CZ280397A3 - Nové, definované směsi enzymů pro získávání buněk a pro léčbu poranění - Google Patents

Description

Nové, definované směsi enzymů pro získávání buňek a pro léčbu poranění.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití definovaných směsí čištěných enzymů z Clostridium histolyticum k reprodukovatelnému, standardizovanému získávání buněk nebo fragmentů z lidských nebo zvířecích tkání a použití těchto čištěných enzymů k léčbě poranění.

Metody izolování buněk z tkání by měly být reprodukovatelně a měly by zaručit pokud možno malé poškození získaných buněk. K tomu se dosud obecně používaly preparáty s nedefinovaným složením obsahující kolagenázu z Clostridium histolyticum, pomocí nichž není dosažení uvedených cílů jisté. Použití jiných enzymových preparátů či neenzymových metod není obvyklé anebo poskytuje pouze špatnou úspěšnost izolování (1), (9).

Obvykle používané a k použití doporučované preparáty obsahující kolagenázu (2) se získávají z filtrátů kultur bakteriálního kmene Clostridium histolyticum a kromě různých kolagenáz a proteáz (3a), (3b) ještě štěpné produkty těchto enzymů vytvořené pomocí proteolýzy, jakož i další částečně škodlivě působící a neznámé složky.

Pomocí jediného enzymu z Clostridium histolyticum nelze podle dosavadního stavu znalostí získat životaschopné buňky s dobrým výtěžkem. K docílení účinného rozkladu tkáně je spíše nutno, aby spolu působily různé enzymy z těchto bakterií. Dosud ovšem nebylo známo, jaký poměr množství těchto enzymů je k tomu potřebný. Definované směsi enzymů z Clostridium histolyticum doposud rovněž nejsou dostupné uživateli.

Na základě uvedených problémů se různé pracovní skupiny pokoušely používat pro izolaci buněk z tkání čištěné enzymy. Přitom však nikdy nebyly používány jednotné enzymy a tudíž • .····· · · ·'·-'· · · ···'·· ·· ··· ani jasně definované směsi. '

Suggs a kol. (4) izoloval buňky endotelu lidských cév pomocí směsi sestávající z čištěné kolagenázové frakce a čištěného trypsinu z hovězího pankreasu. Použitá obohácená kolagenázová frakce však nebyla definována co do obsahu různých enzymů a obsahovala např. také ještě malá množství člostripainu. Výsledek izolace nebyl významně odlišný od těch, kterých bylo dosaženo při použití preparátů s nedefinovaným složením, obsahujících kolagenázu. Pomocí jednotlivých komponent směsi nebylo možné dosáhnout uspokojivé dezintegrace tkáně. Použití trypsinu na izolaci buněk je ovšem problematické, protože tento proteolytický enzym napadá proteiny membrány. Tak je negativně ovlivněno např. vázání inzulínu na membrány jater a adipocyty (5).

Hefley (6), (7) použil k izolaci kostních buněk'z lebeční kosti myši směsi čištěných kolagenázových fřakcí (6). Autor dříve (7) popsal, že k úspěšné izolači těchto buněk lze použit směs čištěné kolagenázové frakce spolu s neutrální proteázou. V obou pracích všyk byly použity eluáty ze sloupcové frakcionace, u nichž nebyl znám obsah různých kolagenáz, které se nelišily ve specifice nosiče, a dalších komponent.

Wolters a kol. (8) použili k izolaci, buněk Langerhansových ostrůvků z pankreasu potkana směsi z neutrální proteázy a kolagenázu typ VII firmy Sigma, u níž však není známo, jaké druhy a množství různých kolagenáz obsahuje. Kromě toho vykazuje malý obsah člostripainu a nespecifikované proteázy. Neutrální proteáza byla použita ve vysoce čisté formě. Směsi obou uvedených komponent poskytly dobrý výtěžek životaschopných buněk Langerhansových ostrůvků.

Předmětem vynálezu jsou jednotlivé enzymy kolagenázy HP, kolagenázy AZ a elastázy ve vysoké čistotě, a jejich směsi.

Kolagenáza HP má specifickou aktivitu minimálně 20 U/mg, přednostně 50 U/mg v testu podle Gragmanna a Nordwiga (11)

se syntetickým hexapeptidem Z-Gly-Pro-Gly-Pro-Ala jako substrátem. Pro farmeceutické účely má přednostně specifickou aktivitu 100 U/mh nebo vyšší.

Kolagenáza AZ má specifickou aktivitu minimálně 10 U/mg, přednostně 30 U/mg v testu podle Mandla et al. (12) při použití azokollu jako substrátu. Pro farmaceutické účely má přednostně specifickou aktivitu 50 U/mg nebo vyšší.

Elastáza má specifickou aktivitu minimálně 2 U/mg, přednostně minimálně 5 U/mg v testu s elastinem ze týlového kmene hovězího skotu jako substrátem. Pro farmaceutické účely má přednostně specifickou aktivitu 12 U/mg nebo vyšší.

Předmětem vynálezu je dále použití směsi z kolagenázy HP a elastázy, případně s přísadou kolagenázy AZ nebo clostripainu, pro izolování buňek nebo fragmentů tkání z lidských nebo zvířecích tkání.

Vynález se dále týká přímého nebo nepřímého použití těchto enzymů, samotných nebo jako součásti směsí, pro medicínské aplikace, např. při léčbě poranění.

Pro použití pro dezintegrování tkání mohou být směsi připraveny v ampulkách v lyofilizované formě v takových množstvích, že vystačí na dezintegrování jater jednoho potkana (oce 9-11 g živé hmotnosti orgánu).

Jako směsi přicházejí v úvahu takové, které sestávají minimálně z dvou čištěných enzymů kolagenázy HP (500-300 U; přednostně 70-170 U) a elastázy (5-70 U, přednostně 10-25 U) a případně přísady kolagenázy AZ (1-20, přednostně 2-8 U) nebo clostripainu (10-280 U, přednostně 20-50 U). Uvedená čísla udávají množství, které se nacházejí v jedné jednotce směsi - například v ampulce.

Kritériem čistoty použitých enzymů je jejich specifická aktivita a jejich důkaz jejich jednotnosti v elektroforetické metodě použité k tomuto účelu (elektroforéza SDS-gel,

·· · izoelektrická fokuzace a elektroforéza na agarozovém gelu). Specifická aktivita čištěného enzymu dosahuje až 100-násobně vyšších hodnot ve srovnání s výchozím materiálem.

Pro přípravu směsí se používají čištěné enzymy s následujícími specifickými aktivitami: kolagenáza HP se specifickou aktivitou minimálně 20 U/mg, elastáza s minimálně 2 U/mg,^! kolagenáza AZ s minimálně 100 U/mg a clostripain s minimálně 19 U/mg.

Směsi se vyznačují tím, že na základě svého definovaného složení synergicky působících kolagenolytických₍ elastinolytických a proteolytických enzymů jsou zvlášť vhodné pro šetrné a efektivní izolování buňek nebo fragmentů ze zvířecích a lidských tkání.

Podstatnou výhodou je, že už není nutná časově a finančně náročná kontrola šarží, protože se při výrobě vždy vychází z čištěných enzymů se známými vlastnostmi. Tím odpadá práce, jež je nutná k funkčnímu charakterizování buněk, nebo je přinejmenším podstatně menší. Z těchto důvodů lze v mnoha oblastech snížit počet pokusů na zvířatech.

Použití ne tak dobře čištěných enzymů nebo použití enzymů s menši specifickou aktivitou vede při uvedených aplikacích zpravidla k horšímu výtěžku buněk a navíc je stižen obvyklými problémy nedostatečné reprodukovatelnosti výsledků izolace, nedostatečné konstatnosti šarží a přítomnosti neznámých, možná negativně působících složek.

Mnoho v literatuře popsaných výsledků pokusů lze obtížně interpretovat kvůli degradaci enzymů průvodními proteázami, k níž dochází při výrobě, čištění nebo charakterizaci. Objasněni vlivu jednotlivých enzymů na úspěch pokusu při izolování buněk bylo ztíženo i tím, že úlomky vznikající z kolagenáz, elastázy a proteáz si částečně ponechávají svoji enzymatickou aktivitu. Do jaké míry se při tom mění specií icita substrátu, však není ještě objasněno. Také v mnohých komerčních preparátech obsahujících kolagenázu jsou • · · · · · ♦ · · ···· · * ···· · · · • · · · · · · · · · · · · ·

- 5 někdy obsaženy pouze produkty odbourávání původních kolagenáz. Podle dosavadního stavu techniky rovněž nebyla možná jednoznačná standardizace preparátů obsahujících kolagenázu, a to jak pro výrobce preparátu, tak i pro uživatele.

Pro použití vynalezených směsí z čištěných enzymů přicházejí kvůli jejich široké aktivitě při rozkládání tkání v úvahu všechny lidské a zvířecí tkáně a buňky, přednostně fragmenty tkání nebo buňky z:

žlučového traktu, krevního systému, žláz, cévního systému, mozku, kůže, srdce, střev, Langerhansových ostrůvků, jater, plic, žaludku, sleziny, svalů, pupeční šňůry, nervů, ledvin, pankreasu, míchy, štítné žlázy, terminálního ilea, nádorové tkáně, dělohy, trávícího a zažívacího traktu a jazyka.

Buňky nebo fragmenty tkání izolované pomocí popsaných směsí se hodí zvláště pro použití při transplantaci buněk nebo tkání, jakož i v genové terapii (např. Langerhansovy ostrůvky, buňky ostrůvků, hepatocyty, nádorové buňky, dipocyty), v imunoterapii nebo při léčbě poranění.

Zvláštní význam má použití vynalezených směsí při izolování hepytocytů, buněk Langerhansových ostrůvků, endotelových buněk, epitělových buněk, adipocytů, oocytů a nádorových buněk. V těchto oblastech použití je standardizace a zlepšování metodiky mimořádně významná.

Například směs s definovaným složením, kterou tvoří 2 kolagenázy s různou specificitou substrátu a elastázy, se ukázala jako velmi vhodná k izolování hepatocytů z potkaních jater (příklady použití A, D, E) a z lidských jater (příklad použití F), epitelových buněk žlučovodu z potkaních jater (příklad použití G), endotelových buněk z lidské pupeční šňůry (příklady použití Η), jakož i k izolování nádorových buněk z lidských nádorů (příklad použití I) a buněk ostrůvků z prasečího pankreasu (příklad použití J).

• ··· · · · • ' · · · • · · · · · ·

- 6 Ve srovnání s nejlepšími enzymovými preparáty obsahujícími kolagenázy s nedefinovaným složením se dosahuje lepší nebo přinejmenší stejně dobré úspěšnosti izolování.

Vynalezené směsi mohou být použity jako náhrada za všechny obvykle užívané preparáty obsahující kolagená2u, protože mají komponenty potřebné pro dezintegraci tkáně. Nevýhody doposud používaných preparátů obsahujících kolagenázu jsou odstraněny m.j. díky konstantnímu složení směsí.

Důležitou oblastí použití pro uvedené směsi, je reprodukovatelné, standardizované získávání hepatocytů z jater známou metodou Berryho a Frienda (9), (10), při níž se doposud pracovalo s enzymovými preparáty obsahujícími kolagenázu s nedefinovaným složením, jakož i použitím uvedených směsí vylepšené získávání buněk ostrůvků v intaktní formě z tkání pankreasu. , ·.

Další hlavní oblastí použití je léčba poranění. K tomu se používají enzymy v co možná nejvyšší čistotě.

Podstata vynálezu _: ; I. Příprava a charakterizování enzymů ,z Clostridium histolyticum

1. Kolagenáza HP

a. Výroba

Frakcionované proteinové srážení se síranem amonným

Všechny operace při čištění enzymů se provádějí při 4-8’C.

200 g syrové kolagenázy se rozpustí ve 3 1 vody a do získaného roztoku se přidá nejdřív 680 g práškového síranu amonného. Vysrážená proteinová sraženina Al se oddělí pomocí odstředivky; za účelem přesahu se přidá dalších 420 g síranu sodného. Proteinová frakce A2, která se přitom vysráží, je odvedena, sraženina se rozpustí vil vody a dialyzuje vůči • ·· ·· · φφ ·· • · · φ · φ φ φ * · · φ • · · ·· · ···· φ ······ φ · ··φ φ · φ · · · φ · · · ··· φφ ·· Φ·· · · ·· vodě. Pak se přes ultrafiltrační membrány (mez propustnosti 10.000 Da) zkoncentruje na asi 100 mi. Koncentrát pak byl lyofilizován. Takto získaná prášková proteinová frakce A2 obsahuje jako hlavní komponenty kolagenázu HP a kolagenázu AZ.

Chromatografické oddělení HP a kolagenázy AZ pomocí metalchelátové afinitní chromatografie

Chromatografická separace kolagenázy HP a kolagenázy AZ probíhalo na chelátové sefaróze B6 obsahující Zn²⁺. K tomu se tento materiál upravil do sloupce (5 x 100 cm) ve výšce vrstvy 70 cm a uvedl do rovnováhy se startovacím pufrem (700 mM octanu sodného + 20 mM octanu vápenatého, pH 8,0). Pak se cca 1,2 g proteinové frakce A2 rozpuštěného v 15 ml iniciačního pufru, jakož hodnota pH byla pomocí TRIS [tris-(hydroxymethyl)-aminomethan] upravena na 8,4, naneslo na sloupec a pomocí iniciačního pufru se ze sloupce vymyly různé složky proteinové frakce A2. Při následné eluci s pufrem A (500 mM octanu sodného + 20 mM octanu vápenatého, upraveno pomocí kyseliny octové na pH 6,3) byla v oddělených frakcích zachycena nejdříve kolagenáza AZ a pak kolagenáza HP.

Obě oddělené enzymové frakce kolagenázy HP a kolagenázy AZ byly pomocí ultrafiltrační membrány (mez propustnosti 10.000 Da) zkoncetrovány na 50-100 ml, potom dialyzovány vodou a opět přes ultrafiltrační membránu (mez propustnosti 10.000 Da) zkoncentrovány na cca 10 ml.

Jemné čištění kolagenázy HP

Jemné čištění kolagenázy HP se provádělo na anexu Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) pomocí přístroje FPLC firmy Pharmacia.

K tomu byla na sloupec, který byl uveden do rovnováhy s pufrem B (20 mM TRIS/HC1 Ph 7,5), nanesena směs z 1 ml pufru B a 2 ml frakce obsahující kolagenázu HP z předchozího chromatografického kroku.

- 8 Po vymytí pufrem B byla kolagenáza B v čisté formě eluována ze sloupce pomocí pufru C (20 mM TRIS/HCl + 200 mM NaCl,

Ph 7,5).

b. Vlastnosti

Kolagenáza HP má své označení HP na základě své vlastnosti, že zvlášt dobře odbourává hexapěptid

Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala. Je proto vhodná pro'specifický důkaz aktivity. Kolagenáza HP je charakterizována tím, že denaturované kolageny jako želatina nebo azokoll může přebudovat pouze v malé míře. Napadá ovšem kolagen hovězích šlach a ve velkém rozsahu štěpí syntetické peptidy uvedené v příkladu 2b na glycid a glycid resp. libovolnou aminokysleinu a glycid.

Zejména je nutno zdůraznit, že kolagenáza HP spolu s kolagenázou AZ (a naopak, t.j. tudíž také veškeré směsi složené minimálně z kolagenázy HP a AZ) mají synergický účinek na rozklgd přírodního kolagenu. Tento synergický účinek in-vitro nabývá na významu také při použití,k dezintegraci tkání (např. příklad použití G).

Specifická aktivita kolagenázy HP činí maximálně 146 U/mg v testu se syntetickým substrátem Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala (11). To odpovídá cca 100-násobnému zvýšení její specifické aktivity vůči výchozímu materiálu.

Takto vyčištěná kolagenáza HP vytváří jak při SDS-gelové elektroforéze, tak i při izoelektrické fokuzaci a elektroforéze na agarozovém gelu pouze jeden pík.

Její molekulová hmotnost stanovená pomocí SDS-elektroforézy činí 106.000 Da. Její izoelektrický bod je pH 5,8-6,0.

-9 • ·· ·* • · · · · • · · · · • · · · · · · • ' · · · • · · · · · · ·· ·· • · · ·

2. Kolagenáza AZ

a. Výroba

Všechny operace při čištění enzymů byly provedeny při 4-8°C. Oba první kroky čištění kolagenázy AZ (frakcionované proteinové vypadávání a metalchelátová afinitní chromatografie) jsou popsány v 1.

Jemné čištění kolagenázy AZ bylo provedeno na anexu Mono Q (HR 10/10 Pharmacia) a za pomoci přístroje FPLC firmy Pharmacia. K tomu bylo na sloupec, který byl uveden do rovnováhy s pufrem D (20 mM octanu vápenatého, pH 7,2), nanesena směs z 1 ml pufru D a 1 ml frakce obsahující kolagenázu AZ (z výše popsané metalchelátové afinitní chromatograf ie ) .

Po vymytí pufrem D byla kolagenáza AZ eluována ze sloupce pomocí pufru E (20 mM octanu vápenatého, pH 5,0).

b. Vlastnosti

Kolagenáza AZ má svoje označení AZ na základě své vlastnosti, že velmi dobře odbourává substrát azokoll. Je charakterizována tím, že dobře přebuduje denaturované kolageny jako želatinu a azokoll, ale také kolagen hovězích šlach. Nemůže ale napadat malé syntetické peptidy jako 2-furanakryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala, 4-fenyl-azobenzyloxy-karbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg a Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala.

Specifická aktivita kolagenázy AZ je maximálně 82 U/mg v testu, který vyvinul Mandl a kol. (12), při použití azokollu jako substrátu. To odpovídá cca 80-násobnému zvýšeni její specifické aktivity vůči výchozímu materiálu.

Takto vyčištěná kolagenáza AZ vytvoří jak při SDS-gelové elektroforéze, tak i při izoelektrické fokuzaci a elektroforéze na agarozovéra gelu pouze jediný pík. Její molekulová hmotnost stanovená pomocí SDS-gelové elektroforézy činí

111.000 Da. Její izoelektrický bod je pH 5,9-6,1.

·«· · • · ♦ · 4

3. Elastáza

a. Výroba

Všechny operace při čištění enzymů byly prováděny při 4-8°C.

První krok čištění elastázy byl proveden proteinovým vysrážením se síranem amonným, jak je popsáno v l.a.

Proteinová sraženina Al se rozpustí v- 1 1, přes ultrafiltrační membránu (mez propustnosti 10.000 Da) zkoncentruje na asi 170 ml a dialyzuje vůči 0,1 mM roztoku octanu vápenatého. Potom se enzymový roztok znovu koncentruje přes ultrafiltrační membránu (mez propustnosti 10.00,0 -Da) na cca 50 ml a pak se lyofilizuje.

Jemné čištění se provedlo pomocí geloyé chrpmatografie na SEPHADEXu G100 nebo G200 (Pharmacia).

b. Vlastnosti

Elastáza je charakterizována tím, žejmůže ve velkém rozsahu odbourávat elastin. Její specifická aktivita (viz 3.c) byla 18 U/mg. To odpovídá cca 80-násobnému zvýšení její specifické aktivity vůči výchozímu materiálu. Takto vyčištěná elastáza tvoří jak u SDS-gelové elektroforézy,tak i u izoelektrické fokuzace a elektroforézy na agarozovém gelu pouze jediný pík.

Molekulární hmotnost elastázy stanovená pomocí SDS-elektroforézy je 35.000 Da.

C. Stanovení aktivity

Stanovení enzymové aktivity se provedlo pomocí substrátu elastinu.

mg jemně práškového elastinu z týlového kmene hovězího skotu (sigma) bylo předinkubováno v 0,4 ml pufru (50 mM

·· • · • · · · • · • ·

TRIS/HCl + 10 mM octanu vápenatého, pH 7,2) třepáním ve vodní lázni při 37°C. Pak byla reakce iniciována přidáním elastázy rozpuštěné v 0,1 ml pufru a 10 minut se dále třepalo při 37°C (výška zdvihu 25 mm, frekvence 150 min^-1). Potom bylo přidáno 3,5 ml ledově studené vody a nezreagovaný elastin byl ihned odstraněn přes filtr. Extinkce E filtrátu byla změřena spektrometricky při vlnové délce 280 nm. Jako srovnávací hodnota sloužila extinkce E_B získaná při pokusu provedeném stejným způsobem, při němž však byl roztok elastázy přidán až po odstranění elastinu. Extinkce E_B tohoto filtrátu byla rovněž stanovena při 280 nm.

Aktivita elastázy je vyjádřena v jednotkách (U). Jako 1 U se definuje taková enzymová aktivita, která za daných podmínek pokusu rozpustí 1 mg elastinu za minutu. Rozpuštěné množství elastinu bylo stanoveno ve filtrátu testovaného materiálu měřením extinkce při 280 nm.

Výpočet specifické aktivity se provádí podle následujícího vzorce:

Δ E x F x testovaný objem x ředící faktor U/mg = -_:min x mg elastázy v testovaném materiálu

ΔΕ = E - EB F = 1,376

Faktor F se stanoví tak, že se 10 mg elastinu určité šarže pomocí elastázy úplně rozpustí a změří se odpovídající rozdíl extinkce δΕ. Součin tohoto faktoru F a rozdílu extinkcí δΕ dává rozpuštěné množství elastinu v miligramech na mililitr testovaného materiálu.

« ·· ·· « ·· ·· · · * · · ·· · ·'·'·' · · · · ··· • ··· · · · · · ··· · · β ···· ··· ··· ·* ·· ··· ·· ··

4. Clostripain

a. Výroba

Izolace clostripainu byla provedena podle metody popsané Ullmanem a Jakubkem (14).

Jeho specifická enzymová aktivita byla stanovena pomocí syntetického substrátu α-N-benzoyl—L-arganin-ethylester (=BAEE) po předchozím 3-hodinovém aktivování roztoku clostripainu pomocí 2 mM roztoku 1,4-dithioerythritu (15). Její hodnota byla cca 83 U/mg.

b. Vlastnosti ^:

Thiolproteáza clostripain je charakterizována tím, že polypetidové řetězce a synteticky vyrobené substráty štěpí specificky za aminokyselinou L-arganin.' J

Její molekulová hmotnost stanovená pomocí SDS-elektroforézy je 55.000 Da.

II. Příklady použití vynálezu

Následující příklady A-J ukazují exemplárně mimořádnou vhodnost některých směsí čištěných enzymů k izolování buněk a fragmentů ze zvířecích a lidských tkání. Příklady K a L ukazují exemplárně vhodnost čištěných enzymů pro použití při léčbě poranění.

Vynález není omezen na tyto příklady použití.

Příklad A

Izolování hepatocytů jater pomocí směsi ze třech enzymů.

Hepatocyty se izolují podle standardní metody Berryho a Frienda Popis(9) a modifikací podle Seglena (16). Potkani Wistar kmene (200-280 g) byly narkotizováni pomocí i.p. injekce nembutalu (35 mg pentobarbitalu/kg tělesné váhy). Po otevření břišní dutiny byla kanylována Véna portae a při • «4 4»

4 4 4 · • > 4 4 4 • ··» 44 4

4 4 4

44444 »4 ··

4 4 * 4 4 4 4

- 13 konstantním hydrostatickém tlaku (12 cm vodního sloupce, proměnný průtok) byla po otevření Véna cava inferior při teplotě 36-36,8⁰C provedena infuze následujících roztoků s hodnotou pH 7,4±0,05 s plynným karbogenem:

perfuze:

1.	5	min	cca	100 ml buněčného pufru	bez	Ca2 +
2 .	5	min	cca	100 ml buněčného pufru	bez	Ca2 +
					s	EGTA (0,42 mM)
1.	8	min	cca	200 ml buněčného pufru	bez	Ca2 +
1.	5·	-30 min <	cca 100-600 ml buněčného pufru, v němž byly

rozpuštěny lyofilizované směsi čištěných enzymů.

buněčný pufr:

120,0 mM NaCl 1,29 mM CaCl₂

5,50 mM D(+)-glukÓzy 1,19 mM KH₂PO₄

4,81 mM KC1 1,20 mM MgSO₄

15,0 mM NaHCO₃ 10,0 mM HEPES karbogen: směs plynů 95% O₂ a 5% CO₂ (v/v)

Směsí enzymů byl lyofilizát 130 U kolagenázy HP, 5 U kolagenázy AZ a 21 U elastázy, který byl rozpuštěn v 87,5 ml buněčného pufru.

Perfuze byla ukončená při změknutí tkáně jater. Po uvolnění Glissonova pouzdra se hepatocyty vytřepaly z jaterní tkáně a přefiltrovaly přes sítové pletivo (velikost ok 100 μπι) . Po filtraci se buňky 20 minut protřepávaly v karbogenové atmosféře ve vodní lázni při 37°C. Neporušené hepatocyty byly koncentrovány pomocí třech 2-minutových odstřeďování v buněčném pufru při 50-násobku zemského tíhového zrychlení. Zbytek, v němž se nacházejí převážně mrtvé buňky, byl po každém odstřeďování odstraněn. Podíl vitálních hepatocytů, párů buněk hepatocytů nebo vícebuněčných agregátů hepatocytů byl mikroskopicky stanoven po resuspenzaci získané buněčné usazeniny v Burkerově počítací komoře (zbarveno 0,08%-ní trypanovou modří, doba 2 min.)

Výsledek

V sérii pokusů (n=4) byla za použití popsané Směsi enzymů získána buněčná suspenze, která obsahovala průměrně 88,7 % vitálních buněk při výtěžku 360 xlO⁶ buněk z jater.

Srovnávací pokusy s preparátem obsahujícím kolagenázu o nedefinovaném složenm s velmi vysokou specifickou kolagenolytickou aktivitou vedly k silnému poškození buněk a pouze k 72,5 % vitálních buněk (n=4).

Příklad B

Izolování hepatocytů jater pomocí směsi ze dvou enzymů

Pracovalo se analogicky jako v příkladu A, ale při použití následující směsi enzymů: 60 U kolagenázy HP a 3 U elastázy. Byla získána buněčná suspenze, která obsahovala průměrně 90,5 % vitálních buněk při výtěžku 263 x 10⁶ buněk (n=2).

Příklad C

Izolování hepytocytů jater pomocí směsi ze čtyřech enzymů

Pracovalo se analogicky jako v příkladu A, ale při použití následující směsi enzymů: 30 U kolagenázy HP, 5 U kolagenázy AZ, 3 U elastázy a 16 U clostripainu.

Byla získána buněčná suspenze, která, obsahovala průměrně 83 % vitálních buněk při výtěžku 232 x 10⁶ buněk (n=2).

Příklad D

Rozsáhlé potvrzení úspěchu izolování hepatocytů potkaních jater pomocí směsi ze třech enzymů ve 4 různých laboratořích ve srovnání s preparáty obsahujícími kolagenázu o nedefinovaném složení.

• · · · · · * • · · ·

Jsou známy malé, ale pro úspěšnost izolování hepatocytů eventuálně významné rozdíly u metod izolování buněk mezi laboratořemi. Aby byla prověřena nezávislost účinnosti izolování buněk pomocí směsi uvedené v příkladu A na použité metodice, byla izolace hepatocytů provedena ve větším počtu ve laboratořích.

Použitou směsí enzymů byl lyofilizát ze 130 U kolagenázy HP,

U kolagenázy AZ a 21 U elastázy, který byl rozpuštěn v 87,5 ml buněčného pufru (analogicky k příkaldu A).

Úspěšnost izolování hepatocytů byla měřena pomocí následujících pěti parametrů: 1. mikroskopické stanovení podílu vitálních hepatocytů (v % celkového počtu hepatocytů v získané buněčné suspenzi pomocí vylučovacího testu s trypanovou modří), 2. stanovení celkového počtu izolovaných hepatocytů, 3. stanovení celkového počtu izolovaných hepatocytů na gram hmotnosti zvířete, 4. stanovení podílu jednotlivých buněk (v % vztaženo na všechny formy agregátů v získané buněčné suspenzi, t.j. vůči dvojným nebo vícenásobným agregátům hepatocytů) a 5. dodržení doby perfuze potřebné k úspěšné dezintegraci tkáně pomocí kolagenázového roztoku.

V těchto testech prokázaly směsi z vynalezených enzymů podstatně lépe reprodukovatelné výsledky než obvyklé přípravky.

Příklad E

Izolování hepatocytů z potkaních jater pomocí směsi ze 3 enzymů: zachování funkce buněk

Pro doložení nejenom vhodnosti vynalezených směsí ohledně prosté úspěšnosti izolace hepatocytů, ale také se zvláštním zřetelem na funkci buněk, byly provedeny srovnávací izolace buněk u potkaních jater za použití preparátu obsahujícího kolagenázu o nedefinovaném složení, který je k tomuto účelu zvlášť, dobře vhodný.

Hepatocyty byly izolovány podle standardní metody Berryho a Frienda (9) a modifikací podle Seglepa (16).

Použitou směsí enzymů byl lyofilizát ze 130 U kolagenázy HP, 5 U kolagenázy AZ a 21 U elastázy, který byl pro izolování hepatocytů z potkaních jater rozpuštěn v 87,5 ml buněčného pufru (analogicky k příkladu A).

Prostá úspěšnost izolace potkaních hepatocytů byla určena následujícími parametry: podíl vitálních buněk podle vylučovacího testu s tyrpanovou modří, výtěžek búněk na 1 g jater, podíl jednotlivých buněk (v %).

Kvalita získané buněčné suspenze bylá z hlediska funkce hepatocytů dále charakterizována (21, 22) následujícími parametry: obsah ATP, energetický náboj (EC), lidokainový metabolizmus ke monoethylglycinxylididu (MEGX) a absorbce cholyltaurinu (kyseliny (3a,7a,12a-trihydroxy-53-cholan-24-oyl)-2-aminoethansulfonové) při koncentraci substrátu 21 μΜ.

U všech zkoumaných parametrů nebyly zaznamenány žádné významné rozdíly mezi oběma preparáty obsahujícími kolagenázu .

Tím lze mít za prokázané, že hepatocyty izolované pomocí vynalezených směsí enzymů jsou zcela neporušené nejenom při posouzení pomocí jednoduché úspěšnosti izolování, ale také při posouzení různých funkcí buněk, např. určitých funkcí diferencovaného přenosu látek nebo určitých metabolických funkcí enzymů hepatocytů, které jsou závislé na cytochromu-P450.

Příklad F

Izolování hepatocytů z lidských jater pomocí směsi ze 3 enzymů

Hepatocyty byly izolována podle metody Berryho a Frienda (9) s

a podifikací podle Seglena (16) při použití bioptické perfuzní techniky (21).

Použitou směsí enzymů byl lyofilizát ze 130 U kolagenázy HP, 5 U kolagenázy AZ a 21 U elastázy, který byl rozpuštěn v 50 ml buněčného pufru.

Úspěšnost izolování lidských hepatocytů byla určena následujícími parametry: podílem vitálních buněk podle vylučovacího testu s trypanovou modří a výtěžek buněk na 1 g jater.

Ukázalo se, že pomocí vynalezených směsí lze izolovat i hepatocyty z lidských jater úspěšně a s konstantním výsledkem (podíl vitálních buněk 85-90 %).

Příklad G

Izolování biliárních epitelovách buněk z potkaních jater

V sérii pokusů (n=4) byly izolovány biliární epitelové buňky z potkaních jater podle metody popsané v literatuře (19). Přitom byly v prvním kroku dezintegrace tkáně nejdříve enzymaticky odstraněny hepatocyty z vaziva tkáně a ve druhém kroku byly ze zbývající tkáně pomocí trypsinu izolovány biliární epitelové buňky.

Enzymovou směsí pro odstranění hepytocytů byl lyofilizát ze 130 U kolagenázy HP, 5 U kolagenázy AZ a 21 U elastázy, který byl rozpuštěn ve 87,5 g buněčného pufru.

Podíl vitálních epitelových buněk byl u všech preparátů přes 95 %, výtěžek buněk byl 4-6 x 10⁶ buněk na játra (n=4). Použití popsané směsi enzymů výjimečně usnadnilo izolování biliárních epitelových buněk ze zbývajícího systému pomocí trypsinu, protože zbylá tkáň, která byla získána po prvním kroku, byla prakticky bez hepatocytů.

U doposud používaných metod získávání biliárních epitelových buněk bylo problematické, že hepatocyty, které zůstávaly « ·

v buněčné suspenzi, jakož i von Kupfférový buňky a další druhy buněk bylo zpravidla obtížné oddělit od izolovaných epitelových buněk.

Díky použití popsané směsi z čistých enzymů bylo možné dosáhnout jasné úspory času a nákladů, protože na rozdíl od dosud používaných metod došlo ke zřetelně lepší, prakticky úplné dezintegraci jaterní tkáně. ·Tím. se podařilo dosáhnout žádoucího odstranění kontaminujících hepatocytů, které se obvykle vyskytují ve velkém počtu.

Příklad H

Izolování endotelových buněk z lidské pupeční šňůry pomocí směsi ze 3 enzymů

Lidské endotelové buňky z pupeční šňůry byly izolovány Jaffovou metodou (17). K tomu byly pupeční šňůry (20 - 30 cm dlouhé) rozpůleny, po párech naplněny příslušným enzymovým roztokem a 15 minut inkubovány při 37°C a 5 % CO₂ v inkubátoru. Uvolněné buňky byly odebrány a drženy v primární kultuře pro vyhodnocení. Výtěžek živých a dělení schopných buněk byl stanoven po vymytí uvolněných buněk po čtařech dnech v kultuře.

Směsí enzymů byl lyofilizát ze 130 U kolagenázy HP, 5 U kolagenázy AZ a 21 U elastázy, který byl rozpuštěn v 87,5 ml buněčného izolačního pufru.

Den po zahájení kultivace buněk byly vymyty uvolněné buňky (erytrocyty, makrofágy atd.). Médium bylo čtvrtý den vyměněno. Splynutí bylo obvykle dosaženo osmý den po zahájení kultivace (> 10⁵ buněk/cm²). Splynutá kultura buněk sestává z více než 95 % z endotelových buněk, jak ukazují FACS zkoušky s protilátkami vůči factor-VIII-related antigenu (von Willebrandův faktor) nebo dvěma endotelové specifickým povrchovým antigenům (EN-4, PAL-E) resp. še dvěmi fluoreskujícími ligandami receptoru Scavenger (dil-Ac-LDL).

• · · · · φ φ φ φ φ · ·

Výtěžek (η=2) dosažený pomocí výše uvedených směsí z čištěných enzymů překonal ty, které byly získány pomocí enzymových preparátů obsahujících kolagenázu s nedefinovaným složením. Hustota buněk po 4 dnech činila 1,8 x 104 na cm². Pokud se použijí doposud známé postupy, získá se hustota buněk, která je znatelně nižší. Splynutí monovrstvy bylo při použití výše uvedenéh směsi dosaženo dříve (již po 5-6 dnech).

Při enzymatické izolaci endotelových buněk pomocí různých enzymových preparátů v žádnm případě nedošlo k protržení žíly pupeční šňůry. Uvolněné buňky byly dobře oddělené. Nebyl pozorován žádný cytotoxický jev. Po jedné hodině bylo zjištěno přichycení endotelových buněk.

Preparované buňky byly v první fáze funkčně prověřeny /produkce endotelinu, uvolňování LDH). Přitom ležely všechny hodnoty v normálním rozmezí. Z funkčního hlediska tudíž nebylo možné buňky odlišit od výsledků z kontrolních pokusů, v nichž byly buňky izolovány pomocí preparátů obsahujících kolagenázu v nedefinovaném složení.

Výhoda použitých směsí z čištěných enzymů tedy spočívá ve vyšším možném výtěžku buněk, rychlejší tvorbě souvislé monovrstvy a v optimální integritě izolovaných buněk (struktura a funkce buněk).

Srovnatelně dobrých výsledků bylo dosaženo v těch pokusech, v nichž místo výše uvedené enzymové směsi byly použity také jiné směsi např. sestávající z kolagenázy HP a elastázy, jakož i směsi z kolagenázy HP, kolagenázy AZ, elastázy a clostripainu.

Příklad I

Izolování nádorových buněk z lidských nádorů pomocí směsi ze 3 enzymů

Nádorové buňky z lidských nádorů byly izolovány podle

předpisu (23).

Použitou směsí enzymů byl lyofilizát ze 130 U kolagenázy HP, 5 U ko.lagenázy AZ a 21 U elastázy, který byl rozpuštěn ve 28,4 ml buněčného izolačního pufru (Ringer-laktát/PBS).

Úspěšnost izolace byla zjištěna podl,e, podílu vitálních buněk ve vylučovacím testu s trypanovou modří a spočtením počtu lymfocytových buněk. Byly provedeny přímo srovnatelné izolace buněk za použití vynalezených enzymových .směsí a preparátů obsahujících kolagenázu s nedefinovaným složením, který se pro tento účel velmi dobře hodí, a to na 4 různých nádorových tkáních. <

Výsledek

Vynalezená enzymová směs může být velmi dobře použita k izolování nádorových buněk z lidských nádorů.

Úspěšnost izolace odpovídá v rámci experimentálních výchylek úspěšnosti izolace, které se dosahuje pomocí vybraných preparátů obsahujících kolagenázu s nedefinovaným složením, které jsou zvlášt dobře vhodné k izolování nádorových buněk.

Protože podle zde předložených výsledků lze úspěšně dezintegrovat nejrůznější struktury vaziv v lidské nádorové tkáni pomocí vynalezené enzymové směsi, a to za současného dosažení nebo zlepšení stavu techniky (úspěšnost izolování, kvalita izolovaných buněk a zachování metodických proměnných), lze předpokládat vhodnost vynalezených enzymových směsí také pro dezintegraci jiných zvířecích a lidských tkání.

Příklad J

Izolování buněk ostrůvků z prasečího pankreasu pomocí směsí ze 3 enzymů

K izolování ostrůvkových buněk z prasečího pankreasu byla • 44 44 4 44 ··

4 4 4 4 44 4 4 4 ·

4 4 4 4 4 4 4 44 • 4 4 4 4 4 4 4 · 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 · 4 · 4

444 44 44 444 44 44 použita známá metoda přípravy podle Ricordiho se zavedením některých podstatných modifikací (24) m.j. k lepší kontrole úspěšnosti izolováni. Roztok kolagenázy přitom působí za zvlášť dobře standardizovaných podmínek na tkáň pankreasu po delší dobu po infuzi žílou pankreasu. Již uvolněné ostrůvky se spojitě odvádějí do rezervoáru o nižší teplotě a po ukončení dezintegrace se ostrůvky, které jsou ve tkáni pankreasu již částečně uvolněny ze své matrice, úplně uvolní a izolují za mírným mechanickým působením.

Izolování ostrůvkových buněk z pankreasu klade mimořádně vysoké požadavky na preparát obsahující kolagenázu, protože zásady pro úspěšné izolování neporušených ostrůvků z pankreasu nejsou dostatečně známy.

V následujícím textu je exemplárně dokázána vhodnost vynalezených definovaných enzymových směsí. Tím lze i u tohoto typu tkáně přenést vhodnost k úspěšné dezintegraci tkáně, při níž by se izolovaly velké přirozené agregáty buněk, na použití u pankreasů také jiných druhů (např. lidského pankreasu) . Tento předpoklad podporují zkušenosti, které hodnotí izolování ostrůvků z prasečího pankreasu jako těžší než z pankreasu jiných druhů. Je např. známo (25), že ostrůvky z prasečího pankreasu se při obvyklém použití preparátů obsahujících kolagenázu s nedefinovaným složením snadno mohou rozpadat na menší, nežádoucí fragmenty. To se vysvětluje zvláštními vlastnostmi buněk v ostrůvkových agregátech, které vykazují mnoho kontaktů mezi buňkami, které jsou citlivé na proteázu, jak mezi endokrinními a exokrinními buňkami, tak i mezi endokrinními buňkami a ostrůvky. Cílem zlepšené metody izolace může také být pouze zachovat více neporušených agregátů ostrůvkových buněk, přičemž ke fragmentaci na agregáty <100 μπι by mělo docházet pouze v menší míře.

Enzymovou směsí použitou v tomto příkladu k izolování ostrůvků z prasečího pankreasu byl lyofilizát ze 130 U kolagenázy HP, 5 U kolagenázy AZ a 21 U elastázy, který byl rozpuštěn v 10 ml izolačního pufru. Do tohoto roztoku byla • ·· · · • · · ·

A rutinným způsobem přidána dezoxyribonukleázý (0,4 mg/10 ml, 440 Kunitzových jednotek/mg, SIGMA).

Úspěšnost izolace lze stanovit pomocí distribuce velikostí získaných neporušených buněčných agregátů a dalších obvyklých parametrů.

Jako zvláštní výhodu použití vynalezených enzymových směsí lze uvést, že bylo možné získat relativně více volných ostrůvků nad 100 μιη než pomocí obvyklých preparátů.

Příklad K

Experimentální výzkum léčby poranění in viyo

Kolagenázy při léčbě poranění odpovídají za účinné odstranění zničené tkáně, činnost buněk v oblasti rány a přebudování mimobuněčné matrice.

V experimentálním in vivo modelu čištění ran podle Webstera (19) byly na potkanech prověřeny vlastnosti čištěných enzymů při odbourávání tkáně.

Podle aplikovaného množství čištěných enzymů na popáleniny třetího stupně bylo pozorováno rychlejší odbourání denaturované tkáně v průběhu prvních 16 hodin. Enzýmy byly aplikovány samostatně nebo v kombinaci s jinými enzymy. Nejlepších výsledků bylo dosaženo při aplikaci směsi z kolagenázy HP (3-48 U/cm², přednostně 16 U/cm²), kolagenázy AZ (0,2-3 U/cm², přednostně 1 U/cm²) a elastázy (1-12 U/cm², přednostně 3 U/cm²). Přitom byl u 8 z 15 zvířat strup ha ráně téměř zcela rozpuštěn a u 6 z 15 zvířat bylo dosaženo částečného rozpuštění. V těchto případech bylo možné nekrotickou tkáň snadno mechanicky odstranit, na rozdíl od kontrolní skupiny.

Po kratší době aplikace 4 hodiny bylo u stejného použitého množství zjištěno změkčení nekrotického,materiálu a ve všech případech bylo možné strup dobře odstranit (na rozdíl od ·· · · •, · · · •·· · · · • · · • ·· ·· ·· · · · ♦ • · · · · • · ··· ♦ · • · · · ··· ·· ·· kontrolní skupiny).

Vedle této směsi byly úspěšně použitelné i další směsi, např. z kolagenázy HP (3-48 U/cm²) a elastázy (1-12 U/cm²).

Příklad L

Experimentální výzkum léčby poranění in vitro

Získané výsledky odbourávajícího účinku na nekřotickou tkáň (příklad K) byly dále charakterizovány v modelu in vitro.

V dobře protřepaném rozotku pufru bylo stanového uvolňování 4-hydroxyprolinu (20) působením kolagenázy HP, kolagenázy AZ nebo elastázy na strup popáleniny uvedený v příkladu K, a to po 2, 4, 6 a 24 hodinách.

Byly aplikovány takové aktivity čištěných enzymů, které byly identické s relativními aktivitami v účinném srovnávacím množství preparátu obsahujícího kolagenázu. Při tomto experimentálním zjednodušení nebyl brán v úvahu příslušný příspěvek dalších komponent nacházejících se v preparátu obsahujícím kolagenázu na uvolňování hydroxyprolinu.

Při použití čištěných enzymů bylo ve všech případech ve zřetelné časové závislosti zjištěno uvolňování srovnatelných množství hydroxyprolinu, jako při použití odpovídajícího množství preparátu obsahujícího kolagenázu.

Podle těchto výsledků jsou vynalezené čištěné enzymy a směsi enzymů použitelné také v oblasti terapie, jako např. při léčbě poranění nebo při léčbě keloidů nebo fibróz. Mohou být aplikovány zevně nebo pomocí injekce.

• 9· ·· · ·· ·· ·· · ♦ ···· · · · · • ··· · · · · · ··· · · • · · · · · · · ··· ·· «· ··· · · ··

Literatura

1) Gerlach J.C. , Brombacher J. , Courtney J.M. a Neuhaus P. (1993) Int. J. Artif. Organs 16(9), 677-681

2) Blaauboer B.J., Boobis A.R., Castell J.V., Coecke S., Groothuis G.M.M., Guillouzo A., Halí T.J., Hawksworth G.M. , Lorenzon G., Miltenburger H.G., Rogiers V, Skett P. Villa P. a Wiebel F.J. (1994) ATLA 22, 231-241

3a) Peterkowski B. (1982) Methods Enzymol. 82, 453-471 3b) Harper E. (1980) Ann. Rev. Biochem. 1063-1078

4) Suggs W., van Wart H. a Sharefkin J.B. (1992) J. Vasc. Surg. 15, 205-213

5) Cuatrecasas P. (1971) J. Biol. Chem. 246, 6522-6531

6) Hefley T.J. (1987) J. Bone Minerál Res. 2 (6), 505-516

7) Hefley T.J., Stern P.H. a Brand J.S. (1983) Exp. Cell Research 149, 227-236

8) Wolters G.H.J, Vos-Scheperkueter G.H., van Deijnen J.H.M a van Schilfgaarde R. (1992) Diabetologia 35, 735-742

9) Berry, M.N. , Edwards, A.M. a Bar.rit, G.J. (1991) V: Isolated hepatocytes: Preparation, properties and applications (Burdon, R.H., van Knippenberg, P.H., Eds.) Elsevier, Amsterdam, 1991

10) Berry, M.N. a Friend, D.S. (1969) J. Cell. Biol. 43, 506-520

11) Grapmann W. a Nordwig A. (1960) Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 322, 267-272

12) Mandl I., MacLennan J.D., Howes E.L., DeBellis R.H. a Sohler A. (1953) J. Clin Invest. 32, 1323-29

14) Ulmann D. a Jakubke H.-D. (1994) Biol. Chem. Hoppe Seyler 375, 89-92

15) Emód I. a Keil B. (1977) FEBS Lett. 77, 51-66

16) Seglen P.O. (1976) Methods Cell. Biol. 13, 29-83

17) Jaffe E.A., Nachmann R.L., Becker C.C. a Minick. C.R. (1973) J. Clin. Invest. 52, 2745-56

18) Eisenmann-Tappe I., Wizigmann S. a Gebhardt R. (1991) Cell. Biol. Toxicol. 7 (4), 315-325 • ·· ·· · ·· ·· ·· · · · · ·· · · · · ······ ···· « ··· · · · · * ··· · · • ···· · · · ··· ·· ·· ··· ·· ··

- 25 19) Webster M.E., Altieri P.L. , Conklin D.A., Berman S., Lowenthal J.P. a Gochenour R.B. (1962) J. Bacteriol. 83, 602-608

20) Jamall I.S., Finelli V.N. a Que Hee S.S. (1981) Anal. Biochem. 112, 70-75

21) Sandker G.W., Weert N., Olinga P., Wolters H., M.J.H. Sloof, D.K.F. Meijer a G.M.M. Groothuis (1994), Biochem. Pharmacol. 47, 2193-2200

22) Olinga P., Merema M.T., Meijer D.K.F., Sloof M.J.H. a Groothuis G.M.M. (1993) ATLA 21, 466-468

23) Hoover H.C.Jr., Surdyke M., Dangel R.B., Peters L.C. a Hanna M.G.Jr. (1984) Cancer Research 44, 1671-1675

24) Schreyenmeir J., Walz S., Marx S. a Laue C., Diabetologia (1994) 37 [Suppl 1] A216

25) Ricordi C., Socci C., Davalli A.M., Staudacher C., Vertova A., Báro P., Frwschi M., Gavazzi F., Bertuzzi F., Pozza G. a Di Carlo V. (1990) Horm. Metab. Res. Suppl. 25,

Claims (9)

1. Patentové nároky

   1. Enzymy, které lze získat z Clostridium histolyticum, přičemž se jedná buďto o

   a) kolagenázu se specifickou aktivitou minimálně 20 U/mg v testu podle Nordwiga a Straucha se syntetickým hexapeptidem Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala jako substrátem, která s denaturovanými kolageny, jako je želatina a azokoll, může reagovat pouze v malé míře, avšak napadá kolagen hovězách šlach, a jejíž molekulová hmotnost, stanovená pomocí SDS-gelové elektroforézy, je 106.000 Da a která má izoelektrický bod při pH 5,8 až 6,0, nebo o

   b) kolagenázu se specifickou aktivitou minimálně 10 U/mg v testu podle Mandla a kol. při použití azokollu jako substrátu, která dobře reaguje s denaturovanými kolageny, jako je želatina nebo azokoll, ale také s kolagenem hovězích šlach, avšak není schopna napadat malé syntetické proteiny jako 2-furan-akryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala, 4-fenylazobenzoloxykarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg a Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala, a jejíž molekulová hmotnost, stanovená pomocí SDS-gelové elektroforézy, je 111.000 Da a která má izoelektrický bod při pH 5,9 až 6,1, nebo o

   c) elastázu se specifickou aktivitou minimálně 2 U/mg v testu s elastinem z hovězí šíje jako substrátem, jejíž molekulová hmotnost, stanovená pomocí SDS-elektroforézy, je 35.000 Da nebo o jejich směsi, přičemž enzym podle a) má specifickou aktivitu minimálně 20 U/mg, enzym podle b) má specifickou aktivitu minimálně 10 U/mh a enzym podle d) má specifickou aktivitu minimálně 2 U/mg.
2. 2. Směsi enzymů podle nároku 1, které se vyznačují tím, že obsahují navíc thiolproteázu clostripain.

   « ·· ♦· « ·· ♦ ··*« ♦··· ··· ·*···· ··· • ···««· · · · ··· · • · ··.»· »· ····· *· ··· ·» ·
3. 3. Použití směsi podle nároku 1, která je tvořena enzymem podle a) a enzymem podle c), k izolování buněk nebo fragmentů z lidské nebo zvířecí tkáně.
4. 4. Použití směsi podle nároku 1, tvořené enzymy podle a), b) a c), k izolování buněk nebo fragmentů z lidské nebo zví řečí tkáně
5. 5. Použití směsi podle nároku 2 k izolování buněk nebo fragmentů z lidské nebo zvířecí tkáně.
6. 6. Použití enzymů podle nároku 1 buďto samotných nebo ve směsi nebo podle nároku 2 při léčbě poranění nebo při onemocněních, k nimž dochází při změněné kolagenového metabolizmu.
7. 7. Kolagenáza HP v čisté formě.
8. 8. Kolagenáza AZ v čisté formě.
9. 9. Elastáza v čisté formě.