の開閉コック６は閉じられ、培養バッグ１は折り畳まれ、遠心管２０の容器本体内を減圧とした状態で提供されることが好ましい。培養バッグ１が折り畳まれた状態で、第一の蓋体３の収容部３ｃに収容され、第二の蓋体４で閉蓋されている状態で提供されると、取扱いが容易となる。

従来は、例えば図５に示すように、前段の細胞のバッチ式の培養工程で得られた培養液を遠心分離処理するには、クリーンベンチにおいて、手作業により、培養バッグ１に移送用チューブ５を接続して培養液を遠心分離管２に移送するか、あるいはピペットなどを用いて培養液を遠心分離管２に移し替える必要があった。

本発明の培養装置１０は、図１に示すように、培養バッグ１と細胞分離用遠心管２０とが開閉コック６を有する培養液移送用チューブ５を介して一体化しているため、培養液を移送するためのラインチューブの接続操作が不要となる。これにより、チューブ接続操作に伴うコンタミネーションが防止され、作業時間が短縮される。また、これにより、バイオ医薬品の生産効率が向上する。

以下、培養バッグ、遠心管及び培養液移送用チューブについて説明する。
（培養バッグ）
本発明における培養バッグ１は、可撓性材料からなる。可撓性材料としては、例えば、エチレン酢酸ビニル共重合体樹脂、エチレンビニルアルコール共重合体樹脂の多層フィルムで構成されたものを好適に用いることができる。中が見えるように透明であるものが好ましい。このような培養バッグは、医薬品包装用途のシングルユースのバッグとして各社から市販されているものと同様なものを用いることができる。

培養バッグ１には、開閉コック６を有する培養液移送用チューブ５が接続されており、その他、ガス入口１ａ、ガス出口１ｂ、細胞・培地注入口１ｃ、サンプリング口１ｄ、等が設けられていてもよい。ガス入口１ａ、ガス出口１ｂ、細胞・培地注入口１ｃは、ガス、細胞、培地などの材料を培養バッグ１に出し入れするために設けられた開口であり、気密接続を容易にするための継ぎ手を備えていることが多い。
培養液移送用チューブ５は、上記ガス入口１ａ、ガス出口１ｂ、細胞・培地注入口１ｃ、サンプリング口１ｄと同様、コンタミネーション防止の観点で、培養バッグ１の上部の空間部分となる位置に接続されることが好ましい。
また、培養バッグ１は、予めガンマ線、紫外線、エチレンオキシドガスなどによって滅菌されて無菌状態が維持され、気体や液体などの内容物がほぼ抜かれて、折り畳まれた状態で提供されることが好ましい。

（遠心管）
遠心管２０は、図２に示すように、開口部を有する容器本体２と、容器本体２の開口部を閉蓋する第一の蓋体３と、前記第一の蓋体３の開口部を閉蓋する第二の蓋体４とを有している。
第一の蓋体３は、蓋部３ａと、該蓋部３ａの周縁部に容器本体２とは反対側に立設された壁部３ｂとを有し、蓋部３ａと壁部３ｂとによって、前記培養バッグ１及び前記培養液移送用チューブ５を収容する収容空間を有する収容部３ｃが形成されている。
また、第二の蓋体４は、第一の蓋体３の壁部３ｂの端部によって形成される、収容部３ｃの開口部を閉蓋する蓋体である。
第一の蓋体３には、途中に開閉コック６を有する培養液移送用チューブ５の一端が接続され、培養液移送用チューブ５の他端は培養バッグ１に接続されている。
遠心管２０の容器本体２、第一の蓋体３、及び第二の蓋体４としては、ポリエチレン、ポリプロピレン等のプラスチック製のものが好ましく使用できる。
遠心管２０の容器本体２の開口部は第一の蓋体の蓋部３ａで閉じられ、容器本体２の内部は無菌状態が維持され、培養液が移送される前は、培養液移送用チューブ５に設けられたコック６が閉じられ、減圧状態となっている。容器本体２内を減圧状態とすることにより、培養液が移送される際に、培養液とガスが遠心管２０の容器本体２内に移送されやすく、ガスで満たされた培養バッグ１の内容物が抜かれ、培養バッグ１を折り畳めるようにすることができる。
この時、遠心管２０の容器本体２の容積が培養バッグ１の容積と同程度以上であれば、培養バッグ１の内容物が全て遠心管２０の容器本体２に移送され、培養バッグ１が空になり、折り畳むことができる。尚、遠心管２０の容器本体２の容積が培養バッグ１の容積よりも小さい場合は、培養バック１の培養液移送用チューブ５が取り付けられた位置に培養液を移動させてからコック６を開いて、培養バッグ１から培養液を（優先的に）遠心管２０の容器本体２に移送し、培養バッグ１に残ったガスをガス出口１ｂから排出することで培養バック１を空にし、折り畳むことができる。遠心管２０の容器本体２の容積は培養バッグ１の容積と同程度の容積であると無駄がなく、好ましい。
前記第一の蓋体３は、培養液移送用チューブ５が接続された培養バッグ１を収容する収容部３ｃを有し、培養液が移送された後の培養バッグ１を折り畳んで収容することができる。

図３に第二の蓋体４の別の態様を示す。
図３Ａは第一の蓋体３の開口部を開けた状態を示し、図３Ｂは第一の蓋体３の開口部を第二の蓋体４で閉じた状態を示している。図３Ｃは第二の蓋体４を真上から見た図である。
第二の蓋体４は蓋部４ａと、ヒンジ部４ｂと係止部４ｃとからなっており、蓋部４ａはヒンジ部４ｂを介して第一の蓋体３の壁部３ｂと連結されている。
第一の蓋体３と第二の蓋体４とは一体成形によって成形することができる。
第二の蓋体４を図３に示したような構成とすることにより第一の蓋体３の開口部の開閉が簡単になる。

（培養液移送用チューブ）
培養液移送用チューブ５は、培養バッグ１と、遠心管２０の第一の蓋体３に接続され、開閉コック６が設けられている。細胞の培養を行う時は、開閉コック６を閉じた状態で行い、培養液を移送する際に開閉コック６を開いて培養液を遠心管２０の容器本体２に移送する。
前記培養液移送用チューブ５としては、シリコン、ポリ塩化ビニル製のものが好ましく使用できる。

（培養方法）
本発明の培養方法は、図４に示すように、容器本体２内が減圧状態となっている培養装置１０を準備する、培養装置準備工程（４Ａ）と、前記培養バッグ１でバッチ培養を行う培養工程（４Ｂ）と、前記培養液移送用チューブ５の開閉コック６を開いて、培養液を培養バッグ１から遠心管２０の容器本体２に移送する、培養液移送工程（４Ｃ）と、培養バッグ１を折り畳んで、培養液移送用チューブ５と共に、遠心管２０の第一の蓋体３に設けられた収容部３ｃに収容し、第一の蓋体３を第二の蓋体４で閉蓋する、培養バッグ及び培養液移送用チューブの収容工程（４Ｄ）と、遠心分離機によって培養液から細胞を遠心分離する、細胞分離工程（４Ｅ）と、前記遠心管２０の第一の蓋体３を開蓋し、分離後の上清又は細胞を回収する、上清又は細胞の回収工程（４Ｆ）とを有する。

以上に説明した培養装置を用いた培養方法について、図４を参照して以下に詳細に説明する。なお、以下の説明は操作の概要について説明するものであり、必ずしも下記の手順に拘束されるものではない。

［培養装置準備工程］（図４Ａ参照）
培養バッグ１と、細胞分離用遠心管２０と、開閉コック６付き培養液移送用チューブ５とを有する培養装置１０であって、前記細胞分離用遠心管２０の容器本体２内を減圧状態とし、この減圧状態が開閉コック６を閉とすることによって保たれている培養装置１０を準備する。

［培養工程］（図４Ｂ参照）
培養バッグ１が、折り畳まれた状態で提供された場合は、培養バッグ１を広げ、培養液移送チューブ５の開閉コック６が閉じていることを確認する。
細胞・培地注入口１ｃを介して、培養バッグ１の内部に目的の細胞３１と培地３２を懸濁した培養液を充填する。培養液は、予め所定の細胞濃度となるように調製された後に充填してもよいが、培地３２を充填した後に、細胞３１を播種して所定の細胞濃度となるように調製してもよい。なお、図には記載していない培地供給槽または培養液調製槽と、細胞・培地注入口１ｃとは、無菌的に接続されることは言うまでもない。
培養バッグ１は、ガス入口１ａを介してガス供給手段と接続されている。液中通気用のガス供給手段と気相用のガス供給手段を駆動させて培養バッグ１内に所定濃度の酸素混合ガスを通気し、培養を開始する。
培養は、バッチ培養で行ない、具体的な培養法としてはＷＡＶＥ式のバッチ培養法などを挙げることができる。
培養液を揺り動かす際には、例えば、培養液移送用チューブ５と遠心管２０を培養バッグ１から離して配置し培養バッグ１のみを揺動させることができる。
培養バッグ１の容量は、最大培地容量の２倍程度であることが好ましい。

培養液のｐＨ、温度、ＤＯ（溶存酸素濃度）、ＤＣＯ_２（溶存二酸化炭素濃度）は、計測手段としてセンサおよび計測器によって測定され、制御装置に入力される。制御装置では、空気と酸素、および窒素の混合ガスの各通気量を調整することにより所定のｐＨ、ＤＯ、ＤＣＯ_２を維持して培養を継続する。また、細胞濃度や培地成分濃度の測定は、サンプリング口１ｄによって、培養中の培養液の一部を無菌的に取り出して計測することができる。細胞濃度の計測を光学的濁度によって行う場合には、計測手段として、予め設けた濁度センサを接続することによって可能となる。これによって、培養を行っている間、培養液中の培養環境を、細胞の培養に適正な状態に維持することができる。
培養を行う際は、遠心管２０の第二の蓋体４は取り外しておく。

［培養液移送工程］（図４Ｃ参照）
サンプリング口１ｄより培地３２を採取し、細胞数および細胞の生存率を計測し、目標値に達したことを確認し、培養が終了すると、揺動が停止される。その後、培養バッグ１に設けた培養液移送用チューブ５の開閉コック６を開にして遠心管２０の容器本体２に培養液を送り込む。遠心管２０の容器本体２内が減圧状態であるため、開閉コック６を開にすることにより容器本体２に培養液を送り込むことができる。
培養バック１の内容物がすべて容器本体２に移送されるよう、容器本体２の容積が、培養バッグ１の容積と等しいことが好ましい。

［培養バッグ及び培養液移送用チューブの収容工程］（図４Ｄ参照）
培養液が容器本体２内に収容された後、空になった培養バッグ１及び培養液移送用チューブ５を折り畳んで、遠心管２０の第一の蓋体３に設けられた培養バッグの収容部３ｃに収容し、第二の蓋体４で閉蓋する。

［細胞分離工程］（図４Ｅ参照）
培養バッグ１を収容した培養装置１０を、遠心分離機にセットする。バランサーが必要な場合は、バランサー用の遠心管に、培養液の入った遠心管２０と同じ質量になるように容器本体２に水３３を入れ、培養バッグ１と培養液移送チューブ５の質量の合計と同じ質量の重りを収容部３ｃに収容し、両者を対に遠心分離機にセットすることが好ましい。但し、培養装置１０が偶数個ある場合は、これらを遠心分離機に対にセットすればバランサーは不要である。
遠心分離の条件は培養する細胞の種類によって適宜調整する。例えば、４℃、５００～１０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行うことができる。

［上清又は細胞の回収工程］（図４Ｆ参照）
クリーンベンチ等の無菌状態で、遠心分離を行った遠心管２０の第一の蓋体３を開蓋し、分離後の培地上清または沈殿した細胞を回収する。

［抗体精製－スケールアップ培養工程］
前記分離後の上清または細胞を回収する工程の後に、上清に含まれる抗体（バイオ原薬）を精製する工程、または、分離した細胞を再度培地に懸濁させて、新しい培地に播種する工程を有することができる。

１ 培養バッグ
１ａ ガス入口
１ｂ ガス出口
１ｃ 細胞・培地注入口
１ｄ サンプリング口
２ 容器本体、遠心分離管
３ 第一の蓋体
３ａ 蓋部
３ｂ 壁部
３ｃ 収容部
４ 第二の蓋体
４ａ 蓋部
４ｂ ヒンジ部
４ｃ 係止部
５ 培養液移送用チューブ
６ 開閉コック
１０ 培養装置
２０ 細胞分離用遠心管
３１ 細胞
３２ 培地

Claims (4)

1. 可撓性材料からなる培養バッグと、細胞分離用遠心管と、前記培養バッグから前記細胞分離用遠心管に培養液を移送するための培養液移送用チューブと、を有し、
   前記細胞分離用遠心管は、開口部を有する容器本体と、該容器本体の開口部を閉蓋する蓋体と、を有し、
   前記蓋体は、蓋部と、該蓋部の容器本体とは反対側に形成された、前記培養バッグ及び前記培養液移送用チューブを収容する収容部と、を有し、
   前記培養液移送用チューブは培養液の移送経路に開閉コックを有する、
   ことを特徴とする培養装置。
2. 前記蓋体は、第一の蓋体と、第二の蓋体とからなり、
   前記第一の蓋体は前記細胞分離用遠心管の容器本体の開口部を閉蓋する蓋部と、該蓋部の周縁部に前記容器本体とは反対側に立設された壁部とを有し、前記蓋部と前記壁部とによって、前記収容部が形成されており、
   前記第二の蓋体は、前記第一の蓋体の前記壁部の端部によって形成される開口部を閉蓋する蓋体である、
   ことを特徴とする、請求項１に記載の培養装置。
3. 請求項１または請求項２に記載の培養装置を用いた培養方法であって、
   前記細胞分離用遠心管の容器本体内が減圧にされた前記培養装置を準備する工程と、
   前記培養バッグを用いてバッチ式で培養を行う培養工程と、
   前記培養液移送用チューブの開閉コックを開いて、培養液を前記培養バッグから前記細胞分離用遠心管の容器本体に移送する培養液移送工程と、
   前記培養バッグを折り畳んで、折り畳まれた培養バッグと培養液移送用チューブを前記細胞分離用遠心管の前記蓋体の収容部に収容する工程と、
   前記培養液を収容した細胞分離用遠心管の容器本体、前記折り畳まれた培養バッグ、培養液移送用チューブ、及び蓋体からなる培養装置を遠心分離機にかけて細胞を分離する細胞分離工程と、
   前記細胞分離用遠心管内の分離後の上清又は細胞を回収する工程と、
   を有する培養方法。
4. 前記分離後の上清または細胞を回収する工程の後に、上清に含まれる抗体を精製する工程、または、分離した細胞を再度培地に懸濁させて、新しい培地に播種する工程を有する請求項３に記載の培養方法。

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