DE3718939C2

DE3718939C2 - Verfahren zur Herstellung von biologisch aktivem Plasminogenaktivator

Info

Publication number: DE3718939C2
Application number: DE3718939A
Authority: DE
Inventors: William R Arathoon; Stuart E Builder; Anthony S Lubiniecki; Robert D Van Reis
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1986-06-06
Filing date: 1987-06-05
Publication date: 1998-09-17
Anticipated expiration: 2007-06-06
Also published as: DD257087A5; FI872526A; NO170595B; PT84991A; NO872395L; PT84991B; US5053334A; HU205171B; ES2032444T3; FR2599625B1; KR880000590A; GB2191493B; FR2599625A1; DE3718939A1; KR930002888B1; AU601984B2; EP0248675A1; DK175366B1; AU7387287A; NO872395D0

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biolo gisch aktivem Human-Gewebe-Plasminogenaktivator in einer rekom binanten Suspensions-Wirtzellkultur.

Human-Gewebe-Plasminogenaktivator bewirkt eine Umwandlung von Plasminogen in Plasmin. Das auf dieses Weise gebildete Plasmin spaltet proteolytisch Fibrinmatrices, die das Gerüst von Blut gerinnseln bilden. Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ spielt somit eine vermittelnde Rolle bei der Auflösung von Blutgerinnseln und eignet sich daher zur Behandlung von ver schiedenen thrombotischen Störungen.

Die Abkürzung "t-PA" wurde gemäss einem Vorschlag, der auf dem XXVIII. Meeting of the International Committee on Thrombosis and Hemostatis, Bergamo, Italien, 27. Juli 1982, gemacht wurde, für den Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ eingeführt. Die hier verwendeten Ausdrücke "Plasminogenaktivator vom Human- Gewebe-Typ", "human-t-PA", "t-PA", "Human-Gewebe- Plasminogenaktivator" oder "Gewebe-Plasminogenaktivator" be zeichnen den humanen, exogenen (Gewebe-Typ) Plasminogenakti vator, der beispielsweise aus natürlichen Quellen durch Extrak tion und Reinigung (vgl. Collen et al., EP-A-41766, und Rijken et al., Journal of Biol. Chem., Bd. 256 (1981), S. 7035) oder durch rekombinante Zellkultursysteme erhältlich ist, die zusam men mit der Aminosäuresequenz und anderen charakteristischen Eigenschaften des Moleküls beispielsweise in EP-A-93619, EP-A- 117059 und bei Kaufman, R. J. et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 5(7) (1985), S. 1750-9, beschrieben worden sind. Die vorstehen den Ausdrücke umfassen auch biologisch aktive Äquivalente des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ, die sich in den Glycosylierungsmustern, von denen man annimmt, dass sie von den speziellen Kulturbedingungen und der Art des Wirts, aus dem der Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ erhalten wird, abhän gen, und in bezug auf eine oder mehrere Aminosäuren in der Gesamtsequenz unterschei den.

In den Laboratorien der Anmelderin wurde Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ, der im wesentlichen frei von üblicher weise damit assoziierten Proteinen ist, durch rekombinante DNA-Technik in prokaryotischen und eukaryotischen Wirten hergestellt (vgl. die vorerwähnte EP-A-93619). Es gibt ver schiedene Gründe zur bevorzugten Bildung von Plasminogenakti vator vom Human-Gewebe-Typ in rekombinanten eukaryontischen Wirten, z. B. Säugetierzellen. Eukaryotische Wirte zeichnen sich im allgemeinen durch folgende Fähigkeiten aus: Erkennung und Glycosylierung von speziellen Aminosäureresten im Mole kül des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ, die übli cherweise im nativen Zustand glycosyliert sind; Bildung der natürlicherweise auftretenden kovalenten Vernetzungen zwischen verschiedenen Cysteinresten des Moleküls des Plasminogenakti vators vom Human-Gewebe-Typ; und genauere Annäherung an die Gesamtkonformationsstruktur des nativen Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ. Diese Eigenschaften werden als wichtig für die Bildung von biologisch aktiven und sicheren Plasmino genaktivator-Produkten vom Human-Gewebe-Typ angesehen.

Jedoch ist die Bildung von Plasminogenaktivator vom Human- Gewebe-Typ aus rekombinanten Wirtszellen nicht ohne Schwierig keiten. Es wurde festgestellt, dass die Ausbeute begrenzende Schwierigkeiten auftreten, da die den Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ bildenden Zellen im allgemeinen in Gegen wart von Serum, verschiedenen aus Blut stammenden Fraktionen oder anderen tierischen Geweben oder Hydrolysaten davon ge züchtet werden. Infolgedessen wird der durch derartige Zellen ausgeschiedene Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ grossen Mengen an Serumproteinen und anderen Serumbestand teilen ausgesetzt. Es wurde festgestellt, dass bestimmte die ser Bestandteile in unveränderlicher Weise die Reinigung ei nes intakten Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ er schweren, so dass es nicht möglich ist, eine pharmazeutisch annehmbare Darreichungsform zu erhalten, da diese Bestandteile schwierig abzutrennende gebundene Aggregatkomplexe mit dem Molekül des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ bilden. Diese Aggregate können auch die biologische Aktivität des Moleküls des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ be einträchtigen, wodurch die im allgemeinen erwarteten Ausbeuten an biologisch aktivem Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe- Typ verringert werden. Der Zusatz von Serumbestandteilen er höht auch die Menge an Verunreinigungen, die während des Rei nigungsvorgangs entfernt werden müssen. Ferner führen zahl reiche dieser Bestandteile zu einem proteolytischen Abbau des Plasminogenaktivators vom Gewebe-Typ. Die Reinigung des ge wünschten Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ aus die sen Systemen bringt technische Schwierigkeiten mit sich, was teurere Verfahren erforderlich macht.

In Anbetracht dieser Befunde wurden zur Vermeidung von Schwie rigkeiten bei der Bildung und Reinigung von durch gezüchtete Zellen endogen gebildeten und sekretierten Plasminogenaktiva toren die Verwendung von serumfreien Medien vorgeschlagen; vgl. z. B. 1) EP-A-113319, die die Herstellung von serumunab hängigen natürlichen Humanzellinien, die endogen gebildeten Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ sekretieren, be schreibt; 2) US-PS 4 232 124; 3) US-PS 4 328 314; 4) US-PS 4 317 882 und 5) Gasser et al., In Vitro Cellular and Developmental Biology, Bd. 21 (1985), S. 588. Keine dieser Druckschriften betrifft hochdichtes Zellwachstum und insbeson dere rekombinante Suspensions-Wirtszellkulturen. Andererseits ist die EP-A-112940 auf ein Verfahren zur Bildung von Plasminogen aktivator vom Human-Gewebe-Typ abgestellt, wobei Albumin, d. h. eine Proteinkomponente des Serums, zugesetzt wird.

Es sind verschiedene Massnahmen zur Fraktionierung von Zell kulturen bekannt, um beispielsweise Serumbestandteile zu ent fernen; vgl. Van Reis et al., The Journal of Immunology, Bd. 133 (1984), S. 758, wonach die Plasmaproteinspiegel von Leukozytenzellkulturen verringert werden und dadurch der Ge halt an Verunreinigungen von rohem, endogen gebildetem Human-γ- interferon vermindert wird; vgl. auch Van Reis et al., Methods in Enzymology, Bd. 119, S. 77. Im November 1982 berichteten Van Reis et al. beim Third Annual International Congress for Inter feron Research, Miami, Florida, über die Anwendung der Quer stromfiltration (Cross-Flow Filtration)zur Verringerung der Ko zentration an autologem Plasmaprotein bei der Gewinnung von en dogen gebildetem Human-γ-interferon aus einer menschlichen Zellkultur. Jedoch konnte die gewonnene Interferonmenge durch weitere Entfernung während der Herstellung nicht erhöht werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur grosstechni schen Herstellung und Gewinnung von biologisch aktivem Human- Gewebe-Plasminogenaktivator aus Wirtszellen, die diesen Aktiva tor bilden, bereitzustellen, bei dem biologisch aktiver Human- Gewebe-Plasminogenaktivator anfällt, der im wesentlichen frei von proteolytischem Abbau, Deglycosylierung, Hemmung durch ver schiedene Proteaseinhibitoren sowie Verunreinigung und Aggrega tion mit Serumbestandteilen ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss mit dem Verfahren nach An spruch 1 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Unteransprüche.

t-PA bildende Wirtszellen, z. B. solche, die mit rekombinanten Vektoren, die in wirksamer Weise für Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ kodierende DNA enthalten, transfiziert sind, werden in einem das Wachstum unterstützenden Medium gezüchtet, das vorzugsweise einen oder mehrere Bestandteile enthält, die zwar das Zellwachstum erleichtern, jedoch für die Gewinnung und die Aktivität des gebildeten exprimierten Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ nachteilig sind. Erfindungsgemäss werden im wesentlichen alle diese Bestandteile vor der Züchtung ausge schlossen oder während der Züchtung aus dem Wachstumsmedium durch Querstromfiltration entfernt. Nach der Entfernung behält die Wirtszellkultur ihre Expressionsfähigkeit mit oder ohne Notwendigkeit einer weiteren Zellreplikation.

Anschliessend wird biologisch aktiver Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ durch Expression in den Zellen, die in der Wirtszellkultur im wesentlichen frei von schädlichen Be standteilen gehalten werden, durch Expression gebildet. Der biologisch aktive Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ wird sodann aus den Zellen isoliert, bevor eine weitere Reini gung entsprechend der pharmazeutischen Verabreichung vorgenom men wird.

Überraschenderweise ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren die Herstellung von gereinigtem, intaktem Plasminogenaktiva tor vom Human-Gewebe-Typ in bisher nicht für möglich gehal tenen Ausbeuten. Ferner liefert das erfindungsgemässe Ver fahren biologisch aktiven Plasminogenaktivator vom Human-Ge webe-Typ, wobei das Produkt mindestens zu 50 Prozent einkettig ist, während bei den herkömmlichen Verfahren ein wesentlich geringerer einkettiger Anteil erhalten wird. Dieser Befund wird abgesehen davon, dass er überraschend ist, deswegen für wichtig gehalten, da er anzeigt, dass das erfindungsgemässe Verfahren ein Produkt liefert, das im wesentlichen frei von proteolytischem Abbau an den verschiedenen Spaltungsstellen ist. Ferner besitzt Material, das vorwiegend in einkettiger Form vorliegt, offensichtlich eine mindestens ebenso gute Wirksamkeit wie zweikettiges Material und bewirkt einen ge ringeren Fibrinogenabbau. Diese Ergebnisse können bei der klinischen Anwendung von Bedeutung sein.

Nachstehend wird das erfindungsgemässe Verfahren näher er läutert.

A. Allgemeine Bemerkungen

Im Fall von Säugetier-Wirtszellkulturen handelt es sich bei den schädlichen Bestandteilen der Medien typischerweise um aus Blut oder anderem tierischen Gewebe abgeleitete Prote asen, Glycosidasen, wie Neuraminidase, Proteaseinhibitoren, Albumin, die ursprünglich im Wachstumsmedium vor handen sind.

Der Ausdruck "biologisch aktiver Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ" bezieht sich auf den vorerwähnten Plasmino genaktivator vom Human-Gewebe-Typ, der in der Lage ist, in vivo eine vermittelnde Rolle bei der Auflösung von Fibrin- Blutgerinnseln zu spielen.

Der Ausdruck "Wirtszellkultur" bezieht sich auf eine Kultur von t-PA bildenden Wirtszellen, beispielsweise von Zellen, die mit einem Expressionsvektor, der in wirksamer Weise für Plasminogenaktivator vom Gewebe-Typ kodierende DNA beinhaltet, transfiziert sind. Unter einer "rekombinanten Wirtszellkultur" ist eine "Wirtszellkultur" zu verstehen, die mit einem Ex pressionsvektor, der in wirksamer Weise für Plasminogenakti vator vom Gewebe-Typ kodierende DNA beinhaltet, transfiziert ist. "Rekombinante Suspensions-Wirtszellkultur"-Systeme wer den bevorzugt.

Verschiedenste Wirtszellen können verwendet werden. Geeignete Wirtszellen sind vorzugsweise dazu in der Lage, mit rekombi nanten Vektoren, die in wirksamer Weise für Plasminogenakti vator vom Human-Gewebe-Typ kodierende DNA beinhalten, trans fiziert zu werden, biologisch aktiven Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ bilden und in Suspensionskulturen ge züchtet und aufrechterhalten werden können. Demzufolge können erfindungsgemäss beliebige Wirtszellen verwendet werden, die t-PA bilden und/oder zur rekombinanten Gentechnik unter Bil dung von rekombinantem Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe- Typ geeignet sind. Bei den Wirtszellen handelt es sich vor zugsweise um Säugetierzellen. Hierzu gehören den Plasminogen aktivator vom Human-Gewebe-Typ sekretierende Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen); vgl. die vorerwähnte EP-A-9-3619 (ATCC Nr. CCL61).

Im erfindungsgemässen Verfahren werden Wirtszellen, die zur Bildung von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ in der Lage sind, zuerst als Wachstumssuspension in einem "Wachstums medium" gezüchtet. Bei diesem Wachstumsmedium kann es sich um beliebige bekannte Standard medien oder Variationen davon handeln die die Züchtung der zur Bildung des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ verwendeten speziellen Zellinie unterstützen; vgl. z. B. ATCC Media Handbook, Hrsg. Cote et al., American Type Culture Collection, Rockville, MD, 1984. Ein Wachstumsmedium für Säugetierzellen enthält z. B. vorzugsweise einen Serumzusatz, z. B. fötales Kälberserum oder andere herkömmlicherweise ver wendete Zusatzbestandteile, die zur Erleichterung des Zell wachstums und der Zellteilung eingesetzt werden, wie Hydro lysate von tierischem Fleisch oder Milch, Gewebe- oder Organ extrakte, aufgeschlossene Gerinnsel oder deren Extrakte und dergl. Beim anfänglichen Wachstumsmedium kann es sich auch um ein Medium handeln, das das Wachstum und die Aufrechter haltung der Wirtszellen sowie die Expression von Plasminogen aktivator vom Human-Gewebe-Typ ermöglicht. Ferner kann ein Standardwachstumsmedium mit einem Mangel an Glycin und/oder Hypoxanthin und/oder Thymidin und/oder einem Gehalt an Metho trexat verwendet werden, um einen selektiven Druck in bezug auf rekombinante CHO-Zellen aufrechtzuerhalten, die einen zur Expression von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ fähi gen Expressionsvektor sowie Dihydrofolat-reduktase mit geringer Bindungsaffinität für Methotrexat enthalten. Weitere selektier bare und/oder amplifizierbare Marker können ebenfalls ver wendet werden. Weitere geeignete Mediumbestandteile sind z. B. Transferrin, Insulin und verschiedene Metalle.

Gemäss einer Ausführungsform werden nach dem Wachstum der Wirtszellen bis zu einer geeigneten Zelldichte, z. B. etwa 1 × 10⁶ /ml bis 3 × 10⁷ /ml für CHO-Zellen, die schädlichen Bestand teile in den Wachstumsmedien durch Querstromfiltration entfernt. Unter Querstrom filtration ist eine Filtrationsart zu verstehen, bei der eine Suspension von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ bil denden Zellen im wesentlichen parallel zu einem Filter, der für einen Bestandteil der Suspension, nicht aber für die Zellen durchlässig ist, strömt.

Das Querstromfiltrationsverfahren ist durch eine Gruppe von dynamischen Fluidparametern charakterisiert, einschliesslich Re = Reynolds-Zahl, γ_w = Wandschergeschwindigkeit, ΔP = Druck abfall und TMP = Transmembrandruck. Re, γ_w und ΔP hängen von der Geometrie des Filtrationssystems, den Strömungsbedingungen und den Flüssigkeitseigenschaften ab. Beispielsweise lassen sich bei Anwendung eines Hohlfaser-Filtrationssystems diese Parameter folgendermassen berechnen:

Re = 2ρQ_s/η_snπr_h
γ_w = 4Q_s/nπr_h ³
ΔP = 8Q_sLη_s/nπr_h ⁴

wobei ρ Zellsuspensionsdichte, Q_s = Rezirkulationsströmungs geschwindigkeit der Suspension, η_s= dynamische Viskosität der Suspension, n = Anzahl der Hohlfasern, r_h = Innenradius der Hohlfasern und L = Länge der Hohlfasern. Ähnliche Glei chungen lassen sich für andere Strömungsgeometrien ableiten. Der durchschnittliche Transmembrandruck lässt sich folgender massen berechnen:

TMP= P_in - P_f - ΔP/2 = Q_fRη_f/A

wobei P_in = Einlaßdruck, P_f = Filtratdruck, Q_f = Filtrations geschwindigkeit, R = Membranwiderstand, A = Membranfläche und η_f = dynamische Viskosität des Filtrats. Gemäss einer be vorzugten Ausführungsform werden die Strömungsgeometrie und die Betriebsparameter so gewählt, dass die Zellabscheidung auf der Filtrationsmembran möglichst gering gehalten wird, wodurch die Wirksamkeit des Trennverfahrens verstärkt und die durch Schereinwirkung hervorgerufene Zellschädigung möglichst gering gehalten wird. Die Zellabscheidung lässt sich empirisch folgendermaßen festlegen:

DP = ν^1/2Uλ/r_c ²ν^3/2

wobei DP = Abscheidungsparameter, ν = kinematische Viskosität, U = Filtrationsgeschwindigkeit, λ = empirische Funktion der Zellkonzentration C_c und R_c = Zellradius. Somit wird das Querstromfiltrationsverfahren durch die Zellsuspension (ρ, η_s, η_f, ν, C_c und r_c), die Wahl der Membran und die Strömungsgeo metrie (n, r_h, L, R und A) sowie durch die Kontrolle der Be triebsparameter (Q_s und Q_f) definiert. Gemäss einer bevor zugten Ausführungsform werden die Strömungsgeometrie und die Betriebsbedingungen so gewählt, dass Re < 2100 und DP < 0,35.

Die Konzentration der schädlichen Bestandteile wird durch ein Querstromfiltrationsverfahren verringert, bei dem man die Zellsuspension durch die Filtrationsvorrichtung rezirkuliert und einen Teil des Stroms als zellfreies Filtrat entnimmt. Ein konstantes Zellsuspensionsvolumen kann aufrechterhalten werden, indem man Medien, die keine schädlichen Bestandteile enthalten, zusetzt. Der endgültige Restanteil an schädlichen Bestandteilen lässt sich folgendermassen berechnen:

wobei C_p = Konzentration der schädlichen Bestandteile in der Herstellungssuspension, C_o = ursprüngliche Konzentration der schädlichen Bestandteile in der Zellwachstumssuspension, V_x = Volumen der Zellsuspension während des Mediumaustausches, e = Basis des natürlichen Logarithmus, V_m = Volumen der Austausch medien und V_p = endgültiges Volumen der Herstellungssuspension. Das Volumen der erforderlichen Austauschmedien, um die Konzen tration der schädlichen Bestandteile auf einen vorbestimmten Wert zu verringern, lässt sich folgendermassen berechnen:

V_m = V_xln(C_oV_x/C_pV_p)

wobei ln = natürlicher Logarithmus. Aus dieser Gleichung geht hervor, dass bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfin dung eine ursprüngliche Konzentration der Zellsuspension vor dem vorerwähnten Medienaustausch bei konstantem Volumen auf einen Minimalwert V_x gebracht wird. Die Verringerung der Konzentration der schädlichen Bestandteile wird somit erreicht, indem man I) die Zellwachstumssuspension von ihrem ursprüng lichen Volumen V_o auf V_x einengt; II) einen Medienaustausch mit konstantem Volumen durchführt; und III) eine weitere Ver ringerung erzielt, wenn V_x < V_p.

Beträgt somit beispielsweise das Volumen der ursprünglichen Zellkultur vor dem Mediumaustausch 100 Liter, so lässt sich eine insgesamt 10 000-fache Verringerung der Konzentration an schädlichen Bestandteilen erreichen, indem man die Zell suspension auf 10 Liter einengt, einen Medienaustausch unter Verwendung von 45 Liter an Medien durchführt und ein Produk tionsvolumen von 1000 Liter anwendet.

Somit ist es möglich, den Verdünnungsfaktor des ursprünglichen Wachstumsmediums während des Mediumaustausches quantitativ so festzulegen, dass der Anteil an schädlichen Bestandteilen in der erhaltenen Wirtszellsuspension unter einer vorbestimm ten Konzentration liegt, wodurch die nachteiligen Wirkungen dieser Bestandteile auf einem Minimum gehalten werden. Diese Verdünnungsfaktoren lassen sich für jeden einzelnen Ansatz des Wachstumsmediums festlegen. Beispielsweise können mit unterschiedlichen Konzentrationen an Serum ergänzte Säugetier wachstumsmedien unterschiedliche Verdünnungsfaktoren erfor derlich machen, um den Anteil an unerwünschten Bestandteilen auf funktionell äquivalente Konzentrationen zu verringern, die die Bildung eines pharmazeutisch annehmbaren Plasminogenakti vators vom Human-Gewebe-Typ ermöglichen. Demgemäss kann der Verdünnungsfaktor so gewählt werden, dass die Serummenge im endgültigen Säugetierexpressionsmedium beispielsweise weniger als 1 Prozent der ursprünglich verwendeten Gesamtmenge beträgt.

Die erfindungsgemäss verwendeten Filtrationsmembranen können unter beliebigen herkömmlichen Produkten gewählt werden, die in bezug auf Membranart und Konfiguration so beschaffen sind, dass sie die den Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-TYP bildenden Zellen zurückhalten, während die verschiedenen schädlichen Bestandteile hindurchgehen. Somit kann man belie bige geeignete Membranen verwenden, die die Zellen unter den gewählten dynamischen Strömungsbedingungen zurückhalten, während die schädlichen Bestandteile passieren und dadurch entfernt werden. Eine Obergrenze für die Porengrösse von etwa 5 µm und eine Untergrenze von etwa 0,1 µm sind geeignet.

Das frische Austauschmedium ist im wesentlichen frei von schädlichen Bestandteilen. Beispielsweise enthält es keine signifikanten Mengen an schädlichen Bestandteilen, wie Pro teasen, Neuraminidasen, Proteaseinhibitoren. Der artige Medien variieren selbstverständlich je nach dem zur Bildung des Plasminogenaktivators vom Human-Gewebe-Typ ver wendeten Zelltyp. Sie können unter den bekannten, zur Ver fügung stehenden Medien aus gewählt werden. Es kann sich um das gleiche Medium wie beim endgültigen Expressionsmedium (aus Zweckmässigkeitsgründen) oder um ein weniger reiches Medium, beispielsweise ein gepuffertes, isotonisches Kochsalz medium, handeln.

Für die hier beschriebenen, Plasminogenaktivator vom Human- Gewebe-Typ bildenden CHO-Zellen kann ein endgültiges Ex pressionsmedium aus einem Standardmedium zum Züchten von CHO- Zellen, das nicht mit fötalem Kälberserum ergänzt ist, gebil det werden. Ein Beispiel für das endgültige Expressionsmedium ist ein Gemisch aus gleichen Teilen aus Dulbecco-modifizie tem Eagles-Medium (hoher Glucosegehalt) und Ham's F-12-Medium.

Gemäss anderen Ausführungsformen lassen sich die schädlichen Bestandteile aus dem Medium vor der Züchtung ausschliessen oder im wesentlichen ausschliessen oder sie können beispiels weise durch Zentrifugations- oder Absetztechniken entfernt werden.

Der Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ wird isoliert und anschliessend aus dem Expressionsmedium gereinigt. Sodann wird er zur Behandlung von verschiedenen vaskulären Zuständen oder Erkrankungen als pharmazeutischer Wirkstoff verwendet.

B. Bevorzugte Ausführungsform

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform werden CHO-Zellen, die zur Bildung von Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ in der Lage sind, als Suspension in einem CHO-Medium, das mit fötalem Kälberserum ergänzt ist, bis zu einer vorbestimmten Zelldichte gezüchtet. Die Zellsuspension wird sodann durch Querstromfiltration eingeengt. Anschliessend wird Serum aus der konzentrierten Suspension durch Querstromfiltration bei konstantem Volumen unter ständiger Zugabe von serumfreiem Medium entsprechend der Geschwindigkeit, in der das serum haltige Medium entfernt wird, entfernt. Aktiver Plasminogen aktivator vom Human-Gewebe-Typ wird anschliessend gebildet, indem die CHO-Zellen in einem serumfreien Expressionsmedium suspendiert werden. Der auf diese Weise gebildete Plasminogen aktivator vom Human-Gewebe-Typ wird durch die CHO-Zellen in das Expressionsmedium sekretiert und kann nach üblichen Ver fahren abgetrennt werden.

Züchtungsgefässe von unterschiedlichem Fassungsvermögen werden zur Züchtung der Suspensionen von CHO-Zellen verwendet. Die einzelnen Züchtungsgefässe werden über Einlassöffnungen mit einer Anordnung von porösen Tangentialstromfiltern verbunden, die ihrerseits über Auslassöffnungen eine Rückverbindung mit der Züchtungskammer aufweisen. Nach dem Wachstum werden die Suspensionen der CHO-Zellen und das Serum enthaltende Medium durch die Anordnung von porösen Tangentialstromfiltern ge pumpt, um zunächst die Suspension einzuengen und um anschlie ssend die Entfernung der Serumbestandteile aus der Suspension während des Mediumaustausches zu ermöglichen. Die CHO-Zell suspension wird durch die Filter und das Züchtungsgefäss im Kreislauf geführt, wobei ein Teil des alten Mediums und der Serumbestandteile entfernt werden. Eine Zufuhr von frischem sterilem Expressionsmedium, das kein Serum enthält, wird zu der Zellsuspension gegeben, um ein Nennvolumen im Züchtungs gefäss aufrechtzuerhalten. Nachdem die Serumkonzentration auf diese Weise durch kontinuierlichen Mediumaustausch auf einen vorbestimmten Wert verringert worden ist, werden die Zellen über sterilisierte Leitungen in ein anderes Gefäss mit einem Gehalt an serumfreiem Expressionsmedium übertragen, worin Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe-Typ sekretiert wird. Anschliessend kann der Plasminogenaktivator vom Human-Gewebe- Typ durch übliche Techniken entfernt werden.

C. Ausführungsbeispiele Zellwachstum, Mediumaustausch und Produktion

Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) (ATCC Nr. CCL61), die mit dem Expressionsvektor pETPFR (vgl. die vorgenannte EP-A-93619) transfiziert sind und daher rekombi nanten t-PA exprimieren, wurden nach Lagerung über flüssigem Stickstoff revitalisiert und in einem Medium, das aus einem 1 : 1-Gemisch aus Hams F12 und Dulbecco-modifiziertem Eagles- Medium bestand, gezüchtet. Dieses Gemisch enthielt kein Hypo xanthin oder Thymidin. Dialysiertes oder diafiltriertes föta les Rinderserum (7% Vol./Vol.) und Methotrexat (auf 500 nano molar) wurden zu dem Medium gegeben. Die Zellen wurden in Sus pensionskultur in bei etwa 37°C inkubierten Glasgefässen ge züchtet. Die Zellen wurden in diesem Medium alle 3 bis 5 Tage einer Subkultivation und Populationserweiterung unterzogen. Nachdem sich eine ausreichende Zellmenge angereichert hatte, wurden die Zellen für eine weitere Wachstumsperiode von etwa 3 Tagen in einen 10 Liter fassenden Fermenter aus korrosions beständigem Stahl übertragen. Für diese Wachstumsphase wurde zur Erzielung besserer Zellausbeuten die Mediumzusammensetzung insofern geändert, als sowohl Hypoxanthin als auch Thymidin aber kein Methotrexat enthalten waren. Dieses Medium war mit nicht-dialysiertem fötalem Rinderserum (2% Vol./Vol.) ver setzt. Während der 3-tägigen Züchtungsphase stieg die Zell populationsdichte von etwa 0,25 × 10⁶ Zellen/ml auf 190 × 10⁶ Zellen/ml.

Die Zellen wurden sodann gemäss den vorstehenden Ausführungen einem Mediumaustausch unterzogen, bevor sie in serumfreiem Produktionsmedium für etwa 90 Stunden resuspendiert wurden. Der Mediumaustausch wurde auf die nachstehend beschriebene Weise durchgeführt.

Ein Hohlfaser-Tangentialstromfilter und damit verbundene Ein lass- und Auslass-Siliconkautschukschläuche wurden in einem Autoklaven sterilisiert und sodann über dampfsterilisierbare Verbindungsstücke mit dem 10 Liter fassenden Produktionsge fäss verbunden. Bei dem verwendeten Filter handelte es sich um eine Polysulfone-Hohlfasereinheit mit einem Gehalt an 280 Hohlfasern von 0,75 mm Innendurchmesser und in Längsrichtung angeordneten Poren mit einer Nenngrösse von 0,1 µm. Diese Einheit wies eine Filtrationsfläche von 0,385 m² auf. Die Zellen wurden unter Verwendung einer Watson-Marlow-Zweibogen pumpe durch die Hohlfasern in das Gefäss zurückgeführt. Eine Rezirkulationsgeschwindigkeit von etwa 3,5 Liter/min wurde angewandt, wobei gleichzeitig ein Teil der Flüssigkeit abge zogen und als klares Filtrat in einer Geschwindigkeit von etwa 211 ml/min verworfen wurde. Auf diese Weise blieben die Zellen erhalten, während das Züchtungsvolumen auf etwa 5,2 Liter verringert wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurde frisches, steri les, serumfreies Medium (gleiche Zusammensetzung wie das vor stehende Medium, aber ohne Gehalt an Rinderserum oder daraus abgeleiteten Bestandteilen) in das Züchtungsgefäss mit einer Geschwindigkeit von etwa 211 ml/min gepumpt, wodurch das Vo lumen bei gleichzeitiger Verdünnung des alten Mediums konstant gehalten wurde.

55 Liter frisches, serumfreies Medium wurden durch das System gepumpt, was eine berechnete Verringerung der Serumkonzentra tion auf das etwa 190 000-fache (oder weniger als 0,0001 Vo lumenprozent) ergab. Eine Aliquotmenge der Zellsuspension wurde zu frischem, serumfreien Medium in einem getrennten, 10 Liter fassenden Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl gegeben. Diese Zellen wurden sodann etwa 90 Stunden bei 37°C zur Durchführung der Produktionsphase inkubiert. Proben wurden aus der Kultur entfernt, durch Zentrifugation geklärt und bis zur anschliessenden Analyse bei -20°C gelagert.

In einem zweiten, parallel durchgeführten Beispiel wurden sämtliche Bedingungen, Zellen und Medien beibehalten, wobei lediglich das nachstehend angegebene Hohlfaserfilter verwendet wurde. Das Filter enthielt 290 Hohlfasern und wies eine Fil trationsfläche von 0,390 m² auf, entsprach aber im übrigen dem vorstehend beschriebenen Filter.

Analysenmethoden

Die Proben wurden zum Nachweis der schädlichen Einwirkungen von Rinderserum auf das von den in diesen Beispielen verwen deten CHO-Zellen gebildete t-PA behandelt und analysiert. Proben der geklärten Zellkulturflüssigkeit aus der serumfreien Produktionsphase wurden aufgetaut, mit β-Mercaptoethanol redu ziert und der SDS-Elektrophorese unter Verwendung des dis kontinuierlichen Systems gemäss Laemmli (Laemmli, Nature, Bd. 227 (1970), S. 680) unterworfen. Die auf diese Weise ab getrennten Proteine wurden der Silber- Färbung (Morrissey, Anal. Biochem., Bd. 117 (1981), S. 307) unterzogen oder wurden auf eine Nitrocellulosefolie übertragen (Übertragung von 4 Stunden bei 8°C und 0,5 A auf 0,45 µm Nitrocellulose unter Anwendung des Verfahrens gemäss Towbin et al., PNAS, Bd. 76 (1979), S. 6350). Die t-PA-Proteine, Proteinfragmente und höhermolekulare Komplexe mit einem Gehalt an t-PA wurden auf der Nitrocellulosefolie durch den nachstehend beschriebenen ELISA-Test sichtbar gemacht: Einer ursprünglichen Reaktion von gebundenen t-PA-Proteinen und Kaninchen-anti-t-PA-Antikörper folgte die Behandlung mit einem zweiten Antikörper. Hierbei handelte es sich um mit Meerrettich peroxidase markiertes anti-Kaninchen-IgG (in Ziegen gewonnen). Nach dieser Reaktion ergab die Zugabe von chromophorem 4-CL- Naphthol in H₂O₂ und PBS eine Farbentwicklung in den Bereichen, wo gebundener Antikörper vorlag. Dabei wurden die elektropho retischen Muster von t-PA und assoziierten Proteinen sichtbar gemacht. Unter Anwendung dieser Technik konnte der Zustand in bezug auf t-PA in rohen Kulturflüssigkeiten ohne weitere Rei nigung bestimmt werden.

Ergebnisse

Zum Nachweis der schädlichen Einwirkungen von fötalem Rinder serum auf t-PA wurden Proben aus der Produktionsphase mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder mit 0,175% Vol./Vol. oder 1,75% Vol./Vol. fötalem Rinderserum 22 Stunden oder 46 Stunden inkubiert, wonach die vorstehend beschriebene Ana lyse durchgeführt wurde. Die Ergebnisse hiervon sind in Form des mit Silber angefärbten Gels von Fig. 1 und des entspre chenden Immunoblots von Fig. 2 dargestellt.

Fig. 1 ist ein mit Silber gefärbtes Gel der auf die vorstehende Weise erhaltenen t-PA-Proben.

Fig. 2 stellt ein Immunoblot des gleichen Gels wie in Fig. 1 dar.

In diesen Figuren haben die einzelnen Bahnen folgende Be deutungen:

Bahn Nr.
Probe
1	Molekulargewichtsstandard (92,5 Kilodalton (K), 66,2 K, 45 K, 31 K, 21,5 K, 14,4 K)
2	Authentische t-PA-Referenzstandards
3	Zellkulturflüssigkeit mit einem Gehalt an t-PA (Laborstandard)
4	Zellkulturflüssigkeit aus einer Probe der Produktionsphase
5	Probe der Produktionsphase; 22 h bei 37°C mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) inkubiert
6	Probe der Produktionsphase; 46 h bei 37°C mit PBS inkubiert
7	Leere Bahn
8	Probe der Produktionsphase; 22 h bei 37°C mit 0,175% (Vol./Vol.)

fötalem Kälberserum (FBS) inkubiert
9	Probe der Produktionsphase; 46 h bei 37°C mit 0,175% (Vol./Vol.) FBS inkubiert
10	0,175% (Vol./Vol.) FBS allein; 22 h bei 37°C inkubiert
11	0,175% (Vol./Vol.) FBS allein; 46 h bei 37°C inkubiert
12	Probe der Produktionsphase; 22 h bei 37°C mit 1,75% (Vol./Vol.) FBS inkubiert
13	Probe der Produktionsphase; 46 h bei 37°C mit 1,75% (Vol./Vol.) FBS inkubiert
14	1,75% (Vol./Vol.) FBS allein; 22 h bei 37°C inkubiert
15	1,75% (Vol./Vol.) FBS allein, 46 h bei 37°C inkubiert

In den Fig. 1 und 2 sind die Bahnen 2 und 3 t-PA-Referenz standards (einkettiger t-PA erkennbar an der Bande mit höherem Molekulargewicht und zweikettiger t-PA erkennbar an den Banden mit geringerem Molekulargewicht).

Die beobachteten schädlichen Wirkungen von fötalem Rinder serum (FBS) sind: a) ein Verschwinden von intaktem t-PA bei gleichzeitiger Anreicherung von verschiedenen proteolytisch gespaltenen Formen und Fragmenten davon (vgl. Bahnen 8 und 9 von Fig. 2) wird verursacht und b) es kommt zur Bildung von höhermolekularem, komplexem Material im Bereich von 90 bis 200 Kilodalton (vgl. Bahnen 12 und 13 von Fig. 2).

Die Ergebnisse zeigen, dass bei Inkubation der gemäss dem vorstehenden Abschnitt "Zellwachstum, Mediumaustausch und Produktion" erhaltenen serumfreien Zellkulturflüssigkeit in Gegenwart von PBS bei einer Züchtungszeit von 22 h oder 46 h die Kulturflüssigkeit im wesentlichen unverändert bleibt (vgl. Bahnen 5 und 6 von Fig. 1 und 2). Somit kommt es sowohl zu einem proteolytischen Abbau als auch zur Bildung von hoch molekularen Komplexen von t-PA, wenn bei der Produktions phase im Kulturmedium fötales Rinderserum verbleibt. Durch die Entfernung des Serums durch den beschriebenen Medium austausch werden die schädlichen Einwirkungen im wesentlichen beseitigt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von biologisch aktivem Human-Gewebe-Plasminogenaktivator in einer rekombinanten Suspensions-Wirtszellkultur, die zur Bildung des Human-Gewebe-Plasminogenaktivators durch rekombinante Expression in der Lage ist, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) rekombinant transfizierte Wirtszellen in Suspensionskultur unter Verwendung eines Wachstumsmediums, welches das Wachstum und die Aufrechterhaltung der Wirtszellen ermöglicht, züchtet;
b) unter Erhaltung der Expressionsfähigkeit der Wirtszellen aus dem Medium der Zellkultur Bestandteile, die schädlich für die Gewinnung und biologische Aktivität des Human-Gewebe- Plasminogenaktivators sind, durch ein Querstromfiltrationsverfahren entfernt, wobei eine Filtrationsvorrichtung mit einer geeigneten Membran verwendet wird, so daß die Zellkultur suspension durch die Filtrationsvorrichtung rezirkuliert und ein Teil des Mediums als zellfreies Filtrat entfernt wird;
c) das Filtrat durch Medium ersetzt, das frei ist von Bestandteilen, die für die Gewinnung und Aktivität des Human-Gewebe-Plasminogen aktivators schädlich sind; und
d) den exprimierten biologisch aktiven Human-Gewebe- Plasminogenaktivator aus der Zellkultur, bei der das Medium ausgetauscht wurde, isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Querstromfiltration durch eine flache Filtrationsmembran erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Querstromfiltration durch die Wand einer porösen Hohlfaser erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Querstromfiltration durch eine in spiraler Form gewundene Membran erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die das Wachstum und die Zellreplikation unterstützenden Mediumbestandteile von Blut, Gewebe oder Derivaten davon abgeleitet sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellkultur Säugetierzellen enthält, die zur Bildung von Human-Gewebe-Plasminogenaktivator in der Lage sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Säugetierzellen rekombinant transfizierte CHO-Zellen umfassen.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, Human-Gewebe-Plasminogenaktivator zu exprimieren, und einen amplifizierbaren Marker enthalten, und die Zellen vor Schritt d) in einem Medium gezüchtet werden, das einen Selektionsdruck hinsichtlich der Zellen, die einen zur Expression von Human-Gewebe-Plasminogenaktivator fähigen Expressions vektor enthalten, ausübt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der amplifizierbare Marker Dihydrofolatreduktase mit einer niedrigen Bindungsaffinität für Methotrexat ist, und das zur Aufrechterhaltung des Selektionsdrucks ausgewählte Medium Methotrexat enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Querstrom filtrationsverfahren durch einen Zellabscheidungs parameter DP und eine Gruppe von dynamischen Fluidparametern, einschließlich Re = Reynold's Zahl, gekennzeichnet ist, und worin die Zellsuspension, die Vorrichtung und die Betriebsbedingungen der Vorrichtung so ausgewählt sind, daß Re kleiner als 2100 und DP kleiner als 0,35 ist.