KR20050006147A - 자동화된 조직 엔지니어링 시스템 - Google Patents

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KR20050006147A
KR20050006147A KR10-2004-7016147A KR20047016147A KR20050006147A KR 20050006147 A KR20050006147 A KR 20050006147A KR 20047016147 A KR20047016147 A KR 20047016147A KR 20050006147 A KR20050006147 A KR 20050006147A
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bioreactor
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tissue engineering
cell
cells
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KR10-2004-7016147A
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스미스티모시제이.엔.
퓨시드니엠.
페커릭마틴알.
하루퍼트
토마시니로베르토
라체르이베스
미세너디.로웰
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밀레늄 바이올로직스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 조직 엔지니어링된 생성물의 자동화된 배양, 증식, 분화, 생성 및 유지를 위한 시스템, 모듈, 생물 반응기 및 방법을 제공한다. 하나의 측면에 있어서는 하우징, 하우징에 의해 지지되는 하나 이상의 생물 반응기를 포함하는 자동화된 조직 엔지니어링 시스템이 있는데, 생물 반응기는 생리학적 세포 기능 및/또는 세포 및/또는 조직원으로부터 유래되는 하나 이상의 조직 제작물의 생성을 돕는다. 유체 봉쇄 시스템은 하우징에 의해 지지되며 생물 반응기와 유체 연통한다. 생리학적 세포 기능 및/또는 조직 제작물의 생성과 관련된 파라미터를 모니터링하기 위한 하나 이상의 센서는 하나 이상의 하우징, 생물 반응기 또는 유체 봉쇄 시스템과 결부되어 있으며; 마이크로프로세서는 하나 이상의 센서에 연결되어 있다. 본 발명의 시스템, 방법 및 생성물은 다양한 임상 및 실험실 세팅에서 그 용도를 찾을 수 있다.

Description

자동화된 조직 엔지니어링 시스템{AUTOMATED TISSUE ENGINEERING SYSTEM}
본 명세서 전반에 걸쳐 본 발명이 속하는 당 분야의 상태를 더욱 충분하게 기술하기 위하여 다양한 참고 문헌이 괄호 안에 인용되어 있다. 상기 참고 문헌의 개시 내용은 본 발명의 개시 내용에 참고로 채택된다.
과거 수년 동안 연구자들은 다양한 유형의 세포 이식체의 배양 및 생성을 위한 상이한 세포 배양 및 조직 엔지니어링 기술을 개발 사용하였다. 이러한 시스템은 예를 들어 미국 특허 제5,041,138호, 동 제5,842,477호, 동 제5,882,929호, 동 제5,891,455호, 동 제5,902,741호, 동 제5,994,129호, 동 제6,048,721호 및 동 제6,228,635호에 기술되어 있다. 생물반응기 시스템도 세포 및 세포 이식체의 배양을 위하여 개발되었으며 이는 예를 들어 미국 특허 제5,688,687호, 동 제5,728,581호, 동 제5,827,729호 및 동 제6,121,042호에 기술되어 있다.
전술한 방법 및 시스템에서는 일반적으로 선택된 세포 집단을 스캐폴드 상으로 세포 접종하기 위한 표준 배양 장치를 사용하는 통상의 실험실 배양 기술이 이용된다. 이와 같이, 생성된 이식체는 단순히, 임의의 세포 환경 조작이 임의의 표준 세포 배양물에 존재하는 내인성 세포의 사이토카인 생성과 세포 배양 배지의 순환 및 세포가 접종되는 지지체의 물리적 조작으로 인한 전단 및/또는 물리적 스트레스의 적용에 한정되는 유형의 생체고분자 지지체 상에서 성장되는 증식 세포 집단을 포함한다. 상기 시스템은 생체내에서 발생중인 조직을 대표하며 생체내에서 성공적으로 통합될 수 있는 선택된 스캐폴드내에 추가로 통합되는 증식 및 분화 세포를 포함하는 조직 이식체를 다루지 않으며, 상기 조직 이식체를 생성할 수도 없다. 또한, 공지된 방법 및 시스템은 생검조직을 분해(digestion)하여 분리된 세포를 생성하는 단계, 그 후 증식용 기판 상에 세포를 접종하는 단계, 세포 수의 확장 단계, 분화 제어 단계, 조직 형성 단계 및 자동화된 단일 조직 엔지니어링 시스템 내에서의 조직 이식체의 생성 단계 모두를 다기능적으로 실시할 수 없다. 이는 주로 공지된 배양 시스템이 세포가 원하는 이식체로 점진적으로 증식 및 분화되도록, 발생중인 이식체 주위의 변화하는 환경을 자동으로 평가 및 조작할 수 없다는 점에서 정교하지 못하기 때문이다.
또한, 종래의 배양 방법 및 시스템은 노동집약적이며, 인간의 오류 및 연속적인 성능평가의 결여로 인한 오염 상의 결점 및 다양한 배양 성공 정도로 인하여 좋지 않다. 종래의 배양 시스템은 접종용 세포의 제조에 있어서 대부분의 초기 단계(즉, 조직 분해, 세포 선택)의 수동적 수행을 필요로 하는데, 이는 시간이 많이 걸리고 생성된 조직의 품질 면에서 신뢰할 수 없으며, 배양 오염 문제가 생기기 쉽다. 상기 시스템은 세포 및 조직 배양 과정을 제한하는 선천적인 디자인상의 한정성, 조직 발생을 지원하는 환경을 적당하게 모니터링하고 변경시키는 것의 무능력, 및 도구의 효과적인 품질관리 측정을 가능하게 하는 기술의 부재로 인하여, 일차 또는 전구 세포로부터 유래되는 조직 엔지니어링된 이식체 제조의 자동화를 지원할 수 없다.
따라서, 조직 엔지니어링된 이식체의 개발 및 생성에 있어서, 상이한 단계들과 관련된 작동상의 요건을 일관되게 충족시킬 수 있는 시험관내 및 생체외에서의 조직 엔지니어링의 시스템 개선에 대한 실제적인 충족되지 않은 필요성이 남아 있다. 특히 중요한 것은 존재하는 세포가 활성을 가지며 분화된, 이미 세포외 매트릭스를 발현하고 있는 기능성 조직 구성물을 생성하는 능력이다. 이는 숙주 부위에 존재하는 성숙한 생체내 환경의 단순한 시뮬레이션 이상을 포함하며, 상기 시뮬레이션과는 매우 다르다. 이는 기능적인 새로운 조직의 제조가, 세포가 생체외 순서의 일부로서 일련의 발생 단계를 통해 진행하는 것이 근본적으로 필요하기 때문이다.
임상적 요건 및 연구 요건 둘 모두를 다루기 위하여, 종래의 생체외 배양 기술 및 시스템의 여러 불리한 점 및 제한성을 없앤 새로운 장치, 방법 및 시스템을 개발하였다.
본 발명은 조직 엔지니어링된 생성물의 배양, 증식, 분화, 생성 및 유지의 자동화를 위한 장치, 방법 및 시스템에 관한 것이다. 이러한 시스템, 방법 및 생성물은 다양한 임상 및 실험실 세팅에서 그 용도를 찾을 수 있다.
본 발명은 도면을 참조로 한 하기의 설명으로부터 더욱 잘 이해될 수 있는데, 여기서
도 1은 자가 연골 세포를 사용한 연골 회복의 예에 적용되는 일반적인 임상적 조직 엔지니어링 방법을 도시하며;
도 2는 본 발명의 통합된 조직 엔지니어링 장치를 도시하며;
도 3은 도 2의 조직 엔지니어링 장치의 추가의 실시 형태를 도시하며;
도 4는 도 2의 조직 엔지니어링 장치의 추가의 실시 형태를 도시하며;
도 5는 내부 구성요소 중 일부 및 장치로의 삽입을 위한 조직 엔지니어링 모듈을 도시하는 도 2의 조직 엔지니어링 장치의 절개도를 도시하며;
도 6은 삽입된 조직 엔지니어링 모듈을 도시하는 도 2의 조직 엔지니어링 장치의 확대된 절단도를 도시하며;
도 7은 조직 엔지니어링 모듈 및 장치의 하우징의 구성요소과의 계면의 확대된 사시도를 도시하며;
도 7(a)는 생물반응기 및 펌프 단위의 확장된 사시도를 도시하며;
도 7(b)는 펌프 단위 및 결부된 펌프 배관의 확대된 사시도를 도시하며;
도 8은 도 7의 조직 엔지니어링 모듈의 배면 및 그에 부착된 유동판의 내부 구성의 사시도를 도시하며;
도 9는 기계가 설치되는 생물반응기 디자인과 결부된 혼합 및 마이크로-로딩 구성요소의 확대된 사시도를 도시하며;
도 10은 기본적인 조직 엔지니어링 유체 유동 개략도를 도시하며;
도 11은 기본적인 조직 엔지니어링 유체 유동 개요의 추가의 실시 형태를 도시하며;
도 12는 상이한 조직 엔지니어링 시나리오에 적용가능한, 택일적인 생물반응기, 증식용 기판 또는 스캐폴드, 분화용 스캐폴드 및 과정 모니터링 디자인을 도시하며;
도 13은 생물반응기의 내부 구조 및 유체의 유동 경로를 설명하는 조직 엔지니어링 모듈의 생물반응기의 확대된 사시도를 도시하며;
도 14는 생물반응기의 내부 구조를 설명하는 조직 엔지니어링 모듈의 생물반응기의 추가의 실시 형태를 도시하며;
도 15는 회전성 생물반응기 디자인을 도시하며;
도 16은 조직 엔지니어링 모듈의 무균 샘플링의 실시 형태를 도시하며;
도 17은 개략적인 조직 엔지니어링 유체 유동의 추가의 실시 형태를 도시하며;
도 18은 개략적인 조직 엔지니어링 유체 유동의 다른 추가의 실시 형태를 도시하며;
도 19는 조직 분해 및 세포 수집에 적합한 생물반응기 디자인을 도시하며;
도 20은 세포 증식에 적합한 생물반응기 디자인을 도시하며;
도 21은 세포 분화 및 조직 구성물 형성에 적합한 생물반응기 디자인을 도시하며;
도 22는 개략적인 조직 엔지니어링 유체 유동의 다른 추가의 실시 형태를 도시하며;
도 23은 조직 분해/세포 수집, 세포 증식 및 세포 분화/조직 형성을 위한 개별적인 생물반응기를 갖춘 조직 엔지니어링 모듈의 추가의 실시 형태를 예시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 인간의 개입은 최소로 필요로 하면서 효율적이며 일관된 방식으로 세포 증식, 세포 분화 및 조직 형성을 가능하게 하는 세포, 특히 자가 세포의 생체외에서의 프로세싱을 위한 일체형 자동 조직 엔지니어링 장치에 관한 것이다. 장치 내에서 발생시킨 조직 구성물은 숙주 내로 통합되어 조직 재건 절차 및 그 후의 환자 회복을 도울 수 있다. 또한, 본 발명은 다수의 상이한 공급원(예를 들어 환자 생검체를 통하여 수득되는 자가 세포, 동종 세포 또는 이종 세포)로부터 유래되는 다양한 세포를 사용한 자동화된 조직 엔지니어링 방법을 제공한다. 또한 세포는 전구 세포, 일차 세포, 불멸성 세포주로부터 유래된 세포 및 그의 조합일 수있다.
본 발명의 조직 엔지니어링 시스템 및 방법을 결합한 임상적 조직 엔지니어링의 일반적인 방법 및 원리가 대표적인 예로서 자가 연골 조직 엔지니어링을 사용하여 도 1에 도시되어 있다. 이러한 예에 있어서 세포 (즉, 연골 세포)는 환자의 외과적 생검체로부터 수득되며 적합한 기판 또는 스캐폴드(즉, SkeliteTM지지체) 상으로 수동으로 또는 자동으로 접종된다. 연골 세포 및 지지체는 자동화 조직 엔지니어링 모듈의 생물반응기 부분 내에 존재하는데 이 모듈은 조직 엔지니어링 시스템의 임상적 베이스 스테이션의 일부를 형성한다. 중앙 마이크로프로세서는 조직 엔지니어링 시스템 내에 존재하며 생물반응기의 내부 환경을 제어하고 맞추며, 따라서 그 안에서의 조직 성장을 도와 지지체 내 및 지지체 상으로의 세포 성장을 촉진하여 이식체를 생성한다. 생물반응기 내의 센서는 마이크로프로세서로의 피드백을 제공하여 원하는, 그리고 제어된 방식으로 세포가 접종되고 확장되며 분화하는 것을 보증하여 자가 조직 이식체를 제공한다. 일단 이식체가 생성되면 이식체는 환자 내로의 외과적 이식을 위하여 생물반응기로부터 옮겨진다. 본 발명의 시스템은 무균성의 안전하며 편리하며 효과적인 방식으로 자가 조직 엔지니어링된 이식체를 제공하는 유리한 방법을 제공한다. 또한 임상적 세팅에서의 조직 엔지니어링된 이식체의 제조 능력에 의해 조직 엔지니어링 과정의 착수를 위한 장소의 상당한 융통성이 가능해진다. 본 시스템은 중앙집중된 장소에서 사용될 수 있는 반면, 시스템의 디자인 및 작동은 지엽적인 센터에서의 임상적인 사용을 가능하게 한다.이러한 광범위한 유용성은 생물학적 재료의 중앙집중식 세포/조직 프로세싱 설비로의, 그리고 중앙집중식 세포/조직 프로세싱 설비로부터의 수송을 배제함으로써 비용 효과 및 조직 엔지니어링 과정의 효율성을 개선시키며 동시에 선적(수송), 추적 및 규제 상의 복잡성을 회피한다.
본 발명의 실시 형태에 따른 것은 도 2에 도시되며 일반적으로 참고 번호 100으로 나타낸 조직 엔지니어링 시스템이다. 시스템(100)(시스템(100)은 대안적으로 장치로 칭해질 수 있음)은 조직 엔지니어링 모듈의 수용을 위한 삽입 슬롯(104)이 있는 하우징(102)을 포함한다. 삽입 슬롯(104)에는 이동성 문(106) 및 잠금 장치(108)가 있다. 터치 스크린, 키 패드 또는 이들 둘 모두의 조합과 같은 사용자 인터페이스(110)가 시스템 작동의 제어 및 시스템 상태의 표시를 위하여 제공된다. 당 업계의 숙련자에게 공지된 다양한 매체(즉, ZIP CDROM, 디스켓, 플래쉬카드)를 통하여 정보를 기록하는 데이터 저장 시스템(112)이 존재한다. 컴퓨터/통신 링크(114)는 새로운 소프트웨어를 전송하거나 외부 컴퓨터를 사용하여 제어 파라미터를 변경하거나 데이터를 다운로드하거나 장치를 조정 및 시험하는 능력을 제공한다. 이 링크는 또한 본 시스템이 클리닉에 존재하는 전자 정보 시스템에 연결되도록 한다. 시스템(100)은 파워 인풋(116)을 사용하여 전력이 공급된다. 도 3은 여러 조직 엔지니어링 모듈을 수용하기 위한 여러 베이 도어(106)가 있는 시스템(100)의 추가의 실시 형태를 도시한다. 도 4는 중력 벡터에 대하여 조직 엔지니어링 모듈의 우선적인 배향을 가능하게 하는 수평 방식으로 배향된 베이 도어(106)가 있는 시스템(100)의 추가의 실시 형태를 도시한다.
도 5는 조직 엔지니어링 모듈의 수직 삽입에 있어서 베이 도어가 수직으로 배향된 도 2 및 3에 나타내어진 시스템(100)의 내부 구조를 도시한다. 베이 도어(106)의 삽입 슬롯(104) 내에서의 삽입을 위한 조직 엔지니어링 모듈(118)이 도시되어 있다. 조직 엔지니어링 모듈(118)은 안내 레일 시스템(120)을 통하여 시스템 하우징(102) 내로 미끄러져 움직인다. 모듈(118)은 삽입시 하나 이상의 펌프 단위(122)(즉, 연동형, 피스톤형, 격판형, 회전형), 전기접속부(124)(즉, DIN, AMP, PCB, 빵판 소켓) 및 밸브 작동기(126)(즉, 서보모터(servo motor), 선형 드라이브, 선형 작동기)와 맞물린다. 당 업계의 숙련자가 알고 있듯이 모듈이 시스템 내로 적당하게 삽입되게 하는 임의의 적합한 안내 시스템이 고려될 수 있다.
도 6에서 더 잘 알 수 있는 바와 같이 조직 엔지니어링 모듈(118)이 하우징(102)내로 삽입되면 일련의 밸브 작동기(126)가 모듈 상의 밸브(도 7 및 7a에서 더욱 상세하게 도시됨)와 결부되어 유동을 제어하게 된다. 전기접속부(124)는 모듈(118)과 중앙 마이크로프로세서 단위(CPU)(128) 사이의 전기적 접속을 전기 백플레인(back-plane)(130)을 통하여 제공한다. CPU(128)는 작동 순서, 유체 및 기체의 수송, 과정 데이터의 관리, 시스템 상태의 모니터링, 유저 인터페이스, 및 외부 데이터 통신포트를 제어한다. CPU(128)는 백플레인(130) 및 삽입된 조직 엔지니어링 모듈(118) 각각에 존재하는 능동 및 수동의 전기적 구성요소와의 전기적 연결을 통한 제어를 제공한다.
온도 센서(132)(즉, 열전쌍, RTD 또는 써미스터, 기체 센서(134)(즉, O2및CO2) 및 환경 제어 단위(environment control unit, ECU)(136)는 CPU(128)에 의해 제어되어 당업계의 숙련자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 하우징(102)내에서 환경(즉, 온도 및 기체 분위기)을 유지한다. 환경은 냉장 온도(즉, 4℃)에서의 시약의 보관, 명목상의 체온(즉, 37℃)의 시뮬레이션, 및 모듈에 기체 교환 구성요소(즉, 막)이 갖추어진 경우에 있어서 모듈(118) 내로 또는 상기 모듈 밖으로의 수송을 위한 기체 혼합물의 이용성을 포함하는 조직 엔지니어링 과정의 요건을 충족시키도록 조정될 수 있다. 기체 상태는 하우징(102)내에 위치하는 기체 센서(134)에 의해 모니터링되며, 데이터는 전자 백플레인(130)을 통하여 CPU로 보내진다. ECU로의 기체 유입(들)은 표준 부속품으로 구성된 하우징(102)내에 제공된 기체 공급 유입구(140)를 통한 것일 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 기체는 ECU 내에 수용될 수 있다. 장치 내에서 사용하기 위한 기체는 산소, 이산화탄소, 질소 및 그의 혼합물을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 이러한 기체를 하우징(102)내에 적절하게 포함시키기 위하여 베이 도어(106)는 그것을 폐쇄할 경우 용접 실링을 제공하도록 구성된다. 하우징((102)는 스티로폼, 에어로겔, 섬유유리 등과 같은 절연재(142)로 절연되어 내부 온도를 효율적으로 제어하게 된다(즉 4℃ 내지 37℃).
본 발명의 조직 엔지니어링 시스템은 일반적으로 박스형 하우징을 포함하는 것으로 밝혀졌으나, 당 업계의 숙련자라면 이 하우징이 본 명세서에 기술된 구성요소를 수용할 수 있는 한 하우징은 다양한 구조로 만들어질 수 있음을 알 것이다.예를 들어 하우징은 상부 및/또는 측면 부분을 필요로 하지 않을 수 있는 개봉형 구조를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다.
조직 엔지니어링 모듈(118)은 도 7-9에 더욱 상세하게 도시되어 있다. 조직 엔지니어링 모듈(118)은 생물반응기(202)가 부착된 강성의 구조 골격(200)를 포함한다. 생물반응기(202)는 뚜껑(204)이 있는 생물반응기 하우징을 포함하며, 그에 포함된 기판(들) 또는 스캐폴드(들)과 관련하여 맞춤형으로 할 수 있어 조직 분해, 조직 배양, 조직 증식, 조직 분화, 조직 이식체 형성 및 그의 조합을 가능하게 한다.
이 생물반응기 뚜껑은 탈착가능하거나 또는 생물반응기 하우징에 선택적으로 일체형으로 된다. 이 생물반응기(202)는 개별적으로 탈착가능하며 구조 골격(200)에 따라서는 일회용일 수 있다. 이러한 탈착이 가능하기 위하여, 이 생물반응기(202) 및 구조 골격(200)은 유체손실을 피하고 생물반응기의 내용물의 오염을 방지하는 입출력 라인의 자체 실링용 설비를 포함하는 유체 비접속 피팅부를 사용할 수 있다. 전체 조직 엔지니어링 모듈은 조직 엔지니어링 순서가 완료된 다음에 폐기하는 것이 고려되는데, 이러한 실시형태는 사용 전의 오염 발생을 방지한다. 다르게는, 단지 모듈(118)의 선택된 구성요소들이 유체와의 접촉으로 인해 일회용으로서 고려될 수 있고, 이 때 재사용에 이용할 수 있는 비-오염 경향 구성요소들은 남게 된다.
도 7, 도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같이, 유체 봉쇄 시스템(206)은 조직 엔지니어링 모듈(118)의 구조 골격(200)에 부착된다. 이 유체 봉쇄 시스템(206)은생물반응기(202)로부터 그리고 생물반응기로 각종 조직 및 세포 배양액과 약들을 공급 및 회수하기 위한 일련의 무균된 가요성 저장기 및 가요성 배관(210)으로 이루어진다. 저장기(208)는 필요에 따라 구성 및 갯수를 변경시킬 수 있고, 상이한 종류의 세포 및 조직 배양 배지, 성장인자, 약제를 함유할 수 있으며, 또 생물반응기(202)로부터 폐기될 배지 및/또는 배지 샘플을 포함한다. 유체는 일련의 유체 액세스 포트(212)를 통하여 유체 봉쇄 시스템(206)에 로딩되거나 그로부터 제거된다. 배관(210)은 여러 저장기(208)와 유체 유동제어 밸브(214)와 같은 유체 봉쇄 구성요소 사이의 유체 접속을 제공하기 위해 존재한다. 유체 유동제어 밸브(214)는 밸브 작동기(126)에 의해 개폐된다. 이와 유사하게, 펌프 단위(122)는 모듈에 존재하는 일회용 펌프 구성요소와 결부되어 있다. 이들 펌프 구성요소는 피스톤, 격판, 회전요소 또는 연동형 배관(218)일 수 있으며, 단 이들 구성요소의 작동이 세포 현탁액의 이동 중에 세포 생존능력을 손상시키는 과도한 전단력과 같은 불리한 조건을 발생시키지 않아야 한다. 펌프 단위(122)와 밸브 작동기(126)는 하우징(102)내에 있다. 또는 달리, 작동기 및 펌프 단위은 조직 엔지니어링 모듈의 일부를 형성할 수 있으나, 이는 환자가 사용한 다음에 이들 구성요소를 폐기해야 하는 결과를 가져올 수 있다. 유체는 펌프 배관(218)에서 펌프 단위(122)의 프로그래밍된 작동에 의하여 저장기(208) 밖으로 이동된다. 유체는 배관(210)을 통해 가요성 유체 저장기(208)로부터 유체 밸브(214)로 이동된다. 유체 유동판(220)(도 8에 도시된 바와 같이)은 펌프 단위(122)의 상이한 유동제어 밸브(214)들과 펌프 배관(218) 사이의 유체 유동을 이끈다. 유체는 선택된 빈 저장기(208)로 복귀되어 저장된다. 가요성 인쇄회로기판(PCB)(222)이 구조골격(200) 및/또는 생물반응기(202)에 존재하는 전기 구성요소(즉, 센서)를 위한 전기 인터페이스를 제공한다. 모니터된 파라미터(예를 들어, pH)가 허용되는 수준을 넘는다고 센서가 나타내는 경우 CPU는 생물반응기내의 배지를 대체하는 것과 같은 제어 개입을 개시한다.
조직 엔지니어링 모듈은 모듈에서 직접적으로 데이터 프로세싱과 데이터 저장을 가능하게 하는 마이크로프로세서(224)를 선택적으로 포함할 수 있다. 이러한 정보가 중앙 CPU(128)에 송달되고, 동시에 모듈이 하우징(102)으로 삽입되며, 일단 모듈이 제거된 다음에 이후 엑세스를 위해 전자 메모리에 보유된다. 조직 엔지니어링 모듈에 상주하는 마이크로프로세서 또는 메모리칩을 통해 저장된 데이터에 더하여, 모듈은 또한 바코드(226), 자기스트립(228), 전자 메모리(도시 생략) 및/또는 ID 라벨(230)을 선택적으로 포함함으로써 클리닉에서 행정상의 관리를 용이하게 한다.
도 8에 도시된 바와 같이, 유체 유동판(220)은 조직 엔지니어링 모듈(118)의 구조 골격(200)에 고정된다. 유체 유동판 부착기술은, 제한은 없지만 억지끼워맞춤, 스냅끼워맞춤, 초음파 용접, 용제 접착제 등일 수 있으며, 채택된 기술에 의한 어셈블리의 실링이 유체손실을 피하고 오염을 방지할 수 있어야 한다는 것이 인정된다. 도 8a의 분해도에서 나타낸 바와 같이, 유체 유동판(220)은 일체형 유체 경로(232)를 갖추어 유체 밸브(214)의 작동과 관련된 유동을 이끌기 위한 수단을 제공한다. 새로운 유동 경로가 유동판(220)에 존재하는 경로의 개조를 통해 설치된다. 한 구체예에서, 유체판(220)은 구조 골격(200)과 일체형으로 형성되어 단일구성요소를 형성한다. 유체 가열 및 혼합 챔버(234)는 생물반응기로 향하는 유체가 정확한 온도에서 적합하게 혼합되어 생물반응기에서 진행되는 생물학적 과정들이 혼란스럽게 되지 않도록 하기 위해서 포함된다. 더욱이, 열전기적 요소(236)가 조직 엔지니어링 모듈(118)에 존재하며, 이로써 ECU(136)의 작동에 의해 한정되는 모듈의 작동온도와 비교하여 생물반응기(202)내의 온도를 변화시킨다. 이러한 온도 변화는 생물반응기내의 명목상의 생리학적 조건을 시뮬레이트하는데 필요할 수 있는데, 그동안 조직 엔지니어링 모듈의 나머지 구성요소, 특히 시약 및/또는 샘플은 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 생존능력을 유지하기 위해 온도가 감소된다(즉, 냉장). 열전기적 요소의 전력 및 제어는 CPU(128)에 의하여 수행된다. 생물반응기에 존재하는 센서에 더하여, 조직 엔지니어링 모듈에 존재하는 센서(238)가 CPU(128)로의 피드백을 제공한다. 이 센서와 열전기적 요소의 연결은 전기케이블(240) 및 커넥터(124)에 의하여 만들어진다.
도 9는 조직 엔지니어링 모듈(118)의 혼합 및 마이크로-로딩 양태를 도시한다. 생물반응기(202)는 혼합 작동기(262) 및 혼합 격판(264)과 함께 작동가능하게 연결된 혼합 드라이브(260)를 갖추고 있다. 혼합 격판은 도시된 바와 같이 생물반응기(202)의 일부로서 또는 생물반응기 뚜껑(204)으로서 결합된다. 작동시에 혼합 작동기(262)와 조합된 혼합 드라이브(260)가 혼합 격판의 병진운동이나 맥동을 제공하여 생물반응기(202)의 내용물의 제어 혼합을 행한다. 이상적으로, 혼합의 성질은 생물반응기내에 존재하는 세포의 물리적 온전성을 손상시킬 수 있는 높은 유체전단을 피할 수 있어야 한다. 어떤 조직 엔지니어링 프로토콜에서는 중간 정도의 유체전단 수준이 조직 구성물의 성공적인 발생에 실제로 유리하다. 혼합 구성요소에 더하여, 충격 드라이브(266)와 충격 작동기(268)가 존재한다. 이들 구성요소는 증식 순서의 종결시에 생물반응기 어셈블리에 제어된 충격을 적용하는 작용을 함으로써 생물반응기내에 상주하는 증식 기판 또는 스캐폴드로부터의 세포 방출을 돕는다. 또, 마이크로-로딩 작동기(272) 및 마이크로-로딩 격판(274)과 작동가능하게 연결된 마이크로-로딩 드라이브(270)가 제공된다. 마이크로-로딩 격판(274)은 도시된 바와 같이 생물반응기(202)의 일부로서 또는 생물반응기 뚜껑(204)으로서 결합된다. 마이크로-로딩 격판의 위치와 방향은 기판 또는 스캐폴드 그리고 생물반응기(202)에 존재하는 어떤 관련된 세포나 조직과 친밀하게 접촉하도록 있어야 한다. 마이크로-로딩의 적용이 어떤 조직 엔지니어링 프로토콜에 유리하다고 알려져 있다. 혼합 드라이브(260), 충격 드라이브(266) 그리고 마이크로-로딩 드라이브(270)는 솔레노이드, 선형드라이브, 회전드라이브 또는 압전기 구성요소와 같은 일련의 전기기계 장치 중 어느 것일 수 있다. 더욱이, 혼합 드라이브(260), 충격 드라이브(266), 마이크로-로딩 드라이브(270), 및 관련된 작동기들은 하우징(200)에 장착되는 것도 가능하다. 또는 달리, 드라이브 및 작동기는 조직 엔지니어링 모듈이나 생물반응기에 장착될 수도 있는데, 단 드라이브의 디자인은 조직 엔지니어링 모듈의 일회용 성질에 일치되어야 한다. 기계적인 자극의 제공에 더하여 생물반응기는 또한 조직 구성물에 전기적 및/또는 화학적 자극을 도입하도록 구성될 수도 있다. 특히, 전기장이 생물반응기의 영역에서 발생되어 세포 수송 및/또는 조직 형성을 증진시킬 수 있다. 전기장 발생법은 당업자에게 알려져 있으며, 제한은 없지만 전기 코일의 제공을 포함한다.
도 10은 생물반응기(202)내에 단일 세포 또는 조직 배양 챔버가 있는 조직 엔지니어링 모듈(118)에서의 기본적인 유체 유동 개요를 예시한다(복수-챔버 생물반응기에 대한 더 이상의 정보는 도 12와 17의 설명 참조). 유동 경로는 생물반응기(202)와 유체를 공급하고 폐기물을 수집하는 저장기(208)를 연결한다. 유체 액세스 포트(212)는 시약을 로딩하거나 샘플 또는 폐액을 제거하는데 사용된다. 유동은 펌프 단위(122)의 작동에 의하여 특정 유동제어 밸브(214)의 작동에 의해 한정되는 유동 방향으로 발생된다. 생물반응기로의 관류는 연속적 또는 박동성일 수 있는데, 단 관련된 유동이 세포를 함유하는 영역에 높은 유체전단, 예를 들어 세포나 만들어진 조직 구성물을 손상시킬 수 있는 조건을 가져오지 않아야 한다. 유체 저장기(208)로부터의 새로운 유체의 송달을 필요로 하지 않으면서, 생물반응기의 유체 내용물이 인라인 기체교환막(282)과 같은 외부 구성요소에 의해 모니터되거나 개량되도록 하는 재순환 루프(280)가 제공된다. 유체를 저장하는 조직 엔지니어링 모듈(118)의 구성요소(즉, 저장기(208))는 체온과 비슷하게 사용되는 온도(즉, 37℃)에서 열화될 수 있는 유체의 저장을 용이하게 하는, 대략 4℃에서 냉장 상태로 유지된다. 미리 프로그램된 루틴에 따라, CPU(128)는 저장기(208)에 저장된 유체가 생물반응기 챔버(300)내로 들어가기 전에 펌프 단위(122)을 통하여 가열 및 혼합 챔버(234)내로 송달되도록 유체 밸브들(214)의 작동을 제어한다(도 13, 14 및 15에 상세하게 도시되어 있음). 유체는 유입구(302)를 통하여 생물반응기로 공급되고 유출구(304)를 통하여 제거된다. 최적의 세포 및 조직 배양 성능을 위해 정상 체온을 시뮬레이트하기 위해서 생물반응기(202), 펌프 단위(122), 가열 및 혼합 챔버(234)는 열전기적 요소(236)의 작동에 의해서 대략 37℃로 유지된다. 조직 엔지니어링 모듈(118)를 위한 바람직한 열적 프로파일을 얻기 위하여 열조절 장치가 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
도 11은 유체 유동제어 밸브가 복수의 펌프 단위(122)을 위해 대체되어 있는 기본적인 유체 유동 개략도에 대한 변경을 도시하고 있다. 이 구성은 증대된 작동 여유 및 구성요소 총수의 감소를 제공한다. 이러한 시스템의 작동은 제어된 유체의 송달을 손상시키는 조절되지 않은 관통 유동을 방지하는 유휴상태의 펌프 단위을 필요로 한다.
도 12a - 12d는 다양한 생물반응기의 구성과, 조직 엔지니어링 시스템의 작동에 수반되는 증식 및 분화 단계에서 사용되는 기판 및 스캐폴드의 교호식 포맷을 예시하고 있다. 도 12a는 상이한 생물학적 처리를 실행하는 일련의 상호교환가능한 생물반응기의 디자인을 도시한다. 타입(Ⅰ)은 증식 스캐폴드 또는 기판(310), 또는 분화 스캐폴드 또는 기판(도시 생략)을 수용하고, 증식 또는 분화에 이상적으로 적합하게 되어 있는 생물반응기(202)내의 기본적인 단일 챔버(300)이다. 세포는 수동으로 스캐폴드(310)상에 접종되거나, 조직 엔지니어링 모듈의 유체 경로를 통하여 자동적으로 송달된다.
타입(Ⅱ)은 세포 집단의 증식을 위한 스캐폴드(또는 기판)(310) 및 조직 구성물의 형성을 촉진하는 이식가능한 분화 스캐폴드(312)의 사용을 위해 제공되는 복수-챔버 생물반응기를 포함하고 있다. 배양/증식 챔버(300)는 깔대기(314)를 통하여 분화/조직 형성 챔버(306)에 연결된다. 깔대기는 증식 스캐폴드(310)로부터 이식가능한 분화 스캐폴드(312)내로 방출된 세포를 전달하는 역할을 한다. 생물반응기내의 몇몇 위치에서 사용되는 필터(316)는 한 챔버로부터 다음 챔버로 자유롭게 통과할 수 있는 세포 또는 세포 응집체의 크기를 조절하는 역할을 한다. 필터(316a)는 세포 확장 단계를 위해, 들어온 세포 집단을 조절할 목적으로 증식 스캐폴드의 상류에 존재한다. 또, 다른 필터(316b)가 조직 엔지니어링 단계로 진입하는 세포 집단을 제어하도록 분화 스캐폴드의 상류에 존재한다. 추가적으로, 생물반응기를 통한 유체 이동을 수반하는 작업 동안, 분화/조직 형성 챔버로부터 세포의 손실을 방지하도록, 또 다른 필터(316c)가 유출구(304) 위에 존재한다. 필터(316)는 당업자에게 공지되어 있는 필터막이나 메시 또는 유사한 종류의 필터링 재료가 될 수 있다.
타입(Ⅲ)은 조직 분해와 이후의 증식, 분화 및 조직 구성물 형성을 조합한다. 이 설계에서, 조직 생검편(320)은 생물반응기(202)내에 존재하는 분해 챔버(322)내로 로딩된다. 조직 생검편의 분해는 조직 엔지니어링 모듈에 존재하는 유체 저장기(208)로부터 생물반응기내로의 분해 효소의 송달을 통하여 발생한다. 분리된 세포는 중력의 영향에 의한 침전, 및/또는 배양/증식 챔버(300)를 통한 유체 유동으로 분해 챔버(322)를 빠져나가고, 이후에 증식 스캐폴드(310) 상에 모인다. 분해 챔버(322)의 밖으로의 조직 응집체의 이동은 분해 챔버(322)와 배양/증식 챔버(300) 사이의 유동 경로에 존재하는 필터막/메시(316a)에 의해서 방지된다. 증식 후에 세포는 세포 깔대기(314)를 통하여 이식가능한 분화 스캐폴드(312)로 방출및 이동된다. 또한, 정확한 세포 집단이 스캐폴드에 접종되고 유체 이송 작업중에 세포가 부주의로 손실되어 폐기되지 않도록 막/메시 필터가 이식가능한 분화 스캐폴드(312)의 상류(316b) 및 하류(316c) 양쪽에 존재한다.
상술한 설계에서, 도 12b에 예시된 바와 같이 증식 기판(310) 또는 스캐폴드의 다양한 구성이 가능하다. 예를 들면, 하나의 구성은 비교적 균일한 기공 구배를 갖는 다공성 스캐폴드(310a)이다. 기공 구배 스캐폴드(310b)는 세포가 스캐폴드를 통하여 이동할 때 기공 크기가 감소하는, 기공 구배를 갖고 있는 다공성 스캐폴드가다. 이것은 세포 접종 과정의 종결시에 스캐폴드 전체에 걸쳐 세포의 더욱 균일한 분포를 촉진한다. 역방향을 갖는 기공 구배 스캐폴드(310c)가 사용될 수 있다. 대안으로, 콜라겐과 같은 유기 화합물의 섬유질 메트릭스인 화이버 필터 스캐폴드(310d)가 사용될 수 있다. 또한, 증식 기판으로서 마이크로-캐리어(예를 들면 Cytodex™)의 완비형 현탁액을 이용하는 것도 가능하다. 게다가, 생물반응기는 CPU(128)에 의해 지원되는 광학 프로브(324)(다공성 스캐폴드(310a)와 함께 도시함)를 가지고 있으므로 증식 스캐폴드내에서 일어나는 세포 접종 과정의 점검이 가능하고, 또한 증식 사건, 특히 합류 세포층을 달성하는 것을 향한 진행을 평가할 수 있다.
증식과 관련된 것으로서, 상이한 구조 및 상이한 재료(즉, 인산칼슘과 같은 무기 광물질-기제 스캐폴드, 콜라겐과 같은 유기 생체고분자 스캐폴드 등)로 형성될 수 있으며, 조직 엔지니어링 과정에 사용될 수 있는 여러가지 이식가능한 분화 스캐폴드(312)가 있다. 도 12c는 조직 구성물 형성을 향해 모두 동시에 진행될 수있는, 최대 3개의 이식가능한 분화 스캐폴드(312)를 포함하는 복수-구역 분화/조직 형성 챔버(306)를 예시하고 있다. 이것은 조직 수득을 평가하고 최대화하도록, 상이한 크기의 이식가능한 조직의 제조, 및 교호식 이식가능한 분화 스캐폴드의 사용을 가능하게 한다. 예를 들면, 스캐폴드(312a)는 조직 구성물이 뼈 안에 고정되는 단단한 조직을 요하는 뼈 및 연골 용도에 사용하기 위한 Skelite™와 같은 뼈 생체적합재료로 형성된 다공성 망상 조직이다. 스캐폴드(312a)는 세포 접종 과정 동안에 스캐폴드(312a) 밖으로의 세포손실을 최분해하도록 스캐폴드(312b)를 둘러싼 막을 생성하도록, 이식체를 둘러싸고 있는 스캐폴드 막/메시(326)의 이용을 통해 더욱 향상될 수 있으며, 이에 의해 조직 엔지니어링 과정을 더욱 효율적으로 만든다. 바람직하게 막은 스캐폴드를 단지 부분적으로만 둘러싸거나 또는 스캐폴드를 보다 완전하게 둘러쌀 수 있다. 스캐폴드 막/메시(326)의 주요 목적이 이식가능한 분화 스캐폴드(312)상에 그리고 그 안에 세포를 포함하도록 하는 것이지만, 스캐폴드 막/메시(326) 특성의 신중한 선택은 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이 세포 수준의 조직 엔지니어링 과정에 대한 현저한 영향을 나타낼 수 있는 특정 분자의 통과를 허용하거나 또는 제한한다.
또 다른 실시예는 구배 다공도 및 기공 구배와 스캐폴드 막/메시(326)의 장점을 조합한 스캐폴드(312c)를 둘러싸고 있는 막이다. 구배는 세포가 최상부 표면에 수집되어 스캐폴드내로 단지 최소한으로 전파되도록 의도적으로 구성된다. 표면 다공도는 발생중인 조직에 스캐폴드 표면을 통하여 영양소의 공급 및 조직 안정성을 위해 유리하다고 생각된다. 이러한 시도는 서로 다른 층으로 된 구역을 갖는양극성 조직 구성물의 발생을 얻게 된다. 상부 구역은 본질적으로 새로운 조직으로 구성된다. 하부 구역은 본질적으로 세포나 조직이 없으며, 개방된 다공성 스캐폴드로 남아 있다. 중간 경계면 구역은, 개방된 스캐폴드와 새로운 조직층 사이의 구조적으로 안정한 전이를 나타낸다. 상부층이 숙주 연골과 측면 방향의 통합을 제공하는 조직 엔지니어링된 연골이고, 하부층은 연골하 뼈와 측면 방향 및 수직 방향의 통합을 제공함에 따라서, 이와 같은 양극성 조직 구성물은 관절 연골의 병소 결함의 수선을 위해 이상적이다. 외과적 이식시, 개방 스캐폴드에 골수를 적용함으로써, 둘러쌓인 연골하 뼈와 하부층의 통합이 보다 증대될 수 있다. 연골 치료 용도에서, 광물질 기판의 스캐폴드가 관절 표면까지 연장되지 않는 것이 중요한데, 이는 관절 기능을 손상시킬 수 있기 때문이다. 따라서, 큰 연골 병소(즉, 최대 직경이 10㎠ 및 최대 두께가 2-3㎜)을 치료하기에 충분한 크기의 조직 구성물의 형성을 지원하기 위하여, 제 2의 비-광물질 스캐폴드(도면에서는 도시 생략)가 새로운 연골의 정상부에 사용될 수 있다. 게다가, 보조 스캐폴드는, 착상 위치에 존재하는 특정의 해부학적 특성에 보다 가깝게 일치하는 관절 표면 프로필을 갖는 구체적인 형상의 구성물을 형성하도록 구성될 수 있다. 스캐폴드의 재료로서는 합성 생체고분자(예를 들면 PGA, PLA) 또는 천연 생체고분자(예를 들면 알긴산염, 아가로스, 피브린, 콜라겐, 히알루론산)를 들 수 있다. 이들 보조 스캐폴드는 히드로겔 또는 3-차원의 예비성형된 스캐폴드의 형태일 수 있다.
양극성 조직 구성물의 제조를 위한 대안 기술은 조직 엔지니어링 시스템내에서 가능하다. 이식가능한 분화 스캐폴드(312)는 스캐폴드의 정해진 영역으로 세포접종을 제한하는 생물학적으로 재흡수될 수 있는 고분자로 부분적 침윤될 수 있다. 이것은 조직 구성물의 제조 동안 새로운 조직 형성에 대한 우선적인 구역을 생성한다. 이식시 고분자는 재흡수되고, 이로써 숙주 조직 내부에의 고정을 촉진하는 다공성 스캐폴드내에 빈틈을 남긴다. 또 다른 구성은 분화/조직 형성 챔버의 출구로부터 떨어져 위치하는 상대적으로 개방된 다공성을 가진 이식가능한 스캐폴드를 포함한다. 세포 접종 동안 이 개방된 공간은 개방된 스캐폴드를 통하여 이동하는 세포의 수집을 제공한다. 세포는 분화/조직 형성 챔버내에 축적되기 때문에, 스캐폴드의 일부분 및 개방된 공간은 세포로 침윤될 수 있고, 이로써 새로운 조직 형성에 대한 우선적인 구역을 형성한다. 결과적인 조직 구성물은, 스캐폴드가 없는 새로운 조직 구역, 새로운 조직 및 스캐폴드 양자를 포함하는 중간 전이 구역 또는 경계면 구역, 그리고 개방되어 있고 세포 또는 조직이 기본적으로 없는 다공성 스캐폴드 영역을 포함한다.
도 12d는 생물반응기 모니터링 계획을 도시하고 있는데, 여기서 센서(216)(즉, 온도, pH, 용해된 기체 등)는 생물반응기(202)의 뚜껑(204)에 일체화되어 조직 엔지니어링 과정 진행을 CPU(128)로 피드백한다. 게다가, CCD 카메라(330)를 사용하여 임박한 합류의 증거로서 증식 스캐폴드(310)(또는 기판)의 광학적 성질(예를 들면, 광학 밀도 및/또는 세포 밀도의 함수로서 광분산)을 모니터하여, 증식 단계로부터의 세포 수득을 최대화하도록 세포 방출 시간을 조정한다.
도 13은 생물반응기(202) 내부의 유동 경로 및 유체 순환을 더 상세하게 도시하고 있다. 생물반응기(202)는 유입구(302), 유출구(304) 및 기본 챔버(300)를한정하는 내부 공동을 가지고 있는 것으로 도시되어 있다. 유체는 유입구(302)를 경유하여 유체 유동판(220)으로부터 생물반응기(202)로 흐르고 유출구(304)를 통해 빠져나간다. 생물반응기 뚜껑(204)은 생물반응기(202)에 부착된다. 생물반응기의 뚜껑(204)과 생물반응기(202)를 함께 고정하기 위하여, 상이한 장착 하드웨어가 다양하게 사용될 수 있다. 챔버(300)는 하나 이상의 기판 또는 스캐폴드(310)를 수용하도록 디자인될 수 있다. 게다가, 생물반응기(202)는 조직의 분해, 증식, 분화 및 조직 형성 단계를 허용하는 개별적인 챔버로 분할될 수 있다. 각 챔버는 조직 엔지니어링 순서에 대한 보다 나은 제어를 위하여, 유동제어 밸브를 통하여 독립적으로 제어되는 유입구 및 유출구를 구비할 수 있다. 유체의 순환은, CPU(128)로부터의 제어 신호에 기초하여, 하나 이상의 유동제어 밸브(214) 및 펌프 단위(122)의 작동에 의해 수행된다. 작동된 특정의 밸브에 따라, 펌프 단위(122)의 작동은 유체 저장기(208)중 하나로부터 생물반응기(202)내로 유체를 이동시키거나, 또는 생물반응기로의 유체의 재순환을 허용한다. 안정적인 용해된 기체 농도를 필요로 하는 생물학적인 과정을 위해서는 재순환이 유리한데, 이는 기체 교환을 용이하게 하는 막을 가로질러 유체가 통과할 수 있게 하기 때문이다. 교환의 성질은 ECU(136)에 의해 확립된 외부 조건에 대한 생물반응기내에 용해된 농도에 의존한다. 생물반응기 뚜껑(204)은 생물반응기의 내부 챔버에 연결되어 작동하는 샘플링포트(332) 및 센서프로브(216)를 가지고 있는 것으로 도시되어 있다. 대안으로서, 샘플링 포트는 생물반응기 하우징의 다른 곳에 구비될 수 있다. 샘플링 포트는 생물반응기로 들어가거나 그로부터 나오는 재료의 제거 또는 추가를 허용한다. 필요할 경우샘플링 포트는 기체교환막으로 대체되거나 또는 기체교환막이 추가될 수 있다.
도 14는, 명료함을 위하여, 생물반응기 뚜껑(204)이 제거된 상태의 복수 챔버 생물반응기(202)를 도시하고 있다다. 유입구(302)는 조직 분해 챔버(322)에 연결된다. 조직 분해 챔버(322)의 구성은 분리된 세포를 생산하는 후속의 자동 분해를 위하여 환자의 생검편이 생물반응기내에 로딩되는 것을 허용한다. 분해 챔버 내부의 순환 경로는, 생검편의 유순한 교반을 촉진시켜 순환하는 분해 효소로의 생검편 조직의 과도한 노출을 잠재적으로 일으킬 수 있는 불안정 영역을 방지한다. 게다가, 분해 챔버의 입구 및/또는 출구는 다양한 다공성의 필터막/메시(316)(도시 생략)를 수납하여 세포 정렬을 제공하고 부분적으로 분해된 조직 응집의 배출을 방지할 수 있다. 생물반응기는 증식을 위한 세포를 받기 위한 증식 기판 또는 스캐폴드(310)를 수용하는 제 2 챔버(300)를 포함한다. 증식 스캐폴드는 2차원 및 3차원 증식을 지지하는 다양한 기하학적 형태로 형성될 수 있고, 세포 증식을 촉진하는, 인산칼슘 생체적합재료(예를 들면 Skelite™), 생체고분자, 또는 천연 재료(예를 들면 콜라겐)와 같은, 다양한 생체적합성 재료로 이루어질 수 있다. 조직 분해 챔버(322)로부터, 또는 선택적인 세포 접종 포트(334)를 경유하여 송달된 세포는 증식 기판 또는 스캐폴드(310)에 분산되고 증식하며, 따라서 후속의 세포 분화 및 조직 형성을 위한 세포 수를 증가시킨다. 더 이상의 분화가 없이 세포를 단지 확장시키는 것이 목적인 경우, 과정은 증식 이후에 종료될 수도 있다. 이식가능한 분화 스캐폴드(312)는 생물반응기(202)의 베이스에서 분화/조직 형성 챔버(306) 내부에 위치한다. 증식 스캐폴드(310)와 함께 함으로써, 이식가능한 분화 스캐폴드(312)는 상이한 기하학적 형태로 형성될 수 있고 이식 위치의 생물학적인 요구조건을 충족하기 위하여 적절하게 선택된 다양한 생체적합성 재료(예를 들면 Skelite™ 이 골격 위치를 위한 이상적인 이식체이다)로 이루어질 수 있다.
작동시, 효소(예를 들면, 트립신)의 송달 및 충격 드라이브(266)(도시 생략)를 경유하여 생물반응기에 충격의 시기적절한 적용과 같은 자동화된 순서를 통하여 세포는 증식 기판 또는 스캐폴드(310)로부터 배출될 수 있다. 세포 현탁액은 생물반응기내에 존재하는 제어된 유동 조건하에서 세포 깔대기(314)를 경유하여 이식가능한 스캐폴드(312)내로 이동하는데, 그 후에 세포는 이동하지 않게 되고 분화 및 조직 형성 순서를 개시한다. 이 순서의 종료시, 그렇게 형성된 조직은 후속의 이식을 위하여 생물반응기로부터 제거될 수 있다. 당업자는 도 14의 생물반응기의 특정 실시예는 단지 예시적인 것이라는 것을 이해할 수 있다. 일반적으로, 생물반응기는, 기능상에 나쁜 영향을 주지 않으면서, 전체적인 형상, 크기 및 내부 구성에 대하여 다양한 방식으로 구성될 수 있다. 예를 들면, 생물반응기에 위치하는 기체교환막(336)은 조직 엔지니어링 모듈(118)의 하나 이상의 유체 송달 튜브(210) 또는 유동판(220)과 한줄로 연결된 별도의 그리고 불연속적인 구성요소일 수 있다. 게다가, 생물반응기의 챔버는 제어 밸브를 경유하여 서로 격리되어 모든 유체가 모든 챔버를 통과해야할 필요성을 제거할 수 있다. 필요할 경우 챔버 사이의 경로는 개방되어 유체 및 세포 현탁액의 송달을 수행할 수 있다. 생물학적 과정 조건 및 순서에서의 증가된 유연성을 가능하게 하는 그와 같은 변형의 예가 도 17에 도시되어 있다. 생물반응기의 내용물에 대한 이식가능한 분화 스캐폴드(312)의 제어된노출을 가능하게 하는 대안의 구성은 분화 단계의 부분으로서 세포 접종이 필요할 때까지 이식가능한 스캐폴드를 격리시키는 셔틀(318)의 사용이다. 세포 접종을 가능하게 하기 위하여, 셔틀(18)은 이식가능한 스캐폴드를 이동시켜 생물반응기 내부의 보호된 위치로부터 유체를 유동시킨다. 회전 기반 운동 또는 세포 접종이 필요할 때까지 이식가능한 스캐폴드를 격리시키는 제거가능한 장벽을 포함하는 다양한 구성의 셔틀이 가능하다.
도 15는 조직 엔지니어링 과정내의 여러 단계에서 침전에 의한 세포 수송을 실시하는 데 중력 벡터의 배향의 장점을 취하는 회전식 생물반응기 디자인을 도시하고 있다. 이 도면이 생물반응기의 회전을 도시하고 있지만, 그 기술적 목적은 조직 엔지니어링 모듈의 회전에 의해 또는 전체 하우징(102)의 회전에 의해 동등하게 얻어질 수 있다는 알아야 한다. 도 15에 도시된 바와 같이, 생물반응기(202)는 조직 엔지니어링 모듈(118)의 구조 골격(200)에 부착된 회전 샤프트(350)에 부착되어 있다. 이는 침전을 통한 세포 접종이 증식/배양 챔버(300) 내부의 선택된 증식 표면 상에서 발생할 수 있도록 생물반응기(202)의 회전을 위한 메카니즘을 제공한다. 생물반응기의 증식 표면은 선택적으로 증식을 향상시키는 생체적합재료(예를 들면 Skelite™)로 코팅되거나, 전용 증식 기판 또는 스캐폴드가 이 역할을 제공하기 위해 챔버(300) 내로 이식될 수 있다. 분해 챔버(322)의 사용에 대한 변경으로서, 제 2 접종 포트(352)가 직접적인 세포 접종을 가능하게 해주도록 생물반응기(202)의 측부에 제공된다. 세포는 초기에는 상대적으로 작은 증식 표면(354) 상에 접종될 수 있다(도 15a 참조). 증식 경과 시간 또는 합류점의 검출에 기초하여,세포는 자동적으로 배출되고 생물반응기는 회전 샤프트(350)를 통해 회전될 수 있어, 증식 표면(354)으로부터 배출된 세포는 증가된 면적의 표면(356) 상으로 침전되어(도 15b 참조), 추가적인 증식을 가능하게 한다. 제 2 증식 단계의 완료시에, 증량된 세포가 배출되고 생물반응기는 다시 회전되어 이식가능한 스캐폴드(312)의 접종을 가능하게 한다(도 15c 참조). 따라서 회전 샤프트(350)와 당해 가요성 튜브(358)는 연속적인 증식 단계들에서 중력 침전의 사용을 최대화하는데 요구되는 만큼 생물반응기(202)가 회전되는 것을 가능하게 해준다. 조건이 맞는 경우 생물반응기를 휘젓거나 흔드는 방식으로 회전 샤프트를 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있는 것이다.
도 16을 이제 참조하면, 조직 엔지니어링 모듈(118)은 현탁 세포, 조직 배양 유체, 및/또는 폐기물의 무균 샘플링을 위한 기술을 포함하도록 조절될 수 있다. 이 실시예에 있어서, 주사기 매니폴드(400) 및 무균 오프로딩 포트(402)가 조직 엔지니어링 모듈(118)의 구조 골격(200) 내로 통합된다. 주사기(404)는 조직 엔지니어링 과정의 작동, 온전성 또는 무균성을 손상시킴이 없이 연속적인 분석을 위해 유체 샘플 또는 세포 현택액의 수집 및 제거를 가능하게 해주도록 매니폴드(400)에서 오프로딩 포트(402)에 연결된다. 또다른 샘플링 기법이 또한 제공되어, 가용성 생물반응기 샘플링 라인(408)이 생물반응기 뚜껑(204)에 연결된다. 이 라인이 생물반응기의 내부에 물리적으로 연결되고 그 안에서 진행중인 생물학적 사건에 근접하고 있을 때, 이 라인은 생물반응기 내에 존재하는 것과 실질적으로 동일한 조성의 유체를 함유한다. 결론적으로, 생물반응기 유체의 대표적인 샘플은, 샘플링 라인의 끝을 융합시키고, 그런 다음 계속되는 분석을 위해 이 라인을 조직 엔지니어링 모듈로부터 제거함으로써 얻어질 수 있다. 그와 같은 가용 라인이 하우징(102) 내의 실링 구성요소의 자동적인 작용을 통한 샘플링 기법의 기초로서 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
도 17은 분해, 증식 및 분화에 대한 상이한 요건들이 개별 생물반응기 챔버들에 의해 수용되는 조직 엔지니어링 모듈(118)의 한층 복잡한 유체 유동을 개략적으로 도시하고 있다. 이들 챔버는 일련의 개별적인 생물반응기 내에 존재하거나 각 챔버 내의 조건에 관하여 개별적인 제어를 유지하는 단일의 생물반응기 내에 조합될 수 있다. 조직생검편(320)을 수용하는 조직 분해 챔버(322)가 존재한다. 분해 챔버(322)로부터 세포를 수용하고 증식 기판 또는 스캐폴드(310)의 접종을 가능하게 해주도록 형성된 증식 챔버(300)가 존재한다. 증식 챔버(300)로부터 증량된 세포를 수용하고 이식가능한 스캐폴드(312)의 접종을 가능하게 해주도록 형성된 분화/조직 형성 챔버(306)가 또한 존재한다.
조직 엔지니어링 시약(즉, 배지, 효소 용액, 세척 용액 등)이 유체 저장기(208a-208e) 내에 로딩된다. 액세스 포트(212f)를 사용하여 샘플링을 목적으로 수동으로 흡인될 수 있는 폐기물이 유체 저장기(208f) 내에 수집된다. 다른 조직 엔지니어링 과정을 위해 요구될 때 추가적인 유체 저장기가 유체 저장기 시스템(206)의 일부를 형성하고 조직 엔지니어링 모듈 상에 수용될 수 있다. 시스템을 통한 유체 유동은 유체 펌프(122a-122k), 유체 제어 밸브(214a-214c) 및 일방향 유동 밸브(410a-410c)(즉 유체 유동 체크 밸브)의 작동에 의해 안내된다. 또한, 펌프(212a-212k)는 중앙 마이크로프로세서로부터의 제어 유입부값에 따라 능동 펌프 또는 수동 밸브(개폐)로서 작용하도록 형성되어 있다. 필터(316a-316d)는 시스템 내의 세포 현탁액의 움직임을 선택적으로 제어하고 조직 엔지니어링 과정의 세척 및 전이 단계 중에 세포 응집체의 통과를 제한하는 데 사용된다. 배지중의 용해 기체의 수준은 인라인 기체교환막(282a, 282b)을 통해 유지된다. 선택적인 주사기(404a, 404b)가 무균 오프로딩 포트(402a, 402b)를 통한 세포 수집 또는 배지 샘플링을 가능하게 해주도록 존재한다.
작업시에 조직 생검편(320)이 필터(316a, 316b) 사이의 조직 분해 챔버(322) 내로 이식된다. 분해 배지 함유 효소가 분해 과정을 시작하기 위해 유체 저장기 시스템(206)으로부터 조직 분해 챔버(322)내로 펌핑된다. 분해는 생검편에 대한 시약의 노출을 최대화하기 위한 혼합 격판을 통한 분해 챔버 내에서의 분해 배지의 유순한 교반에 의해 향상될 수 있다. 분해 배지는 펌프(122g)를 통해 계속적으로 또는 주기적으로 재순환될 수 있다. 재순환시에, 유체 유동은 조직 생검편을 현탁하고 뒤섞어 분해 과정의 효과를 최대화하기 위해 중력 벡터에 대항하여 분해 챔버의 바닥부로 안내된다. 필터(316a)는 유체 경로 내로의 세포 및 세포 응집체의 이동을 방지한다. 재순환 경로는 분해 배지 내에 일정 수준의 용해 기체를 제공하는 인라인 기체교환막(282a)을 포함한다. 유체 저장기 시스템(206) 내에 수용되어 있는 세척 용액을 분해 챔버(322)의 바닥부 내로 도입함으로써, 분해 챔버를 씻어 내리고 해리된 세포와 임의의 잔류 세포 응집체 양자로부터 분해 배지를 효과적으로 세척한다. 단일의 또는 복수의 세척 과정 다음에, 외부 검사 또는 분석을 위해 역방향 유동을 적용하여 세포 현탁액을 증식 챔버(300) 또는 선택적인 주사기(404a)로 전송한다. 부분적으로 분해된 조직의 분해 챔버로부터의 이동은 해리된 세포의 통과는 허용하고 세포 응집체는 체류시키는 크기를 갖는 필터(316b)에 의해 배제된다.
생검편 분해 과정으로부터 생성되거나 세포 현탁액의 직접적인 로딩을 통해 입수가능한 세포는 유체 유동 및/또는 중력 침전을 통해 증식 챔버(300) 내에 있는 증식 기판 또는 스캐폴드(310) 상에 접종된다. 증식 기판 또는 스캐폴드(310)에의 세포의 부착(부착증식 세포를 예를 들어)을 허용하는 정기 기간 다음에, 증식 배지가 유체 저장기 시스템(206)으로부터 증식 챔버(300)내로 도입된다. 이 배지는 증식 단계 중의 특정 시간에 저장기 시스템(206)으로부터 신선한 증식 배지로 주기적으로 교체된다. 배지 교체 단계 사이에, 증식 챔버 내의 유체는 펌프(122g, 122h, 122i), 플러스 제어밸브(214a, 214b)의 제어하에서 계속적으로 또는 주기적으로 교체된다. 유체 공급 및 재순환 경로는 증식 배지 내에 일정 수준의 용해 기체를 제공하는 인라인 기체교환막(282a)을 포함하고 있다. 배지 교체 단계 중, 유체 저장기 시스템(206)으로부터의 신선한 배지의 공급은 펌프(122f)를 통한 폐기물 저장기(208f)로의 유체 제거와 균형맞춤된다. 따라서, 주기적인 배지 교체 단계와 제어된 재순환의 조합을 통해, 조직 엔지니어링 시스템은 증식 과정 전체에 걸쳐 증식 챔버 내의 최적의 상태를 유지한다.
일단 세포 배양이 합류점에 접근하면 증식 챔버(300)내의 배지가 펌프(122f)에 의해 폐기 저장기(208f)로 비워진다. 이러한 과정에 있어서, 증식 챔버로부터유체를 제거하는 것은 증식 챔버 상의 무균 필터 포트를 통하여 공급된 무균 공기를 도입하거나 유제 저장시스템(206)으로부터 PBS 세척용액을 도입함으로써 균형이 잡힌다. 남아있는 증식 배지를 제거하기 위해 PBS 세척용액으로 2개의 연속적인 세척단계에 의해 세포가 광범위하게 세척된다. 계속하여 효소(예를 들면 트립신)의 공급 및 충격 드라이브에 의해 생물반응기에 시간조절된 임팩트를 가하는 것과 같은, 자동화된 순서를 통해서 증식 기판, 즉 스캐폴드(310)로부터 세포가 배출된다. 세포 배출에 이어서, 효소 처리가 효소 활성을 방해하는 혈청을 가진 배지의 공급에 의해 중단될 수 있다. 분화/조직형성 챔버(306)내의 이식가능한 스캐폴드(312)에 최종 접종용 세포를 수집하기 위해서, 세포 현탁액이 증식 챔버(300)로부터 필터(316c)로 송달된다. 상기 필터(316c)는 세포의 통과를 방해하지만 상기 배지가 펌프(122f)의 제어하에서 밸브(214b)를 통하여 폐기 저장기(208f)로 연속되게 한다. 그 다음에, 수집된 세포는 역방향 유동의 적용에 의해 필터(316c)로부터 배출되어 분화/조직 형성 챔버(306) 또는 외부의 검사 또는 분석용의 선택적인 주사기(404b) 중의 하나로 송달된다.
이식가능한 분화 스캐폴드(312)에 대한 세포 접종은 펌프(122j)에 의해 세포를 필터(316c)로부터 스캐폴드의 최상부면으로 이동시킴으로써 실행된다. 스캐폴드로부터의 세포의 손실은 스캐폴드 막 또는 메시(326)의 선택적인 사용에 의해 최분해된다. 세포 접종에 이어서, 새로운 분화 배지가 펌프(122k)의 작동에 의한 제 2의 유입부를 통해서 분화/조직형성 챔버(306) 속으로 도입될 수 있다. 이러한 제 2의 유입부는 세포 응집의 형성을 방해할 수 있는 순수한 스트레스를 손상할 가능성을 최분해하기 위해 세포가 접종되는 이식가능한 스캐폴드의 구역으로부터 떨어져서 위치되어 있다. 상기 분화 배지는 분화 단계 동안 특정한 시간마다 주기적으로 저장 시스템(206)로부터 새로운 분화 배지로 교체된다. 배지 교체 단계 동안, 분화/조직형성 챔버내의 유체는 펌프(122j) 또는 펌프(122k)의 제어와, 밸브(214b)의 제어하에서 연속적으로 또는 주기적으로 재순환된다. 새로운 분화 배지와 재순환된 배지 양자의 송달을 위한 경로는 분화 배지 내에 용해되어 있는 기체의 일정한 수준을 제공하는 인라인 기체교환막(282b)을 포함하고 있다. 배지 교체 단계 동안, 유체 저장시스템(206)으로부터 새로운 배지의 공급은 펌프(122f)에 의한 폐기물 저장기(208f)로의 유체의 제거에 의해 균형이 잡힌다. 분화/조직형성 챔버 내의 환경 조건은 조직 구성물의 성공적인 형성을 위해 필요한 주기 동안 감시되고 제어되며, 상기 시기에 생물반응기의 분화/조직 형성 챔버는 개방되고 상기 구조는 계속되는 임상적인 또는 연구적인 사용을 위해 복구된다.
도 18은 증식 챔버(300) 내의 증식 스캐폴드 또는 기판(310)이 비교적 큰 표면적의 평면 증식 기판으로 교체되는 도 17의 유체 유동 개략도에 대한 변화를 도시한다. 중력하에서 세포 침전이 증식 표면 위에서 세포를 균일하게 분포시키도록 상기 기판이 배향되어 있다. 증식 챔버의 정확한 방향이 유지되면, 증식 기판은 강성의 고분자 배양 플레이트 또는 가요성 벽 용기의 형태로 될 수 있다.
도 19는 조직 생검편(320)과 같은 하나 이상의 조직 샘플을 수용하기에 적합한 크기의 조직 분해 챔버(322)를 포함하고 있는 조직 분해 생물반응기(500)를 도시하고 있다. 상기 생물반응기(500)는 4개의 주요 구성요소: 즉, 실질적으로 조직분해 챔버(322)를 형성하는 생물반응기 베이스(502), 제거가능한 생물반응기 뚜껑(504), 포트 필터(316b), 그리고 선택적인 포트 필터(316a)(도시되지 않음)로 구성되어 있다.
생물반응기 뚜껑(504)는 배지 포트(506)에 선택적인 포트 필터(316a)(도시되지 않음) 및 공기 유출구(508)를 제공한다. 생물반응기 베이스(502)는 배지 포트(510)를 통하여, 조직 분해 챔버(322)로부터 분리된 세포의 통과, 그리고 조직 응집 및 생검편 조직파편의 보유를 허용하는 필터(316b)를 수용하고 있다.
조직 생검편(320)의 이식에 이어서, 상기 생물반응기는 자동화된 제어하에서 포트(506) 또는 포트(510)을 통해서 효소 용액으로 채워진다. 조직 분해 챔버(322)에 효소 용액을 부가하는 것은 포트(508)를 통해 공기를 배출시킴으로써 균형이 잡힌다. 생검편 분해는 연속적이거나 단속적인 효소 용액의 재순환하에서 일어나고, 그 결과 배출된 세포를 현탁액 상태로 유지하고 효소 시약에 대한 생검편의 노출을 최대화한다. 재순환 동안, 효소 용액은 포트(510)를 통하여 생물반응기로 들어가고 포트(506)를 통하여 배출된다. 이러한 구성은, 생검편이 효소 시약의 효율성을 최대화하도록 현탁상태로 되어 뒤섞이도록 중력 벡터에 대향하는 방향으로 유체 유동 경로를 만든다.
분해는 혼합 격판(도시되지 않음)에 의한 분해 챔버 내에서의 분해 배지의 유순한 교반에 의해 강화될 수 있다. 유체 유동 시스템 내에 있는 기포가 포트(506)의 입구(512) 상부의 생물반응기의 상반부에서 포획되기 때문에, 포트(508)는 임의의 재순환 단계 동안에 폐쇄될 수 있다. 분해 순서가 종료하자마자, 포트(506)를 통한 공기 또는 배지 중 어느 하나의 역방향 유동의 적용은 포트(510)를 통한 분해된 세포를 증식 챔버 또는 세포 수집 용기로 이전한다.
도 20은 증식 챔버(300)를 제공하는 증식 생물반응기(520)를 도시하고 있다. 증식 챔버의 바닥부는 세포 부착 및 성장에 적합한 증식 기판(310)으로 이루어져 있다. 배지에 용해된 기체의 수준을 조정하거나 유지하기 위해서, 기체 투과성 막(도시되지 않음)이 산소 또는 이산화탄소와 같은 기체의 송달을 허용하는 증식 챔버의 최상부 표면에 포함될 수 있다. 분리벽(522)은 증식 챔버의 내부 공간을, 배지가 유입구(524)로부터 유출구(526)로 미리 형성된 경로를 따라서 이동되게 하는 채널 시스템으로 분할한다.
증식 생물반응기의 디자인의 설계는 여러가지 중요한 작동적인 특징을 가지고 있다. 비교적 균일한 세포 접종이 채널 시스템을 통해서 세포 현탁액의 주입에 의해 얻어질 수 있다. 더욱이, 채널의 형태는 배지 유동이 전체적인 증식 표면상에서 잘 분포되도록 하여 감소된 영양공급 또는 폐기물 제거로 인한 국부적인 활력을 절충하는 잠재적인 낮은-유동 구역을 감소시키는 것을 보장한다. 증식 순서의 종료시에, 채널 시스템을 통한 적절한 효소액의 연속적인 또는 간헐적인 재순환은 유체 유동에 의해 발생된 낮은 수준의 전단력 그리고 효소 반응의 효과로 인해 균일한 세포 분리를 야기한다. 따라서, 세포 수확은 증식 챔버의 회전 또는 기계적인 진동을 필요로 하지 않고 달성될 수 있다.
도 21은 세포 분화 그리고 이어지는 조직 구성물 형성을 증진하기 위해서 설계된 분화 생물반응기(530)를 도시하고 있다. 생물반응기는 4개의 주요한 구성품으로 이루어져 있는데: 실제로 분화/조직 형성 챔버(306)를 형성하는 생물반응기 베이스(532), 제거가능한 생물반응기 뚜껑(534), 투과성 막 튜브(326), 그리고 분화 스캐폴드(312) 등이다. 투과성 막 튜브(326)는 스캐폴드 망상을 단단하게 감싸서 스캐폴드 위에서 조직 성장실(536)을 형성한다. 조직 성장실은 스캐폴드의 기공 크기 및 막 튜브 내의 스캐폴드 위치에 따라서 스캐폴드 내에서 연장될 수 있다. 막 튜브는 또한 포트(542)의 입구(540)에 고정되어, 막이 분화/조직 형성 챔버(306)내에서 물리적으로 중앙에 위치한다. 이것은 생물반응기를 2개의 독립적인 실로 나누는데, 세포 및 조직 성장실(536) 그리고 외부 세포이 없는 배지실(538)이며, 모두는 전체적인 분화/조직 형성 챔버(306)내에 있다. 막 튜브의 기공 크기는 세포에 대해서는 비투과성이지만, 배양 배지 내의 영양소, 폐기물, 성장인자 등에 대해서는 투과성인 것으로 선택된다. 원한다면, 막 기공 크기는 막을 통과하는 일정한 분자무게를 가진 분자를 배제하는 방식으로 선택될 수 있다.
생물반응기 뚜껑(534)는 2개의 공기 유출구(542, 544), 그리고 하나의 배지 유입구(546)를 가지고 있다. 유입구(546)는 조직 성장실(536)내로의 세포 현탁액을 로딩하기 위해서 그리고 배양 배지로 구성되는 발생 조직의 관류를 위해서 필요하다. 빈 조직 성장실 내로의 세포 현탁액의 송달 동안에, 관련된 공기가 포트(542)를 통해서 배출된다. 유사한 식으로, 외부 세포가 없는 실(538)은 포트(548) 또는 포트(550)를 경유해서 배지가 로딩되고 그리고 관련된 공기는 포트(544)를 경유해서 빠져나간다.
분화 생물반응기의 설계는 포트(546)로의 배지 송달을 통해서 조직 구성을직접 관류하거나 또는 포트(538)를 통해서 세포이 없는 실(538)을 둘러싸도록 간접적으로 배지 공급을 허용한다. 전형적으로, 포트(542,544)는 관류 동안 폐쇄되고 그리고 포트(550)는 배지 출구로서 작용하지만; 여러가지 변경적인 배지 공급 시나리오가 특정의 조직 엔지니어링 요건에 근거해서 가능하다. 배지 관류 전략의 중요한 면은 스캐폴드로부터 세포의 임의의 손실없이 조직 성장실을 형성하는 투과성 막(326)이 신선한 배양 배지를 조직 성장실 내로 투과하도록 허용한다. 더욱이, 임의의 비투과성 생물반응기 벽에 제한되지 않고 기본적으로 모든 방향으로부터 세포에 영양이 제공된다.
도 22는 도 19 내지 도 21의 생물반응기가 채용되는 개략적인 유체 유동의 다른 실시예를 예시하고 있다. 조직 분해 챔버(322)가 조직 생검을 위해 존재한다. 증식 챔버(300)는 분해 챔버(322)로부터 세포을 수용하도록 그리고 증식 기판의 접종을 허용하도록 구성되어 있다. 버블 트랩(560)은 유입부 라인으로부터 증식 챔버까지 공기 방울을 제거하고 그러므로 이들 방울이 증식 챔버(300)로 들어가는 것을 방지하고 그리고 국부화된 세포 합류점을 잠재적으로 절충한다. 저장기(562)는 증식 챔버(300)로부터 확장된 세포 수를 수용하고 그리고 크로스 유동 여과 모듈(564)의 도움으로 수행되는 세포 농축 절차와 세포 세척 동안에 일시적으로 유지되는 용기로서 작용한다. 분화/조직 형성 챔버(306)는 또한 세척과 농축후에 저장기(562)로부터 세포을 받아 들이고 그리고 이식가능한 스캐폴드(312)의 접종을 허용하도록 한다.
조직 엔지니어링 시약(예를들면, 배지, 효소액, 세척액, 등)은 유체 저장기(208a-208e)에 저장된다. 폐기물은 유체 저장기(208f)에 모인다. 시스템을 통한 유체유동은 중앙 마이크로프로세서에서 유입부를 제어함에 따라서 유체 펌프(122a, 122b), 유동제어 밸브(214a-214v)의 작동에 의해 방향이 정해지게 된다. 공기 필터(566a-566c)는 시스템 불능을 초래하지 않고 작동 동안에 필요에 따라 공기를 시스템내로 그리고 시스템으로부터 송달하게 한다. 더욱이, 인라인 기체교환막(도시 생략)은 유체 유동 경로 내에서 여러가지 위치에 배치되어서 배양 배지에서 용해된 기체의 제어를 돕는다.
작업시에, 조직 생검편(320)은 조직 분해 챔버(322)내에 이식된다. 효소를 포함하는 분해 배지는 유체 저장기(208)로부터 조직 분해 챔버(322)내로 펌핑되어 분해 과정을 시작한다. 분해 배지는 펌프(122a)를 경유하여 연속적으로 또는 주기적으로 재순환 되어, 방출된 세포를 현탁액으로 유지하고 그리고 시약으로의 시약 노출을 최대화한다. 유체 저장기(208)중의 하나로부터 분해 챔버(322)의 상부로의 증식 배양 배지의 도입은 세포 현탁액을 증식 챔버(300)로 송달하고 그리고 동시에 증식 챔버(300)에서 세포 증식을 위해 허용가능한 농도까지 효소액을 희석한다. 분해 챔버로부터 부분적으로 분해된 조직의 송달은 분리된 세포의 경로와 세포 집합의 유지를 허용하기 위한 크기로 되어 있는 포트 필터(316b)에 의해 미리 배제되어 있다. 생검 분해 과정으로부터 발생된 세포는 밸브(214h,214j,214l) 및 펌프(122a)의 작동을 통해 세포 현탁액에 의해, 또는 증식 생물반응기의 부드러운 진동의 자동 적용에 의해 증식 챔버(300)를 통해 동질적으로 분포된다.
증식 기판에 세포의 부착을 허용하기 위한 비활동 기간에 뒤이어, 증식 배지가 유체 저장기(208)중의 하나로부터 신선한 증식 배지로 주기적으로 또는 연속적으로 대체된다. 배지 대체 단계동안에, 유체 저장기 시스템(208)으로부터의 신선한 배지의 공급은 밸브(214i)를 통해서 폐기물 저장기(208f)로의 유체의 제거에 의해 균형이 맞는다.
세포 배양이 합류점에 접근하면, 증식 챔버(300)내의 배지는 폐기물 저장기(208f)내로 배출된다. 이러한 과정에서, 증식 챔버로부터의 유체의 제거는 무균 필터(566a)를 통해서 송달된 무균 공기를 도입하므로서 또는 유체 저장기(208)중의 하나로부터 PBS 세척액을 도입하므로서 균형이 맞는다.
세포는 효소(예를들면, 트립신)의 송달 및 세포 현탁액의 시간에 맞는 재순환 또는 충격 드라이브를 통해서 생물반응기에 충격 또는 교반의 시간에 맞는 적용과 같은, 자동 과정을 통해서 증식 기판로부터 연속적으로 방출된다. 효소를 제거하기 위해서 그리고 세포 분화 챔버(306)에 연속적인 송달을 위해 비교적 소량의 배지로 세포를 수집하기 위해서, 세포 현탁액이 증식 챔버(300)로부터 저장기(562)까지 송달된다. 세포 현탁액은 그리고 밸브(214m,214j,214q)와 펌프(122a)를 경유하여 크로스-유동 여과 모듈(564)을 통해서 연속적으로 재순환된다. 크로스-유동 여과 모듈(564)에서 막은 세포의 손실을 막지만, 배지(투과)의 일정한 비율이 밸브(214o)를 경유하여 폐기물 저장기(208f)로 제거되도록 한다. 결과적으로 현탁액 체적의 감소 및/또는 임의의 효소의 희석이 야기되어, 투과의 제거가 유체 저장기(208)중의 하나로부터 신선한 배지의 공급에 의해 보상된다. 연속적인 유동은 잠재적인 세포이 크로스-유동 모듈(564)의 막 내에서 포획되게 된다.
이식가능한 분화 스캐폴드(312)로의 세포 접종은 저장기(562)로부터 밸브(214m,214j,214p), 및 펌프(122a)를 경유하여 스캐폴드의 상부 표면까지 세척된 세포를 송달함으로서 달성된다. 스캐폴드로부터 세포의 손실은 스캐폴드 막 또는 메시(326)의 선택적인 사용에 의해 최분해된다. 세포 접종에 뒤이어, 신선한 분화 배지는 펌프(122b)의 작동을 통해서 분화/조직 형성 챔버(306)내로 도입된다. 분화 배지는 저장기 시스템으로부터 신선한 분화 배지로 주기적으로 또는 연속적으로 대체된다. 배지 대체 단계 동안에, 유체 저장기(208)중 하나로부터의 신선한 배지의 공급은 밸브(214u)를 경유해서 폐기물 저장기(208f)로 유체의 제거에 의해 균형잡힌다. 배지 대체 단계 사이에, 분화/조직 형성 챔버내의 유체는 펌프(122b), 밸브(214t), 및 조직 구성물을 통하여 관류하는 밸브(214r) 또는 스캐폴드 막(326)의 외측으로의 송달을 위한 밸브(214s) 중 하나의 제어하에 연속적으로 또는 주기적으로 재순환된다. 스캐폴드 막 외측의 이러한 제2 유체 송달 경로는 세포 응집체의 형성을 손상시킬 수 있는 전단력을 손상시키는 잠재력을 최소하도록 세포로 접종되는 이식가능한 스캐폴드의 영역으로부터 멀리 떨어져 위치되어 있다. 유체 유동 개략도의 이전의 실시예에 대하여, 분화/조직 형성 챔버내의 환경 조건은 조직 구성의 성공적인 형성을 위해 필요한 기간 동안 모니터링되고 제어되는데, 이때에 생물반응기의 분화/조직 형성 챔버는 개방되고 조직은 연속 임상 또는 리서치 용도로 검색된다.
도 23은 여기에 설명된 바와 같이 조직 엔지니어링 모듈이 3개의 생물반응기를 포함하는 본 발명의 일실시예를 도시하고 있다. 도 23은 증식 챔버(300)를 가지고 있는 도 20의 증식 생물반응기 및, 개별 챔버(306)를 가지고 있는 도 21의 분화 생물반응기와의, 내부 조직 분해 챔버(322)를 가지고 있는 도 19의 조직 분해 생물반응기의 조합된 사용을 도시하고 있다. 3개의 생물반응기는 조직 분해, 세포 증식, 세포 분화, 및 조직 형성의 순서로 포함된 자동 단계를 제공하기 위해 조직 엔지니어링 모듈에 작동가능하게 연결되어 있다.
자동 조직 엔지니어링 시스템은 등가의 수단에 의해 또는 구조적 서포트에 의해 하우징에 지원되는 것으로 하나 이상의 생물반응기를 포함할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 수 있다. 2개의 이상의 생물반응기를 포함할 때, 생물반응기는 동작식으로 연결될 수 있고, 또는 대안으로, 동작가능한 및/또는 협동가능하게 동작가능한 것과 관계 없이 연결될 수 있다. 더욱이, 각각의 생물반응기는 상이한 내부 챔버 또는 동일한 타입의 챔버를 포함할 수 있다. 추가 실시예에서, 챔버 및/또는 생물반응기는 챔버들 및/또는 생물반응기들 사이의 유체, 세포 및/또는 조직의 교환을 위해 작동가능하게 연결되어 있다.
본 발명의 자동 조직 엔지니어링 시스템은 사용 준비에 용이하다. 다음의 순서는 관절 연골내의 병소 결함의 치료를 위해 본 발명의 조직 엔지니어링 시스템의 사용에 기초하여 연골 이식의 준비를 위한 대표적인 예이다. 이러한 적용을 위해, 조직 분해, 세포 증식 및 세포 분화/조직 형성의 단계가 요구된다. 조직 엔지니어링 과정의 3개의 단계는 도 17, 도 18 및 도 22에 도시된 바와 같이, 3개의 별개의 분리된 생물반응기 또는 복수의 챔버를 구비한 단일 생물반응기에 의해 달성될 수 있다.
조직 엔지니어링 순서를 초기화하기 전에, 다음의 시약 합성물이 저장기 주입 포트(212)를 경유해서 조직 엔지니어링 모듈내의 저장기(208a 내지 208e)내로 로딩된다. 시약 A는 작은 인간의 관절 연골 생체조직편로부터 유도된 콘드로사이트의 분해를 위해 사용된다. 시약 B,D,E 는 세포 증식을 위해 사용된다. 시약 C는 분화 및 조직 구성 형성을 위해 사용된다.
ㆍ 시약 A- 분해 배지: DMEM/F-12, 5% FCS 또는 자가이식 유액, 1㎍/ml 인슐린, 50㎍/ml 아스코르빈 산, 100IU/100㎍/ml Pen/Strep, 2.5% Hepes Buffer, 0. 1% (1mg/ml) 프로나제 및 0.025%(0.25mg/ml) 콜라게나제, pH 7.4
ㆍ 시약 B - 증식 배지: DMEM/F-12, 10% FCS 또는 자가이식 유액, 10㎍/ml 아스코르빈 산, 100IU/100㎍/ml Pen/Strep, 2.5% Hepes Buffer, pH 7.4
ㆍ 시약 C - 분화 배지:DMEM/F-12, 10% FCS 또는 자가이식 유액, 1㎍/ml 인슐린, 50㎍/ml 아스코르빈 산, 100IU/100㎍/ml Pen/Strep, 2.5% Hepes Buffer, pH 7.4
ㆍ 시약 D - PBS 세척액: 137 mM NaCl, 3.7mM KCl, 8mM Na2HPO4*2H2O, 1.5mM KH2PO4, in H2O, pH 7.4
ㆍ 시약 E - 세포 방출액: 1×트립신액
상기 시약은 시스템 엔크롤져내의 조직 엔지니어링 모듈상에 4℃에서 저장될 때 복수의 주일에 이르는 기간동안 보통 안정되어 있다. 효소는 조직 엔지니어링 모듈내에 동결 건조되어 저장되고 사용시에 수산화될 수 있다. 따라서, 특정한 조직 엔지니어링 용도에 맞는 맞춤형 효소 제작이 가능하다.
인체 연골 생체조직편(100~500 mg)는 상부 중안 대퇴부 관절구상의 논로드 베어링 영역으로부터 앤스로스코픽 수술을 통해 얻어진다. 생체조직편를 분해 챔버에 로딩하기 전에, 생체조직편는 무게 측정되어 그 질량은 베이스 단위에 대한 프로그래밍 순서로의 연속 데이터 유입부를 위해 기록된다. 질량 결정에 이어, 생체조직편는 분해 챔버내에 놓이고 생물반응기는 조직 엔지니어링 모듈이 조직 엔지니어링 시스템의 베이스 단위내로 이식되는 상태로 준비되도록 페쇄된다. 일단 조직 엔지니어링 모듈이 설치되면, 베이스 단위의 CPU는 요구되는 조직 엔지니어링 순서 및 생체조직편의 크기에 따라 사용자 인터페이스를 경유하여 프로그래밍된다.
프로그래밍된 자동화된 순서의 초기화시에, 생체조직편의 프로나제/콜라게나제 분해는 유체 송달 펌프의 동작 및 요구되는 유동 밸브의 활성화를 통해 생물반응기의 분해 챔버내로 시약 A의 주입에 의해 개시된다. 분해는 세포이 현탁액 상태로 유지되고 생체조직편로의 시약 노출이 최대화되도록 시약 A의 연속적인 또는 간헐적인 재순환 상태로 16시간동안 37℃에서 실행된다. 이것에 이어 시약 D에서의 2개의 연속적인 세척 단계가 이어질 수 있다. 이러한 분해 순서의 끝에서, 생검 조직의 100mg 당 약 200,000 내지 500,000의 세포이 얻어진다.
이러한 점에서, 분해된 세포의 샘플은 세포 수 및 활력을 산정하기 위해 샘플링 포트를 경유하여 검색될 수 있다. 이러한 생체학적 산정은 트라이팬 블루로 스테인된후에 헤모시토미터에 의해 시스템의 외측에서 산정되는 것이 보통이다.
베이스 단위의 자동화된 제어하에서, 비연관된 세포은 2000 세포/cm2및 15000 세포/cm2사이의 세포 접종 밀도를 달성하기 위해 생물반응기의 증식 챔버내에 존재하는 스캐폴드 또는 증식 기판에 송달된다. 연속된 증식으로 합류되기 위해, 시약 B는 프로그래밍된 유동 프로파일에 따라 조직 엔지니어링 모듈상의 저장기로부터 공급된다. 배지의 온도 및 pH 는 각각 37℃ 및 pH 7.4로부터의 편차를 검출하기 위해 모니터링된다. 또한, 세포 증식의 상태는 시간의 함수로서 신진대사의 턴오버의 검출에 의해 간접적으로 산정된다(예를 들어, pH, O2, CO2, 유산 및 포도당 소비량). 더욱이 합류의 수준은 증식 챔버내에 내장된 증식 프로브에 링크된 CCD 카메라를 경유하여 광학 모니터링함으로써 지원된다. 일단 임박한 합류가 센서에 기초한 모니터링에 의해 또는 실험상 결정되면, 세포은 모든 배양 배지를 제거하기 위해 시약 D로써 2개의 연속 세척 단계에 의해 광범위하게 세척된다.
스캐폴드 또는 증식 기판로부터 증식된 세포의 이탈은 증식 챔버로의 조직 엔지니어링 모듈내의 저장기로부터의 시약 E의 송달에 의해 초기화된다. 이러한 트립신액은 효소 활동을 금지하는 자가이식 유액 또는 FCS를 함유하는 시약 B의 자동 추가에 의해 반응이 정지되는 생물반응기내에 5분동안 존재한다. 증식 기판 또는 스캐폴드로부터의 세포 방출은 트립신액의 재순환 또는 충격 드라이브를 경유하여 생물반응기에 저주파수 충격을 가함으로써 더욱 강화된다. 일단 방출되면, 세포 세척 및 여과 단계는 트립신을 제거하고 분화/조직 형성 생물반응기내에 존재하는 스캐폴드로의 연속 전송을 위해 세포 현탁액을 집중시키기 위해 실행된다.
이러한 적용에서, 양극성 형태는 이것이 서브콘드럴 뼈와 통합되기 위해, Skelite™와 같은 뼈 생체적합재료로 형성된, 다공성 스캐폴드에 연결된 관절면에 연골층을 제공하기 때문에 이상적이다. 양극성 구성의 준비는 복수의 대안의 프로시져중 하나를 통하여 이루어질 수 있다. 분화 스캐폴드는 연골층의 형성을 촉진하는 높은 세포농도의 영역을 생성하는 일단부에서 우선적으로 세포을 트랩핑하는 기공 밀도 경도로써 형성될 수 있다. 대안으로, 스캐폴드는 이러한 영역에서의 세포 부착 및 연골 매트릭스 형성을 배제하기 위해 피브린 겔로써 일단상에 사전에 코팅될 수 있다. 어느 하나의 접근법으로, 스캐폴드로부터 떨어져 있는 세포의 손실은 둘러싸는 막 또는 메시의 선택적인 사용에 의해 최분해된다. 세포 송달을 위한 유속은 플로이드 시어가 증식된 세포 합류를 손상시키지 않는 것을 보장하기 위해 낮다. 세포 접종 단계의 완료에 이어, 분화/조직 형성 챔버를 통한 유체 유동은 이것이 성공적인 분화의 관점에서 중요한 것으로 알려져 있기 때문에, 세포 합류의 형성을 가능하게 하도록 정지된다. 이러한 중요한 단계에 이어, 시약 C의 관류는 세포에 영양소를 최적으로 공급하고 폐기물을 제거하기 위해 조직 형성 및 성숙을 위해 필요한 기간동안 실행된다. 이러한 배양 기간후에, 세포은 본래의 인체 관절 연골의 것과 실질상 동일한 세포밖의 매트릭스를 생성할 것이다. 형성된 조직의 특성은 SDS-PAGE 및 유전 표현을 통한 콜라겐 타이핑과 같은 독립 외부 생체 방법에 의해 확인될 수 있다. 프로세스의 최종 단계로서, 조직 엔지니어링 시스템은 순서가 완료되었다고 유저 인터페이스를 통해 통지하고, 조직 엔지니어링 모듈은 이식체를 획득하기 위해 제거될 수 있다. 조직 엔지니어링 모듈 또는 생물반응기의 탈착가능한 폼은 생물반응기 뚜껑이 무균 필드내에서 제거되고 이식체가 수술용으로 검색되는 수술실로 이송될 수 있다.
본 발명의 시스템은 세포 또는 조직의 특정 타입에 제한되는 것을 알아야 한다. 예를 들어, 골격의 이식체가 뼈 결함의 재구성에 사용되기 위해 준비될 수 있다. 이러한 적용에서, 골수는 조직 엔지니어링 프로세스에 필요한 주요 및/또는 프리커서 세포의 소스로서 사용될 수도 있다. 따라서, 조직 분해를 실행하기 위한 아무런 필요조건은 없고, 따라서, 생물반응기는 단지 증식 및 분화를 지원하는 타입일 수 있다. 이식체의 요구되는 크기 및 유용한 세포 합류점에 의존하여, 증식조차 필요하지 않을 수 있다. 이러한 경우에, 생물반응기의 형태는 세포 분화 및 진행하는 조직 형성의 단일 단계로 향해질 수 있다. 최종 조직 구성은 활성 뼈 세포이 스캐폴드의 개방 기공를 라이닝하고 새로운 미네랄화된 매트릭스(뼈 같은)를 적극적으로 레잉 다운하는, Skelite™와 같은 뼈 생체적합재료로 구성될 수 있는, 이식가능한 스캐폴드로 구성된다. 이러한 이식체는 이식체 자리에서 신속하게 통합되어 회복 과정을 가속화시킨다.
시스템의 유연성의 또 다른 예로서, 조직 엔지니어링된 혈관은 최종 분화 단계에서 관 모양의 유연한 스캐폴드로 접종되는 배양 확장된 내피 세포을 사용하여 준비될 수 있다.
본 발명의 일체형 조직 엔지니어링 시스템은 종래기술의 방법 및 시스템과 비교하여 복수의 장점을 가진다. 특히, 장치의 턴키 동작은 복잡한 조직 엔지니어링 과정이 클리닉에서 자동화된 제어하에 실행될 수 있도록 하고, 그래서 생체 처리를 위해 중앙집중된 시설로 세포을 송달할 필요를 배제시킨다. 시스템은 종종 이식체 오염 및 실패에 이르게 하는 기존의 비싼 인체 조직 배양 과정 및 시간 소비 문제를 제거한다. 조직 엔지니어링 모듈 및 연관된 서브시스템 어셈블리는 배양되는 세포 또는 조직의 타입에 대하여 주문되어 임의의 적합한, 생체조직과 잘 교합하고 내무균 물질로부터 제조될 수 있다. 전체 조직 엔지니어링 모듈 또는 그 특정 구성요소는 대체가능하고 교체가능한 것으로 생각될 수 있다. 조직 엔지니어링 모듈은 시스템 설정 및 임상 세팅에서의 동작을 단순화한 전용 무균 패키지로 제공될 수 있다.
본 발명의 조직 엔지니어링 모듈 및 장치는 다양한 크기, 모양 및 방위로 제조될 수 있다는 것을 당업자들은 이해할 수 있다. 이 디바이스는 수직 또는 수평 포맷으로 단일 조직 엔지니어링 모듈 또는 복수의 모듈을 통합하도록 제조될 수 있다. 따라서, 서브어셈블리는 조직 엔지니어링 장치에 대해 선택된 공간 포맷에 상응하도록 만들어질 수 있다. 이와 같이, 상이한 타입의 조직 엔지니어링은 각각의 조직 엔지니어링 순서가 개별적으로 자동적으로 모니터링되고 제어되는 단일 장치내에서 임의로 이루어질 수 있다. 또한, 리모트 컴퓨터의 제어하에 동작하고 네트워킹되는 복수의 자동화된 조직 엔지니어링 시스템을 갖는 것 역시 본 발명의 범위내에 있다.
본 발명의 바람직한 실시예가 상세하게 여기에 설명되어 있지만, 첨부된 청구항 또는 본 발명의 정신으로부터 벗어남 없이 변경이 이루어질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
발명의 개요
본 발명은 인간 및 수의학적 용도 둘 모두를 위한 다양한 임상적 및 연구 세팅에서 사용될 수 있는 세포 배양 및 조직 엔지니어링을 위한 사용하기 쉬운 자동화된 시스템에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "조직 엔지니어링"은 "조직 기능을 회복시키고 유지하며 개선시키기 위한 생물학적 대체물의 기본적인 이해 및 개발을 향한 엔지니어링 및 생명과학의 원리 및 방법의 응용"으로 정의될 수 있다. 이러한 정의는 생물학적 대체물이 생체적합성 재료로 형성된 기판 또는 스캐폴드 상에 이식되어 조직, 특히 이식가능한 조직 구성물을 형성할 수 있는 세포 또는 상이한 세포들의 조합물인 과정을 포함한다. 또한, 조직 엔지니어링 과정에 연루되는 세포는 자가, 동종 또는 이종 세포일 수 있다는 것을 알아야 한다.
본 발명의 조직 엔지니어링 시스템은 무균 작업 조건 하에서 모든 활동을 수행하도록 디자인된다. 본 시스템은 작업에 있어서 완전히 자동화된 휴대용의 다기능 시스템이며, 하기 중 하나 이상을 수행/제공한다:
- 조직 생검체의 무균 수용/보관;
- 분해 과정의 자동 모니터링;
- 생검 조직의 분해에 의한 분리 세포의 생성;
- 안전한 폐기물 수집을 포함하는 세포 분류 및 선택;
- 증식용 기판 또는 스캐폴드 상에서의, 또는 상기 기판 또는 스캐폴드 내에서의 세포 접종;
- 세포의 증식에 의한 세포 집단의 확장;
- 세포 세척 및 세포 수집;
- 조직 엔지니어링용 스캐폴드 또는 매트릭스 상에서의, 또는 상기 스캐폴드또는 매트릭스 내에서의 세포 접종;
- 세포의 분화에 의한 세포 활성의 특수화;
- 조직의 형성;
- 기계적 및/또는 생화학적 자극에 의한 조직 성숙의 촉진;
- 재건 성형 수술용의 조직 엔지니어링된 구성물/이식체의 수확; 및
- 이식가능한 조직의 보관 및 수송.
본 발명의 조직 엔지니어링 시스템은 원하거나 필요할 경우 상기 단계의 각각을 개별적으로, 순차적으로 또는 어떤 정해진 부분적 순서로 수행하도록 미리 프로그래밍될 수 있다. 또한, 상기 각 단계, 또는 임의의 그의 조합은 조직 엔지니어링 모듈의 하나 이상의 생물반응기 내에서 달성된다. 작동시에, 본 조직 엔지니어링 시스템은 미리 프로그래밍되고 자동 제어되며, 따라서 최소의 사용자 개입을 필요로 하고, 그 결과 오염의 위험성을 최분해하면서 세포 배양 및/또는 조직 엔지니어링 과정의 효율성 및 재현성은 향상시킨다. 본 발명의 조직 엔지니어링 시스템 및 그의 구성요소는 마이크로중력 및/또는 0의 중력 상태 하에서 작동가능한데, 여기서 이러한 시스템 및 구성요소는 우주 연구에 사용된다.
본 발명의 시스템은 일차 또는 전구 세포가 조직 이식체의 추가의 증식, 분화 및 생성을 위한 공여 조직으로부터 분리될 수 있도록 디자인된다. 대안적으로는, 세포주(cell line)는 단독으로 또는 다른 세포원과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 것은 자동화된 조직 엔지니어링 시스템인데, 본 시스템은 생리학적인 세포 기능과 세포원 및 조직원으로부터 유래되는 조직 구성물의 생성을돕는 하나 이상의 생물반응기를 지지하는 하우징을 포함한다. 하우징은 생물반응기와 유체연통하는 유체 봉쇄 시스템도 지지한다.
유체 봉쇄 시스템에 제공되는 유체의 생리학적 파라미터를 모니터링하는 센서가 하우징 및/또는 생물반응기와 결합되어 있다. 하우징 내에 배치된 마이크로프로세서는 생물반응기 및 유체 봉쇄 시스템에 연결되어 그의 기능을 제어하는 기능을 한다. 마이크로프로세서는 본 시스템 내의 환경 조건을 독립적으로 제어할 수도 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면 조직 분해, 증식용 기판 상에의 세포 접종, 세포 증식, 분화용 골격 상에의 세포 접종, 세포 분화, 및 조직 형성과 그 이후의 이식용 기능성 조직으로의 성숙에 대한 베이스를 제공하는 하나 이상의 생물반응기가 있는 휴대용의 무균 조직 엔지니어링 모듈을 포함하는 세포 및 조직 엔지니어링 시스템이 제공된다. 생물반응기는 재환류가 아닌 방식으로 시약을 송달하고 폐기액을 수집하기 위한 배지 유동 및 저장 시스템과 작동되도록 연결된다. 생물반응기 및/또는 배지 유동 시스템은 기체 생성물을 이동시킴으로써 배지중의 용해 기체의 수준을 제어하는, 반투과성 막을 이용하는 기체 교환 구성요소를 선택적으로 포함한다. 조직 엔지니어링 모듈은 세포 배양 또는 조직 엔지니어링 과정의 진행을 자동으로 모니터링하며, 생물반응기 내에서의 상이한 단계의 세포 배양 및 조직 발생의 요건을 충족시키는 환경 조건을 조정하는, 중앙 마이크로프로세서 제어 베이스 단위와 작동하도록 상호작용한다. 이상적인 조건으로부터의 일탈은 생물반응기 내에 존재하는 다양한 센서에 의해 감지되고, 생성되는 시그널은 중앙 마이크로프로세서에 의해 모니터링된다. 이와 같이 한정되는 것은 아니지만, pH, 온도 및 용해 기체와 같은 환경 조건의 변화는 자동으로 모니터링되며 필요할 경우 변경될 수 있다. 또한, 세포 증식 상태는 시간 함수로서 신진대사 턴오버의 탐지에 의해 간접적으로 평가된다(예를 들어, pH, 02, C02, 락트산 및 글루코스 소비량). 조직 엔지니어링 모듈 자체는 중앙 마이크로프로세서에 의한 프로세싱 조건의 제어에 더하여, 중앙 마이크로프로세서와 일치되어 작동하는 제 2의 기판상 마이크로프로세서를 선택적으로 포함할 수 있다. 조직 엔지니어링 모듈 마이크로프로세서는 직접적으로 기판상에서 조직 엔지니어링 모듈의 특정 기능을 수햄함으로써 조직 엔지니어링 시스템의 데이터 프로세싱 능력을 확장시킴으로써 중앙 마이크로프로세서에 대한 요구를 최분해한다.
다양한 성장인자, 사이토카인, 실험제제, 약, 화학물질, 배양 유체 및 그의 임의의 조합이 조직 엔지니어링 모듈 상에 위치한 임의의 저장기 내에 로딩 및 보관되며, 미리 프로그래밍된 순서에 따라서 또는 발생중인 조직 이식체가 필요로 할 경우 하나 이상의 생물반응기로 자동으로 이동될 수 있다. 개개의 조직 엔지니어링 모듈은 생물반응기 내에 존재하는 조직 엔지니어링된 구성물의 무균성을 양보함이 없이 수송 시스템으로부터 분리가능하다. 이러한 분리는 조직 엔지니어링 시스템 내에 존재하는 임의의 다른 모듈의 프로세싱에 영향을 주지 않는다. 또한, 조직 엔지니어링 모듈은 조직 엔지니어링 순서의 완료 이후에 폐기가능한 것으로 간주될 수 있는데, 이는 이러한 실행이 이전의 사용에 의해 생기는 오염을 방지하기때문이다.
본 발명의 다양한 실시 형태에 있어서, 본 장치 및 시스템은 외과적 생검체에 의해 얻어진 조직의 분해에 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 세포를 여과하고 특정 집단을 선택하고 분리할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 분해된 세포는 세포 집단의 확장을 위하여 증식시킬 수 있다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 세포는 원하는 스캐폴드 또는 기판(매트릭스로도 칭해짐) 상에 접종하여 배양할 수 있다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 세포는 적합한 조직이 형성될 때까지 원하는 스캐폴드 또는 기판 상에서 및/또는 원하는 스캐폴드 또는 기판 전체에 걸쳐서 분화될 수 있다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 조직은 조직 성숙을 촉진하기 위하여 자극될 수 있다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 재건수술에 적합한 조직 이식체가 생성된다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 세포 샘플링은 배양 자체에 대한 악영향 없이 무균 방식으로 세포 증식 및 발생 진행의 각 단계에서 행해질 수 있다. 전술한 실시 형태 각각은 필요할 경우 단독으로 또는 순차적으로 행해질 수 있다. 이러한 프로세싱 사건의 추적은, 중앙 마이크로프로세서 및/또는 품질제어 기록으로의 편입을 위한 모듈 기반의 마이크로프로세서에 의해 수행될 수 있다.
하나의 측면에 있어서 본 조직 엔지니어링 시스템에서는 생물학적 성능의 향상을 위하여 합성 생체적합재료 화합물인, 본 출원인의 미국특허 제6,323,146호(상기 특허의 내용은 본 명세서에 참고로 인용됨)에 기술되어 있는 SkeliteTM이 선택적으로 이용된다. 간단히 말해, SkeliteTM은 칼슘, 산소 및 인을 포함하는 분리된 생체 재흡수성 생체적합재료 화합물인데, 일부 상기 원소 중 하나 이상은 이온반경이 대략 0.1 내지 0.6옹스트롬인 원소로 치환된다. 한 실시 형태에 있어서 SkeliteTM은 생물반응기의 벽 상의 코팅으로, 증식용 기판 상의 박막으로, 또는 3차원의, 따라서 큰 표면적의 증식용 스캐폴드로서의 사용을 통하여 세포의 증식을 향상시키는 데에 사용될 수 있다. 증식 단계에서의 SkeliteTM의 사용은
- 증식 속도를 증가시키며;
- 증식 단계 이후의 세포 생성을 증가시키며;
- 표적 세포 생성에 필요한 표면적을 감소시키며;
- 증식 동안 문제시되는 세포 표현형의 탈분화 경향을 감소시키며;
- 성장인자의 증식용 기판에의 결합을 향상시킬 수 있다.
추가의 실시 형태에 있어서 SkeliteTM은 세포의 분화 및 그 이후의 조직 구성물의 형성의 향상을 위한 재흡수성 스캐폴드로 사용될 수 있다. 분화 단계에서의 SkeliteTM의 사용은
-분화 단계의 신뢰성의 개선에 의해 생산성을 증가시키며;
- 조직 구성물의 온전성, 따라서 생물학적 생존성을 증가시키며;
- 다양한 골격 포맷에 기초하여 구성물의 구조에서의 융통성을 가능하게 하며;
- 공동의 기판 상에서 증식, 분화 및 조직 형성 단계가 일어나게 하며;
- 성장인자의 분화용 골격에의 결합을 향상시키며;
- 외과적 이식 동안의 조직 구성물 취급성을 개선시킬 수 있다.
다른 측면에 있어서 본 발명은 환자로부터 유래되는 일차 또는 전구 세포의 자동화된 단계의 분해, 증식, 접종 및 분화를 통하여 조직 구성물의 제조를 위한 방법 및 시스템을 제공하여 면역학적 쟁점 및 질환 전염 쟁점을 제거한다. 이식체는 연골세포, 간질세포(stromal cell), 골아세포, 신경세포, 상피세포, 줄기세포, 및 그의 혼합물을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 다양한 세포 형태의 제어된 배양으로부터 형성시킬 수 있다.
본 발명의 시스템에는 한 실시 형태에 있어서 하나 이상의 생물반응기, 배지 저장기 및 유체/배지 유동 시스템을 지원하는 하나 이상의 분리가능하며 휴대용이고 독립적으로 작동가능한 조직 엔지니어링 모듈이 통합되어 있다. 각각의 모듈, 따라서 생물반응기(들)은 중앙 마이크로프로세서의 자동 제어 하에 있다. 모듈 및 관련된 생물반응기(들)은 그에 한정되는 것은 아니지만 하기와 같은 다양한 특수 용도를 위하여 구성될 수 있다:
- 조직 생검체의 무균 수용/보관;
- 분해 시약의 자동 혼합 및 송달;
- 분해 과정의 자동 모니터링;
- 분리 세포의 생성을 위한 생검체 조직의 분해;
- 안전한 폐기물 수집을 포함하는 세포 분류 및 선택;
- 세포 세척 및 세포 수집;
- 증식용 기판 또는 스캐폴드 상에서의, 또는 상기 기판 또는 스캐폴드 내에서의 세포 접종;
- 증식 시약의 자동 혼합 및 송달;
- 세포 집단의 확장을 위한 세포의 증식;
- 합류의 탐지를 포함하는 세포 상태의 자동 모니터링;
- 증식용 기판 또는 골격으로부터의 제어된 세포 방출;
- 세포수의 증가를 위한 선택된 표면적 크기 상에서의 반복된 증식 단계;
- 하나 이상의 조직 엔지니어링용 스캐폴드 또는 매트릭스를 향한 세포 집단의 전달;
- 조직 엔지니어링용 스캐폴드 또는 매트릭스 상에서의, 또는 상기 골격 또는 매트릭스 내에서의 세포 접종;
- 분화 시약의 자동 혼합 및 송달;
- 세포/조직 배양 조건의 자동 모니터링;
- 세포 활성이 특수화되게 하기 위한 세포 분화;
- 조직 형성;
- 조직 성숙의 촉진을 위한 기계적 및/또는 생화학적 자극;
- 재건수술을 위한 조직 엔지니어링된 구성물/이식체의 수확; 및
- 세포 및/또는 이식가능한 조직의 보관 및 수송.
2개 이상의 생물반응기가 직접적으로 본 시스템의 하우징 내에 지지되거나 하우징 내로 삽입가능한 조직 엔지니어링 모듈 상에 지지된 시스템 내에 제공될 경우, 생물반응기에는 연속적으로 연결되며 개별적으로 작동가능하며 마이크로프로세서에 의해 제어될 수 있거나 대안적으로는 사용자의 마이크로프로세서의 프로그래밍 및 원하는 성취 결과에 따라 독립적으로 작동 및 제어될 수 있다. 또한 2개 이상의 생물반응기가 시스템 내에 제공될 경우 생물반응기 및 내부 챔버는 생물반응기로부터 생물반응기로 세포 및/또는 조직이 교환되도록 연결될 수 있다.
본 생물반응기는 필요할 경우 다양한 크기 및 구조로 제조되어 다양한 갯수 및 크기의 증식 및 분화용 스캐폴드 또는 기판을 지지할 수 있다. 본 생물반응기는 조직 엔지니어링 모듈의 구조적 구성요소의 일부로 통합될 수 있다. 택일적으로는, 본 생물반응기는 조직 엔지니어링 모듈의 나머지 구성요소에 대하여 별개의 구성요소로 탈착가능할 수 있다. 본 생물반응기는 별개의 구성요소로 존재할 경우 무균 포장재에 개별적으로 포장되어 사용시에 무균접근기술을 사용하여 조직 엔지니어링 모듈에 결합될 수 있다. 또한, 새롭게 형성된 이식가능한 조직 구성물의 회수를 위하여, 제조시 작업실로의 용이한 수송을 위하여 조직 엔지니어링 과정의 완료시 무균접근기술에 의해 생물반응기는 모듈로부터 분리될 수 있게 된다.
본 생물반응기 및/또는 조직 엔지니어링 모듈은 제어 작동기를 통하여 전체 조직 엔지니어링 시스템 내에서 회전 또는 교반될 수 있다. 회전은 중력의 유익한 사용에 의해 침전에 기초한 세포 접종 및 생물반응기 내에서의 유체 교환과 같은 특정의 생물프로세싱 순서가 가능해지도록 할 수 있다.
본 조직 엔지니어링 모듈은 바코드로 될 수 있거나, 임상 또는 실험 환경의 일부로서 조직 엔지니어링 시스템 내에서, 그리고 외부적으로 신속 정확한 추적을위한 메모리칩이 제공될 수 있다. 조직 엔지니어링 장치 내에 통합된 이러한 추적 기술도 환자기록용의 클리닉-기초 정보 시스템을 통한 전자 추적을 가능하게 한다. 이는 조직 엔지니어링 모듈, 따라서 관련 세포 또는 조직 이식체가 적당하게 코드화되어 정확한 환자의 관리를 보증하며, 이 과정이 병원비 청구 목적으로 기록되는 것을 보증한다. 본 모듈 및/또는 생물반응기에는 유사한 방식으로 신속 정확한 환자 및 샘플 추적을 위하여 바코드 및/또는 메모리칩도 이용될 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 것은
- 하우징;
- 상기 하우징에 의해 지지되며, 생리학적 세포 기능 및/또는 세포 및/또는 조직원으로부터 유래되는 하나 이상의 조직 구성물의 생성을 돕는 하나 이상의 생물반응기;
- 상기 하우징에 의해 지지되며 상기 생물반응기와 유체연통하는 유체 봉쇄 시스템;
- 상기 생리학적 세포 기능 및/또는 조직 구성물의 생성과 관련된 파라미터의 모니터링을 위한 상기 하우징, 생물반응기 또는 유체 봉쇄 시스템 중 하나 이상과 결부된 하나 이상의 센서; 및
- 상기 센서 중 하나 이상에 연결된 마이크로프로세서
를 포함하는 자동화된 조직 엔지니어링 시스템이다.
본 발명의 다른 측면에 따른 것은
- 하우징;
- 상기 하우징 내에 분리가능하게 수용되며 생리학적 세포 기능 및/또는 세포 및/또는 조직원으로부터 유래되는 하나 이상의 조직 구성물의 생성을 돕는 하나 이상의 생물반응기, 상기 생물반응기와 유체연통하는 유체 봉쇄 시스템, 및 상기 세포 배양 및/또는 조직 엔지니어링 기능과 관련된 파라미터의 모니터링을 위한 하나 이상의 센서를 고정하는 지지 구조체를 포함하는 하나 이상의 조직 엔지니어링 모듈; 및
- 상기 하우징 내에 배치되며 상기 조직 엔지니어링 모듈에 결합되며 상기 조직 엔지니어링 모듈의 작동을 제어하는 마이크로프로세서
를 포함하는 자동화된 조직 엔지니어링 시스템이다.
본 발명의 추가의 측면에 따른 것은
- 세포 배양 및 조직 엔지니어링 기능을 돕는 하나 이상의 생물반응기를 고정하는 구조적 지지체;
- 상기 생물반응기와 유체연통하는 유체 봉쇄 시스템; 및
- 상기 세포 배양 및 조직 엔지니어링 기능과 관련된 파라미터의 모니터링을 위한 하나 이상의 센서
를 포함하는 휴대용의 무균가능한 조직 엔지니어링 모듈이다.
본 실시 형태의 측면에 있어서 생물반응기는 배지 유동을 위한 하나 이상의 유입구 및 하나 이상의 유출구가 있는 생물반응기 하우징, 및 세포 및/또는 조직을 수용하고 상기 세포 배양 및 조직 엔지니어링 기능을 돕기 위한 상기 생물반응기 하우징 내에 한정된 하나 이상의 챔버를 포함한다. 챔버는 세포 배양/증식 챔버,세포 분화/조직 형성 챔버, 조직 분해 챔버 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또, 챔버는 하나 이상의 기판 및/또는 스캐폴드를 수용한다. 본 발명의 실시 형태에 있어서 2개 이상의 챔버가 생물반응기 내에서 작동가능하게 연결되어 제공될 수 있으며 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로는 2개 이상의 생물반응기는 독립적으로 작동가능하거나 함께 작동되도록 작동가능할 수 있다. 또다른 측면에 있어서 챔버 및/또는 생물반응기는 작동가능하게 연결되어 유체, 세포 및/또는 조직의 챔버 및/또는 생물반응기 사이에서의 교환을 제공한다. 본 발명에서 사용하기 위한 스캐폴드는 다공성 스캐폴드, 구배 다공도를 가지는 다공성 스캐폴드, 다공성 망상 스캐폴드, 섬유질 스캐폴드, 막으로 둘러싸인 스캐폴드 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 챔버는 또한 구역으로 더 세분될 수 있다. 예를 들어 분화/조직 형성 챔버에는 복수개의 구역이 제공되어 몇개의 스캐폴드를 포함할 수 있다. 깔때기 또는 유사한 경로가 생물반응기 내의 챔버들 사이에 제공될 수 있다. 또한 하나 이상의 필터가 생물반응기 내의 임의의 위치에 제공될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에 따른 것은 조직 생검체의 보관, 조직 생검체의 분해, 세포 분류, 세포 세척, 세포 농축, 세포 접종, 세포 증식, 세포 분화, 세포 보관, 세포 수송, 조직 형성, 이식체 형성, 이식가능한 조직의 보관, 이식가능한 조직의 수송 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 및/또는 조직 엔지니어링 기능을 위한 환경을 제공하는 생물반응기이다.
본 발명의 또다른 측면에 따른 것은 세포 기능 및 이식가능한 조직 구성물의생성을 도우며 지지하기 위한 생물반응기로서, 본 생물반응기는
-생물반응기 하우징;
- 배지 유동을 위한 하나 이상의 유입구 및 하나 이상의 유출구;
- 세포 기능 및/또는 세포 및/또는 조직원으로부터 유래되는 하나 이상의 구성물의 생성을 도우며 지지하기 위한 상기 생물반응기 하우징 내에 한정된 하나 이상의 챔버; 및
- 상기 세포 기능 및/또는 조직 구성물의 생성에 관련된 파라미터를 모니터링하기 위한 상기 하나 이상의 챔버 내의 하나 이상의 센서
를 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 있어서, 생물반응기 하우징은 뚜껑을 포함하는데, 뚜껑은 탈착가능한 뚜껑일 수 있거나, 생물반응기 하우징과 일체화될 수 있다.
세포 및 조직은 뼈, 연골, 관련된 뼈 및 연골의 전구체 세포 및 그의 조합으로부터 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로는 본 발명의 생물반응기, 모듈 및 시스템에서 사용하기에 적합한 세포는 배아 줄기세포, 성숙 줄기세포, 골아세포, 전-골아세포, 연골세포, 수핵세포, 전-연골세포, 뼈로부터 유래된 골격 전구 세포, 줄기세포를 포함하는 골수 또는 혈구, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되지만 그에 한정되는 것은 아니다. 세포 또는 조직은 본 발명의 세포 배양 및 조직 엔지니어링 기능에 의해 형성되는, 이식체의 수용체에 대하여 자가 이식성, 동종 이식성 또는 이종 이식성인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 것은 본 발명의 생물반응기 내에서 생성되는 조직 이식체이다.
본 발명의 또다른 측면에 따른 것은 본 발명의 조직 엔지니어링 시스템에 의해 생성되는 조직 이식체이다.
본 발명의 다른 측면에 따른 것은 골 외상의 회복을 위한 조직 엔지니어링된 이식가능한 구성물인데, 여기서 이식체는 활성 골 세포 및 조직 엔지니어링된 광물화 매트릭스와 조합된 뼈 생체적합재료의 다공성 골격을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따른 것은
- 광물질 기제 스캐폴드가 없는 조직 엔지니어링된 연골을 포함하는 연골 구역;
- 다공성 스캐폴드를 포함하는 뼈 생체적합재료 구역; 및
- 상기 연골 구역과 상기 뼈 생체적합재료 구역 사이의 경계면 구역
을 포함하는 조직 엔지니어링된 이식체이다.
연골 구역은 숙주 연골과의 측면 통합을 촉진하는 반면, 뼈 생체적합재료 구역은 생체내에 이식될 경우 연골하 골판(bone plate)과의 측면 및 수직 통합을 촉진한다. 경계면 구역은 연골 구역과 뼈 생체적합채료 구역 사이의 구조적 통합을 제공한다. 연골 구역에는 조직 엔지니어링된 연골의 형성을 도우며, 이식 부위에 존재하는 특정의 해부학적 특징을 유지하는데 있어서 구체적 형상의 표면 프로필을 발생시키는 제 2의 비-광물질 스캐폴드가 추가로 편입될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 것은 조직 생검체의 분해 방법인데, 본 방법은
- 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기(상기 생물반응기에는 생물반응기 내의 생리학적 상태를 마이크로프로세서가 탐지하게 하기 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 조직 생검체를 로딩하는 단계;
- 조직 분해 효소를 제공하는 단계; 및
- 원하는 조직 분해 수준을 위한 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 분해 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따른 것은 세포의 증식 방법인데, 본 방법은
- 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기(상기 생물반응기에는 생물반응기 내의 생리학적 상태를 마이크로프로세서가 탐지하게 하기 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 증식용 기판 또는 스캐폴드 상으로 세포를 접종하는 단계; 및
- 원하는 세포 증식 수준을 위한 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 배양 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따른 것은 세포의 분화 방법인데, 본 방법은
- 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기(상기 생물반응기에는 생물반응기 내의 생리학적 상태를 마이크로프로세서가 탐지하게 하기 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 분화용 기판 또는 스캐폴드 상으로 세포를 접종하는 단계; 및
- 원하는 세포 분화 수준을 위한 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 배양 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따른 것은 조직 생검체를 분해하여 줄기세포와 같은 전구 세포를 포함하는 일차 세포를 제공하고, 이어서 이 세포를 증식 및 분화시켜 조직 이식체가 형성될 수 있게 하는 방법인데, 본 방법은
- 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기(상기 생물반응기에는 생물반응기 내의 생리학적 상태를 마이크로프로세서가 탐지 및 중계하게 하기 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 조직 생검체를 로딩하는 단계;
- 조직 분해 효소를 제공하는 단계;
- 분리 세포를 수득하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 분해 조건을 모니터링 및 유지하는 단계;
- 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기(상기 생물반응기에는 생물반응기 내의 생리학적 상태를 마이크로프로세서가 탐지하게 하기 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 증식용 기판 또는 스캐폴드 상으로 분리된 세포를 접종하는 단계; 및
- 원하는 세포 증식 및 확장 수준을 수득하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 배양 조건을 모니터링 및 유지하는 단계;
- 확장된 세포를 증식용 기판 또는 스캐폴드로부터 방출시키는 단계;
- 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기(상기 생물반응기에는 생물반응기 내의 생리학적 상태를 마이크로프로세서가 탐지 및 중계하게 하기 위한하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 분화용 기판 또는 스캐폴드 상으로 확장된 세포를 접종하는 단계; 및
- 조직 이식체를 수득하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 분해 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따른 것은 골격 이식체의 제공 방법인데, 본 방법은
- 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기(상기 생물반응기에는 생물반응기 내의 생리학적 상태를 마이크로프로세서가 탐지하게 하기 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 뼈 생체적합재료의 다공성 스캐폴드 상에 골형성 및/또는 골 선조 세포를 접종하는 단계; 및
- 스캐폴드 전체에 걸쳐 골 형성 및/또는 골 선조 세포가 증식 및/또는 분화되게 하여 정형외과적 용도의 조직 이식체를 제공하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 것은 연골 이식체의 제공 방법인데, 본 방법은
- 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기(상기 생물반응기에는 생물반응기 내의 생리학적 상태를 마이크로프로세서가 탐지하게 하기 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 생체적합재료의 다공성 스캐폴드 상에 연골 형성 및/또는 연골 선조 세포를 접종하는 단계; 및
- 스캐폴드 전체에 걸쳐 연골 형성 및/또는 연골 선조 세포가 증식 및/또는 분화되게 하여 연골 이식체를 제공하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 또다른 측면에 따른 것은 세포의 세척 방법인데, 본 방법은
- 하나 이상의 원하지 않는 화학 물질을 포함하는 세포 현탁물을 챔버 내로 로딩하는 단계;
- 상기 세포에 대해서는 불투과성이지만 상기 원하지 않는 화학 물질에 대해서는 투과성인 막을 포함하는 교차-유동 여과 모듈을 통하여 챔버로부터의 세포 현탁물을 연속적으로 재순환시켜 세척된 세포 현탁물을 제공하는 단계; 및
- 세척된 세포 현탁물을 수집하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 또다른 측면에 따른 것은 세포의 부화(enrichment) 방법인데, 본 방법은
- 과도한 부피의 세포 현탁물을 포함하는 세포 현탁물을 챔버 내로 로딩하는 단계; 및
- 세포에 대해서는 불투과성이지만 과도한 부피의 세포 현탁물은 제거 및 수집되게 하는 막을 포함하는 교차-유동하는 여과 모듈을 통하여 챔버로부터의 세포 현탁물을 연속적으로 재순환시키는 단계
를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 것은 추간판의 내핵을 재확립하기 위한 이식체의 제공 방법인데, 본 방법은
- 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기(상기 생물반응기에는 생물반응기 내의 생리학적 상태를 마이크로프로세서가 탐지하게 하기 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 생체적합재료의 다공성 스캐폴드내에 수핵 세포를 접종하는 단계; 및
- 수핵 세포가 증식 및/또는 분화되게 하고 수핵 세포의 특징적인 세포외 매트릭스 구성요소가 발현되게 하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 것은 임상 조직 엔지니어링에서 사용하기 위한 품질 평가용 샘플의 제조 방법인데, 본 방법은
- 본 명세서에 기술된 본 발명의 시스템을 사용하여 일차 및 이차 이식체를 유사하게 제조하는 단계(여기서, 일차 이식체는 이식용이며 하나 이상의 이차 이식체는 일차 이식체의 직경을 추정하기 위한 시험 목적용임)
를 포함한다.
다양한 실시 형태의 본 발명의 조직 엔지니어링 시스템은 사용자가 생물반응기 내의 특정 환경 유형(또는 환경의 결과), 예를 들어 조직 분해, 세포 증식, 세포 분화 및/또는 세포 구성물 형성을 선택할 수 있게 하기 위하여 미리 프로그래밍될 수 있는 하나 이상의 마이크로프로세서의 제어 하에 있다. 이는 작동자의 간섭을 배제하며 우연한 오염의 가능성을 감소시킨다.
본 발명의 조직 엔지니어링 시스템은 "키트"로 제공될 수 있다. 이러한 방식으로 본 장치, 조직 엔지니어링 모듈(들), 생물반응기(들) 및 그의 다양한 구성요소는 사용 설명서 및 품질 제어 기술과 함께 포장 및 시판될 수 있다.
본 발명의 시스템은 병원에서의 임상 사용, 특히 외상 및/또는 질환으로 인하여 조직 엔지니어링된 이식체가 요망되는 외과적 세팅에 이상적이다. 본 발명의 시스템을 사용하여 조직 엔지니어링된 이식가능한 구성물을 환자 생검체를 통하여 수득된 자가 조직, 동종 세포 또는 이종 세포로부터 안전하게 제조할 수 있다. 이러한 조직 엔지니어링된 이식가능한 구성물의 상세한 사항은 이식 부위의 유형, 크기 및 상태에 매치될 수 있다. 또한 본 발명의 시스템에 의해 생성되는 이식체는 숙주와의 통합을 촉진함으로써 환자 회복을 개선시키는 활성 세포를 포함한다.
실제, 자가 세포 모델을 사용하면 조직 생검체는 환자로부터 수득되며 작업실 내에 존재하는 동안 조직 엔지니어링 모듈 상에 존재하는 생물반응기 내에 직접 둘 수 있다. 특정의 생물반응기 디자인이 요망되는 조직 구성물의 유형 및 크기에 따라 선택된다. 조직 엔지니어링 과정의 완료시 생성된 조직 구성물은 무균 생물반응기에 여전히 담겨져서 환자에게 다시 이식하기 위한 작업실로 수송될 수 있다. 본 시스템은 안전하며 치료적으로 유효한 방식으로 "맞춤형" 자가 조직 이식체를 제공하는 데에 이상적이다.
본 발명의 시스템 및 방법은 자동화 세포 배양 기술을 제공하는 데에 한정되지는 않는다. 기술한 조직 엔지니어링 시스템은 세포치료법에서 사용되는 세포 확장을 훨씬 뛰어넘는다. 본 조직 엔지니어링 시스템을 사용하여 존재하는 세포가 활성을 가지며 분화되어 있으며 이미 세포외 매트릭스를 발현하고 있는 기능성 조직 구성물을 생성할 수 있다. 결과적으로 이렇게 생성된 조직 구성물은 고도의 발달 상태로 존재하며 그럼으로써 이식 부위에서의 조직 복구의 속도를 가속화하고 상기 복구의 품질을 개선한다.
본 발명의 시스템은 약리학적 연구에도 적합하다. 구체적으로는 본 시스템은 약물 개발 분야에서 그 용도를 찾을 수 있다. 새로운 잠재적 약물 및 분자가 세포 및 조직 상에서 시험되어 세포적 사건 및 조직 발생에 대한 영향을 결정할 수 있다. 이러한 시험은 환자 자신의 세포/조직에서 행하여져 투여 이전에 불리한 부작용을 평가 및 가능하게는 회피할 수 있다. 대안적으로는 특수 세포주 또는 조직을 약물 발견 과정에서 주요 도구로서 시스템과 함게 사용할 수 있다. 본 시스템을 프로그래밍하여 생물반응기 내에 존재하는 세포/조직의 다양한 생리학적 조건을 모니터링 및 평가하고 따라서 선택된 약물 또는 분자의 생물학적 효과를 신속하게 표시할 수 있다.
본 시스템은 종래의 조직 엔지니어링 기술의 사용 및 실행이 어려운 연구 개발 연구, 및/또는 광범하 진단 기록을 필요로 하는 상태에서 또한 사용될 수 있다. 예를 들어 조직 엔지니어링을 포함하는 마이크로중력 연구는 이 환경의 독특한 특성으로 인하여 수행하기가 어렵다. 전통적인 세포 및 조직 배양 기술은 간단하게는 유체 봉쇄 쟁점 및 중력에 기초한 세포의 수송의 부재로 인하여 상기 환경에서 실행가능하지 않다. 본 발명의 시스템 및 방법은 본 시스템이 완전히 실링되어 유체 손실을 방지하며 조직 엔지니어링 과정의 일부로서의 세포 이동은 유체 유동 제어에 의해 성취될 수 있기 때문에 마이크로중력 환경에 용이하게 적응가능하다.
본 발명의 다른 특징 및 이점이 하기 발명의 상세한 설명, 실시예 및 도면으로부터 명백해질 것이다. 그러나 발명의 상세한 설명, 구체예 및 도면은 본 발명의 실시 형태를 나타내지만 단지 예시를 위하여 주어진 것이라는 것을 알아야 하는데, 이는 본 발명의 취지 및 범주 내에서의 다양한 변화 및 변경이 발명의 상세한 설명으로부터 당 분야의 숙련자에게 명백해질 것이기 때문이다.

Claims (138)

  1. - 하우징;
    - 상기 하우징에 의해 지지되며, 생리학적 세포 기능 및/또는 세포 및/또는 조직원으로부터 유래되는 하나 이상의 조직 구성물의 생성을 돕는 하나 이상의 생물반응기;
    - 상기 하우징에 의해 지지되며 상기 생물반응기와 유체 연통하는 유체 봉쇄 시스템;
    - 상기 생리학적 세포 기능 및/또는 조직 구성물의 생성과 관련된 파라미터의 모니터링을 위한 상기 하우징, 생물반응기 또는 유체 봉쇄 시스템 중 하나 이상과 결부된 하나 이상의 센서; 및
    - 상기 센서 중 하나 이상에 연결된 마이크로프로세서
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화된 조직 엔지니어링 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물반응기가
    - 생물반응기 하우징;
    - 배지 유동을 위한 하나 이상의 유입구 및 하나 이상의 유출구; 및
    - 다양한 세포 및/또는 조직을 수용하기 위한 상기 생물반응기 하우징 내에 한정된 하나 이상의 챔버
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 상기 생물반응기 하우징이 뚜껑을 포함하며, 상기 하나 이상의 유입구 및 유출구가 상기 생물반응기 하우징 및/또는 상기 뚜껑 내에 제공되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 챔버가 조직 분해 챔버, 배양/증식 챔버, 분화/조직 형성 챔버 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 챔버가 상기 생물반응기 내에서 작동되도록 연결되어 제공된 것을 특징으로 하는 시스템.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 챔버가 하나 이상의 기판 및/또는 스캐폴드를 수용하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  7. 제6항에 있어서, 상기 스캐폴드가 다공성 스캐폴드, 구배적 다공도를 가지는 다공성 스캐폴드, 다공성 망상 스캐폴드, 섬유질 스캐폴드, 막으로 둘러싸인 스캐폴드 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 스캐폴드가 천연 바이오세라믹, 합성 바이오세라믹,천연 생중합체, 합성 생중합체, 이식가능한 바이오세라믹, 이식가능한 생중합체 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 상기 물질이 칼슘, 산소 및 인을 포함하는 분리된 생체 흡수성 생체적합재료 화합물이며, 일부 상기 원소 중 하나 이상은 이온 반경이 대략 0.1 내지 0.6 옹스트롬인 원소로 치환되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  10. 제6항에 있어서, 상기 기판이 완비형 마이크로-캐리어의 현탁물인 것을 특징으로 하는 시스템.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 챔버가 복수개의 구역을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 상기 복수개의 구역에 스캐폴드 및/또는 기판이 각각 설비될 수 있는 것을 특징으로 하는 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 생물반응기가 작동되도록 연결된 것을 특징으로 하는 시스템.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 챔버 및/또는생물반응기가 독립적으로 작동가능하며/하거나 함께 작동되도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 시스템.
  15. 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 챔버 및/또는 상기 생물반응기 사이에서의 유체, 세포 및/또는 조직의 교환을 위하여 상기 챔버 및/또는 생물반응기가 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 챔버 및/또는 생물반응기가 경로, 배관, 커넥터, 밸브, 펌프, 필터, 유체 액세스 포트, 직렬식 기체교환막, 직렬식 센서 및/또는 분리 벽의 공극을 통하여 연결된 것을 특징으로 하는 시스템.
  17. 제2항에 있어서, 상기 생물반응기가 상기 챔버 중 하나 이상에 작동되도록 연결된 샘플링 포트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유입구 및 상기 유출구를 통하여 상기 유체 봉쇄 시스템이 상기 생물반응기에 제거가능하게 설비된 것을 특징으로 하는 시스템.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물반응기 및 상기 유체 봉쇄 시스템이 상기 하우징에 고정된 구조적 지지체에 사용될 수 있도록 부착된 것을 특징으로 하는 시스템.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물반응기 및 상기 유체 봉쇄 시스템이 상기 하우징 내에 분리가능하게 설비된 구조적 지지체에 사용될 수 있도록 부착된 것을 특징으로 하는 시스템.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유체 봉쇄 시스템이 상기 생물반응기 및 유체 봉쇄 시스템과 작동가능하게 연결된 하나 이상의 유동 제어 밸브 및 하나 이상의 펌프 단위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 생물반응기에서 상이한 측면의 조직 엔지니어링을 돕고 모니터링하며 제어하도록 프로그래밍된 추가의 마이크로프로세서 및/또는 로직 제어기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물반응기가 조직 생검체의 보관, 조직 생검체의 분해, 세포 분류, 세포 세척, 세포 농축, 세포 접종, 세포 증식, 세포 분화, 세포 보관, 세포 수송, 조직 형성, 이식체 형성, 이식가능한 조직의 보관, 이식 가능한 조직의 수송 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 생리학적 세포 기능 및/또는 조직 구성물의 생성을 위한 환경을 제공하는 것을특징으로 하는 시스템.
  24. 제22항에 있어서, 상기 세포 및 조직이 뼈, 연골, 관련 뼈 및 연골 전구 세포 및 그의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  25. 제22항에 있어서, 상기 세포가 배아 줄기 세포, 성숙 줄기 세포, 골아세포, 전-골아세포, 연골 세포, 전-연골 세포, 수핵 세포, 골격 세포, 뼈로부터 유래된 골격 전구 세포, 줄기 세포를 포함하는 골수 또는 혈구, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 휴대용인 것을 특징으로 하는 시스템.
  27. - 하우징;
    - 상기 하우징 내에 제거가능하게 수용되며 세포 배양 및/또는 조직 엔지니어링 기능을 돕는 하나 이상의 생물반응기, 상기 생물반응기와 유체 연통하는 유체 봉쇄 시스템, 및 상기 세포 배양 및/또는 조직 엔지니어링 기능과 관련된 파라미터의 모니터링을 위한 하나 이상의 센서를 유지하는 지지 구조체를 포함하는 하나 이상의 조직 엔지니어링 모듈; 및
    - 상기 하우징 내에 배치되며 상기 조직 엔지니어링 모듈에 연결되며 상기조직 엔지니어링 모듈의 작동을 제어하는 마이크로프로세서
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 자동화된 조직 엔지니어링 시스템.
  28. 제27항에 있어서, 상기 생물반응기가
    - 배지 유동을 위한 하나 이상의 유입구 및 하나 이상의 유출구가 있는 생물반응기 하우징; 및
    - 세포 및/또는 조직을 수용하고 상기 세포 배양 및 조직 엔지니어링 기능을 돕기 위한 상기 생물반응기 하우징 내에 한정된 하나 이상의 챔버
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  29. 제28항에 있어서, 상기 챔버가 조직 분해 챔버, 배양/증식 챔버, 분화/조직 형성 챔버 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  30. 제29항에 있어서, 상기 챔버가 하나 이상의 기판 및/또는 스캐폴드를 수용하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 챔버가 생물반응기 내에서 작동가능하게 연결되어 제공된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 생물반응기가 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 2개 이상의 챔버 및/또는 생물반응기가 독립적으로 작동가능하고/하거나 함께 작동되도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  34. 제27항에 있어서, 상기 생물반응기가 분리 가능한 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 챔버 및/또는 생물반응기가 작동가능하게 연결되어 유체, 세포 및/또는 조직이 챔버 및/또는 생물반응기 사이에서 교환되게 하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  36. 제30항에 있어서, 상기 스캐폴드가 다공성 스캐폴드, 구배적 다공도를 가지는 다공성 스캐폴드, 다공성 망상 스캐폴드, 섬유질 스캐폴드, 막으로 둘러싸인 스캐폴드 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 상기 챔버가 복수개의 기판 및/또는 스캐폴드를 포함하기 위한 복수개의 구역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  38. 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물반응기가 조직 생검체의 보관, 조직 생검체의 분해, 세포 분류, 세포 세척, 세포 농축, 세포 접종, 세포 증식, 세포 분화, 세포 보관, 세포 수송, 조직 형성, 이식체 형성, 이식가능한 조직의 보관, 이식 가능한 조직의 수송 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 및/또는 조직 엔지니어링 기능을 위한 환경을 제공하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  39. 제38항에 있어서, 상기 조직 엔지니어링 모듈에는 상기 유체 봉쇄 시스템과 연결된 유동 제어 밸브가 있으며 상기 조직 엔지니어링 모듈은 상기 하우징 내에 제공된 하나 이상의 밸브 작동기, 펌프 단위 및 커넥터와 사용될 수 있도록 맞물릴 수 있는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 상기 커넥터가 상기 하우징 내에 제공된 전자 백플레인을 통하여 상기 조직 엔지니어링 모듈과 상기 마이크로프로세서 사이를 전기적으로 연결하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  41. 제27항에 있어서, 상기 유체 봉쇄 시스템이 상기 생물반응기로, 그리고 상기생물반응기로부터 유체를 공급 및 회수하기 위한 가요성 배관에 의해 연결된 복수개의 가요성 저장기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  42. 제27항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하우징이 하나 이상의 상기 하우징, 조직 엔지니어링 모듈, 생물반응기, 유체 봉쇄 시스템, 및/또는 상기 가요성 저장기 내의 상기 환경 상태를 유지하기 위한 하나 이상의 환경 센서 및 환경 제어 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  43. 제42항에 있어서, 상기 생물반응기 내의 환경 조건이 상기 유체 봉쇄 시스템과는 독립적으로 유지되는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  44. 제42항에 있어서, 하나 이상의 가요성 저장기 내의 상기 환경 상태가 상기 유체 봉쇄 시스템 내에서 독립적으로 유지되는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  45. 제43항에 있어서, 상기 생물반응기에 유입되는 유체가 생물반응기 내의 유체 온도에 본질적으로 상응하는 온도로 제공되는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  46. 제43항에 있어서, 상기 생물반응기 내의 상기 환경 상태가 세포 배양 및/또는 조직 엔지니어링 기능에 적합한 온도에서 유지되며, 상기 유체 봉쇄 시스템 또는 선택된 가요성 저장기 내의 상기 환경 상태는 상기 세포 배양 및/또는 조직 엔지니어링 기능에 적합한 것보다 낮은 온도에서 유지되는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  47. 제27항에 있어서, 상기 하우징에 상기 지지 구조체를 수용하기 위한 하나 이상의 가이드 세트를 통하여 상기 조직 엔지니어링 모듈의 삽입을 위한 하나 이상의 삽입 슬롯이 있는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  48. 제47항에 있어서, 상기 삽입 슬롯 및 상기 가이드가 상기 하우징과 관련하여 수직 또는 수평으로 배향된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 삽입 슬롯에 가동성 도어 및 잠금 장치가 있는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  50. 제27항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 상기 마이크로프로세서로 작동하는 사용자 인터페이스를 추가로 포함하며, 사용자 인터페이스는 상기 마이크로프로세서로의 사용자 유입부 및/또는 시스템 상태의 출력의 엔트리를 제공하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  51. 제50항에 있어서, 상기 사용자 인터페이스가 디스플레이, 터치 스크린, 키 패드, 컴퓨터, 컴퓨터 네트워크, 컴퓨터 데이터 매체 장치 및 그의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 정보의 유입부, 출력, 기록, 전송 및 저장을 위한 데이터 시스템을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  53. 제52항에 있어서, 컴퓨터 및 통신 링크를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  54. 제27항에 있어서, 상기 마이크로프로세서가 상기 하우징 내의 다수의 조직 엔지니어링 모듈의 독립적인 작동을 제어하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  55. 제27항에 있어서, 상기 마이크로프로세서가 상기 세포 배양 및 조직 엔지니어링 기능의 품질 제어 평가를 수행하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  56. 제55항에 있어서, 상기 품질 제어 평가가 상기 사용자 인터페이스를 통한 품질 제어 기록으로 제시되는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  57. 제27항에 있어서, 상기 마이크로프로세서가 상기 조직 엔지니어링 모듈의 일부를 형성하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  58. 제27항에 있어서, 상기 조직 엔지니어링 모듈이 상기 하우징에 배치된 상기 마이크로프로세서와 작동가능하게 연결된 하나 이상의 마이크로프로세서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 시스템.
  59. - 세포 배양 및 조직 엔지니어링 기능을 돕는 하나 이상의 생물반응기를 유지하는 구조적 지지체;
    - 상기 생물반응기와 유체 연통하는 유체 봉쇄 시스템; 및
    - 상기 세포 배양 및 조직 엔지니어링 기능과 관련된 파라미터의 모니터링을 위한 하나 이상의 센서
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 휴대용의 무균가능한 조직 엔지니어링 모듈.
  60. 제59항에 있어서, 상기 생물반응기가
    - 배지 유동을 위한 하나 이상의 유입구 및 하나 이상의 유출구가 있는 생물반응기 하우징; 및
    - 세포 및/또는 조직을 수용하고 상기 세포 배양 및 조직 엔지니어링 기능을 돕기 위한 상기 생물반응기 하우징 내에 한정된 하나 이상의 챔버
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  61. 제59항에 있어서, 상기 챔버가 조직 분해 챔버, 배양/증식 챔버, 분화/조직 형성 챔버 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  62. 제60항에 있어서, 상기 챔버가 하나 이상의 기판 및/또는 스캐폴드를 수용하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  63. 제60항에 있어서, 2개 이상의 챔버가 생물반응기 내에서 작동가능하게 연결되어 제공된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  64. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 생물반응기가 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 2개 이상의 챔버 및/또는 생물반응기가 독립적으로 작동가능하고/하거나 함께 작동되도록 작동가능한 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 모듈이 제1 생물반응기, 제2 생물반응기및 제3 생물반응기를 포함하며, 상기 제1 생물반응기는 조직 분해 챔버를 포함하며, 상기 제2 생물반응기는 배양/증식 챔버를 포함하며, 상기 제3 생물반응기는 분화/조직 형성 챔버를 포함하며, 상기 제1, 제2 및 제3 생물반응기는 작동되도록 연결된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 챔버 및/또는 생물반응기는 작동가능하게 연결되어 유체, 세포 및/또는 조직이 챔버 및/또는 생물반응기 사이에서 교환되도록 하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  68. 제62항에 있어서, 상기 스캐폴드가 다공성 스캐폴드, 구배적 다공도를 가지는 다공성 스캐폴드, 다공성 망상 스캐폴드, 섬유질 스캐폴드, 막으로 둘러싸인 스캐폴드 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  69. 제60항 또는 제62항에 있어서, 상기 챔버가 복수개의 기판 및/또는 스캐폴드를 포함하기 위한 복수개의 구역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  70. 제59항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물반응기가 조직 생검체의 보관, 조직 생검체의 분해, 세포 분류, 세포 세척, 세포 농축, 세포 접종, 세포 증식, 세포 분화, 세포 보관, 세포 수송, 조직 형성, 이식체 형성, 이식가능한 조직의 보관, 이식 가능한 조직의 수송 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 및/또는 조직 엔지니어링 기능을 위한 환경을 제공하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  71. 제59항에 있어서, 상기 유체 봉쇄 시스템이 상기 생물반응기로, 그리고 상기 생물반응기로부터 유체를 공급 및 회수하기 위한 가요성 배관에 의해 연결된 복수개의 가요성 저장기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  72. 제71항에 있어서, 상기 가요성 저장기가 다양한 구조 및 크기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  73. 제71항에 있어서, 상기 가요성 저장기 및/또는 배관에 상기 유체 봉쇄 시스템으로부터의 물질의 로딩 또는 제거를 위한 유체 액세스 포트가 제공된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  74. 제59항에 있어서, 복수개의 유체 유동 제어 밸브가 유체 봉쇄 시스템과 작동가능하게 연결되어 상기 유체 봉쇄 시스템 및 상기 생물반응기를 이용하여 유체의 유동을 제어하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  75. 제74항에 있어서, 상기 유체 유동 제어 밸브가 밸브 작동기에 의해 개폐되는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  76. 제59항에 있어서, 자동화된 조직 엔지니어링 장치의 하우징 내에 제공된 하나 이상의 밸브 작동기, 펌프 단위 및 커넥터와 사용될 수 있도록 맞물릴 수 있는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  77. 제76항에 있어서, 상기 유체 봉쇄 시스템 전반에 걸친 유체의 펌핑을 위한 상기 유체 봉쇄 시스템과 연결된 하나 이상의 펌프 단위를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  78. 제59항에 있어서, 유체 유동판이 상기 구조적 지지체에 장착되거나 그에 대한 일체형으로 제공되며, 상기 유체 제어 밸브에 사용될 수 있도록 연결되어 상기 유체 봉쇄 시스템 및 상기 생물반응기 내에서의, 그리고 그들 사이에서의 유체 유동을 지시하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  79. 제59항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물반응기로의 유체 유동물의 가열 및 혼합을 위한 가열 및 혼합 챔버를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  80. 제59항에 있어서, 하나 이상의 기체교환막이 상기 유체 봉쇄 시스템 및/또는 생물반응기 내에, 또는 그들 사이에 제공되며, 상기 기체교환막은 기체 생성물이 유체 유동물 내로 또는 유체 유동물 밖으로 전송되게 하거나 상기 생물반응기에 상주하게 하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  81. 제59항에 있어서, 상기 생물반응기와 작동가능하게 연결된 열전기적 요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  82. 제59항에 있어서, 상기 센서와 작동가능하게 연결된 하나 이상의 마이크로프로세서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 하나 이상의 상기 센서, 마이크로프로세서 또는 열전기적 요소용의 전자 인터페이스를 제공하기 위한 인쇄 회로 기판을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  84. 제59항에 있어서, 상기 생물반응기 및/또는 유체 봉쇄 시스템과 작동되도록 연결되며 세포, 유체, 세포 및 조직 배양 배지, 성장인자, 약제, 품질 제어 시약, 품질 제어 샘플 및 기타 물질의 무균 로딩 또는 제거를 위한 하나 이상의 접근 구를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  85. 제84항에 있어서, 상기 접근 구가 상기 구조적 지지체와 일체형인 다기관 시린지에 작동되도록 연결된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  86. 제85항에 있어서, 상기 다기관 시린지가 시린지에 연결된 하나 이상의 무균 접근 구를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  87. 제59항에 있어서, 상기 생물반응기가 상기 구조적 지지체에 회전가능하게 장착된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  88. 제59항에 있어서, 상기 생물반응기가 상기 구조적 지지체에 일체형으로 장착된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  89. 제59항에 있어서, 상기 생물반응기가 상기 지지체 구조체로부터 분리가능한 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  90. 제59항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물반응기 내에서의 시각적 점검을 위해 카메라가 제공된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  91. 제59항에 있어서, 바 코드, 자성 스트립, ID 라벨, 전자 메모리 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 확인용 요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로하는 조직 엔지니어링 모듈.
  92. 제59항에 있어서, 사용 전에 무균가능하며 사용 후에 폐기가능한 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  93. 제59항에 있어서, 다양한 온도에서 세포 및 조직을 보관 및/또는 수송하기에 적합한 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  94. 제92항에 있어서, 무균 포장재 내에 제공된 것을 특징으로 하는 조직 엔지니어링 모듈.
  95. 세포 기능 및/또는 조직 구성물의 생성을 돕고 지지하기 위한 생물반응기에 있어서,
    -생물반응기 하우징;
    - 배지 유동을 위한 하나 이상의 유입구 및 하나 이상의 유출구;
    - 세포 기능 및/또는 세포 및/또는 조직원으로부터 유래되는 하나 이상의 구성물의 생성을 도우며 지지하기 위한 상기 생물반응기 하우징 내에 한정된 하나 이상의 챔버; 및
    - 상기 하나 이상의 챔버 내에서 상기 세포 기능 및/또는 조직 구성물의 생성에 관련된 파라미터를 모니터링하기 위한 하나 이상의 센서
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  96. 제95항에 있어서, 생물반응기 하우징이 뚜껑을 포함하며, 뚜껑은 분리할 수 있는 뚜껑 및 생물반응기 하우징과 일체화된 뚜껑으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 상기 챔버가 조직 분해 챔버, 배양/증식 챔버, 분화/조직 형성 챔버 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  98. 제97항에 있어서, 상기 챔버가 하나 이상의 기판 및/또는 스캐폴드를 지지하는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 상기 생물반응기가 배양/증식 스캐폴드 및/또는 기판이 그 안에서 지지된 단일 배양/증식 챔버를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  100. 제97항 또는 제98항에 있어서, 상기 생물반응기가 분화/조직 형성 챔버의 하류에 연결된 배양/증식 챔버를 포함하며, 상기 배양/증식 챔버 내에서 증식용 스캐폴드 및/또는 기판이 지지되며, 이식가능한 분화용 스캐폴드가 분화/조직 형성 챔버 내에서 지지된 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  101. 제97항 또는 제98항에 있어서, 상기 연결 경로가 상기 배양/증식 챔버와 상기 분화/조직 형성 챔버 사이에 제공되며 상기 증식용 스캐폴드 및/또는 기판로부터 상기 분화용 스캐폴드으로 방출되는 세포의 이동을 돕는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  102. 제101항에 있어서, 조직 생검체 물질의 분해를 위한, 상기 배양/증식 챔버의 상류에 위치하는 분해 챔버를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 필터가 상기 증식용 스캐폴드의 상류, 상기 분화용 스캐폴드의 상류, 상기 유출구의 상류 및 그의 조합으로부터 선택되는 장소에 제공되는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  104. 제98항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드가 다공성 스캐폴드, 구배적 다공도를 가지는 다공성 스캐폴드, 다공성 망상 스캐폴드, 섬유질 스캐폴드, 막으로 둘러싸인 스캐폴드 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  105. 제104항에 있어서, 상기 스캐폴드가 천연 바이오세라믹, 합성 바이오세라믹,천연 생중합체, 합성 생중합체, 이식가능한 바이오세라믹, 이식가능한 생중합체 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  106. 제98항에 있어서, 상기 증식용 기판이 완비형 마이크로-캐리어 현탁물인 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  107. 제101항에 있어서, 상기 분화/조직 형성 챔버가 복수개의 분화용 스캐폴드 및/또는 기판를 포함하기 위한 복수개의 구역을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  108. 제95항에 있어서, 하나 이상의 상기 챔버에 작동되도록 연결된 샘플링 포트가 있는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  109. 제95항에 있어서, 기체교환막이 상기 챔버의 일부를 형성하는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  110. 제95항에 있어서, 상기 유입구 및 상기 유출구를 통하여 유체 봉쇄 시스템이 제거가능하게 설비되어 있는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  111. 제95항에 있어서, 혼합 격판이 상기 챔버의 일부를 형성하며 혼합 작동기 및/또는 혼합 드라이브에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  112. 제111항에 있어서, 혼합 격판이 생물반응기 내로 혼입된 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  113. 제95항에 있어서, 임팩트 작동기 및/또는 임팩트 드라이브에 작동되도록 연결된 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  114. 제95항에 있어서, 상기 챔버가 상주하는 세포 및/또는 조직의 생리학적 자극을 더 지지하는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  115. 제114항에 있어서, 상기 자극이 마이크로-로딩 작동기 및/또는 마이크로-로딩 드라이브와 작동가능하게 연결된 마이크로-로딩 격판에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  116. 제115항에 있어서, 상기 마이크로-로딩 격판이 생물반응기 내에 혼입된 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  117. 제114항에 있어서, 상기 자극이 전기장의 공급에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  118. 제95항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 구조적 지지체에 고정되며 생물반응기와 유체 연통하며 생물반응기로, 그리고 생물반응기로부터 유체를 공급 및 회수하기 위한 가요성 배관에 의해 연결된 복수개의 가요성 저장기를 포함하는 유체 봉쇄 시스템을 포함하는 조직 엔지니어링 모듈 내에 사용될 수 있도록 설비된 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  119. 제118항에 있어서, 상기 조직 엔지니어링 모듈이 자동화된 조직 엔지니어링 시스템의 하우징 내에 설비되어 있으며, 상기 시스템은 상기 모듈로 작동시키기 위한 마이크로프로세서를 포함하며, 상기 마이크로프로세서는 상기 모듈의 기능을 제어하는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  120. 제95항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 광 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  121. 제95항에 있어서, 세포, 조직 및/또는 이식체를 무균 상태 하에서 보관 또는 수송하는 데에 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  122. 제95항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 생검체의 보관, 조직 생검체의 분해, 세포 분류, 세포 세척, 세포 농축, 세포 접종, 세포 증식, 세포 분화, 세포 보관, 세포 수송, 조직 형성, 이식체 형성, 이식가능한 조직의 보관 및 이식가능한 조직의 수송으로 구성된 군으로부터 선택되는 것 중 하나 이상을 위한 환경을 제공하는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  123. 제122항에 있어서, 상기 세포 및 조직이 뼈, 연골, 관련 뼈 및 연골 전구 세포 및 그의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  124. 제122항에 있어서, 상기 세포가 배아 줄기 세포, 성숙 줄기 세포, 골아세포, 전-골아세포, 연골 세포, 수핵 세포, 골격 세포, 전-연골 세포, 뼈로부터 유래된 골격 전구 세포, 줄기 세포를 포함하는 골수 또는 혈구, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  125. 제123항 또는 제124항에 있어서, 상기 세포 또는 상기 조직이 이식체의 수령체에 대하여 자가, 동종 또는 이종 기원의 것임을 특징으로 하는 생물반응기.
  126. 제95항에 있어서, 사용 전에 무균가능하며 사용 후에 폐기가능한 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  127. 제126항에 있어서, 무균 포장재 내에 제공된 것을 특징으로 하는 생물반응기.
  128. 자동화된 조직 생검체 분해 방법에 있어서,
    - 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기 (상기 생물반응기에는 마이크로프로세서에 의한 평가를 위한 생물반응기 내의 생리학적 상태의 탐지를 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 조직 생검체를 로딩하는 단계;
    - 조직 분해 효소를 상기 생물반응기 내에 제공하는 단계; 및
    - 원하는 조직 분해 수준을 위한 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 분해 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  129. 자동화된 세포 증식 방법에 있어서,
    - 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기 (상기 생물반응기에는 마이크로프로세서에 의한 평가를 위한 생물반응기 내의 생리학적 상태의 탐지를 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 증식용 기판 또는 스캐폴드 상으로 세포를 접종하는 단계; 및
    - 원하는 세포 증식 수준을 위한 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 배양 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  130. 자동화된 세포 분화 방법에 있어서,
    - 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기 (상기 생물반응기에는 마이크로프로세서에 의한 평가를 위한 생물반응기 내의 생리학적 상태의 탐지를 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 분화용 기판 또는 스캐폴드 상으로 세포를 접종하는 단계; 및
    - 원하는 세포 분화 수준을 위한 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 배양 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  131. 조직 구성물의 생성 방법에 있어서,
    - 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기 (상기 생물반응기에는 생물반응기 내의 생리학적 상태를 마이크로프로세서가 탐지하게 하기 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 스캐폴드 상으로 세포를 접종하는 접종하는 단계; 및
    - 상기 세포가 조직 구성물을 위한 구조적 지지체를 제공하는 세포외 매트릭스를 발현하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 배양 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  132. 조직 생검체를 분해하여 전구 세포를 포함하는 일차 세포를 제공하고, 세포를 더 증식 및 분화시켜 조직 이식체가 형성될 수 있게 하는 자동화된 방법에 있어서,
    - 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기 (상기 생물반응기에는 마이크로프로세서에 의한 평가를 위한 생물반응기 내의 생리학적 상태의 탐지를 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 조직 생검체를 로딩하는 단계;
    - 조직 분해 효소를 제공하는 단계;
    - 분리 세포를 수득하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 분해 조건을 모니터링 및 유지하는 단계;
    - 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기 (상기 생물반응기에는 마이크로프로세서에 의한 평가를 위한 생물반응기 내의 생리학적 상태의 탐지를 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 증식용 기판 또는 스캐폴드 상으로 분리된 세포를 접종하는 단계;
    - 원하는 세포 증식 및 확장 수준을 수득하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 배양 조건을 모니터링 및 유지하는 단계;
    - 확장된 세포를 증식용 기판 또는 스캐폴드으로부터 방출시키는 단계;
    - 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기 (상기 생물반응기에는 마이크로프로세서에 의한 평가를 위한 생물반응기 내의 생리학적 상태의 탐지를 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 분화용 기판 또는 스캐폴드 상으로 확장된 세포를 접종하는 단계; 및
    - 조직 이식체를 수득하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한배양 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  133. 골격 이식체의 제공 방법에 있어서,
    - 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기 (상기 생물반응기에는 마이크로프로세서에 의한 평가를 위한 생물반응기 내의 생리학적 상태의 탐지를 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 뼈 생체적합재료의 다공성 스캐폴드 상에 골형성 및/또는 골 선조 세포를 접종하는 단계; 및
    - 스캐폴드 전반에 걸쳐 골 형성 및/또는 골 선조 세포가 증식 및/또는 분화되게 하여 정형 외과적 용도의 조직 이식체를 제공하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  134. 연골 이식체의 제공 방법에 있어서,
    - 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기 (상기 생물반응기에는 마이크로프로세서에 의한 평가를 위한 생물반응기 내의 생리학적 상태의 탐지를 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 생체적합재료의 다공성 스캐폴드 상에 연골 형성 및/또는 연골 선조 세포를 접종하는 단계; 및
    - 스캐폴드 전반에 걸쳐 연골 형성 및/또는 연골 선조 세포가 증식 및/또는 분화되게 하여 연골 이식체를 제공하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의적합한 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  135. 추간판의 내핵을 재확립하기 위한 이식체의 제공 방법에 있어서,
    - 배지 저장기 및 유동 시스템과 연결된 생물반응기 (상기 생물반응기에는 생물반응기 내의 생리학적 상태를 마이크로프로세서가 탐지하게 하기 위한 하나 이상의 센서가 있음) 내에 지지된 생체적합재료의 다공성 스캐폴드 내에 수핵 세포를 접종하는 단계; 및
    - 수핵 세포가 증식 및/또는 분화되게 하고 수핵 세포의 특징적인 세포외 매트릭스 구성요소가 발현되게 하기에 충분한 시간 동안 상기 생물반응기 내의 적합한 조건을 모니터링 및 유지하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  136. 임상 조직 엔지니어링에서 사용하기 위한 품질 평가용 샘플의 제조 방법에 있어서,
    - 제1항 또는 제27항의 시스템을 사용하여 일차 및 이차 이식체를 유사하게 제조하는 단계 (여기서, 일차 이식체는 이식용이며 하나 이상의 이차 이식체는 일차 이식체의 직경을 추정하기 위한 시험 목적용임)
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  137. 세포의 세척 방법에 있어서,
    - 하나 이상의 원하지 않는 화학 물질을 포함하는 세포 현탁물을 챔버 내로 로딩하는 단계;
    - 상기 세포에 대해서는 불투과성이지만 상기 원하지 않는 화학 물질에 대해서는 투과성인 막을 포함하는 교차-유동 여과 모듈을 통하여 챔버로부터의 세포 현탁물을 연속적으로 재순환시켜 세척된 세포 현탁물을 제공하는 단계; 및
    - 세척된 세포 현탁물을 수집하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  138. 세포의 부화 방법에 있어서,
    - 과도한 부피의 세포 현탁물을 포함하는 세포 현탁물을 챔버 내로 로딩하는 단계; 및
    - 세포에 대해서는 불투과성이지만 과도한 부피의 세포 현탁물은 제거 및 수집되게 하는 막을 포함하는 가로질러 유동하는 여과 모듈을 통하여 챔버로부터의 세포 현탁물을 연속적으로 재순환시키는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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