CN107532122A - 液体回流容器、细胞浓缩装置和细胞浓缩系统 - Google Patents

液体回流容器、细胞浓缩装置和细胞浓缩系统 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种具有新型的液体回流容器的细胞浓缩装置以及细胞浓缩系统。一种细胞浓缩装置，其具备液体回流容器，其中，上述液体回流容器具备利用送液管在上述液体回流容器外部连接的第一管和第二管，上述送液管具备能够将内部的液体在两方向输送的送液泵和细胞浓缩模块，第一管和第二管在上述液体回流容器内的液体中具有开口端，第一管在上述液体回流容器内的气体中具有开口部，上述液体为细胞的悬浊液。

Description

液体回流容器、细胞浓缩装置和细胞浓缩系统
技术领域
本发明涉及液体回流容器、细胞浓缩装置和细胞浓缩系统。
背景技术
在使用自身的细胞或他人的细胞进行疾病治疗的再生医疗中，为了将细胞用于移植治疗，需要培养从生物体采取的细胞使细胞数量增加或以应有的形式构建组织。用于治疗的细胞的培养和制备必须在细胞制备设备(Cell Processing Facility，CPF)这样的细胞培养用洁净室中按照GMP(Good Manufacturing Practice，药品生产质量管理规范)进行。这里的课题在于以下方面：由于细胞培养通过技术人员的手动操作进行，因而对于1名患者的细胞的制备非常耗费劳力和成本；由于通过手动实施而存在生物学污染的风险；此外还可能出现操作失误。
作为解决这些课题的手段，开发出了在封闭体系中将细胞培养和制备工序自动化的装置。即，通过使用不需要将培养容器的盖打开关闭的操作的封闭体系培养容器或将细胞培养工序自动化，能够降低操作失误和生物学污染的风险。
其中，作为细胞的浓缩手段，有离心分离方法和使用过滤膜的膜浓缩方法。通常，通过手工培养提高细胞悬浊液的细胞浓度的情况下、或为了更换细胞缓冲液等，使用离心分离法。在离心分离法中，在超净工作台内将细胞悬浊液放入带盖的管内密闭，用离心分离机分离为细胞团和上清液。再次在超净工作台内打开管的盖，利用吸引器将上清液吸引除去而不吸引管底的细胞团。在其中加入其它缓冲液，以达到规定浓度的方式制备细胞悬浊液。这样，离心分离法由于一系列的工序而较为繁琐，因而不仅自动化困难，而且由于制备操作为开放体系，因而存在制备操作区域和器具的灭菌对应需要成本等课题。
近年来，如抗体医药或疫苗等那样将源自细胞的分泌物作为药剂利用的生物医药的开发有所进展，在其制造过程中，需要从细胞悬浊液内分离细胞。目前在该浓缩工序中使用离心分离，但利用单一用途密闭体系流路的生物医药品制造技术正在被确立，其中，广泛使用利用切向流过滤(Tangential Flow Filtration，以下简称为TFF)的膜浓缩法。TFF膜浓缩法虽然处理时间延长且需要密闭体系流路和膜模块的设置等操作准备工序，但控制机构简单且自动化容易。使用这种TFF膜的细胞浓缩装置的实例已被日本特开2015-12837号公报和WO2015/012174号公报公开。
但是，在将细胞悬浊液的操作自动化时，与通过手动操作对细胞进行处理的情况相比，对细胞造成的损伤增大。因此，在专利文献1中公开了通过将线速度控制在特定范围对细胞悬浊液处理器通液、从而对细胞造成的损伤少的方法。
另外，在培养细胞时，通常通过在所使用的液体培养基中添加称作碳酸氢盐缓冲体系的NaHCO3等碱成分，在CO2的浓度提高至5—10％的CO2培养器的仓内保持，通过与相接于培养基的气相的接触，进行控制以使得培养中的pH值不发生大幅变动，尽管如此，与大气(作为一般值，CO2 0.04％、O2 20％、N2 78％、其他成分)的接触机会越多，pH值越容易变化。实际上，在密闭体系流路中进行TFF膜浓缩法时，由于与用于输送细胞悬浊液的管内或用于保持的容器内的大气接触，因而液体培养基的pH值容易变化。(其中，在本说明书中，大气是指与上述的浓度相同或几乎相同的浓度的气体，气体是指具有与大气不同的气体组成的气体。)
另外，在进行TFF膜浓缩法的密闭体系流路中，在输送细胞悬浊液时，容易出现因液体的落下或撞击而产生的气泡等。细胞悬浊液一旦产生气泡，不仅培养基与大气的接触增多、培养基的pH值容易变化，而且，由于产生气泡时的培养基与大气之间的急剧的压力变化，细胞容易死亡。因此，在专利文献2中公开了通过检测细胞浓缩液中的气泡进行送液的供给停止来终止气泡产生的手段。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种具有新型的液体回流容器的细胞浓缩装置和细胞浓缩系统。
用于解决课题的技术方案
本发明的一个实施方式为一种液体回流容器，其为具备第一管和第二管的密闭的液体回流容器，第一管和第二管利用送液管在上述液体回流容器外部连接，上述送液管具备能够将内部的液体在两方向输送的送液泵，第一管和第二管在上述液体回流容器内的液体中具有开口端，第一管在上述液体回流容器内的气体中具有开口部。可以具备与气体袋连接的第三管。上述开口部的开口面积可以大于第一管的截面积。上述液体可以含有细胞。
本发明的另一实施方式为一种细胞浓缩装置，其为具备液体回流容器的细胞浓缩装置，上述液体回流容器具备利用送液管在上述液体回流容器外部连接的第一管和第二管，上述送液管具备能够将内部的液体在两方向输送的送液泵和细胞浓缩模块，第一管和第二管在上述液体回流容器内的液体中具有开口端，第一管在上述液体回流容器内的气体中具有开口部，上述液体为细胞的悬浊液。可以具备与气体袋连接的第三管，上述气体袋包含含有5～10％二氧化碳的气体，上述细胞的悬浊液可以为碳酸缓冲液。上述开口部的开口面积可以大于第一管的截面积。可以进一步具备排出袋，其经由开闭阀或止回阀与上述细胞浓缩模块连接，保持从上述细胞浓缩模块排出的排出液。
本发明的又一实施方式为一种细胞浓缩系统，其以能够装拆的方式具有上述任一个细胞浓缩装置。可以进一步具有压力传感器和/或重量传感器。上述压力传感器可以为选自检测上述细胞浓缩模块的上游的压力的压力传感器、检测上述细胞浓缩模块的下游的压力的压力传感器和检测细胞浓缩模块的滤液的压力的压力传感器中的至少1个压力传感器。可以进一步具备用于向上述液体回流容器供给细胞悬浊液的试样容器和用于回收被浓缩后的上述细胞悬浊液的回收容器。
＝＝与相关文献的相互参照＝＝
本申请基于2015年5月28日申请的日本专利申请2015-108924主张优先权，通过引用该基础申请而包含在本说明书中。
附图说明
图1是本发明的一个实施方式中的、(A)细胞浓缩装置的构成图(B)流入管的前端部所具有的开口部的形状的几个示例。
图2是现有的细胞浓缩装置的构成图的一例。
图3是本发明的另一实施方式中的细胞浓缩装置的构成图。
图4是本发明的一个实施方式中的细胞浓缩系统的构成图。
图5是本发明的一个实施方式中的细胞浓缩系统的控制流程图。
图6是本发明的一个实施方式中的具有多个细胞浓缩装置的细胞浓缩系统的构成图。
图7是本发明的一个实施方式中的具有多个细胞浓缩模块的细胞浓缩系统的构成图。
图8是表示使用本发明的一个实施例中的细胞浓缩装置或现有的细胞浓缩装置进行细胞浓缩的结果的表。
具体实施方式
以下，列举实施例详细地对本发明的实施方式进行说明。
本领域技术人员通过本说明书的记载能够明了本发明的目的、特征、优点及其构思，根据本说明书的记载，本领域技术人员可以容易地再现本发明。以下所记载的发明的实施方式和具体的实施例等表示本发明的优选的实施方式，用于例示或说明，本发明并不限定于这些。本领域技术人员在本说明书中公开的本发明的意图以及范围内基于本说明书的记载能够进行各种改变以及修饰。
＜液体回流容器＞
本发明的液体回流容器是具备第一管和第二管的密闭的液体回流容器，第一管和第二管利用送液管在液体回流容器外部连接，送液管具备能够将内部的液体在两方向输送的送液泵，第一管和第二管在液体回流容器内的液体中具有开口端，第一管在液体回流容器内的气体中具有开口部。其中，在本说明书中，回流容器或液体回流容器的“回流”是指容器内的液体从容器中流出，流出的液体的一部分或全部返回到容器。
作为液体回流容器的形状，没有特别限定，从操作的容易性考虑，优选为瓶状。材料也没有特别限定，例如优选对于其中放入的液体不腐蚀等、具有耐液性，使用者可以根据使用方法等适当选择。
开口部的形状和大小没有特别限定，形状可以例示圆、椭圆、长圆、正方形、长方形等。在椭圆形、长圆形、长方形的情况下，优选第一管的长轴方向与开口部的长轴方向一致。另外，为了在液体流入时不产生从开口部向第一管外部的吸引力或产生气泡，优选将为圆形时的直径等、为椭圆形或长圆形时的通过中心的最小直径等、为正方形或长方形时的短边等制作得大于第一管的内径，或者向气体中敞开的开口部的面积大于第一管的截面积。根据进行处理的液体的粘性，进一步优选开口大。另外，液体回流容器内的向气体中敞开的开口部可以为1个也可以为多个。
第一管和第二管由于利用送液管在液体回流容器外部连接，因此，在送液泵从第二管向第一管的方向送液时，通过第二管从液体回流容器流出的液体从第一管流入液体回流容器中，但在送液泵从第一管向第二管的方向送液时，由于第一管具有向气体中敞开的开口部，因此，液体回流容器内的气体优先从开口部被吸引，随之，送液管内的液体被回收到液体回流容器中，送液管内成为空的。只要具有该功能，送液管可以具备任何装置。作为可以具备的装置的示例，可以列举阀、过滤器、柱等，但并不限定于这些。通过设置这种装置，对于液体回流容器内的液体，能够暂时从液体回流容器向外部流出，自动地进行所期望的处理，再返回到液体回流容器。其中，从第二管流出的液体不需要直接从第一管返回，例如也可以以送液管在中途分支，一部分液体从分支的送液管流出，仅剩余的液体返回到液体回流容器的方式构成。
这样，通过第一管具备开口部，可以在从第二管至第一管的方向上使液体回流容器内部的液体循环，在从第一管至第二管的方向上将送液管内的液体回收到液体回流容器中。而且，通过第一管和第二管在液体回流容器内的液体中具有开口端，在从第一管回收液体时，能够稳定地进行回收，能够减少与液体回流容器内部的气体的接触并防止产生气泡等。
该液体回流容器可以具备与气体袋连接的第三管。由此，在液体回流容器内部形成负压时，能够从气体袋供给气体，保持整体的密闭体系。另外，可以用所期望的气体充满液体回流容器和送液管内的气体。
用于回流的液体没有特别限定，可以为溶液，也可以为悬浊液，液体也可以含有细胞。细胞可以为培养细胞，也可以为从生物体中分离的细胞，但优选活的细胞。活的细胞经不起与气泡等产生的气体的接触，因而第一管具备开口部的构成能够特别有效地发挥作用。
＜细胞浓缩装置＞
图1(A)是表示一个实施方式中的细胞浓缩装置1的构成的图。
该细胞浓缩装置1具备作为上述液体回流容器的用于保持细胞悬浊液的回流容器2。作为回流容器2的形状，没有特别限定，在为瓶状时，容易装入液体，液量的确认也容易且方便，在回收时也容易操作，不易出现操作失误。另外，底部为圆锥形状的容器即使细胞悬浊液为少量也能够吸排，因而优选。
该回流容器2具有能够将内部气密地保持的盖3。盖3上可以设置用于调整气压的气压调整管4。该气压调整管4经由网孔尺寸0.22μm的过滤器5与气体袋6连接。气体袋6中预先保持必要量的抑制细胞悬浊液的品质变化的气体。气体优选为5—10％CO2。作为该气体袋6的形状，没有特别限定，优选袋状的气体袋。由此，在填充气体时，如果预先压扁而将内部的气体排出、之后填充所期望的气体，则容易以所期望的气体浓度将气体保持在其容积内。作为气体袋的材料，优选树脂材料，进一步由于需要内部保持气体，所以优选透气性差的材料，可以使用乙基乙烯醇或聚酯、聚氯乙烯等。
可以进一步在回流容器2的盖3上设置吸引管7和流入管8。关于吸引管7，可以调节其在回流容器2内的长度，使其在回流容器2的内部具有开口端、在保持于回流容器2内的细胞悬浊液中开口。流入管8也同样地调节其在回流容器2内的长度，使其在回流容器2的内部具有开口端、在保持于回流容器2内的细胞悬浊液中开口，但在流入管8上可以进一步设置向回流容器2内的气体敞开的开口部9。
开口部9的形状、大小、数量等没有特别限定，以上述的液体回流容器的开口部为基准。图1(B)表示开口部9的形状的几个示例。
通过将流入管8制成这种构成，在细胞悬浊液通过流入管8流入回流容器2时，细胞悬浊液从开口端直接流入保持在回流容器2内的细胞悬浊液中，相反，在通过流入管8从回流容器2吸引时，回流容器2内的气体自开口部9从回流容器2流出。
与吸引管7连接的送液管11上设有泵10，调节送液管11内的细胞悬浊液的流动。泵10优选滚柱泵，但没有特别限定，隔膜泵、齿轮泵、颈缩泵、管式泵等其它方式的泵也均适用。在细胞浓缩装置中需要确保送液的管的灭菌性，因此优选在使用前将内部灭菌，但特别优选能够在每次使用时更换管的滚柱泵。
为了将细胞悬浊液中的细胞浓缩，在送液管11上设置细胞浓缩模块12。该细胞浓缩模块12在内部具有将中空丝膜制成管状的分离膜13，在其外侧具有外筒部。浓缩前的细胞悬浊液从与送液管11连接的导入口14向分离膜13输送，被分离成经过滤的成分通过的过滤端口15和未被过滤而残留的液体的排出口16。
过滤端口15与控制过滤管17的开闭阀18连接，并且过滤管17与排出袋19连接，作为从细胞浓缩模块12排出的排出液的滤液最终保持在排出袋19中。在排出袋19中可以设置重量传感器20。由该重量传感器20测量排出的滤液的重量，根据滤液的密度算出滤液量，测量每单位时间的流量。其中，如后所述开闭阀18可以设为止回阀。
另一方面，与细胞浓缩模块12的排出口16连接的送液管11可以与压力调整阀21连接，从此与回流容器2的流入管8连接。
该细胞浓缩装置1中的送液管11、过滤管17等所使用的管优选具有挠性的树脂材料，进一步由于需要使气体在内部通过，适合透气性低的材料，优选使用乙基乙烯醇(EVOH)或聚酯、聚氯乙烯等。另外，在开闭阀中，为了利用电磁阀对连接管进行开闭操作，需要使用高弹性的橡胶材料，可以利用透气性低的橡胶材料或经化学合成的橡胶等。
于是，保持在回流容器2中的细胞悬浊液通过吸引管7以泵10为驱动源被输送到细胞浓缩模块12，在细胞浓缩模块12中被浓缩，自细胞浓缩模块12的排出口16从流入管8返回到回流容器2，形成如上所述构成的回流流路。压力调整阀21对该回流流路内的压力进行调制。并且，控制器22适时地对泵10、开闭阀18、压力调整阀21进行控制。
由于该细胞浓缩装置为密闭体系，因此，可以没有细菌污染等风险地使用。例如，在使用前，在超净工作台等无菌空间中从灭菌袋等中取出回流容器2、过滤器5、气体袋6、泵10的管部位、送液管11、细胞浓缩模块12、过滤管17、排出袋19、压力控制阀21的管部位利用连接管连接而成的细胞浓缩装置，在回流容器2中装入浓缩目标的样品。然后，盖上盖并确认流路密闭之后，设置在具备泵等驱动源的装置中，由此能够在维持密闭环境的前提下实施浓缩工序。
＜使用细胞浓缩装置的细胞浓缩方法＞
以下对使用这样的细胞浓缩装置的细胞浓缩方法进行说明。
首先，将想要浓缩的细胞悬浊液放入回流容器2中。此时，使细胞悬浊液的液量高于吸引管7和流入管8的开口端，吸引管7和流入管8直接进入细胞悬浊液中。另外，使流入管8的开口部9的一部分或全部高于细胞悬浊液的液面，开口部9的一部分或全部存在于细胞悬浊液上的气体部分，但优选开口部9的全部高于细胞悬浊液的液面。
然后，盖上回流容器2的盖3，将回流容器2密闭，打开控制过滤管17的开闭阀18，使泵10以箭头23的送液方向驱动时，保持在回流容器2的细胞悬浊液向细胞浓缩模块12的排出口14输送。细胞悬浊液维持在适合细胞浓缩的送液压力，从而在细胞浓缩模块12中从细胞悬浊液分离含有由细胞分泌的因子或血清成分的液体培养基。这些分离物从细胞浓缩模块12的过滤端口15排出，另一方面，被细胞浓缩模块12浓缩的细胞悬浊液(细胞浓缩液)从流入管8返回到回流容器2。此时，由于流入管8的开口端位于回流容器2的细胞悬浊液内，因此，细胞浓缩液能够稳定地流入保持在容器中的细胞悬浊液中而不会产生气泡。这样，在使用本实施例的构成的回流容器2时，能够防止气泡的产生。
在回流容器2内的细胞悬浊液达到所期望的液量时停止用于浓缩的送液。此时，由于细胞悬浊液大量地被保持在包括细胞浓缩模块12的回流流路内部，因此，通过使泵10的送液方向24逆转以与浓缩时方向相反，能够将流路内部的细胞悬浊液回收到回流容器2中。此时，为了使经过滤的液体不发生逆流，预先关闭控制过滤管17的开闭阀18，并打开压力调整阀21，由此能够从开口部9供给气体，使回流流路内的细胞悬浊液从吸引管7返回到回流容器2中，能够提高细胞回收率。此外，通过使开闭阀18为止回阀，不需要如上所述的开闭阀18的开闭控制。
另外，回流容器2的液量减少时，从气体袋6补充利用气压调节管4以大气压保持的抑制液体品质变化(例如pH的变化)的气体，回流容器2被充满。例如在细胞悬浊液为碳酸氢盐缓冲系的细胞培养用培养基或细胞用缓冲液(例如MEM或DMEM、或者Hanks缓冲液或HEPES缓冲液)时，根据碳酸缓冲液的强度使气体为5—10％CO2，能够限定细胞悬浊液的pH变化。
＜参考例1＞
图2是表示现有的一般的回流容器2的形状的细胞浓缩装置29的现有例。回流容器2内的流入管8上不存在图1的开口部9，在流入管8的开口端在气体中敞开时，液体从流入管8的开口端落入细胞悬浊液。此时，由于落下的撞击由液体产生飞沫，并产生卷入了底部的细胞悬浊液的液面附近的气体的气泡。另外，回流容器2内的流入管8的开口部9位于细胞悬浊液附近、或者细胞悬浊液内时，将泵10在送液方向24上送液时，可能会吸引回流容器2内的细胞浓缩液而再次回流。
＜参考例2＞
图3是作为其它实施方式表示的细胞浓缩装置32。流入管8不具有开口部，将其开口端在回流容器2内保持的细胞悬浊液中开口，并且将送液管11分支，构成开闭阀33和过滤器34。进一步与连接管和气体袋6连接，气体袋6内部的气体被用于回流容器2的气压调节和将泵10在送液方向24上送液时的气相的吸气。通过该方法，能够限制流入管8中的防泡功能和回流容器2内的气相的流入。但是，与实施例1相比，流路构成复杂化且增加了开闭阀33，因而需要控制的要件增加。
＜细胞浓缩系统＞
对于利用本发明的细胞浓缩装置的细胞浓缩系统进行说明。图4是表示组装细胞浓缩装置1、全自动地进行细胞浓缩工序的细胞浓缩系统40的构成的图。本装置全自动地实施如下工序：作为第一工序，填充抑制液体品质变化的气体的工序；作为第二工序，输送清洗缓冲液，在细胞浓缩前使细胞浓缩模块适应并清洗的工序；作为第三工序，用细胞浓缩模块将细胞悬浊液浓缩，制造细胞浓缩液的工序；作为第四工序，输送其它缓冲液，用其它缓冲液将细胞浓缩液稀释的工序；作为第五工序，用细胞浓缩液回收容器回收细胞浓缩液的工序。
如图4所示，本系统由可装拆的细胞浓缩装置和保持该细胞浓缩装置并进行控制的机构部构成。细胞浓缩装置基本上使用图1的装置。本系统中，进一步在泵10与细胞浓缩模块12的连接管之间设置分支，与作为细胞浓缩液回收容器的回收瓶25连接，构成控制该连接管的开闭阀26。
该细胞浓缩系统40中可以设置用于检测细胞流路内的压力的压力传感器。例如，为了检测细胞悬浊液的流路(本说明书中也称为细胞流路)内的压力，设置压力传感器，可以设置在细胞浓缩模块12与泵10之间的连接管上。具体而言，例如可以设置检测细胞浓缩模块12的上游的压力的压力传感器Pf(f：Feed之意)27、检测细胞浓缩模块的下游的压力的压力传感器Pr(r：Retentate之意)28和检测细胞浓缩模块的滤液的压力的压力传感器Pp(p：Permeate之意)29这3个压力传感器，这些压力传感器均经由疏水性过滤器30连接。调整进行回流的流路内的压力的控制器22接收来自压力传感器的信息，基于该信息控制泵10的流速，控制压力调整阀21。这样，本系统40中，调整细胞浓缩中的剪切速度，能够控制用于以良好的重现性实行细胞浓缩的细胞流路内的膜间压差，能够控制用于确保重现性和按照GMP基准的送液量。另外，压力传感器检测装置的异常动作，能够安全地使浓缩工序中断等，因此是有用的。作为装置的异常动作的示例，可以考虑连接部脱落、因流路破损导致压力急剧下降、连接管封闭或浓缩物堵塞等，这些动作作为异常动作被检测，能够迅速地停止细胞浓缩工序，转向是否继续处理等的适当的处理。在细胞浓缩工序中，过度的浓缩会使对细胞的损伤飞跃性地升高，为了防止这种情况，必须监控这样的流路内压力，例如在回流容器2的液体减少、混合有气体的细胞浓缩液流出时，在细胞浓缩模块中气体不能通过过滤端口而在细胞浓缩模块中堆积，结果压力传感器Pf、Pp会立即显示高值。
同样，在该细胞浓缩系统40中，与上述同样地为了防止过度的浓缩，也可以设置流路内流速变化的监控重量传感器。重量传感器检测过滤速度，并且例如在回流容器2的液体减少、混合有气体的细胞浓缩液流出时，检测到回流容器2的重量变化量极度减少。也可以以排出袋19的重量变化量的信息为基础进行异常检测。例如，重量传感器31可以测量回流容器2的重量，根据在回流容器2内保持的液体的密度算出保持量，测量每单位时间的流量。这样，可以具有利用监控重量传感器检测流路的异常、更安全地实施浓缩工序的功能。
与回流容器2的流入管8连接的连接管被分支，与泵41的排出口连接。另外，泵41的吸引口经由开闭保持清洗缓冲液的清洗瓶42的连接管的开闭阀43、开闭保持稀释缓冲液的稀释缓冲液瓶44的连接管的开闭阀45、以及开闭作为保持细胞悬浊液的试样容器的样品瓶46的连接管的开闭阀47而与各瓶连接。另外，与泵41的吸引口连接的连接管在分支点39分支，通过开闭连接管的开闭阀48和过滤器49，与气体袋6连接。此外，与开闭阀43、45、47分别连接的清洗瓶42、稀释缓冲液瓶44、样品瓶46使用即使在一般实验环境下也能够将管彼此之间无菌地连接的无菌连接部件50进行连接。
气体袋6经由利用连接管经由过滤器5与清洗瓶2的气压调整管连接的过滤器51、与稀释缓冲液瓶44的气压调整管连接的过滤器52、和与样品瓶46的气压调整管连接的过滤器53，与各瓶连接。而且，气体袋6通过具有开闭阀55的连接管与气体供给源54连接，具有止回阀56。其中，在图4中与气体袋6连接的管作为仅有气体流通的管用虚线表示。
本系统40中，细胞浓缩装置可以由设置板(未图示)一体地保持，在组装细胞浓缩装置后，利用γ射线照射等进行灭菌处理，在使用前设置于系统主体。另一方面，系统主体的结构包括：作为泵10和41中的驱动源的电动机部，开闭阀18、26、43、45、47、48和55中的电磁阀部，压力传感器27、28、29中的压力感应部，以及重量传感器20和31中的重量感应部。这些机械要素和细胞浓缩装置可装拆，因此，能够实现单次使用和无菌的细胞浓缩。
＜使用细胞浓缩系统的细胞浓缩方法＞
图5表示利用细胞浓缩系统40对细胞悬浊液进行浓缩时的操作工序。在本系统中，作为操作的准备工序，在细胞浓缩系统40中设置细胞浓缩装置(S01)，在无菌条件下在细胞浓缩装置中的无菌连接部50上连接清洗缓冲液42、稀释缓冲液瓶43和样品瓶46(S02)，在连接管上设置过滤器5、51、52、53、49(S03)。
接着，在填充抑制浓缩工序中的液体的品质变化的气体(例如5—10％CO2)的第一工序中，将开闭阀55开放规定的时间，将气体填充到气体袋6中(S04)，接着在打开开闭阀26后，在规定的时间内将泵10向送液方向23驱动，由此，从气体袋6向回流容器2填充气体(S05)。接着，在使细胞浓缩模块适应并清洗的第二工序中，利用泵41将清洗液输送到回流容器2(S06)，接着将回流容器2的清洗液输送到细胞浓缩模块12中，将作为滤液的清洗缓冲液输送到排出袋(S07)。在制作细胞浓缩液的第三工序中，将样品瓶46的细胞悬浊液输送到回流容器2(S08)，接着将回流容器2的细胞悬浊液输送到细胞浓缩模块12，将培养基成分、血清成分等作为滤液输送到排出袋(S09)。在使细胞浓缩液在其它缓冲液中再悬浊的第四工序中，将稀释缓冲液瓶44的稀释缓冲液输送到回流容器2(S10)，接着将回流容器2的稀释缓冲液输送到细胞浓缩模块12，将被稀释的培养基成分、血清成分等输送到排出袋(S11)。在将细胞浓缩液回收的第五工序中，将流路内的细胞浓缩液输送到回流容器2(S12)，接着将回流容器2的细胞浓缩液输送到回收瓶25(S13)。
作为浓缩操作的后续工序，从细胞浓缩装置中取出保持有细胞浓缩液的回收瓶25(S14)，接着将细胞浓缩装置从细胞浓缩系统40中卸下(S15)，结束操作。
在S09中进行细胞浓缩时，在将控制过滤管17的开闭阀18打开并使泵10在箭头23的送液方向上驱动时，保持在回流容器2中的细胞悬浊液向细胞浓缩模块12的排出口14输送。通过以适合细胞浓缩的送液压力维持细胞悬浊液，从细胞悬浊液中分离用于维持细胞的液体培养基和血清成分等。这些分离物从细胞浓缩模块12的过滤端口15排出，另一方面，细胞浓缩液从流入管8返回到回流容器2。此时，由于流入管8的开口端位于回流容器2的细胞悬浊液中，因此，细胞浓缩液稳定地从流入管8的开口端流入，因此，能够将细胞损伤最小化，在回流容器2中实现防泡。
该细胞浓缩系统40可以如下所示进行自动浓缩工序。即，将供给压设为Pf、将循环压设为Pr、将透过液压设为Pp时，作为夹持膜的压力差的平均值的膜间压差(TMP)以TMP＝(Pf+Pr)/2－Pp表示。在通常的膜浓缩中，使适合于每个进行浓缩的细胞的TMP值恒定，开始浓缩，进行一定程度的浓缩，在过滤膜表面保持样品内的细胞而形成层状时，过滤速度下降。在该情况下，联动地控制压力调整阀21或控制泵流速，以最适合过滤的TMP值进行送液控制。或者，也可以为通过称为闪动操作的关闭或打开过滤侧的开闭阀18从而避免形成层状的方法。检测滤液的液量的重量传感器20检测每单位时间的重量变化作为过滤速度，可以作为是否实行闪动操作的过滤信息进行记录保持。
该细胞浓缩系统40可以如下所述进行送液的定量。将目标送液量设为V。在清洗缓冲液的送液例中，打开开闭阀43使泵41运转时，输送连接管内的气体，与气体相连的清洗瓶42内的清洗缓冲液通过连接管内开始送液。清洗缓冲液通过泵41到达回流容器2。能够测定回流容器2重量的重量传感器31进行与送液量对应的瓶的重量测量。从分支点39至泵41和回流容器2内的流入管8的连接管内体积是事先已知的，如果将其设为A，则在重量传感器31检测到(V－A)值时将泵暂停。接着，如果打开开闭阀48，则清洗瓶42内的连接管内的清洗缓冲液通过其落差引起的势能从分支点39返回至清洗缓冲液瓶42。根据泵41的内部构造，管被封闭，内部的液体不移动。接着，在使泵41运转规定时间(排出时间)时，从过滤器49依次进行气体导入，并且暂时停留在连接管内的清洗缓冲液(体积A)移动至回流容器2，相当于目标液量V的液量的送液完成。重量传感器31可以以能够检测并记录完成时的液体重量、并且记录送液量和送液时间等的全部细胞浓缩条件的方式构成。
＜具备多个细胞浓缩装置的细胞浓缩系统＞
图6是为了进一步降低细胞浓缩液中不需要的成分的混入的、具有多个细胞浓缩装置的细胞浓缩系统60的实施方式。在本实施方式中，第一细胞浓缩装置61，在从泵10与细胞浓缩模块之间的连接管11分支的连接管中，经由开闭阀62与第二细胞浓缩装置63连接。同样，第二细胞浓缩装置63经由开闭阀64与第三细胞浓缩装置65连接。作为各细胞浓缩装置，可以使用之前详细描述的细胞浓缩装置。
该细胞浓缩系统60可以以如下方式使用。
在第一细胞浓缩装置61中，将细胞悬浊液添加到回流容器2中，使细胞悬浊液浓缩得到第一细胞浓缩液。接着，在打开开闭阀62时，第一细胞浓缩装置61中的回流容器2的细胞浓缩液利用泵10被输送到第二细胞浓缩装置63中的回流容器2。在此，如果预先在第二细胞浓缩装置63中的回流容器2中保持规定量的稀释缓冲液，则能够降低不需要的成分的混入量。其理由是由于利用细胞浓缩模块中的分离中经常存在与目的分离物和想要除去的成分的分子量或粒径相近的物质，想要除去的成分残留并堵塞在细胞浓缩模块中，过滤量减少的缘故。因此，为了降低它们的混入量，将浓缩液再悬浊于其它稀释缓冲液中重复进行浓缩，但这也会导致浓缩时间的延长。因此，按照图6，将利用细胞浓缩装置浓缩后的浓缩细胞在提供了新的细胞浓缩模块的细胞浓缩装置中进行浓缩，从而使得想要除去的不需要的成分残留在使用过的细胞浓缩装置的细胞浓缩模块、或者连接管或回流容器的内部，降低混入量。
其中，各细胞浓缩装置中的细胞浓缩模块12和64、66可以分开使用不同的分离能力的细胞浓缩模块。
＜具备多个细胞浓缩模块的细胞浓缩系统＞
本实施方式表示为了进一步降低细胞浓缩液中不需要的成分混入的、具备多个细胞浓缩模块的细胞浓缩系统70。细胞浓缩模块71使用与上述的细胞浓缩装置1同样的细胞浓缩模块。细胞浓缩装置的基本的构成以图1为基础，但在本实施方式的细胞浓缩装置中，设置多个细胞浓缩模块。下面，参考图7，以下说明设有三个细胞浓缩模块的方式，但细胞浓缩模块为两个以上即可，也可以与图7同样设置四个以上。
即，在泵10与细胞浓缩模块之间的连接管11上设置开闭阀72，在将其之前进行了分支的连接管上经由开闭阀73连接第二细胞浓缩模块74。同样，在将开闭阀73的之前进行分支的连接管上经由开闭阀76连接第三细胞浓缩模块77。通过重复该连接，能够连接四个以上的细胞浓缩模块。并且，在细胞浓缩模块中分别设置过滤端口，设置控制第一细胞浓缩模块中的过滤管的开闭阀18、控制第二细胞浓缩模块中的过滤管的开闭阀75和控制第三细胞浓缩模块中的过滤管的开闭阀78，各过滤管与排液袋连接。
本实施方式的细胞浓缩系统70以如下方式使用。首先，将细胞悬浊液保持在回流容器2中，仅使用第一细胞浓缩模块71对细胞悬浊液进行浓缩。此时的细胞悬浊液的浓缩停留在不达到最终的目标液量的程度(例如停留在减量预定量的1/3左右的减量)。接着，关闭开闭阀72并打开开闭阀73和75，仅使用第二细胞浓缩模块74进一步对细胞悬浊液进行浓缩。此时的细胞悬浊液的浓缩再次停留在不达到最终的目标液量的程度(停留在减量预定量的2/3左右的减量)。接着，关闭开闭阀73并打开开闭阀76和78，仅使用第三细胞浓缩模块77，进一步对细胞悬浊液进行浓缩。而且，在细胞悬浊液被浓缩至目标液量时，结束细胞浓缩工序。
通过制成这样的细胞浓缩系统，通过使用新的细胞浓缩模块对部分浓缩后的细胞悬浊液进一步浓缩，想要除去的不需要的成分残留在使用过的细胞浓缩模块中，因此，能够更有效地除去不需要的成分。
其中，该细胞浓缩系统中的细胞浓缩模块71和74、77可以分开使用不同分离能力的细胞浓缩模块。
实施例
以下，对使用图4的细胞浓缩系统的、癌细胞的细胞浓缩方法的实施例进行说明。
＜细胞浓缩装置的构成＞
作为细胞浓缩模块12，使用利用中空丝膜的Spectrum公司制的TFF细胞浓缩模块、MIDI分支模块系列型号D02-S500-05-P、膜面积190cm2、分子量500kDa)。
开闭阀18、26、43、45、47、48和55中的电磁阀使用夹管阀(流体压力0.2MPa、高砂电气工业株式会社、型号PM-1015W)。与本电磁阀对应的连接管使用弹性管(内径1/16英寸、外径1/8英寸SAINTGOBAIN公司、型号AY242002)。在各泵中，将管泵(排出/吸入压力+/－0.1MPa、Welko公司、型号WP1000-P3.2DM4-C)和作为颈缩用管的弹性管(内径1/8英寸、外径1/4英寸，SAINT GOBAIN公司、型号AY242007)组合使用。本品的滚柱部能够从主体的电动机部装拆，因此，能够在将弹性橡胶管(20.5cm长度)卷绕在滚柱部的状态下进行灭菌操作。关于本泵的流量，在DC12V输入时，根据实测结果为1mL/秒。电磁阀的密闭部位和泵部的颈缩部位以外的管使用材质为氯乙烯的Tygon ND-100(内径1/16英寸、外径1/8英寸、SAINTGOBAIN公司、型号#ADF00002)。管的分支以及接合部使用SMC连接(CPC公司)系列。详细而言，2分支接合使用Y Fitting(接合径1/16英寸、型号#HY291)，直线连结使用StraightFitting(接合径1/16英寸、型号#HS291)。
在回流容器2中，将500mL带附件的离心管(康宁公司、型号11750)改造后使用，清洗缓冲液瓶42和稀释缓冲液瓶44使用赛默飞世尔科技公司NUNC带刻度的方型透明瓶(500mL、型号2015-0500JP)，排出袋19使用Flexboy袋(EVA、EVOH 2重构造、容量3L、Sartorius公司、型号#FFB102812)。
回收瓶25使用50mL带附件的离心管(康宁公司、型号11705)。本品包括预先进行了灭菌的、容器部和盖部、设置于盖部的用于调整气压的管路、以及网孔尺寸0.22μm的过滤器。
气体袋6使用Flexboy袋(EVA、EVOH 2重构造、容量1L、Sartorius公司、型号#FFB103547)，连接于一个诱导端口部的止回阀56使用单相阀(Aram公司、型号#PRC15、破损压力0.2～1.5kPa)。
过滤器5、49、51、52、53和疏水性过滤器30分别使用排气过滤器(ZenPURE公司、型号D25CUE020LFLM)，无菌连接部成对地使用Colder Products公司ASPEEPQUICK S、型号AQS17002。
在安全橱内在无菌的条件下组装以上构成部件，制作细胞浓缩装置。接着，将细胞浓缩装置放入灭菌袋中并密封后，以15kGry进行γ射线灭菌处理。
＜细胞浓缩系统的构成＞
在压力传感器27、28、29中的压力感应部上连接压力转换器(Spectrum公司、型号ACPM-799-01N)和测压元件放大器(M-SYSTEM公司、型号M2LCS-155-R/K/N)，进行压力测量。重量传感器20使用台秤型的测压元件(A&D公司、型号LC4101-K1.5)和放大器显示器(A&D公司、型号AD-4513B)，重量传感器31使用药物电子天平(A&D公司、型号EJ-610)，另外，控制装置使用控制器(Keyence公司、KV-5000系列)进行自动控制。
＜细胞的准备＞
使2.0×107个癌细胞(HepG2细胞株)分散于500ml(细胞浓度4.0×104个/ml)的增殖用培养基(含有胎牛血清10％和青霉素、链霉素各1％的DMEM)，制成细胞悬浊液。
＜细胞的自动浓缩工序＞
设置经灭菌处理的细胞浓缩装置，构成细胞浓缩系统，将各电磁阀与指定部位的连接管、以及泵中的暗盒部连接。分别将500mL的装入有PBS缓冲液(Sigma-Aldrich公司、型号D8537)的清洗缓冲液瓶和稀释缓冲液瓶连接到各个规定的无菌连接部，开始自动细胞浓缩操作。另外，作为比较对象，对现有的循环瓶(相当于图2的形状)也同样进行比较实验。气体袋6中保持的气体浓度为5％CO2、20％O2、78％N2，填充时送气量为送气流量0.5L/分钟。
首先，作为第一工序，打开开闭阀55 2.5分钟，从气体供给源54将上述组成的气体填充到气体袋6中。在此，以气体量比气体袋的容量过量的方式送气，但通过止回阀56的作用，剩余量的气体被放出到大气中，因此，气体袋6的内压维持在大气压。
接着，作为第二工序，从清洗瓶42将500mL清洗缓冲液输送到回流容器2中，使其通过细胞浓缩模块12，为了使模块孔径平均化，进行模块适应。
作为第三工序，从样品瓶46将500mL细胞悬浊液输送到回流容器2中，通过细胞浓缩模块将细胞悬浊液浓缩。通过以膜间压差维持在40kPa的方式自动控制泵的施加电压，进行流速控制。在回流容器2内的液量达到约5mL时，停止浓缩处理。
作为第四工序，从稀释缓冲液瓶44将250mL稀释缓冲液输送到回流容器2中，将细胞浓缩液稀释后，再次实施浓缩处理。进一步再一次将250mL稀释缓冲液输送到回流容器2中，进一步实施浓缩处理，在回流容器2内的液量达到约5mL时，停止浓缩处理。
作为第五工序，在回收瓶25中回收细胞浓缩液时，细胞浓缩液为10mL。如上所述停止全自动的工序，在无菌的条件下从浓缩装置上卸下回收瓶。
＜细胞的手动浓缩工序＞
作为对照实验，通过利用手工的离心操作进行细胞浓缩。将与使用细胞浓缩装置时相同的细胞悬浊液分注于2个250ml离心管(康宁公司、型号430776)，利用离心机(日立工机株式会社、CR21F、RotorNo.RPR12-2)，以1000rpm(150G)离心分离5分钟后，残留约1ml除去上清液。
＜浓缩细胞的测量方法工序＞
经浓缩的细胞在1个15ml管中再次进行离心分离，得到细胞团之后，将其再次分散到2ml的培养基中，利用台盼蓝(Nacalai tesque公司、型号35525-02)按照常规方法染色后，用血细胞计数盘进行计数。
＜浓缩细胞的评价结果＞
将对于癌细胞的悬浊液的浓缩的结果汇总于图8。“相对回收率”是指对各浓缩方法求出回收率(＝浓缩后被回收的活细胞数/投入活细胞数)，将对照实验的手动(离心分离)的回收率设为1，并进行了标准化的值。投入活细胞数在任一种情况下均为1×107cells。“活细胞比率”以被回收的活细胞数/被回收的总细胞数×100(％)求出。图8表示在各“试行次数”的前提下的平均值和标准偏差值。结果，相对于现有的循环瓶，在使用本发明的循环瓶时，回收率和活细胞比率均得到改善。可以认为这是由于抑制了在细胞悬浊液浓缩时产生气泡，对细胞的损伤降低，活细胞的回收率升高。
另外，最终液量的控制通过浓缩液的重量测量进行，但在现有的循环瓶中，存在通过TFF膜浓缩经常形成过量浓缩的情况。这是因为在液量的重量测量中，利用因使瓶内的气体下降的液滴而引起的重量变化值进行控制，因而容易产生气泡，在这样的状况下，液滴的大小变得不均匀，液量测量的误差大，最终的细胞浓缩液量的调节受到损害的缘故。在本发明的循环瓶中，在送液时，并不使气体下降，而是以连续的液流直接向液体中送液，因此，液量的检测成为连续的变化量，不易产生误差，能够实现准确的细胞浓缩液量。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供具有新型的液体回流容器的细胞浓缩装置以及细胞浓缩系统。
符号说明
1：细胞浓缩装置；2：回流容器；3：盖；4：气压调整管：5：过滤器；6：气体袋；7：吸引管；8：流入管；9：开口部；10：泵；11：送液管；12：细胞浓缩模块；13：分离膜；14：导入口；15：过滤端口；16：排出口；17：过滤管；18：阀；19：排出袋；20：重量传感器；21：压力调整阀；22：控制器；23：送液方向(浓缩时)；24：送液方向(回收时)；25：回收瓶；26：开闭阀；27：压力传感器Pr；28：压力传感器Pp；29：细胞浓缩装置(现有例)；30：疏水性过滤器；31：重量传感器；32：细胞浓缩装置；33：开闭阀；34：过滤器；39：分支点；40：细胞浓缩系统；41：泵；42：清洗瓶；43：开闭阀；44：稀释缓冲液瓶；45：开闭阀；46：样品瓶；47：开闭阀；48：开闭阀；49：过滤器；50：无菌连接部件；51、52、53：过滤器；54：气体供给源；55：开闭阀；56：止回阀；60：细胞浓缩系统；61：第一细胞浓缩装置；62：开闭阀；63：第二细胞浓缩装置；64：开闭阀；65：第三细胞浓缩装置；70：细胞浓缩系统；71：第一细胞浓缩模块；72：开闭阀；73：开闭阀；74：第二细胞浓缩模块；75：开闭阀；76：开闭阀；77：第三细胞浓缩模块；78：开闭阀。

Claims (13)

1.一种液体回流容器，其为具备第一管和第二管的密闭的液体回流容器，所述液体回流容器的特征在于：
第一管和第二管利用送液管在所述液体回流容器外部连接；
所述送液管具备能够将内部的液体在两方向输送的送液泵；
第一管和第二管在所述液体回流容器内的液体中具有开口端，
第一管在所述液体回流容器内的气体中具有开口部。
2.根据权利要求1所述的液体回流容器，其特征在于：
具备与气体袋连接的第三管。
3.根据权利要求1或2所述的液体回流容器，其特征在于：
所述开口部的开口面积大于第一管的截面积。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的液体回流容器，其特征在于：
所述液体含有细胞。
5.一种细胞浓缩装置，其为具备液体回流容器的细胞浓缩装置，所述细胞浓缩装置的特征在于：
所述液体回流容器具备利用送液管在所述液体回流容器外部连接的第一管和第二管，
所述送液管具备能够将内部的液体在两方向输送的送液泵和细胞浓缩模块，
第一管和第二管在所述液体回流容器内的液体中具有开口端，
第一管在所述液体回流容器内的气体中具有开口部，
所述液体为细胞的悬浊液。
6.根据权利要求5所述的细胞浓缩装置，其特征在于：
具备与气体袋连接的第三管。
7.根据权利要求5或6所述的细胞浓缩装置，其特征在于：
所述气体袋包含含有5～10％二氧化碳的气体，所述细胞的悬浊液为碳酸缓冲液。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的细胞浓缩装置，其特征在于：
所述开口部的开口面积大于第一管的截面积。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的细胞浓缩装置，其特征在于：
还具备排出袋，其经由开闭阀或止回阀与所述细胞浓缩模块连接，保持从所述细胞浓缩模块排出的排出液。
10.一种细胞浓缩系统，其特征在于：
以能够装拆的方式具有权利要求5～9中任一项所述的细胞浓缩装置。
11.根据权利要求10所述的细胞浓缩系统，其特征在于：
还具有压力传感器和/或重量传感器。
12.根据权利要求11所述的细胞浓缩系统，其特征在于：
所述压力传感器为选自检测所述细胞浓缩模块的上游的压力的压力传感器、检测所述细胞浓缩模块的下游的压力的压力传感器和检测细胞浓缩模块的滤液的压力的压力传感器中的至少1个压力传感器。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的细胞浓缩系统，其特征在于，还具备：
用于向所述液体回流容器供给细胞悬浊液的试样容器；和
用于回收被浓缩后的所述细胞悬浊液的回收容器。
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