PT84991B

PT84991B - Processo para a producao de actividador do plasminogenio biologicamente activo

Info

Publication number: PT84991B
Application number: PT84991A
Authority: PT
Inventors: William R Arathoon; Stuart E Builder; Anthony S Lubiniecki; Robert D Van Reis
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1986-06-06
Filing date: 1987-06-02
Publication date: 1990-03-08
Also published as: ZA874054B; FR2599625A1; NZ220547A; GB2191493B; DE3718939C2; ATE75775T1; EP0248675B1; ES2032444T3; FR2599625B1; HUT43875A; US5053334A; GB8713267D0; FI91886B; NO872395D0; AU7387287A; IE871504L; EP0248675A1; FI872526A0; PT84991A; JPS6332484A

Description

Células hospedeiras produtoras de t-PA como sejam as que tenham sido transfectadas com vectores recombinantes tendo incorporado operacionalmente DNA codificador de activador do plasminogénio humano tipo tecido, são feitas crescer num meio de suporte do crescimento de preferêji cia contendo um ou mais componentes que ao mesmo tempo que facilitam o crescimento celular são prejudiciais para a recuperação e actividade do produto activador do plasminogénio humano tipo tecido expresso. Tais componentes são práticamente todos excluídos antes da cultura ou removidos do . meio de suporte do crescimento atrvés de troca de meio, de preferência através de filtração tangencial durante a cultura. Após remoção a cultura de células hospedeiras mantêm a capacidade de expressão com ou sem necessidade de mais replicação celular.

activador do plasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo é assim produzido pela expressão nas células mantidas na cultura de células hospedeiras substancialmente liberta de componentes prejudiciais. 0 activador do plasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo é depois isolado a partir das células antes de qualquer purificação que o torne adequado à administração farmacêutica.

-3Processo para a Produção de

Activador do Plasminogénio Biológicamente Activo

Campo do Invento presente invento é dirigido a processos para a produção de activador do plasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo e derivados, particularmente a partir de culturas em suspensão de células hospedeiras recombinantes.

Fundamento do Invento activador do plasminogénio humano tipo tecido converte o plasminogénio em plasmina. A plasmina assim produzida, cliva proteoliticamente as matrizes de fibrina que constituem a estretura fundamental dos coágulos sanguíneos. 0 activador do plasminogénio tipo tecido humano medeia assim, a dissolução de cágulos sanguíneos e é consequentemente útil no tratamento de várias perturbações trombóticas.

A abreviatura t-PA para o activador do plasminogénio humano tipo tecido foi adoptada na sequência da proposta do XXVIII Meeting of the INternational Committee or Thrombosis and Hemostatis, Bergamo, Itália, 27 de Julho de 1982. Tal como aqui são usados os termos activador do plasminogénio humano tipo tecido, t-PA humano, t-PA, activador do plasminogénio humano de tecido ou

activador do plasminogénio de tecido pretende significar activador do plasminogénio humano (tipo tecido) extrínseco produzido por exemplo, por extração e purificação a partir de fontes naturais /ver Collen et al., Pedido de Patente Europeia N^s 41766 (publicado em 16 de Dezembro de 1981 com base num primeiro pedido de 11 de Junho de 1980) e Rijken et al., Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981), aqui incluído por referênciaj θ por sistemas de cultura de células recombinantes conforme descrito juntamente com a sequência de aminoácidos e outras caracteristicas da molécula, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente Europeia N^Q 93619, (publicado em 9 de Novembro de 1983, baseado num primeiro pedido de 5 de Maio de 1982) aqui incluído como referência. Os termos também cobrem equivalentes biológicamente activos de activador do plasminogénio humano tipo tecido, diferindo nos padrões de glicosilação, os quais se pensa serem dependentes das condições específicas de cultura usadas e da natureza do hospedeiro a partir do qual é obtido o activador do plasminogénio humano tipo-tecido e diferindo em um ou mais aminoácidos (s) na sequência total.

Os investigadores dos laboratórios requerentes produziram activador do plasminogénio humano tipo tecido, essencialmente liberto de proteínas às quais está normalmente associado, via tecnologia de DNA recombinante em células procarióticas e eucarióticas (Ver EPA 93619, supra). Assistem várias razões à preferência da produção de activador do plasminogénio humano tipo tecido em hospedeiros eucarióticos recombinantes, como sejam células de mamíferos. Os hospedeiros eucarióticos são de um modo geral eficazes na sua capacidade para reconhecerem e glicosilarem resíduos de aminoácidos específicos na molécula do activador do plasminogénio humano tipo tecido que estão normalmente glicolisados no seu estado nativo, geram as ligações covalentes cruzadas naturais entre os vários resíduos de císteina da molécula do activador do pias-5-

minogénio humano tipo tecido e aproximam melhor a estrutura conformacional global do activador do plasminogénio humano nativo tipo tecido. Pensa-se que estas caracteristicas sejam importantes para a produção de um produto activador do plasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo e seguro.

No entanto, a produção de activador do plasminogénio humano tipo tecido a partir de células hospedeiras recombinantes não se dá sem problemas. Assim, encontrou-se que dificuldades na limitação do rendimento surgem devido às células produtoras do activador do plasminogénio humano tipo tecido serem normalmente cultivadas na presença de soro, várias fracções do sangue ou de outros tecidos animais ou seus hidrolizatos. Como sequência o activador do plasminogénio humano tipo tecido secretado por tais células é exposto a grandes quantidades de proteínas do soro e outros componentes do soro. Encontrou-se que alguns destes componentes invariálvelmente complicam a purificação de um activador do plasminogénio humano tipo-tecido intacto para dar uma forma farmacêuticamente aceitável pois eles formam complexos de agregados ligados à molécula do activador do plasminogénio humano tipo tecido dificeis de separar. Estes agregados também interferem com a actividade biológica da molécula do activador do plasminogénio humano tipo tecido reduzindo assim de modo global os rendimentos normalmente esperados do activador do pasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo. A adição de componentes do soro também aumenta a massa de impurezas que deve ser removidas durante a purificação. Ainda, muitos destes componentes degradam proteoliticamente o activador do plasminogénio humano tipo tecido. A purificação do activador do plasminogé nio humano tipo tecido pretendido a partir destes sistemas coloca dificuldades técnicas necessitando consequentemente de processos mais dispendiosos.

-6Consistentes com estas observações foram sugeridas osmeios sem soros numa tentativa para evitar problemas na produção e purificação de activadores do plasminogénio produzidos endógenamente e secretados pelas células em cultura. Ver, por exemplo, 1) Publicação do Pedido de Patente Europeia N^s 113319 (publicado em 11 de Julho de 1984, baseado num primeiro pedido de 30 de Dezembro de 1982) que divulga a preparação de linhas de células humanas naturais independentes de soro e secretando activador do plasminogénio humano tipo tecido produzido endógenamente, 2) Patente U.S. 4232124, 3) Patente U.S. 4328314 4) Patente U.S. 4317882 e 5) Gasser et al., In vitro Cellular and Developmental Biology 21, 588 (1985). Nenhuma destas referências estão relacionadas com crescimento de células até densidades altas e em particular com as culturas em suspensão de células hospedeiras recombinantes. Por outro lado, a Publicação do Pedido de Patente Europeia N^Q 112940 (publicado em 11 de Julho de 1984, baseado num primeiro pedido de 30 de Dezembro de 1982) é dirigido a um processo para a produção de activador do plasminogénio humano tipo tecido envolvendo a adição de albumina um componente proteico de soro.

Também são conhecidos vários meios de fraccionamento de culturas celulares para remover, por exemplo, componentes do soro. Ver, por exemplo, Van Reis et al., The Journal of Immunology 133, 758 (1984) que reduziu os níveis de proteína do plasma das culturas de células leucocitárias reduzindo desse modo as impurezas do interfurão gama humana bruto produzido endógenamente. (Ver também Van Reis et al., Methods in Enzynology 119,,77). Em novembro de 1982 no Third Annual International Congress for Interforon Research em Miami, Flórida, Van Reis et al divulgaram a utilização da filtração tangencial para reduzir os níveis de proteína do plasma de antóloga na recuperação de interferão gama humano produzido endógenamente

a partir de uma cultura de células humanas. No entanto, a quantidade de interferão recuperada não pode ser aumentada com mais remoção durante a produção.

Constitui um objectivo do presente invento proporcionar processos para a produção (em larga escala) e recuperação de activador do plasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo a partir de uma cultura de células hospedeiras produtoras de activador do plasminogénio humano tipo tecido. E ainda objectivo do presente invento proporcionar tais processos para a produção de activado do plasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo que está substancialmente liberto de degradação, proteolítica, desglicosilação, inibição por vários inibidores de proteases e contaminação e agregação com componentes de soro.

Sumário do Invento

Células hospedeiras produtoras de t-PA como sejam as que tenham sido transfectadas com vectores reccombinantes tendo incluído operacionalmente DNA codificador do activador do plasminogénio humano tipo tecido, são crescidas num meio de suporte do crescimento de preferência contendo um ou mais componentes que ao mesmo tempo que facilitam o crescimento celular são prejudiciais para a recuperação e actividade do produto activador do plasminogénio tipo tecido expresso. Substancialmente todos estes componentes são excluídos antes da cultura ou removidos do meio de suporte do crescimento por troca de meio, de preferência via filtração tangencial, durante a cultura. Após remoção a cultura de células hospedeiras mantêm a ca pacidade de expressão com ou sem necessidade de mais replicação celular.

activador do plasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo é portanto produzido por expressão nas células mantidas na cultura de células hospedeiras substancialmente libertas de componentes prejudiciais. 0 activador do plasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo é depois isolado a partir das células para purificação posterior que o torne adequado à administração farmacêutica.

Inesperadamente o processo do presente invento permite a produção de activador do plasminogénio humano tipo tecido intacto e purificado com rendimento até aqui impensáveis de serem atingidos. Ainda, os processos do presente invento proporciona activador do plasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo tendo uma composição de pelo menos 50% da forma de cadeia simples versus produto tendo uma composição de substancialmente menos forma de cadeia simples obtida antes dos presentes processos

Pensa-se que isto seja importante, além de ser inesperado, pois indica que os processos em questão produzem produto substancialmente liberto de degradação proteolítica em vários sitios de clivagem. Ainda, o material que está predominantemente na forma de cadeia simples parece ter pelo menos a mesma eficácia do material de duas cadeias e apresenta menos degradação do fibrinogénio, resultados que podem ter importância em aplicação elínicas.

Descrição Detalhada

A. Geral

No caso de culturas de células hospedeiras de mamíferos os componentes do meio prejudiciais são tipicamente proteases, glicofases tais como neuraminidases, inibidores de proteases, albumina, etc derivados do sangue ou de outro tecido animal que estão inicialmente presentes no meio de suporte do crescimento.

termo activador do plasminogénio humano de tipo tecido biológicamente activo refere-se ao activador de plasminogénio humano tipo tecido atrás descrito que é capaz de mediar a dissolução in vivo dos coágulos de fibrina do sangue.

termo cultura de células hospedeiras refere-se a uma cultura de células hospedeiras produtoras de t-PA, como sejam as que tenham sido transfectadas com um vector de expressão tendo operacionalmente ligado DNA codificador de activador do plasminogénio tipo tecido. Cultura de células hospedeiras recombinantes é uma cultura de células hospedeiras transfectada com um vector de expressão tendo operacionalmente ligado DNA codificador do activador do plasminogénio humano tipo tecido. São referidos os sistemas de cultura em suspensão de células hospedeiras recombinantes.

Pode neste caso ser empregue numa grande variedade de células hospedeiras. As células hospedeiras adequadas são de preferência capazes de serem transfectadas com vectores recombinantes tendo operacionalmente ligado DNA codificador do activador do plasminogénio humano tipo tecido, produzindo por expressão activador do plasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo e sendo susceptiveis de serem crescidas e mantidas em cultura em suspensão.

Deste modo, qualquer célula hospedeira que produza t-PA e/ou seja adequada a engenharia recombinante para produzir activador do plasminogénio humano tipo tecido recombinante está dentro do âmbito do invento. As células hospedeiras são de preferência de mamífero e incluem células de vário de hamster chinês (CHO) secretoras de activador do plasminogénio humano tipo tecido recombinante (ver EPA 93619, supra) (ATCC Ne CCL61).

No processo do presente invento, células hospedeiras capazes de produzirem activador do plasminogénio humano tipo tecido são primeiro crescidas como uma suspensão de crescimento num meio de suporte do crescimento. Este meio de suporte do crescimento pode ser qualquer meio convencional conhecido na especilidade, as suas variantes para suportar uma cultura da linha celular particular usada para produzir activador do plasminogénio humano tipo tecido. /Ver, por exemplo, ATCCMedia Handbook Ed. Cote et al American type Culture Collection, Rockville, MD ( 1984).] Por exemplo num meio de suporte do crescimento para células de mamífero contém de preferência num suplemento de soro como seja soro fetal de vitela ou outro componente de suplementação vulgarmente usado para facilitar o crescimento e divisão celular como sejam hidrolizatos de carne animal ou leite, extratos de tecidos ou orgãos coágulos macerados ou seus extratos, etc. 0 meio de suporte de crescimento inicial pode também ser um meio que permita o crescimento e manutenção das células hospedeiras e a expressão do activador do plasminogénio humano tipo tecido. Em adição pode ser usado num meio de crescimento convencional deficiente em

glicina e/ou hipoxantina e/ou timidina e/ou contendo metotrexato para manter pressão selectiva sobre células CHO recombiantes contendo um vector de expressão capaz de expressar activador do plasminogénio humano tipo tecido, assim como di-hidrofolato redutase tendo uma baixa afinidade de ligação para o metotrexato. Podem igualmente ser empregues outras marcas seleccionáveis e/ou amplificáveis. Outros componente do meio adequados incluem, por exemplo transferina, insulina e vários metais.

Numa execução, após as células hospedeiras terem crescido até uma densidade celular adequado, e. g. cerca de 1x10⁶/ml a 3x10⁷/ml para células CHO, os componentes prejudiciais no meio de suporte do crescimento foram removidos por troca de meio, de preferência via filtração tanjencial. A filtração tanjencial refere-se a um modo de filtração em que uma suspensão de células produtoras do activador do plasminogénio humano tipo tecido corre substancialmeji te em paralelo a um filtro que é permeável a um componente da suspensão que são as células.

processo de filtração tanjencial é caracterizado por uma série de parâmetros da dinâmica de flu_i_ dos incluindo Re=número de Reynolds,V_w=taxa de cisalhamento da parede, ΔΡ= queda da pressão e TMP= pressão transmembranar. ^Re’^_w ^e dependerão da geometria do sistema de filtração condições de fluxo e propriedade do fluido.

Por exmplo se se usar sistema de filtração de fibras Ôcas pode-se calcular estes parâmetros como segue:

Re = 2 p Q_s/h _s ^nTrr _h

ΔΡ = 8Q_sLh_s/nXr_h ⁴ em que ç> = densidade da suspensão celular, Q$ = fluxo de recirculação da suspensão, = viscosidade dinâmica da suspensão, n = número de fibras Ôcas, r^ = raio interno das fibras ôcas e L = comprimento da fibra ôca. Equações semelhar^ tes podem ser derivadas para outras geometrias de segmento de fluxo. A pressão transmembranar média pode ser calculada como se segue:

TMP ^{= P}in^Pf ^{ΔΡ/2 =} Qf^Rhf^/A em que P_in = pressão de entrada, P_f = pressão do filtrado, Qf = fluxo de filtração, R = resistência da membrana, A = área da membrana e Kf = viscosidade dinâmica do filtrado. Numa execução preferida a geometria segmento de fluxo e parâ metros de operação são escolhidos de modo a minimizar a depo sição de células na membrana de filtração, aumentando assim a eficácia do processo de separação e minimizando a danificação das células induzidas por cisalhamento. A deposição das células pode ser empiricamente determinada como:

DP = V ^1/<2υ À/rc²Y³/² onde DP = parâmetro de deposição, v = viscosidade cinemática

U = velocidade de filtração, função empírica da concentração celular, C e r = raio da célula. Portanto, o proL> U cesso de filtração tangencial será definido pela suspensão celular ( ç> , K , n. v , C e r ), selecção da membrana e geo metria do fluxo (n, r^, L, R e A) e através do controlo dos parâmetros de operação (Q$ e Q^). Numa execução preferida, a geometria do segmento do fluxo e as condições de operação são escolhidas de modo a que Re < 2100 e DP < 0,35.

A concentração dos componentes prejudiciais é reduzida por um processo de filtração tangencial em que a suspensão de células.é recirculada através do aparelho de filtração e uma porção do fluxo é retirado como filtrado sem células. Um volume de suspensão celular constante pode ser mantido pela adição de meio que não contem componentes prejudiciais. A proporção residual final de componentes pre judiciais pode ser calculada como:

em que Cp = concentração dos componentes prejudiciais na sus pensão de produção, C_Q = concentração inicial de componentes prejudiciais na suspensão de crescimento celular, V = voluX me de suspensão celular durante a troca de meio, e = base do logaritmo natural, V_m = volume do meio de troca e Vp = volume final da suspensão de produção. 0 volume de meio trocado necessário para reduzir a concentração de componentes prejudiciais até um nível prédeterminado pode ser calculado como:

-14I

em que ln = log. natural. E óbvio a partir desta equação que uma execução preferida deste invento envolverá uma concentração inicial da suspensão celular para um valor mínimo V antes da troca do volume constante de meio atrás referido. A redução da concentração de componentes prejudiciais é assim I) concentração da suspensão de crescimento ce lume inicial para V_v; II)

A constante de meio e III) conseguida por lular do troca de

V seu vo volume efectuação de uma posterior redução se ^vx <

se o volume da culcélulas inicial de uma redução global

Assim, por exemplo, antes da troca de meio for de 100 lide 10 000 vezes na concentração de tura tros, componentes prejudiciais pode ser conseguida através da concentração da suspensão celular para 10 litros efectuando uma troca de meio usando 45 litros de meio e usando um volume de produção de 1 000 litros.

E assim possível determinar quantitativ_a mente o factor de diluição do meio de suporte de crescimento inicial durante a troca demeio de modo a que a quantidade de componentes prejudiciais na suspensão de células hospedeiras resultante esteja abaixo de uma concentração prédeterminada minimizando assim os efeitos adversos de tais componentes. Tais factores de diluição podem ser determinados para cada lote de meio de crescimento. Por exemplo, os meios de crescimento para células de mamífero suplementado com diferentes concentrações de soro podem necessitar de diferentes factores de diluição para reduzir a quantidade de componentes indesejá_ veis para concentrações funcionalmente equivalentes que permitam a produção de activador do plasminogénio humano tipo tecido farmacêuticamente aceitável. Deste modo o factor de diluição pode ser escolhido de modoa que a quantidade de soro no meio de expressão de células de mamífero final seja, por exemplo, inferior a cerca de 1 por cento do total inicialmente empregue.

As membranas de filtração aqui usadas podem ser seleccionadas entre qualquer uma das conhecidas na especialidade tendo uma membrana e configuração adequadas, de modo a que sejam capazes de reter as células produtoras de activador do plasminogénio humano tipo tecido permitindo simultâneamente a passagem através delas dos vários componentes prejudiciais. Assim pode-se empregar qualquer membrana adequada que permita a retenção de clulas nas condições de dinâmica de fluidos seleccionados ao mesmo tempo que permite a passagem através dela dos componentes prejudiciais para a sua remoção. Serão adequados um limite superior de tamanho de po ro de cerca de 5 microns e um limite inferior de cerca de 0,1 microns.

meio de troca fresco está substancialmente livre de componentes prejudiciais. Por exemplo, ele não contem quaisquer quantidades significativas de componentes prejudiciais, e.g. proteases, neuraminidases, inibidores de proteases, etc. Tal meio, certamente, variará com o tipo de células usado para produzir activador do plasminogénio humano tipo tecido e pode ser seleccionado dos disponíveis na especialidade, por exemplo. Pode ser o mesmo meio final de expressão (por conveniência) ou algum meio menos rico como seja um meio salino isotónico tamponado.

Para as células CHO produtoras de activador do plasminogénio humano tipo tecido aqui descritas, por exemplo, o meio final de expressão pode ser formado a partir de um meio convencional para cultura de células CHO que não esteja suplementado com soro fetal de vitela. Um exemplo do

-16meio final de expressão é uma mistura em partes iguais de meio de Eagle modificação de Dulbecco (com alto teor de glucose) e meio de Ham F-12.

Noutras execuções, os componentes prejudiciais podem ser excluídos, ou substancialmente excluídos, do meio antes da cultura ou podem ser removidos, por exemplo, por centrifugação ou técnicas de sedimentação.

activador do plasminogénio humano tipo tecido foi isolado e depois purificado a partir do meio de expressão e usado como um agente farmacêutico para o tratamento de vários problemas ou doenças vasculares.

B. Execução preferida

Numa execução preferida, células CHO capazes de produzirem activador do plasminogénio humano tipo tecido são crescidas como uma suspensão num meio para CHO sjj plementado com soro fetal de vitela até uma determinada densidade celular. A suspensão de células foi em seguida concentrada por filtração tangencial. 0 soro foi depois removido da suspensão concentrada por filtração tangencial de volume constante ao mesmo tempo que se adicionou continuameji te meio sem soro à mesma velocidade que o meio com soro era removido. 0 activador do plasminogénio humano tipo tecido foi produzido subsequentemente pelas células CHO suspensas no meio de expressão sem soro. 0 activador do plasminogénio humano tipo tecido assim produzido foi secretado pelas células CHO para o meio de expressão e pode ser separado dele por técnicas convencionais.

Vasos de cultura de várias capacidades foram usados para crescer suspensões de células CHO. Cada vaso de cultura foi ligado via tubo de saída a um arranjo de filtros porosos de fluxo tangencial os quais por sua vez estão ligados via tubo de entrada à câmara de cultura. Após crescimento, as suspensões de células CHO e meio contendo s£ ro foram bombeados através do arranjo de filtros porosos de fluxo tangencial primeiro para concentrar a suspensão e depois para permitir a remoção dos componentes do soro durante a troca de meio. A suspensão de células CHO foi reciclada através de filtros e vaso de cultura permitindo que uma porção do meio velho e componentes de soro fossem removidos. Foi fornecido meio de expressão fresco estéril sem soro à suspensão celular para manter um volume nominal no vaso de cultura. Após a concentração do soro ter sido reduzida deste modo até uma concentração predeterminada por troca de meio contínua, as células foram transferidas através de tubos estéreis para um outro vaso contendo meio de expressão sem soro para o qual foi secretado o activador do plasminogénio humano tipo tecido. A partir daqui o activador do plasminogénio tipo tecido pode ser removido por técnicas convencionais.

C. Exemplos

Crescimento das células, troca de meio e fases de produção. Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) (ATCC N² CCL61), transfectadas com o vector de expressão pETPFR (Ver EPO 93619 supra.) e portanto expressando t-PA recombinante foram retiradas do azoto líquido e postas a cre£ cer em meio consistindo numa mistura de Hams F12 e meio de Eagle modificação de Dulbecco. Esta mistura não continha h_i_ poxantina ou timidina. Adicionou-se ao meio soro fetal bovj_

-18no dializado ou diafiltrado (7% v/v) e metotrexato (para 500 nM). As células foram crescidas em cultura em suspensão em vasos de vidro incubados a cerca de 37°C. As células foram subcultivadas e a população expandida neste meio de três em três ou de cinco em cinco dias. Quando se acumularam células suficientes elas foram transferidas para um fermentador de ácido inoxidável de 10 1 para mais um período de crescimento de cerca de três dias. Para esta fase de crescimento a composição do meio foi alterada para dar melhores produções de células e continha tanto hipoxantina como timidina mas não metotrexato. Neste meio foi incorporado soro fetal bovino não dializado (2% v/v) e durante a fase de crescimento de três dias a densidade da população de células aumentou de cer fi β ca de 0,25 χ 10 células/ml para cerca de 1,0 χ 10 células/ /ml.

As células foram então sujeitas a troca de meio conforme descrito anteriormente sendo ressuspensas em meio de produção sem soro durante cerca de 90 horas. A troca de meio foi efectuada como se segue:

Um filtro de fibras ôcas de fluxo tangeji ciai e tubagem de entrada e de saída em borracha de silicone foi esterilizado numa autoclave e depois ligado a um vaso de produção de 10 1 via ligações esterilizáveis por vapor. 0 filtro usado foi uma unidade de fibras ôcas de polissulfona (Fabricante: A.G. Techno-logy, . Inc., filtro # 1BZE100801 AL) contendo 280 fibras ôcas com diâmetros internos de 0,75 mm e nominalmente poros de 0,1 um ao longo dos seus comprimentos. Esta unidade possuia uma área de filtração de 4,15 pés quadrados. As células foram recirculadas através das fibras ôcas e de novo para o vaso utilizando uma bomba Watson Marlow de dois lobos. Foi usado uma velocidade de recirculação de aproximadamente 3,5 litros por minuto e ao mesmo tempo uma

porção do fluido foi retirada e rejeitada como um filtrado límpido a uma velocidade de cerca de 211 mLs por minuto. De^ te modo, as células foram retidas e o volume da cultura reduzido para aproximadamente 5,2 litros. Nesta altura meio fre_s co sem soro e estéril (com a mesma formulação usada atrás mas não contendo soro bovino ou coomponentes derivados dele) foi bombeado para o vaso de cultura a uma velocidade de 211 ml por minuto mantendo deste modo o volume ao mesmo tempo que eliminava por diluição constante o meio velho.

litros de meio fresco sem soro foram bombeados através do sistema para dar uma redução calculada na concentração do soro de cerca de 190 000 vezes (ou menos de 0,0001% por volume) quando uma pequena quantidade da suspensão celular foi adicionada a meio fresco sem soro num fermentador de aço inoxidável de 10 1 separado. As células foram então incubadas para a fase de produção durante cerca de 90 horas a 37°C. Retiraram-se amostras da cultura, clarificaram-se por centrifugação e guardaram-se a -20°C para subsequente análise.

Num segundo exemplo que correu em paralelo todas as condições, células e meios usados foram idênticos excepto o filtro de fibra ôca. Neste caso, o filtro continha 290 fibras ôcas e tinha uma área de filtração de 4,3 pés quadrados mas era no resto semelhante ao descrito atrás (Fabricante : A. G. Technology, Inc., filtro #1810902 AL).

Métodos de Análise

Amostras foram tratadas e analizadas para demonstrar os efeitos nocivos do soro bovino no t-PA produzido pelas células CHO usadas nestes exemplos. Amostras do fluido das culturas celulares clarificado da fase de produção sem soro foram descongeladas, reduzidas com B-mercaptoetamol e sujeitas a electroforese na presença de SDS usando o sistema descontinuo de Laemmli (Laemmli, Nature, 227, 680, ( 1970)). As proteínas separadas deste modo foram sujeitas a coloração com prata (Morrissey, Anal. Biochem, 117, 307 (1981)). ou foram transferidas para uma folha de nitrocelulose, (transferência durante 4 horas a 8°C e 0,5 amps para nitrocelulose de 0,45Mm usando o método de Towbin et al PNAS 76, 6350, (1979). As proteínas e fragmentos proteicos do t-PA e complexos de alto peso molecular contendo t-PA foram visualizados na folha de nitrocelulose por uma técnica de imunoensaio indirecto ligado a enzimas descrita como se segue: Uma reacção inicial com as proteínas de t-PA ligadas e anticorpos de coelho anti-t-PA foi seguida de tratamento com um segundo anticorpo. Este era uma IgG anti-coelho ligada a peroxidase de rábano silvestre (induzida em bode). Após esta reacção a adição do cromóforo 4-C1-naftol em H2O2 e PBS resultou no aparecimento de côr nas regiões de anticorpo ligado ilustrando assim os padrões electroforéticos do t-pa e proteínas associadas. Deste modo usando estas técnicas 0 estado do t-PA nos fluidos de cultura brutos pode ser determinado sem posterior purificação.

	Resultados Para demonstrar os efeitos nocivos do so
ro fetal	bovino sobre 0 t-PA, amostras de fase de produção

foram incubadas com tampão fosfato salino (PBS) ou com 0,179% v/v ou 1,75% v/v de soro fetal bovino durante 22 horas ou 46 horas antes de serem analizadas conforme descrito atrás.

Os resultados disto estão apresentados no gel corado com prata da Figura 1 e na correspondente imunotransferência da Figura 2.

A figura 1 é um gel corado com prata das amostras de t-PA obtidas conforme descrito atrás.

A figura 2 é uma imunotransferência de um gel idêntico ao apresentado na figura 1.

Nas Figuras,

Calha N^	Amostra
1	Padrões de peso molecular /92,5 Kdaltons (K), 66,2 K, 45 K, 31 K, 21,5 K, 14,4 K_7
2	Padrões de referência de t-PA autentico
3	Fluido da cultura celular contem do t-PA (referência de laboratório)
4	fluido da cultura celular da amostra da fase de produção
5	Amostra da fase de produção; Incubado 22 horas a 37°C com tampão fosfato salino (PBS)
6	Amostra da fase de produção; Incubada 46 horas a 37°C com PBS
7	Calha em branco
8	Amostra da fase de produção; Incubada 22 horas a 37o c com

-22Calha Ns

Amostra

0,175 por cento bovino (FBS) Amostra da fase cubada 46 horas por cento (v/v) 0,175 por cento zinho; Incubado 0,175 por cento zinho; Incubado Amostra da fase cubado 22 horas por cento (v/v) Amostra da fase bado 46 horas a por cento (v/v) 1,75 por cento zinho, Incubado 1,75 por cento zinho, Incubado (v/v) soro fetal de produção; Ina 37°C com 0,175 de FBS (v/v) de FBS só22 horas a 37°C (v/v) de FBS só46 horas a 37°C de produção; Ina 37°C com 1,75 de FBS de produção; In37°C com 1,75 de FBS v/v) de FBS só22 horas a 37°C. v/v) de FBS só46 horas a 37°C

Nas Figuras 1 e 2, Calhas 2 e 3 estão os padrões de referência t-PA (t-PA de cadeia simples sendo a banda de alto peso molecular e t-PA de duas cadeias sendo as bandas de pesos moleculares mais baixos).

Os efeitos nocivos observados devidos à presença de soro fetal bovino (FBS) são a) provocar um desaparecimento do t-PA intacto com uma acumulação concomitante de várias formas proteoliticamente derivadas e seus fragmentos (ver Calhas 8 e 9 da Figura 2) e b) a formação

de material complexado de alto peso molecular na gama de 90 a 200 Kdaltons (ver Calhas 12 e 13 da Figura 2).

Os resultados mostram que quando o fluido de cultura celular sem soro, obtido conforme descrito atrás em Crescimento celular, troca de meio e fases de produção foi incubado na presença de PBS durante 22 ou 46 horas ele permaneceu substancialmente inalterado (ver Calhas 5 e 6, Figuras 1 e 2). assim, tanto a degradação proteolitica como a formação de complexos de alto peso molecular do t-PA resultam se se deixar soro fetal bovino no meio de cultura celular durante a fase de produção. Assim, a remoção do soro pelo processo de troca de meio descrito aqui elimina substancialmente os seus efeitos prejudiciais.

Se bem que o descrito atfas se refere a execuções particulares preferidas, compreende-se que o presente invento não lhes está limitado. Será óbvio para os familiarizados com a matéria que vários modificações às execuções divulgadas podem ser feitas e que tais modificações estão dentro do âmbito do presente invento.

Claims

1^e. - Processo para a produção de activador do plasminogénio humano tipo tecido biológicamente activo em cultura de células hospedeeiras, caracterizado por se fazer a remoção a partir do meio da referida cultura, de substancialmente todos os componentes do meio que são prejudiciais à recuperação e à actividade do referido activador do plasminogénio humano tipo tecido, mantendo ao mesmo tempo a capacidade de expressão das células hospedeiras.

2^â. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por os referidos componentes serem excluídos antes da cultura.

3®. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por os referidos componenetes serem removidos a partir do meio durante a cultura via troca de meio.

4^â. - Processo de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por os referidos componentes serem removidos a partir do meio durante a cultura via filtração tanjencial.

5^ã. - Processo de acordo com a Reivindicação 4 caracterizado por a referida filtração tangencial ser efectuada através de uma membrana filtrante plana.

-256^â. - Processo de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por a referida filtração tangencial ser efectuada através da parede de uma fibra porosa oca.

7³. - Processo de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por a referida filtração tangencial ser efectuada através de uma membrana enrolada em espiral.

8². - Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 7 caracterizado por a referida cultura de células hospedeiras ser uma cultura de células hospedeiras recombinantes.

9^â. - Processo de acordo com a Reivindicação 8, carcterizado por a referida cultura de células hospedeiras recombinantes ser uma cultura em suspensão de células hospedeiras recombinantes.

10^. _ Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por os referidos componentes serem removidos fazendo crescer a referida cultura de células hospedeiras num meio de crescimento e de suporte da replicação celular contendo um ou mais componentes que são prejudiciais para a recuperação e actividade do activador do plasminogénio humano tipo tecido, removendo substancialmente a totalidade dos referidos um ou mais componentes da referida cultura de células hospedeiras por filtração tangencial, fornecendo à cultura de células hospedeiras mais meio que está substancialmente livre de componentes prejudiciais à recuperação e à actividade do activador do plaminogénio humano tipo tecido e que é capaz de permitir a expressão pela referida cultura de células hospedeiras de activador do plasminogénio tipo tecido humano sem necessidade de suporte adicional da replicação celular.

11^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os referidos componentes do meio de crescimento e suporte da replicação celular serem derivados do sangue ou tecido ou seus derivados.

12®. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida cultura de célu las hospedeiras ser constituída por células de mamíferos capazes de produzirem activador do plasminogénio humano tipo tecido.

13ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida cultura de céljj las hospedeiras ser constituída por células de mamíferos capazes de produzir activador do plasminogénio humano tipo tecido por expressão recombinante.

14².

Processo de acordo com a reivindicação

13, caracterizado por as referidas células de mamíferos compreenderem células CHO recombinantemente tran£ fectadas.

15⁵. - Cultura de células hospedei ras caracterizada por compreender:

a) células capazes de produzirem activador do plasminogénio humano, tipo tecido; e

-27b) meio

i) substancialmente livre de componentes prejudiciais â recuperação e actividade do activa dor do plasminogénio humano tipo tecido; e ii) capaz de permitir a expressão na referida cultura de células hospedeiras de activador do plasminogénio humano tipo tecido sem necessidade de suporte adicional da replicação celular.

16^â. - Cultura celular de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender células hospedeiras recombinantemente transfectadas.

17^ã. - Cultura celular de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender células de mamífero recombinantemente transfectadas.

18^â. - Cultura celular de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por as referidas células de mamífero compreenderem células CHO recombinantemente transfectadas.