DE19532906A1

DE19532906A1 - Neue, definierte Enzymmischungen zur Zellgewinnung und für die Wundbehandlung

Info

Publication number: DE19532906A1
Application number: DE19532906A
Authority: DE
Inventors: Claus Otto Dr Markert; Hans Dr Thom; Juergen Dr Weymann; Wolfgang Dr Zahn
Original assignee: Knoll GmbH
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 1995-03-16
Filing date: 1995-09-07
Publication date: 1996-09-19
Also published as: ZA962104B; KR19980703053A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung definierter Mischungen von gereinigten Enzymen aus Clostridium histolyticum zur reproduzierbaren, standardisierten Gewinnung von Zellen oder Gewebefragmenten aus humanem oder tierischem Gewebe und die An wendung dieser gereinigten Enzyme zur Wundbehandlung.

Methoden zur Isolierung von Zellen aus Geweben sollten reprodu zierbar durchführbar sein und eine möglichst geringe Schädigung der gewonnenen Zellen garantieren. Hierfür werden bisher im allgemeinen undefiniert zusammengesetzte, Kollagenase enthaltende Präparate aus Clostridium histolyticum verwendet, mit denen diese Ziele nicht sicher zu erreichen sind. Der Einsatz anderer Enzym präparate, oder nicht-enzymatischer Methoden, ist nicht üblich oder liefert nur schlechte Isolierungserfolge (I) (9).

Die normalerweise benutzten und zur Benutzung empfohlenen Kollagenase enthaltenden Präparate (2) werden aus Kulturfiltraten des Bakterienstammes Clostridium histolytioum gewonnen und ent halten neben verschiedenen Kollagenasen und Proteasen (3a, b) noch durch Proteolyse gebildete Spaltprodukte dieser Enzyme sowie wei tere, zum Teil schädlich wirkende und unbekannte Bestandteile.

Mit einem einzelnen Enzym aus Clostridium histolyticum ist es nach bisherigem Kenntnisstand nicht möglich, lebensfähige Zellen in guter Ausbeute zu erhalten. Vielmehr müssen unterschiedliche Enzyme aus diesem Bakterium zusammenwirken, um einen effektiven Gewebeabbau zu erzielen. Es ist allerdings bisher nicht bekannt gewesen, welches Mengenverhältnis an Enzymen dazu erforderlich ist. Definierte Gemische von Enzymen aus Clostridium histolytioum sind bisher für den Anwender auch nicht erhältlich.

Aus der dargestellten Problematik heraus haben verschiedene Ar beitsgruppen versucht, gereinigte Enzyme für die Isolierung von Zellen aus Geweben einzusetzen. Dabei wurden jedoch nie einheit liche Enzyme und damit auch keine klar definierten Mischungen verwendet.

Von Suggs et al. (4) wurden menschliche Venen-Endothelzellen mit Hilfe einer Mischung, bestehend aus einer gereinigten Kollagenasefraktion und gereinigtem Trypsin aus Rinder-Pankreas, isoliert. Die eingesetzte angereicherte Kollagenase-Fraktion war jedoch nicht definiert in ihrem Gehalt an verschiedenen Enzymen und enthielt z. B. auch noch geringe Mengen an Clostripain. Der Isolierungserfolg war nicht signifikant verschieden von demjeni gen, der bei Verwendung von undefiniert zusammengesetzten, Kollagenase enthaltenden Präparaten erhalten worden war. Mit ein zelnen Komponenten der Mischung konnte keine befriedigende Gewebedesintegration erreicht werden. Der Einsatz von Trypsin zur Zellisolierung ist jedoch nicht unproblematisch, da dieses proteolytische Enzym Membranproteine angreift. So wird z. B. die Insulin-Bindung an Lebermembranen und an Adipozyten negativ be einflußt (5).

Von Hefley (6), (7) wurden zur Isolierung von Knochenzellen aus der Schädeldecke von Mäusen Mischungen gereinigter Kollagenasef raktionen eingesetzt (6). Früher (7) beschrieb der Autor, daß zur erfolgreichen Isolierung dieser Zellen ein Gemisch aus einer ge reinigten Kollagenasefraktion zusammen mit einer neutralen Protease eingesetzt werden kann. In beiden Arbeiten wurden jedoch Eluate aus Säulenfraktionierungen eingesetzt, deren Gehalt an verschiedenen, in ihrer Substratspezifität sich unterscheidende Kollagenasen und an sonstigen Komponenten nicht bekannt war.

Von Wolters et al. (8) wurden zur Isolierung von Inselzellen aus Ratten-Pankreas Mischungen aus neutraler Protease und "Kollagenase Typ VII" der Firma Sigma verwendet, von der jedoch nicht bekannt ist, welche Arten und Mengen an verschiedenen Kollagenasen sie enthielt. Außerdem wies sie einen geringen Gehalt an Clostripain und "unspezifischer Protease" auf. Die neu trale Protease wurde in einer hochgereinigten Form eingesetzt. Mischungen der beiden genannten Komponenten ergaben gute Ausbeu ten an lebensfähigen Inselzellen.

Gegenstand der Erfindung sind die einzelnen reinen Enzyme Kollagenase HP, Kollagenase AZ und Elastase, und deren Mischungen.

Reine Kollagenase HP besitzt eine spezifische Aktivität von min destens 20 U/mg, vorzugsweise mindestens 50 U/mg im Test nach Graßmann und Nordwig (11) mit dem synthetischen Hexapeptid Z-Gly- Pro-Gly-Gly-Pro-Ala als Substrat.

Reine Kollagenase AZ besitzt eine spezifische Aktivität von min destens 10 U/mg, vorzugsweise mindestens 30 U/mg im Test nach Mandl et al. (12) unter Verwendung von Azokoll als Substrat.

Reine Elastase besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 2 U/mg, vorzugsweise mindestens 5 U/mg im Test mit Elastin aus dem Nackenband des Rindes als Substrat.

Gegenstand der Erfindung ist weiter die Verwendung einer Mischung aus Kollagenase HP und Elastase, ggf. unter Zusatz von Kollagenase AZ oder/und Clostripain zur Isolierung von Zellen oder Gewebefragmenten aus humanem oder tierischem Gewebe.

Weiter betrifft die Erfindung die direkte oder indirekte Verwendung dieser Enzyme, allein oder als Bestandteil von Mischungen, für medizinische Anwendungen, z. B. in der Wundbehand lung.

Für die Anwendung zur Gewebedesintegration können die Mischungen beispielsweise in solchen Mengen in Vials in lyophilisierter Form konfektioniert werden, daß sie zur Desintegration von einer ein zelnen Ratten-Leber (ca. 9-11 g Feuchtgewicht des Organs) ausrei chen.

Als Mischungen kommen solche in Betracht, welche aus mindestens 2 der gereinigten Enzyme Kollagenase HP (50-300 U; bevorzugt 70-170 U) und Elastase (5-70 U, bevorzugt 10-25 U) bestehen und ggf. einen Zusatz von Kollagenase AZ (1-20, bevorzugt 2-8 U) und/oder Clostripain (10-280 U, bevorzugt 20-50 U) enthalten. Die angege benen Zahlen geben die Mengen an, die in einer Einheit der Mischung - beispielsweise in einem Vial - vorliegen.

Reinheitskriterium für die verwendeten Enzyme ist ihre jeweilige spezifische Aktivität und ihr Einheitlichkeitsnachweis in den für diesen Zweck üblicherweise verwendeten elektrophoretischen Metho den (SDS-Gel-Elektrophorese, isoelektrische Fokussierung und Elektrophorese auf Agarosegel). Die spezifische Aktivität der ge reinigten Enzyme erreicht bis zu 100fach höhere Werte im Ver gleich zum Ausgangsmaterial.

Für die Herstellung der Mischungen werden gereinigte Enzyme mit den folgenden spezifischen Aktivitäten eingesetzt: Kollagenase HP mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 20 U/mg, Elastase mit mindestens 2 U/mg, Kollagenase AZ mit mindestens 10 U/mg und Clostripain mit mindestens 10 U/mg.

Die Mischungen zeichnen sich dadurch aus, daß sie, aufgrund ihrer definierten Zusammensetzung aus synergistisch wirkenden kollage nolytischen, sowie elastinoloytischen und proteolytischen Enzy men, besonders geeignet sind für eine schonende und effektive Isolierung von Zellen oder von Gewebefragmenten aus tierischen und humanen Geweben.

Ein wesentlicher Vorteil ist, daß eine Zeit- und kostenaufwendige Prüfung von Chargen nicht mehr erforderlich ist, da für die Her stellung von gereinigten Enzymen mit jeweils bekannten Eigen schaften ausgegangen wird. Dadurch entfällt der Arbeitsaufwand, welcher zur funktionellen Charakterisierung der Zellen notwendig ist, oder er wird zumindest geringer. Aus diesen Gründen kann die Anzahl von Tierversuchen in vielen Bereichen vermindert werden.

Die Verwendung von weniger gut gereinigten Enzymen, oder eine Verwendung von Enzymen mit geringerer spezifischer Aktivität, führt in der Regel zu schlechteren Zellausbeuten bei den genann ten Anwendungen, und ist darüberhinaus von den üblichen Problemen der mangelnden Reproduzierbarkeit des Isolierungserfolges, einer mangelnden Chargen-Konstanz und dem Vorhandensein unbekannter, möglicherweise negativ wirkender Bestandteile behaftet.

Viele in der Literatur beschriebene Versuchsergebnisse sind wegen des bei der Herstellung, Reinigung oder der Charakterisierung auftretenden Abbaus der Enzyme durch Begleitproteasen schwierig zu interpretieren. Die Aufklärung des Beitrages der einzelnen En zyme zum Versuchserfolg bei der Zellisolierung wurde auch dadurch erschwert, daß die aus den Kollagenasen, der Elastase und den Proteasen entstehenden Bruchstücke teilweise ihre enzymatische Aktivität behalten. Inwieweit sich die Substratspezifitäten dabei ändern, ist jedoch noch nicht geklärt. Auch in vielen kommerzi ellen Kollagenase-haltigen Präparaten sind manchmal nur Abbaupro dukte der ursprünglichen Kollagenasen enthalten. Nach dem bishe rigen Stand der Technik war also eine eindeutige Standardisierung von Kollagenase-haltigen Präparaten sowohl für die Präparate-Her steller als auch für die Anwender von Zellisolierungsmethoden nicht möglich.

Für die Anwendung der erfindungsgemäßen Mischungen aus gereinig ten Enzymen kommen wegen ihrer breiten gewebeabbauenden Aktivität alle menschlichen und tierischen Gewebe und Zellen in Frage, vor zugsweise Gewebefragmente und/oder Zellen aus:
dem biliären Trakt, dem Blutsystem, Drüsen, dem Gefäßsystem, dem Gehirn, der Haut, dem Herzen, dem Intestinum, Langerhans′schen Inseln, der Leber, der Lunge, dem Magen, der Milz, Muskeln, der Nabelschnur, Nerven, der Niere, dem Pankreas, dem Rückenmark, der Schilddrüse, dem terminalen Ileum, Tumorgewebe, dem Uterus, dem Verdauungstrakt und der Zunge.

Die mit Hilfe der beschriebenen Mischungen isolierten Zellen oder Gewebefragmente eignen sich ganz besonders für den Einsatz in der Zell- und Gewebetransplantation, sowie in der Gentherapie (z. B. Langerhans′sche Inseln, Inselzellen, Hepatozyten, Tumorzellen, Adipozyten), in der Immuntherapie oder in der Wundbehandlung.

Von besonderer Bedeutung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Mischungen bei der Isolierung von Hepatozyten, Langerhans′schen Inselzellen, Endothelzellen, Epithelzellen, Adipozyten, Oozyten und Tumorzellen. In diesen Anwendungsbereichen ist eine Standar disierung und Verbesserung der Methodik in besonderem Maß vor teilhaft.

Zum Beispiel hat sich eine definiert zusammengesetzte Mischung aus 2 Kollagenasen mit unterschiedlicher Substratspezifität und einer Elastase als hervorragend geeignet für die Isolierung von Hepatozyten aus Ratten-Leber (Anwendungsbeispiele A, D, E) und Human-Leber (Anwendungsbeispiel F), von Gallengangsepithelzellen aus Ratten-Lebern (Anwendungsbeispiel G), von Endothelzellen aus menschlichen Nabelschnüren (Anwendungsbeispiele H), sowie zur Isolierung von Tumorzellen aus Human-Tumoren (Anwendungsbeispiel I) und Inselzellen aus Schweine-Pankreas (Anwendungsbeispiel J) erwiesen.

Im Vergleich zu den besten undefiniert zusammengesetzten, Kolla genase-haltigen Enzympräparaten wird ein besserer oder zumindest gleich guter Isolierungserfolg erzielt.

Die erfindungsgemäßen Mischungen können als Ersatz für alle üblicherweise benutzten Kollagenase-haltigen Präparate verwendet werden, da sie die für eine Gewebedesintegration notwendigen Kom ponenten aufweisen. Die Nachteile der bisher verwendeten Kollage nase-haltigen Präparate werden u. a. aufgrund der konstanten Zusammensetzung der Mischungen vermieden.

Ein wichtiges Einsatzgebiet für die genannten Mischungen ist die reproduzierbare, standardisierte Gewinnung von Hepatozyten aus der Leber nach der anerkannten Methode von Berry und Friend (9), (10), bei der bislang mit undefiniert zusammengesetzten, Kollage nase-haltigen Enzympräparaten gearbeitet wurde, sowie die durch Einsatz der genannten Mischungen nach dem Stand der Technik ver besserte Gewinnung von Inselzellen in intakter Form aus Pankreas- Gewebe.

Ein weiteres Hauptanwendungsgebiet ist die Wundbehandlung.

I. Präparation und Charakterisierung der Enzyme aus Clostridium histolytioum 1. Kollagenase HP a. Herstellung Fraktionierte Proteinfällung mit Ammoniumsulfat

Alle Operationen bei der Enzymreinigung wurden bei 4-8°C durchge führt.

200 g Rohkollagenase wurden in 3 l Wasser gelöst und in die erhaltene Lösung zunächst 680 g pulverisiertes Ammoniumsulfat eingetragen. Der ausgefallene Proteinniederschlag A1 wurde durch Zentrifugation abgetrennt; zum Überstand wurden weitere 420 g Ammoniumsulfat gegeben. Die hierbei ausgefällte Proteinfraktion A2 wurde abgeschleudert, der Niederschlag in 1 l Wasser gelöst und gegen Wasser dialysiert. Danach wurde über eine Ultrafiltra tionsmembran (Ausschlußgrenze 10 000 Da) auf etwa 100 ml konzen triert. Das Konzentrat wurde dann lyophilisiert. Diese pulver förmige Proteinfraktion A2 enthielt Kollagenase HP und Kollagenase AZ als Hauptkomponenten.

Chromatographische Trennung von HP und Kollagenase AZ mittels Me tallchelat-Affinitätschromatographie

Die chromatographische Trennung von Kollagenase HP und Kollage nase AZ erfolgte an Zn²⁺-beladener Chelating Sepharose 6B. Dazu wurde dieses Material in einer Schichthöhe von 70 cm in eine Säule (5 × 100 cm) gepackt und mit Startpuffer (500 mM Natrium acetat + 20 mM Calciumacetat, pH 8,0) äquilibriert. Dann wurden ca. 1,2 g der Proteinfraktion A2, gelöst in 15 ml Startpuffer, dessen pH-Wert mit TRIS [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan] auf 35 8,4 korrigiert worden war, auf die Säule aufgetragen und mit Startpuffer verschiedene Bestandteile der Proteinfraktion A2 aus der Säule gewaschen. Bei der nachfolgenden Elution mit dem Puffer A (500 mM Natriumacetat + 20 mM Calciumacetat, mit Essigsäure auf pH 6,3 korrigiert) wurde zunächst Kollagenase AZ und dann Kollagenase HP in getrennten Fraktionen aufgefangen.

Die beiden getrennten Enzymfraktionen von Kollagenase HP und Kollagenase AZ wurden mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze 10 000 Da) auf 50-100 ml konzentriert, anschlie ßend gegen Wasser dialysiert und wieder über eine Ultrafiltrati onsmembran (Ausschlußgrenze 10 000 Da) auf ca. 10 ml konzen triert.

Feinreinigung von Kollagenase HP

Die Feinreinigung von Kollagenase HP erfolgte an dem Anionenaus tauscher Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) mittels des FPLC-Gerätes der Fa. Pharmacia. Dazu wurde auf die Säule, die mit Puffer B (20 mM TRIS/HCl pH 7,5) äquilibriert worden war, ein Gemisch aus 1 ml Puffer B und 2 ml der Kollagenase HP enthaltenden Fraktion aus dem vorhergehenden Chromatographieschritt aufgetragen.

Nach Waschen mit Puffer B wurde die Kollagenase HP mit dem Puffer C (20 mM TRIS/HCl + 200 mM NaCl, pH 7,5) in gereinigter Form von der Säule eluiert.

b. Eigenschaften

Die Kollagenase HP erhielt ihre Bezeichnung "HP" aufgrund ihrer 20 Eigenschaft, das Hexapeptid Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala besonders gut abzubauen. Es ist daher für einen spezifischen Nachweis der Aktivität besonders gut geeignet. Kollagenase HP ist dadurch cha rakterisiert, daß sie denaturierte Kollagene wie Gelatine oder Azokoll nur in geringem Maße umsetzen kann. Sie greift jedoch Rindersehnenkollagen an und spaltet mit hohem Umsatz die im Bei spiel 2b genannten synthetischen Peptide zwischen Glycin und Glycin bzw. zwischen einer beliebigen Aminosäure und Glycin.

Besonders hervorzuheben ist, daß Kollagenase HP zusammen mit Kollagenase AZ (vice-versa, d. h. damit auch jegliche Mischun-gen aus mindestens Kollagenase HP und AZ) einen über-additiven Effekt auf den Abbau von nativem Kollagen besitzt. Diesem synergisti schen Effekt in-vitro kommt auch beim Einsatz zur Gewebedes integration Bedeutung zu (z. B. Anwendungsbeispiel G).

Die spezifische Aktivität der Kollagenase HP liegt bei maximal 146 u/mg im Test mit dem synthetischen Substrat Z-Gly-Pro-Gly- Gly-Pro-Ala (11). Dies entspricht einer etwa 100fachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial.

Die so gereinigte Kollagenase HP bildet sowohl bei der SDS-Gel elektrophorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande.

Ihr mittels SDS-Elektrophorese ermittelte Molekulargewicht liegt bei 106 000 Da. Ihr isoelektrischer Punkt liegt bei pH 5,8-6,0.

2. Kollagenase AZ a. Herstellung

Alle Operationen bei der Enzymreinigung wurden bei 4-8°C durchge führt. Die beiden ersten Reinigungsschritte von Kollagenase AZ (fraktionierte Proteinfällung und Metallchelat-Affinitätschroma tographie) sind unter 1. beschrieben.

Feinreinigung von Kollagenase AZ

Die Feinreinigung von Kollagenase AZ wurde an dem Anionenaustau scher Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) und unter Zuhilfenahme des FPLC-Gerätes der Fa. Pharmacia durchgeführt. Dazu wurde auf die Säule, die mit Puffer D (20 mM Calcium-acetat, pH 7,2) äquili briert worden war, ein Gemisch aus 1 ml Puffer D und 1 ml der Kollagenase AZ enthaltenden Fraktion (aus der oben beschriebenen Metallchelat-Affinitätschromatographie) aufgetragen.

Nach Waschen mit Puffer D wurde die Kollagenase AZ mit dem Puffer E (20 mM Calciumacetat, pH 5,0) von der Säule eluiert.

b. Eigenschaften

Die Kollagenase AZ erhielt ihre Bezeichnung "AZ" aufgrund ihrer Eigenschaft, das Substrat Azokoll besonders gut abzubauen. Sie ist dadurch charakterisiert, daß sie denaturierte Kollagene wie Gelatine oder Azokoll, aber auch Rindersehnenkollagen gut um setzt. Sie vermag jedoch kleine synthetische Peptide wie 2-Fura nacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala, 4-Phenyl-azobenzyloxy-carbonyl-Pro- Leu-Gly-Pro-Arg und Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala nicht anzugreifen.

Die spezifische Aktivität der Kollagenase AZ liegt bei maximal 82 U/mg in dem von Mandl et al. (12) entwickelten Test unter Verwendung von Azokoll als Substrat. Dies entspricht einer ca. 80fachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial.

Die so gereinigte Kollagenase AZ bildet sowohl bei der SDS-Gel elektrophorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande. Ihr mittels SDS-Gelelektrophorese ermitteltes Molekulargewicht liegt bei 111 000 Da. Ihr isoelektrischer Punkt liegt bei pH 5,9-6,1.

3. Elastase a. Herstellung

Alle Operationen bei der Enzymreinigung wurden bei 4-8°C durchge führt.

Der erste Reinigungsschritt von Elastase erfolgt durch Protein fällung mit Ammoniumsulfat, wie unter 1.a. beschrieben.

Der Proteinniederschlag A1 wird in 1 l Wasser gelöst, über eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze 10 000 Da) auf etwa 170 ml eingeengt und gegen eine 0,1 mM Calciumacetat-Lösung dialy siert. Anschließend wurde die Enzymlösung erneut über eine Ultra filtrationsmembran (Ausschlußgrenze 10 000 Da) auf ca. 50 ml kon zentriert und dann lyophilisiert.

Die Feinreinigung erfolgt durch Gelchromatographie an SEPHADEX G100 oder G200 (Pharmacia).

b. Eigenschaften

Die Elastase ist dadurch charakterisiert, daß sie Elastin mit ho hem Umsatz abbauen kann. Ihre spezifische Aktivität (s. 3.c.) lag bei 18 U/mg. Dies entspricht einer ca. 80fachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial.

Die so gereinigte Elastase bildet sowohl bei der SDS-Gelelektro phorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande.

Das mittels SDS-Elektrophorese ermittelte Molekulargewicht der Elastase liegt bei 35 000 Da.

c. Aktivitätsbestimmung

Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte mit Hilfe des Substra tes Elastin.

20 mg fein pulverisiertes Elastin aus dem Nackenband des Rindes (Sigma) wurden in 0,4 ml Puffer (50 mM TRIS/HCl + 10 mM Calcium acetat, pH 7,2) 5 min im Wasserbad bei 37°C unter Schütteln vor inkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von Elastase, ge löst in 0,1 ml Puffer, gestartet und 10 min bei 37°C weiter ge schüttelt (Hubhöhe 25 mm, Frequenz 150 min^-1). Anschließend wurden 3,5 ml eiskaltes Wasser zugesetzt und das nicht umgesetzte Ela stin sofort über einen Filter entfernt. Die Extinktion E des Fil trates wurde spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. Als Blindwert diente der in einem gleichartig durchgeführten Versuch erhaltene Extinktionswert E_B, bei dem die Elastaselösung dem Ansatz jedoch erst nach Entfernung des Ela stins zugesetzt worden war. Die Extinktion E_B dieses Filtrates wurde dann ebenfalls bei 280 nm bestimmt.

Die Elastaseaktivität wird in Units [U] ausgedrückt. Als 1 U wird diejenige Enzymaktivität definiert, die unter den gegebenen Versuchsbedingungen 1 mg Elastin pro Minute auflöst. Die aufgelö ste Menge an Elastin wird im Filtrat des Testansatzes durch Mes sen der Extinktion bei 280 nm bestimmt.

Die Berechnung der spezifischen Aktivität erfolgte nach folgender Formel:

ΔE = E - EB
F = 1,376

Der Faktor F wird ermittelt, indem 10 mg Elastin einer bestimmten Charge mit Hilfe von Elastase vollständig aufgelöst und die ent sprechende Extinktionsdifferenz AE gemessen wird. Die Multiplika tion dieses Faktors F mit der Extinktionsdifferenz ΔE ergibt die aufgelöste Milligramm-Menge an Elastin pro ml Testansatz.

4. Clostripain a. Herstellung

Die Isolierung von Clostripain erfolgte nach der von Ullmann und Jakubke beschriebenen Methode (14).

Die Bestimmung ihrer spezifischen Enzymaktivität erfolgte mit Hilfe des synthetischen Substrates α-N-Benzoyl-L-arginin-ethyl ester (= BAEE) nach vorheriger 3stündiger Aktivierung der Clostripainlösung mit 2 mM 1,4-Dithioerythrit-Lösung (15). Sie lag bei ca. 83 U/mg.

b. Eigenschaften

Die Thiolprotease Clostripain ist dadurch charakterisiert, daß sie in Polypeptidketten und in synthetisch hergestellten Substra ten spezifisch hinter der Aminosäure L-Arginin spaltet.

Ihr mittels SDS-Elektrophorese ermitteltes Molekulargewicht liegt bei 55 000 Da.

II. Anwendungsbeispiele

Die folgenden Beispiele A-J zeigen exemplarisch die besondere Eignung einiger Mischungen der gereinigten Enzyme für die Isolie rung von Zellen und Gewebefragmenten aus tierischem und humanem Gewebe. Die Beispiele K und L zeigen exemplarisch die Eignung der gereinigten Enzyme für eine Anwendung in der Wundbehandlung.

Die Erfindung ist nicht auf diese Anwendungsbeispiele be schränkt.

Beispiel A Isolierung von Hepatozyten der Leber mit Mischungen aus drei En zymen

Hepatozyten wurden nach der Standardmethode von Berry und Friend (9) und den Modifikationen nach Seglen (16) isoliert. Wistar-Rat ten (200-280 g) wurden durch i.p. Injektion von Nembutal (35 mg Pentobarbital/kg Körpergewicht) betäubt. Nach der Eröffnung der Bauchraumes wurde die Vena portae kanüliert, und unter konstantem hydrostatischem Druck (12 cm Wassersäule, variable Flußrate) die folgenden, Carbogen-begasten Lösungen mit einem pH-Wert von 7.4 ± 0.05 bei einer Temperatur von 36-36.8°C nach Eröffnung der Vena oava inferior infundiert:

Perfusion:
1. 5 min ca. 100 ml Zellpuffer ohne Ca²⁺
2. 5 min ca. 100 ml Zellpuffer ohne Ca²⁺ mit EGTA (0,42 mM)
3. 8 min ca. 200 ml Zellpuffer ohne Ca²⁺
4. 5-30 min ca. 100-600 ml Zellpuffer, in dem die lyophilisierten Mischungen der gereinigten Enzyme gelöst worden waren.

Zellpuffer:
120,0 mM NaCl
  5,50 mM D(+)-Glucose
  4,81 mM KCl
15,0 mM NaHCO₃
  1,29 mM CaCl₂
  1,19 mM KH₂PO₄
  1,20 mM MgSO₄
10,0 mM HEPES

Carbogen:
Gasgemisch aus 95% O₂ und 5% CO₂ (v/v).

Die Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 87,5 ml Zellpuffer gelöst wurde.

Die Perfusion wurde beim Weichwerden des Lebergewebes beendet. Nach Ablösung der Glisson′schen Kapsel wurden die Hepatozyten aus dem Lebergewebe ausgeschüttelt und durch ein Siebgewebe (100 µm Maschenweite) filtriert. Nach der Filtration wurden die Zellen unter Carbogen-Atmosphäre in einem Wasserbad 20 min lang bei 37°C geschüttelt. Intakte Hepatozyten wurden durch drei 2minütige Zen trifugationsvorgänge in Zellpuffer bei 50facher Erdbeschleunigung angereichert. Der Überstand, in dem sich vorwiegend tote Zellen befinden, wurde nach jeder Zentrifugation verworfen. Der Anteil an vitalen Hepatozyten, Hepatozyten-Zellpaaren oder vielzelligen Aggregaten aus Hepatozyten wurden nach Resuspension des erhaltenen Zellniederschlages in einer Burker-Zählkammer mikro skopisch bestimmt (Färbung mit 0,08%igem Trypanblau, 2 min lang).

Ergebnis

In einer Versuchsserie (n=4) wurden unter Verwendung der be schriebenen Enzymmischung Zellsuspensionen erhalten, welche durchschnittlich 88,7% vitale Zellen bei einer Ausbeute von 360 × 10⁶ Zellen pro Leber enthielten.

Vergleichsversuche mit einem Kollagenase-haltigen Präparat unde finierter Zusammensetzung mit besonders hoher spezifischer kollagenolytischer Aktivität führte zu starken Zellschädigungen und nur zu 72,5% vitalen Zellen (n=4).

Beispiel B Isolierung von Hepatozyten der Leber mit einer Mischung aus zwei Enzymen

Es wurde analog Beispiel A gearbeitet, aber unter Einsatz der folgenden Enzymmischung: 60 U Kollagenase HP und 3 U Elastase. Es wurden Zellsuspensionen erhalten, welche durchschnittlich 90,5% vitale Zellen bei einer Ausbeute von 263 × 10⁶ Zellen ent hielten (n=2).

Beispiel C Isolierung von Hepatozyten der Leber mit einer Mischung aus vier Enzymen

Es wurde analog Beispiel A gearbeitet, aber unter Einsatz der folgenden Enzymmischung: 30 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ, 3 U Elastase und 16 U Clostripain.

Es wurden Zellsuspensionen erhalten, welche durchschnittlich 83% vitale Zellen bei einer Ausbeute von 232 x 10⁶ Zellen enthielten (n=2).

Beispiel D

Umfangreiche Validierung des Isolierungserfolges von Hepatozyten der Ratten-Leber mit einer Mischung aus drei Enzymen in 4 ver schiedenen Labors im Vergleich zu Kollagenase-haltigen Präparaten undefinierter Zusammensetzung.

Geringe, aber für den Isolierungserfolg von Hepatozyten eventuell bedeutsame, Unterschiede sind bei der Methode der Zellisolierung von Labor zu Labor bekannt. Um unabhängig von der benutzten Me thodik die Wirksamkeit der in Beispiel A genannten Mischung für die Zellisolierung zu überprüfen, wurden Hepatozyten-Isolierungen in 4 verschiedenen Labors in einer größeren Anzahl durchgeführt.

Die verwendete Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 87,5 ml Zellpuffer wurde (analog Beispiel A).

Der Isolierungserfolg von Hepatozyten wurde anhand der folgenden fünf Parameter gemessen: 1. mikroskopische Bestimmung des Anteils vitaler Hepatozyten (in % von der Gesamtzahl Hepatozyten in der erhaltenen Zellsuspension mittels Trypanblau-Exclusionstest), 2. Bestimmung der Gesamtzahl der isolierten Hepatozyten, 3. Bestim mung der Gesamtzahl der isolierten Hepatozyten pro Gramm Tierge wicht, 4. Bestimmung des Anteils an Einzelzellen (in % bezogen auf alle Aggragationsformen in der erhaltenen Zellsuspension, d. h. gegenüber Zweier- und Mehrfach-Aggregaten von Hepatozyten), und 5. Festhalten der zur erfolgreichen Gewebedesintegration not wendigen Perfusionszeit mit der Kollagenase-Lösung.

Für die Beurteilung einer Kollagenase-Qualität ist der Anteil vi taler Hepatozyten in der erhaltenen Zellsuspension der entschei dende Parameter. Darüberhinaus sollte die Ausbeute an Zellen auch vergleichbar gut sein, wie mit den besten, üblicherweise verwen deten Kollagenase-haltigen Präparaten undefinierter Zusammen setzung. Nur für bestimmte Anwender ist es wichtig, eine kurze Dauer der Kollagenase-Perfusion zu erreichen, andere Anwender ziehen eine längere Perfusionsdauer vor. Nur für manche Anwender mag eine hohe Zellausbeute wichtig sein, z. B. um viele Kultur schalen zu Vergleichszwecken anlegen zu können, oder um z. B. Hepatozyten als Organ-Ersatz einzusetzen. Andere Anwender legen hingegen Wert auf einen hohen Anteil an Einzelzellen in der Zell suspension, weniger auf eine hohe Gesamtausbeute an Zellen. Dies kann bei solchen Experimenten von Vorteil sein, bei denen die zu untersuchenden Zellfunktionen von der Aggregationsform (Einzel zelle versus Zellpaar oder Mehrfach-Aggregate) abhängig sind.

In allen 4 Labors wurden die Hepatozyten nach der Standard-me thode von Berry und Friend (9) und den Modifikationen nach Seglen (16) isoliert, gewisse Unterschiede im methodischen Verfahren von Labor zu Labor waren jedoch bekannt. Diese Unterschiede können mit den unterschiedlichen Ergebnissen beim Isolierungserfolg in Zusammenhang gebracht werden, welche von der Kollagenase-Qualität unabhängig sind.

Die erhaltenen Werte wurden statistisch ausgewertet. Normalver teilungen nach Shapiro-Wilk-Test liegen für die Datensätze mit ausreichenden Stichprobenzahlen vor.

Signifikante Unterschiede zwischen Ergebnissen unter Verwendung der definierten Mischung und den Ergebnissen unter Verwendung von Kollagenase-haltigen Präparaten undefinierter Zusammensetzung wurden in den Tabellen 1-5 (Anhang) jeweils vermerkt: nach Stu dent-t-Test erhaltene Werte für p kleiner 0.05 sind mit "*" mar kiert, Werte für p kleiner 0,01 sind mit "**" markiert; "ns" steht für nicht signifikant.

Ergebnis

Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymmischung war der ent scheidende Parameter bei jeder Hepatozyten-Isolierung, der Anteil vitaler Hepatozyten, in allen vier Labors gleich gut oder besser, als mit den zu Vergleichszwecken aufgeführten Kollagenase-halti gen Präparaten undefinierter Zusammensetzung (Tabelle 1; Labor 1: mit Präparat 5 und 7 wurden schlechtere Ergebnisse erhalten als mit der erfindungsgemäßen Enzymmischung, bezeichnet mit Präparat 0).

Methodische Unterschiede führten zu Unterschieden einzelner Para meter von Labor zu Labor. So war z. B. die Gesamtzahl der mit der erfindungsgemäßen Mischung isolierten Hepatozyten (Tabelle 2) in Labor 2 und Labor 4 deutlich höher, als die Gesamtzahl, welche mit Kollagenase enthaltenden Präparaten undefinierter Zusammen setzung erhalten wurde.

Nur in Labor 1 und Labor 3 wurden mit Präparaten undefinierter Zusammensetzung geringfügig höherer Ausbeuten als mit der erfindungsgemäßen Mischung erhalten. Da diese geringfügig höheren Ausbeuten jedoch mit solchen Präparaten erhalten wurden, welche zu stark vermindertem Anteil vitaler Zellen in der Zellsuspension führten, kann daraus kein Anwendungsvorteil solcher Präparate abgeleitet werden.

Auch bei dem dritten festgehaltenen Parameter, dem Anteil an Ein zelzellen in der Zellsuspension, waren Unterschiede von Labor zu Labor festzustellen. So ist z. B. in Labor 2 der Prozentsatz an Einzelzellen wesentlich höher als in Labor 1, oder auch in Labor 3 (Tabelle 3).

Großen Einfluß auf die sichtbaren Unterschiede von Labor zu Labor hat allem Anschein nach z. B. die Verwendung mehrerer, sequentiel ler Filtrationsvorgänge nach dem Ausschütteln der Zellen aus dem Lebergewebe nach dem Ende der Kollagenase-Perfusion in Labor 2 (260 µm - 100 µm - 75 µm Maschenweite) gegenüber nur einem Filtra tionsvorgang in Labor 1 (100 µm Maschenweite).

Vermutlich wurde in Labor 2 durch diese mehrfache Filtration, evtl. auch durch eine Zentrifugation der Zellen bei niedrigerer g-Zahl, stets eine niedrigere Zellzahl als in den anderen Labors erhalten (Tabelle 2, Tabelle 3). Möglicherweise wirken sich auch Unterschiede in den Perfusionszeiten (Tabelle 5) und die indivi duelle Gestaltung der "Erholungsphase" der Zellen nach Isolie rung, z. B. durch ein 20 min langes Schütteln der Zellen bei 37°C in Labor 2 und in Labor 1, auf die Ausbeute an Zellen und den Prozentsatz Einzelzellen aus.

Aufgrund der deutlichen Unterschiede in der Methodik wurden die erhaltenen Daten nur jeweils innerhalb eines Labors in Hinsicht auf die Eignung der Kollagenase-Präparates verglichen.

Anhand der erhaltenen Daten läßt sich die außerordentlich gute Eignung der definierten Enzymmischung zur Hepatozyten-Gewinnung mit einem reproduzierbaren Isolierungserfolg in allen 4 Labors klar belegen (Tabellen 1-5).

Der Isolierungserfolg, welcher mit Kollagenase-haltigen Präpara ten undefinierter Zusammensetzung erhalten wird, kann also in al len Labors, unabhängig von der Modifikation der anerkannten Stan dard-Methode, gleichermaßen erreicht, und teilweise übertroffen werden.

Beispiel E Isolierung von Hepatozyten aus Ratten-Leber mit einer Mischung aus 3 Enzymen: Erhaltung der Zellfunktion

Um nicht nur die Eignung der erfindungsgemäßen Mischungen hin sichtlich des einfachen Isolierungserfolges von Hepatozyten, sondern auch unter besonderer Betrachtung der Zellfunktion zu be legen, wurden vergleichende Zellisolierungen unter Verwendung eines für diesen Zweck besonders gut geeigneten, Kollagenase-hal tigen Präparates undefinierter Zusammensetzung an Ratten-Lebern durchgeführt.

Hepatozyten wurden nach der Standardmethode von Berry und Friend (9) und den Modifikationen nach Seglen (16) isoliert.

Die verwendete Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches zur Isolierung von Hepatozyten aus Ratten-Lebern in 87,5 ml Zell puffer gelöst wurde (analog Beispiel A).

Der einfache Isolierungserfolg von Ratten-Hepatozyten wurde be stimmt nach folgenden Parametern: Anteil vitaler Zellen nach dem Trypanblau-Exklusionstest, Zellausbeute pro g Leber, Anteil an Einzelzellen (in %).

Die Qualität der erhaltenen Zellsuspension wurde in Hinsicht auf die Funktion der Hepatozyten weiter charakterisiert (21, 22) durch die folgenden Parameter: ATP-Gehalt, Energy Charge (EC), Lidocain-Metabolismus zu Monoethylglycinxylidid (MEGX), und Auf nahme von Cholyltaurin ((3α,7α,12α-Trihydroxy-5β-cho lan-24-oyl)-2-aminoethansulfonsäure).

Ergebnis

Bei Isolierung von Hepatozyten aus Ratten-Lebern wurden die in Tabelle 6 (Anhang) aufgeführten Ergebnisse mit einer erfindungs gemäßen Enzymmischung (n=4) im Vergleich zur Verwendung eines für diesen Zweck besonders gut geeigneten, Kollagenase-haltigen Prä parates undefinierter Zusammensetzung (n=3-7) erhalten.

Bei allen untersuchten Parametern ergaben sich keine signifikan ten Unterschiede zwischen beiden Kollagenase-haltigen Präparaten.

Damit konnte gezeigt werden, daß die mit einer erfindungsgemäßen Enzym-Mischung isolierten Hepatozyten nicht nur nach Beurteilung durch den einfachen Isolierungserfolg, sondern auch nach Bewer tung verschiedener Zellfunktionen, z. B. bestimmte Funktionen des differenzierten Stofftransportes, oder bestimmte metabolische Leistungen von Cytochrom-P450-abhängigen Enzymen der Hepatozyten, völlig intakt sind.

Beispiel F Isolierung von Hepatozyten aus Human-Leber mit einer Mischung aus 3 Enzymen

Hepatozyten wurden nach der Methode von Berry und Friend (9) und den Modifikationen nach Seglen (16) unter Anwendung einer Biop sie-Perfusionstechnik (21) isoliert.

Die verwendete Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 50 ml Zellpuffer gelöst wurde.

Der Isolierungserfolg von Human-Hepatozyten wurde bestimmt nach folgenden Parametern: Anteil vitaler Zellen nach dem Trypanblau- Exklusionstest und Zellausbeute pro g Leber.

Ergebnis

Es wurden die folgenden Ergebnisse mit der definierten Enzym mischung (bezeichnet mit 1) im Vergleich zur Verwendung eines zur Human-Hepatozyten-Isolierung sehr gut geeigneten, Kollagenase haltigen Präparates undefinierter Zusammensetzung (bezeichnet mit 2) erhalten:

Damit konnte gezeigt werden, daß mit einer erfindungsgemäßen Mischung auch Hepatozyten von Human-Lebern erfolgreich isoliert werden können.

Beispiel G Isolierung von biliären Epithelzellen aus der Ratten-Leber

In einer Versuchsreihe (n=4) wurden biliäre Epithelzellen aus der Ratten-Leber nach der in Referenz (18) beschriebenen Methode iso liert. Dabei wurden in einem ersten Schritt der Gewebedes integration zunächst Hepatozyten enzymatisch aus dem Gewebe verband entfernt, und in einem zweiten Schritt biliäre Epithel zellen aus den verbleibenden Geweberesten mit Trypsin isoliert.

Die Enzymmischung zur Entfernung der Hepatozyten war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 87,5 ml Zellpuffer gelöst war.

Der Anteil vitaler Epithelzellen lag in allen Präparationen über 95%, die Zellausbeute bei 4-6 × 10⁶ Zellen pro Leber (n=4). Die Verwendung der beschriebenen Enzymmischung erleichterte außeror dentlich die Isolierung von biliären Epithelzellen aus dem ver bleibenden Gefäßsystem mittels Trypsin, denn das nach dem ersten Schritt erhaltene Restgewebe war praktisch frei von Hepatozyten.

Problematisch war bei den bisher verwendeten Methoden zur Gewin nung von biliären Epithelzellen, daß die in der Zellsuspension verbleibenden Hepatozyten, sowie von-Kupffer-Zellen und andere Zellsorten in der Regel schwer von den zu isolierenden Epithel zellen abzutrennen waren. Durch den Einsatz der beschriebenen Mischung aus Reinenzymen läßt sich so eine klare Zeit- und Kostenersparnis erreichen, da gegenüber der bisher angewandten Methode eine eindeutig verbesserte, praktisch vollständige Desin tegration des Lebergewebes erfolgt. Damit gelingt die wünschens werte Entfernung der üblicherweise in großer Zahl kontaminieren den Hepatozyten.

Beispiel H Isolierung von Endothelzellen aus menschlicher Nabelschnur mit einer Mischung aus 3 Enzymen

Menschliche Endothelzellen aus der Nabelschnurvene wurden nach der Methode von Jaffe (17) isoliert. Dazu wurden die Nabelschnüre (20-30 cm lang) halbiert, paarweise mit der jeweiligen Enzym lösung gefüllt und 15 min bei 37°C und 5% CO₂ im Brutschrank inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden entnommen und zur Eva luierung in Primärkultur gehalten. Die Ausbeute an lebenden und teilungsfähigen Zellen wurde nach Auswaschen der nicht adhärenten Zellen nach vier Tagen in Kultur bestimmt.

Die Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 87,5 ml Zelliso lierungspuffer gelöst war.

Am Tag nach der Aussaat der Zellen werden die nicht-adhärenten Zellen (Erythrozyten, Macrophagen, etc.) ausgewaschen. Das Medium wird am vierten Tag gewechselt. Die Konfluenz wird üblicherweise spätestens am achten Tag nach Aussaat erreicht (< 10⁵ Zellen/cm²). Der konfluente Zellrasen besteht zu über 95% aus Endothelzellen, wie FACS-Untersuchungen mit Antikörpern gegen Factor-VIII-Rela ted-Antigen (Von-Willebrand-Faktor) oder zwei endothelspezifische Oberflächenantigene (EN-4, PAL-E) bzw. mit einem fluoreszierenden Liganden des Scavenger-Receptors (dil-Ac-LDL) zeigten.

Ergebnis

Die mit der oben genannten Mischung aus gereinigten Enzymen er zielte Ausbeute (n=2) übertraf diejenige, welche mit undefiniert zusammengesetzten, Kollagenase-haltigen Enzympräparaten erhalten worden war. Die Zelldichte nach 4 Tagen betrug 1,8 × 10⁴ pro cm². Wendet man bislang bekannte Verfahren an, so erhält man eine Zelldichte, die deutlich darunter liegt. Die Konfluenz der Mono schicht wurde bei Verwendung der oben genannten Mischung zu einem früheren Zeitpunkt (bereits nach 5-6 Tagen) erreicht.

Bei der enzymatischen Isolierung der Endothelzellen mit den ver schiedenen Enzympräparaten kam es in keinem Fall zu einer Ruptur der Nabelschnurvene. Die herausgelösten Zellen waren gut verein zelt. Es wurden keine zytotoxischen Erscheinungen beobachtet. Nach einer Stunde war ein Anheften von Endothelzellen festzustel len.

Die präparierten Zellen wurden in der ersten Passage funktionell geprüft (Endothelin-Produktion, Freisetzung von LDH). Dabei lagen alle Werte im Normbereich. Funktionell waren die Zellen damit ge genüber Ergebnissen aus Kontrollversuchen, in denen Zellen mit undefiniert zusammengesetzten Kollagenase-haltigen Präparaten isoliert worden waren, nicht zu unterscheiden.

Die Überlegenheit der eingesetzten Mischung aus gereinigten Enzy men ergibt sich somit in der höheren möglichen Zellausbeute, einer schnelleren Ausbildung einer konfluenten Monoschicht, und einer optimalen Integrität der isolierten Zellen (Zellstruktur und -funktion).

Vergleichbar gute Ergebnisse wurden in solchen Versuchen erzielt, in denen statt der oben genannten Enzymmischung auch andere Mischungen, z. B. bestehend aus Kollagenase HP und Elastase, sowie Mischungen aus Kollagenase HP, Kollagenase AZ, Elastase und Clostripain verwendet wurden.

Beispiel I Isolierung von Tumorzellen aus Human-Tumoren mit einer Mischung aus 3 Enzymen

Tumorzellen wurden aus Human-Tumoren nach der Vorschrift (23) isoliert.

Die verwendete Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 28,4 ml Zell-Isolierungspuffer (Ringer-Lactat/PBS) gelöst wurde.

Der Isolierungserfolg wurde ermittelt anhand des Anteils an vita len Zellen nach dem Trypanblau-Exklusionstest und Auszählung der Lymphozyten-Zellzahl. Direkt vergleichende Zellisolierungen wur den durchgeführt unter Verwendung der erfindungsgemäßen Enzym mischung (bezeichnet mit 1) und eines für diesen Zweck sehr gut geeigneten, Kollagenase enthaltenden Präparates undefinierter Zusammensetzung (bezeichnet mit 2) bei 4 verschiedenen Tumor-Ge weben.

Ergebnis

Die erfindungsgemäße Enzymmischung kann sehr gut zur Isolierung von Tumor-Zellen aus Human-Tumoren eingesetzt werden (Tabelle 7, Anhang).

Der Isolierungserfolg entspricht im Rahmen der experimentellen Schwankungen dem Isolierungserfolg, welcher mit ausgesuchten, be sonders gut zur Tumorzell-Isolierung geeigneten, Kollagenase ent haltenden Präparaten undefinierter Zusammensetzung erhalten wird.

Da nach den hier vorgestellten Ergebnissen unterschiedlichste Bindegewebsstrukturen in Tumorgewebe beim Menschen mit der erfindungsgemäßen Enzymmischung stets unter Erreichen, oder unter Verbesserung des Standes der Technik (Isolierungserfolg, Qualität der isolierten Zellen, und Beibehaltung der methodischen Varia blen) erfolgreich des integriert werden können, kann die Eignung der erfindungsgemäßen Enzymmischungen für die Desintegration auch von anderen tierischen und menschlichen Geweben vorausgesetzt werden.

Beispiel J Isolierung von Inselzellen aus Schweine-Pankreas mit einer Mischung aus 3 Enzymen

Zur Isolierung von Inselzellen aus Schweine-Pankreas wurde die bekannte präparative Methode nach Ricordi unter Einführung eini ger wesentlicher Modifikationen (24) u. a. zur besseren Kontrolle des Isolierungserfolges angewandt. Die Kollagenase-Lösung wirkt dabei unter besonders gut standardisierten Bedingungen auf das Pankreasgewebe nach Infusion über den Pankreasgang längere Zeit ein. Die bereits abgelösten Inseln werden kontinuierlich in ein Reservoir niedrigerer Temperatur abgeführt, und nach Ende der Desintegration werden die im Pankreasgewebe bereits teilweise von ihrer Matrix befreiten Inseln unter Anwendung leichter mechani scher Behandlung vollends abgelöst und isoliert.

Die Isolierung von Inselzellen aus Pankreas stellt außerordent lich hohe Anforderungen an ein Kollagenase enthaltendes Präparat, da die Grundlagen für eine erfolgreiche Isolierung von intakten Inseln aus Pankreas nicht ausreichend bekannt sind.

Ein bemerkenswerter Schritt zu einer reproduzierbaren Präparati onsmethode stellt daher der Beweis der notwendigen Komponenten der üblicherweise verwendeten Kollagenase enthaltenden Präparate undefinierter Zusammensetzung dar.

Im Folgenden wird exemplarisch die Eignung einer erfindungs gemäßen, definierten Enzymmischung bewiesen. Damit ist auch bei diesem Gewebetypus die Eignung zur einer erfolgreichen Gewebedes integration mit dem Ziel der Isolierung von großen, nativen Zel laggregaten (Langerhans′sche Inseln) übertragbar auf die Verwendung von Pankreata auch anderer Spezies (z. B. Human-Pan kreas) - Unterstützend zu dieser Perspektive sind Erfahrungen, welche die Isolierung von Inseln aus Schweine-Pankreas i.a. als schwieriger bewerten, als aus Pankreata anderer Spezies. Bekannt ist z. B. (25), daß Inseln aus Schweine-Pankreas sehr leicht zu kleineren, unerwünschten, Fragmenten durch üblicherweise verwen dete Kollagenase-haltige Präparate undefinierter Zusammensetzung zersetzt werden. Dies wird erklärt durch die besonderen Eigen schaften der Zellen in Inselaggregaten, welche viele Protease sensitive Zell-Zell-Kontakte aufweisen, sowohl zwischen endokri nen und exokrinen Zellen, und auch zwischen endokrinen Zellen und den Inseln. Ziel einer verbesserten Isolierungsmethode kann also nur sein, vermehrt intakte Insel-Zellaggregate zu erhalten, wobei Fragmentierungen zu Aggregaten < 100 µm nur in kleinerem Ausmaß auf treten sollen.

Die in diesem Anwendungsbeispiel zur Isolierung von Inseln aus Schweine-Pankreas verwendete Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 10 ml Isolierungspuffer gelöst wurde. Dieser Lösung wurde routinemäßig Desoxyribonuclease (0,4 mg/10 ml, 440 Kunitz- Einheiten/mg, SIGMA) zugesetzt.

Ergebnis

Der Isolierungserfolg wurde anhand der Größenverteilung der erhaltenen, intakten Zellaggregate und anderer üblicher Parameter ermittelt, welche in Tabelle 8 für eine vergleichende Präparation aufgeführt sind.

Die Einteilung nach der Größe der erhaltenen Inseln und der durch den Isolierungsprozeß fragmentierten Insel-Bestandteile wurde folgendermaßen vorgenommen:

Die Anwendung eines besonders gut zur Inselzell-Isolierung aus Schweine-Pankreas geeigneten Kollagenase enthaltenden Präparates ergab eine etwas höhere Ausbeute an Inselzellmasse pro g Gewebe gegenüber der Isolierung unter Anwendung der erfindungsgemäßen Mischung (Tabelle 8, Anhang). Diese geringfügig erhöhte Ausbeute ist jedoch im wesentlichen auf eine unerwünschte, vermehrte Bildung von kleineren Inselfragmenten unter 50 µm bzw. 50-100 µm zurückzuführen.

Als besonderer Vorteil der Anwendung der erfindungsgemäßen Enzym mischung kann daher angeführt werden, daß anteilig mehr freie In seln über 100 µm gewonnen werden konnten (ohne exokrinen Randsaum 45 43,6%, mit exokrinem Randsaum 48,4%) im Vergleich zum undefi nierten Präparat (mit nur 26,6% bzw. 37,2%).

Beispiel K Experimentelle Untersuchungen zur Wundbehandlung in vivo

Kollagenasen sind bei der Wundheilung verantwortlich für ein ef fektives Entfernen von zerstörtem Gewebe, die Rekrutierung von Zellen im Wundbereich und die Umformung der extrazellulären Ma trix.

In einem experimentellen in vivo-Modell zur Wundreinigung nach Webster (19) wurde die Gewebe-abbauende Eigenschaft der gereinig ten Enzyme an Ratten überprüft.

Je nach applizierter Menge der gereinigten Enzyme auf die Brand wunde dritten Grades wurde ein beschleunigter Abbau des denatu rierten Gewebes innerhalb der ersten 16 Stunden beobachtet. Die Enzyme wurden einzeln oder in Kombination mit anderen Enzymen ap pliziert. Die besten Ergebnisse wurden erhalten bei Applikation von einem Gemisch aus Kollagenase HP (3-48 U/cm², bevorzugt 16 20 U/cm²), Kollagenase AZ (0,2-3 U/cm², bevorzugt 1 U/cm²) und Elastase (1-12 U/cm², bevorzugt 3 U/cm²). Dabei war bei 8 von 15 Tieren der Wundschorf nahezu vollständig aufgelöst, und bei 6 von 15 Tieren war eine teilweise Auflösung erreicht. In diesen Fällen ließ sich das nekrotische Gewebe äußerst leicht mechanisch ent fernen, im Gegensatz zur Kontrolle.

Nach einer kürzeren Applikationszeit von 4 Stunden war bei glei chen verwendeten Mengen eine Erweichung des nekrotischen Materials festzustellen, und in allen Fällen ließ sich der Wund schorf gut entfernen (im Gegensatz zur Kontrolle).

Neben dieser Mischung waren auch andere Mischungen erfolgreich einsetzbar, z. B. solche aus Kollagenase HP (3-48 U/cm²) und Elastase (1-12 U/cm²).

Beispiel L Experimentelle Untersuchungen zur Wundbehandlung in vitro

Die erhaltenen Ergebnisse zur abbauenden Wirkung des nekrotischen Gewebes (Beispiel K) wurden in einem in vitro-Modell weiterfüh rend charakterisiert. In einer geschüttelten Pufferlösung wurde durch Einwirkung von Kollagenase HP, Kollagenase AZ und/oder Elastase auf den in Beispiel K genannten Verbrennungs-Wundschorf die Freisetzung von 4-Hydroxyprolin (20) nach 2,4,6 und 24 h be stimmt.

Es wurden solche Aktivitäten an gereinigten Enzymen eingesetzt, welche mit der relativen Aktivität in einer wirksamen Vergleichs menge eines Kollagenase-haltigen Präparates identisch war. Bei dieser experimentellen Vereinfachung wird der jeweilige Beitrag der anderen Komponenten in dem Kollagenase-haltigen Präparat zur Hydroxyprolinfreisetzung außer acht gelassen.

Bei Einsatz der gereinigten Enzyme wurde in allen Fällen in kla rer Abhängigkeit von der Zeit eine Freisetzung von vergleichbaren Mengen an Hydroxyprolin festgestellt, wie bei Verwendung einer entsprechenden Menge an Kollagenase-haltigem Präparat.

Nach diesen Ergebnissen sind die erfindungsgemäßen gereinigten Enzyme und Enzymmischungen auch in therapeutischen Bereichen, wie z. B. in der Wundbehandlung, einzusetzen.

Literatur

1) Gerlach J.C., Brombacher J., Courtney J.M. und Neuhaus P. (1993) Int. J. Artif. Organs 16(9), 677-681
2) Blaauboer B.J., Boobis A.R., Castell J.V., Coecke S., Groo thuis G.M.M., Guillouzo A., Hall T.J., Hawksworth G.M., Lo renzon G., Miltenburger H.G., Rogiers V, Skett P., Villa P. und Wiebel F.J. (1994) ATLA 22, 231-241
3a) Peterkowski B. (1982) Methods Enzymol. 82, 453-471
3b) Marper E. (1980) Ann. Rev. Biochem. 1063-1078
4) Suggs W., van Wart H. und Sharefkin J.B. (1992) J. Vasc. Surg. 15, 205-213
5) Cuatrecasas P. (1971) J. Biol. Chem. 246, 6522-6531
6) Hefley T.J. (1987) J. Bone Mineral Res. 2 (6), 505-516
7) Hefley T.J., Stern P.H. und Brand J.S. (1983) Exp. Cell Re search 149, 227-236
8) Wolters G.H.J, Vos-Scheperkeuter G.H., van Deÿnen J.H.M und van Schilfgaarde R. (1992) Diabetologia 35, 735-742
9) Berry, M.N., Edwards, A.M. und Barritt, G.J. (1991) In: Iso lated hepatocytes: Preparation, properties and applications. (Burdon, R.H., van Knippenberg, P.H., Eds.) Elsevier, Amster dam, 1991
10) Berry, M.N. und Friend, D.S. (1969) J. Cell. Biol. 43, 506-520
11) Graßmann W. und Nordwig A. (1960) Hoppe-Seyler′s Z. Physiol. Chem. 322, 267-272
12) Mandl I., MacLennan J.D., Howes E.L., DeBellis R.H. und Soh ler A. (1953) J. Clin. Invest. 32, 1323-29
14) Ullmann D. und Jakubke H.-D. (1994) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 375, 89-92
15) Emöd I. und Keil B. (1977) FEBS Lett. 77, 51-66
16) Seglen P.O. (1976) Methods Cell. Biol. 13, 29-83
17) Jaffe F.A., Nachman R.L., Becker C.C. und Minick C.R. (1973) J. Clin. Invest. 52, 2745-56
18) Eisenmann-Tappe I., Wizigmann S. und Gebhardt R. (1991) Cell Biol. Toxicol. 7 (4), 315-325
19) Webster M.E., Altieri P.L., Conklin D.A., Berman S., Lowent hal J.P. und Gochenour R.B. (1962) J. Bacteriol. 83, 602-608
20) Jamall I.S., Finelli V.N. und Que Hee S.S. (1981) Anal. Biochem. 112, 70-75
21) Sandker G.W., Weert B., Olinga P., Wolters H., M.J.H. Slooff, D.K.F. Meÿer und G.M.M. Groothuis (1994), Biochem. Pharmacol. 47, 2193-2200
22) Glinga P., Merema M.T., Meÿer D.K.F., Slooff M.J.H. und Groothuis G.M.M. (1993) ATLA 21, 466-468
23) Hoover H.C.Jr., Surdyke M., Dangel R.B., Peters L.C. und Hanna M.G.Jr. (1984) Cancer Research 44, 1671-1675
24) Schrezenmeir J., Walz S., Marx S. und Laue C., Diabetologia (1994) 37 [Suppl 1] A216
25) Ricordi C., Socci C., Davalli A.M., Staudacher C., Vertova A., Baro P., Freschi N., Gavazzi F., Bertuzzi F., Pozza G. und Di Carlo V. (1990) Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 26-30

Claims

1. Kollagenase HP in reiner Form.

2. Kollagenase AZ in reiner Form.

3. Elastase in reiner Form.

4. Mischungen, welche neben anderen Bestandteilen mindestens Kollagenase HP, Kollagenase AZ oder Elastase enthalten.

5. Verwendung einer definierten Mischung aus den Enzymen Kollagenase HP und Elastase zur Isolierung von Zellen oder Gewebefragmenten aus humanem oder tierischem Gewebe.

6. Verwendung einer definierten Mischung aus den Enzymen Kollagenase HP, Kollagenase AZ und Elastase zur Isolierung von Zellen oder Gewebefragmenten aus humanem oder tierischem Gewebe.

7. Verwendung der Mischungen gemäß Anspruch 4 zusammen mit wei teren Enzymen zur Isolierung von Zellen oder Gewebefragmenten aus humanem oder tierischem Gewebe.

8. Die Verwendung der Enzyme gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 allein oder in Mischungen in der Wundbehandlung oder bei Erkrankun gen, welche mit einem veränderten Kollagenstoffwechsel ein hergehen.