DE69732616T2

DE69732616T2 - Erhöhung der Migration oder Proliferation von Keratinocyten

Info

Publication number: DE69732616T2
Application number: DE69732616T
Authority: DE
Inventors: Ira M. Dr. Newton Herman
Original assignee: TRUSTEES OF TUFTS COLLEGE MEDF; Tufts University
Current assignee: TRUSTEES OF TUFTS COLLEGE MEDF; Tufts University
Priority date: 1996-12-31
Filing date: 1997-12-22
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2017-12-23
Also published as: EP0852144A3; ATE289823T1; CA2225898A1; US5718897A; EP0852144B1; DE69732616D1; JPH10212244A; AU4836497A; EP0852144A2; CA2225898C; AU733240B2

Description

Diese Anmeldung ist eine teilweise Fortführung meiner parallel anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 08/484,382, eingereicht am 07.06.1995, deren Inhalte hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Verwendung von Wachstumsfaktoren in Verbindung mit einer bestimmten Form von Collagenase, um die Beweglichkeit und das Wachstum von Keratinozyten zu erhöhen.
Keratinozyten sind der vornehmliche Zelltyp in der Epidermis. Sie entstehen durch mitotische Teilung von Stammzellen, die die unterste Lage der Epidermis ausbilden. Die Keratinozyten wandern aufwärts, ändern ihre Struktur und Funktion, bis sie verhornte Zellen an der Oberfläche der Haut werden und ggf. abgestreift werden.
Die Heilungsrate von Wunden wird unter anderem durch die Rate der Keratinozytenmigration und -proliferation beeinflusst. Collagenase ist verwendet worden, um verschiedene pathologische Zustände des Körpers zu verbessern, und der Effekt von endogener Collagenase auf bestimmte Körperfunktionen ist untersucht worden.
Chiulli und Wegman, US Patent 3,705,083 (1972), produzierten eine Kombination von Collagenase und anderen Proteasen von Clostridium histolyticum und verwendeten sie in einer Salbe, um nekrotisches Gewebe von Hautläsionen, wie beispielsweise Verbrennungen, infizierten Wunden und Geschwüren zu entfernen. Die Salbe ist seit 25 Jahren auf dem Markt. Sie schlugen auch vor, die Kombination als injizierbare Lösung zu verwenden, um das innere Abstreifen und Wiederabsorbieren von physiologisch antagonistischem Gewebe zu erleichtern.
Sussman, US Patent 3,678,158 (1972), injizierte gereinigte Collagenase in vorfallende Bandscheiben.
Cope, US Patent 4,174,389 (1979), verwendete Clostridiopeptidase A-Collagenase für die selektive Lyse von Collagenfibrillen im Glaskörper des Auges.
Pinell, US Patent 4,524,065 (1985) behandelte Säugeniernarben, wie beispielsweise Aknenarben, Verbrennungsnarben und andere Hypertropische Narben durch intraläsionale Injektion von gereinigter Collagenase.
Wehling, US Patent 5,173,295 (1992) verwendete gereinigte Collagenase, um die Regeneration von verletzten Nerven zu verbessern.
Gelbard, US Patent 4,338,300 (1982) injizierte Collagenase in die Plaques bei Penisinduration.
W. E. Zimmerman, Collagenase, Innie Mandel, Herausgeber, London, 1972, Gordon & Breach, (Seiten 131–141) "The Importance of Collagenase for the Local Treatment of Major Burns" stellt fest, dass Collagenase, die bei Verbrennungen verwendet wird, einen nützlichen Nebeneffekt auf die Bildung von Gewebeproliferationen hat, und deshalb vorteilhaft bei der Behandlung von verschiedenen Typen von Wunden verwendet werden kann.
Herman, Journal of Cardiovascular Pharmacology 22 (Beilage 4): S. 25 bis S. 36 (1993), "Molecular Mechanisms Regulating the Vascular Endothelial Cell Motile Response to Injury" berichtet, dass eine kommerzielle nicht homogene Präparation von bakterieller Collagenase, die routinemäßig für die Isolation von vaskulären Zellen von Blutgefäßsegmenten verwendet wird, die Migrationsrate von vaskulären Endothelialzellen, die bei einer epithelialen zellsynthetisierten Matrix in vitro verletzt werden, verglichen mit identischen Populationen von vaskulären Endothelialzellen, die von der Verletzung bei einer intakten Matrix geborgen werden, auf das zwei- bis fünffache erhöht.
Herman, Wounds 8(2): 33–41 (1996), "Stimulation of Human Keratinocyte Migration and Proliferation In Vitro: Insight into the Cellular Responses to Injury and Wound Healing" berichtet die Arbeit, die in der US-Anmeldung mit der Serienummer 08/484,382 beschrieben ist, der Ursprungsanmeldung dieser Teilfortführungsanmeldung.
Die Ursprungsanmeldung mit der Seriennummer 08/484,382 lehrt die Verbesserung der Migration und Proliferation von Keratinozyten bei der Wundheilung durch Kontaktieren derselben mit Clostridiopeptidase A-Collagenase (EC 3.4.24.3), die durch die Fermentation von Clostridium histolytikum erhalten wird und die aufgereinigt wurde, um im Wesentlichen frei von anderen Proteinasen zu sein. Vorzugsweise wird eine offene Wunde in der Haut durch Kontaktieren von freiliegender subzellulärer Matrix mit der genannten gereinigten Collagenase in einer Menge behandelt, die wirksam ist, um die Migrationsrate der Keratinozyten benachbart den Wundkanten zu verbessern. Das Kontaktieren der Keratinozyten bedeutet, diese direkt zu kontaktieren oder indirekt durch Kontaktieren ihres Wachstumssubstrats, auf dem sie wachsen und sich teilen, d. h. die subzelluläre Matrix.
Die Erfindung, die in der vorliegenden Anmeldung gelehrt wird, ist eine Weiterentwicklung, bei die Wirkung der gereinigten Collagenase durch Wachstumsfaktoren verbessert wird.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die beigefügten Patentansprüche beschrieben.
Mit Wachstumsfaktor (Growth Factor = GF) schließe ich alle Säugetierwachstumsfaktoren sowohl natürlich auftretend als auch durch rekombinante DNA-Technologie ausgebildet ein. Bevorzugt sind jene, die mit hoher Affinität und Spezifizität an Keratinozyten anbinden, und jene, die so und mit niedriger Affinität an die subzelluläre Matrix der Haut anbinden. In der Praxis der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass der Wachstumsfaktor vorzugsweise an Hochaffinitätsrezeptoren von Keratinozyten anbindet, indem er von den Niedrigaffinitätsbindungsplätzen der Matrix wechselt. Eine besonders bevorzugte Gruppe ist die Familie der Heparin bindenden Wachstumsfaktoren. Heparin bindender epidermalartiger Wachstumsfaktor (HBEGF) ist insbesondere bevorzugt. Andere solche Wachstumsfaktoren dieser Familie umfassen FGF-1 (saurer Fibroblastenwachtumsfaktor), FGF-2 (basischer Fibroblastenwachstumsfaktor) und FGF-4 (KGFG, Kaposi-Fibroblastenwachstumsfaktor). Andere Wachstumsfaktorfamilien der Wahl umfassen Keratinozytenwachstumsfaktoren und Epidermalwachstumsfaktoren.
Die Wunde wird behandelt durch Kontaktieren der subzellulären Matrix oder von Teilen der Wunde näher der Oberfläche der Haut (wobei diese letztere Arte der Kontaktierung hier als "exogen" bezeichnet wird) oder von beiden mit Clostridiopeptidase A-Collagenase im Wesentlichen frei von anderen Proteinasen behandelt. Der Wachstumsfaktor wird ebenfalls in Kontakt gebracht. Überlegene Resultate werden erhalten, wenn die Collagenase sowohl in subzellulärem Kontakt als auch in exogenem Kontakt steht. Eine nützliche Prozedur ist es, zunächst die subzelluläre Matrix unterhalb der Wunde zu behandeln, von der ein Teil exponiert sein kann oder nicht, indem eine Lösung der gereinigten Clostridiopeptidase A-Collagenase injiziert wird, einige Zeit abgewartet wird, z. B. ein paar Minuten bis zu einer Stunde oder mehr, und dann die Wunde mit einer exogenen Lösung der gereinigten Collagenase und des Wachstumsfaktors behandelt wird. Ein Wachstumsfaktor oder zwei oder mehr können verwendet werden.
Die gereinigte Collagenase und ein oder mehrere Wachstumsfaktoren werden vorzugsweise – getrennt oder zusammen – in einer wässrigen Lösung aufgetragen, z. B. aufgelöst in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung. Sie können auch in einer Mischung mit anderen pharmazeutisch akzeptablen flüssigen oder festen Trägern verwendet werden, einschließlich langsam freisetzender Träger. Die Natur und Verwendung solcher Träger liegt innerhalb des Fachwissens.
Geeignete Konzentrationen der gereinigten Clostridiopeptidase A können von etwa 0,5 ABC-Einheiten Collagenase/ml oder weniger bis zu etwa 150 ABC-Einheiten/ml oder mehr, d. h. etwa 5 μg/ml oder weniger bis zu etwa 1500 μg/ml oder mehr reichen. Die Menge der aufgetragenen gereinigten Collagenase wird ausreichend sein, um die Migrationsrate der Keratinozyten zu den und an die Wundränder wesentlich zu erhöhen, vorzugsweise auf mindestens das dreifache der Rate, die ohne die Behandlung auftreten würde. Natürlich ist die Menge der zu verwendenden gereinigten Collagenase um so größer, desto größer die Wunde ist. Eine bevorzugte effektive Menge beträgt üblicherweise etwa vier ABC-Einheiten pro Quadratzentimeter Matrix und vier ABC-Einheiten pro Kubikzentimeter Gewebevolumen. Außerdem ist die Konzentration der Collagenaselösung, die verwendet werden wird, umso höher, desto mehr Körperflüssigkeit in der Wunde vorliegt oder in der Wunde erwartet wird. Der Mediziner/die Medizinerin wird in diesen Fällen seine/ihre professionelle Beurteilung anwenden.
Geeignete Konzentrationen an Wachstumsfaktor können von etwa 0,01 ng/ml oder weniger bis zu etwa 10 ng/ml oder mehr, vorzugsweise etwa 0,1 ng/ml oder weniger bis zu etwa 0,5 ng/ml (z. B. HBEGF) oder mehr reichen. Die Menge des angewandten Wachstumsfaktors wird ausreichend sein, um die Effektivität der Collagenase zu erhöhen. Wenn die Konzentration an Wachstumsfaktor von einer geringen Menge relativ zu einer gegebenen Konzentration an Collagenase erhöht wird, steigt der günstige Effekt auf Keratinozyten bis zu einem Maximum an und fällt dann ab; daher wäre es in einer gegebenen Situation kontraproduktiv, das Maximum zu überschreiten. In derselben Weise, wie oben bezüglich der Collagenase festgestellt wurde, wird die Menge und Konzentration an verwendetem Wachstumsfaktor eine Funktion der Wundgröße und der Körperflüssigkeit in der Wunde sein, und medizinische Beurteilung wird angewendet werden.
Der Wirksamkeitstest von Collagenase basiert auf dem Aufschluss von nicht denaturiertem Collagen (von bovinen Sehnen) bei pH 7,2 und 37°C für 20 bis 24 Stunden. Die Anzahl von gespaltenen Peptidbindungen wird durch Reaktion mit Ninhydrin gemessen. Aminogruppen, die durch eine Trypsinaufschlusskontrolle freigesetzt werden, werden abgezogen. Eine netto ABC-Einheit Collagenase wird ninhydrinreaktives Material äquivalent zu 1,09 Nanomol Leuzin pro Minute auflösen.
Der Test von Collagenasen auf andere Proteinasen basiert auf der Fähigkeit, Casein aufzuschließen. Diese Caseinasetestprozedur kombiniert (1) die Idee von Reimerdes und Klostermeyer [Methods Enzymol 45: 26–28 (1976)], die Menge an primären Aminogruppen zu bestimmen, die in dem in Trichloressigsäure löslichen Aufschlussprodukten vorliegen, mit (2) dem Verfahren von Undenfried et al. [Science 178: 871–2 (1972)], die primären Aminogruppen fluorometrisch zu detektieren. Die Probe wird mit zugegebenem Casein, das nicht löslich ist, bei 37°C für 20 bis 22 Stunden inkubiert. Die Probe wird mit Trichloressigsäure inaktiviert, und das nicht aufgeschlossene Kasein wird abzentrifugiert. Gelöste Peptide resultieren von der Wirkung der Caseinase in der Probe auf das zugesetzte Casein. Jedes Peptidmolekül weist eine endseitige primäre Amingruppe auf. Fluorescamine^TM wird zu dem Überstand zugesetzt und reagiert mit den primären Amingruppen, um fluoreszente Moleküle zu erzeugen. Die Fluoreszenz wird gemessen, und eine Berechnung ergibt eine Caseinaktivität als FFC-Einheiten.
Die Erfindung hat besonderen Wert bei Anwendung auf Wunden bei Menschen. Sie ist nützlich in der Behandlung von Wunden bei allen Säugetieren, insbesondere solchen von ökonomischem Wert, wie z. B. Pferden, Maultieren, Rindern, Schafen, Ziegen, Schweinen, Hunden, Katzen und anderen landwirtschaftlichen oder gezähmten Tieren, Pelztieren, Zootieren, einschließlich schwimmenden Arten.
Die vorliegende Erfindung stellt in einem anderen Aspekt ein Verfahren zum Verbessern der Migration und Proliferation von Keratinozyten beim Wachstum von künstlicher Säugetierhaut, beispielsweise humaner Haut, in vitro bereit, indem die künstliche Haut auf Biomatrizen gezogen wird, die zuvor mit gereinigter Clostridiopeptidase A-Collagenase aufgeschlossen wurden, wie bei Herman beschrieben ist, und in der Anwesenheit von zugesetzter Clostridiopeptidase A-Collagenase, die gereinigt wurde, um im Wesentlichen frei von anderen Proteinasen zu sein. Künstliche Haut ist nützlich als temporäres Hauttransplantat bei Verbrennungen und Geschwüren, und sie wird zum Testen von kosmetischen und Haushalts-Reinigern in vitro verwendet.
Beim Anwenden der vorliegenden Erfindung wird die künstliche Haut auf lebenden Biomatritzen gezogen, die zuvor mit gereinigter Clostridiopeptidase A-Collagenase, wie sie hier beschrieben ist, aufgeschlossen wurde (um die Anhaftung, Migration und Proliferation zu optimieren), wie bei Herman beschrieben ist; Wachstumsfaktor(en) kann/können ebenfalls eingeschlossen werden. Die hier beschriebene gereinigte Clostridiopeptidase A-Collagenase und ein oder mehrere hier beschriebene Wachstumsfaktoren werden zu dem Wachstumsmedium zugegeben, wodurch die Migration und Proliferation von Keratinozyten verbessert wird. Konzentrationen in dem Wachstumsmedium können von etwa 0,5 ABC-Einheiten Collagenase/ml oder weniger bis etwa 150 ABC-Einheiten/ml oder mehr reichen, und von etwa 0,01 ng/ml oder weniger bis etwa 10 ng/ml oder mehr Wachstumsfaktor.
Einige Beispiele von künstlicher Haut, deren Wachstum durch diese Erfindung in vorteilhafter Weise beeinflusst werden kann, folgen.
Advanced Tissue Sciences in La Jolla, Kalifornien hat Dermagraft^TM als Hautersatz vermarktet. Ein aus Milchsäure-Glykolsäurecopolymer hergestelltes Gittergrundgerüst, ungefähr 90 μm dick und mit Öffnungen von etwa 200 bis 220 μm, wurde mit Hautfibroblasten von neonataler Vorhaut beimpft. Die Zellen verbrücken ausreichend, um Hautproteine und Proteoglykane zu sekretieren. Siehe Hubbell, JA et al. Chemical and Engineering News S. 42–53 (März 13, 1995).
Grafskin^TM ist durch Organogenesis in Canton, Massachusetts eingeführt worden, siehe Nolte CJ et al. Journal of Anatomy 185 (Pt. 2): 325–33 (1944, Oktober).
Advanced Tissue Sciences hat ebenfalls Skin2^TM als Hautsubstitut für das in vitro Testen von Kosmetika, Haushaltschemikalien und anderen Produkten vermarktet. Siehe Stoppie P et al. European Journal of Morphology 31 (1–2): 26–9 (1993).
Siehe auch Hansbrough JF et al., Journal of Burn Care & Rehabilitation 14(5): 485–94 (1993).
EXPERIMENTELLES
In der folgenden Beschreibung illustriert ABSCHNITT A, der wörtlich aus der Ursprungsanmeldung übernommen ist, die Effekte von Collagenase verschiedener Reinheit. ABSCHNITT B illustriert die vorliegende Erfindung, die Wachstumsfaktoren verwendet.
ABSCHNITT A
Die Auswirkungen von Collagenasen variierender Reinheit auf die Beweglichkeit und Proliferation von Keratinozyten wurden unter Verwendung von subzellulären Matrizen, die von vaskulären Endothelialzellen synthetisiert wurden, in vitro bestimmt.
Vaskuläre Endothelialzellkultur
Endothelialzellen wurden von lebenden bovinen Gefäßsegmenten isoliert. Aortaringe wurden auf Eis von einem Schlachthof erhalten, an den Enden verschlossen und mit gepufferter Kochsalzlösung gefüllt. Endothelialzellen werden von der Gefäßinnenhaut unter Verwendung von 0,1% Collagenase aufgelöst in gepufferter Kochsalzlösung durch Inkubation bei 37°C für 30 min. bis 1 h freigesetzt. Die Zellen werden bei 200 g für 5 min. bei Raumtemperatur pelletiert, und das resultierende Pellet wird in Wachstumsmedium, das 5% Kalbsserum enthält, erneut suspendiert. Zellen werden auf Gewebekulturen mit 50 k Zellen/25 cm² plattiert. Nach dem Wachsen bis zum Zusammenfluss, werden die Zellen trypsinisiert und mit einer 1:5 Aufteilung durchgeleitet. Zellen werden zwischen den Durchgängen 5 bis 15 verwendet.
Endothelial erhaltende Matrix
Endothelialzellen eine Woche nach dem Zusammenfluss werden vor der Lyse in steriler Lösung, die 0,5% Natriumdeoxicholat in 0,015 M NaCl, 0,001 M EGTA gepuffert mit 0,02 M Tris-Cl, pH 7,8 mit 0,001 M Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) als Proteaseinhibitor enthielt, mit gepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Zwei Detergentsbehandlungen bei Raumtemperatur, von denen jede 15 min. dauert, folgen fünf Waschungen mit gepufferter Kochsalzlösung, wobei jede Waschung fünf Minuten dauert. Keratinozyten werden dann direkt und steril auf gewaschene Matrizen oder Matrizen, die mit Collagenaselösungen aufgeschlossen waren, plattiert.
Behandlung von Matrizen mit Collagenasen:
Endotheliale Matrizen, die wie oben beschrieben zubereitet wurden, werden für 60 min. bei 37°C mit verschiedenen Präparationen von Collagenase behandelt, die in gepufferter Kochsalzlösung (0,9% Natriumchlorid), aufgelöst waren, welche zwei mM CaCl₂ enthielt; die Collagenasedosis reichte von 0 bis 128 U/ml; 1 U/ml = 10 μg/ml Collagenase. (U bedeutet ABC-Einheiten.) Matrizen behandelt mit dem Enzym werden dann mit gepufferter Kochsalzlösung ohne Kalzium und Keratinozyten gewaschen und dann plattiert.
Humane Keratinozyten:
Am Kreisschnitt werden Vorhäute in GIBCO Keratinozyten-SFM gegeben, das Gentamycin (Katalognummern 17005-018 und 157-015) zu 5 μg/ml enthält. Das Gewebe wird dann in gepufferter Kochsalzlösung mit Gentamyzin gewässert, bevor es in Stücke von 3 bis 4 mm² zerschnitten wird. Die Gewebestücke werden dann für achtzehn Stunden bei 4°C in 25 U/ml Dispase (Collaborative Research Katalognummer 40235) inkubiert. Nach der Dispaseinkubation wird die epidermale Schicht von humanem Keratinozyten von der Dermis abgehoben und in 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben, die Trypsin-EDTA (2 ml) enthalten. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 37°C werden die Zellen sedimentiert und in Keratinozyten-SFM mit einer anfänglichen Impfdichte von 3 × 10⁶ Zellen/T/75 cm²/Kolben plattiert. Die Zellen werden inkubiert und unter Verwendung von Trypsin-EDTA durchgeleitet, wenn der Kolben zu 60 bis 70% zusammengeflossen ist.
Beweglichkeit- und Wachstumsstudien:
Für Zellbeweglichkeits-(Wundheilung-)Studien werden Keratinozyten in nahezu zusammenfließenden Dichten auf intakte oder mit Collagenase behandelte Matrizen plattiert (100 k Zellen/cm²). Auf gläserne Mikroskopprobenträger plattierte Zellen mit anhaftenden Matrizen werden dann in eine speziell ausgelegte Kulturkammer gegeben, die auf den Probenträger eines umgekehrten Interferenz- oder Phasenkontrastlichtmikroskops aufsetzbar ist. Die Zellen werden auf 37°C erwärmt, während sie unter Verwendung von videounterstützten Optiken betrachtet werden, die mit einer computerunterstützten Bildverarbeitungsstation und Software gekoppelt sind, die im Labor entwickelt wurde, um die Migration von lebenden Zellen automatisch zu verfolgen (Cell Tracker, Askey und Herman, 1988; Computers and Biomedical Res. 21: 551–61). Keratinozyten, die an künstlich erzeugte Wunden angrenzen, die mit feuerpolierten Pasteurpipetten zugefügt wurden, oder Keratinozyten an den Kanten von intakten Bögen wurden dann bezüglich ihrer Beweglichkeit als Funktion des Matrixzustands aufgezeichnet.
Für Zellproliferationsstudien wurden Keratinozyten dreifach auf Kunststoff oder Matrizen (intakt oder mit Collagenase behandelt; Dosierungen von 0 bis 64 U/ml, wobei 4 U/ml ausreichend waren, um die maximale proliferative Antwort zu ergeben, die binnen 7 Tagen nach dem Plattieren beobachtet wurde) zu 2 bis 5 k Zellen/cm² plattiert. Die Zellen wurden an alternierenden Tagen mit Keratinozyten-SFM gefüttert und dreifache Löcher von Zellen wurden direkt unter Verwendung eines Coulter Counter, ZF gezählt. Die Zellzählungen zusammen mit den Fehlern des Mittelwerts sind als Funktion der Zeit und des Zustands unter Verwendung von Kaleidograph aufgetragen, einer Softwareunterstützung, die mit einem PC-MacIntosh-Computerarbeitsplatz im Labor kompatibel ist.
Rohcollagenase:
Diese wurde im Wesentlichen so erhalten, wie von Chiulli und Wegman in dem US-Patent 3,705,083 (s. S. 1, oben) beschrieben wurde, mit geringen Modifikationen. Es ist das Pulver, das als der aktive Inhaltsstoff in Santyl^®-Salbe verwendet wird. Der Collagenasegehalt reicht von 100 bis 300 ABC-Einheiten/mg und der Proteinasegehalt reicht von 30 bis 240 FFC-Einheiten/mg.
Gesäuberte Collagenase:
Rohcollagenase wurde in destilliertem Wasser suspendiert und nach eingehendem Rühren zentrifugiert. Das Zentrifugenröhrchen wurde dekantiert und der Überstand wurde erneut zentrifugiert. Die resultierende geklärte Lösung war das "gesäuberte" Produkt.
ABC-gereinigte Collagenase:
Diese wurde aus Rohcollagenase durch Chromatographie zubereitet, die andere Proteinasen im Wesentlichen eliminierte. Die verwendete gereinigte Collagenase enthielt nur ungefähr 0,1 FFC-Einheiten Proteinasen/mg.
Pool 3A
Dies war eine Kombination von Fraktionen, die bei der Chromatographie verworfen wurden, welche die gereinigte Collagenase ergab.
Clostripain
Eine Proteinase, die als Rohmaterial vorliegt. Diese Probe war kommerziell erhältliches Clostripain.
Die Collagenasen wurden von Advance Biofactures Corporation in Lymbrook, New York 11563 bereitgestellt.
In den folgenden Tests war die Konzentration der verwendeten Collagenase bei allen Proben variierender Reinheiten 4 ABC-Einheiten/ml.
1 gibt graphisch die Beweglichkeits-(Migrations-)Daten wieder.
2 gibt graphisch die Proliferationsdaten wieder.
3–10 sind Graphen, die Aspekte der Erfindung illustrieren.
Tabelle I gibt die Migrationsergebnisse in Form eines Migrationsindexes wieder.
Tabelle II gibt die Proliferationsresultate in Form eines Proliferationsindexes wieder. TABELLE I DIE MATRIX MODULIERT DIE KERATINOZYTENBLATTMIGRATION

$ MI = Mittelwert der Beweglichkeit (Experiment)/Mittelwert der Beweglichkeit (Kontrolle)

$ PI = Mittlere Zellzählungen (Experimente)/Mittlere Zellzählungen (Kontrolle)

In diesen Tests potenzierte die Behandlung der extrazellulären Matrix mit der gereinigten Collagenase die Keratinozytenmigration dreifach gegenüber der unbehandelten Matrixkontrolle, und sie potenzierte die Keratinozytenproliferation zweifach gegenüber der unbehandelten Matrixkontrolle. Andere ähnliche Tests ergaben Migrationsraten bis zum Zehnfachen gegenüber der unbehandelten Matrix. Weiterhin waren in jedem Fall die Resultate mit der gereinigte Collagenase denjenigen überlegen, die mit den weniger reinen (gesäuberten Roh- und Roh-)Collagenasen erhalten wurden.
Eine andere Reihe von Tests verwendete drei Arten von synthetischen subzellulären Matrizen, die jeweils von normalen Hautfibroblasten, Endothelialzellen und Zellen von Verbrennungsnarben präpariert wurden. Jede wurde mit Konzentrationen von gereinigter Collagenase, die von einer ABC-Einheit/ml bis 64 ABC-Einheiten/ml reichten, behandelt, und die Rate des Zellwachstums (Proliferation) wird gemessen. Bei jeder Matrix wurde die Wachstumsrate bei 64 Einheiten/ml als die Rate angenommen, über die hinausgehend eine höhere Dosierung nur noch begrenzten Effekt hätte. Die Dosierung, die 50% dieser Wachstumsrate (bezeichnet als ED 50) ergab, lag für jede der Matrizen bei etwa einer ABC-Einheit/ml.
ABSCHNITT B
Die Effekte von verschiedenen Kombinationen von gereinigter Collagenase und Wachstumsfaktoren auf die Beweglichkeit und Proliferation von Keratinozyten wurden unter Verwendung von subzellulären Matrizen, die von vaskulären Endothelialzellen synthetisiert worden waren, in vitro bestimmt. Die Protokolle variierten nicht stark von denjenigen, die im ABSCHNITT A beschrieben sind, soweit nichts anderes angegeben ist. Die gesamte Collagenase, die in diesem ABSCHNITT B verwendet wurde, war gereinigte Clostridiopeptidase A, die im Wesentlichen frei von anderen Proteinasen war. Die Figuren III bis X geben graphisch die experimentellen Ergebnisse wieder.
3
Basischer Fibroblastenwachstumsfaktor als humaner Rekombinant (bFGF) wurde exogen zu dem Kulturmedium hinzugegeben, bei dem eine Kunststoffbasis mit humanen Keratinozyten plattiert war. In diesem Experiment wurde keine Collagenase verwendet. Die Medien, die verschiedene Konzentrationen an bFGF enthielten, wurden jeden nächsten Tag ersetzt ("Zellfütterung"). Die Proliferation der Keratinozyten erreichte ein Maximum bei 10 ng bFGF/ml.
4
Ein Experiment identisch mit demjenigen von Figur III, aber auf einer Matrix und ohne Verwendung von Collagenase auf der Matrix oder exogen. "Vor der bFGF Zugabe" bedeutet, dass dies die anfängliche Plattierung der Zellen war, bevor die Medien gewechselt wurden, um die Medien zu testen, die entweder bFGF enthielten oder nicht. Wie in Figur III erreichte der Effekt von bFGF ein Maximum bei 10 ng/ml.
5
Der Effekt von Heparin bindenden epidermalartigem Wachstumsfaktor (HBEGF) auf Keratinozytenwachstum wurde in Medien bestimmt, die ansteigende Konzentrationen an HBEGF enthielten, ohne Matrix und ohne Collagenase. Am Tag 2 betrug das Maximum 0,1 ng/ml. Am Tag 4 lag es bei 0,01 ng/ml.
6
Hier wurde die Matrix von bovinen retinalen Endothelialzellen (BREC) gemäß dem Protokoll in ABSCHNITT A, oben, präpariert. In diesem Experiment wurde keine Collagenase verwendet. HBEGF wurde exogen zu dem Wachstums-(Kultur)-Medium zugegeben, wie unter Figur IV, oben, beschrieben wurde. Am siebten Tag war das maximale Wachstum der Keratinozyten bei der maximal getesteten Konzentration von 1,0 ng HBEGF/ml erreicht.
7
Dieses Experiment wurde auf einer mit gereinigter Collagenase behandelten BREC-Matrix durchgeführt, wobei von Test zu Test eine konstante Konzentration von 0,5 ng/ml exogenem HBEGF und eine ansteigende Konzentration an exogener Collagenase eingestellt wurde. Das maximale Keratinozytenwachstum lag bei 1, 2 und 4 Einheiten/ml Collagenase. Bei 7 Einheiten/ml und darüber war das Wachstum behindert.
8
Dieses Experiment war identisch mit demjenigen gemäß Figur VII, außer dass es eine konstante Konzentration von 1,0 ng/ml HBEGF mit einem entsprechend höheren Wachstumsniveau verwendete. Maximales Wachstum wurde bei 4 Einheiten Collagenase/ml erreicht, und 7 Einheiten/ml und mehr waren behindernd.
9
Matrizen, die von bovinen retinalen Endothelialzellen erhalten wurden, wurden mit gereinigter Collagenase behandelt. In Kulturmedium, das entweder 0 oder 4 Einheiten/ml gereinigte Collagenase enthielt, wurden Konzentrationen an HBEGF getestet, die von 0,01 ng/ml bis zu 1,0 ng/ml reichten. Die Rate an Wachstum von humanen Keratinozyten (HK) wurde bei Konzentration von 0,01, 0,05 und 0,1 ng/ml HBEGF potenziert. Maximales Wachstum lag bei 0,1 ng/ml vor, während 0,2 ng/ml und darüber behindernd waren. Die Daten zeigen, dass die Zugabe von HBEGF zu Keratinozyten, die auf einer mit gereinigter Collagenase behandelten Matrix wachsen, in der Anwesenheit von gereinigter Collagenase ein wachstumsförderndes Potenzial von ungefähr dem 3,5-fachen gegenüber unbehandelten Matrixkontrollen ergibt.
10
Diese Figur zeigt die Resultate einer Begutachtung von Wachstumsfaktoren bezüglich ihrer Beeinflussung von Keratinozytenproliferation.
Die erste Spalte zeigt den Proliferationsindex, bei dem die Matrix nicht mit Collagenase behandelt wurde oder es irgendeine exogene Collagenase gab.
In der zweiten Spalte war die Matrix mit gereinigter Collagenase behandelt.
Die dritte Spalte zeigt das Resultat der Verwendung von exogener gereinigter Collagenase bei der behandelten Matrix.
Die verbleibenden Spalten zeigen die Proliferationsindizes, wenn ein weiter Bereich von verwandten und nicht verwandten Wachstumsfaktoren als exogene Lösungen mit der behandelten Matrix getestet wurde. Die Wachstumsfaktoren waren transformierender Wachstumsfaktor alpha (TGF alpha), Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF), Epidermalwachstumsfaktor (EGF), saurer Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF-1) (aFGF), basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF-2) (bFGF), Heparin bindender epidermalartiger Wachstumsfaktor (HBEGF). Andere in Betracht zu ziehende Wachstumsfaktoren umfassen von Blutplättchen erhaltenen Wachstumsfaktor (PDGF = Platelet Derived Growth Factor), transformierender Wachstumsfaktor beta (TGF-beta), insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF) und Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF).
Es wird gesehen werden, dass keiner der Wachtumsfaktoren einen Proliferationsindex ergab, der so groß war wie derjenige, der aus der Verwendung von Collagenase resultiert. Wie in den vorangehenden Figuren gezeigt wurde, sind Kombinationen von Wachstumsfaktoren mit Collagenase jedem von beiden allein überlegen.

Claims

Zusammensetzung mit: (a) gereinigter Clostridiopeptidase A-Collagenase im Wesentlichen frei von anderen Proteasen; (b) einer Menge eines Wachstumsfaktors aus der Heparin bindenden Wachstumsfaktorfamilie, der Keratinozytenwachstumsfaktorfamilie oder der Epidermalwachstumsfaktorfamilie, der den Effekt der Collagenase auf die Migration und Proliferation von Keratinozyten bei der Wundheilung erhöht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Wachstumsfaktor ausgewählt ist aus HBEGF, FGF-1, FGF-2, FGF-4, KGF, EGF, TGF-α und HGF.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die gereinigte Clostridiopeptidase A-Collagenase einen Proteinasengehalt von etwa 0,1 FFC-Units/mg aufweist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die weiterhin einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei (a) und (b) zur aufeinander folgenden Verwendung vorgesehen sind.
Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Migration und Proliferation von Keratinozyten bei der Säugetierwundheilung, wobei die Zusammensetzung aufweist: (a) gereinigte Clostridiopeptidase A-Collagenase im Wesentlichen frei von anderen Proteasen; (b) eine Menge eines Wachstumsfaktors aus der Heparin bindenden Wachstumsfaktorfamilie, der Keratinozytenwachstumsfaktorfamilie oder der Epidermalwachstumsfaktorfamilie, der den Effekt der Collagenase auf die Migration und Proliferation von Keratinozyten bei der Wundheilung erhöht.
Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer offenen Wunde in Säugetierhaut, wobei die Zusammensetzung aufweist: (a) gereinigte Clostridiopeptidase A-Collagenase im Wesentlichen frei von anderen Proteasen in einer Konzentration, die wirksam ist, um die Rate der Migration von Keratinozyten zu den Wundkanten zu erhöhen; und (b) einen Wachstumsfaktor der Heparin bindenden Wachstumsfaktorfamilie, der Keratinozytenwachstumsfaktorfamilie oder der Epidermalwachstumsfaktorfamilie, der an Hochaffiniätsrezeptoren von Keratinozyten in einer Konzentration anbindet, die wirksam ist, um die Wirksamkeit der Collagenase beim Stimulieren des Keratinozytenwundheilungsprozesses zu erhöhen.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Wachstumsfaktor ausgewählt ist aus HBEGF, FGF-1, FGF-2, FGF-4, KGF, EGF, TGF-α und HGF.
Verfahren zum Erhöhen der Migration und Proliferation von Keratinozyten beim Wachstum von künstlicher Haut, die in vitro gezogen wird, das das Ziehen der künstlichen Haut auf einer Biomatrix aufweist, die zuvor mit gereinigter Collagenase in der Anwesenheit (a) einer effektiven Konzentration an gereinigter Clostridiopeptidase A-Collagenase im Wesentlichen frei von anderen Proteinasen und (b) einer Menge eines Wachstumsfaktors der Heparin bindenden Wachstumsfaktorfamilie, der Keratinozytenwachstumsfaktorfamilie oder der Epidermalwachstumsfaktorfamilie, der die Wirksamkeit der Collagenase in Bezug auf die Migration und Proliferation von Keratinozyten bei der Wundheilung erhöht, getränkt wurde.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Wachstumsfaktor ausgewählt ist aus hb-EGF, FGF-1, FGF-2, FGF-4, kGF, EGF, TGF-α und HGF.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
Zusammensetzung oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 9 bis 11, wobei die Collagenase die Form einer wässrigen Lösung hat, die von etwa 0,5 ABC-Units Collagenase/ml bis etwa 150 ABC-Units/ml enthält.
Zusammensetzung oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder 9 bis 12, wobei der Wachstumsfaktor die Form einer wässrigen Lösung hat, die von etwa 0,01 ng/ml bis etwa 10 ng/ml enthält.
Zusammensetzung oder Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Wachstumsfaktor die Form einer wässrigen Lösung hat, die von etwa 0,1 ng/ml bis etwa 1,0 ng/ml enthält.
Zusammensetzung, Verwendung oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Wachstumsfaktor an Hochaffinitätsrezeptoren von Keratinozyten anbindet.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Wachstumsfaktor mit niedriger Affinität auch an die sub-zelluläre Matrix anbietet.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 12 bis 16 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 17 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer offenen Wunde in Säuretierhaut, die vorzugsweise das Kontaktieren der unter der Wunde liegenden sub-zellulären Matrix mit (a) und (b) umfasst.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Säugetier ein Mensch ist.