WO1998001108A1 - Definierte enzymmischungen für kosmetische zwecke - Google Patents

Definierte enzymmischungen für kosmetische zwecke Download PDF

Info

Publication number
WO1998001108A1
WO1998001108A1 PCT/EP1997/003376 EP9703376W WO9801108A1 WO 1998001108 A1 WO1998001108 A1 WO 1998001108A1 EP 9703376 W EP9703376 W EP 9703376W WO 9801108 A1 WO9801108 A1 WO 9801108A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagenase
elastase
units
clostripain
enzymes
Prior art date
Application number
PCT/EP1997/003376
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heinz Einig
Josef Johna
Lothar Rasthofer
Hans-Ulrich Wekel
Wolfgang Zahn
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Priority to AU34382/97A priority Critical patent/AU3438297A/en
Publication of WO1998001108A1 publication Critical patent/WO1998001108A1/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q1/00—Make-up preparations; Body powders; Preparations for removing make-up
    • A61Q1/12—Face or body powders for grooming, adorning or absorbing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/59—Mixtures
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/005—Preparations for sensitive skin

Definitions

  • the present invention relates to the use of defined mixtures of enzymes from Clostridiu histolyticum for cosmetic purposes.
  • Medicinal products containing collagenase have been used for wound treatment for many years. However, these ointments are applied to severely damaged skin e.g. in burns and ulcers of various origins. There, collagenase can split off necrotic tissue that is bound to collagen and thus contribute to wound healing through wound cleaning. In cosmetic treatment, on the other hand, there are no open wounds, but almost intact skin that should be cared for with an active ingredient. Intact skin has an epidermis, which consists of Kera in that is not attacked by collagenase.
  • the invention relates to the use of mixtures of at least two enzymes, selected from the group consisting of, on the one hand, collagenase HP and / or collagenase AZ and, on the other hand, elastase and / or clostripain, for cosmetic purposes and cosmetics which contain these mixtures.
  • Elastase and / or clostripain must be present in the mixture as these enzymes can react with the epidermis.
  • Collagenase HP has a specific activity of at least 20 U / mg, preferably at least 50 U / mg in the Grclumann and Nordwig (1) test with the synthetic hexapeptide Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala as substrate.
  • a collagenase HP with an activity of 70-146 U / mg is particularly preferably used.
  • Collagenase AZ has a specific activity of at least 10 U / mg, preferably at least 30 U / mg in the test according to Mandl et al. (2) using azocoll as substrate.
  • a collagenase AZ with an activity of 60-82 U / mg is particularly preferably used.
  • Elastase has a specific activity of at least 2 U / mg, preferably at least 5 U / mg in the test with elastin from the neck band of the cattle as a substrate.
  • An elastase with an activity of 15-20 U / mg is particularly preferably used.
  • Clostripain has a specific activity of at least 10 U / mg, preferably 25 U / mg in that of Emod et al. (4) described test, which is carried out with the synthetic substrate ⁇ -N-benzoyl-L-arginine-ethyl ester after prior activation of the clostripain solution with a 2 mM 1,4-dithio-erythritol solution for 3 hours.
  • a clostripain with an activity of 60-90 U / mg is particularly preferably used.
  • the purity criterion for the enzymes used is their respective specific activity and their uniformity proof in the electrophoretic methods usually used for this purpose (SDS gel electrophoresis, isoelectric focusing and electrophoresis on agarose gel).
  • the specific activity of the purified enzymes is up to 100 times higher than that of the starting material.
  • Purified enzymes with the following specific activities are used for the preparation of the mixtures: collagenase HP with a specific activity of at least 20 U / mg, elastase with at least 2 U / mg, collagenase AZ with at least 10 U / mg and clostripain with at least 10 U / mg.
  • the mixtures are distinguished by the fact that, owing to their defined composition of synergistic collagenolytic, as well as elastinolytic and proteolytic enzymes, they are particularly suitable for cosmetic purposes.
  • 1 g of a cosmetic preparation (eg 1 g cream) should contain at least 0.02 units of collagenase HP and the maximum amount should be below the lowest dose of 0.6 units / g in the pharmaceutical sector, preferably between 0.06 and 0.3 units / g in the preparation.
  • the elastase should be contained in the combination of two between 0.01 and 0.2 units / g, preferably between 0.02 and 0.1 units / g of preparation.
  • the dosage of elastase should be as described above, the dosage of collagenase AZ should be between 0.02 and 0.6, preferably between 0.06 and 0.3 units / g of preparation.
  • the dosage of collagenase HP should be the same as in the combination of two with elastase.
  • the amount of clostripain should be between 0.1 and 1.2 U / g preparation, preferably between 0.04 and 0.5 U / g preparation.
  • the dosage of collagenase AZ is as in the combination with elastase described above and the dosage of clostripain as indicated in the previous paragraph in combination with collagenase HP.
  • the best combination of two with the highest cosmetic care result is the combination of collagenase HP and elastase.
  • collagenase HP is used in a combination of three, the amounts of collagenase HP and collagenase AZ used are as described above, and the amount of clostripain used is between 0.01 and 1.2, preferably 0.04 to 0.5 units / g Preparation.
  • a particularly favorable combination for a cream is when it contains between 0.02 to 0.2 units of collagenase HP, 0.01 to 0.3 units of elastase and 0.06 and 0.3 units of collagenase AZ per g of a cosmetic preparation are incorporated.
  • a more cleansing effect on the skin can be achieved if the two enzymes elastase and clostripain are dosed as high as possible.
  • the skin-smoothing effect can be achieved by higher proportions of the two collagenases, but not without the presence of elastase and / or clostripain.
  • the dosage of the individual enzymes is between 0.02 and 0.6 units / g for collagenase HP, between 0.02 and 0.6 units / g for collagenase AZ and between 0.01 and 0.3 units / g for elastase for clostripain between 0.01 and 0.6 units / g in the cosmetic formulation.
  • vitamin E and / or ⁇ -bisabolol may be beneficial to add vitamin E and / or ⁇ -bisabolol to the formulations.
  • the chromatographic separation of collagenase HP and collagenase AZ was carried out on Zn 2- laden chelating Sepharose 6B.
  • this material was packed into a column (5 ⁇ 100 cm) at a layer height of 70 cm and equilibrated with starting buffer (500 mM sodium acetate + 20 mM calcium acetate, pH 8.0).
  • starting buffer 500 mM sodium acetate + 20 mM calcium acetate, pH 8.0
  • TRIS tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • the two separate enzyme fractions of collagenase HP and collagenase AZ were concentrated to 50-100 ml with the aid of an ultrafiltration membrane (exclusion limit 10000 Da), then dialyzed against water and again concentrated to approx. 10 ml via an ultrafiltration membrane (exclusion limit 10000 Da).
  • the fine purification of collagenase HP was carried out on the anion exchanger Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) and with the aid of the FPLC device from Pharmacia.
  • a mixture of 1 ml of buffer B and 1 ml of the fraction containing collagenase AZ (from the metal chelate described above) was added to the column, which had been equilibrated with buffer B (20 mM calcium acetate, pH 7.2). Affinity chromatography).
  • the collagenase HP was eluted from the column with buffer C (20 mM TRIS / HC1 + 200 mM NaCl, pH 7.5) in purified form.
  • the collagenase HP got its name "HP" because of its property to break down the hexapeptide Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala particularly well. It is therefore particularly well suited for specific detection of activity.
  • Collagenase HP is characterized by the fact that it can only convert denatured collagens such as gelatin or azocoll to a small extent. However, it attacks beef tendon collagen and cleaves the synthetic peptides mentioned under 2b between glycine and glycine or between any amino acid and glycine with high turnover.
  • the specific activity of collagenase HP is a maximum of 146 U / mg in the test with the synthetic substrate Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala (5). This corresponds to an approximately 100-fold increase in their specific activity compared to the starting material.
  • the collagenase HP purified in this way forms only a single band both in SDS gel electrophoresis and in isoelectric focusing and electrophoresis on agarose gel.
  • Collagenase AZ fractional protein precipitation and metal chelate affinity chromatography
  • the fine purification of collagenase AZ was carried out on the anion exchanger Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) and with the aid of the FPLC device from Pharmacia.
  • the column was filled with buffer D
  • collagenase AZ was eluted from the column with buffer E (20 mM calcium acetate, pH 5.0).
  • the collagenase AZ got its name "AZ" because of its property to degrade the substrate Azocoll particularly well. It is characterized by the fact that it well converts denatured collagens such as gelatin or azocolla, but also bovine tendon collagen. However, it can handle small synthetic peptides such as 2-furanacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala, 4-phenyl-azobenzyloxy-carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg and Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala not attack.
  • the specific activity of collagenase AZ is a maximum of 82 U / mg in that of Mandl et al. (2) developed test using Azokoll as substrate. This corresponds to an approximately 80-fold increase in their specific activity compared to the starting material.
  • the collagenase AZ purified in this way forms only a single band in ⁇ DS gel electrophoresis as well as in isoelectric focusing and electrophoresis on agarose gel.
  • the first step in elastase purification was by protein precipitation with ammonium sulfate, as described in l.a. described.
  • the protein precipitate Al was dissolved in 1 liter of water, concentrated to about 170 ml through an ultrafiltration membrane (cut-off limit 10,000 Da) and dialyzed against a 0.1 mM calcium acetate solution. The enzyme solution was then concentrated again to about 50 ml via an ultrafiltration membrane (cut-off limit 10,000 Da) and then lyophilized.
  • the fine purification was carried out by gel chromatography on SEPHADEX G100 or G200 (Pharmacia).
  • the elastase is characterized in that it can break down elastin with high turnover. Their specific activity (see 3.c.) was 18 U / mg. This corresponds to an approximately 80-fold increase in their specific activity compared to the starting material.
  • the elastase cleaned in this way forms only a single band both in SDS gel electrophoresis and in isoelectric focusing and electrophoresis on agarose gel.
  • the molecular weight of the elastase determined by means of SDS electrophoresis is 35,000 Da.
  • the enzyme activity was determined using the substrate elastin.
  • the extinction value E B obtained in a similar test was used as the blank value, in which the elastase solution was only added to the mixture after the elastin had been removed.
  • the absorbance E B of this filtrate was then also determined at 280 nm.
  • the elastase activity is expressed in units [U].
  • the enzyme activity that dissolves 1 mg elastin per minute under the given test conditions is defined as 1 U.
  • the amount of elastin dissolved in the filtrate of the test mixture was determined by measuring the absorbance at 280 nm.
  • the factor F is determined by completely dissolving 10 mg elastin of a certain batch with the help of elastase and measuring the corresponding extinction difference ⁇ E. The multiplication of this factor F by the extinction difference ⁇ E gives the dissolved milligram amount of elastin per ml test batch.
  • Clostripain was isolated using the method described by Ulimann and Jakubke (3).
  • the thiol protease clostripain is characterized in that it cleaves specifically behind the amino acid L-arginine in polypeptide chains and in synthetic substrates. Its molecular weight determined by SDS electrophoresis is 55,000 Da.
  • Example 1 easily distributable ointment
  • the ingredients other than the two enzymes were melted at 80 ° C and allowed to cool to a temperature of 40-45 ° C with stirring.
  • the two enzymes were added at this temperature and the mixture was mixed intensively until it cooled.
  • Example 2 easily distributable ointment
  • composition Elastase 10 units
  • Titanium dioxide 5 g
  • Example 5 Skin Care Babyol
  • Composition component A Elastase 20 units
  • Paraffin and petroleum jelly were melted at 80 ° C and cooled to 40-45 ° C with stirring. The 4 enzymes were then also added and the mixture was cooled to room temperature with vigorous stirring.
  • Composition component B is a composition component having Composition component B:
  • Sorbitan trioleate 1.87 g paraffin 3.69 g
  • Vaseline ad 00 g Manufacturing
  • Components A and B were filled in a two-chamber tube.
  • the tube opening for component B allows four times the amount of that for component A.
  • An adapter is used to bring the two strands together and rub them on the skin.
  • the two-component cream is particularly suitable when it is applied to damp skin.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Es wird die Verwendung von Mischungen aus mindestens zwei Enzymen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kollagenase HP, Kollagenase AZ, Elastase und Clostridiopeptidase A in hoher Reinheit für kosmetische Zwecke beschrieben.

Description

Definierte Enzymmischungen für kosmetische Zwecke
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung definierter Mischungen von Enzymen aus Clostridiu histolyticum für kosmetische Zwecke.
Für die Wundbehandlung sind Kollagenase-enthaltende Arzneimittel seit vielen Jahren eingesetzt. Bei diesen Salben erfolgt jedoch eine Applikation auf stark beschädigte Haut z.B. bei Verbrennungswunden und Ulcera verschiedener Genese. Dort kann Kollagenase nekrotisches Gewebe, das an Kollagen gebunden ist, abspalten und so durch Wundreinigung zur Wundheilung beitragen. In der kosmetischen Behandlung liegen hingegen keine offenen Wunden vor, sondern nahezu intakte Haut, die mit einem Wirkstoff gepflegt werden soll. Intakte Haut besitzt eine Epidermis, die aus Kera in besteht, das von Kollagenase nicht angegriffen wird.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Mischungen aus mindestens zwei Enzymen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einerseits Kollagenase HP und/oder Kollagenase AZ und andererseits aus Elastase und/oder Clostripain, für kosmetische Zwecke sowie Kosmetika, die diese Mischungen enthalten.
Elastase und/oder Clostripain müssen in der Mischung vorhanden sein, da diese Enzyme mit der Epidermis reagieren können.
Kollagenase HP besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 20 U/mg, vorzugsweise mindestens 50 U/mg im Test nach Graßmann und Nordwig (1) mit dem synthetischen Hexapeptid Z-Gly-Pro- Gly-Gly-Pro-Ala als Substrat. Besonders bevorzugt wird eine Kollagenase HP mit einer Aktivität von 70-146 U/mg verwendet.
Kollagenase AZ besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 10 U/mg, vorzugsweise mindestens 30 U/mg im Test nach Mandl et al. (2) unter Verwendung von Azokoll als Substrat. Besonders bevorzugt wird eine Kollagenase AZ mit einer Aktivität von 60-82 U/mg verwendet.
Elastase besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 2 U/mg, vorzugsweise mindestens 5 U/mg im Test mit Elastin aus dem Nackenband des Rindes als Substrat. Besonders bevorzugt wird eine Elastase mit einer Aktivität von 15-20 U/mg verwendet. Clostripain besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 10 U/mg, vorzugsweise von 25 U/mg im von Emod et al. (4) beschriebenen Test, der mit dem synthetischen Substrat α-N-Benzoyl- L-arginin-ethylester nach vorheriger 3stundιger Aktivierung der Clostripain-Lόsung mit einer 2 mM 1 , 4-Dithιoerythrιt-Losung durchgeführt wird. Besonders bevorzugt wird ein Clostripain mit einer Aktivität von 60-90 U/mg verwendet.
Reinheitskriterium für die verwendeten Enzyme ist ihre jeweilige spezifische Aktivität und ihr Einheitlichkeitsnachweis in den für diesen Zweck üblicherweise verwendeten elektrophoretischen Methoden (SDS-Gel-Elektrophorese, isoelektrische Fokussierung und Elektrophorese auf Agarosegel) . Die spezifische Aktivität der gereinigten Enzyme erreicht bis zu lOOfach höhere Werte im Ver- gleich zum Ausgangsmaterial.
Für die Herstellung der Mischungen werden gereinigte Enzyme mit den folgenden spezifischen Aktivitäten eingesetzt: Kollagenase HP mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 20 U/mg, Elastase mit mindestens 2 U/mg, Kollagenase AZ mit mindestens 10 U/mg und Clostripain mit mindestens 10 U/mg.
Die Mischungen zeichnen sich dadurch aus, daß sie, aufgrund ihrer definierten Zusammensetzung aus synergistisch wirkenden kollagenolytischen, sowie elastinolytischen und proteolytisehen Enzymen, für kosmetische Zwecke besonders geeignet sind.
Bei einer Zweierkombination von Elastase und Kollagenase HP soll 1 g einer kosmetischen Praparation (z.B. 1 g Creme) mindestens 0,02 Units Kollagenase HP enthalten und die Hόchstmenge soll unter der im pharmazeutischen Bereich niedrigsten Dosis von 0,6 Units/g liegen, vorzugsweise zwischen 0,06 und 0,3 Units/g im Präparat. Die Elastase soll in der Zweierkombination zwischen 0,01 und 0,2 Units/g, vorzugsweise zwischen 0,02 und 0,1 Units/g Präparat enthalten sein.
Bei einer Zweierkombination von Elastase und Kollagenase AZ soll die Dosierung von Elastase wie vorstehend beschrieben erfolgen, die Dosierung von Kollagenase AZ soll zwischen 0,02 und 0,6, vorzugsweise zwischen 0,06 und 0,3 Units/g Präparat liegen.
Bei einer Zweierkombination von Kollagenase HP und Clostripain soll die Dosierung der Kollagenase HP wie in der Zweierkombination mit Elastase liegen. Die Menge an Clostripain soll darin zwischen 0,1 und 1,2 U/g Präparat, vorzugsweise zwischen 0,04 und 0,5 U/g Präparat liegen. Bei einer Kombination von Kollagenase AZ und Clostripain liegt die Dosierung der Kollagenase AZ wie in der oben beschriebenen Kombination mit Elastase und die Dosierung von Clostripain wie im voranstehenden Absatz in der Kombination mit Kollagenase HP angegeben vor.
Die beste Zweierkombina ion mit dem höchsten kosmetischen Pflegeergebnis ist die Kombination aus Kollagenase HP und Elastase.
Wird Kollagenase HP in einer Dreierkombination eingesetzt, so liegen die eingesetzten Mengen an Kollagenase HP und Kollagenase AZ wie oben beschrieben, und die eingesetzte Menge an Clostripain liegt zwischen 0,01 und 1,2, vorzugsweise 0,04 bis 0,5 Units/g Präparat.
Eine besonders gunstige Kombination für eine Creme liegt vor, wenn in diese zwischen 0,02 bis 0,2 Units Kollagenase HP, 0,01 bis 0,3 Units Elastase und 0,06 und 0,3 Units Kollagenase AZ pro g eines kosmetischen Präparates eingearbeitet sind.
Weitere Dreierkombinationen sind Kollagenase HP + Elastase + Clostripain.
Einen mehr reinigenden Effekt auf die Haut kann man erzielen, wenn die beiden Enzyme Elastase und Clostripain möglichst hoch dosiert sind. Der hautglattende Effekt ist durch höhere Anteile der beiden Kollagenasen zu erreichen, jedoch nicht ohne das Vorhandensein von Elastase und/oder Clostripain.
Ausgesprochen günstige Effekte der Hautglättung und des Peelings erreicht man mit einer Viererkombination. Die Dosierung der einzelnen Enzyme liegt bei Kollagenase HP zwischen 0,02 bis 0,6 Units/g, bei Kollagenase AZ zwischen 0,02 bis 0,6 Units/g, bei Elastase zwischen 0,01 bis 0,3 Units/g und bei Clostripain zwischen 0,01 und 0,6 Units/g in der kosmetischen Formulierung.
Für die Anwendung der Enzyme in der Hautpflege kann es gunstig sein, den Formulierungen Vitamin E und/oder α-Bisabolol hinzu- zufügen.
Die oben aufgeführten Kombinationen können in viele kosmetische Präparationen eingearbeitet werden. Diese reichen von einfachen Suspensionen in 01 oder Fetten, in Wasser in 01- bzw. 01 in Wasser-Emulsionen bis zu liposomenähnlichen Formulierungen, Gesichtsmasken und Zweikomponentencremes, die beim Zusammenfuhren eine 01 in Wasser- bzw. Wasser in Ol-Emulsion bilden.
Praparation und Charakterisierung der Enzyme aus Clostridi um histolyticum
1. Kollagenase HP
a. Herstellung
Fraktionierte Proteinfällung mit Ammoniumsulfat
Alle Operationen bei der Enzymreinigung wurden bei 4-8°C durchgeführt.
200 g Rohkollagenase wurden in 3 1 Wasser gelost und in die erhaltene Losung zunächst 680 g pulverisiertes Ammoniumsulfat eingetragen. Der ausgefallene Proteinniederschlag AI wurde durch Zentrifugation abgetrennt; zum Überstand wurden weitere 420 g A moniumsulfat gegeben. Die hierbei ausgefällte Proteinfraktion A2 wurde abgeschleudert, der Niederschlag in 1 1 Wasser gelöst und gegen Wasser dialysiert. Danach wurde über eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze 10000 Da) auf etwa 100 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde dann lyophilisiert . Die so gewonnene pulverformige Proteinfraktion A2 enthielt Kollagenase HP und Kollagenase AZ als Hauptkomponenten.
Chromatographische Trennung von Kollagenase HP und
Kollagenase AZ mittels Metallchelat-Affinitätschromato- graphie
Die chromatographische Trennung von Kollagenase HP und Kollagenase AZ erfolgte an Zn2-beladener Chelating Se- pharose 6B. Dazu wurde dieses Material in einer Schichthöhe von 70 cm in eine Säule (5 x 100 cm) gepackt und mit Startpuffer (500 mM Natriumacetat + 20 mM Calciumacetat , pH 8,0) äquilibriert . Dann wurden ca. 1,2 g der Protein- fraktion A2, gelöst in 15 ml Startpuffer, dessen pH-Wert mit TRIS [Tris-(hydroxymethyl) -aminomethan] auf 8,4 korrigiert worden war, auf die Säule aufgetragen und mit Startpuffer verschiedene Bestandteile der Proteinfraktion A2 aus der Säule gewaschen. Bei der nachfolgenden Elution mit dem Puffer A (500 mM Natriumacetat + 20 mM Calciumacetat, mit Essigsaure auf pH 6,3 korrigiert) wurde zunächst Kollagenase AZ und dann Kollagenase HP in getrennten Fraktionen aufgefangen.
Die beiden getrennten Enzymfraktionen von Kollagenase HP und Kollagenase AZ wurden mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze 10000 Da) auf 50-100 ml konzentriert, anschließend gegen Wasser dialysiert und wieder über eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze 10000 Da) auf ca. 10 ml konzentriert.
Feinreinigung von Kollagenase HP
Die Feinreinigung von Kollagenase HP wurde an dem Anionenaustauscher Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) und unter Zuhilfenahme des FPLC-Gerates der Fa. Pharmacia durchgeführt. Dazu wurde auf die Säule, die mit Puffer B (20 mM Calcium-acetat, pH 7,2) aquilibriert worden war, ein Gemisch aus 1 ml Puffer B und 1 ml der Kollagenase AZ enthaltenden Fraktion (aus der oben beschriebenen Metall- chelat-Affinitatschromatographie) aufgetragen.
Nach Waschen mit Puffer B wurde die Kollagenase HP mit dem Puffer C (20 mM TRIS/HC1 + 200 mM NaCl, pH 7,5) in gereinigter Form von der Säule eluiert.
Eigenschaften
Die Kollagenase HP erhielt ihre Bezeichnung "HP" aufgrund ihrer Eigenschaft, das Hexapeptid Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro- Ala besonders gut abzubauen. Es ist daher für einen spezifischen Nachweis der Aktivität besonders gut geeignet. Kollagenase HP ist dadurch charakterisiert, daß sie denaturierte Kollagene wie Gelatine oder Azokoll nur in geringem Maße umsetzen kann. Sie greift jedoch Rinder- sehnenkollagen an und spaltet mit hohem Umsatz die unter 2b genannten synthetischen Peptide zwischen Glycin und Glycin bzw. zwischen einer beliebigen Aminosäure und Glycin.
Die spezifische Aktivität der Kollagenase HP liegt bei maximal 146 U/mg im Test mit dem synthetischen Substrat Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala (5) . Dies entspricht einer etwa lOOfachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial. Die so gereinigte Kollagenase HP bildet sowohl bei der SDS-Gel-elektrophorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande.
Ihr mittels SDS-Elektrophorese ermitteltes Molekulargewicht liegt bei 106.000 Da. Ihr isoelektrischer Punkt liegt bei pH 5,8-6,0.
2. Kollagenase AZ
a. Herstellung
Alle Operationen bei der Enzymreinigung wurden bei 4-8°C durchgeführt. Die beiden ersten Reinigungsschritte von
Kollagenase AZ (fraktionierte Proteinfällung und Metall- chelat-Affinitätschromatographie) sind unter 1. beschrieben.
Feinreinigung von Kollagenase AZ
Die Feinreinigung von Kollagenase AZ wurde an dem Anionenaustauscher Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) und unter Zuhilfenahme des FPLC-Gerates der Fa. Pharmacia durch- geführt. Dazu wurde auf die Säule, die mit Puffer D
(20 mM Calcium-acetat, pH 7,2) äquilibriert worden war, ein Gemisch aus 1 ml Puffer D und 1 ml der Kollagenase AZ enthaltenden Fraktion (aus der oben beschriebenen Metall- chelat-Affinitätschromatographie) aufgetragen.
Nach Waschen mit Puffer D wurde die Kollagenase AZ mit dem Puffer E (20 mM Calciumacetat , pH 5,0) von der Säule eluiert .
b. Eigenschaften
Die Kollagenase AZ erhielt ihre Bezeichnung "AZ" aufgrund ihrer Eigenschaft, das Substrat Azokoll besonders gut abzubauen. Sie ist dadurch charakterisiert, daß sie denaturierte Kollagene wie Gelatine oder Azokoll, aber auch Rindersehnen-kollagen gut umsetzt. Sie vermag jedoch kleine synthetische Peptide wie 2-Furanacryloyl-Leu-Gly- Pro-Ala, 4-Phenyl-azobenzyloxy-carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro- Arg und Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala nicht anzugreifen. Die spezifische Aktivität der Kollagenase AZ liegt bei maximal 82 U/mg in dem von Mandl et al . (2) entwickelten Test unter Verwendung von Azokoll als Substrat. Dies entspricht einer ca. 80fachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial.
Die so gereinigte Kollagenase AZ bildet sowohl bei der ΞDS-Gel-elektrophorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande.
Ihr mittels SDS-Gelelektrophorese ermitteltes Molekulargewicht liegt bei 111000 Da. Ihr isoelektrischer Punkt liegt bei pH 5, 9-6, 1.
3. Elastase
a. Herstellung
Alle Operationen bei der Enzymreinigung wurden bei 4-8°C durchgeführt .
Der erste Reinigungsschritt von Elastase erfolgte durch Proteinfällung mit Ammoniumsulfat, wie unter l.a. beschrieben.
Der Proteinniederschlag Al wurde in 1 1 Wasser gelöst, über eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze 10000 Da) auf etwa 170 ml eingeengt und gegen eine 0 , 1 mM Calciumacetat-Lόsung dialysiert. Anschließend wurde die Enzymlösung erneut über eine Ultrafiltrations- me bran (Ausschlußgrenze 10000 Da) auf ca. 50 ml konzentriert und dann lyophilisier .
Die Feinreinigunge erfolgte durch Gelchromatographie an SEPHADEX G100 oder G200 (Pharmacia) .
b. Eigenschaften
Die Elastase ist dadurch charakterisiert, daß sie Elastin mit hohem Umsatz abbauen kann. Ihre spezifische Aktivität (s. 3.c.) lag bei 18 U/mg. Dies entspricht einer ca. 80fachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial. Die so gereinigte Elastase bildet sowohl bei der SDS- Gelelektrophorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande.
Das mittels SDS-Elektrophorese ermittelte Molekulargewicht der Elastase liegt bei 35000 Da.
Aktivitatsbestimmung
Die Bestimmung der Enzymaktivitat erfolgte mit Hilfe des Substrates Elastin.
20 mg fein pulverisiertes Elastin aus dem Nackenband des Rindes (Sig a) wurden in 0,4 ml Puffer (50 mM TRIS/HC1 +
10 mM Calciumacetat, pH 7,2) 5 min im Wasserbad bei 37°C unter Schuttein vorinkubiert . Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von Elastase, gelost in 0,1 ml Puffer, gestartet und 10 min bei 37°C weiter geschüttelt (Hubhöhe 25 mm, Frequenz 150 min-1). Anschließend wurden 3,5 ml eiskaltes Wasser zugesetzt und das nicht umgesetzte Elastin sofort über einen Filter entfernt. Die Extinktion E des Filtrates wurde spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. Als Blindwert diente der in einem gleichartig durchgeführten Versuch erhaltene Extinktionswert EB, bei dem die Elastaselόsung dem Ansatz jedoch erst nach Entfernung des Elastins zugesetzt worden war. Die Extinktion EB dieses Filtrates wurde dann ebenfalls bei 280 nm bestimmt.
Die Elastaseaktivität wird in Units [U] ausgedrückt. Als 1 U wird diejenige Enzymaktivität definiert, die unter den gegebenen Versuchsbedingungen 1 mg Elastin pro Minute auflöst. Die aufgelöste Menge an Elastin wuirde im Filtrat des Testansatzes durch Messen der Extinktion bei 280 nm bestimmt.
Die Berechnung der spezifischen Aktivität erfolgte nach fo1gender Forme1 :
Δ E x F x Testvolumen x Verdünnungsfaktor U/mg = min x mg Elastase im Testansatz
ΔE = E-EB F = 1,376 Der Faktor F wird ermittelt, indem 10 mg Elastin einer bestimmten Charge mit Hilfe von Elastase vollständig aufgelöst und die entsprechende Extinktionsdifferenz ΔE gemessen wird. Die Multiplikation dieses Faktors F mit der Extinktionsdifferenz ΔE ergibt die aufgelöste Milligramm-Menge an Elastin pro ml Testansatz.
4. Clostripain
a. Herstellung
Die Isolierung von Clostripain erfolgte nach der von Ulimann und Jakubke beschriebenen Methode (3).
Die Bestimmung ihrer spezifischen Enzymaktivitat erfolgte mit Hilfe des synthetischen Substrates α-N-Benzoyl-L- arginin-ethylester ( - BAEE) nach vorheriger 3stundιger Aktivierung der Clostripainlösung mit 2 mM 1,4-Dithio- erythrit-Losung (4). Sie lag bei ca. 83 U/mg.
b. Eigenschaften
Die Thiolprotease Clostripain ist dadurch charakterisiert, daß sie in Polypeptidketten und in snythetisch hergestellten Substraten spezifisch hinter der Aminosäure L-Arginin spaltet. Ihr mittels SDS-Elektrophorese ermitteltes Molekulargewicht liegt bei 55000 Da.
Es empfiehlt sich, den Präparaten mit Clostripain eine Menge von 1-2 mg/g Salbe einer Thioverbindung wie Glutathion oder Cystin hinzuzufügen, damit das Enzym besonders aktiv wird.
Anwendungsbeispiele
Beispiel 1: leicht verteilbare Salbe
Zusammensetzung:
Elastase 20 Units Kollagenase HP 10 Units
Zinkoxid 3 g
Cetearyloctanoat (Luvitol® EHO) 5 g
(-)-α-Bisabolol 1 g
Eucerinum anhydricum ad 100 g Herstellung:
Die Bestandteile außer den beiden Enzymen wurden bei 80°C geschmolzen und unter Rühren bis zu einer Temperatur von 40-45°C abkühlen gelassen. Bei dieser Temperatur wurden die beiden Enzyme zugesetzt und die Mischung intensiv bis zum Erkalten gemischt.
Beispiel 2 : leicht verteilbare Salbe
Zusammensetzung: Elastase 10 Units
Clostripain 20 Units
Kollagenase AZ 15 Units
Zinkoxid 3 g
Cetearyloctoanat (Luvitol® EHO) 5 g (-) -o-Bisabolol 1 g
Eucerinum anhydricum ad 100 g
Die Herstellung erfolgte analog Beispiel 1
Beispiel 3: Puder
Zusammensetzung:
Kollagenase HP 15 Units
Kollagenase AZ 10 Units Elastase 10 Units
Zinkoxid 4 g
Titandioxid 5 g
Magnesiumstearat 5 g
(-)-α-Bisabolol 1 g Parfümöl q.s.
Talkum ad 100 g
Die Herstellung erfolgte durch gutes und intensives Mischen der Bestandteile.
Beispiel 4 : Puder
Analog Beispiel 3 wurde ein Puder hergestellt, welches jedoch anstelle von Clostripain 10 Units Elastase enthielt. Beispiel 5: Hautpflegendes Babyol
Zusammensetzung:
Elastase 10 Units Clostripain 15 Units
Kollagenase HP 20 Units
Kollagenase AZ 10 Units
Cetearyloctanoat (Luvitol® EHO) 47,9 g
Tocopherylacetat 2,0 g (-)-α-Bisabolol 0,1 g
Parfumöl q.s.
Glutathion 1,0 g
Caprylic/Capric Triglyceride (Miglyol®) ad 100 g
Herstellung:
Alle Bestandteile wurden zusammengefugt und gerührt, bis eine vollst ndige Losung vorlag. Sehr feine Partikel der Enzyme lösen sich nicht. Eine Sedimentation der Partikel ist möglich, daher vor Gebrauch kurz und intensiv aufrütteln.
Beispiel 6: Wasser in όl-Creme, Zweikomponenten-Creme
Zusammensetzung Komponente A: Elastase 20 Units
Clostripain 60 Units
Kollagenase HP 80 Units
Kollagenase AZ 40 units
Paraffin 20 g Vaseline ad 100 g
Herstellung:
Paraffin und Vaseline wurden bei 80°C geschmolzen und unter Rühren bis auf 40 - 45°C abgekühlt. Danach wurden auch die 4 Enzyme zuge- geben und die Mischung unter intensivem Rühren auf Raumtemperatur abgekühlt.
Zusammensetzung Komponente B:
Sorbitantrioleat 1 , 87 g Paraffin 3 , , 69 g
Cystin 1 , , 0 g
Polyoxyethylen-sorbitolhexaoleat 11 , , 87 g
Wasser 13 , , 02 g
Vaseline ad 00 g Herstellung:
Alle Bestandteile außer Wasser wurden auf 70°C erwärmt. Unter intensivem Ruhren wurde das Wasser eingearbeitet. Unter Rühren wurde auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die Komponenten A und B wurden in eine Zweikammertube gefüllt. Die Tubenόffnung für die Komponente B laßt die vierfach größere Menge durch als die für die Komponente A. Über einen Adapter werden die beiden Stränge zusammengeführt und auf der Haut verrieben. Die Zweikomponentencreme eignet sich besonders, wenn sie auf feuchte Haut aufgetragen wird.
Literatur
1) Graßmann W. und Nordwig A. (1960) Hoppe-Seyler' s Z. Physiol. Chem. 322, 267-272
2) Mandl I., MacLennan J.D. , Howes E.L., DeBellis R.H. und Sohler A. (1953) J. Clin. Invest . 32, 1323-29
3) Ulimann D. und Jakubke H.-D. (1994) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 375, 89-92
4) Emόd I. und Keil B. (1977) FEBS Lett. 77, 51-66
5) Nordwig A. und Strauch L. (1996) Hoppe-Seyler ' s Z. Physiol. Chem. 330, 10

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Mischungen aus mindestens zwei Enzymen, ausge- wählt aus der Gruppe, bestehend aus einerseits Kollagenase HP und/oder Kollagenase AZ und andererseits aus Elastase und/oder Clostripain, für kosmetische Zwecke.
2. Kosmetika enthaltend eine Mischling gemäß Anspruch 1.
3. Kosmetika enthaltend eine Mischung aus Kollagenase HP und Elastase.
4. Kosmetika enthaltend eine Mischung aus Kollagenase AZ, Clostripain und Elastase.
5. Kosmetika enthaltend eine Mischung aus Kollagenase AZ, Kollagenase HP und Elastase.
PCT/EP1997/003376 1996-07-05 1997-06-27 Definierte enzymmischungen für kosmetische zwecke WO1998001108A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU34382/97A AU3438297A (en) 1996-07-05 1997-06-27 Defined enzyme mixtures for cosmetic purposes

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE1996127232 DE19627232A1 (de) 1996-07-05 1996-07-05 Definierte Enzymmischungen für kosmetische Zwecke
DE19627232.7 1996-07-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998001108A1 true WO1998001108A1 (de) 1998-01-15

Family

ID=7799089

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1997/003376 WO1998001108A1 (de) 1996-07-05 1997-06-27 Definierte enzymmischungen für kosmetische zwecke

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU3438297A (de)
DE (1) DE19627232A1 (de)
WO (1) WO1998001108A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2343844A (en) * 1998-11-23 2000-05-24 Bio Silk Ltd Topical therapeutic composition comprising an enzyme

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008070368A2 (en) * 2006-11-01 2008-06-12 Living Proof, Inc. Methods and compositions for skin care

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU719630A1 (ru) * 1978-04-19 1980-03-05 Всесоюзный Научно-Исследовательский Биотехнический Институт Средство дл сухой кожи лица
FR2609629A1 (fr) * 1987-01-15 1988-07-22 Bory Jacques Introduction dans des preparations cosmetologiques de diastases permettant un remodelage de certaines structures cutanees
DE19532906A1 (de) * 1995-03-16 1996-09-19 Knoll Ag Neue, definierte Enzymmischungen zur Zellgewinnung und für die Wundbehandlung

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU719630A1 (ru) * 1978-04-19 1980-03-05 Всесоюзный Научно-Исследовательский Биотехнический Институт Средство дл сухой кожи лица
FR2609629A1 (fr) * 1987-01-15 1988-07-22 Bory Jacques Introduction dans des preparations cosmetologiques de diastases permettant un remodelage de certaines structures cutanees
DE19532906A1 (de) * 1995-03-16 1996-09-19 Knoll Ag Neue, definierte Enzymmischungen zur Zellgewinnung und für die Wundbehandlung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 93, no. 4, 28 July 1980, Columbus, Ohio, US; abstract no. 31635, LUPOVA, L. M. ET AL: "Agent for a dry facial skin" XP002046085 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2343844A (en) * 1998-11-23 2000-05-24 Bio Silk Ltd Topical therapeutic composition comprising an enzyme
GB2343844B (en) * 1998-11-23 2000-10-25 Bio Silk Ltd Composition and method for treatment of hypertrophic skin accumlations and their prevention

Also Published As

Publication number Publication date
DE19627232A1 (de) 1998-01-08
AU3438297A (en) 1998-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0845972B1 (de) Verwendung von mutierter subtilisin-protease in kosmetischen produkten
DE69001730T2 (de) Pastenfoermige, waesserige pharmazeutische zusammensetzungen.
EP0181465B2 (de) Blutgerinnungshemmende Proteine, Verfahren zur Herstellung sowie deren Verwendung
EP0209061B1 (de) Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel
US5747043A (en) Cucumis melo protein extract with antioxidant activity and process for preparing it, cosmetic composition or food composition containing such an extract
DE19720437B4 (de) Mutanase enthaltende orale Zusammensetzungen
EP0278112B1 (de) Gentechnologisch hergestellter pankreatischer sekretorischer Trypsininhibitor und seine Varianten
DE69333931T2 (de) Verwendung von Krillenzymen zur Behandlung von Zahnbelag
DE3233665A1 (de) Mittel zur haarbehandlung
DE69826643T2 (de) Verfahren und produkt zum reinigen und/oder weissen der zaehne
WO1999009065A1 (de) Peptid mit radioprotektiver wirkung
DE3886175T2 (de) Trigramin, ein Polypeptid, das die Aggregation der Blutplättchen hemmt.
DE69003595T2 (de) Mikroproteine, Verfahren zur Herstellung derselben und Anwendung dieser Mikroproteine als Arzneimittel.
DE3912638A1 (de) Gentechnologisch hergestellte homologe des alzheimer protease inhibitors, wirtstaemme sowie expressionsvektoren fuer ihre herstellung und ihre verwendung als arzneimittel
DE69205154T2 (de) Verwendung von mindestens einem gereinigten peptid, welches durch kaseinhydrolyse hergestellt werden kann und opiataktivität hat, als aktiven bestandteil in der herstellung einer kosmetischen zusammensetzung.
DE10006578C2 (de) Verwendung von kompatiblen Soluten als Inhibitoren des enzymatischen Abbaus von makromolekularen Biopolymeren
WO1996028543A1 (de) Neue, definierte enzymmischungen zur zellgewinnung und für die wundbehandlung
DE69216188T2 (de) Kosmetika und Pharmazeutika enthaltend Extensin
JPH04507238A (ja) プロテアーゼインヒビター
DE69125489T2 (de) Verwendung von derivaten durch menschliches gallensalz stimulierter lipase zur herstellung von medikamenten
DE69402861T2 (de) Verwendung eines peptids mit ein lysine und ein endständigen alanine für ein entfärbungszusammensetzung sowie ihre verwendung
AT409822B (de) Verwendung von aktiviertem protein c zur herstellung einer pharmazeutischen präparation
WO1998001108A1 (de) Definierte enzymmischungen für kosmetische zwecke
DE3937076A1 (de) Kollagene, verfahren zu ihrer herstellung und kosmetische mittel
EP0850044B1 (de) Verfahren zur aminosäuregewinnung aus proteinen und verwendung derselben aminosäurehaltigen produkte

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU CA JP KR MX US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WA Withdrawal of international application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 98504713

Format of ref document f/p: F

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

122 Ep: pct application non-entry in european phase