ES2713559T3 - Sistema automatizado de ingeniería de tejidos - Google Patents

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Timothy Smith
Sydney Pugh
Martin Pecaric
Rupert Hagg
Roberto Tommasini
Yves Larcher
D Lowell Misener
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Octane Biotech Inc
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Abstract

Un método para (a) la proliferación automatizada de células autólogas, alogénicas o xenogénicas para uso en procedimientos de ingeniería de tejidos, comprendiendo dicho método: - sembrar las células sobre o dentro de un sustrato o andamio de proliferación sostenido dentro de un biorreactor (202) conectado con un sistema (206) de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor (202) sensores (132, 134) para detectar los cambios en las condiciones ambientales que comprenden pH y temperatura y gases disueltos dentro de dicho biorreactor (202), cuyos sensores (132, 134) generan señales que son monitorizadas por un microprocesador (128), y cuyo microprocesador (128) controla y personaliza el ambiente interno del biorreactor (202) para cumplir así los requisitos de proliferación celular dentro del biorreactor (202); - monitorizar y mantener condiciones adecuadas de cultivo dentro de dicho biorreactor (202) durante un periodo de tiempo suficiente para un nivel deseado de proliferación celular, en donde el estado de proliferación celular es evaluado indirectamente por la detección del recambio metabólico en función del tiempo y la evaluación del estado de proliferación celular comprende determinar el nivel de confluencia mediante monitorización a base de sensores.

Description

DESCRIPCION
Sistema automatizado de ingeniena de tejidos
Campo de la invencion
Esta invencion se refiere a dispositivos, metodos y sistemas para el cultivo, proliferacion, diferenciacion, produccion y mantenimiento automatizados de productos de ingeniena de tejidos. Tales sistemas, metodos y productos encuentran uso en diversos ambitos clmicos y de laboratorio.
Antecedentes de la invencion
A lo largo de esta solicitud, se citan varias referencias entre parentesis para describir mas completamente el estado de la tecnica a la que pertenece esta invencion. Las descripciones de estas referencias se incorporan aqu como referencia en la presente divulgacion. Durante los ultimos anos, los investigadores han desarrollado y utilizado diferentes tecnicas de cultivo celular y de ingeniena de tejidos para el cultivo y la produccion de diversos tipos de implantes celulares. Tales sistemas estan descritos, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos numeros 5.041.138, 5.842.477, 5.882.929, 5.891.455, 5.902.741, 5.994.129, 6.048.721 y 6.228.635. Tambien se han desarrollado sistemas de biorreactores para el cultivo de celulas e implantes celulares y estan descritos, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos numeros 5.688.687, 5.728.581, 5.827.729 y 6.121.042. Otros ejemplos de sistemas y metodos de cultivo celular y de ingeniena de tejidos estan descritos en los documentos WO 99/47922 y US 5994129. El documento WO 99/47922 se refiere a matrices de tejidos a microescala y a su construccion, donde la matriz de tejido a microescala se construye a partir de una micromatriz sembrada con celulas que forma un microtejido y/o un microorgano, y a metodos para utilizar las matrices de tejidos a microescala en una variedad de sistemas y ensayos. El documento US 5994129 se refiere a una casete portatil para uso en combinacion con un instrumento procesador y/o un instrumento incubador, para recibir, mantener y cultivar celulas biologicas ex vivo sin exponer las celulas al ambiente externo, en donde ambos instrumentos estan configurados para acondicionar la casete portatil durante las fases del proceso de cultivo celular, sin perturbar el sistema esteril de la casete.
Los metodos y sistemas mencionados antes generalmente emplean tecnicas de cultivo de laboratorio convencionales que utilizan equipo de cultivo estandar para la siembra sobre andamiaje de celulas de poblaciones de celulas seleccionadas. Por tanto, los implantes generados comprenden simplemente poblaciones de celulas proliferadas cultivadas sobre un tipo de soporte de biopolfmero donde cualquier manipulacion del entorno celular se limita a la produccion de citocinas de celulas endogenas presentes en cualquier cultivo celular estandar, y a la aplicacion de tensiones de cizallamiento y/o ffsicas debido a la circulacion de medios de cultivo celular y a la manipulacion ffsica del soporte sobre el que se siembran las celulas. Los sistemas no abordan ni son capaces de generar un implante de tejido que comprenda celulas proliferadas y diferenciadas representativas de tejidos en desarrollo in vivo y ademas integradas dentro de un andamiaje seleccionado que se pueda integrar satisfactoriamente in vivo. Ademas, los metodos y sistemas conocidos no son capaces de llevar a cabo de manera multifuncional todas las etapas de la digestion de tejidos de biopsia para producir celulas desasociadas, la subsiguiente siembra de celulas sobre un sustrato de proliferacion, la expansion del numero de celulas, la diferenciacion controlada, la formacion de tejido y la produccion de un implante de tejido dentro de un unico sistema automatizado de ingeniena de tejidos. Esto se debe principalmente a que los sistemas de cultivo conocidos no son sofisticados porque no son capaces de evaluar y manipular automaticamente el entorno cambiante que rodea al implante en desarrollo, de manera que las celulas proliferen y se diferencien progresivamente en un implante deseado.
Ademas, los metodos y sistemas de cultivo convencionales son laboriosos y sufren los inconvenientes de la contaminacion y de los diferentes grados de exito del cultivo debido al error humano y a la falta de evaluacion continua del funcionamiento. Los sistemas de cultivo convencionales requieren que la mayor parte de las etapas iniciales en la preparacion de celulas para siembra (esto es, digestion de tejidos, seleccion de celulas) se realicen manualmente, lo que requiere mucho tiempo, no es fiable en terminos de la calidad del tejido producido y es propenso a problemas de contaminacion del cultivo. Los sistemas son incapaces de sostener la preparacion automatizada de implantes de ingeniena de tejidos a partir de celulas primarias o precursoras debido a las limitaciones inherentes de diseno que restringen el proceso de cultivo de celulas y tejidos, a la incapacidad para monitorizar y modificar adecuadamente el entorno para sostener el desarrollo del tejido y a la ausencia de tecnicas que permitan la implementacion de medidas efectivas de control de calidad.
Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad real y no satisfecha de un sistema mejorado para la ingeniena de tejidos in vitro y ex vivo que pueda cumplir de manera consistente los requisitos operativos asociados con las diferentes etapas en el desarrollo y produccion de implantes por ingeniena de tejidos. Es de particular importancia la capacidad de crear constructos de tejido funcionales donde las celulas presentes sean activas, diferenciadas y expresen ya una matriz extracelular. Esto implica mas que la simple simulacion del entorno maduro in vivo presente en el sitio del hospedante, y es sorprendentemente diferente a ella. Esto se debe a que la preparacion de tejido funcional de novo requiere fundamentalmente que las celulas progresen a traves de una serie de fases de desarrollo como parte de una secuencia ex vivo.
Con el fin de abordar los requisitos tanto clmicos como de investigacion, se han desarrollado nuevos dispositivos, metodos y sistemas que evitan varias de las desventajas y limitaciones de las tecnicas y sistemas de cultivo convencionales ex vivo.
Sumario
Se proporciona en la presente invencion un metodo para (a) la proliferacion automatizada de celulas autologas, alogenicas o xenogenicas para uso en procedimientos de ingeniena de tejidos, comprendiendo dicho metodo:
- sembrar las celulas sobre o dentro de un sustrato o andamio de proliferacion sostenido dentro de un biorreactor (202) conectado con un sistema (206) de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor (202) sensores (132, 134) para detectar los cambios en las condiciones ambientales que comprenden pH y temperatura y gases disueltos dentro de dicho biorreactor (202), cuyos sensores (132, 134) generan senales que son monitorizadas por un microprocesador (128), y cuyo microprocesador (128) controla y personaliza el ambiente interno del biorreactor (202) para cumplir asf los requisitos de proliferacion celular dentro del biorreactor (202);
- monitorizar y mantener condiciones adecuadas de cultivo dentro de dicho biorreactor (202) durante un periodo de tiempo suficiente para un nivel deseado de proliferacion celular, en donde el estado de proliferacion celular es evaluado indirectamente por la deteccion del recambio metabolico en funcion del tiempo y la evaluacion del estado de proliferacion celular comprende determinar el nivel de confluencia mediante monitorizacion a base de sensores. Se proporciona tambien en la presente invencion un sistema automatizado de cultivo celular y/o de ingeniena de tejidos que comprende:
- uno o mas biorreactores (202) comprendiendo cada uno de dichos biorreactores (202) una o mas camaras adecuadas para facilitar las funciones fisiologicas celulares y/o la generacion de una o mas poblaciones de celulas y/o constructos de tejido en un modo de proceso secuencial y/o concurrente dentro de y/o entre las camaras y/o biorreactores (202) deseados, durante el uso; en donde dichos uno o mas biorreactores (202) estan conectados operativamente con el sistema (206) de reservorio y flujo de medios,
- sensores (132, 134) asociados con dichos uno o mas biorreactores (202) para detectar cambios en las condiciones ambientales que comprenden el pH y la temperatura y los gases disueltos dentro de dicho biorreactor (202), y cuyos sensores (132, 134) generan senales que son monitorizadas por un microprocesador (128);
- medios de deteccion del recambio metabolico en funcion del tiempo para evaluar el estado de proliferacion celular; - medios de monitorizacion a base de sensores para determinar el nivel de confluencia;
- un microprocesador (128) para efectuar dicho procesamiento biologico de modo secuencial y/o concurrente durante el uso, y que durante el uso controla y personaliza el ambiente interno del biorreactor (202) para cumplir asf los requisitos de las diferentes fases de cultivo celular y/o desarrollo de tejido dentro del biorreactor (202), en respuesta a la monitorizacion de las senales generadas por los sensores (132, 134);
en donde, en uso, el microprocesador (128) monitoriza el progreso de la proliferacion de celulas autologas, alogenicas o xenogenicas, y opcionalmente, la diferenciacion celular y/o el desarrollo de tejido, y mantiene condiciones de cultivo adecuadas dentro de dicho biorreactor (202) durante un periodo de tiempo suficiente para un nivel deseado de proliferacion celular y opcionalmente, durante un periodo de tiempo suficiente para un nivel deseado de diferenciacion celular y/o durante un periodo de tiempo suficiente para que dichas celulas expresen una matriz extracelular que proporciona el soporte estructural para el constructo de tejido.
Un sistema automatizado facil de usar para el cultivo de celulas y la ingeniena de tejidos, descrito en la presente memoria, se puede utilizar en una variedad de ambitos clmicos y de investigacion tanto para aplicaciones humanas como veterinarias.
Como se usa en la presente memoria, "ingeniena de tejidos" se puede definir como "la aplicacion de principios y metodos de ingeniena y ciencias de la vida hacia la comprension y el desarrollo fundamentales de sustitutos biologicos para restaurar, mantener y mejorar las funciones de los tejidos". Con esta definicion se pretende incluir procedimientos donde los sustitutos biologicos son celulas o combinaciones de diferentes celulas que pueden ser implantadas sobre un sustrato o andamio formado de materiales biocompatibles para formar un tejido, en particular un constructo de tejido implantable. Las celulas implicadas en los procedimientos de ingeniena de tejidos son autologas, alogenicas o xenogenicas.
Un sistema de ingeniena de tejidos descrito en la presente memoria esta disenado para realizar todas las actividades en condiciones operativas esteriles. El sistema es totalmente automatizado, portatil, de operacion multifuncional y realiza/proporciona uno o mas de lo siguiente:
- recepcion/almacenamiento esteril de biopsia de tejido;
- monitorizacion automatizada del proceso de digestion.
- digestion del tejido de biopsia para producir celulas desasociadas;
- clasificacion y seleccion de celulas, incluyendo la recogida segura de residuos;
- siembra de celulas sobre o dentro de un sustrato o andamio de proliferacion;
- proliferacion de celulas para aumentar las poblaciones de celulas;
- lavado de celulas y recogida de celulas;
- siembra de celulas sobre o dentro de un andamio o matriz de ingeniena de tejidos;
- diferenciacion celular para permitir la especializacion de la actividad celular;
- formacion de tejido;
- estimulacion mecanica y/o bioqmmica para promover la madurez tisular;
- recogida de los constructos/implantes de ingeniena de tejidos para cirugfa reconstructiva; y
- almacenamiento y transporte de tejido implantable.
El sistema de ingeniena de tejidos descrito en la presente memoria se puede preprogramar para realizar cada una de las etapas indicadas anteriormente, individualmente, secuencialmente o en ciertas secuencias parciales predeterminadas segun se desee y se requiera. Ademas, cada una de estas etapas, o cualquier combinacion de ellas, se realizan dentro de uno o mas biorreactores en un modulo de ingeniena de tejidos. En funcionamiento, el sistema de ingeniena de tejidos es preprogramado y controlado automaticamente, por lo que requiere una intervencion minima por parte del usuario y, como resultado, aumenta la eficacia y la reproducibilidad del proceso de cultivo celular y/o ingeniena de tejidos a la vez que minimiza los riesgos de contaminacion. El sistema de ingeniena de tejidos de la invencion y los componentes del mismo pueden funcionar en condiciones de microgravedad y/o de gravedad cero donde tales sistema y componentes se usan en la investigacion del espacio.
Un sistema descrito en la presente memoria esta disenado de tal manera que las celulas primarias o precursoras pueden ser aisladas de un tejido donante para posterior propagacion, diferenciacion y produccion de un implante de tejido. Alternativamente, las lmeas celulares tambien se pueden usar solas o en combinacion con otras fuentes celulares.
La descripcion se refiere a un sistema automatizado de ingeniena de tejidos, comprendiendo el sistema una carcasa que sostiene al menos un biorreactor que facilita las funciones celulares fisiologicas y la generacion de constructos de tejido a partir de fuentes de celulas y de tejidos. La carcasa tambien sostiene un sistema de contencion de fluidos que esta en comunicacion fluida con el biorreactor.
Asociados con la carcasa y/o con el biorreactor hay sensores que monitorizan los parametros fisiologicos del fluido proporcionado en el sistema de contencion de fluidos. Un microprocesador dispuesto dentro de la carcasa esta conectado al biorreactor y al sistema de contencion de fluidos y funciona para controlar el funcionamiento de estos. El microprocesador tambien puede controlar independientemente las condiciones ambientales dentro del sistema. Se describe en la presente memoria, un sistema para ingeniena celular y tisular que comprende modulos de ingeniena de tejidos, portatiles, esteriles, que tienen uno o mas biorreactores que proporcionan la base para la digestion de tejidos, la siembra de celulas sobre un sustrato de proliferacion, la proliferacion celular, la siembra de celulas sobre un andamio de diferenciacion, la diferenciacion celular y la formacion de tejido con la subsiguiente maduracion hasta tejido funcional para implantacion. El biorreactor esta conectado operativamente con un sistema de flujo y reservorio de medios para el suministro de reactivos y la recogida de fluidos de desecho de una manera sin reflujo. El biorreactor y/o el sistema de flujo de medios incluyen opcionalmente componentes de intercambio de gases que utilizan membranas semipermeables que permiten la transferencia de productos gaseosos controlando de este modo los niveles de gases disueltos en los medios. El modulo de ingeniena de tejidos interactua operativamente con una unidad base controlada por un microprocesador central que monitoriza automaticamente la progresion del proceso de cultivo celular o de ingeniena de tejidos y ajusta las condiciones ambientales para cumplir los requisitos de las diferentes fases de cultivo celular y desarrollo de tejido dentro del biorreactor. Las desviaciones de las condiciones ideales son detectadas por una variedad de sensores presentes dentro del biorreactor y las senales generadas son monitorizadas por el microprocesador central. Por tanto, los cambios en las condiciones ambientales tales como, pero sin limitarse a ellos, el pH, la temperatura y los gases disueltos se pueden monitorizar y modificar automaticamente segun sea necesario. Ademas, el estado de la proliferacion celular se evalua indirectamente mediante la deteccion del recambio metabolico en funcion del tiempo (p. ej., pH, O2, CO2 , acido lactico y consumo de glucosa). Ademas del control de las condiciones de proceso por el microprocesador central, el propio modulo de ingeniena de tejidos puede incluir opcionalmente un microprocesador secundario incorporado que funciona al umsono con el microprocesador central. El microprocesador del modulo de ingeniena de tejidos amplfa las capacidades de procesamiento de datos del sistema de ingeniena de tejidos al realizar funciones espedficas directamente incorporado al modulo de ingeniena de tejidos, minimizando as ^ las exigencias al microprocesador central.
Diferentes factores de crecimiento, citocinas, agentes experimentales, productos farmaceuticos, productos qmmicos, fluidos de cultivo y cualquier combinacion de los mismos se pueden cargar y almacenar dentro de cualquiera de los reservorios localizados en el modulo de ingeniena de tejidos y se pueden transferir automaticamente al uno o mas biorreactores segun una secuencia preprogramada o como sea requerido por el implante de tejido en desarrollo. Los modulos de ingeniena de tejidos individuales son separables del sistema para su transporte sin comprometer la esterilidad de los constructos de ingeniena de tejidos presentes dentro del biorreactor. Dicha separacion no afecta el procesamiento de ningun otro modulo presente dentro del sistema de ingeniena de tejidos. Ademas, el modulo de ingeniena de tejidos se puede considerar desechable despues de completar una secuencia de ingeniena de tejidos, ya que esta practica evita la contaminacion derivada de un uso anterior.
En diversas realizaciones descritas en la presente memoria, el dispositivo y el sistema se pueden usar para digerir tejidos obtenidos mediante biopsia quirurgica. En otra realizacion, las celulas se pueden filtrar y se puede seleccionar y aislar una poblacion particular. En otra realizacion, las celulas digeridas se pueden proliferar para aumentar la poblacion de las celulas. En otra realizacion adicional, las celulas se pueden sembrary cultivar sobre un andamio o sustrato deseado (denominado tambien matriz). En una realizacion adicional mas, las celulas se pueden diferenciar sobre y/o a lo largo de un andamio o sustrato deseado hasta que se obtenga la formacion de tejido adecuado. En otra realizacion adicional, el tejido puede ser estimulado para promover la madurez del tejido. En otra realizacion mas, se produce un implante de tejido que es adecuado para cirugfa reconstructiva. En otra realizacion adicional, se puede realizar muestreo de celulas en cada fase de proliferacion celular y progresion del desarrollo de una manera esteril sin efectos adversos sobre el propio cultivo. Cada una de las realizaciones mencionadas anteriormente se puede llevar a cabo sola o secuencialmente, segun se desee. El rastreo de tales sucesos de procesamiento se puede realizar por el microprocesador central y/o el microprocesador basado en modulos para incorporacion a los registros de control de calidad.
Un sistema de ingeniena de tejidos descrito en la presente memoria puede utilizar opcionalmente un compuesto de biomaterial sintetico, Skelite™, descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos N° 6.323.146 (cuyos contenidos se incorporan a la presente memoria como referencia) para mejorar el funcionamiento biologico. Brevemente, Skelite™ es un compuesto de biomaterial bioabsorbible aislado que comprende calcio, oxfgeno y fosforo, en donde una porcion de al menos uno de dichos elementos esta sustituida con un elemento que tiene un radio ionico de aproximadamente 0,1 a 0,6 Angstroms. En una realizacion, se puede utilizar Skelite™ para mejorar la proliferacion celular a traves de su uso como un recubrimiento sobre las paredes del biorreactor, como una pelfcula delgada sobre el sustrato de proliferacion, o como un andamio de proliferacion tridimensional y por lo tanto de area superficial alta. Se puede demostrar que el uso de Skelite™ en la fase de proliferacion:
- aumenta la tasa de proliferacion;
- aumenta el rendimiento celular despues de la etapa de proliferacion;
- reduce el area superficial requerida para un rendimiento de celulas deseado;
- reduce la tendencia problematica de la desdiferenciacion del fenotipo celular durante la proliferacion; y
- mejora la union de los factores de crecimiento al sustrato de proliferacion.
En una realizacion adicional, se puede usar Skelite™ como un andamiaje reabsorbible para mejorar la diferenciacion de las celulas y la subsiguiente formacion de constructos de tejido. Se puede demostrar que el uso de Skelite™ en la fase de diferenciacion:
- aumenta la productividad mejorando la fiabilidad de la fase de diferenciacion;
- aumenta la integridad y por lo tanto la viabilidad biologica del constructo de tejido;
- permite flexibilidad en la configuracion del constructo basada en diferentes formatos de andamios;
- permite que las fases de proliferacion, diferenciacion y formacion de tejido se produzcan sobre un sustrato comun; - aumenta la union de los factores de crecimiento al andamio de diferenciacion; y
- mejora las propiedades de manipulacion del constructo de tejido durante la implantacion quirurgica.
Se describe en la presente memoria un metodo y un sistema para la preparacion de constructos de tejido a traves de las etapas automatizadas de digestion, proliferacion, siembra y diferenciacion de celulas primarias o precursoras que se originan en un paciente, eliminando asf los problemas inmunologicos y de transmision de enfermedades. Se puede formar un implante a partir del cultivo controlado de diversos tipos de celulas, que incluyen, pero no se limitan a condrocitos, celulas estromales, osteoblastos, celulas nerviosas, celulas epiteliales, celulas madre y mezclas de las mismas.
Un sistema descrito en la presente memoria, en una realizacion, incorpora uno o mas modulos de ingeniena de tejidos desmontables, portatiles y que funcionan independientemente que incluyen uno o mas biorreactores, sistema de reservorios de medios y de flujo de fluidos/medios. Cada modulo, y por lo tanto el biorreactor o biorreactores, esta bajo el control automatizado de un microprocesador central. El modulo y el biorreactor o biorreactores asociados pueden estar configurados para diferentes aplicaciones especializadas, tales como las siguientes, pero sin limitarse a ellas:
- recepcion/almacenamiento esteril de biopsia de tejido;
- mezcla y suministro automatizados de reactivos de digestion;
- monitorizacion automatizada del proceso de digestion;
- digestion de tejido de biopsia para producir celulas desasociadas;
- clasificacion y seleccion de celulas, incluyendo la recogida segura de residuos;
- lavado de celulas y recogida de celulas;
- siembra de celulas sobre o dentro de un sustrato o andamio de proliferacion;
- mezcla y suministro automatizados de reactivos de proliferacion;
- proliferacion de celulas para aumentar las poblaciones de celulas;
- monitorizacion automatizada de las condiciones celulares, incluyendo la deteccion de la confluencia;
- liberacion celular controlada desde el sustrato o andamio de proliferacion;
- etapas de proliferacion repetidas en tamanos de area superficial seleccionados para aumentar el numero de celulas;
- canalizacion de la poblacion celular hacia uno o mas andamios o matrices de ingeniena de tejidos;
- siembra de celulas sobre o dentro del andamio o matriz de ingeniena de tejidos;
- mezcla y suministro automatizados de reactivos de diferenciacion;
- monitorizacion automatizada de las condiciones de cultivo de celulas/tejidos;
- diferenciacion celular para permitir la especializacion de la actividad celular;
- formacion de tejido;
- estimulacion mecanica y/o bioqmmica para promover la madurez tisular;
- recogida de los constructos/implantes de ingeniena de tejidos para cirugfa reconstructiva; y
- almacenamiento y transporte de celulas y/o tejido implantable.
Cuando se proporcionan dos o mas biorreactores dentro del sistema ya sea sostenidos directamente dentro de la carcasa del sistema o ya sea sostenidos en un modulo de ingeniena de tejidos insertable en la carcasa, los biorreactores se pueden proporcionar conectados en serie e individualmente operables y controlados por el microprocesador o alternativamente, pueden ser operados y controlados independientemente dependiendo de la programacion del microprocesador por parte del usuario y del resultado que se desea lograr. Ademas, cuando se proporcionan dos o mas biorreactores dentro del sistema, los biorreactores y las camaras internas pueden estar conectados de tal manera que haya un intercambio de celulas y/o de tejidos de biorreactor a biorreactor.
El biorreactor se puede fabricar en diferentes tamanos y configuraciones segun sea necesario para sostener numeros y tamanos variables de andamios o sustratos de proliferacion y diferenciacion. El biorreactor se puede incorporar como parte de los componentes estructurales del modulo de ingeniena de tejidos. Alternativamente, el biorreactor puede ser desmontable como un componente separado de los restantes componentes del modulo de ingeniena de tejidos. Si esta presente como un componente discreto, el biorreactor se puede empaquetar por separado en un paquete esteril y se puede unir al modulo de ingeniena de tejidos utilizando tecnicas de acceso esteril en el momento de uso. Ademas, las tecnicas de acceso esteril permiten que el biorreactor se separe del modulo, una vez finalizado el proceso de ingeniena de tejidos, para un facil transporte al quirofano en preparacion para la recuperacion de un constructo de tejido implantable recien formado.
El biorreactor y/o el modulo de ingeniena de tejidos se pueden rotar o agitar dentro del sistema general de ingeniena de tejidos mediante actuadores de control. La rotacion puede permitir el uso beneficioso de la gravedad para efectuar secuencias espedficas de bioprocesado, tales como la siembra de celulas basada en la sedimentacion y el intercambio de fluidos dentro del biorreactor.
El modulo de ingeniena de tejidos puede tener un codigo de barras o disponer de un chip de memoria para un rastreo rapido y preciso tanto dentro del sistema de ingeniena de tejidos como externamente como parte del entorno clmico o experimental. Dicha tecnolog^a de rastreo incorporada dentro del dispositivo de ingeniena de tejidos permite tambien el rastreo electronico mediante los sistemas de informacion de una clmica para los registros de pacientes. Esto asegura que el modulo de ingeniena de tejidos y, por lo tanto, las celulas o los implantes de tejidos asociados sean codificados correctamente para asegurar la administracion al paciente correcto y que el proceso se registra para los fines de facturacion del hospital. El modulo y/o el biorreactor pueden utilizar tambien un codigo de barras y/o un chip de memoria de manera similar para un rastreo rapido y seguro de pacientes y muestras.
En la presente memoria, se describe un sistema automatizado de ingeniena de tejidos que comprende;
- una carcasa;
- al menos un biorreactor sostenido por dicha carcasa, facilitando dicho biorreactor las funciones celulares fisiologicas y/o la generacion de uno o mas constructos de tejido a partir de fuentes celulares y/o tisulares;
- un sistema de contencion de fluidos sostenido por dicha carcasa y en comunicacion fluida con dicho biorreactor, - uno o mas sensores asociados con uno o mas de dichos carcasa, biorreactor o sistema de contencion de fluidos para monitorizar los parametros relacionados con dichas funciones celulares fisiologicas y/o la generacion de constructos de tejido; y
- un microprocesador ligado a uno o mas de dichos sensores.
En la presente memoria, se describe un sistema automatizado de ingeniena de tejidos que comprende;
- una carcasa;
- al menos un modulo de ingeniena de tejidos alojado de manera desmontable dentro de dicha carcasa, comprendiendo dicho modulo de ingeniena de tejidos un soporte estructural que contiene al menos un biorreactor, facilitando dicho biorreactor las funciones celulares fisiologicas y/o la generacion de uno o mas constructos de tejido a partir de fuentes de celulas y/o de tejidos, un sistema de contencion de fluidos en comunicacion fluida con dicho biorreactor y uno o mas sensores para monitorizar los parametros relacionados con dichas funciones de cultivo celular y/o de ingeniena de tejidos; y
- un microprocesador dispuesto en dicha carcasa y conectado a dicho modulo de ingeniena de tejidos, controlando dicho microprocesador el funcionamiento de dicho modulo de ingeniena de tejidos.
En la presente memoria, se describe un modulo de ingeniena de tejidos portatil y esterilizable, que comprende; - un soporte estructural que contiene al menos un biorreactor, facilitando dicho biorreactor las funciones de cultivo celular y de ingeniena de tejidos;
- un sistema de contencion de fluidos en comunicacion fluida con dicho biorreactor; y
- uno o mas sensores para monitorizar los parametros relacionados con dichas funciones de cultivo celular y de ingeniena de tejidos.
En aspectos de esta realizacion, el biorreactor comprende una carcasa de biorreactor que tiene uno o mas puertos de entrada y uno o mas puertos de salida para el flujo de medios y al menos una camara definida dentro de dicha carcasa de biorreactor para recibir celulas y/o tejidos y facilitar dichas funciones de cultivo celular y de ingeniena de tejidos. La camara se puede seleccionar del grupo que consiste en una camara de cultivo/proliferacion celular, una camara de diferenciacion celular/formacion de tejido, una camara de digestion de tejido y combinaciones de las mismas. Ademas, la camara alberga uno o mas sustratos y/o andamios. En alguna realizacion de la invencion, se pueden proporcionar dos o mas camaras conectadas operativamente dentro del biorreactor y pueden ser conectadas operativamente. Alternativamente, los dos o mas biorreactores pueden ser independientemente operables o cooperativamente operables. En otros aspectos adicionales, las camaras y/o biorreactores estan conectados operativamente para proporcionar el intercambio de fluidos, celulas y/o tejidos entre las camaras y/o los biorreactores. El andamio para uso en la presente invencion se selecciona del grupo que consiste en un andamio poroso, un andamio poroso con gradiente de porosidad, un andamio reticulado poroso, un andamio fibroso, un andamio rodeado por una membrana y combinaciones de los mismos. Las camaras tambien se pueden subdividir en zonas. Por ejemplo, una camara de diferenciacion/formacion de tejido puede estar provista de una pluralidad de zonas para contener varios andamios. Se pueden proporcionar embudos o pasadizos similares entre camaras dentro de un biorreactor. Ademas, se pueden proporcionar uno o mas filtros en cualquier localizacion dentro de un biorreactor.
Segun otro aspecto mas de la presente invencion, se encuentra un biorreactor que proporciona un entorno para las funciones de cultivo celular y/o de ingeniena de tejidos seleccionadas del grupo que consiste en almacenamiento de biopsia de tejido, digestion de biopsia de tejido, clasificacion celular, lavado celular, concentracion celular, siembra celular, proliferacion celular, diferenciacion celular, almacenamiento celular, transporte celular, formacion de tejido, formacion de implante, almacenamiento de tejido implantable, transporte de tejido implantable y combinaciones de los mismos.
Se describe en la presente memoria, un biorreactor para facilitar y sostener funciones celulares y la generacion de constructos de tejido implantables, comprendiendo dicho biorreactor;
- una carcasa de biorreactor;
- uno o mas puertos de entrada y uno o mas puertos de salida para flujo de medios;
- al menos una camara definida dentro de dicha carcasa de biorreactor para facilitar y sostener funciones celulares y/o la generacion de uno o mas constructos de tejido a partir de fuentes de celulas y/o de tejidos; y
- uno o mas sensores para monitorizar los parametros relacionados con dichas funciones celulares y/o la generacion de constructos de tejido dentro de dicha al menos una camara.
Una carcasa de biorreactor descrita en la presente memoria comprende una tapa que puede ser una tapa desmontable o integral con la carcasa del biorreactor.
Las celulas y los tejidos se pueden seleccionar de celulas precursoras de huesos, cartflagos, huesos y cartflagos relacionados y sus combinaciones. Mas espedficamente, las celulas adecuadas para uso en el biorreactor, en el modulo y en el sistema de la invencion se seleccionan del grupo, pero sin limitarse a el, que consiste en celulas madre embrionarias, celulas madre adultas, celulas osteoblasticas, celulas pre-osteoblasticas, condrocitos, celulas del nucleo pulposo, pre-condrocitos, celulas progenitoras esqueleticas derivadas de hueso, medula osea o sangre, incluyendo las celulas madre, y combinaciones de las mismas. Las celulas o tejidos son de origen autologo, alogenico o xenogenico en relacion con el receptor de un implante formadas por las funciones de cultivo celular y de ingeniena de tejidos de la invencion.
Segun otro aspecto de la invencion, se encuentra un implante de tejido producido dentro de un biorreactor de la presente invencion.
Segun otro aspecto mas de la presente invencion, se encuentra un implante de tejido producido por el sistema de ingeniena de tejidos de la presente invencion.
Se describe en la presente memoria, un constructo implantable de ingeniena de tejidos para la reparacion de un traumatismo oseo en donde el implante comprende un andamiaje poroso de un biomaterial oseo en combinacion con celulas oseas activas y una matriz mineralizada formada por ingeniena de tejidos.
Se describe en la presente memoria, un implante de ingeniena de tejidos que comprende:
- una zona de cartflago que comprende un cartflago de ingeniena de tejidos que esta desprovisto de cualquier andamio a base de minerales;
- una zona de biomaterial oseo que comprende un andamio poroso; y
- una zona interfacial entre dicha zona de cartflago y dicha zona de biomaterial oseo.
La zona de cartflago promueve la integracion lateral con el cartflago del hospedante, mientras que la zona de biomaterial del hueso promueve la integracion lateral y vertical con la placa de hueso subcondral cuando se implanta in vivo. La zona interfacial proporciona la union estructural entre la zona del cartflago y la zona del biomaterial oseo. La zona de cartflago puede incorporar adicionalmente un andamio no mineral secundario que ayuda a la formacion de cartflago por ingeniena de tejidos y permite el desarrollo de un perfil de superficie conformada manteniendo las caractensticas anatomicas particulares presentes en el sitio de implantacion.
Se describe en la presente memoria un metodo para digerir una biopsia de tejido, comprendiendo el metodo;
- cargar una biopsia de tejido dentro de un biorreactor conectado con un sistema de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor uno o mas sensores para detectar las condiciones fisiologicas dentro de dicho biorreactor hasta un microprocesador
- proporcionar enzimas de digestion de tejidos; y
- monitorizar y mantener las condiciones adecuadas de digestion dentro de dicho biorreactor durante un penodo de tiempo suficiente para un nivel deseado de digestion de tejido.
Se describe en la presente memoria un metodo para la proliferacion de celulas, comprendiendo dicho metodo; - sembrar celulas en un sustrato o andamio de proliferacion sostenido dentro de un biorreactor conectado con un sistema de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor uno o mas sensores para detectar las condiciones fisiologicas dentro de dicho biorreactor hasta un microprocesador; y
- monitorizar y mantener las condiciones de cultivo adecuadas dentro de dicho biorreactor durante un penodo de tiempo suficiente para un nivel deseado de proliferacion celular.
Se describe en la presente memoria un metodo para la diferenciacion de celulas, comprendiendo dicho metodo; - sembrar celulas sobre un sustrato o andamio de diferenciacion sostenido dentro de un biorreactor conectado con un sistema de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor uno o mas sensores para detectar las condiciones fisiologicas dentro de dicho biorreactor hasta un microprocesador; y
- monitorizar y mantener las condiciones de cultivo adecuadas dentro de dicho biorreactor durante un penodo de tiempo suficiente para un nivel deseado de diferenciacion celular.
Se describe en la presente memoria un metodo para digerir una biopsia de tejido para proporcionar celulas primarias, incluyendo celulas precursoras tales como celulas madre, y despues proliferar y diferenciar las celulas para permitir la formacion de un implante de tejido, comprendiendo el metodo;
- cargar una biopsia de tejido dentro de un biorreactor conectado con un sistema de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor uno o mas sensores para detectar y transmitir las condiciones fisiologicas dentro de dicho biorreactor a un microprocesador;
- proporcionar enzimas de digestion de tejidos;
- monitorizar y mantener las condiciones de digestion adecuadas dentro de dicho biorreactor durante un penodo de tiempo suficiente para obtener celulas desasociadas;
- sembrar las celulas desasociadas sobre un sustrato o andamio de proliferacion sostenido dentro de un biorreactor conectado con un sistema de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor uno o mas sensores para detectar las condiciones fisiologicas dentro de dicho biorreactor hasta un microprocesador;
- monitorizar y mantener las condiciones de cultivo adecuadas dentro de dicho biorreactor durante un penodo de tiempo suficiente para obtener el nivel deseado de proliferacion y expansion celular;
- liberar las celulas expandidas del sustrato o andamio de proliferacion;
- sembrar las celulas expandidas sobre un sustrato o andamio de diferenciacion sostenido dentro de un biorreactor conectado con un sistema de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor uno o mas sensores para detectar y transmitir las condiciones fisiologicas dentro de dicho biorreactor a un microprocesador; y
- monitorizar y mantener las condiciones de cultivo adecuadas dentro de dicho biorreactor durante un penodo de tiempo suficiente para obtener un implante de tejido.
Se describe en la presente memoria un metodo para proporcionar un implante esqueletico, comprendiendo el metodo;
- sembrar celulas osteogenicas y/u osteoprogenitoras sobre un andamio poroso de un biomaterial oseo sostenido dentro de un biorreactor conectado con un sistema de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor uno o mas sensores para detectar las condiciones fisiologicas dentro de dicho biorreactor hasta un microprocesador; y - monitorizar y mantener las condiciones adecuadas dentro de dicho biorreactor durante un penodo de tiempo suficiente para permitir que las celulas osteogenicas y/u osteoprogenitoras proliferen y/o se diferencien a lo largo del andamio para proporcionar un implante de tejido para aplicaciones ortopedicas.
Se describe en la presente memoria un metodo para proporcionar un implante de cartflago, comprendiendo el metodo;
- sembrar celulas condrogenicas y/o condroprogenitoras sobre un andamio poroso de un biomaterial sostenido dentro de un biorreactor conectado con un sistema de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor uno o mas sensores para detectar las condiciones fisiologicas dentro de dicho biorreactor hasta un microprocesador; y - monitorizar y mantener las condiciones adecuadas dentro de dicho biorreactor durante un penodo de tiempo suficiente para permitir que las celulas condrogenicas y/o condroprogenitoras proliferen y/o se diferencien a lo largo del andamio para proporcionar un implante de cartflago.
Se describe en la presente memoria un metodo para el lavado de celulas, que comprende:
- cargar una suspension celular que contiene uno o mas productos qmmicos no deseados en una camara; - recircular de manera continua la suspension celular desde la camara a traves de un modulo de filtracion de flujo cruzado que comprende una membrana impermeable a dichas celulas pero permeable a dichos productos qmmicos no deseados para proporcionar una suspension de celulas lavadas; y
- recoger la suspension de celulas lavadas.
Se describe en la presente memoria un metodo para el enriquecimiento de celulas, que comprende:
- cargar una suspension celular que contiene un volumen excesivo de suspension celular en una camara;
- recircular de manera continua la suspension celular desde la camara a traves de un modulo de filtracion de flujo cruzado que comprende una membrana impermeable a las celulas, pero que permite que el exceso de volumen de la suspension celular sea separado y recogido.
Se describe en la presente memoria un metodo para proporcionar un implante para restablecer el nucleo interno de un disco espinal, comprendiendo el metodo;
- sembrar celulas del nucleo pulposo dentro de un andamio, un andamio poroso de un biomaterial sostenido dentro de un biorreactor conectado con un sistema de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor uno o mas sensores para detectar las condiciones fisiologicas dentro de dicho biorreactor hasta un microprocesador; y - monitorizar y mantener las condiciones adecuadas dentro de dicho biorreactor durante un penodo de tiempo suficiente para permitir la proliferacion y/o la diferenciacion de las celulas del nucleo pulposo y la expresion de componentes de la matriz extracelular caractensticos del nucleo pulposo.
Se describe en la presente memoria un metodo para la preparacion de muestras para evaluacion de la calidad para uso en ingeniena de tejidos clmica, comprendiendo dicho metodo;
- preparacion paralela de implantes primarios y secundarios utilizando el sistema de la invencion como se describe en la presente memoria, donde el implante primario es para implantacion y uno o mas implantes secundarios son para fines de analisis para inferir el calibre del implante primario.
En varias realizaciones el sistema de ingeniena de tejidos descrito en la presente memoria esta bajo el control de uno o mas microprocesadores que pueden estar preprogramados para que el usuario pueda seleccionar un tipo espedfico de entorno (o secuencia de entornos) dentro del biorreactor, tal como la digestion de tejidos, proliferacion celular, diferenciacion celular y/o formacion de constructos de tejido. Esto elimina la intervencion del operador y reduce la posibilidad de contaminacion involuntaria.
El sistema de ingeniena de tejidos de la invencion se puede proporcionar como un "kit". De esta manera, el dispositivo, el modulo o modulos de ingeniena de tejidos, el biorreactor o biorreactores y diferentes componentes de los mismos pueden ser empaquetados y vendidos juntos acompanados de instrucciones y tecnicas de control de calidad.
El sistema de la presente invencion es ideal para uso clmico en hospitales y, en particular, en ambitos quirurgicos en los que, debido a un traumatismo y/o una enfermedad, se desea un implante obtenido por ingeniena de tejidos. Utilizando el presente sistema, los constructos implantables obtenidos por ingeniena de tejidos se pueden preparar de manera segura a partir de tejido autologo obtenido mediante biopsia del paciente, celulas alogenicas o celulas xenogenicas. Las especificaciones de tales constructos de ingeniena de tejidos implantables se pueden adaptar al tipo, tamano y condicion del sitio de implantacion. Ademas, el implante generado por el presente sistema contiene celulas activas que promueven la integracion con el hospedante, mejorando asf la recuperacion del paciente.
En la practica, utilizando un modelo de celulas autologas, se puede obtener una biopsia de tejido del paciente y colocarla directamente en el biorreactor presente en el modulo de ingeniena de tejidos mientras esta en el quirofano. Se selecciona un diseno de biorreactor espedfico dependiendo del tipo y tamano del constructo de tejido deseado. Una vez finalizado el proceso de ingeniena de tejidos, el constructo de tejido producido se puede transportartodavfa contenido en el biorreactor esteril al quirofano para volverlo a implantar en el paciente. El sistema es ideal para proporcionar implantes de tejidos autologos "personalizados" de una manera segura y terapeuticamente eficaz. El sistema y los metodos de la presente invencion no se limitan a proporcionar tecnicas automatizadas de cultivo celular. El sistema de ingeniena de tejidos descrito se mueve mucho mas alla de la expansion celular utilizada en la terapia celular. El sistema de ingeniena de tejidos se puede usar para crear constructos de tejido funcionales donde las celulas presentes son activas, diferenciadas y expresan ya una matriz extracelular. En consecuencia, los constructos de tejido asf producidos tienen un alto estado de desarrollo y, por lo tanto, aceleran la velocidad y mejoran la calidad de la reparacion del tejido en el sitio del implante.
El sistema de la invencion tambien es adecuado para la investigacion farmacologica. Espedficamente, el sistema se puede utilizar en el area de desarrollo de farmacos. Se pueden ensayar nuevas moleculas y farmacos potenciales en celulas y tejidos para determinar los efectos sobre los sucesos celulares y el desarrollo de tejidos. Dichos ensayos se pueden realizar en las celulas/tejidos propios de un paciente para evaluar y posiblemente evitar los efectos secundarios adversos antes de la administracion. Alternativamente, se pueden usar lmeas celulares o tejidos especializados con el sistema como una herramienta clave en el proceso de descubrimiento de farmacos. El sistema se puede programar para monitorizar y evaluar diversas condiciones fisiologicas de las celulas/tejidos presentes dentro del biorreactor y, por lo tanto, proporcionar una indicacion rapida de los efectos biologicos de un farmaco o molecula seleccionados.
El sistema se puede usar tambien para estudios de investigacion y desarrollo donde las tecnicas de ingeniena de tejidos convencionales son diffciles de usar y practicar, y/o en condiciones que requieren extensos registros de diagnostico. Por ejemplo, los estudios en microgravedad que implican la ingeniena de tejidos son diffciles de realizar debido a las propiedades unicas de este entorno. Las tecnicas tradicionales de cultivo de celulas y tejidos simplemente no son viables en este entorno debido a problemas de contencion de fluidos y a la ausencia de transporte de celulas en gravedad. El sistema y los metodos de la invencion son facilmente adaptables al entorno de la microgravedad, ya que el sistema esta completamente sellado para evitar la perdida de fluido y la migracion de las celulas como parte del proceso de ingeniena de tejidos se puede lograr mediante un flujo de fluido controlado.
Otras caractensticas y ventajas de la presente invencion se haran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, ejemplos y dibujos. Sin embargo, se debe entender que la descripcion detallada, los ejemplos espedficos y los dibujos aunque indican realizaciones de los sistemas y metodos descritos en la presente memoria, se dan a modo de ilustracion solamente, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de dicha descripcion detallada.
Breve descripcion de los dibujos
La presente divulgacion se comprendera mejor a partir de la siguiente descripcion con referencia a las figuras, en las que:
Figura 1 ilustra una metodologfa general para la ingeniena de tejidos clmica aplicada al ejemplo de reparacion de cartflago utilizando condrocitos autologos;
Figura 2 muestra un dispositivo integrado de ingeniena de tejidos como se describe en la presente memoria;
Figura 3 muestra una realizacion adicional del dispositivo de ingeniena de tejidos de la Figura 2;
Figura 4 muestra una realizacion adicional del dispositivo de ingeniena de tejidos de la Figura 2;
Figura 5 muestra una vista en corte del dispositivo de ingeniena de tejidos de la Figura 2 que ilustra algunos de los componentes internos y un modulo de ingeniena de tejidos para insercion en el dispositivo;
Figura 6 muestra una vista en corte ampliada del dispositivo de ingeniena de tejidos de la Figura 2 que ilustra un modulo de ingeniena de tejidos insertado;
Figura 7 muestra una vista en perspectiva ampliada del modulo de ingeniena de tejidos y la interfaz con los componentes de la carcasa del dispositivo;
Figura 7 (a) muestra una vista en perspectiva ampliada del biorreactor y de la unidad de la bomba;
Figura 7 (b) muestra una vista en perspectiva ampliada de la unidad de la bomba y el tubo de la bomba asociado; Figura 8 muestra una vista en perspectiva del lado inverso del modulo de ingeniena de tejidos de la Figura 7 y la configuracion interna de la placa de flujo que se une al mismo;
Figura 9 muestra una vista en perspectiva ampliada de los componentes de la mezcla y microcarga asociados con el diseno del biorreactor instrumentado;
Figura 10 muestra el esquema de flujo de fluidos de la ingeniena de tejidos basica;
Figura 11 muestra una realizacion adicional del esquema de flujo de fluido de la ingeniena de tejidos basica.
Figura 12 muestra biorreactor alternativo, sustrato o andamio de proliferacion, andamio de diferenciacion y disenos de monitorizacion del proceso, segun sea aplicable a diferentes escenarios de ingeniena de tejidos;
Figura 13 muestra una vista en perspectiva ampliada del biorreactor del modulo de ingeniena de tejidos, que ilustra la configuracion interna del biorreactor y la trayectoria de flujo de los fluidos;
Figura 14 muestra una realizacion adicional del biorreactor del modulo de ingeniena de tejidos, que ilustra la configuracion interna del biorreactor;
Figura 15 muestra un diseno de biorreactor giratorio;
Figura 16 muestra la realizacion de muestreo esteril del modulo de ingeniena de tejidos;
Figura 17 muestra una realizacion adicional del esquema de flujo de fluido de la ingeniena de tejidos;
Figura 18 muestra otra realizacion mas del esquema de flujo de fluido de ingeniena de tejidos; y
Figura 19 muestra un diseno de biorreactor adecuado para la digestion de tejidos y la recogida de celulas;
Figura 20 muestra un diseno de biorreactor adecuado para la proliferacion celular;
Figura 21 muestra un diseno de biorreactor adecuado para la diferenciacion celular y la formacion de constructos de tejido;
Figura 22 muestra otra realizacion mas del esquema de flujo de fluido de ingeniena de tejidos; y
Figura 23 muestra una realizacion adicional del modulo de ingeniena de tejidos con biorreactores separados para la digestion de tejidos/recogida de celulas, proliferacion celular y diferenciacion de celulas/formacion de tejidos.
Descripcion detallada
La presente invencion se dirige a un dispositivo de ingeniena de tejidos integrado y automatizado para el procesamiento ex vivo de celulas, particularmente celulas autologas, para permitir la proliferacion celular, la diferenciacion celular y la formacion de tejido de una manera eficiente y consistente que requiere una intervencion humana minima. Los constructos de tejido desarrollados dentro del dispositivo pueden ser integrados en un hospedante para ayudar en los procedimientos de reconstruccion del tejido y la posterior recuperacion del paciente. Ademas, la invencion proporciona metodos automatizados para la ingeniena de tejidos utilizando una variedad de celulas de una serie de fuentes diferentes incluyendo celulas autologas obtenidas mediante biopsia del paciente, celulas alogenicas o celulas xenogenicas. Ademas, las celulas pueden ser celulas precursoras, celulas primarias, celulas de una lmea celular inmortal y combinaciones de las mismas.
La metodologfa general y el principio para la ingeniena de tejidos clmica que incorpora el sistema de ingeniena de tejidos y los metodos de la presente divulgacion se ilustran en la Figura 1, utilizando ingeniena de tejido de cartflago autologo como un ejemplo representativo. En tal ejemplo, las celulas (esto es, los condrocitos) se obtienen de una biopsia quirurgica de un paciente y se siembran manual o automaticamente en un sustrato o andamio adecuado (esto es, un soporte de Skelite™). Los condrocitos y el soporte estan presentes dentro de la porcion del biorreactor de un modulo automatizado de ingeniena de tejidos, formando el modulo parte de una estacion de base clmica del sistema de ingeniena de tejidos. Un microprocesador central esta presente dentro del sistema de ingeniena de tejidos y controla y personaliza el ambiente interno del biorreactor, y por lo tanto facilita el crecimiento del tejido en el, dando como resultado la estimulacion del crecimiento celular dentro y sobre el soporte para generar un implante. Los sensores dentro del biorreactor proporcionan informacion al microprocesador para asegurar que las celulas se siembran, se expanden y se diferencian de una manera deseada y controlada para proporcionar un implante de tejido autologo. Una vez que se genera el implante, se retira del biorreactor para la implantacion quirurgica en el paciente. El presente sistema proporciona una forma ventajosa de proporcionar implantes autologos por ingeniena de tejidos de una manera esteril, segura, conveniente y eficaz. Ademas, la capacidad de preparar implantes por ingeniena de tejidos en un ambito clmico permite una considerable flexibilidad en las localizaciones para llevar a cabo el proceso de ingeniena de tejidos. Aunque el sistema se puede utilizar en una localizacion centralizada, el diseno y el funcionamiento del sistema permiten el uso clmico en centros regionales. Dicha disponibilidad generalizada excluye el transporte de material biologico hacia y desde las instalaciones centralizadas de procesamiento de celulas/tejidos, lo que mejora la rentabilidad y la eficiencia del proceso de ingeniena de tejidos a la vez que se evita el transporte, el seguimiento y las complicaciones reglamentarias.
De acuerdo con una realizacion un sistema de ingeniena de tejidos como se muestra en la Figura 2 y en general se indica con el numero de referencia 100. El sistema 100 (se puede denominar alternativamente como un dispositivo) comprende una carcasa 102 que tiene una ranura 104 de insercion para recibir un modulo de ingeniena de tejidos. La ranura 104 de insercion tiene una puerta 106 movil y un mecanismo 108 de cierre. Se proporciona una interfaz 110 de usuario, tal como una pantalla tactil, un teclado o una combinacion de ambos para controlar la operacion del sistema y para mostrar el estado del sistema. Esta presente un sistema 112 de almacenamiento de datos que permite el registro de informacion a traves de una variedad de medios conocidos por los expertos en la tecnica (esto es, ZIP, CDROM, disquete, flashcard). Un enlace 114 de ordenador/comunicaciones proporciona la capacidad de cargar nuevo software, modificar los parametros de control utilizando un ordenador externo, descargar los datos, asf como solucionar problemas y probar el dispositivo. Este enlace permite tambien que el sistema se conecte a los sistemas de informacion electronicos presentes en la clmica. El sistema 100 se alimenta con una entrada 116 de energfa. La Figura 3 muestra una realizacion adicional del sistema 100 que tiene varias puertas 106 de compartimento para acomodar varios modulos de ingeniena de tejidos.
La Figura 4 muestra una realizacion adicional del sistema 100 que tiene puertas 106 de compartimento orientadas de manera horizontal para permitir la orientacion preferencial del modulo de ingeniena de tejidos con respecto al vector de gravedad.
La Figura 5 muestra la configuracion interna del sistema 100 representado en las figuras 2 y 3 con la orientacion vertical de las puertas de compartimento para la insercion vertical de un modulo de ingeniena de tejidos. Se muestra un modulo 118 de ingeniena de tejidos para insercion dentro de la ranura 104 de insercion de la puerta 106 de modulos. El modulo 118 de ingeniena de tejidos se desliza en la carcasa 102 del sistema a traves de un sistema 120 de rail como grna. Despues de la insercion, el modulo 118 se acopla con una o mas unidades de bombas 122 (esto es, peristalticas, de piston, diafragma o rotativas), conectores 124 electricos (esto es, DIN, AMP, PCB, enchufe de tablero) y actuadores 126 de valvulas (esto es, servomotor, impulsion lineal, actuador lineal). Se puede contemplar cualquier sistema de grna adecuado para permitir que el modulo se inserte adecuadamente en el sistema, tal como lo entiende un experto en la tecnica.
Como se ve mejor en la Figura 6, cuando se inserta el modulo 118 de ingeniena de tejidos en la carcasa 102, una serie de actuadores 126 de valvulas se interconectan con las valvulas (que se muestran con mas detalle en las figuras 7 y 7a) sobre el modulo para proporcionar control de flujo. Los conectores 124 electricos proporcionan conexion electrica entre el modulo 118 y una unidad central de microprocesamiento (CPU) 128 mediante un panel 130 posterior electronico. La CPU 128 controla la secuencia operativa, el transporte de fluidos y gases, la gestion de datos de proceso, la monitorizacion del estado del sistema, la interfaz de usuario y el puerto de comunicacion de datos externos. La CPU 128 proporciona control a traves de enlaces electricos con componentes electricos activos y pasivos presentes en el panel posterior 130 y cada uno de los modulos 118 de ingeniena de tejidos insertados.
Los sensores 132 de temperatura (esto es, termopar, RTD o termistor), los sensores 134 de gases (esto es, O2 y CO2) y una unidad 136 de control de ambiente (ECU) se controlan por la CPU 128 para mantener el ambiente (esto es, la temperatura y la atmosfera de gas) dentro de la carcasa 102 utilizando metodos estandar conocidos por los expertos en la tecnica. El ambiente se puede ajustar para cumplir los requisitos del proceso de ingeniena de tejidos, incluyendo el almacenamiento de reactivos a temperatura de refrigeracion (esto es, 4°C), la simulacion de la temperatura corporal nominal (esto es, 37°C) y la disponibilidad de mezclas gaseosas para transporte dentro y fuera del modulo 118 en el caso de que el modulo este equipado con componentes de intercambio de gases (esto es, membranas). Las condiciones gaseosas son monitorizadas por los sensores 134 de gases localizados dentro de la carcasa 102 y los datos se envfan a la CPU 128 a traves del panel 130 posterior electronico. La entrada de gases a la ECU puede ser a traves de la entrada 140 de suministro de gases provista dentro de la carcasa 102 configurada con accesorios estandar. En otras realizaciones, los gases pueden alojarse dentro de la ECU. Los gases para uso dentro del dispositivo incluyen, pero no se limitan a oxfgeno, dioxido de carbono, nitrogeno y mezclas de los mismos. Para contener adecuadamente dichos gases dentro de la carcasa 102, la puerta 106 del modulo esta configurada para proporcionar un cierre hermetico cuando esta cerrada. La carcasa 102 esta aislada con material 142 aislante tal como espuma de poliestireno, aerogel, fibra de vidrio y similares para permitir una regulacion eficiente de las temperaturas internas (esto es, de 4°C a 37°C).
Aunque generalmente se muestra que los sistemas de ingeniena de tejidos descritos en la presente memoria comprenden una carcasa con forma de caja, los expertos en la tecnica entienden que la carcasa puede tener diferentes configuraciones siempre que pueda alojar a los componentes como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, esto incluye pero no se limita a configuraciones abiertas que pueden no requerir partes superiores ni/o laterales.
El modulo 118 de ingeniena de tejidos se ilustra con mas detalle en las figuras 7-9. El modulo 118 de ingeniena de tejidos comprende una columna 200 estructural ngida a la que se fija un biorreactor 202. El biorreactor 202 comprende una carcasa de biorreactor que tiene una tapa 204 y puede ser personalizado con respecto al sustrato o andamio o a lo sustratos o andamios que contiene para permitir la digestion de tejidos, el cultivo celular, la proliferacion celular, la diferenciacion celular, la formacion de implantes tisulares y combinaciones de los mismos. La tapa del biorreactor puede ser desmontable o, como alternativa, puede estar integrada en la carcasa del biorreactor. El biorreactor 202 puede ser por separado desmontable y desechable con respecto a la columna 200 estructural. Para permitir tal desmontaje, el biorreactor 202 y la columna 200 estructural pueden usar accesorios de desconexion de fluido que incluyen la provision para el autosellado de las lmeas de entrada y salida para evitar la perdida de fluidos y para prevenir la contaminacion de los contenidos del biorreactor. El modulo de ingeniena de tejidos completo se puede considerar desechable despues de completar una secuencia de ingeniena de tejidos, ya que esta practica evita la contaminacion que se deriva de un uso anterior. Alternativamente, solo componentes seleccionados del modulo 118 se pueden considerar desechables debido al contacto con fluidos, dejando los componentes no propensos a la contaminacion disponibles para su reutilizacion.
Como se ve en las figuras 7, 7a y 7b, un sistema 206 de contencion de fluidos esta fijo sobre la columna 200 estructural del modulo 118 de ingeniena de tejidos. El sistema 206 de contencion de fluidos se compone de una serie esteril de reservorios 208 flexibles y una tubena 210 flexible para suministrar y recuperar tipos de tejido y fluidos de cultivo celular y productos farmaceuticos hacia y desde el biorreactor 202. Los reservorios 208 pueden ser de configuracion y numero variables segun sea necesario y pueden contener diferentes tipos de medios de cultivo de celulas y tejidos, factores de crecimiento, agentes farmaceuticos y pueden contener tambien residuos de medios y/o de muestras de medios procedentes del biorreactor 202. Los fluidos se cargan o se eliminan del sistema 206 de contencion de fluidos a traves de una serie de puertos 212 de acceso de fluidos. La tubena 210 esta presente para proporcionar una conexion de fluido entre los diversos reservorios 208 y los componentes de control de fluido, tales como las valvulas 214 de control de flujo de fluido. Las valvulas 214 de control de flujo de fluido se abren y se cierran por los actuadores 126 de valvulas. De manera similar, la unidad de bomba 122 interactua con los componentes de bomba desechables presentes en el modulo. Estos componentes de la bomba pueden ser pistones, diafragmas, elementos rotativos o tubos 218 peristalticos, siempre que el funcionamiento de estos componentes no genere condiciones extremas, tales como un esfuerzo excesivo de cizallamiento, que comprometan la viabilidad celular durante la transferencia de las suspensiones celulares. La unidad de bomba 122 y los actuadores 126 de valvulas residen dentro de la carcasa 102. Alternativamente, los actuadores y la unidad de bomba pueden formar parte del modulo de ingeniena de tejidos, sin embargo, esto puede dar como resultado el desecho de estos componentes despues del uso por el paciente. El fluido se transfiere fuera de los reservorios 208 por la accion programada de la unidad de bomba 122 sobre la tubena 218 de la bomba. El fluido se desplaza desde un reservorio 208 de fluido flexible hasta una valvula 214 de fluido a traves de la tubena 210. Una placa 220 de flujo de fluido (como se muestra en la Figura 8) dirige el flujo de fluido entre las diferentes valvulas 214 de control de flujo y la tubena 218 de bomba de la unidad 122 de bomba. El fluido es devuelto a un reservorio 208 seleccionado vacfo para su almacenamiento. Una placa 222 de circuito impreso (PCB) flexible proporciona la interfaz electronica para los componentes electronicos (esto es, los sensores) presentes sobre la columna 200 estructural y/o el biorreactor 202. En el caso de que un sensor indique que un parametro monitorizado (por ejemplo, pH) esta fuera de niveles aceptables, la CPU desencadena una intervencion de control, tal como la sustitucion de los medios dentro del biorreactor.
El modulo de ingeniena de tejidos puede incluir opcionalmente un microprocesador 224 para permitir el procesamiento de datos y el almacenamiento de datos directamente en el modulo. Esta informacion se puede transferir a la CPU 128 central mientras el modulo se inserta en la carcasa 102 y se retiene en la memoria electronica para un acceso posterior una vez que se retira el modulo. Ademas de los datos almacenados mediante el microprocesador o el chip de memoria residente en el modulo de ingeniena de tejidos, el modulo puede incluir tambien opcionalmente un codigo de barras 226, una banda magnetica 228, una memoria electronica (no se muestra) y/o una etiqueta 230 de identificacion para facilitar el seguimiento administrativo dentro de la clmica.
Como se ve en la Figura 8, la placa 220 de flujo de fluido esta asegurada a la columna 200 estructural del modulo 118 de ingeniena de tejidos. La tecnica para la union de la placa de flujo de fluido puede ser, pero no se limita a, un contacto a presion, ajuste a presion, soldadura ultrasonica, union por disolvente y similares, reconociendo que la tecnica adoptada debe permitir el sellado del conjunto para evitar la perdida de fluidos y prevenir la contaminacion. Como se muestra en la vista desmontada en la Figura 8a, la placa 220 de flujo de fluido tiene una ruta 232 de fluido integral para proporcionar un medio para dirigir el flujo asociado con la actuacion de las valvulas 214 de fluido. Se pueden acomodar nuevas rutas de flujo a traves de revisiones de la ruta presente en la placa 220 de flujo. En una realizacion, la placa 220 de fluido puede estar formada integralmente en la columna 200 estructural para formar un unico componente. Se incluye una camara 234 de calentamiento y mezcla de fluido para asegurar que los fluidos que se dirigen al biorreactor estan a la temperatura correcta y se mezclan adecuadamente para no interrumpir los procesos biologicos en curso en el biorreactor. Ademas, un elemento 236 termoelectrico esta presente en el modulo 118 de ingeniena de tejidos para variar la temperatura dentro del biorreactor 202 en comparacion con la temperatura operativa del modulo, como se define por la operacion de la ECU 136. Tal cambio de temperatura puede ser necesario para simular condiciones fisiologicas nominales dentro del biorreactor, mientras que los componentes restantes del modulo de ingeniena de tejidos, particularmente los reactivos y/o las muestras, estan a una temperatura reducida (esto es, refrigeracion) para mantener la viabilidad ffsica, qrnmica y/o biologica. La energfa y el control del elemento termoelectrico se realizan mediante la CPU 128. Ademas de los sensores presentes en el biorreactor, un sensor 238 presente en el modulo de ingeniena de tejidos proporciona informacion a la CPU 128. El sensor y las conexiones termoelectricas se realizan a traves del cableado 240 electrico y el conector 124.
La Figura 9 muestra los aspectos de mezcla y microcarga del modulo 118 de ingeniena de tejidos. El biorreactor 202 tiene un impulsor 260 de mezcla conectado operativamente con un actuador 262 de mezcla y con el diafragma 264 de mezcla. El diafragma de mezcla se incorpora como parte del biorreactor 202 o de la tapa 204 del biorreactor, como se muestra. En funcionamiento, el impulsor 260 de mezcla en combinacion con el actuador 262 de mezcla proporciona la traslacion o la pulsacion del diafragma de mezcla para efectuar la mezcla controlada de los contenidos del biorreactor 202. Idealmente, la naturaleza de la mezcla es tal que evite un alto cizallamiento del fluido que podna comprometer la integridad ffsica de las celulas presentes dentro del biorreactor. Para ciertos protocolos de ingeniena de tejidos, los niveles moderados de cizallamiento del fluido son realmente beneficiosos para el desarrollo satisfactorio de constructos de tejido. En adicion a los componentes de la mezcla, estan presentes un impulsor 266 de impacto y un actuador 268 de impacto. Estos componentes sirven para aplicar un impacto controlado al conjunto del biorreactor a la conclusion de la secuencia de proliferacion para ayudar a la liberacion de celulas desde un sustrato o andamio de proliferacion residente dentro del biorreactor. Tambien se proporciona un impulsor 270 de microcarga en conexion operable con un actuador 272 de microcarga y un diafragma 274 de microcarga. El diafragma 274 de microcarga se incorpora como parte del biorreactor 202 o de la tapa 204 del biorreactor, como se muestra. La localizacion y orientacion del diafragma de microcarga es tal que permite un contacto mtimo con el sustrato o andamio y cualquier celula o tejido asociado presentes en el biorreactor 202. Es sabido que la aplicacion de microcargas es ventajosa para ciertos protocolos de ingeniena de tejidos. El impulsor 260 de mezcla, el impulsor 266 de impacto y el impulsor 270 de microcarga pueden ser cualquiera de una serie de dispositivos electromecanicos tales como solenoides, transmisores lineales, transmisores rotacionales o componentes piezoelectricos. Ademas, es posible que el impulsor 260 de mezcla, el impulsor 266 de impacto, y el impulsor 270 de microcarga, y los actuadores relacionados esten montados sobre la carcasa 200. Alternativamente, los impulsores y actuadores se pueden montar sobre el modulo de ingeniena de tejidos o sobre el biorreactor, siempre que el diseno de los impulsores sea consistente con la naturaleza desechable del modulo de ingeniena de tejidos. Ademas de la provision de estimulacion mecanica, el biorreactor tambien puede estar configurado para introducir estimulacion electrica y/o qmmica del constructo de tejido. En particular, se pueden generar campos electricos en la region del biorreactor para mejorar el transporte celular y/o la formacion de tejido. Los expertos en la tecnica conocen metodos de generacion de campos electricos que incluyen, pero no se limitan a la provision de bobinas electricas.
La Figura 10 ilustra un esquema de flujo de fluido basico para el modulo 118 de ingeniena de tejidos en el que hay una unica camara de cultivo de celulas o tejidos presente dentro del biorreactor 202 (hagase referencia a las descripciones de las figuras 12 y 17 para obtener mas informacion sobre los biorreactores de multiples camaras). La ruta de flujo une el biorreactor 202 a los reservorios 208 que suministran fluido y recogen residuos. Los puertos 212 de acceso de fluido se pueden utilizar para cargar reactivos o separar muestras o fluido de desecho. El flujo se genera mediante la operacion de la unidad de bomba 122 con la direccion del flujo definida por la actuacion de las valvulas 214 de control de flujo espedficas. La perfusion al biorreactor puede ser continua o pulsatil, siempre que el flujo asociado no de lugar a un alto cizallamiento del fluido en regiones que contienen celulas, ya que tales condiciones podnan danar a las celulas o a un constructo de tejido emergente. Se proporciona un bucle 280 de recirculacion para permitir que los contenidos de fluido del biorreactor sean monitorizados o modificados por componentes externos, tales como una membrana 282 de intercambio de gases en lmea, sin necesidad de suministro de nuevo fluido desde los reservorios 208 de fluido. Los componentes del modulo 118 de ingeniena de tejidos dedicado al almacenamiento de fluidos (esto es, los reservorios 208), se mantienen refrigerados a aproximadamente 4°C para facilitar el almacenamiento de fluidos que de otro modo se degradanan a las elevadas temperaturas utilizadas para simular la temperatura corporal (esto es, 37°C). Segun una rutina preprogramada, la CPU 128 controla el funcionamiento de la valvula o valvulas 214 de fluido para permitir que el fluido almacenado en un reservorio 208 sea suministrado a traves de la unidad de bomba 122 a una camara 234 de calentamiento y mezcla antes de entrar en la camara 300 del biorreactor (mostrado en detalle en las figuras 13, 14 y 15). Los fluidos se suministran al biorreactor a traves del puerto 302 de entrada y se eliminan a traves del puerto 304 de salida. Para simular las temperaturas corporales normales para un rendimiento optimo del cultivo de celulas y tejidos, el biorreactor 202, la unidad 122 de bomba y la camara 234 de calentamiento y mezcla se mantienen a aproximadamente 37°C mediante la operacion de un elemento 236 termoelectrico. Sera obvio para los expertos en la tecnica que se pueden usar dispositivos de regulacion termica alternativos para obtener los perfiles termicos deseados para el modulo 118 de ingeniena de tejidos.
La Figura 11 ilustra una variacion del esquema basico de flujo de fluidos donde las valvulas de control de flujo de fluidos estan sustituidas por multiples unidades 122 de bombeo. Esta configuracion proporciona una redundancia operativa mejorada y un numero de componentes reducido. El funcionamiento de un sistema de este tipo requiere que cualquier unidad de bomba inactiva evite el flujo de transferencia no regulado, ya que tal aparicion podna comprometer el suministro controlado de fluidos.
Las figuras 12a-12d ilustran varias configuraciones de biorreactores y formatos alternativos para los sustratos y andamios utilizados para las etapas de proliferacion y diferenciacion implicadas en la operacion del sistema de ingeniena de tejidos. La Figura 12a muestra una serie de disenos de biorreactores intercambiables que abordan diferentes escenarios de bioprocesamiento. El escenario de Tipo I es indicativo de una unica camara 300 basica dentro de un biorreactor 202 que aloja un andamio o sustrato 310 de proliferacion, o un andamio o sustrato de diferenciacion (no se muestra) y es idealmente adecuada para la proliferacion o la diferenciacion. Las celulas se siembran manualmente sobre el andamio 310 o se suministran automaticamente a traves de la ruta de fluido del modulo de ingeniena de tejidos.
El escenario de Tipo II incluye un biorreactor multi-camaras que permite el uso de un andamio 310 (o sustrato) para la proliferacion de la poblacion celular y un andamio 312 de diferenciacion implantable que promueve la formacion de un constructo de tejido. La camara 300 de cultivo/proliferacion esta conectada a la camara 306 de diferenciacion/formacion de tejido a traves de un embudo 314. El embudo sirve para canalizar las celulas liberadas desde el andamio 310 de proliferacion hasta el andamio 312 de diferenciacion implantable. El uso de un filtro 316 en varias localizaciones dentro del biorreactor sirve para regular el tamano de las celulas o agregados celulares que pueden pasar libremente de una camara a la siguiente. Un filtro 316a esta presente aguas arriba del andamio de proliferacion con el fin de regular la poblacion de celulas entrantes para la etapa de expansion celular. Otro filtro 316b esta presente aguas arriba del andamio de diferenciacion nuevamente para controlar la poblacion de celulas que entra en esta etapa de la secuencia de ingeniena de tejidos. Ademas, hay un filtro adicional 316c sobre el puerto 304 de salida para prevenir la perdida de celulas de la camara de diferenciacion/formacion de tejido durante las operaciones que implican la transferencia de fluido a traves del biorreactor. El filtro 316 puede ser una membrana o malla filtrante o un material de filtracion de tipo similar, como es conocido por los expertos en la tecnica.
El escenario de Tipo III combina la digestion de tejido con la subsiguiente proliferacion, diferenciacion y formacion de constructos de tejido. En este escenario, una biopsia 320 de tejido se carga en una camara 322 de digestion presente dentro del biorreactor 202. La digestion de la biopsia de tejido se produce a traves del suministro de enzimas de digestion al biorreactor desde uno de los reservorios 208 de fluido presentes en el modulo de ingeniena de tejidos. Las celulas desasociadas salen de la camara 322 de digestion bajo la influencia de la sedimentacion por gravedad y/o el flujo de fluido a traves de la camara 300 de cultivo/proliferacion, y despues se recogen en el andamio 310 de proliferacion. La transferencia de agregados de tejido fuera de la camara 322 de digestion queda excluida por la presencia de una membrana/malla 316a de filtro en la trayectoria de flujo entre la camara 322 de digestion y la camara 300 de cultivo/proliferacion. Despues de la proliferacion, las celulas se liberan y se transfieren al andamio 312 de diferenciacion implantable a traves del embudo 314 de celulas. Nuevamente, los filtros de membrana/malla estan presentes tanto aguas arriba 316b como aguas abajo 316c del andamio 312 de diferenciacion implantable para asegurar que la poblacion celular correcta esta sembrada sobre el andamio y que las celulas no se pierden inadvertidamente en desechos durante las operaciones de transferencia de fluidos.
En los escenarios anteriores, son posibles varias configuraciones del sustrato o andamio 310 de proliferacion, como se ilustra, por ejemplo, en la Figura 12b. Por ejemplo, una configuracion es un andamio 310a poroso que tiene un gradiente de poros relativamente uniforme. Un andamio 310b de gradiente de poros es un andamio poroso que tiene un gradiente de poros donde el tamano de los poros disminuye a medida que las celulas se desplazan a traves del andamio. Esto promueve una distribucion mas homogenea de las celulas en todo el andamio al terminar el proceso de siembra de las celulas. Se puede usar un andamio 310c con gradiente de poros con orientacion invertida. Alternativamente, se puede usar un andamio 310d de filtro de fibra que es una matriz fibrosa tfpica de compuestos organicos tales como colageno. Tambien es posible utilizar una suspension contenida de microportadores (p. ej., Cytodex™) como sustrato de proliferacion. Ademas, el biorreactor puede tener una sonda 324 optica (se muestra junto con el andamio 310a poroso) sostenida por la CPU 128 para permitir la inspeccion del procedimiento de siembra de celulas que tiene lugar dentro del andamio de proliferacion y para evaluar ademas los sucesos de proliferacion, particularmente el progreso para obtener una capa de celulas confluentes.
Al igual que con la proliferacion, hay una variedad de andamios 312 de diferenciacion implantables que se pueden formar en diferente configuracion y de diversos materiales (esto es, andamios a base de minerales inorganicos tales como el fosfato de calcio, andamios de biopolfmero organico tales como el colageno, etc.) y emplear en el proceso de ingeniena de tejidos. La Figura 12c ilustra una camara 306 multizona de diferenciacion/formacion de tejido que comprende hasta tres andamios 312 de diferenciacion implantables, todos los cuales pueden seguir simultaneamente hacia la formacion de constructos de tejido. Esto permite la preparacion de diferentes tamanos de tejido implantable y el uso de andamios alternativos de diferenciacion implantables para evaluar y maximizar el rendimiento del tejido. Por ejemplo, el andamio 312a es un retteulo poroso formado a partir de un biomaterial oseo tal como Skelite™ para uso en aplicaciones de cartflago y hueso donde el constructo de tejido requiere un anclaje de tejido duro dentro del hueso. El andamio 312a se puede mejorar aun mas mediante el uso de una membrana/malla 326 de andamio que rodea el implante para crear un andamio 312b rodeado de membrana de tal manera que se minimice la perdida de celulas fuera del andamio 312a durante el proceso de siembra de celulas, haciendo asf mas eficiente el proceso de ingeniena de tejidos. Preferiblemente, la membrana puede rodear solo parcialmente el andamio o alternativamente, rodear mas completamente el andamio. Aunque el proposito principal de la membrana/malla 326 de andamio es contener las celulas sobre y dentro del andamio 312 de diferenciacion implantable, la seleccion cuidadosa de las propiedades de la membrana/malla 326 del andamio tal como entienden los expertos en la tecnica permite o limita el paso de entidades moleculares espedficas que pueden tener una influencia marcada sobre el proceso de ingeniena de tejidos a nivel celular.
Una realizacion adicional es una porosidad en gradiente y un andamio 312c rodeado por una membrana que combina las ventajas de la membrana/malla 326 del andamio con un gradiente de poros. El gradiente esta configurado para hacer deliberadamente que las celulas se recojan en la superficie superior con solo una propagacion minima en el andamio. Un grado de porosidad en la superficie se considera ventajoso para la estabilidad del tejido y para el suministro de nutrientes al tejido en desarrollo a traves de la superficie del andamio. Esta estrategia da como resultado el desarrollo de un constructo de tejido bipolar con distintas zonas estratificadas. La zona superior se compone esencialmente de tejido de novo. La zona inferior esta esencialmente libre de celulas o de tejido y permanece como un andamio poroso abierto. La zona interfacial media representa la transicion estructuralmente estable entre el andamio abierto y la capa de tejido de novo. Tal constructo de tejido bipolar es ideal para la reparacion de defectos focales en el carteago articular, ya que la capa superior es un cartflago obtenido por ingeniena de tejidos que proporciona una integracion lateral con el cartflago del hospedante, mientras que la capa inferior proporciona una integracion lateral y axial con el hueso subcondral. La integracion de la capa inferior con el hueso subcondral circundante se puede mejorar ademas por la aplicacion de medula osea al andamio abierto en el momento de la implantacion quirurgica. En las aplicaciones de reparacion de cartflago, es importante que el andamio a base de minerales no se extienda a la superficie articular, ya que esto puede comprometer la funcion de la articulacion. Por consiguiente, se puede emplear un andamio secundario no mineral (no se muestra en las figuras) en la zona superior del cartflago de novo para ayudar en la formacion de constructos de tejido de tamano suficiente para tratar lesiones grandes de cartflago (esto es, hasta 10 cm2 de diametro y 2-3 mm de espesor). Ademas, el andamio secundario se puede configurar para generar constructos con forma que tienen perfiles de superficie articular que se ajustan mas a las caractensticas anatomicas particulares presentes en el sitio de implantacion. Los materiales candidates para el andamio secundario son biopolfmeros sinteticos (por ejemplo, PGA, PLA) o biopolfmeros naturales (por ejemplo, alginato, agarosa, fibrina, colageno, acido hialuronico). Estos andamios secundarios pueden estar en la forma de hidrogeles o andamios preformados tridimensionales.
Son posibles tecnicas alternativas para la preparacion de constructos de tejido bipolar dentro del sistema de ingeniena de tejidos. El andamio 312 de diferenciacion implantable puede estar parcialmente infiltrado con un polfmero biorreabsorbible que limita la siembra de celulas a ciertas regiones del andamio. Esto crea una zona preferencial de formacion de nuevo tejido durante la preparacion del constructo de tejido. Tras la implantacion, el poUmero se reabsorbe, lo que deja vados en el andamio poroso que promueven el anclaje dentro del tejido hospedante. Una configuracion adicional implica un andamio implantable con una porosidad relativamente abierta que se posiciona lejos de la salida de la camara de diferenciacion/formacion de tejido. Durante la siembra de celulas, este espacio abierto permite la recogida de celulas que migran a traves del andamio abierto. A medida que las celulas se acumulan dentro de la camara de diferenciacion/formacion de tejido, tanto el espacio abierto como una porcion del andamio se infiltran con las celulas y, por lo tanto, crean una zona preferencial de formacion de nuevo tejido. El constructo de tejido resultante comprende una zona de tejido de novo que esta desprovista del andamio, una zona media de transicion o zona interfacial que contiene tanto el tejido de novo como el andamio, y una region del andamio poroso que es abierta y esencialmente libre de celulas o tejido.
La Figura 12d ilustra un esquema de monitorizacion del biorreactor por el cual los sensores 216 (esto es, temperatura, pH, gases disueltos, etc.) se integran en la tapa 204 del biorreactor 202 para proporcionar informacion a la CPU 128 del progreso del proceso de ingeniena de tejidos. Ademas, se puede emplear una camara 330 CCD para monitorizar las propiedades opticas del andamio 310 (o sustrato) de proliferacion en busca de evidencia de confluencia inminente (por ejemplo, densidad optica y/o dispersion de la luz en funcion de la densidad celular) de tal manera que la liberacion celular es cronometrada para maximizar el rendimiento celular a partir de la etapa de proliferacion.
La Figura 13 muestra mejor la trayectoria de flujo y la circulacion de fluido dentro del biorreactor 202. Se muestra que el biorreactor 202 tiene un puerto 302 de entrada, un puerto 304 de salida y una cavidad interna que define una camara 300 basica. El fluido fluye desde la placa 220 de flujo de fluido hasta el biorreactor 202 a traves del puerto 302 de entrada y sale a traves del puerto 304 de salida. La tapa 204 del biorreactor se une al biorreactor 202. Se puede usar una variedad de diferente hardware de montaje para mantener la tapa 204 del biorreactor y el biorreactor 202 juntos. La camara 300 puede ser disenada para acomodar uno o mas sustratos o andamios 310. Ademas, el biorreactor 202 se puede subdividir en camaras separadas que permiten las etapas de digestion de tejido, proliferacion, diferenciacion y formacion de tejido. Cada camara puede ser configurada con puertos de entrada y salida que se controlan independientemente a traves de valvulas de control de flujo para un mayor control sobre la secuencia de ingeniena de tejidos. La circulacion de fluido se efectua mediante la activacion de una o mas valvulas 214 de control de flujo y la unidad 122 de bomba, en base a las senales de control de la CPU 128. Dependiendo de las valvulas espedficas activadas, el funcionamiento de la unidad 122 de bomba mueve el fluido desde uno de los reservorios 208 de fluido hasta el biorreactor 202 o permite la recirculacion del fluido dentro del biorreactor. Para procesos biologicos que requieren concentraciones estables de gases disueltos, la recirculacion es ventajosa ya que permite que el fluido pase a traves de una membrana que facilita el intercambio de gases. La naturaleza del intercambio se basa en las concentraciones disueltas en el biorreactor en comparacion con las condiciones externas establecidas por la ECU 136. Se muestra que la tapa 204 del biorreactor tiene un puerto 332 de muestreo y sondas 216 sensoras que estan conectadas operativamente a la camara interior del biorreactor. Alternativamente, el puerto de muestreo se puede proporcionar en otro lugar en la carcasa del biorreactor. El puerto de muestreo permite la separacion o adicion de materiales dentro y fuera del biorreactor. El puerto de muestreo se puede reemplazar o aumentar con una membrana de intercambio de gases segun se requiera.
La Figura 14 ilustra un biorreactor 202 multi-camaras con la tapa 204 del biorreactor retirada para claridad. El puerto de entrada 302 esta conectado a una camara 322 de digestion de tejidos. La configuracion de la camara 322 de digestion de tejidos permite que sea cargada una biopsia del paciente en el biorreactor para su posterior digestion automatizada para producir celulas desasociadas. La ruta de circulacion dentro de la camara de digestion promueve la agitacion suave de la biopsia para evitar areas estancadas que podnan conducir potencialmente a una exposicion excesiva del tejido de la biopsia a las enzimas de digestion circulantes. Ademas, la entrada y/o la salida de la camara de digestion pueden alojar una membrana/malla 316 de filtro (no se muestra) de porosidad variable para proporcionar la clasificacion celular y evitar la liberacion de agregados de tejido parcialmente digeridos. El biorreactor contiene una segunda camara 300 que aloja un sustrato o andamio 310 de proliferacion para recibir celulas para la proliferacion. El andamio de proliferacion se puede formar en diversas geometnas que sostienen tanto la proliferacion bidimensional como tridimensional, y puede comprender varios materiales biocompatibles que promueven la proliferacion celular, tales como los biomateriales de fosfato de calcio (por ejemplo, Skelite™), biopolfmeros o matrices naturales (por ejemplo, colageno). Las celulas liberadas desde la camara 322 de digestion de tejidos, o a traves del puerto 334 de inoculacion celular opcional, acaban dispersadas sobre o dentro del sustrato o andamio 310 de proliferacion y proliferan, aumentando asf la poblacion celular para la posterior diferenciacion celular y formacion de tejido. Se debe tener en cuenta que el proceso se puede finalizar despues de la proliferacion si el objetivo es solamente aumentar la poblacion celular sin diferenciacion adicional. Un andamio 312 de diferenciacion implantable esta presente dentro de una camara 306 de diferenciacion/formacion de tejido en la base del biorreactor 202. Al igual que con el andamio 310 de proliferacion, el andamio 312 de diferenciacion implantable se puede formar en diferentes geometnas y puede estar compuesto de una variedad de materiales biocompatibles que se seleccionan correctamente para cumplir los requisitos biologicos del sitio del implante (por ejemplo, Skelite™ es un implante ideal candidato para sitios esqueleticos).
En funcionamiento, las celulas se liberan desde el sustrato o andamio 310 de proliferacion a traves de una secuencia automatizada, tal como el suministro de enzimas (por ejemplo, tripsina) y la aplicacion cronometrada de impacto al biorreactor a traves del impulsor 266 de impacto (no se muestra). La suspension celular migra bajo las condiciones de flujo controlado presentes en el biorreactor hasta el andamio 312 implantable a traves del embudo 314 celular, con lo cual las celulas se vuelven residentes e inician la secuencia de diferenciacion y formacion de tejido. Al concluir esta secuencia, el tejido asf formado se puede retirar del biorreactor para su posterior implantacion. Los expertos en la tecnica deben entender que la realizacion particular del biorreactor de la Figura 14 es solo un ejemplo representativo de diseno. El biorreactor, en general, se puede configurar de varias maneras con respecto a la forma general, el tamano y la configuracion interna sin efectos adversos sobre la funcion. Por ejemplo, una membrana 336 de intercambio de gases presente en el biorreactor puede ser un componente separado y discreto que esta conectado en lmea con uno o mas tubos 210 de suministro de fluido o la placa 220 de flujo del modulo 118 de ingeniena de tejidos. Ademas, las camaras del biorreactor se pueden aislar una de otra a traves de valvulas de control para evitar la necesidad de que todos los fluidos pasen por todas las camaras. Cuando sea necesario, los pasadizos entre las camaras se pueden abrir para efectuar la transferencia de fluidos y suspensiones celulares. Un ejemplo de una variacion de este tipo que permite una mayor flexibilidad en las condiciones y secuencias de bioprocesamiento se ilustra en la Figura 17. Una configuracion alternativa para permitir la exposicion controlada del andamio 312 de diferenciacion implantable a los contenidos del biorreactor es el uso de una lanzadera 318 que afsla el andamio implantable hasta que sea necesaria la siembra de celulas como parte de la etapa de diferenciacion. Para hacer posible la siembra de celulas, la lanzadera 318 mueve el andamio implantable hasta el flujo de fluido desde una localizacion protegida dentro del biorreactor. Son posibles varias configuraciones de la lanzadera, incluyendo el movimiento basado en la rotacion o el uso de una barrera desmontable que afsla el andamio implantable hasta que se requiera la siembra de celulas.
La Figura 15 ilustra un diseno de biorreactor rotativo que aprovecha la orientacion del vector de gravedad para efectuar el transporte celular por sedimentacion en diferentes fases del proceso de ingeniena de tejidos. Se debe tener en cuenta que aunque esta figura ilustra la rotacion del biorreactor, el objetivo tecnico se puede alcanzar igualmente mediante la rotacion del modulo de ingeniena de tejidos o, de hecho, mediante la rotacion de toda la carcasa 102. Como se muestra en la Figura 15, el biorreactor 202 esta unido a un eje 350 de rotacion que se fija a la columna 200 estructural del modulo 118 de ingeniena de tejidos. Esto proporciona un mecanismo para la rotacion del biorreactor 202 con el fin de que se pueda producir la siembra de celulas mediante sedimentacion sobre superficies de proliferacion seleccionadas dentro de la camara 300 de cultivo/proliferacion. Las superficies de proliferacion del biorreactor pueden estar recubiertas opcionalmente con biomateriales que mejoran la proliferacion (por ejemplo, Skelite™), o puede ser insertado un sustrato o un andamio de proliferacion dedicado en la camara 300 para proporcionar este papel. Como una alternativa al uso de la camara 322 de digestion, se proporciona un segundo puerto 352 de inoculacion en el lado del biorreactor 202 para permitir la siembra directa de celulas. Las celulas se pueden sembrar inicialmente sobre una superficie 354 de proliferacion que es relativamente pequena (Figura 15a). Basandose en el tiempo de proliferacion transcurrido o en la deteccion de la confluencia, las celulas pueden ser liberadas automaticamente y el biorreactor puede ser girado a traves del eje 350 de rotacion, de modo que las celulas liberadas desde la superficie 354 de proliferacion se sedimentaran sobre el area superficial 356 aumentada (Figura 15b), permitiendo una mayor proliferacion. Al finalizar la etapa de proliferacion secundaria, las celulas expandidas se liberan y el biorreactor es girado de nuevo para permitir la siembra del andamio 312 implantable (Figura 15c). Por lo tanto, el eje 350 de rotacion y los tubos 358 flexibles asociados permiten que el biorreactor 202 gire cuando sea necesario para maximizar el uso de la sedimentacion por gravedad en etapas de proliferacion secuencial. Se puede usar un eje de rotacion para agitar o sacudir el biorreactor cuando tales condiciones sean deseables.
En referencia ahora a la Figura 16, el modulo 118 de ingeniena de tejidos se puede adaptar para incluir tecnicas para el muestreo esteril de celulas suspendidas, fluidos de cultivo de tejidos y/o productos de desecho. En esta realizacion, un colector 400 de jeringa y puertos 402 de descarga esteriles se integran en la columna 200 estructural del modulo 118 de ingeniena de tejidos. El tubo 406 microperforado conecta el colector de jeringa al biorreactor 202 a traves del puerto 332 de muestreo. Las jeringas 404 estan conectadas a los puertos 402 de descarga en el colector 400 para permitir la recogida y eliminacion de muestras de fluidos o suspensiones de celulas para su posterior analisis sin comprometer la operacion, integridad o esterilidad del proceso de ingeniena de tejidos. Tambien se proporciona una tecnica de muestreo alternativa mediante la cual una lmea 408 de muestreo del biorreactor fusible se conecta a la tapa 204 del biorreactor. Como esta lmea esta ffsicamente unida al interior del biorreactor y esta muy cerca de los sucesos biologicos en marcha, la lmea contiene fluido sustancialmente de la misma composicion que el presente dentro del biorreactor. En consecuencia, se puede obtener una muestra representativa del fluido del biorreactor fusionando los extremos de la lmea de muestreo y retirando despues la lmea del modulo de ingeniena de tejidos para su posterior analisis. Sera obvio para los expertos en la tecnica que una lmea fusible de este tipo se puede usar como base para una tecnica de muestreo a traves de la operacion automatica de sellar componentes dentro de la carcasa 102.
La Fig. 17 ilustra un esquema de flujo de fluidos mas complejo para el modulo 118 de ingeniena de tejidos en el cual los diferentes requisitos para la digestion, proliferacion y diferenciacion se acomodan en camaras separadas del biorreactor. Estas camaras pueden estar presentes dentro de una serie de biorreactores discretos o combinadas dentro de un solo biorreactor que mantiene un control separado sobre las condiciones de cada camara. Esta presente una camara 322 de digestion de tejidos que contiene una biopsia 320 de tejido. Esta presente una camara 300 de proliferacion que esta configurada para aceptar celulas de la camara 322 de digestion y permite la siembra de un sustrato o andamio 310 de proliferacion. Una camara 306 de diferenciacion/formacion de tejido tambien esta presente y esta configurada para aceptar la cantidad de celulas expandidas desde la camara 300 de proliferacion y permite la siembra de un andamio 312 implantable.
Los reactivos de ingeniena de tejidos (esto es, medios, soluciones enzimaticas, soluciones de lavado, etc.) se cargan en reservorios 208a-208e de fluido. Los productos de desecho en el reservorio 208f de fluidos, que pueden ser aspirados manualmente para fines de muestreo utilizando el puerto de acceso 212f. Los reservorios adicionales de fluidos pueden formar parte del sistema 206 de reservorios de fluidos y ser acomodados en el modulo de ingeniena de tejidos segun se requiera para diferentes procesos de ingeniena de tejidos. El flujo de fluido a traves del sistema esta dirigido por el funcionamiento de las bombas 122a-122k de fluido, de las valvulas 214a-214c de control de flujo, y de las valvulas 410a-410c de flujo unidireccionales (esto es, valvulas de retencion de flujo de fluido). Ademas, las bombas 212a-212k estan configuradas para funcionar como bombas activas o valvulas pasivas (abiertas/cerradas), de acuerdo con las entradas de control de un microprocesador central. Los filtros 316a-3l6d se usan para controlar selectivamente el movimiento de las suspensiones celulares dentro del sistema y para limitar el paso de agregados celulares durante las fases de lavado y transicion del proceso de ingeniena de tejidos. Los niveles de gases disueltos en los medios se mantienen mediante las membranas 282a y 282b de intercambio de gases en lmea. Las jeringas 404a y 404b opcionales estan presentes para permitir la recogida de celulas o el muestreo de medios a traves de los puertos 402a y 402b de descarga esteriles.
En funcionamiento, se inserta una biopsia 320 de tejido en la camara 322 de digestion de tejido entre los filtros 316a y 316b. Un medio de digestion que contiene enzimas se bombea a la camara 322 de digestion de tejidos desde el sistema 206 de reservorios de fluidos para iniciar el proceso de digestion. La digestion se puede mejorar agitando suavemente el medio de digestion dentro de la camara de digestion a traves de un diafragma de mezcla para maximizar la exposicion del reactivo a la biopsia. El medio de digestion se puede recircular de forma continua o periodica a traves de la bomba 122g. Durante la recirculacion, el flujo de fluido se dirige hacia la parte inferior de la camara de digestion, contra el vector de gravedad, para suspender y girar la biopsia de tejido, maximizando asf la eficacia del proceso de digestion. El filtro 316a evita la migracion de celulas y agregados celulares hacia la ruta del fluido. La trayectoria de recirculacion incluye la membrana 282a de intercambio de gases en lmea que proporciona niveles consistentes de gases disueltos en el medio de digestion. La introduccion de una solucion de lavado, contenida en el sistema 206 de reservorios de fluidos, en el fondo de la camara 322 de digestion enjuaga la camara de digestion y lava eficazmente el medio de digestion tanto de las celulas desasociadas como de cualquier agregado de celulas residuales. Despues de un procedimiento de lavado unico o multiple, la aplicacion de flujo inverso transfiere la suspension celular a la camara 300 de proliferacion o a la jeringa 404a opcional para inspeccion o analisis externo. La transferencia de tejido parcialmente digerido fuera de la camara de digestion se evita por el filtro 316b que esta dimensionado para permitir el paso de celulas desasociadas y la retencion de agregados celulares.
Las celulas generadas en el proceso de digestion de una biopsia o disponibles a traves de la carga directa de una suspension celular se siembran a traves de flujo de fluido y/o sedimentacion por gravedad en un sustrato o andamio 310 de proliferacion presente dentro de la camara 300 de proliferacion. Despues de un penodo de reposo para permitir la union de las celulas al sustrato o andamio 310 de proliferacion (para el ejemplo de union de celulas dependientes), se introduce un medio de proliferacion en la camara 300 de proliferacion desde el sistema 206 de reservorios de fluido. Este medio se reemplaza periodicamente con medio de proliferacion fresco procedente del sistema 206 de reservorios a tiempos espedficos durante la fase de proliferacion. Entre las etapas de reemplazo del medio, el fluido dentro de la camara de proliferacion se recircula de forma continua o periodica bajo el control de las bombas 122g, 122h y 122i, mas las valvulas 214a y 214b de control. Las rutas de suministro y recirculacion de fluido incluyen la membrana 282a de intercambio de gases en lmea que proporciona niveles consistentes de gases disueltos en el medio de proliferacion. Durante una etapa de reemplazo del medio, el suministro de medio fresco desde el sistema 206 de reservorios de fluido se equilibra por la separacion de fluido al reservorio 208f de residuos a traves de la bomba 122f. Por lo tanto, a traves de una combinacion de etapas periodicas de reemplazo de medio y de recirculacion controlada, el sistema de ingeniena de tejidos mantiene las condiciones optimas dentro de la camara de proliferacion durante todo el proceso de proliferacion.
Una vez que el cultivo celular se acerca a la confluencia, el medio dentro de la camara 300 de proliferacion es evacuado al reservorio 208f de residuos por la bomba 122f. En este proceso, la separacion del fluido de la camara de proliferacion se equilibra mediante el aire esteril entrante suministrado a traves de una porcion de filtro esteril en la camara de proliferacion (no se muestra) o por la solucion de PBS de lavado entrante desde el sistema 206 de reservorios de fluido. Las celulas se lavan extensamente mediante dos etapas de lavado consecutivas con la solucion de lavado PBS para eliminar el medio de proliferacion residual. Las celulas se liberan posteriormente desde el sustrato o andamio 310 de proliferacion a traves de una secuencia automatizada, tal como el suministro de enzimas (por ejemplo, tripsina) y la aplicacion cronometrada de impacto al biorreactor a traves de un impulso de impacto. Despues de la liberacion celular, el proceso enzimatico se puede detener mediante la administracion de medios que contengan suero que inhibe la actividad de la enzima. Con el fin de recoger las celulas para una siembra eventual sobre el andamio 312 implantable dentro de la camara 306 de formacion de tejido/diferenciacion, la suspension celular es transferida desde la camara 300 de proliferacion al filtro 316c. El filtro 316c evita el paso de celulas, pero permite que el medio continue a traves de la valvula 214b hasta el reservorio 208f de residuos bajo el control de la bomba 122f. Las celulas recogidas se liberan entonces del filtro 316c mediante la aplicacion de flujo inverso y se envfan o bien a la camara 306 de diferenciacion/formacion de tejido o bien a la jeringa 404b opcional para inspeccion o analisis externo.
La siembra de celulas sobre el andamio 312 de diferenciacion implantable se logra transfiriendo las celulas desde el filtro 316c hasta la superficie superior del andamio a traves de la bomba 122j. La perdida de celulas fuera del andamio se minimiza mediante el uso opcional de una membrana o malla 326 de andamio. Despues de la siembra de celulas, se pueden introducir nuevos medios de diferenciacion en la camara 306 de diferenciacion/formacion de tejido a traves de una entrada secundaria mediante el funcionamiento de la bomba 122k. Esta entrada secundaria se ubica lejos de la region del andamio implantable que se siembra con celulas para minimizar el potencial de las tensiones daninas de cizallamiento que podnan comprometer la formacion de agregados celulares. El medio de diferenciacion se reemplaza periodicamente con medio de diferenciacion nuevo procedente del sistema 206 de reservorios en momentos espedficos durante la fase de diferenciacion. Entre las etapas de reemplazo del medio, el fluido dentro de la camara de diferenciacion/formacion de tejido se recircula de forma continua o periodica bajo el control de las bombas 122j o 122k, mas la valvula de control 214b. La ruta para el suministro tanto de medio de diferenciacion fresco como de medio recirculado incluye la membrana 282b de intercambio de gases en lmea que proporciona niveles consistentes de gases disueltos en el medio de diferenciacion. Durante una etapa de reemplazo del medio, el suministro de medio fresco desde el sistema 206 de reservorios de fluido se equilibra mediante la separacion del fluido al reservorio 208f de residuos a traves de la bomba 122f. Las condiciones ambientales dentro de la camara de diferenciacion/formacion de tejido se monitorizan y controlan durante el penodo de tiempo necesario para la formacion satisfactoria del constructo de tejido, en cuyo momento se abre la camara de diferenciacion/formacion de tejido del biorreactor y se recupera el constructo para su posterior uso clmico o de investigacion.
La Figura 18 ilustra una variacion del esquema de flujo de fluido de la Figura 17, donde el andamio o el sustrato 310 de proliferacion dentro de la camara 300 de proliferacion se reemplaza con un sustrato de proliferacion plano de un area superficial relativamente grande. La orientacion del sustrato es tal que la sedimentacion celular bajo gravedad distribuye uniformemente las celulas sobre la superficie de proliferacion. Siempre que se mantenga la orientacion correcta de la camara de proliferacion, el sustrato de proliferacion puede estar en forma de una placa de cultivo de polfmero ngido o un recipiente de pared flexible.
La Figura 19 muestra un biorreactor 500 de digestion de tejidos que contiene una camara 322 de digestion de tejidos de un tamano apropiado para acomodar una o mas muestras de tejido, tales como una biopsia 320 de tejido. El biorreactor 500 consiste en cuatro componentes principales: una base 502 de biorreactor que forma sustancialmente la camara 322 de digestion de tejidos, una tapa 504 de biorreactor extrafble, filtro 316b de puerto y filtro 316a de puerto opcional (no se muestra).
La tapa 504 del biorreactor proporciona un puerto 506 de medios con un filtro 316a de puerto opcional (no se muestra) y un puerto 508 de salida de aire. La base 500 del biorreactor aloja el filtro 316b que permite el paso de las celulas desasociadas fuera de la camara 322 de digestion de tejidos, a traves del puerto 510 de medios, y la retencion de agregados de tejidos y restos de biopsias.
Despues de la insercion de la biopsia 320 de tejido, el biorreactor se llena bajo control automatico con una solucion de enzima a traves del puerto 506 o del puerto 510. La adicion de solucion de enzima a la camara 322 de digestion de tejidos se equilibra mediante el escape de aire a traves del puerto 508. La digestion de la biopsia tiene lugar bajo una recirculacion continua o intermitente de la solucion de enzima, manteniendo de este modo las celulas liberadas en suspension y maximizando la exposicion de la biopsia a los reactivos enzimaticos. Durante la recirculacion, la solucion de enzima entra en el biorreactor a traves del puerto 510 y sale a traves del puerto 506. Esto crea una trayectoria de flujo de fluido en una direccion opuesta al vector de gravedad, de tal modo que la biopsia se suspende y se voltea para maximizar la efectividad de los reactivos enzimaticos. La digestion se puede mejorar agitando suavemente el medio de digestion dentro de la camara de digestion a traves de un diafragma de mezcla (no se muestra). El puerto 508 se puede cerrar durante cualquier etapa de recirculacion, ya que las burbujas de aire presentes en el sistema de flujo de fluido quedan atrapadas en la mitad superior del biorreactor por encima de la entrada 512 del puerto 506. Una vez completada la secuencia de digestion, la aplicacion de flujo inverso de aire o de medio a traves del puerto 506 transfiere las celulas desasociadas a traves del puerto 510 o bien a una camara de proliferacion o bien a un recipiente de recogida de celulas.
La Figura 20 muestra un biorreactor 520 de proliferacion que proporciona una camara 300 de proliferacion. El fondo de la camara de proliferacion consiste en un sustrato 310 de proliferacion adecuado para la union y el crecimiento de las celulas. Para ajustar o mantener los niveles de gases disueltos en el medio, se puede incorporar una membrana permeable a los gases (no se muestra) a la superficie superior de la camara de proliferacion que permite el transporte de gases tales como el oxfgeno y el CO2. Las paredes 522 de separacion dividen el espacio interno de la camara de proliferacion en un sistema de canales que obliga al medio a seguir una ruta predefinida desde el puerto 524 de entrada hasta el puerto 526 de salida.
El diseno del biorreactor de proliferacion tiene varias caractensticas operativas importantes. Se puede obtener una siembra de celulas relativamente uniforme mediante la perfusion de una suspension de celulas a traves del sistema de canales. Ademas, la configuracion del canal asegura que el flujo de medios esta bien distribuido sobre toda la superficie de proliferacion, lo que reduce las posibles regiones de flujo bajo que pueden comprometer la vitalidad de las celulas locales debido a un suministro nutricional reducido o la eliminacion del producto de desecho. Al final de la secuencia de proliferacion, la recirculacion continua o intermitente de una solucion enzimatica apropiada a traves del sistema de canales induce un desprendimiento uniforme de celulas debido al efecto de la reaccion enzimatica y los bajos niveles de estres de cizallamiento generado por el flujo de fluido. En consecuencia, la recogida de celulas se logra sin necesidad de agitacion o rotacion mecanica de la camara de proliferacion.
La Figura 21 muestra un biorreactor 530 de diferenciacion disenado para promover la diferenciacion celular y la subsiguiente formacion de constructos de tejido. El biorreactor consiste en cuatro componentes principales: una base 532 de biorreactor que forma sustancialmente una camara 306 de diferenciacion/formacion de tejido, una tapa 534 de biorreactor desmontable, un tubo 326 de membrana permeable y un andamio 312 de diferenciacion. El tubo 326 de membrana permeable rodea fuertemente el retmulo del andamio para formar un compartimiento 536 de crecimiento de tejido por encima del andamio. El compartimento de crecimiento de tejido se puede extender dentro del andamio segun el tamano de poro del andamio y la colocacion del andamio dentro del tubo de membrana. El tubo de membrana tambien se fija a la entrada 540 del puerto 542, de manera que la membrana esta ffsicamente localizada centralmente dentro de la camara 306 de diferenciacion/formacion de tejido. Esto divide al biorreactor en dos compartimientos independientes, un compartimento 536 de crecimiento de celulas y tejido y un compartimento 538 de medio externo exento de celulas, todo dentro de la camara 306 global de diferenciacion/formacion de tejido. El tamano de poro del tubo de la membrana se selecciona sobre la base de ser impermeable para las celulas pero permeable para los nutrientes, productos de desecho, factores de crecimiento, etc., dentro del medio de cultivo. Si se desea, el tamano del poro de la membrana se puede elegir de manera que se excluya que las moleculas de un cierto peso molecular pasen a traves de la membrana.
La tapa 534 del biorreactor tiene dos puertos 542 y 544 de salida de aire, y un puerto 546 de entrada de medios. La base 532 del biorreactor aloja dos puertos 548 y 550 adicionales. El puerto 546 de entrada es necesario para cargar una suspension celular en el compartimiento 536 de crecimiento de tejido y para la perfusion del constructo de tejido emergente con medio de cultivo. Durante el suministro de la suspension celular al compartimiento vado de crecimiento de tejido, se permite que el aire atrapado salga por el puerto 542. De manera similar, el compartimiento 538 exterior libre de celulas se carga con el medio a traves del puerto 548 o el puerto 550 y el aire atrapado puede escapar a traves del puerto 544.
El diseno del biorreactor de diferenciacion permite la perfusion directa del constructo de tejido a traves del suministro de medios al puerto 546 o el suministro indirecto de medios al compartimiento 538 circundante libre de celulas a traves del puerto 548. Tfpicamente, los puertos 542 y 544 se cierran durante la perfusion y el puerto 550 sirve como salida del medio; sin embargo, son posibles varios escenarios alternativos de suministro de medios basados en requisitos espedficos de ingeniena de tejidos. Un aspecto importante de la estrategia de perfusion de medios es que la membrana 326 permeable, que forma parte del compartimiento de crecimiento de tejido, permite que el medio de cultivo fresco permee al compartimento de crecimiento de tejido sin ninguna perdida de celulas fuera del andamio. Ademas, se proporciona nutricion a las celulas desde practicamente todas las direcciones sin restricciones desde cualquier pared impermeable del biorreactor.
La Figura 22 ilustra una realizacion adicional del esquema de flujo de fluido en el que se pueden emplear los biorreactores de las figuras 19-21. Se encuentra una camara 322 de digestion de tejidos que aloja una biopsia de tejido. Esta presente una camara 300 de proliferacion que esta configurada para aceptar celulas procedentes de la camara 322 de digestion y permite la siembra de un sustrato de proliferacion. Una trampa 560 de burbujas elimina las burbujas de aire de la lmea de entrada a la camara de proliferacion y, por lo tanto, evita que estas burbujas entren en la camara 300 de proliferacion y comprometan potencialmente las poblaciones de celulas localizadas. Un reservorio 562 esta presente para aceptar la cantidad creciente de celulas a partir de la camara 300 de proliferacion y para servir como un recipiente de retencion temporal durante un procedimiento de lavado de celulas y de concentracion de celulas realizado con la ayuda de un modulo 564 de filtracion de flujo cruzado. Tambien esta presente una camara 306 de diferenciacion/formacion de tejido que esta configurada para aceptar las celulas del reservorio 562 despues de la etapa de lavado y concentracion y permite la siembra de un andamio 312 implantable.
Los reactivos de ingeniena de tejidos (esto es, medios, soluciones enzimaticas, soluciones de lavado, etc.) se almacenan en los reservorios 208a-208e de fluido. Los productos de desecho se recogen en el reservorio 208f de fluido. El flujo de fluido a traves del sistema esta dirigido por el funcionamiento de las bombas 122a y 122b de fluido, de las valvulas 214a-214v de control de flujo de acuerdo con las entradas para control de un microprocesador central. Los filtros 566a-566c de aire permiten la transferencia de aire dentro o fuera del sistema segun se requiera durante la operacion sin comprometer la esterilidad del sistema. Ademas, las membranas de intercambio de gases en lmea (no se muestran) se pueden desplegar en varias localizaciones dentro de las rutas de flujo del fluido para facilitar el control de los gases disueltos en el medio de cultivo.
En funcionamiento, se inserta una biopsia 320 de tejido en la camara 322 de digestion de tejido. Se bombea un medio de digestion que contiene enzimas a la camara 322 de digestion de tejido desde un reservorio 208 de fluido para iniciar el proceso de digestion. El medio de digestion puede ser recirculado de manera continua o periodica a traves de la bomba 122a, manteniendo asf en suspension las celulas liberadas y maximizando la exposicion del reactivo a la biopsia. La introduccion de un medio de cultivo de proliferacion desde uno de los reservorios 208 de fluido en la parte superior de la camara 322 de digestion transfiere la suspension celular a la camara 300 de proliferacion y simultaneamente diluye la solucion de enzima hasta una concentracion que sea tolerable para la proliferacion celular en la camara 300 de proliferacion. La transferencia de tejido parcialmente digerido fuera de la camara de digestion se evita por el filtro 3l6b del puerto que esta dimensionado para permitir el paso de celulas desasociadas y la retencion de agregados celulares. Las celulas generadas a partir del proceso de digestion de la biopsia se distribuyen homogeneamente en toda la camara 300 de proliferacion o bien por la recirculacion de la suspension celular mediante la activacion de las valvulas 214h, 214J, 2141 y la bomba 122a, o bien por la aplicacion automatica de agitacion suave del biorreactor de proliferacion.
Despues de un penodo de reposo para permitir la union de las celulas al sustrato de proliferacion, el medio de proliferacion se reemplaza periodica o continuamente con medio de proliferacion fresco procedente de uno de los reservorios 208 de fluido. Durante una etapa de reemplazo del medio, el suministro de medio fresco desde el sistema 208 de reservorios de fluido se equilibra por la separacion del fluido al reservorio 208f de residuos a traves de la valvula 214i.
Una vez que el cultivo celular se aproxima a la confluencia, el medio dentro de la camara 300 de proliferacion es evacuado al reservorio 208f de residuos. En este proceso, la separacion del fluido desde la camara de proliferacion se equilibra por el aire esteril entrante suministrado a traves de un filtro esteril 566a o por la solucion de lavado de PBS entrante desde uno de los reservorios 208 de fluido.
Las celulas se liberan posteriormente desde el sustrato de proliferacion a traves de una secuencia automatizada, tal como el suministro de enzimas (por ejemplo, tripsina) y la recirculacion cronometrada de la suspension celular o la aplicacion cronometrada de impacto o agitacion al biorreactor a traves de un impulso de impacto. Para eliminar las enzimas y recoger las celulas en un volumen relativamente pequeno de medio para su posterior transferencia a la camara 306 de diferenciacion celular, la suspension celular se transfiere desde la camara 300 de proliferacion al reservorio 562. La suspension celular se recircula entonces continuamente mediante las valvulas 214m, 214j, 214q y la bomba 122a a traves del modulo 564 de filtracion de flujo cruzado. La membrana en el modulo 564 de filtracion de flujo cruzado evita la perdida de celulas, pero permite que un cierto porcentaje de medio (permeato) sea separado a traves de la valvula 214o al reservorio 208f de residuos. La consecuencia es una reduccion del volumen de la suspension y/o la dilucion de cualquier enzima presente, siempre que la separacion del permeato se compense con el suministro de medio fresco desde uno de los reservorios 208 de fluido. El flujo continuo reduce el potencial de que las celulas queden atrapadas dentro de la membrana del modulo 564 de flujo cruzado.
La siembra de celulas sobre el andamio 312 de diferenciacion implantable se logra transfiriendo las celulas lavadas desde el reservorio 562 a la superficie superior del andamio mediante las valvulas 214m, 214j, 214p, y la bomba 122a. La perdida de celulas fuera del andamio se minimiza mediante el uso opcional de una membrana o malla 326 de andamio. Despues de la siembra de celulas, se puede introducir nuevo medio de diferenciacion en la camara 306 de diferenciacion/formacion de tejido a traves del funcionamiento de la bomba 122b. El medio de diferenciacion se reemplaza periodica o continuamente con medio de diferenciacion fresco desde el sistema de reservorios. Durante una etapa de reemplazo de medio, el suministro de medio fresco desde uno de los reservorios 208 de fluido se equilibra por la separacion del fluido al reservorio 208f de residuos mediante la valvula 214u. Entre las etapas de reemplazo del medio, el fluido dentro de la camara de diferenciacion/formacion de tejido se recircula de forma continua o periodica bajo el control de la bomba 122b, la valvula 214t, y la valvula 214r para perfusion a traves del constructo de tejido o la valvula 214s para el suministro fuera de la membrana 326 del andamio. Esta ruta secundaria de suministro de fluido fuera de la membrana del andamio se localiza lejos de la region del andamio implantable que se siembra con celulas para minimizar el potencial de danos por esfuerzos de cizallamiento que podnan comprometer la formacion de agregados celulares. Al igual que con las realizaciones anteriores del esquema de flujo de fluido, las condiciones ambientales dentro de la camara de diferenciacion/formacion de tejido se monitorizan y controlan durante el penodo de tiempo necesario para la formacion satisfactoria del constructo de tejido, en cuyo momento se abre la camara de diferenciacion/formacion de tejido del biorreactor y se recupera el constructo para su posterior uso clmico o de investigacion.
La Figura 23 ilustra una realizacion de un modulo de ingeniena de tejidos descrito en la presente memoria que comprende tres biorreactores. La Figura 23 ilustra el uso combinado del biorreactor de digestion de tejidos de la Figura 19 que tiene una camara 322 interna de digestion de tejido, con el biorreactor de proliferacion de la Figura 20 que tiene una camara 300 de proliferacion, y el biorreactor de diferenciacion de la Figura 21 que tiene una camara 306 de diferenciacion. Estos biorreactores estan conectados de manera operativa a un modulo de ingeniena de tejidos para proporcionar las etapas automatizadas implicadas en la secuencia de digestion de tejidos, proliferacion celular, diferenciacion celular y formacion de tejido.
Los expertos en la tecnica entenderan que el sistema automatizado de ingeniena de tejidos puede comprender uno o mas biorreactores sostenidos en una carcasa por un soporte estructural o por medios equivalentes. Cuando comprende dos o mas biorreactores, los biorreactores pueden estar conectados operativamente o alternativamente, ser independientemente operables y/o cooperativamente operables. Ademas, cada biorreactor puede comprender diferentes camaras internas o el mismo tipo de camaras. En una realizacion adicional, las camaras y/o los biorreactores estan conectados operativamente para proporcionar el intercambio de fluidos, celulas y/o tejidos entre las camaras y/o los biorreactores.
El sistema automatizado de ingeniena de tejidos de la invencion es facil de preparar para su uso. La siguiente secuencia es un ejemplo representativo para la preparacion de un implante de cartflago basado en el uso del sistema de ingeniena de tejidos de la presente invencion para la reparacion de defectos focales en el cartflago articular. Para esta aplicacion, se requieren las fases de digestion del tejido, la proliferacion celular y la diferenciacion celular/formacion de tejido. Las tres fases del proceso de ingeniena de tejidos se pueden realizar por medio de un unico biorreactor con multiples camaras o tres biorreactores separados y discretos, como se muestra en las figuras 17, 18 y 22.
Antes de iniciar la secuencia de ingeniena de tejidos, se cargan las siguientes composiciones de reactivos en los reservorios 208a a 208e en el modulo de ingeniena de tejidos a traves de los puertos 212 de inyeccion de reservorio. El reactivo A se utiliza para la digestion de condrocitos derivados de pequenas biopsias de cartflago articular humano. Los reactivos B, D y E se utilizan para la proliferacion celular. El reactivo C se utiliza para la diferenciacion y la formacion de constructos de tejido.
• Reactivo A: Medio de digestion: DMEM/F-12, FCS al 5% o suero autologo, 1 pg/ml de insulina, 50 pg/ml de acido ascorbico, 100 UI/100 pg/ml de penicilina/estreptomicina, Tampon Hepes al 2,5%, pronasa al 0,1% (1 mg/ml) y colagenasa al 0,025% (0,25 mg/ml), pH 7,4
• Reactivo B: Medio de proliferacion: DMEM/F-12, FCS al 10% o suero autologo, 10 pg/ml de acido ascorbico, 100 UI/100 pg/ml de penicilina/estreptomicina, Tampon Hepes al 2,5%, pH 7,4
• Reactivo C: Medio de diferenciacion: DMEM/F-12, FCS al 10% o suero autologo, 1 pg/ml de insulina, 50 pg/ml de acido ascorbico, 100 UI/100 pg/ml de penicilina/estreptomicina, Tampon Hepes al 2,5%, pH 7,4
• Reactivo D: Solucion de lavado PBS: NaCl 137 mM, KCl 3,7 mM, Na2HPO4*2H2O 8 mM, KH2PO41,5 mM, en H2O, pH 7,4
• Reactivo E: Solucion de liberacion de celulas: solucion de tripsina 1x
Los reactivos anteriores son nominalmente estables durante penodos de hasta varias semanas cuando se almacenan a 4°C sobre el modulo de ingeniena de tejidos dentro del envolvente del sistema. Las enzimas se pueden conservar liofilizadas dentro del modulo de ingeniena de tejidos y se pueden hidratar en el momento de su uso. Esto permite una adaptacion personalizada de las enzimas para la aplicacion espedfica de la ingeniena de tejidos.
Se obtiene una biopsia de cartflago humano (100-500 mg) por medio de una cirugfa artroscopica de un area que no lleva carga sobre el condilo femoral medial superior. Antes de cargar la biopsia en la camara de digestion, se pesa la biopsia y se registra la masa para la entrada posterior de datos en la secuencia de programacion para la unidad base. Despues de la determinacion de la masa, se coloca la biopsia dentro de la camara de digestion y se cierra el biorreactor listo para que el modulo de ingeniena de tejidos sea insertado en la unidad base del sistema de ingeniena de tejidos. Una vez que se ha instalado el modulo de ingeniena de tejidos, se programa entonces la CPU de la unidad base a traves de la interfaz de usuario de acuerdo con el tamano de la biopsia y la secuencia de ingeniena de tejidos deseada.
Al inicio de la secuencia automatizada programada, se empieza la digestion de la biopsia con pronasa/colagenasa por una infusion de Reactivo A en la camara de digestion del biorreactor a traves de la activacion de las valvulas de flujo necesarias y el funcionamiento de la bomba de suministro de fluido. La digestion se realiza a 37°C durante un penodo de 16 horas bajo recirculacion continua o intermitente del Reactivo A para mantener las celulas en suspension y para maximizar la exposicion del reactivo a la biopsia. Esto puede ir seguido por dos etapas consecutivas de lavado con Reactivo D. Al final de esta secuencia de digestion, se obtienen aproximadamente 200.000 a 500.000 celulas por 100 mg de tejido de biopsia.
En este punto, se puede recuperar una muestra de las celulas digeridas a traves del puerto de muestreo para evaluar el numero y la vitalidad de las celulas. Esta evaluacion biologica generalmente se evalua fuera del sistema por medio de un hemocitometro despues de tenir con azul de tripano.
Bajo el control automatizado de la unidad base, las celulas desasociadas se suministran al sustrato o andamio de proliferacion presente en la camara de proliferacion del biorreactor para establecer una densidad de siembra de celulas entre 2000 celulas/cm2 y 15000 celulas/cm2. Para efectuar la proliferacion continua hacia la confluencia, se suministra el Reactivo B desde un reservorio sobre el modulo de ingeniena de tejidos de acuerdo con un perfil de flujo preprogramado. La temperatura y el pH del medio se monitorizan para detectar desviaciones de 37°C y pH 7,4, respectivamente. Ademas, se evalua el estado de la proliferacion celular indirectamente mediante la deteccion del recambio metabolico en funcion del tiempo (p. ej., pH, O2, CO2 , acido lactico y consumo de glucosa). El nivel de confluencia tambien es sostenido por monitorizacion optica a traves de una camara CCD conectada a la sonda de proliferacion incorporada dentro de la camara de proliferacion. Una vez que se determina la confluencia inminente ya sea empmcamente o por medio de una monitorizacion basada en sensores, las celulas se lavan extensamente mediante dos etapas de lavado consecutivas con Reactivo D para eliminar todo medio de cultivo.
La separacion de las celulas propagadas del sustrato o andamio de proliferacion se inicia por la transferencia de Reactivo E desde un reservorio dentro del modulo de ingeniena de tejidos a la camara de proliferacion. Esta solucion de tripsina esta presente durante 5 minutos dentro del biorreactor, tras lo cual la reaccion se detiene mediante la adicion automatica de Reactivo B que contiene FCS o suero autologo que inhibe la actividad de la enzima. La liberacion celular desde el sustrato o andamio de proliferacion se mejora aun mas por la aplicacion de un impacto de baja frecuencia al biorreactor a traves del impulso de impacto o la recirculacion de la solucion de tripsina. Una vez liberadas, se realiza una etapa de lavado y filtrado de las celulas para eliminar la tripsina y para concentrar la suspension celular para su posterior transferencia al andamio presente en el biorreactor de diferenciacion/formacion de tejido.
Para esta solicitud, una configuracion bipolar es ideal ya que proporciona una capa de cartflago en la superficie articular que esta conectada a una capa de andamio porosa, formada por un biomaterial oseo tal como Skelite™, para la integracion con el hueso subcondral. La preparacion del constructo bipolar se puede lograr a traves de uno de varios procedimientos alternativos. El andamio de diferenciacion se puede formar con un gradiente de densidad de poros que atrapa preferiblemente las celulas en un extremo, creando una region de alta concentracion celular que promueve la formacion de la capa de cartflago. Alternativamente, el andamio se puede recubrir previamente en un extremo con gel de fibrina para evitar la union celular y la formacion de matriz de cartflago en esta region. Con cualquiera de estas estrategias, la perdida de celulas fuera del andamio se minimiza mediante el uso opcional de una membrana o malla circundante. La velocidad de flujo para el suministro de celulas es baja para asegurar que el cizallamiento del fluido no dana la poblacion de celulas proliferadas. Despues de la finalizacion de la etapa de siembra de las celulas, el flujo de fluido a traves de la camara de diferenciacion/formacion de tejido se detiene para permitir la formacion de agregados celulares, ya que como es sabido esto es crucial en terminos de diferenciacion satisfactoria. Despues de esta etapa importante, la perfusion de Reactivo C se realiza durante el penodo de tiempo necesario para la formacion y maduracion del tejido con el fin de suministrar nutrientes a las celulas de manera optima y eliminar los productos de desecho. Despues de este penodo de cultivo, las celulas habran producido una matriz extracelular que es sustancialmente identica a la del cartflago articular humano nativo. Las propiedades del tejido formado se pueden confirmar mediante metodos bioqmmicos externos independientes, tales como la tipificacion del colageno mediante SDS-PAGE y expresion genica. Como etapa final del procedimiento, el sistema de ingeniena de tejidos proporciona una notificacion a traves de la interfaz del usuario de que la secuencia esta completa y que el modulo de ingeniena de tejidos se puede retirar para recoger el implante. El modulo de ingeniena de tejidos o una forma desmontable del biorreactor se puede transportar al quirofano, tras lo cual se retira la tapa del biorreactor en un campo esteril y se extrae el implante para uso quirurgico.
Cabe senalar que el sistema de la invencion esta limitado al uso con un tipo particular de celula o tejido autologo, alogenico o xenogenico. Por ejemplo, se puede preparar un implante esqueletico para uso en la reconstruccion de defectos oseos. En esta solicitud, se podna utilizar la medula osea como la fuente de las celulas primarias y/o precursoras requeridas para el procedimiento de ingeniena de tejidos. En consecuencia, no hay ningun requisito para realizar la digestion de tejidos; por lo tanto, el biorreactor puede ser del tipo que solo sostiene la proliferacion y la diferenciacion. Dependiendo de la poblacion de celulas disponible y del tamano requerido del implante, puede que no se requiera una proliferacion uniforme. En este caso, la configuracion del biorreactor se puede dirigir a la fase unica de la diferenciacion celular y la formacion de tejido en curso. El constructo de tejido final estana compuesto por un andamio implantable, que puede estar compuesto de un biomaterial oseo tal como Skelite™, con celulas oseas activas que recubren los poros abiertos del andamio y que dejan activamente una nueva matriz mineralizada (osteoide). Dicho implante se integrana rapidamente en el sitio del implante, acelerando asf el proceso de recuperacion.
Como un ejemplo adicional de la flexibilidad del sistema, se pueden preparar vasos sangumeos por ingeniena de tejidos utilizando celulas endoteliales expandidas de cultivo sembradas sobre andamios flexibles de una geometna tubular en la fase final de diferenciacion.
El sistema integrado de ingeniena de tejidos de la presente invencion tiene varias ventajas en comparacion con los metodos y sistemas de la tecnica anterior. En particular, la operacion llave en mano del dispositivo permite realizar procedimientos complejos de ingeniena de tejidos bajo control automatizado en la clmica, lo que evita la necesidad de transportar celulas a instalaciones centralizadas para el procesamiento biologico. El sistema es facil de usar y evita los procedimientos existentes de cultivo de tejidos humanos que necesitan mucho tiempo y son costosos y que a menudo llevan a la contaminacion y fallo de los implantes. Los modulos de ingeniena de tejidos y los conjuntos de subsistemas asociados se pueden personalizar para el tipo de celula o tejido que se va a cultivar y se pueden fabricar a partir de cualquier material adecuado biocompatible y tolerante a la esterilizacion. El modulo entero de ingeniena de tejidos o sus componentes espedficos son reemplazables y se pueden considerar desechables. El modulo de ingeniena de tejidos se puede proporcionar en un paquete esteril de un solo uso que simplifica la configuracion y el funcionamiento del sistema en ambitos clmicos.
Los expertos en la tecnica entenderan que el modulo y el dispositivo de ingeniena de tejidos de la presente invencion se pueden fabricar en diferentes tamanos, formas y orientacion. El dispositivo se puede fabricar para incorporar un solo modulo de ingeniena de tejidos o multiples modulos en formatos verticales u horizontales. Por consiguiente, se pueden hacer subconjuntos que correspondan al formato espacial seleccionado para el dispositivo de ingeniena de tejidos. Por lo tanto, diferentes tipos de ingeniena de tejidos se pueden llevar a cabo simultaneamente en un solo dispositivo siendo cada secuencia de ingeniena de tejidos monitorizada y controlada automaticamente de forma individual. Tambien esta dentro del alcance de la invencion tener una pluralidad de sistemas automatizados de ingeniena de tejidos que operan y estan conectados en red bajo el control de un ordenador remoto.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo para (a) la proliferacion automatizada de celulas autologas, alogenicas o xenogenicas para uso en procedimientos de ingeniena de tejidos, comprendiendo dicho metodo:
- sembrar las celulas sobre o dentro de un sustrato o andamio de proliferacion sostenido dentro de un biorreactor (202) conectado con un sistema (206) de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor (202) sensores (132, 134) para detectar los cambios en las condiciones ambientales que comprenden pH y temperature y gases disueltos dentro de dicho biorreactor (202), cuyos sensores (132, 134) generan senales que son monitorizadas por un microprocesador (128), y cuyo microprocesador (128) controla y personaliza el ambiente interno del biorreactor (202) para cumplir asf los requisitos de proliferacion celular dentro del biorreactor (202);
- monitorizar y mantener condiciones adecuadas de cultivo dentro de dicho biorreactor (202) durante un periodo de tiempo suficiente para un nivel deseado de proliferacion celular, en donde el estado de proliferacion celular es evaluado indirectamente por la deteccion del recambio metabolico en funcion del tiempo y la evaluacion del estado de proliferacion celular comprende determinar el nivel de confluencia mediante monitorizacion a base de sensores.
2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas (b) la diferenciacion automatizada de celulas, comprendiendo dicho metodo:
- sembrar las celulas sobre o dentro de un sustrato o andamio de diferenciacion sostenido dentro del biorreactor (202) conectado con un sistema (206) de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor (202) sensores (132, 134) para detectar los cambios en las condiciones ambientales que comprenden pH y temperatura y gases disueltos dentro de dicho biorreactor (202), cuyos sensores (132, 134) generan senales que son monitorizadas por el microprocesador (128), y cuyo microprocesador (128) monitoriza el progreso de la diferenciacion celular y ajusta las condiciones ambientales del biorreactor (202) para cumplir asf los requisitos de diferenciacion celular dentro del biorreactor (202);
- monitorizar el progreso de la diferenciacion celular dentro del biorreactor (202) para mantener asf condiciones adecuadas de cultivo dentro de dicho biorreactor (202) durante un periodo de tiempo suficiente para un nivel deseado de diferenciacion celular.
3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende ademas (c) la produccion de un constructo de tejido, comprendiendo dicho metodo:
- sembrar las celulas sobre o dentro de un andamio, estando sostenido el andamio dentro de un biorreactor (202) conectado con un sistema (206) de reservorio y flujo de medios, teniendo dicho biorreactor (202) sensores (132, 134) para detectar los cambios en las condiciones ambientales que comprenden pH y temperatura y gases disueltos dentro de dicho biorreactor (202), cuyos sensores (132, 134) generan senales que son monitorizadas por un microprocesador (128), y cuyo microprocesador (128) monitoriza el progreso de desarrollo de tejido y ajusta las condiciones ambientales del biorreactor (202) para cumplir asf los requisitos para la formacion de tejido dentro del biorreactor (202);
- monitorizar el progreso de desarrollo de tejido para mantener asf las condiciones adecuadas de cultivo dentro de dicho biorreactor (202) durante un periodo de tiempo suficiente para que dichas celulas expresen una matriz extracelular que proporciona el soporte estructural para el constructo de tejido.
4. El metodo de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en donde las medidas de pH, O2, CO2 y consumo de glucosa se utilizan para detectar el recambio metabolico.
5. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la monitorizacion basada en sensores comprende la monitorizacion optica mediante una camara CCD.
6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde el constructo de tejido formado es un implante de cartflago, implante esqueletico o un nucleo interno de un disco espinal.
7. Un sistema automatizado de cultivo celular y/o de ingeniena de tejidos que comprende:
- uno o mas biorreactores (202) comprendiendo cada uno de dichos biorreactores (202) una o mas camaras adecuadas para facilitar las funciones fisiologicas celulares y/o la generacion de una o mas poblaciones de celulas y/o constructos de tejido en un modo de proceso secuencial y/o concurrente dentro de y/o entre las camaras y/o biorreactores (202) deseados, durante el uso; en donde dichos uno o mas biorreactores (202) estan conectados operativamente con el sistema (206) de reservorio y flujo de medios,
- sensores (132, 134) asociados con dichos uno o mas biorreactores (202) para detectar cambios en las condiciones ambientales que comprenden el pH y la temperatura y los gases disueltos dentro de dicho biorreactor (202), y cuyos sensores (132, 134) generan senales que son monitorizadas por un microprocesador (128);
- medios de deteccion del recambio metabolico en funcion del tiempo para evaluar el estado de proliferacion celular; - medios de monitorizacion a base de sensores para determinar el nivel de confluencia;
- un microprocesador (128) para efectuar dicho procesamiento biologico de modo secuencial y/o concurrente durante el uso, y que durante el uso controla y personaliza el ambiente interno del biorreactor (202) para cumplir asf los requisitos de las diferentes fases de cultivo celular y/o desarrollo de tejido dentro del biorreactor (202), en respuesta a la monitorizacion de las senales generadas por los sensores (132, 134);
en donde, en uso, el microprocesador (128) monitoriza el progreso de la proliferacion de celulas autologas, alogenicas o xenogenicas, y opcionalmente, la diferenciacion celular y/o el desarrollo de tejido, y mantiene condiciones de cultivo adecuadas dentro de dicho biorreactor (202) durante un periodo de tiempo suficiente para un nivel deseado de proliferacion celular y opcionalmente, durante un periodo de tiempo suficiente para un nivel deseado de diferenciacion celular y/o durante un periodo de tiempo suficiente para que dichas celulas expresen una matriz extracelular que proporciona el soporte estructural para el constructo de tejido.
8. El sistema de la reivindicacion 7, en donde la deteccion del recambio metabolico en funcion del tiempo comprende medir el pH, O2, CO2 y el consumo de glucosa.
9. El sistema de la reivindicacion 7, en donde la monitorizacion basada en sensores comprende la monitorizacion optica, en donde los medios de monitorizacion optica comprenden una camara CCD.
10. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde dichas una o mas camaras se seleccionan del grupo que consiste en una camara de digestion de tejidos, camara de cultivo/proliferacion, camara de diferenciacion/formacion de tejido y combinaciones de las mismas.
11. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde dichas camaras y/o biorreactores (202) se proporcionan conectados operativamente.
12. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde al menos uno de dichas camaras y/o biorreactores (202) son uno al menos independientemente operable y cooperativamente operable.
13. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde al menos una de dichas camaras y/o biorreactores (202) estan conectados operativamente para proporcionar el intercambio de uno o mas fluidos, celulas y tejidos durante el uso.
14. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en donde dichos dos o mas camaras y/o biorreactores (202) son operables en paralelo y/o en serie.
15. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, en donde dicho sistema comprende ademas uno o mas sensores (132, 134) adecuados para monitorizar, durante el uso, los parametros relacionados con dichas funciones celulares fisiologicas y/o la generacion de poblaciones celulares y/o constructos de tejido en dicho modo de procesamiento secuencial y/o concurrente.
16. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, en donde durante el uso, dicho sistema realiza y/o proporciona uno o mas de lo siguiente:
- recepcion/almacenamiento esteril de biopsia de tejido;
- mezcla y suministro automatizados de reactivos de digestion;
- monitorizacion de un proceso de digestion;
- digestion de tejido de biopsia para producir celulas desasociadas;
- clasificacion y seleccion de celulas;
- siembra de celulas sobre o dentro de un sustrato o andamio de proliferacion;
- mezcla y suministro de reactivos de proliferacion;
- proliferacion de celulas para aumentar las poblaciones de celulas;
- monitorizacion de las condiciones celulares;
- deteccion de confluencia;
- liberacion controlada desde un sustrato o andamio de proliferacion;
- lavado de celulas y recogida de celulas;
- siembra de celulas sobre o dentro de un andamio o matriz de ingeniena de tejidos;
- mezcla y suministro de reactivos de diferenciacion;
- monitorizacion de las condiciones de cultivo de celulas/tejidos;
- diferenciacion celular para permitir la especializacion de la actividad celular; - formacion de tejido;
- estimulacion mecanica y/o bioqmmica para promover la madurez tisular; - recogida de residuos;
-recogida de los constructos/implantes de ingeniena de tejidos; y
- almacenamiento y transporte de celulas y/o tejido.
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