JP2018027030A

JP2018027030A - 細胞培養装置

Info

Publication number: JP2018027030A
Application number: JP2016159575A
Authority: JP
Inventors: 幡多　徳彦; Norihiko Hata; 徳彦幡多; 正広村井; Masahiro Murai
Original assignee: Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Current assignee: Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2016-08-16
Publication date: 2018-02-22
Anticipated expiration: 2036-08-16
Also published as: TW201819617A; JP6724649B2; WO2018034269A1

Abstract

【課題】培養バッグを用いて培養された細胞を回収又は移送するに際し、培養バッグが備える移送用ポートの送流孔に細胞が到達し易くすることで、より多くの細胞を回収又は移送できるようにする。【解決手段】培養バッグ１０が載置される基台２に、培養バッグ１０を載置したときに移送用ポート１１が対向する部位に切り欠き部２２を形成し、移送用ポート１１の送流孔１２の最下部が、培養バッグ１０が載置される基台２の載置面を含む基準面よりも下方に位置する状態で、移送用ポート１１を保持具３に保持する。【選択図】図３

Description

本発明は、培養バッグを用いて細胞培養を行う細胞培養装置に関する。

近年、医薬品の生産、遺伝子治療、再生医療、免疫療法などの医薬学・生化学分野において、細胞（組織、微生物、ウイルスなどを含む）を人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。

このような要求に応えるべく、本出願人は、可撓性材料からなる袋状の培養バッグを用いて閉鎖系の環境を構築し、コンタミネーションのリスクを低減しつつ、効率的に細胞を培養することができる細胞培養に係る技術について検討を重ねてきた。

例えば、本出願人は、特許文献１において、移送チューブを介して複数の培養バッグを接続し、容量の小さい培養バッグで培養された細胞をより容量の大きい培養バッグに移送して、細胞の密度を適性に維持しながら、細胞を効率良く増殖させる細胞培養方法を提案している。

また、特許文献１では、相対的に高い位置に配置された培養バッグを、当該培養バッグが備える移送用ポートが下側となるように傾けて、その内容液（培養された細胞が培地中に懸濁した細胞懸濁液）を移送用ポートから送流することによって、相対的に低い位置に配置された培養バッグに移送することも提案している。そして、特許文献１には、培養バッグを傾ける装置の一例として、培養バッグが載置された基台を、その一端側を軸支して回動させることによって培養バッグを傾ける例を示している。

特開２０１５−１８８３９２号公報

しかしながら、その後の本出願人の検討によれば、培養バッグが備える移送用ポートから内容液を送流して、培養された細胞を回収又は移送する際には、培養バッグ内の移送用ポートの近傍に細胞が滞留し易い傾向にあり、滞留した細胞は培養バッグ内に残って回収できなくなってしまうという知見が得られている。

これは、次のような理由によるものと考えられる。すなわち、移送用ポートは、通常、ある程度の厚みのある管状の部材からなり、図４に示すように、培養バッグ１０を基台２ｐに載置したときに、培養バッグ１０の内底面と移送用ポート１１の送流孔１２との間には、移送用ポート１１の厚み分の段差が形成され、また、移送用ポート１１の周辺では、培養バッグ１０の内底面に可撓性材料の撓みによるシワが生じ易い。そのため、このような段差やシワに遮られて、移送用ポート１１の送流孔１２に到達できなかった細胞Ｃが、移送用ポート１１の手前に滞留してしまうためであると考えられる。
なお、図４は、従来技術を示す説明図であり、基台２ｐに載置された培養バッグ１０の移送用ポート１１側の断面を示している。

本発明は、このような知見に基づいてなされたものであり、培養バッグを用いて培養された細胞を回収又は移送するに際し、培養バッグが備える移送用ポートの送流孔に細胞が到達し易くすることで、より多くの細胞を回収又は移送できるようにした細胞培養装置の提供を目的とする。

本発明に係る細胞培養装置は、可撓性材料からなる培養バッグを用いて細胞培養を行う細胞培養装置であって、前記培養バッグが載置される基台と、前記培養バッグに設けられた移送用ポートを保持する保持具とを備え、前記基台には、前記培養バッグを載置したときに前記移送用ポートが対向する部位に、切り欠き部が形成され、前記保持具が、前記移送用ポートの送流孔の最下部が、前記培養バッグが載置される前記基台の載置面を含む基準面よりも下方に位置する状態で、前記移送用ポートを保持する構成としてある。

本発明によれば、培養バッグを用いて培養された細胞を回収又は移送するに際し、移送用ポートの近傍に細胞が滞留することによる培養バッグ内での細胞残留を軽減し、より多くの細胞を回収又は移送することができる。

本発明の実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す説明図である。本発明の実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す説明図である。図２のＡ−Ａ断面図である。従来技術を示す説明図である。

以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。

本発明に係る細胞培養装置の一実施形態として、その概略を図１及び図２に簡略化して示す。これらの図に示す細胞培養装置１は、可撓性材料からなる培養バッグ１０を用いて細胞培養を行うための装置である。
なお、図１は、細胞培養装置１に培養バッグ１０を取り付ける前の状態を示しており、図２は、細胞培養装置１に培養バッグ１０を取り付けた状態を示している。

培養バッグ１０は、細胞培養を閉鎖系で行うことができるように、細胞培養に必要なガス透過性（酸素透過性、二酸化炭素透過性）を有しているのが好ましい。さらに、高い細胞増殖効率を実現するために、低細胞毒性、低溶出性、及び放射線滅菌適性を有しているのが好ましく、細胞培養の進行状況や細胞の状態を観察できるように、内部を透視できる程度の透明性を有しているのが好ましい。

培養バッグ１０を形成する可撓性材料としては、例えば、ポリエチレン，ポリプロピレン，エチレン−α−オレフィン共重合体，エチレン−酢酸ビニル共重合体，エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー，ポリエステル系熱可塑性エラストマー，シリコーン系熱可塑性エラストマー，ポリスチレン系熱可塑性エラストマー，テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）等の熱可塑性樹脂からなる樹脂フィルムが挙げられる。これらの樹脂は単層で用いても、同種又は異種の樹脂を積層して用いてもよい。

培養バッグ１０は、このような可撓性材料を用いて袋状に形成される。例えば、周辺部が熱融着によりシールされ、方形状などの所望の形状に製袋されたものとすることができるが、培養の対象となる細胞とともに、かかる細胞を培養するために調製された培地を培養に支障なく収容できれば、その具体的な形態は限定されない。

また、培養バッグ１０には、移送チューブを接続可能とする移送用ポート１１が設けられている。このような移送用ポート１１を設けることで、例えば、培地が貯留された培地バッグから培養バッグ１０に培地を供給したり、培養された細胞を培養終了後に培養バッグ１０から回収し、回収用のバッグや別の培養バッグなどに移送したりするなどの操作を、移送用ポート１１に接続された移送チューブを介して閉鎖系を維持したまま行うことができる。

移送用ポート１１は、培地や細胞などが流通可能な管状の部材からなり、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリブタジエン樹脂、シリコーンゴム、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、塩化ビニル、ポリスチレン系熱可塑性エラストマー、ＦＥＰなどの熱可塑性樹脂を用いて、射出成形、押出成形などにより、軸方向に貫通する送流孔１２を有する所定の形状に成形することができる。

特に図示しないが、移送用ポート１１には、培養バッグ１０の天面側と底面側の内面どうしが貼り付いて送流孔１２が閉塞してしまうのを避けるために、その基端から培養バッグ１０内に突出するポート閉塞防止片を設けることができる。

また、移送用ポート１１は、例えば、樹脂フィルムを用いて培養バッグ１０を製袋する場合には、培養バッグ１０の天面側を形成する樹脂フィルムと、底面側を形成する樹脂フィルムとの間に、上記部材を挟んで熱融着することによって設けることができる。

細胞培養装置１は、このような培養バッグ１０が載置される基台２と、培養バッグ１０に設けられた移送用ポート１１を保持する保持具３とを備えている。

基台２は、培養バッグ１０が載置される載置面を有する台であり、図示する例では、基台２の四隅に立設された固定具２１に、培養バッグ１０の四隅に穿設された孔１３を係止することによって、載置面上に培養バッグ１０を定置できるようにしてある。

特に図示しないが、基台２は、その一端側を軸支して回動させることができるようにしてもよい。このようにすることで、基台２に載置された培養バッグ１０を移送用ポート１１が下側となるように傾けて、培養バッグ１０の内容液を移送用ポート１１から送流させることによって、回収用のバッグや別の培養バッグに移送することができるが、培養バッグ１０の内容液を移送用ポート１１から送流させる手段は、これに限定されない。例えば、移送用ポート１１に接続された移送チューブにペリスタポンプを取り付けるなどして、その動作によって培養バッグ１０の内容液を移送用ポート１１から送流させるようにしてもよい。

また、基台２には、培養バッグ１０を載置したときに培養バッグ１０に設けられた移送用ポート１１が対向する部位に、切り欠き部２２が形成されている。かかる切り欠き部２２は、移送用ポート１１が基台２と干渉せずに、基台２の載置面に対して移送用ポート１１を押し下げることができるように、基台２上に位置する移送用ポート１１の輪郭に沿って形成することができる（図２参照）。
そして、押し下げられた移送用ポート１１は、図３に示すように、その送流孔１２の最下部が、基台２の載置面を含む基準面よりも下方に位置する状態で、保持具３に保持されている。
なお、図３は、図２のＡ−Ａ断面図であり、上記基準面を一点鎖線で示している。

図示する例では、移送用ポート１１を保持する保持具３の一例として、移送用ポート１１が挿通される挿通部が設けられた受け部３ａと、挿通部に挿通された移送用ポート１１の上方を押える押え板３ｂとからなる保持具３を簡略化して示している。移送用ポート１１の送流孔１２の最下部が、基台２の載置面を含む基準面よりも下方に位置する状態で、移送用ポート１１を保持できれば、保持具３の具体的な構成は、これに限定されないが、移送用ポート１１の中心軸が、基台２の載置面と平行となるように移送用ポート１１を保持できるようにするのが好ましい。

前述したように、基台２に載置された培養バッグ１０の内底面と移送用ポート１１の送流孔１２との間に段差が形成されてしまったり、移送用ポート１１の周辺の培養バッグ１０の内底面にシワが発生してしまったりすると、移送用ポート１１から内容液を送流して、培養された細胞を回収又は移送する際に、この段差やシワに遮られて移送用ポート１１の送流孔１２に到達できなかった細胞Ｃが、移送用ポート１１の手前に滞留してしまう（図４参照）。
これに対して、本実施形態では、移送用ポート１１の送流孔１２の最下部が、基台２の載置面を含む基準面よりも下方に位置するように、移送用ポート１１を保持具３に保持しており、基台２に載置された培養バッグ１０の内底面の延長上に移送用ポート１１の送流孔１２が位置している。これによって、培養バッグ１０の内底面と移送用ポート１１の送流孔１２との間に段差が形成されず、また、押し下げられた移送用ポート１１に引っ張られて培養バッグ１０の内底面におけるシワの発生が抑止されているため、内容液中の細胞Ｃが移送用ポート１１の送流孔１２に到達し易くなっている（図３参照）。その結果、本実施形態によれば、移送用ポート１１の手前に細胞が滞留してしまうのを有効に回避して、より多くの細胞を回収又は移送することができる。

このように、本実施形態では、移送用ポート１１の送流孔１２の最下部が、基台２の載置面を含む基準面よりも下方に位置するようにして、内容液中の細胞が移送用ポート１１の送流孔１２に到達し易くしている。このような効果がより良好に奏されるようにする上で、移送用ポート１１を保持具３に保持したときに、移送用ポート１１の送流孔１２の中心が、基台２の載置面を含む基準面上又は当該基準面よりも下方に位置しているのが好ましく、移送用ポート１１の送流孔１２の最上部は、当該基準面よりも上方に位置しているのが好ましい。

以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。

例えば、前述した実施形態では、基台２の一例として平板状に簡略化されたものを図示して説明したが、基台２の具体的な形態は、これに限定されない。本出願人が特願２０１５−０１７８２３で提案したように、基台２は、載置面から所定の高さで突出可能な仕切片が、かかる仕切片を基台内に収容したときに、仕切片の上端面が載置面と面一になるように埋設された構成としてもよい。さらに、本出願人が特願２０１５−０１７８２４で提案したように、基台２には、基台２に載置された培養バッグ１０を押圧する押圧板を、培養バッグ１０の内容液の液量に応じて上下動可能となるように取り付けることもできる。

要するに、本発明は、培養バッグ１０が載置される基台２と、培養バッグ１０に設けられた移送用ポート１１を保持する保持具３とを備え、基台２には、培養バッグ１０を載置したときに移送用ポート１１が対向する部位に、切り欠き部２２が形成され、保持具３が、移送用ポート１１の送流孔１２の最下部が、培養バッグ１０が載置される基台２の載置面を含む基準面よりも下方に位置する状態で、移送用ポート１１を保持するようになっていれば、これ以外の細部の構成は、前述した実施形態に限定されることなく適宜変更することができる。また、前述した実施形態で説明した細部の構成を適宜取捨選択して組み合わせることもできる。

以下、具体的な実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。

［実施例１］
ポリエチレン製の樹脂フィルムを用いて、周辺部を熱融着によりシールして縦３２０ｍｍ×横９０ｍｍの矩形状に製袋された培養バッグ１０を用意した。かかる培養バッグ１０に、サンプル培養液（培養細胞と培地を含む）２３０ｍＬを収容して、図２に示すように、細胞培養装置１に取り付けた。その際、基台２に形成された切り欠き部２２上に位置する移送用ポート１１を押し下げて、移送用ポート１１の送流孔１２の最下部が、培養バッグ１０が載置される基台２の載置面を含む基準面よりも下方に位置する状態で、移送用ポート１１が保持具３に保持されるようにした。

次に、基台２の一端側を軸支して回動させて、基台２に載置された培養バッグ１０を移送用ポート１１が下側となるように傾けて、培養バッグ１０の内容液を移送用ポート１１から落差により送流させ、移送用ポート１１からの送流が認められなくなるまで静置した。
なお、基台２には、培養バッグ１０の上面側を押圧する押圧板を設置して、培養バッグ１０を傾けたときの内容液の偏りが生じ難くなるようにした。また、基台２の傾斜角度は、約１０°とした。

その後、培養バッグ１０を細胞培養装置１から取り外して、生理食塩水５ｍＬと空気７ｍＬを入れたシリンジを移送用ポート１１に接続し、培養バッグ１０内に注入した。次いで、培養バッグ１０内を注入生理食塩水で洗浄し、培養バッグ１０内に残った培養液と生理食塩水との混合液を回収し、その回収液を１５ｍＬ遠沈管に入れて、１２００ｒｐｍで３分間、遠心分離した。遠心分離後の回収液をピペットにて再び混合し、回収液量を測定し、１０倍希釈して、血球計算盤にて定法通りに細胞数を計測し、回収液中の残存細胞数を算出した。その結果を表１に示す。

［比較例１］
切り欠き部２２が形成されていない基台２ｐ（図４参照）を用いた以外は、実施例１と同一の条件で、培養バッグ１０の内容液を移送用ポート１１から落差により送流させた後に、培養バッグ１０内を生理食塩水で洗浄し、その回収液中の残存細胞数を算出した。これに基づいて、実施例１の比較例１に対する残存細胞数の削減率を併せて算出した。その結果を表１に示す。

［実施例２、比較例２］
サンプル培養液の細胞濃度が異なる以外は、それぞれ実施例１、比較例１と同一の条件で、培養バッグ１０の内容液を移送用ポート１１から落差により送流させた後に、培養バッグ１０内を生理食塩水で洗浄し、その回収液中の残存細胞数を算出した。これに基づいて、実施例２の比較例２に対する残存細胞数の削減率を併せて算出した。その結果を表１に示す。

これらの結果から、移送用ポート１１の送流孔１２の最下部が、基台２の載置面を含む基準面よりも下方に位置するようにすることで、培養バッグ１０内の残存細胞数を減らし、より多くの細胞を回収できることが確認できた。

本発明は、閉鎖系で細胞を大量に培養する再生医療、免疫療法、抗体医薬生産などにおいて好適に利用することが可能である。

１細胞培養装置
２基台
２２切り欠き部
３保持具
１０培養バッグ
１１移送用ポート
１２送流孔

Claims

可撓性材料からなる培養バッグを用いて細胞培養を行う細胞培養装置であって、
前記培養バッグが載置される基台と、
前記培養バッグに設けられた移送用ポートを保持する保持具と
を備え、
前記基台には、前記培養バッグを載置したときに前記移送用ポートが対向する部位に、切り欠き部が形成され、
前記保持具が、前記移送用ポートの送流孔の最下部が、前記培養バッグが載置される前記基台の載置面を含む基準面よりも下方に位置する状態で、前記移送用ポートを保持することを特徴とする細胞培養装置。
前記保持具が、前記移送用ポートの送流孔の中心が、前記基準面上又は前記基準面よりも下方に位置する状態で、前記移送用ポートを保持する請求項１に記載の細胞培養装置。
前記保持具が、前記移送用ポートの送流孔の最上部が、前記基準面よりも上方に位置する状態で、前記移送用ポートを保持する請求項１又は２に記載の細胞培養装置。