KR20210125510A - 자동화 생물반응기에서 사용하기 위한 세포 농축 방법 및 장치 - Google Patents

자동화 생물반응기에서 사용하기 위한 세포 농축 방법 및 장치 Download PDF

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에리카 맥아피
사마타 반다페일
옐링 쉬
이튼 아브라함
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론자 워커스빌 아이엔씨.
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Abstract

본 개시내용은 자동화 공정 동안 또는 이에 이어서 세포 샘플의 유체 부피를 감소시키기 위한 세포 농축 필터를 포함하는 자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 카세트를 제공한다. 본 개시내용은 또한 카세트를 이용하고 방법을 수행할 수 있는 자동화 세포 조작 시스템뿐만 아니라 세포 모집단을 농축하는 방법도 제공한다.

Description

자동화 생물반응기에서 사용하기 위한 세포 농축 방법 및 장치
본 개시내용은 자동화 공정 동안 또는 자동화 공정 후에 세포 샘플의 유체 부피를 감소시키기 위한 세포 농축 필터를 포함하는 자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 카세트를 제공한다. 본 개시내용은 또한 세포 모집단을 농축하는 방법뿐만 아니라 카세트를 이용하고 방법을 수행할 수 있는 자동화 세포 조작 시스템을 제공한다.
첨단 세포 요법의 가속화된 임상 채택에 대한 기대가 고조됨에 따라 이들 요법이 전 세계 환자에게 혜택을 줄 수 있는 근본적인 제조 전략에 더 많은 관심이 집중되고 있다. 세포 요법은 임상적으로 크게 유망하지만 수익 대비 높은 제조 비용은 상용화를 가로막는 큰 장애물이다. 따라서 비용 효율성, 공정 효율성 및 제품 일관성에 대한 요구는 다수의 세포 요법 분야에서 자동화를 위한 노력을 주도하고 있다.
다양한 공정의 자동화는 요법을 위한 세포 모집단을 생성하는 것과 관련된다. 이것은 광범위한 환자 모집단으로 이들 중요한 요법의 전환을 위해, 상업적 제조 플랫폼 안으로 세포 활성화, 형질도입 및 팽창의 통합을 포함한다.
자동화 공정 동안 또는 자동화 시스템으로부터의 최종 유출 이전에 세포 모집단의 부피를 감소시키는 것이 종종 필요하다. 필요한 것은 세포 샘플이 농축될 수 있는 공정, 즉, 자동화 동안 또는 샘플 유출 이전에 감소된 샘플의 부피이다.
일부 실시형태에서, 세포 배양 챔버, 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템, 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터를 포함하는 자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 카세트가 본 명세서에 제공되며, 여기서 펌핑 시스템은 접선 유동 필터에 잔류물 유동을 제공하고 접선 유동 필터의 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어되고, 세포 샘플 유출은 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된다.
추가 실시형태에서, 세포 배양 챔버, 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템, 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터를 포함하는 자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 카세트가 본 명세서에 제공되며, 여기서 펌핑 시스템은 접선 유동 필터에 잔류물 유동을 제공하고 접선 유동 필터의 투과물 유동은 유동 제어기, 접선 유동 필터에 연결된 위성 부피, 접선 유동 필터를 통해 잔류물 유동을 다시 재순환하기 위한 유체의 경로, 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버, 및 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 세포 샘플 유출에 의해 제어된다.
추가의 실시형태에서, 자동화 공정 동안 세포 샘플의 부피를 감소시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 세포 샘플을 잔류물 유동 및 투과물 유동을 갖는 접선 유동 필터에 도입하는 단계로서, 여기서 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어되는 단계, 접선 유동 필터의 잔류물 유동을 통해 세포 샘플을 통과시키는 단계, 투과물 유동을 통해 세포 샘플로부터 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버로 부피를 제거하는 단계, 및 감소된 부피를 갖는 세포 샘플을 수집하는 단계를 포함한다.
더욱 추가 실시형태에서, 밀폐형 하우징, 밀폐형 하우징 내에 함유된 카세트로, 세포 배양 챔버를 포함하는 카세트, 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템, 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터로, 여기서 펌핑 시스템은 잔류물 유동을 접선 유동 필터에 제공하고 접선 유동 필터의 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어되는 접선 유동 필터, 및 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 세포 샘플 유출, 및 사용자로부터 유입을 수신하기 위한 사용자 인터페이스를 포함하는 자동화 세포 조작 시스템이 본 명세서에 제공된다.
도 1은 본 명세서의 실시형태에 기재된 바와 같이 자동화 세포 조작 시스템의 카세트로 수행될 수 있는 다양한 단계를 도시한다.
도 2a는 본 명세서의 실시형태에 따른 예시적인 카세트를 도시한다.
도 2b는 본 명세서에 기재된 카세트, 시스템 및 방법에 사용하기 위한 예시적인 접선 유동 필터를 도시한다.
도 2c는 본 명세서에 기재된 바와 같은 접선 유동 필터와 함께 사용하기 위한 예시적인 유동 제어기를 도시한다.
도 3a 및 3b는 본 명세서의 실시형태에 따른 자동화 세포 조작 시스템의 이미지를 도시한다.
도 4는 본 명세서의 실시형태에 기재된 바와 같은 예시적인 세포 조작 시스템을 함유하는 실험실 공간을 도시한다.
도 5는 본 명세서의 실시형태에 기재된 바와 같은 자동화 세포 조작 시스템의 카세트에서 세포 농축을 위한 유로를 도시한다.
도 6a-6b는 본 발명의 실시형태에 따른 접선 유동 여과에 대한 혈청의 효과를 도시한다.
도 7a-7c는 본 발명의 실시형태에 따른 접선 유동 필터의 막힘을 감소시키기 위한 투과물 제어의 사용을 도시한다.
도 8a-8b는 본 발명의 실시형태에 따른 접선 유동 여과를 사용한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 부피 감소를 도시한다.
도 9a-9d는 본 발명의 실시형태에 따른 PMBC의 접선 유동 부피 감소 동안 투과물 펌프 최적화를 도시한다.
도 10a는 본 발명의 실시형태에 따른 접선 유동 여과 후 세포 회수를 도시한다.
도 10b는 본 발명의 실시형태에 따른 사전- 및 사후- 접선 유동 여과의 세포 생존율을 도시한다.
도 11은 대조군 및 TFF 세포 현탁액에서 CD4+ 및 CD8+ 발현을 도시한다.
본 명세서에 도시되고 설명된 특정 구현은 예이고 달리 어떤 식으로든 출원의 범주를 제한하려는 의도가 아니다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서에 언급된 공개된 특허, 특허 출원, 웹사이트, 회사명, 및 과학 문헌은 각각이 참고로 포함되고 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 그 전체가 참고로 포함된다. 본 명세서에 인용된 임의의 참고와 이 명세서의 특정 교시 사이의 충돌은 후자의 관점에서 해결되어야 한다. 마찬가지로, 이 명세서에서 구체적으로 교시된 단어 또는 구의 기술-이해 정의와 단어 또는 구의 정의 사이의 임의의 충돌은 후자의 관점에서 해결되어야 한다.
이 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 그들이 지칭하는 용어의 복수 형태도 또한 구체적으로 포괄한다. 용어 "약"은 본 명세서에서 대략, ~의 영역에서, 대략적으로, 또는 대강을 의미하는 데 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 조합하여 사용되는 경우 제시된 수치 값의 위 및 아래 경계를 확장하여 그 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 명시된 값 위 및 아래의 수치 값을 20% 변화량으로 수정하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에서 사용된 기술 및 과학 용어는 달리 정의되지 않는 한, 본 출원이 속하는 기술분야에서 당업자가 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 기술분야에서 당업자에게 공지된 다양한 방법론 및 재료에 대해 본 명세서에 언급되어 있다.
실시형태에서, 자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 카세트가 본 명세서에 제공된다. 도 1은 다양한 세포 샘플 및 모집단의 생산을 허용하는 밀폐된 자동화 시스템에서 다양한 공정이 수행될 수 있는 예시적인 카세트 (102)를 도시한다. 이러한 공정에는 활성화, 형질도입, 팽창, 농축, 세정 및 수집/수확 단계가 포함될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 카세트 및 방법은 활성화, 형질도입, 팽창, 농축, 및 수확과 같은 단계를 수행하기 위해 완전히 밀폐된 자동화 세포 조작 시스템 (300)(도 3a, 3b 참고)에 이용되고 실행되며 그에 대한 지침이 적절하게 되어 있다. 예를 들어, CAR T 세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역 세포의 자동화된 생산을 위한 세포 조작 시스템은 2018년 8월 31일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 16/119,618에 기술되어 있고 (그의 개시내용은 그 전체로 본 명세서에 참고로 포함됨), 또한 본 명세서에서 자동화 세포 조작 시스템, COCOON™ 또는 COCOON™ 시스템으로 지칭된다.
예를 들어, 사용자는 세포 생산 (예를 들어, 시작 세포의 수, 배지의 유형, 활성화 시약의 유형, 벡터의 유형, 생산되는 세포의 수 또는 용량 등)을 위한 세포 배양 및 시약 (예를 들어, 활성화 시약, 벡터, 세포 배양 배지, 영양소, 선택 시약 등) 및 매개변수로 사전-충진된 자동화 세포 조작 시스템을 제공할 수 있다. 자동화 세포 조작 시스템은 사용자로부터 추가 유입 없이 CAR T 세포를 포함한 유전적으로 변형된 면역 세포 배양물을 생산하는 방법을 포함하여 다양한 자동화 방법을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 완전히 밀폐된 자동화 세포 조작 시스템은 비-멸균 환경에 대한 세포 배양물의 노출을 감소시킴에 의해 세포 배양물의 오염을 최소화한다. 추가 실시형태에서, 완전히 밀폐된 자동화 세포 조작 시스템은 세포의 사용자 취급을 감소시킴에 의해 세포 배양물의 오염을 최소화한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 자동화 세포 조작 시스템 (300)은 적절하게는 카세트 (102)를 포함한다. 따라서, 실시형태에서 자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 카세트가 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에서 사용된 "카세트"는 본 명세서에 기술된 방법의 다양한 요소를 수행하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하는 자동화 세포 조작 시스템의 대체로 자체-완비된 제거 가능하고 교체 가능한 요소를 지칭하고, 적합하게는 또한 하나 이상의 세포 배지, 활성화 시약, 세정 배지 등을 포함한다.
도 2a는 자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 예시적인 카세트 (102)를 도시한다. 실시형태에서, 카세트 (102)는 세포 샘플 유입 (202)을 포함한다. 세포 샘플 유입 (202)은 도 2a에서 세포 샘플이 카세트 (102) 안으로 도입되거나 장입되기 이전에 배치될 수 있는 바이알 또는 챔버로서 도시되어 있다. 다른 실시형태에서, 세포 샘플 유입 (202)은 단순히 주사기 또는 세포-함유 백, 예컨대 혈액 백이 연결될 수 있는 멸균-잠금 배관 (예를 들어, 루어 잠금 배관 연결 등)일 수 있다.
카세트 (102)는 세포 배양 챔버 (206)를 추가로 포함한다. 세포 배양 챔버 (206)의 특성 및 용도의 예가 본 명세서에 기술되어 있다. 카세트 (102)는 또한 세포 배양 챔버 (206)에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템 (520)(유로 내의 예시적인 위치에 대해 도 5 참고)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "유체적으로 연결된"은 카세트 (102)의 구성성분과 같은 시스템의 하나 이상의 구성성분이 유체 (기체 및 액체를 포함함)가 누출 또는 부피 손실 없이 구성성분 사이를 통과할 수 있도록 하는 적절한 요소를 통해 연결됨을 의미한다. 예시적인 유체 연결은 실리콘 또는 고무 배관, 루어 잠금 연결 등과 같은 당업계에 공지된 다양한 배관, 채널 및 연결을 포함한다. 유체적으로 연결되는 구성성분은 또한 각각의 구성성분 사이에 추가 요소를 포함할 수 있지만, 여전히 유체 연결을 유지한다는 것을 이해해야 한다. 즉, 유체적으로 연결된 구성성분은 구성성분 사이를 통과하는 유체가 이들 추가 요소를 또한 통과할 수 있지만 반드시 그렇게 할 필요는 없도록 추가 요소를 포함할 수 있다.
펌핑 시스템 (520)은 적절하게는 연동 펌프 시스템이지만, 다른 펌핑 시스템도 사용될 수 있다. 연동 펌프는 유체를 펌핑하기 위한 일종의 양성 변위 펌프를 지칭한다. 유체는 펌프 케이싱 내부에 장착된 신축성 튜브 - 종종 원형 내에 적절하게 함유된다. 로터의 외주에 부착된 다수의 "롤러", "슈", "와이퍼" 또는 "로브"가 있는 로터는 신축성 튜브를 압축한다. 로터가 회전할 때 압축을 받고 있는 튜브의 부분이 꽉 닫혀서 (또는 "폐쇄되어") 펌핑되어지는 유체가 튜브를 통해 이동하도록 한다. 부가적으로, 튜브가 캠의 통과 후 열리면 ("복원" 또는 "탄성") 유체 유동이 펌프로 유도된다. 이 공정은 연동운동으로 불리고 신축성 튜브를 통해 유체를 이동시키는 데 사용된다. 전형적으로, 튜브를 폐쇄하고 그 사이에 유체의 본체를 가두는 2개 이상의 롤러 또는 와이퍼가 있다. 그런 다음 유체의 본체는 펌프 유출구를 향해 이송된다.
카세트 (102)는 또한 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터 (204)를 포함한다. 도 2b는 예시적인 접선 유동 필터를 도시한다. 도 2c는 접선 유동 필터의 내부의 개략도를 도시한다. 직교류 여과로도 알려진 접선 유동 여과는 공급물, 유입구 또는 유입 유체 스트림 (도 2c에서 250)의 일부가 멤브레인을 통해 그 밖으로 통과하고 (투과물 유동 - 도 2c에서 252) 반면 나머지 (잔류물 유동 - 도 2c에서 254)는 멤브레인 내로 통과하고 유입으로 다시 재순환될 수 있고, 농축되고, 궁극적으로 저장소 또는 유출물로 통과될 수 있는 바와 같이 멤브레인 면에 평행하게 통과하는 여과 시스템 또는 공정이다.
접선 유동 필터 (204)는 용액이 그 안으로 공급되는 일련의 중공사막 (단일 섬유도 사용될 수 있음)으로 적절하게 구성된다. 잔류물 유동은 중공사 내부를 통과하여, 섬유 멤브레인 내부의 용액 내에 세포를 유지하는 반면 초과 부피는 섬유 멤브레인을 통과하여 투과물 유동 안으로 나간다. 이것은 총 세포 샘플의 부피를 줄여, 세포 샘플의 농축을 초래한다. 멤브레인은 유동 제어기 (258)를 포함할 수 있는 자체-완비된 장치의 형태로 적합하게 제공된다.
본 명세서에 설명된 바와 같이, 도 2c를 참조하여, 펌핑 시스템 (520)은 접선 유동 필터 (204)에 잔류물 유동 (254)을 제공하는 반면, 접선 유동 필터의 투과물 유동 (252)은 유동 제어기 (258)에 의해 제어된다. 본 명세서에 사용된 "유동 제어기"는 접선 유동 필터의 섬유 멤브레인을 떠나 투과물 유동으로 들어가는 유체의 양을 제어하기 위한 다양한 배관 설정 또는 기타 메커니즘을 포함하는 - 밸브, 수축 장치, 유동 전환기, 펌프 메커니즘, 유체학을 지칭한다. 도 2c의 유동 제어기 (258)는 투과물 유동 (252)의 양을 제어하기 위한 메커니즘의 포함을 예시하기 위해 간단히 제공되며 이 메커니즘의 구조를 나타내지는 않는다.
예시적인 실시형태에서, 유동 제어기 (258)는 유동 제한기 (260)이다. "유동 제한기"는 접선 유동 필터를 빠져나가는 투과물 유동 (252)의 양 및 속도를 제어하기 위한 밸브, 점진적으로 좁아지는 배관, 또는 수축 장치를 지칭한다. 유동 제한부 (260)는 접선 유동 필터 (204)의 하류에 배치되어, 접선 유동 필터 (204)의 멤브레인을 여기시킨 후에 투과물 유동의 제어가 발생한다. 유동 제한기 (260)는 단지 예시적 목적을 위해 도 2c에 도시되어 있고, 유동 제한기 (260)의 위치 및 작동은 도 2c의 표시에 의해 제한되지 않는다. 당업자는 유동 제한기가 투과물 유동 (252)의 양 및 속도를 제어하기 위해 사용될 수 있는 다양한 방식을 쉽게 인식할 것이다. 적절하게는, 유동 제한기 (260)는 접선 유동 필터 (204)(도 2b 참조)의 단부 (262)에 인접하여 배치되어 투과물 유동 (252)의 양 및 속도를 제한한다.
추가 실시형태에서, 유동 제어기 (258)는 투과물 유동 (252)의 양 및 속도를 제어 및 제한 (또는 증가)시키도록 설정될 수 있는 추가 펌핑 시스템이다.
여전히 추가 실시형태에서, 유동 제어기 (258)는 투과물 유동 (252)의 양 및 속도의 원하는 제어 (제한 또는 증가)를 제공하기 위해 카세트 (102) 내에 또한 배향되고 배치될 수 있는 복수의 배관을 갖는 시스템이다.
실시형태에서, 카세트 (102)는 세포 배양 챔버에 적절하게 연결된 하나 이상의 유체의 경로를 추가로 포함한다 (도 2a에서 카세트 (102) 내부 참고). 또한 카세트 (102)에는 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 세포 샘플 유출 (208)이 포함된다. 카세트 (102)는 또한 접선 유동 필터 (204)에 유체적으로 연결된 세포 샘플 유출 (208)을 적절하게 포함한다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 세포 샘플 유출 (208)은 추가 공정, 저장 또는 환자에 잠재적인 사용을 위한 다양한 자동화 절차에 따라 세포를 수확하는 데 사용될 수 있다. 세포 샘플 유출 (208)은 또한, 예를 들어, 전기천공과 같은 형질도입을 위해 세포 샘플이 카세트로부터 제거될 수 있게 하고, 그 다음 추가 자동화 공정를 위해 카세트로 복귀될 수 있게 하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 샘플 포트 (220)일 수 있다. 유체 경로의 예는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 카세트의 요소에 영양분, 용액 등을 제공하는 다양한 배관, 채널, 모세관, 미세유체 요소 등을 포함한다. 세포 샘플 유출 (208)은 또한 단순히 접선 유동 필터의 유출일 수 있으며, 그런 다음 본 명세서에 기술된 카세트 (102)의 다른 섹션 또는 부분에 유체적으로 연결된다.
실시형태에서, 카세트 (102)는 접선 유동 필터 (204) 이전 또는 이후에 원심분리기를 명시적으로 배제한다. 본 명세서에 기술된 다양한 세포 분리 필터 및 방법의 사용을 통해 원심분리 절차 및 원심분리기의 사용을 통한 추가적인 세포 분리가 요구되지 않는 것으로 결정되었다. 그러나, 실시형태에서 컬럼 여과 및/또는 자기 여과 시스템과 같은 추가 여과 시스템이 이용될 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 접선 유동 필터 (204)는 약 0.40μm 내지 약 0.80μm의 기공 크기 및 약 0.5mm 내지 약 0.9mm의 섬유 직경을 갖는 멤브레인을 포함한다. 실시형태에서, 접선 유동 필터 (204)의 기공 크기는 약 0.2μm 내지 약 1.0μm, 또는 약 0.3μm 내지 약 0.9μm, 약 0.4μm 내지 약 0.8μm, 약 0.5μm 내지 0.7μm, 약 0.6μm 내지 약 0.7μm, 또는 약 0.40μm, 약 0.45μm, 약 0.50μm, 약 0.55μm, 약 0.60μm, 약 0.65μm, 약 0.70μm, 약 0.75μm 또는 약 0.80μm이다. 실시형태에서, 섬유 직경은 약 0.30mm 내지 약 1.2mm, 적합하게는 약 0.40mm 내지 약 1.0mm, 약 0.50mm 내지 약 0.90mm, 약 0.60mm 내지 약 0.80mm, 약 0.70mm 내지 약 0.80mm, 또는 약 0.60mm, 약 0.65mm, 약 0.70mm, 약 0.75mm, 약 0.80mm, 약 0.85mm, 또는 약 0.90mm이다.
적합하게는, 접선 유동 필터 (204)는 약 10-20cm, 적합하게는 약 10-15cm 사이, 또는 약 13cm의 섬유 루멘의 총 길이를 갖는 약 15-20개 섬유, 적합하게는 18개 필터를 포함한다. 섬유의 표면적은 약 40-70㎠, 보다 적절하게는 약 50-60㎠, 또는 약 57㎠ 정도이다. 실시형태에서, 접선 유동 필터 (204)에 사용하기 위해서는 상대적으로 높은 표면적, 큰 기공 크기의 멤브레인이 바람직하다.
접선 유동 필터 (204)에 사용하기 위한 예시적인 재료는 폴리(에테르 술폰), 폴리(아크릴로니트릴) 및 폴리(비닐리덴 디플루오라이드), 셀룰로스 에스테르, 폴리(술폰)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리머를 포함한다. 예시적인 접선 유동 필터는 MICROKROS® 및 MIDIKROS® 필터를 포함하는 SPECTRUM LABS®로부터 이용 가능한 것과 원하는 카세트 내부에 맞도록 된 그의 변형형을 포함한다. 실시형태에서, 재료는 개질된 폴리(에테르 술폰)이다.
추가의 실시형태에서, 접선 유동 필터의 표면에 코팅이 적용될 수 있다. 적합하게는, 이 코팅은 접선 유동 필터 (204)의 표면 상의 오염을 감소시키거나 제거하는 것을 도울 수 있다. 예시적인 비-오염 코팅은, 예를 들어, 인지질 코팅, 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(에틸렌 글리콜) 코팅 등과 같은 중합체 코팅을 포함한다. 안정성, 증가된 또는 감소된 유동 또는 기타 원하는 특성을 제공하기 위해 접선 유동 필터에 추가 표면 코팅이 적용될 수도 있다.
추가의 실시형태에서, 추가적인 사전- 및 사후-필터 (즉, 접선 유동 필터 전 또는 후)가 또한 본 명세서에 기재된 카세트 및 방법에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 자기 분리 공정을 이용하여 원하지 않는 세포 및 파편을 세포 모집단에서 추가로 제거하고 분리할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 생체분자 (예를 들어, 항체, 항체 단편 등)가 결합된 자기 비드 또는 기타 구조는 표적 세포와 상호작용할 수 있다. 필터, 컬럼, 유동관 또는 자기장이 있는 채널 등의 사용을 포함한 다양한 자기 분리 방법을 그 다음 사용하여 세포 샘플에 있을 수 있는 원하지 않는 세포, 파편 등으로부터 표적 세포 모집단을 분리할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포 모집단은 튜브 또는 다른 구조를 통해 흐르고 자기장에 노출될 수 있으며, 이로써 표적 세포 모집단은 자기장에 의해 보유되거나 유지되어 원하지 않는 세포 및 파편이 튜브를 통과할 수 있게 한다. 그런 다음 자기장을 끌 수 있어 표적 세포 모집단은 추가 자동화 공정을 위해 추가 보유 챔버 또는 카세트의 다른 영역(들) 상으로 통과할 수 있게 한다. 추가 여과는 전통적인 컬럼 여과 또는 다른 여과 멤브레인 및 구조의 사용을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 카세트 (102)는 접선 유동 필터 (204)에 유체적으로 연결되는 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버 (510)를 추가로 포함한다. 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버 (510)는 접선 유동 필터를 빠져나가는 투과물 유동 (252)을 수집하는데 사용된다. 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버는 고정된 부피를 이용하는 것에 의해, 수집된 투과물 유동 (252)의 사전-결정된 정도만 유지하도록 허용된다. 일단 이 사전-결정된 투과물 유동 (252)의 양에 도달하면 추가의 투과물 유동 (252)이 접선 유동 필터 (204)를 빠져나가는 것이 허용되지 않고, 따라서 세포 샘플의 부피가 더 이상 감소되지 않을 것이다. 이는 사전-정의되고 알려진 값, 예를 들어 최종 목표를 충족하거나 정의된 부피의 추가 공정을 위해 사전-정의된 값을 갖는 세포 농축 및 세포 샘플 부피를 초래한다. 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버 (510)의 예는 팽창하지 않고 따라서 고정된 부피만 보유하는 다양한 경질 플라스틱, 금속 등을 포함한다. 부가하여, 백 또는 신축성 플라스틱을 사용할 수 있지만 경질 플라스틱 용기의 내부나 비-이동성 벽 (예를 들어, 플라스틱 벽) 사이에 배치될 수 있어 백이 사전-결정된 부피에 도달하면 비-이동성 벽이나 용기에 영향을 미칠 수 있고, 백의 팽창이 멈춘다. 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버 (510)가 용량까지 채워짐에 따라, 추가의 투과물 유동 (252)이 빠져나가는 것이 허용되지 않고, 잔류물 유동 (254)은 그 다음 수집이 요구되는 그러한 시점까지 접선 유동 필터를 통해 단순히 재순환된다. 적합하게는, 이 재순환은 (즉, 도 5의 유로에서 일반적으로 540으로 도시된 유체 경로를 통해 발생한다. 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버 (510)는 또한 투과물 유동 (252)을 촉발하고 지향시켜 잔류물 유동 (254)을 정지시키고 재순환시키는 수준 모니터를 포함할 수 있다.
추가 실시형태에서, 자동화 공정의 전반적인 부피, 또는 접선 유동 여과를 위한 추가 부피 유동을 증가시키기 위해 카세트에 대한 추가 저장 능력을 제공할 수 있는 위성 부피 (550)는 접선 유동 필터 (204)에 유체적으로 연결된다. 위성 부피 (550)의 예시적인 위치는 도 5의 유로에 도시되어 있다.
카세트는 또한 하나 이상의 유체 경로 (일반적으로 540)를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 유체 경로는 재순환, 폐기물의 제거와 균질한 가스 교환 및 카세트의 다양한 부분으로의 영양성 분배, 예컨대 세포 배양 챔버 내의 세포를 건드리지 않고 세포 배양 챔버로 영양소의 분배를 제공한다. 카세트 (102)는 또한 다양한 유체 경로를 통한 유동을 제어하기 위한 하나 이상의 밸브 (522 또는 552)를 추가로 포함한다 (유로 내의 예시적인 위치에 대해서는 도 5 참고).
예시적인 실시형태에서, 도 2a에 도시된 바와 같이, 세포 배양 챔버 (206)는 쉽게 구부러지거나 휘어지지 않는 편평하고 비-신축성 챔버 (즉, 플라스틱과 같은 실질적으로 비-신축성 재료로 제조됨)이다. 비-신축성 챔버의 사용은 세포가 실질적으로 방해받지 않은 상태로 유지될 수 있게 한다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 세포 배양 챔버 (206)는 면역 세포 배양이 세포 배양 챔버의 바닥을 가로질러 분산하도록 허용하기 위해 배향된다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 세포 배양 챔버 (206)는 바닥 또는 테이블과 평행한 위치에 적절하게 유지되어, 세포 배양을 방해받지 않은 상태로 유지하여 세포 배양이 세포 배양 챔버의 바닥의 넓은 영역에 걸쳐 분산하도록 한다. 실시형태에서, 세포 배양 챔버 (206)의 전반적인 두께 (즉, 챔버 높이)는 약 0.5cm 내지 약 5cm 정도로 낮다. 적합하게는, 세포 배양 챔버는 약 0.50ml 내지 약 300ml, 더욱 적합하게는 약 50ml 내지 약 200ml의 부피를 갖거나, 세포 배양 챔버는 약 180ml의 부피를 갖는다. 낮은 챔버 높이 (5cm 미만, 적합하게는 4cm 미만, 3cm 미만, 또는 2cm 미만)의 사용은 세포에 매우 근접하여 효과적인 배지 및 가스 교환을 가능하게 한다. 포트는 세포를 건드리지 않고 유체의 재순환을 통해 혼합을 허용하도록 구성된다. 더 큰 높이의 고정 용기는 농도 구배를 생성하여 세포 근처의 영역에 산소와 신선한 영양소가 제한되도록 할 수 있다. 제어된 유동 역학을 통해, 세포 방해 없이 배지 교환이 수행될 수 있다. 세포 손실의 위험 없이 추가 챔버 (세포가 존재하지 않음)로부터 배지가 제거될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 예시적인 실시형태에서 카세트는 세포 배양, 배양 배지, 원하는 경우 세포 세정 배지, 활성화 시약 및/또는 이들의 임의의 조합을 포함한 벡터 중 하나 이상으로 사전-충진된다. 추가의 실시형태에서, 이들 다양한 요소는 적절한 주입 포트 등을 통해 나중에 추가될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 실시형태에서, 카세트는 적절하게는 pH 센서 (524), 글루코스 센서 (도시되지 않음), 산소 센서 (526), 이산화탄소 센서 (도시되지 않음), 젖산 센서/모니터 (도시되지 않음) 및/또는 광학 밀도 센서 (도시되지 않음) 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 유로 내의 예시적인 위치에 대해서는 도 5를 참고한다. 카세트는 또한 하나 이상의 샘플링 포트 및/또는 주입 포트를 포함할 수 있다. 이러한 샘플링 포트 (220) 및 주입 포트 (222)의 예가 도 2a에 도시되어 있고 유로의 예시적인 위치는 도 5에 도시되어 있고, 카트리지를 전기천공 단위 또는 추가 배지 공급원과 같은 외부 장치에 연결하기 위한 액세스 포트를 포함할 수 있다. 도 2a는 또한 유입 (202), 세포 배지 등을 가온하는 데 사용할 수 있는 시약 가온 백 (224), 및 2차 챔버 (230)의 위치를 나타낸다.
실시형태에서, 카세트 (102)는 적절하게는 세포 배양의 활성화, 형질도입 및/또는 팽창을 수행하기에 적합하게 고온 챔버뿐만 아니라 세포 배양 배지의 저장을 위해 적합하게 냉장 영역 (226)을 포함할 수 있는 저온 챔버를 포함한다. 적합하게는, 고온 챔버는 열 장벽에 의해 저온 챔버로부터 분리된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "저온 챔버"는 냉장된 온도에서 세포 배지 등의 유지를 위해 실온 미만, 보다 적절하게는 약 4℃ 내지 약 8℃로 유지되는 챔버를 지칭한다. 저온 챔버는 약 1L, 약 2L, 약 3L, 약 4L 또는 약 5L의 유체를 포함하는 배지용 백 또는 기타 홀더를 포함할 수 있다. 추가 배지 백 또는 기타 유체 공급원은 외부에서 카세트에 연결되고 액세스 포트를 통해 카세트에 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "고온 챔버"는 실온 이상으로 적절하게 유지되고, 보다 적절하게는 세포 증식 및 성장을 허용하는 온도, 즉 약 35-40℃ 사이, 보다 적절하게는 약 37℃로 유지되는 챔버를 지칭한다. 실시형태에서, 고온 챔버는 적합하게는 세포 배양 챔버 (206)(또한 전체에 걸쳐 증식 챔버 또는 세포 증식 챔버로 언급됨)를 포함한다.
실시형태에서, 접선 유동 필터 (204)는 카세트 (102)에 접선 유동 필터가 수평에 대해 약 3° 내지 약 20°, 보다 적합하게는 수평에 대해 약 5° 내지 약 15° 또는 약 10°의 각도로 있도록 적절하게 정렬된다 (유입 단부보다 위/더 높이 위치한 접선 유동 필터 (204)의 출구 단부). 접선 유동 필터의 출구 단부 (즉, 262)가 유입 단부 위에 있는 수평에 대한 각도에서 접선 유동 필터 (204)의 정렬은 접선 유동 필터 (204)를 통해 개선된 부피 감소 및 세포 농축을 산출하기 위해 원하는 유동 특성을 제공하기 위해 바람직하다.
수평에 대해 약 3° 내지 약 20°의 각도로 접선 유동 필터를 정렬하면 세포 프라이밍 (또는 중력 침강)이 감소되거나 회피될 수 있다는 이점이 또한 제공된다. 이러한 각도를 사용하면 세포가 접선 유동 필터 아래로 흐를 때 세포가 현탁액으로 떨어진다.
실시형태에서, 카세트 (102)는 또한 카세트 (102) 내에 (즉, 도 2a에 도시된 구조 내에) 적절하게 함유되고 접선 유동 필터 (204)에 유체적으로 연결되거나 세포 세정이 필요한지 여부에 따라 카세트 내의 다른 섹션에 연결될 수 있는 세포 세정 시스템 (512)을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 세포 세정 시스템 (512)은 세포 세정 배지를 적절하게 포함하는 카세트 (102) 내에 함유된 용기 또는 백이다. 세포 세정 배지는 추가 공정 또는 사용을 위해 카세트 내에서 또는 카세트 외부로 세포 모집단을 옮기기 이전에 임의의 원치 않는 폐기물 세포 또는 오염을 제거하기 위해 원하는 세포 모집단을 클리닝하는 데 적합하게 사용된다. 세포 세정 시스템 (512)은 또한 카세트 (102)의 외부에 포함될 수 있다.
카세트 (102)는 또한 선택적으로 세포 보유 챔버 (516)(카세트 (102) 내부에 위치하기 때문에 도 2에서 보이지 않음)를 더 포함할 수 있다. 도 5는 카세트용 유로에서 세포 보유 챔버 (516)의 예시적인 위치를 도시한다. 세포 보유 챔버 (516)는 적절하게는 본 명세서에 기재된 바와 같이 접선 유동 여과 이전 또는 이후에 세포 모집단이 그 내부에 보유될 수 있는 카세트 내에 위치된 저장소 또는 적합한 챔버이다.
추가 실시형태에서, 세포 배양 챔버 (206), 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템 (520), 및 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터 (204)를 적합하게 포함하는 자동화 세포 조작 시스템 (300)에서 사용하기 위한 카세트 (102)가 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 펌핑 시스템은 접선 유동 필터에 잔류물 유동을 제공하고 접선 유동 필터의 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어된다. 카세트는 또한 접선 유동 필터에 연결된 위성 부피 (550), 접선 유동 필터를 통해 잔류물 유동을 다시 재순환시키기 위한 유체 경로 (540), 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버 (510), 및 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 세포 샘플 유출 (208)을 추가로 포함한다.
접선 유동 필터 (204)에 사용하기 위한 예시적인 기공 크기 및 섬유 직경이 본 명세서에 기술되어 있다. 실시형태에서, 접선 유동 필터는 약 0.60μm 내지 약 0.70μm의 기공 크기 및 약 0.70mm 내지 약 0.80mm의 섬유 직경을 포함한, 약 0.40μm 내지 약 0.80μm의 기공 크기 및 약 0.5mm 내지 약 0.9mm의 섬유 직경을 갖는다.
접선 유동 필터에 사용하기에 적합한 재료는 폴리(에테르 술폰), 폴리(아크릴로니트릴) 및 폴리(비닐리덴 디플루오라이드)와 같은 중합체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 실시형태에서, 카세트 (102)는 하나 이상의 유체 경로를 추가로 포함하며, 여기서 유체 경로는 재순환, 폐기물 제거와 균질한 가스 교환 및 세포 배양 챔버 내의 세포를 건드리지 않고 세포 배양 챔버에 영양소의 분배를 제공한다. 실시형태에서, 세포 배양 챔버는 낮은 챔버 높이를 갖는 평평하고 비-신축성 챔버이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 카세트 (102)는 pH 센서, 글루코스 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및/또는 광학 밀도 센서 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있고, 또한 하나 이상의 샘플링 포트를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 접선 유동 필터는 카세트 (102)와 함께 위치하며 수평에 대해 약 3° 내지 약 20°의 각도로 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 유동 제어기는 유동 제한기, 추가 펌핑 시스템, 복수의 배관을 갖는 시스템, 또는 이러한 제어기의 조합일 수 있다.
도 3a-3b는 카세트 (102)가 내부에 위치된 COCOON® 자동화 세포 조작 시스템 (300)을 도시한다 (자동 세포 조작 시스템의 커버는 도 3b에서 열림). 또한 바코드 판독기를 포함할 수 있는 예시적인 사용자 인터페이스, 및 터치 패드 또는 기타 유사한 장치에 의한 유입을 사용하여 수신하는 기능이 도시되어 있다.
본 명세서에 기술된 자동화 세포 조작 시스템 및 카세트는 적절하게 3개의 관련 부피, 즉, 세포 배양 챔버 부피, 작업 부피 및 총 부피를 갖는다. 적절하게는, 카세트에 사용되는 작업 부피는 공정 단계를 기준으로 180mL 내지 460mL의 범위이며, 최대 약 500mL, 약 600mL, 약 700mL, 약 800mL, 약 900mL 또는 약 1L까지 증가될 수 있다. 실시형태에서, 카세트는 4*109 세포 - 10*109 세포를 쉽게 달성할 수 있다. 세포 농도는 공정 동안에 0.3*106 세포/ml에서 대략 10*106 세포/ml까지 다양하다. 세포는 세포 배양 챔버에 위치되지만 배지는 추가 챔버 (예를 들어, 직교류 저장소 및 위성 부피)를 통해 지속적으로 재순환되어 본 명세서에 기술된 바와 같이 작업 부피를 증가시킨다.
가스 교환 라인을 포함하는 유체 경로는, 예를 들어, 실리콘과 같은 가스-투과성 재료로 만들어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 자동화 세포 조작 시스템은 세포 생산 방법 동안 실질적으로 비-항복 챔버 전체에 걸쳐 산소를 재순환시킨다. 따라서, 일부 실시형태에서, 자동화 세포 조작 시스템에서 세포 배양물의 산소 수준은 신축성 기체-투과성 백 내의 세포 배양의 산소 수준보다 더 높다. 증가된 산소 수준은 증가된 세포 성장 및 증식을 지지할 수 있으므로, 더 높은 산소 수준은 세포 배양 팽창 단계에서 중요할 수 있다.
추가 실시형태에서, 자동화 공정 동안 세포 샘플의 부피를 줄이는 방법이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 제공된 방법은 도 5의 유로를 참고하여 단지 예시적 목적으로 기술되지만, 그러한 방법이 수행될 수 있는 방식을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 세포 샘플은 유입 (202)을 통해 카세트 (102) 내로 도입될 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포 샘플은, 예를 들어, 세포 배양 챔버 (206)에서, 예를 들어 형질도입 또는 세포 팽창 단계에 이어서 이미 카세트 (102) 내에 있을 수 있다. 샘플은, 예를 들어, 밸브 (V11)를 통과함에 의해 접선 유동 필터 (204) 내로 도입된다 (250). 접선 유동 필터는 잔류물 유동 (254) 및 투과물 유동 (252)을 갖는다 (도 2c 참고). 본 명세서에 기술된 바와 같이, 투과물 유동 (252)은 원하는 세포 농도 및 부피 감소를 제공하기 위해 유동 제어기 (258)에 의해 제어된다. 세포 샘플은 잔류물 유동 (254)을 통과하는 반면 부피는 투과물 유동 (252)을 통해 세포 샘플에서 제거된다. 적합하게는, 투과물 유동 (252)은 밸브 (v1 및 v13)를 통과하여 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버 (510)로 제거된다 (원하는 경우 밸브 (v13)를 통해 제거될 수 있음). 소정의 부피의 감소가 달성되면, 밸브 (V1 및 V10)를 통해 유출 (208)로 적절하게 통과함에 의해 감소된 부피를 갖는 세포 샘플이 수집된다. 다른 실시형태에서, 감소된 부피를 갖는 세포 샘플은, 예를 들어, 추가의 자동화된 공정 또는 카세트로부터의 제거 이전에 세포 보유 챔버 (516)에 수집될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 잔류물 유동 (254)은 부피 제거 단계에 이어서 적절하게 재순환되어 잔류물 유동 (254)을 통해 세포 샘플을 반복적으로 통과시킨다. 예를 들어, 잔류물 유동 (254)은 밸브 (V1, V12 및 V11)를 통해 접선 유동 필터 (204) 밖으로 통과할 수 있고, 접선 유동 필터 (204) 안으로 다시 통과할 수 있다.
고정된 부피의 폐기물 수집 챔버 (510)를 이용하는 실시형태에서, 폐기물의 고정된 부피에 도달하면, 이것은 또한 세포 샘플을 접선 유동 필터를 통해 (예를 들어, 밸브 (V14, V12 및 V11)를 통해) 되돌리도록 할 것이지만, 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버가 소정의 부피를 함유하게 되면 부피를 제거하는 것이 적절하게 중단되므로 임의의 추가 부피 제거는 허용하지 않을 것이다.
추가 실시형태에서, 세포 샘플의 초기 수집에 이어서, 샘플은 세포 세정 시스템 (512)을 사용하여 세정될 수 있고, 그 다음 부피 감소 방법이 반복될 수 있다. 세포 세정 시스템 (512)은, 예를 들어 밸브 (V4)를 통해 그리고 밸브 (V12 및 V11)를 폐쇄함에 의해 세포 보유 챔버 (516)에 연결되어 세정 용액을 보유 챔버 내로 강제할 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법은, 예를 들어 접선 유동 여과 후 수집에 이어서 세포 샘플을 전기천공하는 것을 포함하는 추가 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 내부 (즉, 카세트 (102)와 함께) 또는 외부 전기천공 시스템을 통해 발생할 수 있다. 접선 유동 여과 후 수집 후에 이어서 추가 형질도입 단계가 수행될 수도 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 방법은 유량 제한기, 추가 펌핑 시스템, 복수의 배관을 갖는 시스템, 또는 이러한 제어기의 조합일 수 있는 유동 제어기를 적합하게 이용한다.
실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 카트리지는 단일 턴키 플랫폼에서 다중 단위 작동을 통합하는 COCOON® 플랫폼 (Octane Biotech (온타리오주 킹스턴 소재))에서 이용된다. 매우 특정한 세포 공정 목표로 다중 세포 프로토콜이 제공된다. 효율적이고 효과적인 자동화 번역을 제공하기 위해, 기술된 방법은 다중 단위 작동을 조합하는 적용-특이적/후원자-특이적 일회용 카세트의 개념을 이용하며 - 모두 최종 세포 요법 제품의 핵심 요구사항에 중점을 두었다. 다중 자동화 세포 조작 시스템 (300)은 개별 환자에 대한 대량의 세포 또는 다중 상이한 세포 샘플의 생산을 위한 대규모 다중-단위 작동으로 함께 통합될 수 있다 (도 4 참조).
또한 다양한 센서 (예를 들어, pH 센서 (524), 용존 산소 센서 (526)), 뿐만 아니라 샘플링/샘플 포트 및 다양한 밸브 (우회 체크 밸브 (552) 포함)의 예시적인 위치화, 뿐만 아니라 적절하게 구성성분을 연결하는 실리콘-기반 배관 구성성분을 포함하는 하나 이상의 유체 경로 (540)가 도 5에 도시되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 실리콘-기반 배관 구성성분의 사용은 배관 구성성분을 통한 산소화를 허용하여 세포 배양을 위한 기체 전달 및 최적의 산소화를 촉진한다. 또한 카세트의 유로에서 하나 이상의 소수성 필터 (554) 또는 친수성 필터 (556)의 사용이 도 5에 도시되어 있다.
추가 실시형태에서, 자동화 세포 조작 시스템 (300)이 본 명세서에 제공된다. 도 3a 및 3b에 도시된 바와 같이, 자동화 세포 조작 시스템 (300)은 밀폐형 하우징 (302), 및 밀폐형 하우징 내에 함유된 카세트 (102)를 적절하게 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "밀폐형 하우징"은 열리고 닫힐 수 있는 구조를 지칭하며, 본 명세서에 기술된 카세트 (102)가 그 안에 배치될 수 있고 유체 공급 라인, 가스 공급 라인, 전원, 냉각 연결, 가열 연결 등과 같은 다양한 구성성분과 통합될 수 있다. 도 3a 및 3b에 도시된 바와 같이, 밀폐형 하우징은 카세트의 삽입을 허용하기 위해 개방될 수 있고 (도 3b), 폐쇄되고 밀봉된 환경을 유지하기 위해 폐쇄될 수 있어 (도 3a) 본 명세서에서 기술되는 다양한 자동화 공정이 카세트를 이용하여 발생하도록 허용한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 카세트 (102)는 세포 배양 챔버 (206), 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템 (520), 및 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터 (204)를 적합하게 포함한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 펌핑 시스템은 접선 유동 필터에 잔류물 유동을 제공하고, 접선 유동 필터의 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어된다. 카세트 (102)는 또한 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 세포 샘플 유출 (208)을 적절하게 포함한다.
도 3a-3b에 도시된 바와 같이, 자동화 세포 조작 시스템 (300)은 또한 사용자로부터 유입을 수신하기 위한 사용자 인터페이스 (304)를 추가로 포함한다. 사용자 인터페이스 (304)는 사용자가 원하는 제어 및 기준을 자동화된 공정 및 유로를 제어하기 위해 자동화 세포 조작 시스템에 입력할 수 있게 하는, 터치 패드, 태블릿, 키보드, 컴퓨터 터미널, 또는 다른 적절한 인터페이스일 수 있다. 적절하게는, 사용자 인터페이스는 자동화 세포 조작 시스템에 명령을 제공하고 자동화 세포 조작 시스템의 전반적인 활동을 제어하기 위해 컴퓨터 제어 시스템에 연결된다. 이러한 명령은 다양한 밸브를 열고 닫아야 할 때, 배지 또는 세포 모집단을 제공해야 할 때, 온도를 높이거나 낮추어야 할 때 등을 포함할 수 있다.
자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 접선 유동 필터 (204)의 기공 크기 및 섬유 직경의 예시적인 특성이 본 명세서에 기술되어 있고, 실시형태에서 접선 유동 필터는 약 0.40μm 내지 약 0.80μm의 기공 크기 및 약 0.5mm 내지 약 0.9mm의 섬유 직경, 적합하게는 약 0.60μm 내지 약 0.70μm의 기공 크기 및 약 0.70mm 내지 약 0.80mm의 섬유 직경을 갖는다. 적합하게는 접선 유동 필터에 사용하기 위한 중합체가 본 명세서에 기재되어 있고, 폴리(에테르 술폰), 폴리(아크릴로니트릴) 및 폴리(비닐리덴 디플루오라이드)를 포함한다.
실시형태에서, 자동화 세포 조작 시스템에서 카세트는 접선 유동 필터 (204)에 유체적으로 연결된 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버 (510)를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 자동화 세포 조작 시스템 (300)의 카세트 (102)는 하나 이상의 유체 경로 (540)로, 여기서 유체 경로는 재순환을 제공하는 유체 경로, 폐기물의 제거와 균질한 가스 교환 및 세포 배양 챔버 내에 세포를 건드리지 않고 세포 배양 챔버 (206)에 영양소의 분배를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 세포 배양 챔버는 낮은 챔버 높이를 갖는 평평한 비-신축성 챔버이다. 유체 경로는 또한 접선 유동 필터를 통해 잔류물 유동을 다시 재순환하기 위해 포함될 수 있다. 카세트는 또한 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 위성 부피 (550)를 포함할 수 있다.
자동화 세포 조작 시스템의 실시형태에서, 카세트 (102)에는 배양 배지, 세포 세정 배지 등으로 사전-충진되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 실시형태에서, 자동화 세포 조작 시스템의 카세트는 pH 센서 (524), 글루코스 센서, 산소 센서 (526), 이산화탄소 센서, 및/또는 광학 밀도 센서 중 하나 이상, 및 적절한 실시형태에서, 하나 이상의 샘플링 포트를 추가로 포함할 수 있다.
예시적인 유동 제어기가 본 명세서에서 기술되고, 유동 제한기, 추가 펌핑 시스템, 및 복수의 배관을 갖는 시스템을 포함한다. 실시형태에서, 접선 유동 필터는 카세트 내에서 수평에 대해 약 3° 내지 약 20°의 각도로 있다.
세포 요법 생산에서 단위 작동의 자동화는 동종 및 자가 세포 요법 적용 전반에 걸쳐 보편적인 이점에 대한 기회를 제공한다. 환자-특이적, 자가 세포 제품의 고유한 시나리오와 이들 요법의 임상적 성공으로 더욱 강조되는 경우, 소규모 배치 GMP 준수, 경제성, 환자 추적 가능성 및 공정 편차의 조기 식별의 유의한 마이크로-로트 복잡성으로 인해 자동화의 이점은 특히 매력적이다. 복잡한 제조 프로토콜의 연관된 출현은 마이크로-로트 세포 생산에서 자동화된 단위 작동의 종단 간 통합의 가치가 중요한 연구의 포인트가 아니라는 사실에 주의를 기울인다. 그러나, 그의 임박한 승인에 따라 이들 요법에 대한 예상된 수요는 완전히 폐쇄된 종단 간 시스템의 구현이 적시 실습 및 족문과 같은 제조 병목현상에 대해 훨씬 필요한 해결을 제공할 수 있음을 나타낸다.
첨단 요법의 개발자는 임상 번역의 출시 및 임상 시험 프로토콜의 확대에서 조기에 자동화를 고려하도록 권장된다. 조기 자동화는 프로토콜 개발에 영향을 미치고, 수동 공정에서 나중 단계에서 자동화 공정로 전환하는 경우 비교 가능성 연구에 대한 필요성을 피하고, 장기간 상업화 경로에 대한 더 큰 이해를 제공할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 자동화 세포 조작 시스템은 복수의 챔버를 포함하고, 여기서 본 명세서에 기재된 다양한 방법의 각각의 단계는 자동화 세포 조작 시스템의 복수의 챔버 중 상이한 챔버에서 수행되고, 각각의 활성화 시약, 벡터 및 세포 배양 배지는 방법을 시작하기 이전에 복수의 챔버 중 상이한 챔버에 함유되고, 그리고 여기서 복수의 챔버 중 적어도 하나는 세포를 성장시키기 위한 온도 (예를 들어, 약 37℃)에서 유지되고 복수의 챔버 중 적어도 하나는 냉장된 온도 (예를 들어, 약 4-8℃)에서 유지된다.
실시형태에서, 본 명세서에 기술된 자동화 세포 조작 시스템은 온도 센서, pH 센서, 글루코스 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및/또는 광학 밀도 센서로 모니터링된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 자동화 세포 조작 시스템은 온도 센서, pH 센서, 글루코스 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및/또는 광학 밀도 센서 중 하나 이상을 포함한다. 추가 실시형태에서, 자동화 세포 조작 시스템은 사전-정의된 배양 크기에 기반하여 세포 배양의 온도, pH, 글루코스, 산소 수준, 이산화탄소 수준, 및/또는 광학 밀도를 조정하도록 구성된다. 예를 들어, 자동화 세포 조작 시스템이 세포 배양의 현재 산소 수준이 원하는 세포 배양 크기에 필요한 성장을 달성하기에 너무 낮다는 것을 감지하면, 자동화 세포 조작 시스템은, 예를 들어, 산소화된 세포 배양 배지를 도입하거나, 세포 배양 배지를 산소화된 세포 배양 배지로 대체하거나, 또는 세포 배양 배지를 산소화 구성성분 (즉, 실리콘 배관)을 통해 흐르게 함에 의해 자동으로 세포 배양의 산소 수준을 증가시킬 것이다. 다른 예에서, 자동화 세포 조작 시스템이 세포 배양의 현재 온도가 너무 높다는 것과 세포가 너무 빠르게 성장하고 있음을 감지하면 (예를 들어, 가능한 세포의 과밀화는 바람직하지 않은 특성을 초래할 수 있음), 자동화 세포 조작 시스템은 세포의 안정된 성장 속도 (또는 원하는 경우 지수 성장 속도)를 유지하도록 세포 배양의 온도를 자동으로 낮출 것이다. 더욱 추가의 실시형태에서, 자동화 세포 조작 시스템은 세포 성장 속도 및/또는 세포 계수, 또는 다른 모니터링된 인자 예컨대 pH, 산소, 글루코스 등에 기반하여 세포 공급 (즉, 신선한 배지 및/또는 영양소를 세포 배양에 제공함)의 일정을 자동으로 조정한다. 자동화 세포 조작 시스템은 저온 챔버 (예를 들어, 4℃ 또는 -20℃)에 배지 (및 세정 용액 등과 같은 기타 시약)를 저장하고, 가온된 배지를 세포 배양에 도입하기 전에 실온 챔버 또는 고온 챔버 (예를 들어, 각각 25℃ 또는 37℃)에서 배지를 가온하도록 구성될 수 있다.
추가의 예시적인 실시형태
실시형태 1은 세포 배양 챔버, 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템, 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터를 포함하는 자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 카세트이며, 여기서 펌핑 시스템은 접선 유동 필터에 잔류물 유동을 제공하고, 접선 유동 필터의 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어되고, 세포 샘플 유출은 접선 유동 필터에 유체 연결된다.
실시형태 2는 실시형태 1의 카세트를 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 약 0.40μm 내지 약 0.80μm의 기공 크기 및 약 0.5mm 내지 약 0.9mm의 섬유 직경을 갖는다.
실시형태 3은 실시형태 2의 카세트를 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 약 0.60μm 내지 약 0.70μm의 기공 크기 및 약 0.70mm 내지 약 0.80mm의 섬유 직경을 갖는다.
실시형태 4는 실시형태 1-3 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 폴리(에테르 술폰), 폴리(아크릴로니트릴) 및 폴리(비닐리덴 디플루오라이드)로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함한다.
실시형태 5는 실시형태 1-4 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버를 추가로 포함한다.
실시형태 6은 실시형태 1-5 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 접선 유동 필터를 통해 잔류물 유동을 다시 재순환시키기 위한 유체 경로를 추가로 포함한다.
실시형태 7은 실시형태 1-6 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 위성 부피를 추가로 포함한다.
실시형태 8은 실시형태 1-7 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 하나 이상의 유체 경로를 추가로 포함하고, 여기서 유체 경로는 재순환, 폐기물의 제거와 균질한 가스 교환 및 세포 배양 챔버 내에서 세포를 건드리지 않고 세포 배양 챔버에 영양소의 분배를 제공한다.
실시형태 9는 실시형태 1-8 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 세포 배양 챔버는 낮은 챔버 높이를 갖는 평평한 비-신축성 챔버이다.
실시형태 10은 실시형태 1-9 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, pH 센서, 글루코스 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및/또는 광학 밀도 센서 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
실시형태 11은 실시형태 1-10 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 하나 이상의 샘플링 포트를 추가로 포함한다.
실시형태 12는 실시형태 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 수평에 대해 약 3° 내지 약 20°의 각도에 있다.
실시형태 13은 실시형태 1-12 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 유동 제어기는 유동 제한기이다.
실시형태 14는 실시형태 1-13 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 유동 제어기는 추가 펌핑 시스템이다.
실시형태 15는 실시형태 1-14 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 유동 제어기는 복수의 배관을 갖는 시스템이다.
실시형태 16은 세포 배양 챔버, 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템, 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터를 포함하는 자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 카세트이며, 여기서 펌핑 시스템은 잔류물 유동을 접선 유동 필터에 제공하고 그리고 여기서 접선 유동 필터의 투과물 유동은 유동 제어기, 접선 유동 필터에 연결된 위성 부피, 접선 유동 필터를 통해 잔류물 유동을 다시 재순환시키기 위한 유체 경로, 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버 및 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 세포 샘플 유출에 의해 제어된다.
실시형태 17은 실시형태 16의 카세트를 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 약 0.40μm 내지 약 0.80μm의 기공 크기 및 약 0.5mm 내지 약 0.9mm의 섬유 직경을 갖는다.
실시형태 18은 실시형태 17의 카세트를 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 약 0.60μm 내지 약 0.70μm의 기공 크기 및 약 0.70mm 내지 약 0.80mm의 섬유 직경을 갖는다.
실시형태 19는 실시형태 16-18 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 폴리(에테르 술폰), 폴리(아크릴로니트릴) 및 폴리(비닐리덴 디플루오라이드)로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함한다.
실시형태 20은 실시형태 16-19 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 하나 이상의 유체 경로를 추가로 포함하고, 여기서 유체 경로는 재순환, 폐기물의 제거와 균질한 가스 교환 및 세포 배양 챔버 내에서 세포를 건드리지 않고 세포 배양 챔버에 영양소의 분배를 제공한다.
실시형태 21은 실시형태 16-20 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 세포 배양 챔버는 낮은 챔버 높이를 갖는 평평한 비-신축성 챔버이다.
실시형태 22는 실시형태 16-21 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, pH 센서, 글루코스 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및/또는 광학 밀도 센서 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
실시형태 23은 실시형태 16-22 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 하나 이상의 샘플링 포트를 추가로 포함한다.
실시형태 24는 실시형태 16-23 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 수평에 대해 약 3° 내지 약 20°의 각도로 있다.
실시형태 25는 실시형태 16-24 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 유동 제어기는 유동 제한기이다.
실시형태 26은 실시형태 16-25 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 유동 제어기는 추가 펌핑 시스템이다.
실시형태 27은 실시형태 16-26 중 어느 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 유동 제어기는 복수의 배관을 갖는 시스템이다.
실시형태 28은 자동화 공정 동안 세포 샘플의 부피를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 세포 샘플을 잔류물 유동 및 투과물 유동을 갖는 접선 유동 필터 안으로 도입하는 단계로서, 여기서 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어되는 단계, 세포 샘플을 접선 유동 필터의 잔류물 유동을 통해 통과시키는 단계, 투과물 유동을 통해 세포 샘플로부터 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버로 부피를 제거하는 단계, 및 감소된 부피를 갖는 세포 샘플을 수집하는 단계를 포함한다.
실시형태 29는 실시형태 28의 방법을 포함하며, 부피 제거 단계에 이어서 잔류물 유동을 재순환시켜 세포 샘플을 잔류물 유동을 통해 반복적으로 통과시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 30은 실시형태 28-29 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버가 소정의 부피를 함유하면 부피를 제거하는 단계가 중단된다.
실시형태 31은 실시형태 28-30 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 수집에 이어서 세포 샘플을 세정하는 것, 및 방법의 단계 (a)-(d)를 반복하는 것을 추가로 포함한다.
실시형태 32는 실시형태 28-31 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 수집에 이어서 세포 샘플을 전기천공하는 것을 추가로 포함한다.
실시형태 33은 실시형태 28-32 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 유동 제어기는 유동 제한기이다.
실시형태 34는 실시형태 28-33 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 유동 제어기는 추가 펌핑 시스템이다.
실시형태 35는 실시형태 28-34 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 여기서 유동 제어기는 복수의 배관을 갖는 시스템이다.
실시형태 36은 밀폐형 하우징, 밀폐형 하우징 내에 함유된 카세트로서, 세포 배양 챔버, 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템, 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터로, 여기서 펌핑 시스템은 접선 유동 필터에 잔류물 유동을 제공하고 접선 유동 필터의 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어되는 접선 유동 필터, 및 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 세포 샘플 유출을 포함하는 카세트, 및 사용자로부터 유입을 수신하기 위한 사용자 인터페이스를 포함하는 자동화 세포 조작 시스템이다.
실시형태 37은 실시형태 36의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 약 0.40μm 내지 약 0.80μm의 기공 크기 및 약 0.5mm 내지 약 0.9mm의 섬유 직경을 갖는다.
실시형태 38은 실시형태 37의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 약 0.60μm 내지 약 0.70μm의 기공 크기 및 약 0.70mm 내지 약 0.80mm의 섬유 직경을 갖는다.
실시형태 39는 실시형태 36-38 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 폴리(에테르 술폰), 폴리(아크릴로니트릴) 및 폴리(비닐리덴 디플루오라이드)로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함한다.
실시형태 40은 실시형태 36-39 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버를 추가로 포함한다.
실시형태 41은 실시형태 36-40 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 접선 유동 필터를 통해 잔류물 유동을 다시 재순환시키기 위한 유체 경로를 추가로 포함한다.
실시형태 42는 실시형태 36-41 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 위성 부피를 추가로 포함한다.
실시형태 43은 실시형태 36-42 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 하나 이상의 유체 경로를 추가로 포함하고, 여기서 유체 경로는 재순환, 폐기물의 제거와 균질한 가스 교환 및 세포 배양 챔버 내에서 세포를 건드리지 않고 세포 배양 챔버에 영양소의 분배를 제공한다.
실시형태 44는 실시형태 36-43 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 여기서 세포 배양 챔버는 낮은 챔버 높이를 갖는 평평한 비-신축성 챔버이다.
실시형태 45는 실시형태 36-44 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, pH 센서, 글루코스 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및/또는 광학 밀도 센서 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
실시형태 46은 실시형태 36-45 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 하나 이상의 샘플링 포트를 추가로 포함한다.
실시형태 47은 실시형태 36-46 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 여기서 접선 유동 필터는 수평에 대해 약 3° 내지 약 20°의 각도에 있다.
실시형태 48은 실시형태 36-47 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 컴퓨터 제어 시스템을 더 포함하고, 여기서 사용자 인터페이스는 자동화 세포 조작 시스템에 명령을 제공하기 위해 컴퓨터 제어 시스템에 연결된다.
실시형태 49는 실시형태 36-48 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 여기서 유동 제어기는 유동 제한기이다.
실시형태 50은 실시형태 36-48 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 여기서 유동 제어기는 추가 펌핑 시스템이다.
실시형태 51은 실시형태 36-48 중 어느 하나의 자동화 세포 조작 시스템을 포함하며, 여기서 유동 제어기는 복수의 배관을 갖는 시스템이다.
실시예
실시예 1 - COCOON™ 시스템에서 접선 유동 여과
세포 요법 적용을 위한 접선 유동 여과 (TFF)는 제형화 이전에 수확-후 현탁액에서 세포를 분리, 정화, 회수 및 수집하는 데 사용될 수 있다. 전통적인 TFF 공정은 두 단계로 구성된다: 1) 부피 감소 및 2) 정용여과. 부피 감소 단계 동안 벌크 부피 (수확 시약 및 배양 배지에서의 세포)는 공정 백에서 원하는 세포 농도에 도달할 때까지 필터의 투과 측면을 통한 여과를 통해 지속적으로 제거된다. 정용여과 동안 농축된 세포 현탁 용액은 제형 완충액으로 교체되고 최종 용액에서 바람직하지 않은 잔류 단백질 및 오염물질은 허용 가능한 수준으로 감소된다. 최종 세포 현탁물질은 제형화할 준비가 된 세포 농축에서 완충액에 있을 것이다. 접선 유동 필터는 막힘을 방지하고 세포 손상을 회피하면서 유체 부피를 줄일 수 있으므로 표준 필터보다 선호된다. 세포는 또한 필터에 대해 압축되지 않기 때문에 회수하기도 더 용이하다.
TFF 필터는 단일 사용이고 폐기 가능하므로 폐쇄되고 자동화된 방식으로 작업을 수행하도록 카세트 안으로 쉽게 실현될 수 있다. 완전히 폐쇄된 시스템은, 세포 요법 제품이 최종적으로 멸균되거나 여과될 수 없기 때문에, 공정이 무균적으로 수행되도록 허용한다. 완전히 폐기 가능한 시스템은 교차-오염 위험을 제거하고 세척 필요성을 감소시킨다. COCOON™의 기능성을 증가시키기 위해 카세트에 통합 접선 유동 필터가 제공된다. 이 실시예는 세포 요법 적용을 위한 자동화 시스템에서 세포를 농축하고 세정하는 TFF 시스템의 개발을 자세히 설명한다.
방법
COCOON™ 카세트에서 접선 유동 여과
세포 농축을 위한 TFF 시스템은 전형적으로 2개의 펌프를 가지고 있는데, 하나는 공급 유속을 제어하고 하나는 투과물 (즉, 폐기물) 유속을 제어한다. 각 펌프의 유속은 전형적으로 막횡단 압력을 최적화함에 기반하여 결정된다. 차압이 너무 높거나 너무 낮으면, 필터를 통과하는 것이 없게 할 수 있고 따라서 시스템을 비효율적으로 하거나 막힘을 초래할 수 있다. COCOON™은 일반적으로 압력 센서 없이 단일 펌프로 작동하므로 TFF를 통한 통상의 여과 방법이 적용되지 않는다.
COCOON™ 카세트 또는 카세트-유사 경로에 설치된 TFF 필터로 실험을 실행했다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 카세트 경로는 세포 배양을 위한 팽창 챔버, 세포 공정을 위한 위성 백 또는 L-형상 챔버, 과잉 배지를 제거하기 위한 TFF, 및 과잉 배지를 수집하기 위한 폐기물 백을 함유한다. COCOON™ 카세트는 그 배양 챔버에서 최대 450mL의 배양 배지를 적절하게 재순환한다. COCOON™ 카세트의 다양한 위성 저장소로부터 260㎠ 증식 챔버의 180mL 용량을 초과하는 추가 배지 용량이 제공된다. 이들 위성 저장소로부터 추가 배지는 폐기 가능한 카세트의 배양 분량 내에서 재순환되어 신선한 영양소를 제공하고 증식 챔버에서 세포로부터 폐기물을 제거할 수 있다.
차압을 발생시키기 위해, 유동 제한기가 투과물 라인에 사용되었다. 실험 최적화를 기반으로 하여, 막힘을 방지하고 세포 회수를 최대화하며 부피 감소를 위한 시간을 최소화하는 이상적인 투과물 유속이 선택되었다. 이와 병행하여, 섬유 직경, 섬유 면적, 섬유의 수, 총 표면적, 세포 유형, 잔류물 유속, 기공 크기 및 필터 재료의 영향을 이해하기 위해 광범위한 필터가 시험되었다.
고정된 부피의 폐기물 용기
몇몇 실험은 또한 고정된 부피의 폐기물 용기를 이용하였다. 카세트는 전형적으로 유체 저장소에 위치된 신축성 폐기물 백을 갖는다. 이 백은 팽창하는 능력이 있어 특정 상황에서 잠재적으로 위성 백과 TFF의 완전한 배수를 초래한다. 필터의 완전한 배수는 필터 멤브레인 상에 갇히기 때문에 세포의 비가역적 손실을 초래한다. 폐기물 백의 용량을 제한하기 위해, 그것은 액체 저장소에서 고정된 분리를 갖는 두 개의 단단한 플라스틱 층 사이에 유지될 수 있다. 백은 고정된 부피로 채워지며, 그 지점에서 백에서의 압력은 폐기물에 추가 유체의 전달 없이 위성 백/TFF를 통한 재순환이 계속하도록 된다.
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 농축하기 위한 맞춤 필터
초기 세포 농축 실험은 증가된 표면적 및 큰 기공 크기와 같은 접선 유동 필터의 원하는 특성을 밝혔다. Spectrum Labs P-OCTA01-04-N 필터는 이들 요구사항을 충족하고 Cocoon 카세트 내부에 맞도록 맞춤 설계된 필터이다. 특성은 다음을 포함한다:
mPES 멤브레인
섬유 직경 = 0.75
기공 크기 = 0.65μm
섬유의 수 = 18
루멘 = 총 길이 13cm
표면적 = 57㎠
이 필터를 평가하고 최적화한 다음 개념 증명 전기천공 통합 연구에 사용했다.
맞춤 필터를 사용한 TFF 부피 감소
맞춤 필터의 초기 연구는 COCOON™ 없이 수행되었다. KrosFlo® Research 2i TFF 시스템 (Spectrum Labs)은 세포 공정 동안 공급, 잔류물, 투과물 및 막횡단 압력을 모니터링하는 데 사용되었다. 공급 라인의 유속을 제어하는 단 하나의 펌프가 (달리 언급되지 않는 한) COCOON™ 기기 기능을 모방하기 위해 이용되었다. 20 게이지, 0.024" I.D./0.036" O.D., Nordson EFD로부터 유량 제한기로, 그것은 미리 최적화된 TFF 절차를 모방하기 위해 투과물 라인 말단에 추가되었다. 이 시스템을 사용하여, 100mL의 세포 현탁액을 10-20mL로 농축했다. TFF는 실온에서 벤치탑 상에서 수행되었다. 막횡단 압력은 다음과 같이 정의된다:
TMP = (P 공급 + P 잔류물 )/2 - P투과물
PBMC 배양
1x108 PBMC를 1x108 CD3+:CD28+ Dynabeads (Invitrogen)로 자극하고 최대 10일 동안 다중 GREX 100 (Wilson Wolf) 배양 용기를 사용하여 5% 인간 혈청 A/B (Sigma) 및 10ng/mL IL-2 (Peprotech)가 보충된 X-VIVO 15 배지 (Lonza)로 구성된 완전 T-세포 배지에서 팽창시켰다. 필터를 막을 수 있는 높은 점도 혈청을 수용하기 위해, COCOON™에서 사전-세정 프로토콜은 TFF 공정을 사용하여 부피 감소 이전에 먼저 혈청의 농도를 낮추도록 정의되었다. 세포의 시험 농축물을 250mL 원뿔형 바이알로 옮기고 원심분리하거나 2-4시간 동안 가습된 공기 중 5% CO2가 포함된 37℃ 인큐베이터에 침전되도록 했다. 침전된 세포 현탁액의 상청액을 10mL로 줄이고 과잉의 상청액을 폐기했다. 적절한 배지가 100mL의 최종 부피를 위해 농축된 세포 현탁액에 첨가되었다.
분석
카운트는 사전-희석된 세포 배양물, 희석된 배양물 및 최종 농축된 세포 현탁액에 대해 Nucleocounter NC-200 (Chemometec)을 사용하여 이중으로 수행되었다. 부피는 TFF 전후에 혈청학적 피펫과 KrosFlo 저울을 사용하여 측정되었다. 잔류 시험 샘플은 초기 배양 사전-희석, 상청액 사전-TFF 및 TFF 후 최종 농축된 세포 현탁액으로부터 획득되었다. 인간 혈청 ELISA 키트 (Bethyl Laboratories)를 사용하여 희석 및 농축 후 남은 혈청의 백분율을 결정했다. FACS 분석은 CD4+ 및 CD8+ 발현에 대해 대조군 세포 및 TFF 농축된 세포 현탁액에 대해 수행되었다.
TFF 부피 감소의 성공적인 입증은 다음과 같이 정의되었다:
≥85% TFF 후 세포의 회수
≤10% TFF 후 세포 생존율의 감소
≤10% TFF 후 초기 농축의 잔류 인간 혈청 (전기천공 연구의 경우)
결과
접선 유동 필터의 평가
광범위한 필터가 다양한 필터 매개변수의 영향을 이해하기 위해 시험되었다. 섬유 직경, 섬유 면적, 섬유의 수, 총 표면적, 잔류물 유속, 기공 크기 및 필터 재료는 모두 세포 현탁액의 부피를 줄이는 데 있어 필터의 효율성에 중요한 역할을 한다. 결과는 또한 용액 (예를 들어, 배지 유형 및 혈청의 유형)뿐만 아니라 세포 유형 (예를 들어, 크기), 세포의 수, 세포 농도 및 목표 최종 부피에 의해 영향을 받았다. 정수압도 영향을 미치므로 정수압에 따라 유동 제한기가 조정되어야 했다. 대부분의 실행은 시험된 세포 유형으로 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)를 사용했다.
투과물 유동의 양에서의 가변성을 수용하기 위해, 고정된 부피를 갖는 비-신축성 폐기물 용기가 사용되었다. 예를 들어, 전체 부피에서 100mL를 제거해야 하는 경우, 정확히 100mL의 폐기물 용기가 사용되었다. 유동의 지속시간은 가장 느린 투과물 유동을 기준으로 설정될 수 있다. 바이패스 루프는 인라인 고압 체크 밸브가 있는 펌프 튜브의 양 측면 상에 배치되었다. 펌핑 시간이 완료되기 전에 폐기물이 채워지면, 바이패스 라인이 활성화되어 유체가 순환으로 펌핑되고 따라서 TFF 공정이 종료된다. 이 접근방식은 표 1에서 입증된 바와 같이 폐기물에 대한 매우 일관된 유속을 달성했다. 추가 제어를 위해, 레벨 센서를 COCOON™에 통합하여 비-신축성 용기에서 유체 레벨을 모니터링할 수 있다.
표 1: 고정된 부피의 폐기물 용기 수행 요약
Figure pct00001
맞춤 접선 유동 필터의 평가 및 최적화
다양한 접선 유동 필터의 시험 결과는 바람직한 조건을 나타냈다. 맞춤 필터인 Spectrum Labs P-OCTA01-04-N은 이들 사양을 충족했지만 시험과 최적화가 필요했다. 본 발명자들은 필터가 올바르게 작동하는지 확인하고 처음에는 COCOON™ 시스템의 임의의 제한을 완화하기를 원했다; 따라서, 본 발명자들은 Spectrum Labs TFF 시스템을 사용하여 필터를 평가했다.
필터의 초기 작동 매개변수를 받기 위해 무세포 실행이 개시되었다. RPMI 배지의 부피가 감소했을 때, 일정한 막횡단 압력 (TMP)과 필터를 통한 플럭스가 있었다 (도 6a). 그러나, RMPI에 혈청을 첨가하면, 시간이 지남에 따라 TMP는 증가하고 플럭스는 감소한다 (도 6b). 이것은 필터가 혈청에서의 단백질로부터 막히고 있다는 신호이다.
혈청으로부터의 막힘을 제어하기 위해, 자동화된 배압 밸브 (도 7a 및 7bB) 또는 2차 펌프(도 7c)가 투과물 라인에 추가되었다. 자동화된 배압 밸브는 부피 감소 3분 후 투과물 압력을 제어할 수 있다. 2차 펌프는 투과물 유속을 초기에 20ml/분으로 제어한 다음 5.5분 후에 10ml/분으로 제어했다. 투과물 제어의 두 경우 모두에서, 대부분 일정한 플럭스, 투과물 압력 및 TMP가 있었다. 결과는 COCOON™에서 TFF 투과물 라인 상의 압력을 제어하면 필터 막힘에 대한 제어를 제공한다는 것을 나타낸다.
유사한 경향은 혈청이 없는 PBMC 현탁액의 부피 감소로 관찰된다 (도 8a 및 8b). 투과물에 배압 제어 밸브의 추가는 플럭스, 투과물 압력 및 TMP를 안정화하는 데 도움이 된다. 이는 투과물 제어에 대한 필요성을 추가로 확인한다.
생존력에서 상당한 손실 없이 최대의 세포 회수를 얻기 위해, 공정 매개변수가 최적화된다. 조사된 첫 번째 매개변수는 투과물 제어 펌프를 통한 투과물 압력이다. PMBC + 0% 혈청 현탁액을 농축하는 동안, 재순환 펌프를 60mL/분으로 설정하고 투과물 제어 펌프를 0, 5, 10 또는 15mL/분으로 설정했다 (도 9a-9d). 투과물 펌프의 속도는 플럭스, TMP 또는 투과물 압력에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 15mL/분은 가장 빠른 TFF 지속시간으로 이어질 것이기 때문에 다음 실험을 위해 선택되었다.
재순환 유속이 또한 조사되었다. 0% 혈청 현탁액에서의 PBMC는 15mL/분의 투과물 펌프 및 60mL/분과 70mL/분 중 어느 하나의 재순환 유속으로 TFF에 의해 농축되었다 (표 2). 70mL/분의 유속으로 더 큰 세포 회수가 있었다.
표 2: 투과물 제어를 위한 0% 혈청을 갖는 PMBC의 접선 유동 여과 농도
Figure pct00002
0% 혈청 현탁액에서의 PBMC는 투과액 라인 상의 유동 제한기와 70mL/분의 재순환 유속으로 TFF에 의해 농축되었다 (표 3). 평균 회수는 80% 초과 생존율로 대략 89%이었다.
표 3: 0% 혈청을 갖는 PMBC의 접선 유동 여과 농도 및 유동 제한기
Figure pct00003
많은 세포 요법에서 혈청이 사용되고, 일부 경우에는 TFF 이전에 혈청을 제거하는 것이 불가능할 수 있다. 5% 혈청 현탁액에서의 PBMC는 투과물 라인 상의 유동 제한기와 70mL/분의 재순환 유동으로 TFF에 의해 농축되었다 (표 4). 평균 회수는 80% 초과 생존율로 대략 86%이었다.
표 4: 5% 혈청을 갖는 PMBC의 접선 유동 여과 농도 및 유동 제한기
Figure pct00004
전기천공을 위한 TFF를 통한 COCOON™ 카세트에서 세포 농도
세포 세정 및 농축은 제품의 다운스트림 공정 이전에만 유용하지 않고; 또한 전기천공과 같은 특정 단위 작동을 위한 중간-자동화 공정에 활용될 수도 있다. 세포를 전기천공 단위에 추가하기 전에, 세포를 <10mL로 적절하게 농축하고 잔류물을 세정한다. 개념 증명을 위해, 두 공여체로부터 세포를 4.4×108 및 4.2×108 총 생존 가능한 세포를 갖는 10mL 부피로 침전시켜 농축했다. 그 다음 이들 두 세포 현탁액을 90mL의 보충된 Nucleofector™ Solution (NFS)으로 희석하고 TFF를 사용하여 10mL로 농축했다. TFF 농축 후 세포 회수는 92% 및 87%였다 (도 10a). 형질감염 이전의 세포 생존율은 92% 및 74%였고 TFF 후 5% 미만으로 감소하였다 (도 10b).
실행 모두에서, 초기 배양 상청액의 6% 및 8%가 최종 TFF 농축된 세포 현탁액에서 검출되었다 (표 5).
표 5: 원래의 배양 상청액, 희석 및 농축 후 TFF 투과물, 및 TFF 후 최종 세포 현탁 상청액에서 검출 가능한 인간 혈청 A/B의 백분율.
Figure pct00005
TFF에 의해 농축되지 않은 대조군 배양물과 비교하여 TFF 후 CD4+:CD8+ 프로파일에는 차이가 없었다 (도 11).
이들 결과는 공정-내 형질감염 이전에 세포의 세정 및 농축에서 TFF의 사용을 입증한다.
결론
세정 및 접선 유동 여과를 통한 농축은 COCOON™ 시스템을 사용하여 적절하게 수행될 수 있다. TFF는 공정이 폐쇄되고 자동화된 상태를 유지하게 하고 COCOON™ 폐기 가능한 카세트의 범위 내에서 적합하다. TFF는 <20ml의 세포 현탁액을 농축하고 시스템을 통해 >85%의 세포를 회수할 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법 및 적용에 대한 다른 적절한 변형 및 적응이 임의의 실시형태의 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것은 관련 기술 분야에서 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
특정 실시형태가 본 명세서에서 예시되고 기술되었지만, 청구범위는 기술되고 도시된 부분의 특정 형태 또는 배열로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 명세서에서 예시적인 실시형태가 개시되어 있으며, 특정한 용어가 이용되었지만, 이들은 단지 일반적이고 설명적인 의미로 사용되며 제한을 위한 것은 아니다. 상기 교시에 비추어 실시형태의 변형 및 변동이 가능하다. 따라서 실시형태는 구체적으로 기술된 것과는 다르게 실시될 수 있음을 이해해야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims (51)

  1. 자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 카세트로서,
    (a) 세포 배양 챔버;
    (b) 상기 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템;
    (c) 상기 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터로서, 상기 펌핑 시스템은 상기 접선 유동 필터에 잔류물 유동을 제공하고, 상기 접선 유동 필터의 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어되는, 접선 유동 필터; 및
    (d) 상기 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 세포 샘플 유출을 포함하는, 카세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 약 0.40μm 내지 약 0.80μm의 기공 크기와 약 0.5mm 내지 약 0.9mm의 섬유 직경을 갖는, 카세트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 약 0.60μm 내지 약 0.70μm의 기공 크기와 약 0.70mm 내지 약 0.80mm의 섬유 직경을 갖는, 카세트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 폴리(에테르 술폰), 폴리(아크릴로니트릴) 및 폴리(비닐리덴 디플루오라이드)로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는, 카세트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버를 추가로 포함하는, 카세트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터를 통해 잔류물 유동을 다시 재순환시키기 위한 유체 경로를 추가로 포함하는, 카세트.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 위성 부피를 추가로 포함하는, 카세트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유체 경로를 추가로 포함하고, 여기서 상기 유체 경로는 재순환, 폐기물의 제거와 균질한 가스 교환 및 세포 배양 챔버 내에서 세포를 건드리지 않고 세포 배양 챔버에 영양소의 분배를 제공하는, 카세트.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 챔버는 낮은 챔버 높이를 갖는 편평한 비-신축성 챔버인, 카세트.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, pH 센서, 글루코스 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및/또는 광학 밀도 센서 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 카세트.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 샘플링 포트를 추가로 포함하는, 카세트.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 수평에 대해 약 3° 내지 약 20°의 각도에 있는, 카세트.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 유동 제한기인, 카세트.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 추가 펌핑 시스템인, 카세트.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 복수의 배관을 갖는 시스템인, 카세트.
  16. 자동화 세포 조작 시스템에서 사용하기 위한 카세트로서,
    (a) 세포 배양 챔버;
    (b) 상기 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템;
    (c) 상기 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터로서, 상기 펌핑 시스템은 상기 접선 유동 필터에 잔류물 유동을 제공하고, 상기 접선 유동 필터의 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어되는, 접선 유동 필터;
    (d) 상기 접선 유동 필터에 연결된 위성 부피;
    (e) 상기 접선 유동 필터를 통해 잔류물 유동을 다시 재순환시키기 위한 유체 경로;
    (f) 상기 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버; 및
    (g) 상기 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 세포 샘플 유출을 포함하는, 카세트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 약 0.40μm 내지 약 0.80μm의 기공 크기와 약 0.5mm 내지 약 0.9mm의 섬유 직경을 갖는, 카세트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 약 0.60μm 내지 약 0.70μm의 기공 크기와 약 0.70mm 내지 약 0.80mm의 섬유 직경을 갖는, 카세트.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 폴리(에테르 술폰), 폴리(아크릴로니트릴) 및 폴리(비닐리덴 디플루오라이드)로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는, 카세트.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유체 경로를 추가로 포함하고, 여기서 상기 유체 경로는 재순환, 폐기물의 제거와 균질한 가스 교환 및 세포 배양 챔버 내에서 세포를 건드리지 않고 세포 배양 챔버에 영양소의 분배를 제공하는, 카세트.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 챔버는 낮은 챔버 높이를 갖는 평평한 비-신축성 챔버인, 카세트.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, pH 센서, 글루코스 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및/또는 광학 밀도 센서 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 카세트.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 샘플링 포트를 추가로 포함하는, 카세트.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 수평에 대해 약 3° 내지 약 20°의 각도에 있는, 카세트.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 유량 제한기인, 카세트.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 추가 펌핑 시스템인, 카세트.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 복수의 배관을 갖는 시스템인, 카세트.
  28. 자동화 공정 동안 세포 샘플의 부피를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 세포 샘플을 잔류물 유동 및 투과물 유동을 갖는 접선 유동 필터 안으로 도입하는 단계로서, 여기서 상기 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어되는 단계;
    (b) 상기 세포 샘플을 접선 유동 필터의 잔류물 유동을 통해 통과시키는 단계;
    (c) 상기 투과물 유동을 통해 세포 샘플로부터 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버로 부피를 제거하는 단계; 및
    (d) 상기 감소된 부피를 갖는 세포 샘플을 수집하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 부피 제거 단계에 이어서 잔류물 유동을 재순환시켜 세포 샘플을 잔류물 유동을 통해 반복적으로 통과시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제28항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버가 소정의 부피를 함유하면 부피를 제거하는 단계가 중단되는, 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수집에 이어서 세포 샘플을 세정하고, 상기 방법의 단계 (a)-(d)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수집에 이어서 세포 샘플을 전기천공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 유동 제한기인, 방법.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 추가 펌핑 시스템인, 방법.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 복수의 배관을 갖는 시스템인, 방법.
  36. 자동화 세포 조작 시스템으로서,
    (a) 밀폐형 하우징;
    (b) 상기 밀폐형 하우징 내에 함유된 카세트로서, 상기 카세트는:
    i) 세포 배양 챔버;
    ii) 상기 세포 배양 챔버에 유체적으로 연결된 펌핑 시스템;
    iii) 상기 펌핑 시스템에 유체적으로 연결된 접선 유동 필터로서, 여기서 상기 펌핑 시스템은 접선 유동 필터에 잔류물 유동을 제공하고 상기 접선 유동 필터의 투과물 유동은 유동 제어기에 의해 제어되는, 접선 유동 필터; 및
    iv) 상기 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 세포 샘플 유출을 포함하는, 카세트; 및
    (c) 사용자로부터 유입을 수신하기 위한 사용자 인터페이스를 포함하는, 자동화 세포 조작 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 약 0.40μm 내지 약 0.80μm의 기공 크기와 약 0.5mm 내지 약 0.9mm의 섬유 직경을 갖는, 자동 세포 조작 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 약 0.60μm 내지 약 0.70μm의 기공 크기와 약 0.70mm 내지 약 0.80mm의 섬유 직경을 갖는, 자동 세포 조작 시스템.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 폴리(에테르 술폰), 폴리(아크릴로니트릴) 및 폴리(비닐리덴 디플루오라이드)로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는, 자동화 세포 조작 시스템.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 고정된 부피의 폐기물 수집 챔버를 추가로 포함하는, 자동화 세포 조작 시스템.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터를 통해 잔류물 유동을 다시 재순환시키기 위한 유체 경로를 추가로 포함하는, 자동화 세포 조작 시스템.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터에 유체적으로 연결된 위성 부피를 추가로 포함하는, 자동화 세포 조작 시스템.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유체 경로를 추가로 포함하고, 여기서 상기 유체 경로는 재순환, 폐기물의 제거와 균질한 가스 교환 및 세포 배양 챔버 내에서 세포를 건드리지 않고 세포 배양 챔버에 영양소의 분배를 제공하는, 자동화 세포 조작 시스템.
  44. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 챔버는 낮은 챔버 높이를 갖는 평평한 비-신축성 챔버인, 자동화 세포 조작 시스템.
  45. 제36항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, pH 센서, 글루코스 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및/또는 광학 밀도 센서 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 자동화 세포 조작 시스템.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 샘플링 포트를 추가로 포함하는, 자동화 세포 조작 시스템.
  47. 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 필터는 수평에 대해 약 3° 내지 약 20°의 각도에 있는, 자동화 세포 조작 시스템.
  48. 제36항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 컴퓨터 제어 시스템을 추가로 포함하고, 상기 사용자 인터페이스는 자동화 세포 조작 시스템에 명령을 제공하기 위해 상기 컴퓨터 제어 시스템에 연결되는, 자동화 세포 조작 시스템.
  49. 제36항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 유동 제한기인, 자동화 세포 조작 시스템.
  50. 제36항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 추가 펌핑 시스템인, 자동화 세포 조작 시스템.
  51. 제36항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 제어기는 복수의 배관을 갖는 시스템인, 자동화 세포 조작 시스템.
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