DE3886175T2

DE3886175T2 - Trigramin, ein Polypeptid, das die Aggregation der Blutplättchen hemmt.

Info

Publication number: DE3886175T2
Application number: DE88307818T
Authority: DE
Inventors: John C Holt; Tur-Fu Huang; Hanna Lukasiewicz; Stefan Niewiarowski
Original assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Current assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Priority date: 1987-11-18
Filing date: 1988-08-24
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2008-08-25
Also published as: EP0317053A3; EP0317053B1; EP0317053A2; ES2060654T3; JPH01250399A; DE3886175D1; JPH0631317B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf Trigramin, ein Polypeptid mit niedrigem Molekulargewicht, welches ein starker Hemmer der Blutplättchenaggregation ist.

Hintergrund der Erfindung

Es ist wohl begründet, daß die Wechselwirkung von Fibrinogen mit speziellen Rezeptoren, welche mit dem Glykoprotein-IIb- IIIa- (GpIIb-GPIIIa) Komplex verbunden sind, für die Blutplättchenaggregation wesentlich ist. Nicht-stimulierte Blutplättchen binden kein Fibrinogen und ballen sich daher im Blutkreislauf nicht zusammen. Wenn Blutplättchen durch Agonisten, wie etwa ADP, Epinephrin, Thrombin oder Prostaglandinendoperoxide, stimuliert werden, werden die mit dem GPIIb- GPIIIa-Komplex verbundenen Fibrinogenrezeptoren auf der Blutplättchenoberfläche exponiert, was das Binden von Fibrinogen und die darauffolgende Blutplättchenaggregation zur Folge hat. Die gewöhnliche Erklärung ist, daß ADP ein wesentlicher Mediator der Fibrinogenrezeptor-Exposition unter physiologischen Bedingungen ist. Die Anzeichen deuten darauf hin, daß während einer Gewebsverletzung ADP in ausreichenden Mengen gebildet wird, um eine Blutplättchenaggregation hervorzurufen.
Ouyang, C. und Huang, T., Biochim. Biophys. Acta 757:332-341 (1983) und Thrombos. Res. 33:125-138 (1984) berichten eine Rohherstellung einer die Blutplättchenaggregation hemmenden Substanz aus Trimeresurus gramineus-Schlangengift. Das Material wurde als eine an Asparaginsäure, Glutaminsäure und Cystein reiche, saure Phospholipase A beschrieben, welche durch Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration isoliert wurde. Ouyang et al. identifizierten eine einzelne 12,4 kd-Bande bei der Herstellung durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Diskelektrophorese. Sie berichteten von einem geschätzten Mindestmolekulargewicht von 11682 bezogen auf 109 Aminosäurereste.
Trotz der Wirksamkeit des Faktors von Ouyang et al. macht ihn die Phospholipase-A-Aktivität des Materials aufgrund der hämolytischen Wirkung von Phospholipase A auf Erythrozyten zur klinischen Verwendung völlig ungeeignet. Darüber hinaus kann das unreine Material ein oder mehrere verunreinigende Toxine aus dem rohen Schlangengift enthalten. Es ist bekannt, daß bestimmte, in Schlangengiften gefundene Toxine für den Menschen in Nanogramm-Mengen toxisch sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Wir haben gefunden, daß das angebliche Protein mit 109 Aminosäuren von Ouyang et al. nur ein unreines Gemisch ist, welches den tatsächlichen, die Blutplättchenaggregation hemmenden Faktor enthält.
Wir haben den die Blutplättchenaggregation hemmenden Faktor aus T. gramineus in im wesentlichen chemisch reiner Form, frei von einer Verunreinigung durch Phospholipase A erhalten. Der aktive, die Blutplättchenaggregation hemmende Faktor, welchen wir "Trigramin" genannt haben, ist bis zur chemischen Einheitlichkeit gereinigt worden.
Trigramin in im wesentlichen chemisch reiner Form ist ein Polypeptid mit 72 Aminosäuren, welches die folgende Aminosäurensequenz besitzt
EAGEDCDCGSPANPCCDAATCKLIPGAQCGEGLCCDQCSFIEEGTVCRIARGDDLDDYCNGRSAGCPRNPFH,
worin die Symbole für die Aminosäuren wie folgt ihre anerkannten Bedeutungen besitzen: Symbol Aminosäurerest Lysin Histidin Arginin Asparaginsäure Asparagin Threonin Serin Glutaminsäure Glutamin Prolin Glycin Alanin Cysteinhälfte Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Tryptophan
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung des vorstehenden Polypeptids als ein Arzneimittel und auf Zubereitungen von Trigramin, welche im wesentlichen frei von einer Verunreinigung durch Phospholipase A sind, zum Hemmen einer durch Fibrinogen ausgelösten Aggregation menschlicher Blutplättchen gerichtet.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des Polypeptids bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung beim Hemmen des Bindens von Fibrinogen an menschliche Blutplättchen oder beim Hemmen der durch Fibrinogen ausgelösten Aggregation menschlicher Blutplättchen. Menschliche Blutplättchen können mit einer Zubereitung inkubiert werden, welche Trigramin in im wesentlichen chemisch reiner Form enthält. Somit kann Trigramin einem Menschen verabreicht werden, in dessen Blutkreislauf das Auftreten einer Blutplättchenaggregation gehemmt werden soll.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Figur 1 ist eine doppelt umgekehrte Darstellung von ¹²&sup5;I-Fibrinogen, welches an menschliche Blutplättchen bindet und durch 10 mikromolares ADP stimuliert wird, in Abwesenheit (0 -- 0) oder Gegenwart von Trigramin (0,5 Mikrogramm/ml), -- ; 1,0 Mikrogramm/ml, -- ).
Figur 2 ist eine Darstellung der konzentrationsabhängigen Hemmwirkung von Trigramin auf die durch Fibrinogen ausgelöste Blutplättchenaggregation durch ADP-stimulierter Blutplättchen (Δ -- Δ) oder mit Chymotrypsin (CT) behandeiter Blutplättchen (0 -- 0). 200 Mikrogramm/ml Fibrinogen und 10 mikromolares ADP wurden verwendet. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert aus wenigstens fünf Versuchen dar.
Figur 3 ist eine Darstellung der in vivo-Wirkung einer kontinuierlichen Infusion von Trigramin auf die Blutungszeit eines Hamsters aus einer Mesenteriumsläsion.
Figur 4 ist eine Druckkurve der Blutungszeit aus einer Mesenteriumsläsion vor, während und nach der Infusion von Trigramin (80 Mikrogramm/kg/min).
Figur 5 ist eine Darstellung der Trigraminhemmung des Bindens von ¹²&sup5;I-von Willebrand-Faktor an durch Thrombin (0,5 E/ml) aktivierte Blutplättchen (0 -- 0) und mit Ristocetin (0,75 mg/ml) gereizter ( -- ) Blutplättchen.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Trigramin wird zuerst durch Erhalten einer rohen, Phospholipase A-Aktivität besitzenden Zubereitung gemäß Ouyang et al., Biochim. Biophys. Acta 757:332-341 (1983) gereinigt. Die Endreinigung von Trigramin bis zur chemischen Einheitlichkeit wird mittels der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, "HPLC", bewerkstelligt.

Herstellung rohen Materials

Das Gift von Trimeresurus gramineus wird gesammelt, zentrifugiert, lyophilisiert und in einem wasserfreies CaCl&sub2; enthaltenden Exsikkator bei -20ºC aufbewahrt. Das Gift wird zuerst mittels DEAE-Sephadex A-50-Säulenchromatographie wie folgt in zwölf Fraktionen getrennt.

DEAE-Sephadex A-50-Säulenchromatographie:

1 g des Gifts wird auf eine mit DEAE-Sephadex A-50 gepackte Säule (3,2 x 100 cm) aufgebracht. Eine erste Stufe einer Gradientenelution wird mit 1000 ml 0,005 M Ammoniumacetat (der pH wird mit wäßrigem Ammoniak auf 8,0 eingestellt) im Mischgefäß und 1000 ml 0,25 M Ammoniumacetat (der pH wird mit Eisessig auf 6,0 eingestellt) tenelution wird mit 800 ml 0,25 M Ammoniumacetat (pH 6,0) im Mischgefäß und 1000 ml 1 M Ammoniumacetat (pH 5,2) im Vorratsgefäß durchgeführt. Die Fließgeschwindigkeit wird auf 16-18 ml/h eingestellt und Eluate von 6 ml je Röhrchen werden gesammelt. Das Ausfließende wird mit einem Spektrophotometer (z.B. "LKB Uvicord", LKB Company) kontinuierlich bei 278 nm und 5ºC überwacht.
Das Gift wird gemäß der vorstehenden DEAE-Sephadex A-50-Säulenchromatographie in zwölf Fraktionen getrennt. Acht Fraktionen werden in der ersten Stufe der Gradientenelution erhalten, während die anderen vier Fraktionen in der zweiten Stufe der Elution erhalten werden. Fraktion 12 wird anschließend an einer Sephadex G-75-Säule wie folgt erneut fraktioniert:

Sephadex G-75-Chromatoaraphie:

Die Säule enthält in 0,005 M Ammoniumbicarbonat (pH 7,8) vorbereitetes Sephadex. Die Größe der Säule entspricht der Giftmenge. Die Elution aus der Sephadex G-75-Säule wird mit 0,005 M Ammoniumbicarbonat durchgeführt. Die Fließgeschwindigkeit wird auf 18 ml/h eingestellt. Eluate von 3 ml je Röhrchen werden gesammelt.

Sephadex G-50-Chromatographie:

Die dritte Unterfraktion aus der Sephadex G-75-Säule, welche eine Hemmwirkung auf die durch Thrombin (0,1 E/ml) ausgelöste Blutplättchenaggregation besitzt, wird dreimal an Sephadex G-50 erneut fraktioniert, bis ein einziger Peak erhalten wird. Ammoniumbicarbonat (0,005 M, pH 7,8) wird als Elutionsmittel verwendet. Das sich daraus ergebende rohe Material wird wie folgt weiter gereinigt.

Reinigung von Trigramin bis zur chemischen Einheitlichkeit

Eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule (250 x 4,6 mm), welche eine weitporige C-18-Siliziumdioxidmatrix (z.B. Vydac TPRP, The Separations Group, Hesperia, CA) besitzt, wird bei 20ºC in 0,1%iger Trifluoressigsäure äquilibriert. 150 Mikrogramm des vorstehend hergestellten rohen Materials in 200 Mikrolitern 0,15 M NaCl wird in die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eingespritzt. Die Säule wird 3 Minuten gewaschen. Fraktionen werden während 50 Minuten mit einem Gradienten von 0-55% Acetonitril eluiert. Der erste Bestandteil, der nach einer Retentionszeit von 37 Minuten eluiert wird, enthält reines Trigramin ohne Phospholipase A-Aktivität. Die Einheitlichkeit des gereinigten Materials wird durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit Silberanfärbung (1 Mikrogramm) bestätigt. Trigramin erscheint als eine einzelne Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 9 kd an 20%igen Gelen.
Die Aminosäurensequenz des HPLC-gereinigten Trigramins wird nach dem Pyridylethylieren des Materials unter Überführen der Cysteinreste in S-Pyridylethylcystein, ein während des Edman- Abbaus stabiles Cysteinderivat, bestimmt. Unversehrtes S-Pyridylethyl-trigramin wird der NH&sub2;-terminalen Sequenzierung unterworfen, welches 35 eindeutige Reste liefert. Das weitere Sequenzieren wird durch vorsichtige proteolytische Spaltung des S-Pyridylethyl-trigramins durch Chymotrypsin, Trypsin und S. aureus V8-Protease und Sequenzieren einzelner getrennter Spaltungsfragmente bewerkstelligt. Die vollständige Sequenz der 72 Aminosäurereste von Trigramin wird auf diese Weise erhalten.
Trigramin hemmt die Blutplättchenaggregation durch spezifisches und kompetitives Hemmen der Fibrinogenbindung an Fibrinogenrezeptoren auf mit dem GPIIb-GPIIIa-Komplex verbundene Blutplättchen, deren Rezeptoren durch ADP exponiert sind. Trigramin hemmt weiterhin das Binden von von Willebrand-Faktor, welcher zusammen mit Fibrinogen Blutplättchen dazu anregt, sich zusammenzuballen oder an Oberflächen zu haften. Unsere Versuche liefern den Beweis, daß Trigramin spezifisch an den GPIIb-GPIIIa- Komplex bindet und daß es Fibrinogen und von Willebrand-Faktor kompetitiv am Binden an die mit dem Komplex verbundenen Rezeptoren blockiert.

Trigraminhemmung des Bindens von Fibrinogen an Blutplättchen

Der folgende Versuch veranschaulicht, daß Trigramin das Binden von Fibrinogen an Blutplättchen hemmen kann. Eine gewaschene Suspension menschlicher Blutplättchen wurde gemäß der Methode von Mustard et al., Brit. J. Haemat. 22:193-204 (1972) hergestellt und Tyrodes Albuminlösung (pH 7,35), welche 3,5 mg/ml Rinderserumalbumin (Sigma, Fraktion V) enthielt, suspendiert. 420 Mikrolitern dieser Blutplättchensuspension (e;twa 5 x 10&sup8; Blutplättchen/ml) wurden 10 Mikroliter ¹²&sup5;I-Fibrinogen zugesetzt. Eine Menge Trigramin wurde der Suspension zugesetzt, 3 Minuten später gefolgt von 10 Mikrolitern ADP (Endkonzentration 10 mikromolar). Auf den ADP-Zusatz folgend wurde die Blutplättchensuspension mäßig geschüttelt und weitere 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 400 Mikroliter der Blutplättchensuspension bei 15000 g in einer Eppendorf-Zentrifuge durch Silikonöl zentrifugiert. Die Menge des an das Blutplättchenpellets gebundenen ¹²&sup5;I-Fibrinogens wurde gemessen. Das nichtspezifische Binden von Fibrinogen wurde in der Anwesenheit von 6 mM EDTA gemessen. Die IC&sub5;&sub0; oder 50%ige Hemmung der Fibrinogenbindung wurde bestimmt.
Wie in Figur 1 gezeigt, hemmte Trigramin das Binden von ¹²&sup5;I- Fibrinogen an durch ADP (10 mikromolar) stimulierte Blutplättchen in einer konzentrationsabhängigen Weise mit einer IC&sub5;&sub0; von 2,8-5,6 x 10&supmin;&sup8; M. Der Wert ist mit einem kompetitiven Hemmechanismus von Trigramin mit einer Hemmkonstante Ki von 2 x 10&supmin;&sup8; vereinbar.
Von Trigramin wird ferner beobachtet, daß es das Binden von ¹²&sup5;I-Fibrinogen an mit alpha-Chymotrypsin behandelte Blutplättchen in einer IC&sub5;&sub0; von 1,1 x 10&supmin;&sup8; M hemmt und auf diese Weise seine direkte Wirkung auf die exponierten Fibrinogenrezeptoren anzeigt (Daten nicht gezeigt). Reduziertes Trigramin (2 x 10&supmin;&sup6; M) hemmte das Binden von ¹²&sup5;I-Fibrinogen an ADP-stimulierte Blutplättchen nicht (Daten nicht gezeigt).

Trigraminhemmung der Blutplättchenaggregation in isolierter Blutplättchensuspension

Die folgenden Versuche demonstrieren die Wirksamkeit von Trigramin beim Hemmen der Blutplättchenaggregation ADP-stimulierter und mit Chymotrypsin behandelter Blutplättchen. Die Blutplättchensuspension wurde wie vorstehend hergestellt. Mit alpha-Chymotrypsin (Sigma, 15-Qualität) behandelte Blutplättchen wurden wie von Kornecki et al., J. Biol. Chem. 258:9349- 9356 (1983) beschrieben hergestellt, außer daß die Inkubationszeit der Blutplättchen mit Chymotrypsin von 45 Minuten auf 20 Minuten verringert wurde.
Verschiedene Dosen Trigramin (0,25-5,0 Mikrogramm/ml) wurden 420 Mikrolitern Blutplättchensuspension (3 x 10&sup8; Blutplättchen je ml) zugesetzt. Eine Minute später wurden 10 Mikroliter ADP (10 mikromolar) und 10 Mikroliter Fibrinogen (200 Mikrogramm) zugesetzt, um die Blutplättchenaggregation einzuleiten. Dasselbe Verfahren wurde mit Fibrinogen allein (ohne ADP) durchgeführt, um die Aggregation der mit Chymotrypsin behandelten Blutplättchen anzuregen. Das Ausmaß der Blutplättchenaggregation in jedem System wurde bei 37ºC durch die Trübungsmeßmethode von Born et al., J. Physiol. (Lond.) 168:178-195 (1963) gemessen. Der IC&sub5;&sub0;-Wert für die Trigraminhemmung der Aggregation ADP-stimulierter Blutplättchen betrug 1,3 x 10&supmin;&sup7; M. Der IC&sub5;&sub0;- Wert für die Trigraminhemmung mit Chrymotrypsin behandelter Blutplättchen betrug 2,8 x 10&supmin;&sup8; M. Die Daten werden in Figur 2 gezeigt.
Es ist bekannt, daß mit Chrymotrypsin behandelte Blutplättchen mit Fibrinogen direkt in Wechselwirkung treten, da sie an der Oberfläche exponierte Fibrinogenrezeptoren besitzen. Ohne daß gewünscht wird, an irgendeine Theorie gebunden zu sein, zeigt die Hemmwirkung von Trigramin auf die durch Fibrinogen hervorgerufene Aggregation mit Chymotrypsin behandelter Blutplättchen an, daß Trigramin direkt mit Fibrinogenrezeptoren auf den Blutplättchenmembranen in Wechselwirkung tritt.
Trigramin hemmte auch die durch das stabile Prostaglandinendoperoxid-Analogon 9,11-Didesoxy-9,11-methanoepoxy-PGF&sub2;-alpha (2,5 mikromolar) und durch Thrombin (0,5 Einheiten/ml) ausgelöste Blutplättchenaggregation in konzentrationsabhängiger Weise.
In blutplättchenreichem Plasma hemmte Trigramin die durch ADP (10 mikromolar), Epinephrin (50 mikromolar), 9,11-Didesoxy- 9,11-methanoepoxy-PGF&sub2;-alpha (2,5 mikromolar) und Natriumarachidonat (200 mikromolar) ausgelöste Blutplättchenaggregation mit einer IC&sub5;&sub0; von 2-4 x 10&supmin;&sup7; M.
Es gibt mehrere Ähnlichkeiten zwischen dem Binden von ¹²&sup5;I- Trigramin und dem Binden von ¹²&sup5;I-Fibrinogen an menschliche Blutplättchen. Das Binden beider Liganden wird durch EDTA, durch monoklonale, mit dem GPIIb-GPIIIa-Komplex in Wechselwirkung tretende (Coller, J. Clin. Invest. 76:101-108 (1985) und Bennett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2417-2421 (1983)) monoklonale Antikörper, durch mutmaßliche Blutplättchenbindungsstellen auf dem Fibrinogenmolekül darstellende synthetische Peptide Arg-Gly-Asp-Ser (Gartner et al., J. Biol. Chem. 260:11891-11894 (1985) und Plow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:8057-8061 (1985)) und durch ein Tyrosylpentadecapeptid des C-terminalen Teils der Gammakette, Gly-Gln-Gln- His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val (Kloczewiak et al., Biochemistry 23:1767-1774 (1984)) gehemmt. Weder von Trigramin noch Fibrinogen wurde beobachtet, daß es an Blutplättchen von Patienten mit Glanzmann-Thrombasthenie ausreichend bindet. Diesen Personen mangelt es an GPIIb-GPIIIa-Komplex. Fibrinogen bindet nicht an ruhende Blutplättchen und die Stimulierung von Blutplättchen durch ADP oder Behandlung mit proteolytischen Enzymen ist eine Notwendigkeit für die Exposition von Fibrinogen-Bindungsstellen. Andererseits ist die Zahl der Trigramin-Bindungsstellen auf ruhenden Blutplättchen, auf ADP- stimulierten Blutplättchen und auf mit Chymotrypsin behandelten Blutplättchen ähnlich und beträgt 50% der Gesamtzahl der durch ADP exponierten Fibrinogen-Bindungsstellen.
Die Bindungsaffinität von ¹²&sup5;I-Trigramin an ADP-stimulierte Blutplättchen ist der Beurteilung auf der Grundlage der Dissoziationskonstanten zufolge etwa 15-fach größer als die Bindungsaffinität von ¹²&sup5;I-Fibrinogen an ADP-stimulierte Blutplättchen. So wurde beobachtet, daß sowohl monoklonale Antikörper als auch synthetische Peptide wirksamer das Binden von Fibrinogen an Blutplättchen als das Binden von Trigramin an ADP-stimulierte Blutplättchen hemmen. Die Bindungsaf finität von Trigramin an ADP-stimulierte Blutplättchen ähnelt derjenigen monoklonaler Antikörper. Sie ist mehrere Größenordnungen höher als die Bindungsaffinität synthetischer Peptide an Blutplättchen.
Wir haben auch gezeigt, daß Trigramin in einer Konzentration von 10&supmin;&sup8; spezifisch das Binden hochgereinigten von Willebrand- Faktors an durch Thrombin stimulierte menschliche Blutplättchen blockiert. Figur 5 zeigt die Wirkung von Trigramin auf das Binden von ¹²&sup5;I-von Willebrand-Faktor an durch Thrombin (0,5 E/ml) stimulierte Blutplättchen. Die Endkonzentration an von Willebrand-Faktor betrug 5 Mikrogramm/ml. Das gesamte spezifische Binden des von Willebrand-Faktors betrug in der Kontrollprobe 380 ± 55 ng/10&sup8; Blutplättchen. Im Gegensatz dazu blockiert Trigramin nicht das Binden des von Willebrand-Faktors an durch Ristocetin (0,75 mg/ml) stimulierte Blutplättchen (Kontrolle, 754 ± 140 ng/10&sup8; Blutplättchen). Es ist wohlbekannt, daß von Willebrand-Faktor an den GPIIb-GPIIIa-Komplex auf durch Thrombin stimulierte Blutplättchen und an GPIb auf durch Ristocetin stimulierte Blutplättchen bindet. Wir schließen daraus, daß Trigramin das Binden von von Willebrand- Faktor an GPIb nicht blockiert.
Ohne daß gewünscht wird, an irgendeine Theorie gebunden sein, kann Trigramin an dasselbe Epitop im GPIIb-GPIIIa-Komplex wie Fibrinogen binden oder es kann in enger Nachbarschaft zu dem Fibrinogenrezeptor-Epitop binden.
Wir haben ferner eine Wechselwirkung zwischen Trigramin und Melanomzellen, welche GPIIIa und Vitronectinrezeptor enthalten, beobachtet. Trigramin blockiert die Haftung der Zellen an mit Fibronectin bedecktes Substrat und hemmt die Zellausbreitung. In dem getesteten System entspricht die biologische Aktivität von 0,2 nMol Trigramin 100 nMol des Peptids Glycin-Arginin- Glycin-Asparaginsäure-Serin ("GRGDS"). Diese Beobachtung ist im Hinblick auf die erfolgreichen Bemühungen von Humphries et al., Science 233: 467-470, Metastasen einer Melanomzellinie in Mäusen durch GRGDS zu hemmen, interessant.
Herkömmliche Methoden zum Hemmen der Blutplättchenaggregation vertrauen auf die Hemmung der Blutplättchenstimulation. Trigramin wirkt andererseits als direkter kompetitiver Hemmer des Bindens von Fibrinogen, welches die Blutplättchenaggregation hervorruft. Obwohl monoklonale Antikörper gegen den GPIIIa- Komplex starke Blutplättchenaggregationshemmer sind, sind monoklonale Antikörper außergewöhnlich große Moleküle. Sie besitzen typischerweise Molekulargewichte von 180 kd oder mehr. Von derartigen Molekülen, insbesondere monoklonalen Antikörpern mit der Herkunft von der Maus, ist bekannt, daß sie beim Menschen immunogen sind.
Trigramin ist andererseits ein verhältnismäßig kleines Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 8 kd. Somit wird von Trigramin erwartet, viel weniger immunogen als monoklonale Antikörper zu sein. Darüber hinaus ist die Wirkung von Trigramin beim kompetitiven Hemmen des Bindens von Fibrinogen an den GPIIb- GPIIIa-Komplex hochspezifisch. Trigramin besitzt die Epitopspezifität und hohe Bindungsaffinität eines monoklonalen Antikörpers ohne die damit verbundene Immunogenität.
Trigramin kann in jeder Situation verabreicht werden, wo eine Hemmung der Bildung eines hämostatischen Blutplättchenpfropfes gewünscht wird.
Trigramin scheint rasch aus dem Blutkreislauf entfernt zu werden. Trigramin ist besonders nützlich zum Hemmen der Blutplättchenaggregation in Situationen, wo ein starker Blutgerinnungshemmer mit kurzer Wirkungsdauer benötigt wird. Somit kann Trigramin bei der Chirurgie peripherer Arterien (Arterienersatz) und bei der Herz-Kreislauf-Chirurgie Verwendung finden, wo der Umgang mit Arterien und Organen und die Wechselwirkung von Blutplättchen mit künstlichen Oberflächen zu einer Aggregation und einem Verbrauch von Blutplättchen führt. Die zusammengeballten Blutplättchen können eine Thromboembolie bilden. Trigramin kann diesen Chirurgie-Patienten verabreicht werden, um einen Blutplättchenverbrauch zu verhindern.
Ein extrakorporaler Blutkreislauf wird üblicherweise bei der Herz-Kreislauf-Chirurgie eingesetzt, um das Blut mit Sauerstoff zu versorgen. Blutplättchen haften an den Oberflächen des extrakorporalen Kreislaufs. Die Haftung ist von der Wechselwirkung zwischen GPIIb/IIIa auf den Plättchenmembranen und dem auf der Oberfläche des im Kreislauf adsorbierten Fibrinogens abhängig (Gluszko et al., Amer. J. Physiol. 252:H615-621, 1987). Von den künstlichen Oberflächen freigesetzte Blutplättchen zeigen eine verschlechterte hämostatische Funktion. Trigramin kann zum Verhindern einer Adhäsion verabreicht werden.
Es ist von Interesse, daß Trigramin die Wechselwirkung zwischen Glykoprotein Ib auf den Blutplättchenmembranen und von Willebrand-Faktor nicht stört, was für eine wirkungsvolle Blutstilllung bei Wunden kritisch ist. Deswegen und weil die hämostatische Wirkung von Trigramin kurzlebig ist, hindert Trigramin die Wiederaufnahme der normalen Blutgerinnung in einem Chirurgie- Patienten nicht. Eine rasche Rückkehr zu einer normalen Blutungszeit tritt mit dem Absetzen der Trigraminverabreichung ein.
Andere Anwendungen von Trigramin können die Verhinderung einer Blutplättchenthromboembolie nach dem Absetzen der Thrombolysetherapie und die Verhinderung einer Blutplättchenthromboembolie nach einer Angioplastie von Koronar- und anderen Arterien. In vielen klinischen Zentren erhalten Patienten, welche diesen Verfahren unterzogen werden, bereits Antiblutplättchen-Wirkstoffe, welche verglichen mit Trigramin schwächere Hemmer der Blutplättchenaggregation sind.
Trigramin kann zum Verhindern der Ausbreitung bestimmter Tumorzellen (z.B. Melanome) und Metastasen nützlich sein. Dies rührt daher, weil von Trigramin beobachtet wurde, die Haftung und das Ausbreiten von Melanomzellen zu hemmen.
Trigramin kann durch jedes geeignete Mittel verabreicht werden, welches seine Zuführung in einer wesentlichen Menge in den Blutstrom zu Folge hat. Die intravenöse Verabreichung wird derzeit als bevorzugter Verabreichungsweg angesehen. Trigramin ist in Wasser löslich und kann daher wirkungsvoll in Lösung verabreicht werden.
Trigramin ist gegenüber einer Proteolyse verhältnismäßig stabil und eine orale Verabreichung ist somit möglich. Die orale Verabreichung kann die Form von Tabletten, Kapseln usw. annehmen, welche aus Trigramin mit geeigneten Bindematerialien gebildet wurden.
Die in vivo-Wirkung von Trigramin wird durch die folgende Hamster-Studie demonstriert.

Hamster-Studie

Weibliche syrische Goldhamster (90-150 g) wurden bei unbegrenzter Nahrung und Wasser gehalten, wurden aber vor ihrer Verwendung in dem vorliegenden Versuch übel Nacht fasten gelassen. Nach der Verabfolgung einer Anästhesie (65 mg/kg Natriumpentobarbital, i.p.) wurden die Tiere zur Vorbereitung für den Eingriff rasiert. Die Luftröhre wurde mit einem PE-100 Polyethylenschlauch intubiert, um die Spontanatmung zu erleichtern. Eine Kanüle wurde in die rechte Oberschenkelvene eingeführt, um einen intravenösen Weg sowohl zur ergänzenden Anästhesie als auch zur Verabfolgung verschiedener Kontroll- und Untersuchungsmittel bereitzustellen. Ein Katheter wurde in die rechte Halsschlagader zum kontinuierlichen Überwachen des arteriellen Blutdrucks eingeführt und eine rektale Temperatursonde wurde eingeführt. Die Körpertemperatur des Tiers wurde mit einem Heizkissen und einer Lampe bei 37ºC gehalten.
Der rasierte Unterleib wurde durch einen Mittellinieneinschnitt geöffnet und ein Teil des Dünndarms wurde vorgelagert und über einen Lucitständer gehängt. Das exponierte Gewebe wurde durch kontinuierliches Überspülen mit warmer (37ºC) Säuger-Ringer Lösung warm und feucht gehalten. Versuchslösungen wurden in die rechte Oberschenkelvene mit einer Geschwindigkeit von 0,199 ml/min mit einer Harvard-Pumpe über einen Zeitraum von 10 Minuten infundiert. Ein arterielles Gefäß (100-200 Mikrometer äußerer Durchmesser), welches sich an der Verbindung zwischen der Dünndarmwand und dem Mesenterium befand, wurde 4 Minuten nach Beginn der Infusion durchtrennt. Das Blut wurde durch das Überspülsystem weggespült und der Ablauf wurde durch ein Vakuum aus einem den Beobachtungsständer umgebenden Trog entfernt. Das Bluten wurde durch ein Zeiss-Präpariermikroskop (20 x) beobachtet und die Blutungszeit wurde von dem Zeitpunkt des Schnittes bis zum Aufhören der Blutung durch die Bildung eines hämostatischen Propfs aufgezeichnet. Jedes Tier wurde als seine eigene Kontrolle verwendet, wobei die Blutungszeit sowohl während der Infusion von Kochsalzlösung als auch des ausgewählten Versuchsmittels bestimmt wurde. Sechs Tiere wurden mit einer zweiten Kochsalzlösung, welche Trigramin ersetzte, untersucht, um sicherzustellen, daß wiederholte Messungen das darauffolgende Blutungszeitansprechen nicht beeinflußten. Es wurden keine Unterschiede zwischen den mittleren Blutungszeiten dieser beiden Kochsalzinfusionen gefunden. Vier zusätzlichen Tieren wurde Trigramin infundiert, während der arterielle Blutdruck kontinuierlich überwacht wurde, um zu bestimmen, ob es irgendeine direkte Wirkung auf den systemischen Blutdruck besitzt. Einem Hamster wurde das PGI&sub2;-Analogon (2 ng/kg/min) Iloplrost (Benlex Laboratories, Cedar Knolls, NJ) verabfolgt, um als positive Kontrolle zu dienen. Bei diesem Tier hörte das Bluten bis etwa 9 Minuten nach Beenden der Infusion nicht auf.
Infundiertes Trigramin erhöhte kontinuierlich die Blutungszeit des Hamster-Mesenteriums in merklichem Maß in dosisabhängiger Weise bezogen auf eine Kontroll-Blutungszeit von 3,02 Minuten ± 0,43; siehe Figur 3. Das Absetzen der Trigramininfusion rief eine rasche Rückkehr der Blutungszeit zu normalen Werten hervor; siehe Figur 4.
Es gelang uns, Trigramin aus dem Gift von Trimeresurus gramineus zu isolieren. Es versteht sich, daß Proteine, welche aus anderen Trimeresurus-Arten gemäß dem Reinigungsverfahren hierin isoliert werden können und welche dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäurensequenz wie das hier beschriebene Molekül besitzen, im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.
Die Reinigung von Trigramin bis zur chemischen Einheitlichkeit gemäß der vorliegenden Erfindung hat die Aminosäurensequenzierung des Moleküls gestattet. Während das Molekül zuerst aus einer natürlichen Quelle, T. gramineus-Gift, gereinigt worden ist, wird erwartet, daß Trigramin auch durch dem Fachmann bekannte gentechnologische Verfahren hergestellt werden kann. Somit kann man auf der Grundlage der hier offenbarten Aminosäurensequenz von Trigramin vorteilhaft ein synthetisches Gen herstellen, welches der Aminosäurensequenz entspricht, und dieses Gen durch geeignete Klonierungsvektoren in einen geeigneten Wirt einführen. Wahlweise wird angenommen, daß reines Trigramin durch Erhalten des natürlichen Gens aus giftproduzierenden Zellen von T. gramineus, gefolgt von Rekombination und Klonen hergestellt werden kann. Es versteht sich daher, daß der Umfang der Erfindung nicht nur auf Trigramin beschränkt ist, welches den hier offenbarten chromatographischen Verfahren folgend hergestellt wurde, sondern auch Trigramin einschließt, wie es durch gentechnologische Verfahren hergestellt werden kann.

Claims

1. Polypeptid in im wesentlichen chemisch reiner Form und durch die folgende Aminosäurensequenz gekennzeichnet:

EAGEDCDCGSPANPCCDAATCKLIPGAQCGEGLCCDQCSFI- EEGTVCRIARGDDLDDYCNGRSAGCPRNPFH.

2. Zubereitung zum Hemmen der durch Fibrinogen ausgelösten Aggregation menschlicher Blutplättchen, gekennzeichnet durch das Polypeptid

EAGEDCDCGSPANPCCDAATCKLIPGAQCGEGLCCDQCSFI- EEGTVCRIARGDDLDDYCNGRSAGCPRNPFH.

und dadurch, daß die Zubereitung frei von einer Phospholipase A-Verunreinigung ist.

3. Zubereitung gemäß Anspruch 2, in welcher das Polypeptid in im wesentlichen chemisch reiner Form vorliegt.

4. Polypeptid gemäß Anspruch 1 zur Verwendung als Arzneimittel.

5. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Hemmung des Bindens von Fibrinogen an menschliche Blutplättchen.

6. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Hemmung der durch Fibrinogen ausgelösten Aggregation menschlicher Blutplättchen.