FI91886B - Menetelmä biologisesti aktiivisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi - Google Patents
Menetelmä biologisesti aktiivisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI91886B FI91886B FI872526A FI872526A FI91886B FI 91886 B FI91886 B FI 91886B FI 872526 A FI872526 A FI 872526A FI 872526 A FI872526 A FI 872526A FI 91886 B FI91886 B FI 91886B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- medium
- plasminogen activator
- culture
- human tissue
- cell
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
91886
Menetelmä biologisesti aktiivisen plasminogeeniaktivaat-torin tuottamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää biologisesti ak-5 tiivisen kudosplasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi rekombinantti-isännän solususpensioviljelmässä, joka yh-distelmä-DNA:ta ilmentämällä pystyy tuottamaan biologisesti aktiivista ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattoria.
Ihmisen kudostyyppiä oleva plasminogeeniaktivaat-10 tori muuttaa plasminogeenin plasmiiniksi. Näin muodostunut plasmiini pilkkoo proteolyyttisesti fibriini matriiseja, jotka muodostavat verihyytyrnien perusrakenteen. Ihmisen kudostyyppiä oleva plasminogeeniaktivaattori aiheuttaa siten välillisesti verihyytymien liukenemisen ja 15 on siitä syystä hyödyllinen erilaisten tromboottisten häiriöiden hoidossa.
Lyhennys "t-PA" otettiin käyttöön ihmisen kudos tyyppiä olevalle plasminogeeniaktivaattorille sen jälkeen kun sitä oli ehdotettu kokouksessa the XXVIII Meeting of 20 the International Committee on Thrombosis and Hemostasis, Bergamo, Italia, 27.6.1982. Tässä käytettynä tarkoitetaan termeillä "ihmisen kudostyyppiä oleva plasminogeeniaktivaattori", "ihmisen t-PA", "t-PA", "ihmisen kudoplasmino-geeniaktivaattori" tai "kudosplasminogeeniaktivaattori" 25 ihmisen ulkoa tulevaa (kudostyyppiä olevaa) plasminogee-niaktivaattoria, joka on tuotettu esimerkiksi eristämällä ja puhdistamalla luonnon lähteestä (katso Collen et ai., EP-patenttihakemus nro 41766 (julkaistu 16.12.1981, perustuen ensimmäiseen jättämiseen 11.6.1980) ja Rijken et 30 ai., Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981), jotka liitetään tähän viitteenä), ja yhdistelmä-DNA:ta sisältävien solujen viljelyn menetelmillä, kuten on kuvattu yhdessä molekyylin aminohappojärjestyksen ja muiden ominaisuuksien kanssa esimerkiksi EP-patenttihakemusjulkaisussa nro 2 91886 93619, (julkaistu 9.11.1983, perustuen ensimmäiseen jättämiseen 5.5.1982), joka liitetään tähän viitteenä. Termit koskevat myös biologisesti aktiivisia ihmisen kudos-tyyppiä olevan plasminogeeniaktivaattorin vastikkeita, 5 jotka eroavat glykosyloituneisuustavan suhteen, jonka ajatellaan riippuvan käytetyistä erityisistä viljelyolosuhteista ja sen tuottajaisännän laadusta, josta ihmisen kudostyyppiä oleva plasminogeeniaktivaattori on saatu, ja eroavat kokonaissekvenssiltään yhden tai useamman amino-10 hapon osalta.
Assigneen laboratorioiden tutkijat ovat tuottaneet ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeeniaktivaattoria käytännöllisesti katsoen puhtaana proteiineista, joihin se on tavallisesti liittyneenä, yhdistelmä-DNA-tekniikan 15 avulla prokaryootti- ja eukaryootti-isännissä. (Katso EPÄ 93619, supra). On olemassa useita syitä, joiden vuoksi ihmisen kudostyyppiä olevaa palsminogeeniaktivaattoria tuotetaan mieluimmin eukaryoottisissa yhdistelmä DNA:n isännissä, kuten esimerkiksi imettäväisen soluissa. Euka-20 ryootti-isännät kykenevät yleensä tehokkaasti tunnista maan ja glykosyloimaan sellaisia määrättyjä aminohappo-jäännöksiä ihmisen kudostyyppiä olevassa plasminogeeniak-tivaattorimolekyylissä, jotka ovat tavallisesti glykosy-loituja luonnon tilassa, ja ne muodostavat luonnossa 25 esiintyvät kovalenttiset ristisidokset eri kysteiinijään nösten välille ihmisen kudostyyppiä olevassa plasminogee-niaktivaattorimolekyylissä ja aikaansaavat rakenteelle kokonaiskonformaation, joka muistuttaa lähemmin luonnossa esiintyvää ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeeniakti-: 30 vaattoria. Näitä seikkoja pidetään tärkeinä pyrittäessä tuottamaan biologisesti aktiivista ja turvallista ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeenin aktivaattorituotetta.
Ihmisen kudostyyppiä olevan plasminogeeniaktivaattorin tuottaminen yhdistelmä-DNA:n isäntäsolujen avulla li 91886 3 ei kuitenkaan ole ongelmatonta. Niinpä on todettu esiintyvän saantoa rajoittavia vaikeuksia, jotka johtuvat siitä, että ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeeniakti-vaattoria tuottavia soluja on tapana viljellä seerumin, 5 erilaisten verestä tai muista eläinkudoksista saatujen fraktioiden tai niiden hydrolysaattien läsnä ollessa. Sen johdosta tällaisten solujen erittämä ihmisen kudostyyppiä oleva plasminogeeniaktivaattori joutuu kosketuksiin suurten määrien kanssa seerumin proteiineja ja muita seerumin 10 komponentteja. On todettu, että tietyt näistä komponenteista aina vaikeuttavat ehjän ihmisen kudostyyppiä olevan plasminogeeniaktivaattorin puhdistamista farmaseuttisesti hyväksyttävään muotoon, koska ne muodostavat vaikeasti jaettavia sitoutuneita aggregaattikomplekseja ih-15 misen, kudostyyppiä olevan, plasminogeeniaktivaattorimo-lekyylin kanssa. Nämä aggregaatit häiritsevät myös ihmisen kudostyyppiä olevan plasminogeeniaktivaattorimolekyy-lin biologista aktiivisuutta, vähentäen siten kaiken kaikkiaan tavallisesti odotettuja biologisesti aktiivi-20 sen, ehyen, ihmisen, kudostyyppiä olevan plasminogeeniaktivaattorin saantoja. Seerumin komponenttien lisääminen suurentaa myös epäpuhtauksien määrää, joka on poistettava puhdistettaessa. Lisäksi monet näistä komponenteista ha-joittavat proteolyyttisesti kudostyyppiä olevaa plasmino-25 geenin aktivaattoria. Halutun, ihmisen kudostyyppiä olevan plasminogeeniaktivaattorin puhdistamiseen näistä systeemeistä liittyy teknisiä vaikeuksia, ja se vaatii siten kalliimpia menetelmiä.
Näiden havaintojen vuoksi on ehdotettu käytettä-: 30 väksi seerumittomia elatusaineita pyrittäessä välttämään ongelmia, jotka liittyvät viljeltyjen solujen erittämien endogeenisesti tuotettujen plasminogeeniaktivaattoreiden tuottamiseen ja puhdistamiseen. Katso esimerkiksi 1) EP-patenttihakemusjulkausua nro 113319 (julkaistu 11.6.1984, 4 91886 perustuen ensimmäiseen jättämiseen 30.12.1982), jossa esitellään sellaisten seerumista riippumattomien luonnollisten ihmisen solulinjojen valmistaminen, jotka erittävät endogeenisesti tuotettua ihmisen kudostyyppiä olevaa 5 plasminogeeniaktivaattori, 2) US-patenttia 4 232 124, 3) US-patenttia 4 328 314, 4) US-patenttia 4 317 882 ja 5) Gasser et ai., In Vitro Cellular and Developmental Biology 21, 588 (1985). Mikään näistä viitteistä ei liity solujen kasvatukseen suurella tiheydellä eikä etenkään 10 yhdistelmä-DNA:n isäntäsolujen suspensioviljelmiin. Toisaalta EP-patenttihakemusjulkaisu nro 112940 (julkaistu 11.6.1984, perustuen ensimmäiseen jättämiseen 30.12.1982) koskee sellaista menetelmää ihmisen kudostyyppiä olevan plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi, jossa lisätään 15 albumiinia, erästä seerumin proteiinikomponenttia.
Tunnetaan myös erilaisia keinoja fraktioida soluviljelmiä esimerkiksi seerumin komponenttien poistamiseksi . Katso esimerkiksi Van Reis et ai., The Journal of Immunology 133, 758 (1984), joka vähensi plasman proteii-20 nien määriä leukosyyttisolujen viljelmistä vähentäen siten raa'an endogeenisesti tuotetun ihmisen gamma-interferonin epäpuhtauksia. (Katso myös Van Reis et ai.. Methods in Enzymology 119, 77). Marraskuussa 1982, kokouksessa the Third Annual International Congress for Interferon * 25 Research, Miamissa, Floridassa, Van Reis et ai. selostivat poikittaisvirtaussuodatuksen käyttöä autologisten plasman proteiinien määrien vähentämiseksi otettaessa talteen endogeenisesti tuotettua ihmisen gammaingerfero-nia ihmisen solujen viljelmästä. Talteen saadun interfe--.30 ronin määrää ei kuitenkaan voitu suurentaa suorittamalla lisäksi poistamista tuottamisen aikana.
Tämän keksinnön eräänä tarkoituksena on tarjota käyttöön menetelmiä biologisesti aktiivisen, ihmisen kudostyyppiä olevan plasminogeeniaktivaattorin (suuresta il 5 91S86 mittakaavassa tapahtuvaa) tuottamista ja talteenottoa varten ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeeniaktivaat-toria tuottavien isäntäsolujen viljelmästä. Lisäksi tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota käyttöön tällaisia me-5 netelmiä sellaisen biologisesti aktiivisen, ihmisen, ku-dostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi, joka on suurin piirtein kokonaan ilman proteolyyttistä hajoittumista, deglykosylointia, erilaisten proteaasiin-hibiittorien aiheuttamaa inhibitiota ja epäpuhtautena 10 esiintyviä seerumin komponentteja ja tällaisten kanssa aggregoitumista.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. t-PA:ta tuottavia isäntäsoluja, kuten sellaisilla yhdistelmä-DNA-vek-15 toreilla transfektoituja, jotka vektorit sisältävät toimintakykyisenä ihmisen kudostyyppiä olevan plasminogeeniaktivaattorin koodittavan DNA:n, kasvatetaan kasvua ylläpitävässä elatusaineessa, joka sisältää mieluimmin yhden tai useamman sellaisen komponentin, että ne helpottavat 20 solujen kasvua, mutta haittaavat ilmennetyn ihmisen, kudostyyppiä olevan, plasminogeeniaktivaattori-tuotteen talteen saantia ja aktiivisuutta. Suurin piirtein kaikki sellaiset komponentit suljetaan pois ennen viljelyä tai poistetaan kasvua ylläpitävästä elatusaineesta elatusai-25 neen vaihdon avulla, joka suoritetaan poikittaisvirtaus-suodatuksen avulla, viljelyn aikana. Poistamisen jälkeen isäntäsoluviljelmä säilyttää ilmentämiskyvyn ja solujen lisääntyminen edelleen joko on tarpeen tai ei ole.
Biologisesti aktiivista ihmisen kudostyyppiä ole-. 30 vaa plasminogeeniaktivaattoria tuotetaan sen jälkeen antamalla sen ilmentyä soluissa, joita ylläpidetään isän-täsoluviljelmässä suurin piirtein ilman haitallisia komponentteja. Biologisesti aktiivinen ihmisen kudostyyppiä oleva plasminogeeniaktivaattori eristetään sitten soluis- 91886 6 ta ennen lisäpuhdistusta, jonka avulla se saadaan sopivaksi farmaseuttista antamista varten.
Yllättäen on tämän keksinnön mukaisella menetelmällä mahdollista tuottaa, ehjää ihmisen kudostyyppiä 5 olevaa plasminogeeniaktivaattoria saantoina, jollaisia aikaisemmin ei ole pidetty mahdollisina. Lisäksi tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä saadaan biologisesti aktiivista ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeeniaktivaattoria, joka on koostumukseltaan vähintää 50-prosent-10 tisesti yksiketjuista muotoa, kun taas ennen näitä menetelmiä on saatu tuotetta, jonka koostumuksessa on ollut oleellisesti vähemmän yksiketjuista muotoa. Tätä pidetään merkittävänä, sen lisäksi että se on yllättävää, koska se viittaa siihen, että tässä kysymyksessä olevilla menetel-15 millä saadaan tuotetta, joka ei ole suurin piirtein ollenkaan hajoittunut proteolyyttisesti eri katkaisukohdis-ta. Lisäksi materiaalilla, joka on pääasiallisesti yksiketjuista muotoa, näyttää olevan vähintään sama tehokkuus kuin kaksiketjuisella materiaalilla ja eiintyy vähemmän 20 fibrinogeenin hajottumista, joilla tuloksilla voi olla merkitystä kliinisissä sovellutuksissa.
A. Yleistä
Imettäväisisäntäsolujen viljelmien tapauksessa . ovat haitalliset elatusaineen komponentit tyypillisesti ' 25 verestä tai muusta eläinkudoksesta peräisin olevia pro- teaaseja, glykosidaaseja, kuten esimerkiksi neuramididaa-si, proteaasien inhibiittoreita, albumiini jne., jotka ovat alkujaan läsnä kasvua ylläpitävässä elatusaineessa.
Termillä "biologisesti aktiivinen ihmisen kudos-: 30 tyyppiä oleva plasminogeeniaktivaattori" tarkoitetaan yllä kuvattua ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeeniaktivaattoria, joka kykenee välillisesti aiheuttamaan fibriiniverihyytymien liukenemisen in vivo.
7
Termillä "isäntäsoluviljelmä" tarkoitetaan t-PA:ta tuottavien isäntäsolujen viljelmää, kuten esimerkiksi sellaisten, jotka on transfektoitu ilmentämisvektorilla, joka sisältää toimintakykyisenä kudostyyppinä 5 olevan plasminogeeniaktivaattorin koodittavan DNA:n. "Yhdistelmä-DNA:n sisältävien isäntäsolujen viljelmä" on "isäntäsoluviljelmä", joka on transfektoitu kudos-tyyppiä olevan plasminogeeniaktivaattorin koodittavan DNA:n toimintakykyisenä sisältävällä ilmentämisvekto-10 rilla. Parhaina pidetään "yhdistelmä-DNA:n sisältävien isäntäsolujen suspensioviljelmä" -systeemejä.
Isäntäsoluina käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikan tuloksena ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeeniak-tivaattoria erittäviä kiinalaisen hamsterin munasarjan 15 (CH0-) soluja (katso EPÄ 93619, supra). (ATCC nro CCL61).
Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä kasvatetaan ensin isäntäsoluja, jotka kykenevät tuottamaan ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeeniaktivaattoria, 20 kasvususpensiona "kasvua tukevassa elatusaineessa". Tämä kasvua tukeva elatusaine voi olla mikä tahansa normaali alalla tunnettu elatusaine tai sellaisen muunnelma, joka ylläpitää ihmisen kudostyyppiä olevan plasmi-nogeenin aktivaattorin tuottamiseen käytetyn nimenomai-25 sen solulinjan viljelmää. [Katso esimerkiksi ATCC Media Handbook, toim.: Cote et ai., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1984).] Imettäväisen solujen kasvua tukeva elatusaine sisältää mieluimmin seerumisä-väyksen, kuten esimerkiksi sikiökautisen vasikan seeru-; 30 mia, tai muun sellaisen lisätyn komponentin, jollaisia tavallisesti käytetään helpottamaan solujen kasvua ja 8 91 886 jakautumista, kuten esimerkiksi eläimen lihan hydroly-saatteja tai maitoa, kudos- tai elinuutteita, maseroituja hyytymiä tai niiden uutteita jne. Alkuperäinen kasvua tukeva elatusaine voi myös olla elatusaine, jossa on mah-5 dollista kasvattaa ja ylläpitää isäntäsoluja ja ilmentää ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeeniaktivaat.toria. Lisäksi voidaan käyttää normaalia viljelyainetta, jossa on riittämättömästi glysiiniä ja/tai hypoksantiinia ja/tai tymidiiniä ja/tai joka sisältää metotreksaattia, jotta 10 pidettäisiin yllä valintapainetta sellaisten yhdistelmä-DNA-CHO-solujen hyväksi, jotka sisältävät ilmentämisvekto-rin, joka kykenee ilmentämään ihmisen kudostyyppistä plasminogeenin aktivaattoria samoin kuin vähäisen sitou-tumisaffiniteetin metotreksaattia kohtaan omaavaa di-15 hydrofolaattireduktaasia. Voidaan käyttää myös muita merkitsijöitä, joita on mahdollista selektoida ja/tai lisätä. Muita sopivia elatusaineen komponentteja ovat esimerkiksi transferriini, insuliini ja erilaiset metallit.
Sen jälkeen kun isäntäsolut ovat kasvaneet sopi- 20 vaan solutiheyteen, esim. CHO-solujen kohdalla noin 6 7 tiheyteen 1 x 10 /ml - 3 x 10 /ml, haitalliset komponentit kasvua tukevasta elatusaineesta elatusaineen vaihdon avulla, mieluimmin käyttäen "poikittaisvir-, taussuodatusta". Poikittaisvirtaussuodatus tarkoittaa 25 suodatustapaa, jossa ihmisen kudostyyppiä olevaa plas-minogeeniaktivaattoria tuottavien solujen suspensio virtaa suurin piirtein yhdensuuntaisesti suodattimen kanssa, joka läpäisee suspension muut komponentit kuin solut.
30 Poikkivirtaussuodatusmenetelmälle on tunnusomainen nesteen dynaamisten parametrien ryhmä, johon kuuluvat Re = Reynoldin luku, Yw = seinämänleikkausnopeus, Δρ = paineen pienentyminen ja TMP = paine kalvon lävitse.
Re, Y ja ΔΡ riippuvat suodatussysteemin geometriasta, 35 virtausolosuhteista ja nesteen ominaisuuksista. Esimerkik- 91886 9 si jos käytetään onttokuitusuodatussysteemiä, voidaan nämä parametrit laskea seuraavasti:
Be - iiC/rywr,, TV * .
5 ΔΡ - eQgLn^nr^ jossa p = solususpension tiheys, Q = suspension kierrä-tysvirta, η3 = suspension dynaaminen viskositeetti, n = onttojen kuitujen lukumäärä, r^ = onton kuidun sisäsäde ja L = onton kuidun pituus. Samankaltaisia yhtälöitä 10 voidaan johtaa muille virtaamistiegeometrioille. Keskimääräinen paine kalvon lävitse voidaan laskea seuraavasti:
TOP - Pin-Pf-AP/2 - Q£RryA
jossa Pin = tulopaine, Pf = suodoksen paine, Qf = suoda-15 tusnopeus, R = kalvon vastus, A = kalvon pinta-ala ja = suodoksen dynaaminen viskositeetti. Erityisen hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa valitaan virtaamistien geometria ja käyttöparametrit siten, että saadaan mahdollisimman vähäiseksi solujen kerrostuminen sudatuskalvolle, mikä 20 lisää erottamismenetelmän tehokkuutta ja saa mahdollisimman vähäiseksi solujen leikkausvaurioitumisen. Solujen kerrostuminen voidaan määrittää empiirisesti seuraavan yhtälön mukaisesti: : DP - v1/2UVr_2r3/2 25
jossa DP = kerrostumisparametri, γ = kinemaattinen viskositeetti, U = suodatusnopeus, λ = solukonsentraation C
c empiirinen funktio ja rc = solun säde. Poikittaisvirtaus-suodatusprosessin määrää siten solususpensio (P, ng, η£, 30 γ» Cc ja r ), kalvon virtuasgeometrian valinta (n, r^, L, R ja A) käyttöparametrien kontrolli (Qs ja Qf). Erityisen hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa valitaan virtaamistien geometria ja käyttöolosuhteet siten, että Re < 2100 ja DP < 0,35.
1 O
91886
Haitallisten komponenttien konsentraatiota pienennetään poikittaisvirtaussuodatusmenetelmällä, jossa solu-suspensiota kierrätetään suodatuslaitteen lävitse ja osa virrasta otetaan pois soluttomana suodoksena. Solususpen-5 sion tilavuus voidaan pitää vakiona lisäämällä elatus-ainetta, joka ei sisällä haitallisia komponentteja. Haitallisten komponenttien lopullinen jäljelle jäänyt osuus voidaan laskea seuraavasti:
<-W
Cp-W
vp jossa Cp = haitallisten komponenttien konsentraatio tuot- tamissuspensiossa, CQ = haitallisten komponenttien alku- 15 peräinen konsentraatio solujen kasvususpensiossa, νχ = solususpension tilavuus elatusaineen vaihdon aikana, e = luonnollisen logaritmin kanta, V = vaihtoelatusaineen m tilavuus ja Vp = tuottamissuspension lopullinen tilavuus. Vaihtoelatusaineen tilavuus, joka vaaditaan haitallisten 20 komponenttien konsentraation. pienentämiseksi ennalta määrätylle tasolle, voidaan laske seuravasti:
v„ - V^oVVV
; jossa In = luonnollinen logaritmi. Tästä yhtälöstä käy 25 ilmi, että tämän keksinnön erityisen hyvänä pidettyyn suoritusmuotoon kuuluisi solususpension alkukonsentroimi-nen mahdollisimman pieneen arvoon νχ ennen yllä mainittua elatusaineen vaihtoa, jolloin tilavuus pysyy vakiona. Haitallisten komponenttien konsentraation pienentäminen 30 suoritetaan siten I) konsentroimalla solujen kasvususpen-sio sen alkuperäisestä tilavuudesta V tilavuuteen V ; O Λ II) suorittamalla elatusaineen vaihto tilavuuden pysyessä vakiona ja III) pienentämällä lisää, jos νχ < Vp.
Siten esimerkiksi jos alkuperäisen soluviljelmän 35 tilavuus on ennen elatusaineen vaihtoa 100 litraa, voidaan
II
„ 91886 saada aikaan kaiken kaikkiaan 10 000-kertainen haitallisten komponenttien konsentraation pieneneminen konsentroimalla solususpensio 10 litraksi, suorittamalla elatus-aineen vaihto käyttäen 45 litraa elatusainetta ja käyttä-5 mällä tuottamistilavuutta 1000 litraa.
On siten mahdollista määrätä kvantitatiivisesti alkuperäisen kasvua tukevan elatusaineen elatusaineen vaihdon aikana laimenemisen kerroin siten, että haitallisten komponenttien määrä on saadussa isäntäsolususpensiossa 10 alle ennalta määrätyn konsentraation, jolloin saadaan tällaisten komponenttien haitalliset vaikutukset mahdollisimman vähäisiksi. Tällaisia laimennuskertomia voidaan määrittää jokaiselle viljely-erälle. Esimerkiksi imettäväisten solujen viljelyaineet, joihin on lisätty erilaisia 15 konsentraatioita seerumia, voivat vaatia erilaisia laimen-nuskertoimia ei-toivottujen komponenttien määrän pienentämiseksi funktionaalisesti vastaaviksi konsentraatioiksi, joissa on mahdollista tuottaa farmaseuttisesti hyväksyttävää ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeeniaktivaattor.
20 ria. Niinpä laimennuskerroin voidaan valita sellaiseksi, että seerumin määrä on lopullisessa imettäväisen solujen ilmentämiselatusaineessa esimerkiksi pienempi kuin noin 1 prosentti alkujaan käytetystä kokonaismäärästä.
. Tässä käytettävät suodatuskalvot voivat olla mitä 25 tahansa alalla tunnettuja, jotka ovat kalvoltaan ja kon-figuraatioltaan sopivia, niin että ne kykenevät pitämään ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeeniaktivaattoria tuottavat solut, mutta antavat erilaisten haitallisten komponenttien kulkea läpi. Siten voidaan käyttää mitä 30 tahansa sopivaa kalvoa, joka mahdollistaa solujen pi-tättämisen valituissa nesteen dynaamisissa olosuhteissa, mutta antaa haitallisten komponenttien kulkea lävitse poistettavaksi. Huokoskoon ylärajaksi sopisi noin 5 mikronia ja alarajaksi noin 0,1 mikronia.
12 91 886
Tuore vaihtoelatusaine on suurin piirtein vailla haitallisia komponentteja. Se ei esimerkiksi sisällä merkittäviä määriä vahingollisia komponentteja, kuten esim. proteaaseja, neuramididaaseja, proteaasien inhibiittorei-5 ta jne. Tällainen elatusaine vaihtelee luonnollisesti sen solutyypin mukaan, jota käytetään tuottamaan ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeenin aktivaattoria, ja se voidaan valita esimerkiksi alalla käytettävissä olevista.
Se voi olla sama kuin lopullinen ilmentämiselatusaine 10 (mukavuussyistä) tai jokin niukempi elatusaine, kuten esimerkiksi puskuroitu, isotooninen suolaliuoselatus-aine.
Esimerkiksi tässä kuvatuille ihmisen kudostyyppiä olevaa plasminogeenin aktivaattoria tuottaville CHO-soluil-15 le voidaan lopullinen, ilmentämiselatusaine valmistaa normaalista CHO-solujen viljelyyn käytettävästä elatus-aineesta, johon ei ole lisätty sikiökautisen vasikan seerumia. Esimerkki lopullisesta ilmentämiselatusaineesta on seos, jossa on yhtä suuret osat Dulbecco-muunnettua 20 Eaglesin elatusainetta (runsaasti glukoosia) ja Hamin F-12-elatusainetta.
Toisissa suoritusmuodoissa voidaan haitalliset komponentit jättää pois, tai suurin piirtein kokonaan . jättää pois, elatusaineesta ennen viljelyä tai ne voidaan 25 poistaa esimerkiksi sentrifugointi- tai laskeutusmenet-telyjen avulla.
Ihmisen kudostyyppiä oleva plasminogeeniaktivaat-tori eristetään ja sen jälkeen puhdistetaan ilmentämiselatusaineesta ja sitä käytetään farmaseuttisena vaikut-30 taja-aineena erilaisten verisuonitilojen tai -sairauksien hoitoon.
B. Erityisen hyvänä pidetty suoritusmuoto
Erityisen hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa CHO-soluja, jotka kykenevät tuottamaan ihmisen kudostyyppiä 35 olevaa plasminogeeniaktivaattoria, kasvatetaan suspen- 13 91 886 siona CHO-elatusaineessa, johon on lisätty sikiökautisen vasikan seerumia, ennalta määrättyyn solujen tiheyteen asti. Solususpensio konsentroidaan sitten poikittaisvir-taussuodatuksen avulla. Tämän jälkeen poistetaan seerumi 5 konsentroidusta suspensiosta vakiotilavuudessa tapahtuvan poikittaisvirtaussuodatuksen avulla, lisäten jatkuvasti seerumitonta elatusainetta samalla nopeudella kuin seerumia sisältävää elatusainetta poistetaan. Sen jälkeen annetaan seerumittomaan ilmentämiselatusaineeseen suspen-10 doitujen CHO-solujen tuottaa aktiivista ihmisen kudos-tyyppiä olevaa plasminogeenin aktivaattoria. CHO-solut erittävät tällöin tuottamiansa ihmisen kudostyyppiä olevan plasminogeenin aktivaattorin ilmentämiselatusaineeseen ja se voidaan erottaa siitä yleisillä menetelmillä.
15 CHO-solususpensioiden kasvattamisessa käytetään tilavuudeltaan erilaisia viljelyastioita. Kukin viljely-astia on yhdistetty tuloaukkojen kautta huokoisten tan-gentiaalisen virtauksen suodattimien järjestelmää, joka on puolestaan yhdistetty ulostuloaukkojen kautta takai-20 sin viljeykammioon. Kasvatuksen jälkeen pumpataan CHO- solususpensiot ja seerumia sisältävät elatusaine huokoisten tangentiaalisen virtauksen suodattimien järjestelmän kautta, ensiksi suspension konsentroimiseksi ja sen jälkeen seerumin komponenttien poistamiseksi suspensiosta 25 elatusaineen vaihdon aikana. CHO-solususpensiota kierrätetään suodattimien ja viljelyastian kautta antaen osan vanhasta elatusaineesta ja seerumin komponenteista poistua. Solususpensioon lisätään täydellykseski tuoretta steriiliä ilmentämiselatusainetta, joka ei sisällä see-30 rumia, jotta viljelyastiassa saataisiin pidettyä nimellis-tilavuus. Sen jälkeen kun seerumin konsentraatioksi jatkuvan elatusaineen vaihdon avulla, solut siirretään steriloitujen putkien kautta toiseen, seerumitonta il-mentämiselatusainetta sisältävään astiaan, jonka elatus-35 aineeseen ihmisen kudostyyppiä oleva plasminogeeni- 14 91886 aktivaattori erittyy. Sen jälkeen ihmisen kudostyyppiä oleva plasminogeeniaktivaattori voidaan poistaa yleisillä menetelmillä.
C. Esimerkkejä 5 Solujen kasvatus-, elatusaineen vaihto- ja tuottamisvaiheet
Kiinalaisen hamsterin munasarjan (CHO-) soluja (ATCC nro CCL61), jotka oli transfektoitu ilmentämisvek-torilla pETPFR (katso EP 93619 supra) ja ilmensivät sen 10 vuoksi rekombinantti-t-PA:ta, elvytettiin nesteytetyn typen päällä säilyttämisen jälkeen ja kasvatettiin ela-tusaineessa, jonka muodosti 1:1-seos Hamin F12- ja Dulbecco-muunnettua Eagle'in elatusainetta. Tämä seos ei sisältänyt hypoksantiinia eikä tymidiiniä. Elatusaineeseen 15 lisättiin dialysoitua tai diasuodatettua sikiökautisen naudan seerumia (7 %, tilavuus/tilavuus) ja metotreksaat-tia (500 nMrksi). Soluja kasvatettiin suspensioviljel-mässä lasiastioissa inuboiden noin 37 °C:ssa. Soluja siir-rostettiin uusiksi viljelmiksi ja populaatiota laajen-20 nettiin tähän elatusaineeseen joka 3. - 5. päivä. Kun oli kertynyt riittävästi soluja, ne siirrettiin ruostumatonta terästä olevaan 10 l:n käymisastiaan kasvatettaviksi vielä noin kolmen päivän ajan. Tätä kasvatusvaihetta varten . elatusaineen koostumusta muutettiin, jotta saataisiin 25 parempia solusaantoja, ja se sisälsi sekä hypoksantiinia että tymidiiniä, mutta ei metotreksaattia. Tähän elatus-aineeseen oli lisätty dialysoimatonta sikiökautisen naudan seerumia (2 %, tilavuus/tilavuus), ja kolme päivää kestävän kasvuvaiheen aikana solupopulaation tiheys kasvoi noin 30 suuruudesta 0,25 x 10® solua/ml noin suuruudeksi 1,0 x 10® solua/ml.
Soluille suoritettiin sitten elatusaineen vaihto kuten aikaisemmin on kuvattu, suspendoiden ne seerumitto-maan tuottamiselatusaineeseen noin 90 tunnin ajaksi. Ela-35 tusaineen vaihto suoritettiin seuraavasti:
II
15 91 886
Onttokuitu-tangentiaalisen virtauksen suodatin ja siihen liitetyt sisääntulo- ja poisto-silikonikumiput-ket steriloitiin autoklaavissa ja yhdistettiin sitten 10 l:n tuottamisastiaan höyrysteriloitavien liittymien 5 kautta. Käytetty suodatin oli polysulfonionttokuituyksik-kö (valmistaja: A. G. Technology, Inc., suodatin # 1BZE100801AL), joka sisälsi 280 onttoa kuitua, joiden sisähalkaisija oli 0,75 mm ja joissa oli pitkin pituutta nimellisesti 0,1 um olevia huokosia. Tämän yksikön 2 10 suodatuspinta-ala oli 3 855,5 cm . Soluja kierrätettiin onttojen kuitujen lävitse ja takaisin astiaan käyttäen Watson Marlow -kaksilohkoista pumppua. Käytettiin kier-rätysnopeutta suurin piirtein 3,5 litraa minuutissa ja samanaikaisesti osa nesteestä laskettiin pois ja heitet-15 tiin menemään kirkkaana suodoksena noin nopeudella 211 ml minuutissa. Tällä tavalla säilytettiin solut ja pienennettiin viljelmän tilavuus suurin piirtein 5,2 litraksi. Tänä aikana pumpattiin viljelyastiaan tuoretta steriiliä seerumitonta elatusainetta (koostumukseltaan samaa kuin 20 aikaisemmin käytetty, mutta ilman nauhdan seerumia tai siitä peräisin olevia komponentteja) noin nopeudella 211 ml minuutissa säilyttäen siten tilavuus ennallaan laimennettaessa jatkuvasti vanhaa elatusainetta.
. Systeemin lävitse pumpattiin 55 litraa tuoretta ; 25 seerumitonta elatusainetta, jotta saataisiin laskettu seerumin konsentraation pieneneminen noin 190 00 kertaisesti (tai alle 0,0001 tilavuusprosenttiseksi), kun osa solususpensiosta lisättiin tuoreeseen seerumittomaan elastusaineeseen uuteen ruostumatonta terästä olevaan • : 30 10 l:n käymisastiaan. Soluja inkuboitiin sitten tuot tamisvaihetta varten noin 90 tunnin ajaksi 37 °C:ssa. Viljelmästä otettiin näytteitä, selkeytettiin sentri-fugoimalla ja säilytettiin -20 °C:ssa myöhempää analysointia varten.
16 91886
Toisessa esimerkissä, joka suoritettiin rinnakkaisena, olivat kaikki käytetyt olosuhteet, solut ja ela-tusaineet samoja, paitsi onttokuitusuodatin. Tässä tapauksessa suodatin sisälsi 290 onttoa kuitua ja sen suodatus- 2 5 pinta-ala oli 3 994,8 cm , mutta se oli muuten samanlainen kuin yllä kuvattu {valmistaja: A. G. Technology, Inc., suodatin # 1810902 AL).
Analyys imenetelmiä Näytteitä käsiteltiin ja analysoitiin, jotta osoi-10 tettaisiin naudan seerumin haitalliset vaikutukset näissä esimerkeissä käytettyjen CHO-solujen tuottamaan t-PA:han. Seerumittomasta tuottamisvaiheesta peräisin olevia selkeytetyn soluviljelmänesteen näytteitä sulatettiin, pelkistettiin β-merkaptoetanolilla ja niille suoritettiin S.D.S-15 elektroforeesi käyttäen Laemmlin epäjatkuvaa systeemiä (Laemmli, Nature, 227, 680, (1970)). Tällä tavalla erotetuille proteiineille suoritettiin hopeavärjäys (Morrissey, Anal. Biochem. 117, 307, (1981)) tai ne siirrettiin nitro-selluloosakalvoille (siirto 4 tunnin aikana 8 °C:ssa ja 20 käyttäen 0,5 ampeeria 0,45 μπι:η nitroselluloosalle käyttäen seuraavaa menetelmää: Towbin et ai., PNAS 76, 6350, (1979)). t-PA-proteiinit, -proteiinin palaset ja suuren molekyylipainon omaavat kompleksit, jotka sisälsivät . t-PA:ta, tehtiin silmin nähtäviksi nitroselluloosakalvol- 25 la epäsuoran entsyymin kytketyn immunoanalyysimenetelmän avulla, joka voidaan kuvata seuraavasti: Alkuperäistä sitoutuneiden t-PA-proteiinien ja kaniinin anti-t-PA-vasta-aineen välistä reaktiota seurasi käsittely toisella vasta-aineella. Tämä oli piparjuuriperoksidaasiin kytketty : 30 anti-kaniinin IgG (tuotetta vuohissa). Tämän reaktion jälkeen seurasi kromoforin 4-Cl-naftoli ja PBS:n lisäämistä värin kehittyminen alueilla, jossa oli sitoutunutta vasta-ainetta, minkä avulla saatiin kuva t-PA:n ja siihen liittyneiden proteiinien kulkeutumisesta elektrofo-35 reesissa. Siten voitiin näitä menetelmiä käyttäen määrittää t-PA:n tila raaoissa viljelynesteissä ilman lisäpuhdistusta.
K
17 91 886
Tulokset
Jotta osoitettaisiin sikiökautisen naudan seerumin haitalliset vaikutukset t-PA:han, inkuboitiin tuottamis-vaiheesta peräisin olevia näytteitä fosfaatilla puskuroi-5 dun suolaliuoksen (PBS) kanssa tai 0,175 tilavuus/tila-vuus-prosentin tai 1,75 tilavuus/tilavuus-prosentin kanssa sikiökautisen nauhdan seerumia 22 tunnin tai 46 tunnin ajan ennen kuin ne analysoitiin kuten yllä on kuvattu. Saadut tulokset ovat nähtävissä kuvion 1 hopealla värjä-10 tyssä geelissä ja vastaavassa immunoblotissa kuviossa 2.
Kuviossa 1 on hopealla värjätty t-PA-näytteiden geeli, joka on saatu yllä kuvatulla tavalla.
Kuviossa 2 on immunoblotti kuviossa 1 esitetystä identtisestä geelistä.
15 Kuvissa on
Kaista nro Näyte 1 Molekyylipainostandardeja (92,5 kilodaltonia (K), 66,2 K, 45 K, 31 K, 21,5 K, 14,4 K) 2 Autenttisia t-PA-vertailustandardeja 20 3 t-PA:ta sisältävä solujen viljelyneste (laboratoriovertailunäyte) 4 solujen viljelyneste tuottamisvaihenäytteestä 5 tuottamisvaihenäyte; inkuboitu 22 tuntia • 37 °C:ssa fosfaatilla puskuroidun suolaliuok- 25 sen (PBS) kanssa 6 tuottamisvaihenäyte; inkuboitu 46 tuntia 37 °C:ssa PBS:n kanssa 7 nollakaista 8 tuottamisvaihenäyte; inkuboitu 22 tuntia 30 37 °C:ssa 0,175 prosentin (tilavuus/tilavuus) kanssa sikiökautisen naudan seerumia 9 tuottamisvaihenäyte; inkuboitu 46 tuntia 37 °C:ssa 0,175 prosentin (tilavuus/tilavuus) kanssa FBS:ää 1β 91886 10 0,175 prosenttinen (tilavuus/tilavuus) FBS yksin; inkuboitu 22 tuntia 37 °C:ssa 11 0,175 prosenttinen (tilavuus/tilavuus) FBS yksin; inkuboitu 46 tuntia 37 °C:ssa 5 12 tuottamisvaihenäyte; inkuboitu 22 tuntia 37 °C:ssa 1,75 prosentin (tilavuus/tilavuus) kanssa FBS:ää 13 tuottamisvaihenäyte; inkuboitu 46 tuntia 37 °C:ssa 1,75 prosentin (tilavuus/tilavuus) 10 kanssa FBS:ää
14 1,75-prosenttinen (tilavuus/tilavuus) FBS
yksin; inkuboitu 22 tuntia 37 °C:ssa 15 1,75-prosenttinen (tilavuus/tilavuus) FBS yksin; inkuboitu 46 tuntia 37 °C:ssa 15 Kuvioissa 1 ja 2 ovat kaistat 2 ja 3 t-PA-vertailu- standardeja (yksiketjuista t-PA:ta, joka näkyy suuremman molekyylipainon vyöhykkeenä, ja kaksiketjuista t-PA:ta, joka näkyy pienemmän molekyylipainon vyöhykkeinä).
Haitalliset vaikutukset, jotka on todettu sikiö-20 kautisen naudan seerumin (FBS) länsäololla, ovat a) että se aiheuttaa ehyen t-PA:n häviämistä ja samanaikaisesti erilaisten proteolyyttisesti hajoittuneiden muotojen ja niiden palasten kertymistä (katso kuvion 2 kaistat . 8 & 9) ja b) että muodostuu suuremman molekyylipainon * 25 omaavaa kompleksoitunutta materiaalia alueelta 90 - 200 kilodaltonia (katso kuvion 2 kaistoja 12 & 13).
Tuloksista näkyy, että kun seerumitonta solujen viljelynestettä, joka oli saatu kuten on kuvattu kappaleessa "Solujen kasvatus-, elatusaineen vaihto- ja tuot-; 30 tamisvaiheet", inkuboitiin PBS:n läsnä ollessa 22 tai 46 tunnin ajan, se pysyi suurin piirtein muuttumattomana (katso kuvioiden 1 ja 2 kaistoja 5 ja 6). Siten aiheutuu sekä t-PA:n proteolyyttistä hajoittumista että suuren molekyylipainon omaavien t-PA:n kompleksien muodostumista, 35 jos sikiökautisen naudan seerumin annetaan jäädä tuotta- 91886 1 9 misvaiheen solujenviljelyaineeseen. Näin ollen seerumin poistaminen tässä kuvatun elatusaineenvaihtomenetelmän avulla poistaa suurin piirtein sen haitalliset vaikutukset.
Vaikka edellä olevassa käsitellään eiityisiä parhai-5 na pidettyjä suoritusmuotoja, on selvää, ettei tämä keksintö rajoitu niihin. Alan normaalin ammattitaidon omaavat huomaavat, että esitettyihin suoritusmuotoihin voidaan tehdä erilaisia muunnelmia ja että sellaisten muunnelmien on tarkoitettu sisältyvän tämän keksinnön piiriin.
Claims (8)
1. Menetelmä biologisesti aktiivisen kudosplasmi-nogeeniaktivaattorin tuottamiseksi rekombinantti-isännän 5 solususpensioviljelmässä, joka yhdistelmä-DNA:ta ilmentämällä pystyy tuottamaan biologisesti aktiivista ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattoria, tunnettu siitä, että a) viljellään yhdistelmä-DNA:11a transfektoidut 10 kiinalaisen hamsterin munasarjan (CH0-) isäntäsolut sus- pensioviljelmässä käyttäen kasvua edistävää elatusainet-ta, joka sallii isäntäsolujen kasvun ja ylläpidon; b) poistetaan mainitun viljelmän elatusaineesta sellaiset alustan komponentit, jotka haittaavat ihmisen 15 kudosplasminogeeniaktivaattorin talteenottoa ja biologista aktiivisuutta säilyttäen isäntä-solujen ilmentämisky-vyn, poikittaisvirtaussuodatusmenetelmällä käyttäen suo-datinlaitetta, jossa on sellainen sopiva kalvo, että so-luviljelmäsuspensio kierrätetään suodatinlaitteen läpi ja 20 osa elatusaineesta poistetaan soluttomana suodoksena samalla kun soluviljelmäsuspension homogeeninen luonne säilytetään; c) suodos korvataan elatusaineella, josta kompo- . nentit, jotka haittaavat ihmisen kudosplasminogeeniakti- * 25 vaattorin talteenottoa ja aktiivisuutta, puuttuvat; ja d) kerätään biologisesti aktiivinen ihmisen kudos-plasminogeeniaktivaattori vaihdetussa elatusaineessa olevasta viljelmästä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, : 30 tunnettu siitä, että poikittaisvirtaussuodatus suoritetaan laakean suodatuskalvon läpi.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että poikittaisvirtaussuodatus suoritetaan huokoisen onton kuidun seinämän läpi. 91886
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että poikittaisvirtaussuodatus suoritetaan kalvokierukan läpi.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että kasvua ja solujen lisääntymistä tukevat elatusaineen komponentit ovat peräisin verestä tai kudoksesta tai niiden johdannaisista.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolut sisältävät il- 10 mentämisvektorin, joka pystyy ilmentämään ihmisen kudos-plasminogeeniaktivaattorin ja monistettavan markkerin ja lisäksi solut viljellään elatusaineessa, joka on valittu ylläpitämään selektiivisen paineen ennen vaihetta d) soluille, jotka sisältävät monistettavaa markkeria monena 15 kopiona.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monistettava markkeri on di-hydrofolaattireduktaasi, jolla on alhainen sitoutumisaf-finiteetti metotreksaattiin ja että selektiivisen paineen 20 ylläpitämiseksi valittu elatusaine sisältää metotreksaat- tia.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että poikittaisvirtausmenetelmäl- . le ovat ominaisia solujen kerrostumisparametri, DP, ja 25 joukko nesteen dynaamisia parametreja mukaanlukien Re eli Reynoldin luku, ja että solususpensio, laite ja laitteen suoritusolosuhteet on valittu siten, että Re on pienempi kuin 2100 ja DP on pienempi kuin 0,35. 91886
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87164286A | 1986-06-06 | 1986-06-06 | |
| US87164286 | 1986-06-06 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI872526A0 FI872526A0 (fi) | 1987-06-05 |
| FI872526A FI872526A (fi) | 1987-12-07 |
| FI91886B true FI91886B (fi) | 1994-05-13 |
| FI91886C FI91886C (fi) | 1994-08-25 |
Family
ID=25357832
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI872526A FI91886C (fi) | 1986-06-06 | 1987-06-05 | Menetelmä biologisesti aktiivisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5053334A (fi) |
| EP (1) | EP0248675B1 (fi) |
| JP (1) | JPS6332484A (fi) |
| KR (1) | KR930002888B1 (fi) |
| AT (1) | ATE75775T1 (fi) |
| AU (1) | AU601984B2 (fi) |
| DD (1) | DD257087A5 (fi) |
| DE (2) | DE3718939C2 (fi) |
| DK (1) | DK175366B1 (fi) |
| ES (1) | ES2032444T3 (fi) |
| FI (1) | FI91886C (fi) |
| FR (1) | FR2599625B1 (fi) |
| GB (1) | GB2191493B (fi) |
| GR (1) | GR3005245T3 (fi) |
| HU (1) | HU205171B (fi) |
| IE (1) | IE60485B1 (fi) |
| IL (1) | IL82746A (fi) |
| NO (1) | NO170595C (fi) |
| NZ (1) | NZ220547A (fi) |
| PT (1) | PT84991B (fi) |
| ZA (1) | ZA874054B (fi) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT84991B (pt) * | 1986-06-06 | 1990-03-08 | Genentech Inc | Processo para a producao de actividador do plasminogenio biologicamente activo |
| JP2576200B2 (ja) * | 1988-03-09 | 1997-01-29 | 味の素株式会社 | 生理活性タンパク質の製造法 |
| EP0338716A3 (en) * | 1988-04-21 | 1990-04-11 | Berlex Laboratories, Inc. | Method and system for the production of non-degraded proteins from mammalian cells |
| DE3829244A1 (de) * | 1988-08-29 | 1990-03-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung von einkettigem t-pa |
| EP0391080A3 (de) * | 1989-03-07 | 1990-11-07 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Herstellung von zweikettigem t-PA |
| GB2249099B (en) * | 1990-09-26 | 1995-05-03 | Squibb & Sons Inc | Squalene synthetase |
| US5677184A (en) * | 1994-04-19 | 1997-10-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | CHO cells that express human LH-RH receptor |
| US6077940A (en) * | 1997-12-24 | 2000-06-20 | Genentech, Inc. | Free solution ligand interaction molecular separation method |
| AU2003218572B2 (en) * | 2002-04-08 | 2009-08-20 | Octane Biotech, Inc. | Automated tissue engineering system |
| PL2343362T3 (pl) * | 2006-07-14 | 2016-11-30 | Udoskonalony sposób hodowania komórek | |
| EP3327132A3 (en) * | 2007-08-09 | 2018-07-18 | Wyeth LLC | Use of perfusion to enhance production of fed-batch cell culture in bioreactors |
| CA2787656A1 (en) * | 2010-01-22 | 2011-07-28 | Lonza Walkersville, Inc. | High yield method and apparatus for volume reduction and washing of therapeutic cells using tangential flow filtration |
| US10934519B2 (en) * | 2011-07-29 | 2021-03-02 | Global Life Sciences Solutions Usa Llc | Systems, methods and control laws for cell harvesting |
| CN104583386A (zh) * | 2012-08-20 | 2015-04-29 | 泰尔茂比司特公司 | 浓缩穿过细胞生长腔室循环的流体的组分 |
| AU2018324180A1 (en) | 2017-09-01 | 2020-03-19 | Lonza Cologne Gmbh | End-to-end cell therapy automation |
| SG11202106384YA (en) | 2018-12-21 | 2021-07-29 | Octane Biotech Inc | Carousel for modular biologic production units |
| JP2022514761A (ja) | 2018-12-21 | 2022-02-15 | ロンザ ウォーカーズヴィル，インコーポレーテッド | ウイルスベクターの自動産生方法 |
| WO2020132743A1 (en) | 2018-12-28 | 2020-07-02 | Octane Biotech Inc. | Cell culture and tissue engineering systems with controlled environmental zones |
| CN113498432A (zh) | 2019-02-08 | 2021-10-12 | 隆萨沃克斯维尔股份有限公司 | 用于自动化生物反应器的细胞浓缩方法和装置 |
| AU2022303345A1 (en) | 2021-07-02 | 2024-01-18 | Combangio, Inc. | Processes for making and using a cellular fibronectin composition |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3904480A (en) * | 1972-10-24 | 1975-09-09 | Lilly Co Eli | Enhanced production of plasminogen activator |
| JPS5329985A (en) * | 1976-08-27 | 1978-03-20 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | High concentration culturing of yeast |
| JPS5571496A (en) * | 1978-11-24 | 1980-05-29 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Preparation of living substance |
| US4409331A (en) * | 1979-03-28 | 1983-10-11 | Damon Corporation | Preparation of substances with encapsulated cells |
| US4232124A (en) * | 1979-04-23 | 1980-11-04 | Mann George F | Method of producing plasminogen activator |
| DE3015699C2 (de) * | 1979-04-26 | 1982-07-15 | Asahi Kasei Kogyo K.K., Osaka | Herstellung eines Plasminogen-Aktivators |
| JPS5642584A (en) * | 1979-09-18 | 1981-04-20 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Cell cultivation method |
| US4420398A (en) * | 1981-08-13 | 1983-12-13 | American National Red Cross | Filteration method for cell produced antiviral substances |
| IL68561A (en) * | 1982-05-05 | 1991-01-31 | Genentech Inc | Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof |
| JPS5951220A (ja) * | 1982-08-02 | 1984-03-24 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−およびその製法ならびにこれを含有する薬剤 |
| US4537860A (en) * | 1982-12-08 | 1985-08-27 | Monsanto Company | Static cell culture maintenance system |
| NZ206699A (en) * | 1982-12-30 | 1989-08-29 | Bio Response Inc | Process for the production of serum independent cell lines |
| IE56716B1 (en) * | 1983-01-19 | 1991-11-20 | Genentech Inc | Method for producing human tpa and expression vectors therefor |
| JPS59121172U (ja) * | 1983-02-04 | 1984-08-15 | ミネソタ・マイニング・アンド・マニユフアクチユアリング・コンパニ− | ケーブル電線被覆の剥離部分のカバー装置 |
| US4546083A (en) * | 1983-04-22 | 1985-10-08 | Stolle Research & Development Corporation | Method and device for cell culture growth |
| PH22337A (en) * | 1983-11-21 | 1988-08-12 | Ciba Geigy Ag | Synthesis of fibrinolytic agents by yeast |
| US4740461A (en) * | 1983-12-27 | 1988-04-26 | Genetics Institute, Inc. | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells |
| US4888115A (en) * | 1983-12-29 | 1989-12-19 | Cuno, Incorporated | Cross-flow filtration |
| US4757005A (en) * | 1984-04-19 | 1988-07-12 | Miles Inc. | Method and cell line for obtaining plasminogen activators |
| DE3676604D1 (de) * | 1985-03-22 | 1991-02-07 | Chiron Corp | Expression von epa in saeugetierzellen. |
| AU593264B2 (en) * | 1985-07-10 | 1990-02-08 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Chromosomal DNA sequence, expression vector for human tissue plasminogen activating factor, cultured cells transfected with same and method of producing said activating factor |
| WO1987001389A1 (en) * | 1985-09-06 | 1987-03-12 | Codon | Methods for the recovery of tissue plasminogen activator |
| JPH07110232B2 (ja) * | 1985-10-14 | 1995-11-29 | 株式会社日立製作所 | 遺伝子組換え大腸菌の遺伝子生産物を採取する方法および装置 |
| PT84991B (pt) * | 1986-06-06 | 1990-03-08 | Genentech Inc | Processo para a producao de actividador do plasminogenio biologicamente activo |
-
1987
- 1987-06-02 PT PT84991A patent/PT84991B/pt unknown
- 1987-06-02 IL IL8274687A patent/IL82746A/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-03 NZ NZ220547A patent/NZ220547A/en unknown
- 1987-06-03 HU HU872536A patent/HU205171B/hu unknown
- 1987-06-04 KR KR1019870005638A patent/KR930002888B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-06-04 DK DK198702881A patent/DK175366B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-06-05 FI FI872526A patent/FI91886C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-06-05 FR FR878707905A patent/FR2599625B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 AU AU73872/87A patent/AU601984B2/en not_active Expired
- 1987-06-05 JP JP62142121A patent/JPS6332484A/ja active Granted
- 1987-06-05 IE IE150487A patent/IE60485B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-05 ES ES198787304995T patent/ES2032444T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 NO NO872395A patent/NO170595C/no unknown
- 1987-06-05 GB GB8713267A patent/GB2191493B/en not_active Revoked
- 1987-06-05 DE DE3718939A patent/DE3718939C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 DE DE8787304995T patent/DE3778758D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 ZA ZA874054A patent/ZA874054B/xx unknown
- 1987-06-05 AT AT87304995T patent/ATE75775T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-06-05 DD DD30357587A patent/DD257087A5/de unknown
- 1987-06-05 EP EP87304995A patent/EP0248675B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-05-09 US US07/522,073 patent/US5053334A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-07-21 GR GR920401579T patent/GR3005245T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI91886B (fi) | Menetelmä biologisesti aktiivisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi | |
| RU2222547C2 (ru) | Получение рекомбинантного фактора viii в среде, не содержащей белка | |
| EP0113319B1 (en) | Cell lines and their use for the production of proteins | |
| Bowman et al. | Primary culture of microvascular endothelial cells from bovine retina: selective growth using fibronectin coated substrate and plasma derived serum | |
| US20050019914A1 (en) | Perfusion process for producing erythropoietin | |
| EP0355811B1 (en) | Thrombus control agent | |
| JPH04228066A (ja) | 外来遺伝子発現用培養細胞 | |
| JP2003506077A (ja) | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 | |
| WO1990002175A1 (en) | A method of producing polypeptides by culturing eukaryotic cells in the presence of protease inhibitors | |
| US5576194A (en) | Recombinant protein production | |
| AU2460702A (en) | A method for the production of pharmaceutically active recombinant proteins | |
| US6331403B1 (en) | Use of mCRP to slow cell growth and to promote maturation of cells | |
| Kobayashi et al. | Enhancement effects of BSA and linoleic acid on hybridoma cell growth and antibody production | |
| JP2879906B2 (ja) | プロコラゲナーゼの製造方法 | |
| WO1994003586A1 (en) | A method for detaching intact cells and reducing implant rejection | |
| WO1994003586A9 (en) | A method for detaching intact cells and reducing implant rejection | |
| JPH0947284A (ja) | 動物細胞の培養方法 | |
| EP0115284A2 (en) | Tissue culture medium | |
| JP2837549B2 (ja) | プロコラゲナーゼの製造方法 | |
| JPS61126031A (ja) | コロニ−形成刺激因子の製造法 | |
| JPH05252951A (ja) | プロコラゲナーゼの製造方法 | |
| JPH0532025B2 (fi) | ||
| JPS58146278A (ja) | ウロキナ−ゼの大量製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| HC | Name/ company changed in application |
Owner name: COURTAULDS COATINGS (HOLDINGS) LIMITED |
|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: GENENTECH, INC. |
|
| MA | Patent expired |