JP5821847B2 - 細胞培養用ディスポセット、細胞培養装置及び細胞調製方法 - Google Patents
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Description
また、目的とする細胞を所定数まで増殖させた後は、トリプシン等の酵素処理や、2価カチオンキレート剤等の処理を行い、細胞を培養容器から剥離し、剥離された細胞はこれら酵素液とともに回収されるため、トリプシン等の酵素や2価カチオンキレート剤を除去する作業を別途行なう必要がある。
現在、最も一般的な細胞の洗浄方法として遠心分離法がある。本方法は、遠心分離操作により細胞を沈殿させ、上清を除去後、新しい洗浄液を加えて細胞を再懸濁し、再度遠心分離操作を行なうという方法であり、本操作を数回繰り返すことにより細胞の洗浄を行っている。しかしながら、その操作の煩雑さ、閉鎖系での分離操作が容易でないこと等、細胞洗浄工程におけるコンタミネーションのリスクが指摘されている。
しかしながら、捕捉された細胞を回収するためには、細胞を濃縮するという意味からも少量の細胞回収液で一気に回収する必要があり、シリンジやバッグを使用する方法は、手作業に依存し、回収率のばらつきも大きい。また、落差を用いる方法は、流速不足で細胞の回収率が激減する。さらに、ポンプを用いる方法は、シリンジポンプでは流速が不足し、細胞はほとんど回収できず、ローラーポンプでは構造上、立ち上がり時(可動時)の流速が遅く、細胞の回収に必要な圧力に到達する前に所定量の細胞回収液が流れてしまい細胞の回収率が低くなるという問題点がある。
その上、細胞回収液を注入する次のステップとして、回収した細胞をそのままの圧力で培養容器へ送液すると、非常に高い圧力で培養面へ叩きつけられることになり、細胞へのダメージ(分化能の低下、生存性の低下等)が大きく、この点に関しても解決すべき課題が多い。
その上さらに、第1細胞回収液導入部又は第2細胞回収液導入部が細胞回収液を収容したシリンジであり、シリンジのプランジャーを圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットにより押圧することにより、一般的なローラーポンプと比較して、細胞の回収に必要な圧力に短時間で到達することから比較的少量の細胞回収液で一気に回収することができるため、細胞の回収率が高くなるとともに回収率のばらつきが小さくなる。
本発明でいう細胞を含む被処理液とは、細胞を含む液体であればその物理的、化学的性状について限定されない。具体的には、骨髄液、末梢血(末梢血、G−CSF動員末梢血等を含む)、アフェレーシス産物(濃厚白血球溶液等)、リンパ液、臍帯血、経血、精液等の体液;臓器又は組織等からコラゲナーゼ等の分解酵素処理により生化学的に、あるいは、超音波処理、ホモジナイザー、鋭利な刃物等で物理的に、細胞を分離した処理液;体細胞に遺伝子組み換え等を行い多分化能を付与させた細胞、例えばiPS細胞等;受精卵から樹立されるES細胞等;浮遊系の細胞や細胞同士が凝集したスフェロイド状の細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、上記の体液や処理液は、細胞分離フィルターで処理される前に、生理食塩水、リン酸緩衝液等の適当な液体で希釈されてもよく、あるいは、遠心分離等の適当な方法で濃縮されてもよい。濃縮する方法の具体例としては、フィコール、パーコール、リンフォプレップ、ヒドロキシエチルスターチ(HES)、バクティナーチューブ等を使用する密度勾配遠心法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明における閉鎖系とは、本発明の細胞培養容器内の環境が、該容器外の環境と遮断されており、外部環境の雑菌等に汚染されない状態をいう。なお、空気やCO2等の気体を細胞培養容器内外で交換する場合は、雑菌の進入を阻止する孔径を有したフィルターを設置するのが好ましく、このフィルターの孔径としては、例えば0.45μmや0.22μmが好ましい。閉鎖系を維持するためには、バッグ、回路や各種フィルター等の各パーツを予め閉鎖系になるように接続しても良いし、各パーツが分かれており、閉鎖系を保つように使用する直前に各パーツを接続できる構造であってもよい。また、本発明の細胞培養容器は滅菌してから使用することが好ましい。滅菌方法としては、高圧蒸気滅菌やエチレンオキサイドガス滅菌、ガンマ線滅菌や電子線滅菌等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
また、以下の説明における「流路開閉弁」は、前記チューブを押し挟んでその流路を開閉するものであり、例えばピンチバルブ又はローラーバルブ等が用いられる。
さらに、以下の説明における「ポンプ」は、前記チューブをローラー等により順次押圧して送液するものであり、例えばローラーポンプ等が用いられる。
さらにまた、流路開閉弁の開閉制御及びポンプの駆動制御は、図示しないプログラマブルコントローラ等の制御装置により行われる。
また、以下の説明において、細胞分離フィルターSFに対する被処理液の入口側及び細胞回収フィルターCFに対する細胞懸濁液の入口側をそれぞれ「上流側」と言い、細胞分離フィルターSF,細胞回収フィルターCFに捕捉されない廃液の出口側をそれぞれ「下流側」と言う。
以下、本発明の実施の形態1に係る細胞培養用ディスポセット及び細胞培養装置について、図1の概略構成図を用いて説明する。
細胞培養用ディスポセットは、液体流入口Lin及び液体排出口Loutを有する細胞培養容器CCと、液体流入口Linに接続された、細胞培養に用いる細胞を分離させるための細胞分離キットAと、液体排出口Loutに接続された、細胞培養容器CCで培養された細胞を洗浄濃縮するための細胞回収キットBとからなり、(1)播種する有用細胞の分離工程、(2)分離した有用細胞の培養工程、(3)培養した細胞の洗浄・濃縮工程の全ての工程が無菌的に処理できるよう閉鎖系で接続されているとともに、使用後は安全性を高めるために廃棄される。
細胞分離キットAは、細胞培養に用いる細胞を分離させるためのものであり、本実施の形態では、細胞分離フィルターSF、被処理液槽T1及び細胞貯留バッグT2並びに廃液槽W1及び第1細胞回収液導入部C1等により構成される。
すなわち、細胞分離フィルターSFの上流側に管路L1により被処理液槽T1が接続され、管路L1の途中から分岐した管路L11により細胞貯留バッグT2が接続される。
また、細胞分離フィルターSFの下流側に管路L2により廃液槽W1が接続され、管路L2の途中から分岐した管路L21により第1細胞回収液導入部C1が接続される。
さらに、管路L11よりも下流側で管路L1の途中から分岐した管路L3が、細胞培養容器CCの液体流入口Linに接続される。
ここで、被処理液槽T1は、任意の方法によって調製された細胞を含む被処理液を収容しており、前記被処理液が閉鎖系の環境下で移送されるために、被処理液槽T1には被処理液の調製手段と無菌的に連結できる注入口が設けられていることが好ましい。
細胞分離フィルターSFは、細胞を含む被処理液から細胞を選択的に捕捉する機能を有しており、細胞分離フィルターSFに収納されている細胞分離材は、細胞を含む被処理液中の白血球及び赤血球を実質的に通過させることが可能であることを特徴とするものである。
ここでいう「細胞を含む被処理液中の白血球及び赤血球を実質的に通過させる」とは、細胞を含む被処理液を細胞分離材に通液した時、被処理液中の白血球の30%以上、かつ赤血球の80%以上が細胞分離材に捕捉されることなく通過することを意味する。
目的細胞である成体幹細胞の分離能の点から、より好ましい細胞分離材は、被処理液中の白血球の45%以上、かつ赤血球の85%以上を通過させるものであり、さらに好ましくは、被処理液中の白血球の60%以上、かつ赤血球の90%以上を通過させるものであり、最も好ましくは被処理液中の白血球の70%以上、かつ赤血球の95%以上を通過させるものである。
細胞分離材の形態は、特に限定されるものではないが、細胞を含む被処理液を接触させやすいこと、接触する面積が大きいことから、連通孔構造の多孔質体、繊維の集合体、織物等であることが好ましい。より好ましくは繊維で構成されるものであり、さらに好ましくは繊維の集合体として不織布である。
細胞分離材が繊維又は繊維の集合体で構成される場合、その繊維径は、成体幹細胞の捕捉・回収率の観点から、3〜40μmの範囲が好ましい。細胞分離材を構成する繊維の繊維径が3μmより細いと白血球等の夾雑有核細胞、赤血球及び血小板等の通過率が低くなり、それらの除去効率が低くなる。繊維径が40μmより太いと有効接触面積の低下やショートパスが起こりやすくなり、成体幹細胞の捕捉・回収率の低下につながる。成体幹細胞と細胞分離材との相互作用を上げ、収率を上げるためには、繊維径は5〜35μmの範囲がより好ましく、さらに好ましくは5〜30μmの範囲である。
白血球等の夾雑有核細胞、赤血球及び血小板の除去効率等の観点より、好ましくは、目開きの短径が5μm以上、長径が80μm以下であり、白血球等の夾雑有核細胞、赤血球及び血小板の除去効率並びに成体幹細胞の捕捉・回収率等の観点から、さらに好ましくは、目開きの短径が5μm以上、長径が70μm以下である。ここでいう目開きとは、細胞分離材を走査型電子顕微鏡にて写真撮影し、異なる2本以上の繊維が交差することにより形成される実質的な孔の長径及び短径を画像解析装置にて50ポイント以上測定した値の平均値である。
細胞分離材の材質は、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン等のポリオレフィン、ポリエステル、ポリブチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル重合体(ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル等)、ナイロン、ポリウレタン、ポリイミド、アラミド、ポリアミド、キュプラ、ケブラー、カーボン、ポリアクリレート、フェノール、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿等の少なくとも1種より選択される材質が好ましく、より好ましくは、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル重合体、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ポリエチレン、ナイロン、ポリウレタン等の少なくとも1種より選択される合成又は半合成の高分子である。
また、成分の異なる高分子単独よりなる繊維をそれぞれ複合化した形態でもよい。ここでいう複合化とは、特に限定はないが2種類以上の繊維が混在した状態より構成される形態、あるいは高分子単独よりなる形態をそれぞれ張り合わせたもの等挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
細胞分離材の性能をより向上させるために、材料の親水化処理を行ってもよい。親水化処理することにより、必要細胞以外の細胞の非特異的な捕捉の抑制、体液を偏りなく細胞分離材中に通過させる等の性能の向上、必要細胞の回収効率の向上等を付与することができる。親水化処理方法としては、水溶性多価アルコール、又は水酸基やカチオン基、アニオン基を有したポリマー、あるいはその共重合体(例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、あるいはその共重合体等)を吸着させる方法、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子物質を吸着させる方法、疎水性膜に親水性高分子を固定化する方法(例えば、表面に親水性モノマーを化学的に結合させる方法等)、細胞分離材に電子線照射する方法、含水状態で細胞分離材に放射線を照射することで親水性高分子を架橋不溶化する方法、細胞分離材を乾燥状態で熱処理することにより、親水性高分子を不溶化し固定化する方法、親水性高分子と水不溶性複合体を形成する成分で細胞分離材を処理する方法、疎水性膜の表面をスルホン化する方法、ポリエチレングリコールやポリビニルピロリドン等の親水性高分子物質と、疎水性ポリマードープとの混合物から膜をつくる方法、アルカリ水溶液(NaOH,KOH等)処理により膜表面に親水基を付与する方法、疎水性多孔質膜をアルコールに浸漬した後、水溶性ポリマー水溶液で処理、乾燥後、熱処理や放射線等で不溶化処理する方法、界面活性作用を有する物質を吸着させる方法等が挙げられる。
細胞分離フィルターSFの形態は、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態をとりうるが、好ましい具体例としては、例えば、容量0.5〜1000ml、直径0.3〜10cmの透明又は半透明の円柱状容器、あるいは一片の長さ1〜20cmの正方形あるいは長方形で、厚みが0.1〜5cmの四角柱状の形態等が挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
細胞分離フィルターSFは、任意の構造材料を使用して作製することができる。具体的には、非反応性ポリマー、生物親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー;ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー;ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネート、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。
容器の材料として有用な金属材料は、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、及びそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。容器の材料として特に好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的には、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。
次に、細胞分離フィルターSFを使用した細胞の分離方法について説明する。
管路L11上の流路開閉弁V11、管路L3上の流路開閉弁V3及び管路L21上の流路開閉弁V21を閉にし、管路L1上の流路開閉弁V1,V13及び管路L2上の流路開閉弁V2を開にした状態で、ポンプP1を駆動することにより、被処理液槽T1に収容された細胞を含む被処理液を、管路L1を通して細胞分離フィルターSFに通液する。
ポンプP1により通液する場合の流速は、0.1〜100ml/minが挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。細胞を含む被処理液を、細胞分離フィルターSFに通液後は、夾雑している赤血球等を洗浄するために細胞分離フィルターSFの洗浄を行なうことが好ましい。この場合、細胞洗浄液は、生理食塩液、リンゲル液、細胞培養に使用する培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液が挙げられるが、安全面から生理食塩液が好ましい。洗浄は、細胞を含む被処理液を送液したポンプにより通液することができる。この場合の流速は、0.1〜100ml/minが挙げられる。洗浄量は、細胞分離フィルターSFの容量により異なるが、該フィルター容積の約1〜100倍の体積で洗浄することが好ましい。
細胞分離フィルターSF中において細胞は上流側に偏在する可能性が高いため、細胞分離フィルターSFの下流側に第1細胞回収液導入部C1を位置させることが好ましい。そして、第1細胞回収液導入部C1から細胞分離フィルターSFに対して、細胞を含む被処理液を流した方向とは逆方向へ細胞回収液を通液することにより細胞を回収する。
すなわち、流路開閉弁V1,V2,V3を閉にし、流路開閉弁V11,V13,V21を開にして第1細胞回収液導入部C1から細胞回収液を導入することにより細胞分離フィルターSFから回収された細胞は、管路L1及びL11を経由して細胞貯留バッグT2内に貯留される。
あるいは、図1における細胞貯留バッグT2を備えない構成として、被処理液槽T1に細胞を回収するようにしてもよい。
このように、回収した細胞を細胞貯留バッグT2又は被処理液槽T1に回収して、回収した細胞をそのままの圧力で細胞培養容器CCへ送液しないようにすることにより、細胞回収の際の高い圧力による細胞へのダメージを軽減することができる。
細胞分離フィルターSFに細胞回収液を導入する方法としては、ローラーポンプ等により送液する方法もあるが、図2に示すような圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットDを用いるのがより好ましいものである。すなわち、第1細胞回収液導入部C1を細胞回収液を収容したシリンジにより構成し、シリンジの外筒を固定具Eに固定し、シリンジのプランジャーを外部押圧ユニットDである例えばエアシリンダーD1のピストンロッドにより押すことにより、図2(a)から図2(b)のようにシリンジ内の細胞回収液が管路L21内に押し出される。
すなわち、加圧気体をポートP1に供給することにより図2(b)のようにピストンロッドが突出し、加圧気体をポートP2に供給することにより図2(a)の状態にピストンロッドが復帰する。
なお、加圧気体の供給源として、加圧気体を収容したボンベを用いることにより、管路L0への加圧気体の供給が容易になる。特に、加圧気体の供給源を二酸化炭素ボンベにすることにより、二酸化炭素ボンベはCO2インキュベーター等に使用されていることから利用しやすいため、より好ましい実施態様である。
一般的なローラーポンプと比較して、圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットDを用いることにより、細胞の回収に必要な圧力に短時間で到達することから比較的少量の細胞回収液で一気に回収することができるため、細胞の回収率が高くなるとともに回収率のばらつきが小さくなる。
また、回収された幹細胞の増殖能や分化能を高めるために、上記の培地に血清、血漿等の生体成分、bFGF(塩基性繊維芽細胞増殖因子)、TGF−β(トランスフォーミング増殖因子−β)、インスリン、トランスフェリン、ラミニン、フィブロネクチン等の蛋白性因子、レチノイン酸、アスコルビン酸、各種アミノ酸、各種糖類、5−アザシチジン、2−メルカプトエタノール、亜セレン酸ナトリウム、ハイドロコルチゾン、デキサメサゾン等の低分子物質を加えてもよい。
さらに、幹細胞の培養過程における雑菌汚染を避けるために、上記の液体にカナマイシン、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ポリミキシンB、バンコマイシン、アンホテリシンB等の抗生物質、抗真菌剤を加えてもよい。またこれらの培地には、必要に応じて血清を5〜20%程度添加しても良い。
細胞貯留バッグT2又は被処理液槽T1に貯留された細胞懸濁液は、流路開閉弁V13を閉にし、流路開閉弁V11又はV1及びV3を開にしてポンプP2を駆動することにより、管路L11、L1及びL3又は管路L1及びL3を経由して細胞培養容器CCへ移送される。
細胞培養容器CCとしては、回収された細胞に含まれる成体幹細胞を培養し、その細胞数を増幅することができるものであれば、いかなる器具、装置を用いることができるが、操作が簡便であること、雑菌汚染やクロスコンタミネーション等の危険性が低いことから、細胞培養バッグ、細胞培養カセット、あるいは細胞培養皿を用いることが好ましい。
また、これら構造体の材質は、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、塩化ビニル、ポリエチレン、ポリオレフィン、スチレンブタジエン熱可塑性樹脂等のエラストマー、ポリカーボネート、ポリプロピレン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
細胞回収キットBは、培養された細胞を洗浄濃縮するためのものであり、本実施の形態では、細胞回収フィルターCF、細胞濾過フィルターRF、廃液槽W2及び第2細胞回収液導入部C2並びに細胞回収槽T3等により構成される。
すなわち、細胞培養容器CCの液体排出口Loutに接続された管路L4が細胞濾過フィルターRFを介して細胞回収フィルターCFの上流側に接続される。
また、細胞回収フィルターCFの下流側に管路L5により廃液槽W2が接続され、管路L5の途中から分岐した管路L51により第2細胞回収液導入部C2が接続される。
さらに、細胞回収フィルターCFの上流側に管理L4から分岐した管路L6により細胞回収槽T3が接続される。
次に細胞培養容器CCからの培養細胞の剥離方法について説明する。
細胞培養容器CCにて所定期間培養した細胞は、トリプシン等の酵素処理やキレート剤処理等により剥離し、管路L4を介して細胞回収フィルターCFに導入する。この際、剥離された細胞は一部で凝集塊を形成し、そのままの状態で細胞回収フィルターに送液すると、フィルターが詰まることが懸念される。
そこで、細胞培養容器CCから細胞回収フィルターCFの間に、孔径30μm〜500μm、より好ましくは50μm〜400μmの細胞濾過フィルターRFを設置し、細胞の凝集塊を除去した後に細胞回収フィルターCFに通液を行う。
間葉系幹細胞のように細胞外マトリックスの分泌量が多い細胞では、細胞が例えば培養皿一面に広がってこれ以上増えないコンフルエント(confluent)な状態まで培養を続けると、細胞剥離剤で処理を行なった際にシングル細胞として回収し難く、回収率が低下する可能性がある。また、増殖初期に回収してしまうと、細胞数が少ない可能性が高い。
そこで、細胞を回収する際には、培養面積に対して細胞が占める面積の割合が50%以上であることが好ましい。また、上述の理由から70%から90%の範囲がより好ましいが、本発明はこれに限定されない。細胞剥離剤で剥離した細胞は、全ての細胞を次の細胞回収工程に供してもよいが、一部の細胞を細胞培養容器内に残し、再度培養を継続してもよい。また本操作を数回繰り返すことにより、細胞数の増幅を行なってもよい。
細胞回収フィルターCFは、その中に収納された細胞回収材により、培養した細胞を捕捉して夾雑物を通過させる機能を有している。ここでいう夾雑物とは、細胞培地に含まれる目的細胞である成体幹細胞以外の細胞や細胞膜断片等の固形物の他、細胞由来の分泌物、細胞培地、細胞剥離時に使用するトリプシン等の酵素、キレート剤等が挙げられる。
細胞回収材の材質は、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン等のポリオレフィン、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル(ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、アクリロニトリル、アクリル酸、アクリル酸エステル等)、ナイロン、ポリウレタン、ポリイミド、アラミド、ポリアミド、キュプラ、ケブラー、カーボン、ポリアクリレート、フェノール、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿等の少なくとも1種類より選択される材質が好ましく、より好ましくは、ポリエステル、ポリスチレン、アクリル、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ポリエチレン、ナイロン、ポリウレタン等の少なくとも1種類より選択される合成高分子である。
細胞回収材の繊維径は、成体幹細胞の回収率から、3〜40μmが好ましい。3μmより細いと白血球との相互作用が高まり、不要細胞の除去効率が低くなる。また40μmより太いと有効接触面積の低下やショートパスが起こりやすくなり、成体幹細胞の回収率の低下につながる。成体幹細胞とフィルターとの相互作用を上げ、収率を上げるためには、5〜35μmがより好ましい。さらに好ましくは5μmから30μmである。
赤血球等の比較的大きな夾雑物の除去効率から、細胞回収材の目開きは、より好ましくは5〜80μmであり、成体幹細胞の捕捉性から、さらに好ましくは5〜30μmである。ここでいう目開きとは、細胞回収材を走査型電子顕微鏡にて写真撮影し、異なる2本以上の繊維が交差することにより形成される実質的な孔の長径及び短径を画像解析装置にて50ポイント以上測定した値の平均値である。
また、細胞回収フィルターCFは適切な大きさに切断した平板状で体液を処理してもよいし、またロール状に巻いた形状で体液の処理を行ってもよい。ロール状で使用する場合、該ロールの内側から外側に向け体液を処理することにより、必要細胞の捕捉を行ってもよいし、あるいはこの逆に、ロールの外側から内側に体液を流入させ、成体幹細胞の捕捉を行ってもよい。以上、具体例を挙げたが、本発明はこれに限定されるものではない。
次に細胞回収フィルターCFを使用した培養細胞の洗浄濃縮方法について説明する。
所定期間培養後の細胞を剥離するために使用したトリプシン等の酵素やキレート剤等を含む細胞懸濁液は、管路L6上の流路開閉弁V6及び管路L51上の流路開閉弁V51を閉にし、管路L4上の流路開閉弁V4及び管路L5上の流路開閉弁V5を開にした状態で、ポンプP3を駆動することにより、細胞培養容器CCから管路L4を通して細胞回収フィルターCFに送液される。
トリプシン等の酵素やキレート剤等を含む細胞懸濁液を、細胞回収フィルターCFに通液した後は、フィルター内に残存しているトリプシン等の酵素やキレート剤等を洗浄するために細胞回収フィルターの洗浄を行なうことが好ましい。
この場合、細胞洗浄液は、生理食塩液、リンゲル液、細胞培養に使用する培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液が挙げられる。洗浄は、トリプシン等の酵素やキレート剤等を含む細胞懸濁液を送液したポンプにより通液することができる。この場合の流速は、0.1〜100ml/minが挙げられる。洗浄量は、細胞回収フィルターCFの容量により異なるが、該フィルター容積の約1〜100倍の体積で洗浄することが好ましい。
すなわち、流路開閉弁V4,V5を閉にし、流路開閉弁V6,V51を開にして第2細胞回収液導入部C2から細胞回収液を導入することにより細胞回収フィルターCFから回収された細胞は、管路L4,L6を経由して細胞回収槽T3内に貯留され、最終産物の細胞を得ることができる。
細胞回収槽T3としては、いかなる器具を用いることができるが、雑菌汚染やクロスコンタミネーション等の危険性が低いこと、持ち運びが簡便であること等から、バッグ、試験管、チューブ等を用いることが好ましい。またこれら構造体の材質は、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、塩化ビニル、ポリエチレン、ポリオレフィン、スチレンブタジエン熱可塑性樹脂等のエラストマー、ポリカーボネート、ポリプロピレン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
細胞回収液は、等張液であれば特に限定はないが、細胞回収フィルターCFから回収された細胞は、移植等に使用されるために、生理食塩液やリンゲル液等の医療用途に使用される実績のあるもの、血漿、血清、あるいは生理食塩液やリンゲル液等にアルブミンや血漿、血清を添加した溶液等が好ましい。
細胞回収フィルターCFに細胞回収液を導入する方法としては、ローラーポンプ等により送液する方法もあるが、図2に示すような圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットDを用いるのがより好ましいものである。すなわち、第2細胞回収液導入部C2を細胞回収液を収容したシリンジにより構成し、シリンジの外筒を固定具Eに固定し、シリンジのプランジャーを外部押圧ユニットDである例えばエアシリンダーD1のピストンロッドにより押すことにより、図2(a)から図2(b)のようにシリンジ内の細胞回収液が管路L51内に押し出される。
すなわち、加圧気体をポートP1に供給することにより図2(b)のようにピストンロッドが突出し、加圧気体をポートP2に供給することにより図2(a)の状態にピストンロッドが復帰する。
一般的なローラーポンプと比較して、圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットDを用いることにより、細胞の回収に必要な圧力に短時間で到達することから比較的少量の細胞回収液で一気に回収することができるため、細胞の回収率が高くなるとともに回収率のばらつきが小さくなる。
次に、本発明の実施の形態2に係る細胞培養用ディスポセット及び細胞培養装置について、図3の概略構成図を用いて説明する。図3における図1と同一符号は同一又は相当部分を示しているため、以下において、図1と同一符号のものについては詳細説明を省略する場合がある。
本実施の形態は、成体幹細胞を含む被処理液から成体幹細胞を細胞分離フィルターSFで分離し、分離した細胞を細胞培養容器CCにて培養した後に、細胞回収フィルターCFにより、細胞を酵素やキレート剤等から洗浄し、濃縮した状態で回収する、より好ましい方法を示している。
実施の形態2の細胞分離キットAは、実施の形態1の細胞回収バッグT2を無くして被処理液槽T1を細胞回収に併用しており、実施の形態1の細胞分離キットAに加えて、管路L1の途中から分岐した管路L12により洗浄液槽WA1が接続され、管路L3の途中から分岐した管路L31により培地槽T4が接続され、管路L31の途中から分岐した管路L32により細胞剥離液槽T5が接続される。
〔細胞回収キット]
実施の形態2の細胞回収キットBは、実施の形態1の細胞回収キットBに加えて、管路L7により廃液槽W3が細胞培養容器CCの液体排出口Loutに接続され、管路L6の途中から分岐した管路L8により洗浄液槽WA2が接続される。
細胞分離フィルターSFへの被処理液の通液速度は、特に限定されないが、細胞分離材の厚さに対する被処理液の通過速度(線速)で表した時、0.1〜1000mm/minの範囲にあることが好ましい。線速が0.1mm/minより低いと処理時間が長期化し、1000mm/minより高いと被処理液の流水圧により成体幹細胞が分離材に捕捉されにくくなる。より好ましい線速は、0.5〜500mm/minであり、さらにより好ましくは1〜250mm/minである。
成体幹細胞を含む被処理液が細胞分離フィルターSFに通液されることによって、被処理液中の成体幹細胞は細胞分離材に捕捉され、捕捉されなかった赤血球、成体幹細胞以外の有核細胞、血漿成分、酵素、希釈に用いた緩衝液等の不要成分は、管路L2を通って廃液槽W1に移送される。
ここで用いられる洗浄液は、成体幹細胞に対して負の影響を与えない液体であれば特に限定されないが、具体例としては、生理食塩液、リンゲル液、血清、血漿、細胞培養に用いられる培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液等が挙げられる。成体幹細胞への負の影響が小さいこと、医療用途に用いられている実績があることから、生理食塩液を用いることが好ましい。いずれの場合にも、洗浄液の通液条件は、被処理液を細胞分離フィルターSFに通液した場合に準じるものを用いることが好ましい。
細胞分離フィルターSFに捕捉された成体幹細胞は、第1細胞回収液導入部C1より管路L21を介して細胞回収液を細胞分離フィルターSFに通液することによって、管路L1を介して被処理液槽T1に一旦貯留され、その後管路L1,L3を介して細胞培養容器CCに移送されて、そのまま培養される。
この時、細胞回収液として、幹細胞培養用の培地等の、幹細胞を増殖させる機能を有する液体を用いると、移送後そのまま培養することができるので好ましい。
また、細胞分離フィルターSF中において成体幹細胞は上流側に偏在する可能性が高いため、管路L21は細胞分離フィルターSFの下流側に位置する管路L2に連結されていることが好ましい。
細胞分離フィルターSFから回収された成体幹細胞は、細胞培養容器CCを用いて培養され、必要な細胞数まで増幅されるが、この時、成体幹細胞としての性質を保ったまま増幅されてもよいし、適当な特定の細胞や組織に分化誘導されてもよい。成体幹細胞としての性質を保ったまま増幅された細胞組成物も、特定の細胞や組織に分化誘導された細胞組成物も本発明の範疇に含まれる。また、細胞培養容器CC中で、必要な細胞数まで増幅された成体幹細胞は、その後一部の細胞を残して、更に続けて細胞培養容器CC内で培養を続けてもよい。
また、細胞培養容器CC内に培地が残っている場合は、培地中のタンパク質成分や二価カチオン等の影響により細胞剥離剤の効きが悪くなる可能性があるため、ポンプP2を駆動して、洗浄液槽WA1内の洗浄液を管路L12及び管路L3を経て細胞培養容器CC内に注入することにより、残っている培地を洗浄してもよい。
洗浄を行った場合は、ポンプP4を駆動して洗浄液を管路L7から廃液槽W3に排液する。
次に、ポンプP2を駆動して、細胞剥離液槽T5内の細胞を剥離するためのトリプシン等の酵素、キレート剤等の細胞剥離剤を、管路L32,L31及びL3を経て細胞培養容器CC内に注入する。この際、細胞剥離剤が細胞培養容器CC全体に行き渡るように、細胞培養容器CCの揺動を行なってもよい。
細胞剥離剤と培地が混合された細胞懸濁液は、管路L4から細胞濾過フィルターRFを介して細胞回収フィルターCFへ通液することにより、増殖した細胞が細胞回収フィルターCFに捕捉される。
捕捉されなかった細胞以外の有核細胞、血清成分、酵素、キレート剤、培地等の不要成分は、管路L5を通って廃液槽W2に移送される。
細胞回収フィルターCFへの被処理液の通液速度、及び、細胞回収フィルターCFを洗浄する際の流速は、特に限定されないが、フィルターの厚さに対する被処理液の通過速度(線速)で表した時、0.1〜1000mm/minの範囲にあることが好ましく、より好ましい線速は、0.5〜500mm/minであり、さらに好ましくは1〜250mm/minである。
ここで用いられる洗浄液は、細胞に対して負の影響を与えない液体であれば特に限定されないが、具体例としては、生理食塩液やリンゲル液等注射用剤として使用実績のあるもの等が挙げられる。
また、洗浄量は、細胞回収フィルターCFの容量により異なるが、該フィルター容積の約1〜100倍の体積で洗浄することが好ましい。
細胞回収フィルターCF中において細胞は上流側に偏在する可能性が高いため、管路L51は細胞回収フィルターCFの下流側に位置する管路L5に連結されていることが好ましい。細胞回収液としては、細胞に対して負の影響を与えない液体であれば特に限定されないが、具体例としては、生理食塩液やリンゲル液等注射用剤として使用実績のあるものや、血漿、血清等が挙げられる。また、生理食塩液やリンゲル液等に血漿、血清等を添加して使用してもよい。
図3の構成の細胞培養容器CC、細胞分離キットA及び細胞回収キットBからなる細胞培養用ディスポセットを用い、図3に示した位置に流路開閉弁及びポンプを備えるとともに、流路開閉弁の開閉制御及びポンプの駆動制御並びに図2に示す外部押圧ユニットDの駆動制御を行う制御装置を備えた細胞培養装置を用いた。
また、細胞分離フィルターSFとして、出入口を備えた外径26mm、内径22mmの円筒状のカラムに、ポリエステルとプロピレンからなる不織布(密度(目付け(g/m2)/厚み(m))=1.8×105(95/(5.2×10-4))(g/m3)、繊維径=15±10μm、目開き=5〜50μm)を36枚積層し、不織布の厚みが9mmになるまで圧縮してなる細胞分離材を収容したものを用いた。
次に、購入したヒト骨髄液20mlを被処理液槽T1に入れ、被処理液槽T1内のヒト骨髄液を、管路L1を通して流速6ml/minで細胞分離フィルターSFに導入し、細胞分離フィルターSFより導出された被処理液について管路L2からサンプリングを行い、自動血球計測装置(シスメックスK−4500)により血球数の測定を実施した。
次に、洗浄液槽WA1内の生理食塩液30mlを、管路L12及びL1を通して流速6ml/minにて細胞分離フィルターSFに流すことにより、赤血球や白血球、血小板の洗浄除去を行った。
次に、管路L1及びL3を介して細胞培養容器CC(直径250mm)に移送して管路L3からサンプリングを行い、自動血球計測装置(シスメックスK−4500)により血球数の測定を実施した。
また、回収溶液中の細胞数を細胞分離フィルターSF通過前の血球数で割ることにより細胞の回収率を求めたところ、表1に示すように、赤血球が0.5%、血小板が4%であり、白血球は25%であった。
以上より、細胞分離フィルターSFにより、赤血球及び血小板はほとんど除去されることがわかる。
細胞回収フィルターCFとして、出入口を備えた外径26mm、内径22mmの円筒状のカラムに、ポリエステルからなる不織布(密度(目付け(g/m2)/厚み(m))=1.6×105(85/(5.3×10-4))(g/m3)、繊維径=12±2μm、目開き=10〜26μm)を36枚積層し、不織布の厚みが9mmになるまで圧縮してなる細胞回収材を収容したものを用いた。
洗浄液槽WA2内の生理食塩液30mlを、管路L8を通して流速30ml/minで細胞回収フィルターCFに通液することにより洗浄を行なった。
次に、細胞培養容器CC内の生理食塩液を、管路L7を通して廃液槽W3に排液し、細胞培養容器CC内を洗浄した。
次に、細胞剥離液槽T5内のトリプシン-EDTA液(TrypLE Select,GIBCO社製)75mlを、管路L32、L31及びL3を通して、生理食塩液を除去した細胞培養容器CCに加え、細胞培養容器CCの揺動を行なった後に、37℃の温度条件下で10分間静置した後、細胞培養容器CCの揺動を再度行なうことによって細胞を剥離した。
該細胞懸濁液を管路L4を通し、細胞濾過フィルターRF(70μm)を介して、流速10ml/minで細胞回収フィルターCFに通液し、細胞回収フィルターCFより導出された廃液は、管路L5を通して廃液槽W2に廃液した。
細胞回収フィルターCFに導入し、細胞回収フィルターCFより導出された細胞懸濁液は、管路L5からサンプリングを行った。
次に、細胞回収液として血清10mlを第2細胞回収液導入部C2としてのシリンジに収容した。そして、圧力気体を二酸化炭素とした図2に示す外部押圧ユニットDにより前記シリンジのプランジャーを押圧し、第2細胞回収液導入部C2から管路L51及びL5を通して細胞懸濁液を流した方向と逆方向から、流速300ml/min、圧力0.3MPaで細胞回収フィルターCFに注入することにより、細胞回収フィルターCFから管路L6を通して洗浄後の細胞を細胞回収槽T3に回収した。
また、細胞回収槽T3に回収された培養細胞の細胞数を細胞回収フィルターCF通過前の細胞数で割ることにより、細胞回収フィルターCFによる細胞の回収率を求めた。
なお、細胞数は血球計算盤にて測定した。
その結果、表2に示すように、14日間の培養後に得られた細胞数は、2.0×107個と非常に高い値を示した。
これは、後述する比較例1(一般的に使用されている幹細胞分離方法)の骨髄液処理量(2ml)を細胞分離フィルターSFでの処理液量(20ml)に換算したものと比較して約2.5倍多い細胞が得られている。
ここで、トリプシン溶液を含む細胞懸濁液は、225mlから10mlまで細胞懸濁液量を減少することができ、細胞が濃縮されていることを確認した。
また、細胞回収フィルターCFに細胞懸濁液を通液した後に生理食塩液にて細胞回収フィルターCFの洗浄を行なった際における、細胞回収フィルターCF出口側の生理食塩液中の最終トリプシン濃度は、表2に示すように、280nmにおける紫外吸収スペクトル測定で検出限界以下であり、トリプシンは十分に洗浄除去されていた。
GIBCO BRL社製DMEM−ハイグルコース培地に軟骨分化誘導を促す添加物(TGFβ3ヒトリコンビナント 最終濃度10ng/ml:フナコシ製,デキサメサゾン 最終濃度100nM(nmol/l):Sigma製,アスコルビン酸リン酸エステル 最終濃度50μg/ml:WAKO製,ピルビン酸ナトリウム 最終濃度100μg/ml:コスモバイオ製,L−プロリン 最終濃度40μg/ml:コスモバイオ製)を所定量添加した培地に、さらにITS(インスリン、トランスフェリン、セレン、ウシ血清アルブミン)を市販原液の1/100量添加した培地で間葉系細胞濃度が4×105個/mlになるように懸濁した。
この細胞懸濁液を0.5ml取り、15mlファルコンチューブに入れた。その後遠心分離操作(1000rpm,10min,4℃)を行うと細胞がペレット状になるが、そのままチューブの蓋を緩めて、5%CO2インキュベーター内において37℃の温度環境下で3週間培養した。
なお、この間に培地は週2回実施した。培養終了後は球形となった細胞塊を回収し、組織固定用ホルマリンで固定し、軟骨基質染色剤であるアルシアンブルー染色を行った。組織切片を顕微鏡観察した結果、図4(a)に示すように軟骨基質が青色に染まる異染色性(メタクロマジー)が観察され、得られた細胞は分化能を有する幹細胞であることを確認した。
前記軟骨分化誘導を促す添加物を培地に添加しないこと以外は実施例1と同様の方法にて、軟骨基質形成能を評価した。その結果、図4(b)に示すように軟骨基質が紫色に染まる異染色性(メタクロマジー)は観察されなかった。
実施例1と同一のヒト骨髄液2mlを、リン酸緩衝液(以下PBSと略す。)2mlと混合(2倍希釈)した。
次に、15ml遠沈管に、Ficoll paque plus(GEヘルスケア)を3ml添加し、該溶液の上層に先に調製した希釈骨髄液4mlを積層し、遠心分離操作(1400rpm,30min,室温)を行うことにより、成体幹細胞を含む単核球画分層を回収した。
PBSを約10ml入れ、遠心分離操作(1300rpm,5min)により細胞の洗浄を行った。
次に、同様にPBSを約10ml入れ、遠心分離操作(1200rpm,5min)を行い、細胞の再洗浄を行った。再洗浄液を2mlのPBSに懸濁し、血球数の測定を行い、細胞回収率を求めた。また実施例1と同様の方法で細胞数の測定を行なった。
得られた単核球画分を、α−MEM培地(GIBCO社製)に懸濁し、5%CO2インキュベーター内において37℃の温度環境下で14日間培養を行った。この際、2〜3日ごとに培地交換を行なった。
次に、トリプシン-EDTA液(TrypLE Select,GIBCO社製)を1ml添加し、5%CO2インキュベーター内において37℃の温度環境下で5分間静止後、ピペッティングを行なって細胞を剥離し、さらに等量の培地を加えて再度ピペッティングを行なって細胞を回収した。
その後、遠心分離操作(1500rpm,5min)を行い、細胞を沈殿させて上清を除去した後に、生理食塩液を加えて細胞を再懸濁した。本操作を合計3回繰り返すことによりトリプシン-EDTAの洗浄を行った。
表2に示すように、得られた総細胞数は0.6×106個、回収率は75%であり、残存トリプシン濃度は細胞剥離時に使用したトリプシン-EDTA液(TrypLE Select,GIBCO社製)の濃度を100%とした時の3%であった。
また、本発明の細胞培養用ディスポセット、細胞培養装置及び細胞調製方法を使用することにより、有用細胞の分離工程、分離工程で分離された有用細胞の培養工程及び培養工程で培養された細胞の洗浄・濃縮工程の全てを一貫して行う、大掛かりな設備によらない簡素な構成の閉鎖系システムが実現され、操作性を向上しながら、安全性及び品質の高い有用細胞の調製が可能になる。
B 細胞回収キット
C1 第1細胞回収液導入部
C2 第2細胞回収液導入部
CC 細胞培養容器
CF 細胞回収フィルター
D 外部押圧ユニット
D1 エアシリンダー
D2 流路切換弁
E 固定具
L0,L1,L11,L12,L2,L21,L3,L31,L32,L4,L5,L51,L6,L7,L8 管路
Lin 液体流入口
Lout 液体排出口
P1,P2,P3,P4 ポンプ
RF 細胞濾過フィルター
SF 細胞分離フィルター
T1 被処理液槽
T2 細胞貯留バッグ
T3 細胞回収槽
T4 培地槽
T5 細胞剥離液槽
V1,V11,V12,V13,V2,V21,V3,V31,V32,V4,V5,V51,V6,V8 流路開閉弁
W1,W2,W3 廃液槽
WA1,WA2 洗浄液槽
Claims (17)
- 液体流入口及び液体排出口を有する細胞培養容器と、
前記液体流入口に接続された、細胞培養に用いる細胞を分離させるための細胞分離キットと、
前記液体排出口に接続された、前記細胞培養容器で培養された細胞を洗浄濃縮するための細胞回収キットと、
を含み、
前記細胞分離キットが、
細胞を含む被処理液から細胞を選択的に捕捉する細胞分離材を収容した細胞分離フィルターと、
前記細胞分離フィルターの上流側に第1管路により接続された、細胞を含む被処理液を収容した被処理液槽と、
前記細胞分離フィルターの下流側に第2管路により接続された廃液槽と、
前記第2管路の途中から分岐した管路により接続された、細胞回収液を導入するための第1細胞回収液導入部と、
前記第1管路の途中から分岐し、前記細胞培養容器の液体流入口に接続された第3管路と、
により構成されるとともに、
前記第1細胞回収液導入部から前記細胞分離フィルターに導入された前記細胞回収液により回収された細胞を一旦貯留するための細胞貯留バッグを、前記第1管路の前記第3管路よりも上流側位置から分岐した管路に接続してなることを特徴とする細胞培養用ディスポセット。 - 前記被処理液槽が、前記第1細胞回収液導入部から前記細胞分離フィルターに導入された前記細胞回収液により回収された細胞を一旦貯留する細胞貯留バッグを兼ねている請求項1に記載の細胞培養用ディスポセット。
- 前記細胞分離フィルターは、細胞医療又は再生医療に有用な細胞と夾雑細胞とを含む被処理液を通液して夾雑細胞を実質的に通過させることより細胞医療又は再生医療に有用な細胞を実質的に捕捉し、前記被処理液を通液させた方向とは逆方向へ前記細胞回収液を通液することにより捕捉された細胞が回収される請求項1又は2に記載の細胞培養用ディスポセット。
- 前記第1細胞回収液導入部が前記細胞回収液を収容したシリンジであり、前記シリンジのプランジャーが気体圧で駆動する外部押圧ユニットにより押圧されて前記細胞分離フィルターに対する前記細胞回収液の供給が行われる請求項1〜3の何れか1項に記載の細胞培養用ディスポセット。
- 洗浄液を収容した洗浄液槽を前記細胞分離フィルターの上流側に管路により接続してなる請求項1〜4の何れか1項に記載の細胞培養用ディスポセット。
- 培地を収容した培地槽及び細胞剥離剤を含む細胞剥離液を収容した細胞剥離液槽の少なくともどちらかを、前記第3管路の途中から分岐した管路により接続してなる請求項1〜5の何れか1項に記載の細胞培養用ディスポセット。
- 前記細胞回収キットが、培養した細胞を捕捉して夾雑物を通過させる細胞回収材を含むものである請求項1〜6の何れか1項に記載の細胞培養用ディスポセット。
- 前記細胞回収キットが、培養した細胞を捕捉して夾雑物を通過させる細胞回収材を収容した細胞回収フィルターと、
前記細胞培養容器の液体排出口と前記細胞回収フィルターの上流側に接続された第4管路と、
前記細胞回収フィルターの下流側に第5管路により接続された廃液槽と、
前記第5管路の途中から分岐した管路により接続された、細胞回収液を導入するための第2細胞回収液導入部と、
前記第4管路の途中から分岐した管路により接続された、前記第2細胞回収液導入部から前記細胞回収フィルターに導入された前記細胞回収液により回収された細胞を回収するための細胞回収槽と、
により構成される請求項1〜7の何れか1項に記載の細胞培養用ディスポセット。 - 前記第4管路の途中に、細胞の凝集塊を除去するための細胞濾過フィルターを介在させてなる請求項8に記載の細胞培養用ディスポセット。
- 前記細胞回収フィルターは、前記細胞培養容器にて培養された細胞を含む細胞懸濁液を通液して培養された細胞を捕捉し、前記細胞懸濁液を通液させた方向とは逆方向へ前記細胞回収液を通液することにより捕捉された細胞が回収される請求項8又は9に記載の細胞培養用ディスポセット。
- 前記第2細胞回収液導入部が前記細胞回収液を収容したシリンジであり、前記シリンジのプランジャーが気体圧で駆動する外部押圧ユニットにより押圧されて前記細胞回収フィルターに対する前記細胞回収液の供給が行われる請求項8〜10の何れか1項に記載の細胞培養用ディスポセット。
- 洗浄液を収容した洗浄液槽を前記細胞回収フィルターの上流側に管路により接続してなる請求項8〜11の何れか1項に記載の細胞培養用ディスポセット。
- 請求項1〜12の何れか1項に記載の細胞培養用ディスポセットを用い、この細胞培養用ディスポセットの管路の適宜箇所に配設された、前記管路を押し挟んでその流路を開閉する流路開閉弁及び前記管路を順次押圧するポンプと、前記流路開閉弁の開閉制御及び前記ポンプの駆動制御を行う制御装置とを備えたことを特徴とする細胞培養装置。
- 請求項4又11に記載の細胞培養用ディスポセットを用い、この細胞培養用ディスポセットの管路の適宜箇所に配設された、前記管路を押し挟んでその流路を開閉する流路開閉弁及び前記管路を順次押圧するポンプと、前記シリンジのプランジャーを押圧する圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットと、前記流路開閉弁の開閉制御及び前記ポンプの駆動制御並びに前記外部押圧ユニットの駆動制御を行う制御装置とを備えてなることを特徴とする細胞培養装置。
- 前記圧力気体の供給源が、圧力気体を収容したボンベである請求項14に記載の細胞培養装置。
- 前記圧力気体が二酸化炭素である請求項15に記載の細胞培養装置。
- 請求項13〜16のいずれか1項に記載の細胞培養装置を用いて、
播種する有用細胞の分離工程と、
前記分離工程で分離された有用細胞の培養工程と、
前記培養工程で培養された細胞の洗浄・濃縮工程と、
を閉鎖系で一貫して行うことを特徴とする細胞調製方法。
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